LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO

Į S A K Y M A S

DĖL AFLATOKSINO B1, HALOFUGINONO, ROBENIDINO IR METILBENZOKVATO KIEKIO PAŠARUOSE NUSTATYMO TECHNINIŲ REGLAMENTŲ PATVIRTINIMO

2002 m. gegužės 27 d. Nr. 196

Vilnius

Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos pašarų įstatymo (Žin., 2000, Nr. 34-952) 9 straipsniu ir siekdamas tikslaus pašarų kokybės įvertinimo:

1. Tvirtinu pridedamus:

1.1. Aflatoksino B₁ kiekio pašaruose nustatymo techninį reglamentą;

1.2. Halofuginono kiekio pašaruose nustatymo techninį reglamentą;

1.3. Robenidino ir metilbenzokvato kiekio pašaruose nustatymo techninį reglamentą.

2. Nustatau, kad šie techniniai reglamentai įsigalioja nuo 2002 m. liepos 1 d.

ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS JERONIMAS KRAUJELIS

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro

2002 m. gegužės 27 d. įsakymu Nr. 196

Aflatoksino B₁ kiekio pašaruose nustatymo techninis reglamentas

Parengtas pagal 1976 m. kovo 1 d. Europos Komisijos direktyvą 76/372/EEB „Dėl Bendrijos cheminės analizės metodų, kuriuos valstybės institucijos taiko pašarams kontroliuoti“ bei ją taisančias direktyvas 1981 m. rugpjūčio 29 d. 81/680/EEB ir 1994 m. kovo 29 d. 94/14/EB.

I. Bendrosios nuostatos

1. Šis techninis reglamentas nustato į rinką tiekiamų pašarinių žaliavų, kombinuotųjų pašarų aflatoksino B₁ cheminės analizės metodus pašarų kokybės valstybinei kontrolei vykdyti. (Tačiau kai kuriems pašarams dėl jiems būdingų sudėties savybių reikia taikyti atskirus, tik jiems tinkamus cheminės analizės metodus. Šie atvejai nurodyti metodų aprašymuose su nuoroda „Pastabos“).

2. Jei pašarų analitei nustatyti taikomi du ar daugiau metodų, taikomą metodą, jei nenurodyta kitaip, pasirenka cheminę analizę atliekanti laboratorija, tačiau šis metodas turi būti nurodomas analizės sertifikate.

3. Šio techninio reglamento reikalavimų privalo laikytis visi prekinius pašarus gaminantys, laikantys, gabenantys, naudojantys, tarpininkaujantys juos parduodant ir jais prekiaujantys ūkio subjektai ir pašarų kokybės valstybinė kontrolės institucija.

4. Šio techninio reglamento reikalavimai netaikomi pašarams:

4.1. skirtiems eksportuoti ne į Europos Sąjungos valstybes nares;

4.2. gabenamiems uždarose transporto priemonėse arba uždarose pakuotėse tranzitu per Lietuvos Respublikos teritoriją.

II. Sąvokos, terminai ir sutrumpinimai

5. Šiame techniniame reglamente vartojamos sąvokos:

Nustatymo riba – kiekybinės analizės metodu ieškomo komponento mažiausias kiekis arba koncentracija, dar duodantys išmatuojamą signalą;

„Tuščiasis“ bandymas – analizės eigos pakartojimas be analizuojamosios medžiagos.

Kitos šiame reglamente vartojamos sąvokos turi tą pačią reikšmę kaip Pašarų įstatyme ir Pašarų klasifikatoriuje.

6. Metodų aprašymuose vartojami cheminių junginių trivialieji pavadinimai ir juos atitinkantys IUPAC terminai:

Acetonas – propanonas, CH₃COCH₃;

Acetonitrilas – etannitrilas, CH₃CN;

Aflatoksinas B₁ – C₁₇H₁₂O₆;

Aflatoksinas B_2a – C₁₇H₁₄O₇;

Aflatoksinas B₂ – C₁₇H₁₄O₆;

Azoto dujos – diazotas, N₂;

Benzenas – C₆H₆;

Chloroformas – trichlormetanas, CHCl₃;

Dietileteris – (C₂H₅)₂O;

Etanolis – C₂H₅OH;

Heksanas – H(CH₂)₆H;

Metanolis – CH₃OH;

Natrio sulfatas – dinatrio tetraoksosulfatas, Na₂SO₄;

Sieros rūgštis – divandenilio tetraoksosulfatas, H₂SO₄.

7. Metodų aprašymuose vartojamos santrumpos:

c – koncentracija;

PSCh – plonasluoksnė chromatografija;

PTFE – politetrafluoretilenas;

UV – ultravioletinis;

v/v – tūrių santykis.

III. Mėginių paruošimas cheminei analizei

8. Pašarų cheminių analizių metodų bendrosios nuostatos:

8.1. Mėginių paruošimas cheminėms analizėms:

8.1.1. aprašyti veiksmai toliau taikomi galutiniams mėginiams (toliau – mėginiai), atsiųstiems į kontrolės laboratorijas po mėginių paėmimo pagal Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 208 (Žin., 2000, Nr. 60-1786) patvirtintą Pašarų mėginių paėmimo ir paruošimo techninį reglamentą;

8.1.2. galutiniai mėginiai turi būti paruošti tokiu būdu, kad pasverti kiekiai, numatyti analizių metoduose, būtų homogeniniai ir atitiktų galutinį mėginį.

8.2. Būtinos atsargumo priemonės mėginių paruošimo metu:

8.2.1. visi būtini veiksmai turi būti atliekami išvengiant mėginio užteršimo ir jo sudėties pokyčio. Malimas, maišymas ir sijojimas turi būti atliekami kaip galima greičiau, kuo trumpiau mėginį veikiant oru ir šviesa. Neturi būti naudojami malūnai ir smulkintuvai, pastebimai įšildantys mėginį. Pašarus, kurie yra ypatingai jautrūs šilumai, rekomenduojama smulkinti rankomis. Reikėtų įsitikinti, kad patys prietaisai nėra mikroelementų taršos šaltinis;

8.2.2. jei mėginys negali būti paruoštas be ženklaus mėginio drėgnio pokyčio, prieš paruošimą ir po jo nustatomas drėgnis pagal Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 206 (Žin., 2000, Nr. 60-1784) patvirtintą Drėgnio, lakiųjų azoto bazių, suminio fosforo, žalio aliejaus ir riebalų kiekio nustatymo pašaruose techninį reglamentą.

8.3. Galutinio mėginio paruošimo eiga:

8.3.1. galutinis mėginys kruopščiai sumaišomas maišytuvu arba rankomis. Mėginys padalijamas į dvi lygias dalis (jei tinka, turi būti naudojamas ketvirčiavimo metodas). Viena dalis saugoma tinkamoje švarioje, sausoje talpykloje su oro nepraleidžiančiu kamščiu, antroji dalis (arba jai būdinga mažiausiai 100 g dalis) paruošiama kaip nurodyta toliau:

8.3.1.1. pašarai gali būti malami iš karto, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip.

Visas sumaltas mėginys persijojamas per sietą su kvadratinėmis akutėmis, kurios kraštinės ilgis 1 mm (pagal rekomendaciją ISO R565). Vengiama per smulkaus sumalimo. Persijotas mėginys išmaišomas ir surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys vėl išmaišomas;

8.3.1.2. pašarai gali būti sumalami juos išdžiovinus, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip; mėginys džiovinamas, siekiant sumažinti drėgnį iki 8%–12% pagal parengtinio džiovinimo procedūrą, nurodytą drėgnio nustatymo metodo 4.3 punkte. Toliau dirbama, kaip nurodyta šio techninio reglamento 8.3.1.1 punkte;

8.3.1.3. skysto ir pusiau skysto pašaro mėginys surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys kruopščiai išmaišomas;

8.3.1.4. kitų pašarų mėginiai, kurie negali būti paruošti vienu iš nurodytų būdų, turi būti paruošiami bet kokiu kitu būdu, garantuojančiu, kad cheminei analizei pasvertas mėginys yra homogeninis ir būdingas galutiniam mėginiui;

8.4. Mėginiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Mėginiai, kuriuose numatyta analizuoti vitaminus ar kitas iš dalies šviesai jautrias medžiagas, turi būti laikomi rudo stiklo induose;

8.5. Reikalavimai reagentams ir prietaisams, naudojamiems cheminės analizės metoduose:

8.5.1. visi analiziniai reagentai turi būti analiziškai gryni (a. p.), jei cheminės analizės metoduose nenurodyta kitaip. Nustatant mikroelementus, reagentų grynumas turi būti tikrinamas „tuščiuoju“ bandymu. Atsižvelgiant į gautą rezultatą, gali būti reikalingas tolesnis reagentų gryninimas;

8.5.2. jei analizės metodų veiksmuose, susietuose su tirpalų ruošimu, skiedimu, skalavimu ar plovimu, nenurodoma naudojamo tirpiklio ar skiediklio prigimtis, suprantama, kad turi būti naudojamas vanduo. Vanduo turi būti tik demineralizuotas ar distiliuotas. Kai kuriais analizių metoduose nurodytais atvejais jis turi būti gryninamas specialiomis priemonėmis;

8.5.3. atsižvelgiant į kontrolės laboratorijose esančią įrangą, cheminės analizės metoduose leidžiama naudoti tik specialius ar specifinio naudojimo reikalaujančius instrumentus ir prietaisus. Jie turi būti ypač švarūs, nustatant labai mažus medžiagų kiekius;

8.6. Cheminės analizės metodų taikymas ir rezultatų išraiška:

8.6.1. kiekviena medžiaga pašaruose paprastai nustatoma atskiru metodu. Jei yra pateikta keletas metodų, kontrolės laboratorijoje naudotas metodas turi būti nurodomas analizės ataskaitoje;

8.6.2. analizės ataskaitoje pateikiamas rezultatas išreiškiamas mažiausiai dviejų matavimų, atliktų su atskiromis mėginio dalimis, vidurkiu, esant patenkinamam šių matavimų pakartojamumui. Šis rezultatas išreiškiamas reikšmingų skaitmenų skaičiumi analizės metoduose nurodytu būdu ir, jei reikia, koreguojamas pagal drėgnio kiekį, esantį galutiniame mėginyje prieš jo paruošimą.

IV. Mėginių cheminė analizė

9. Aflatoksino B₁ kiekis pašaruose nustatomas šio techninio reglamento priede nurodytais metodais.

SUDERINTA SUDERINTA

Nacionalinės veterinarijos Lietuvos gyvulininkystės

laboratorijos direktorius instituto direktorė

Jonas Milius Violeta Juškienė

2002 m. gegužės 20 d. 2002 m. gegužės 17 d.

______________

Aflatoksino B₁ kiekio pašaruose

nustatymo techninio reglamento

priedas

aflatoksino b₁nustatymas

I. Vienmatės PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS METODAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatomas aflatoksino B₁ kiekis šiuose pašaruose: žemės riešutuose, džiovintuose kokoso riešutų branduoliuose, sezamuose, babasu palmių ir kukurūzų branduolių išspaudose, grūduose ir grūdų produktuose, žirnių miltuose, bulvių išspaudose ir krakmole. Nustatymo riba – 0,01 mg/kg.

2. Metodo esmė

Mėginys ekstrahuojamas chloroformu. Ekstraktas filtruojamas, filtrato dalis gryninama chromatografinėje kolonėlėje su silikageliu. Eliuatas išgarinamas, likutis ištirpinamas chloroforme arba benzeno ir acetonitrilo mišinyje. Dalis šio tirpalo naudojama plonasluoksnei chromatografijai (PSCh). Aflatoksino B₁ kiekis nustatomas lyginant mėginio ir žinomo aflatoksino B₁ kiekio chromatogramas vizualiai ar fluorodensitometru UV šviesoje. Išekstrahuoto aflatoksino B₁ identiškumas turi būti patvirtintas pagal nurodytą procedūrą.

3. Reagentai:

Visi reagentai, jei nenurodyta kitaip, turi būti analiziškai gryni.

3.1. Acetonas;

3.2. Chloroformas, stabilizuotas 0,5 %–1 % etanoliu (96 %, v/v);

3.3. n-Heksanas;

3.4. Metanolis;

3.5. Dietileteris, bevandenis, be peroksidų;

3.6. Benzeno ir acetonitrilo mišinys: 98/2 (v/v);

3.7. Chloroformo (3.2) ir metanolio (3.4) mišinys: 97/3 (v/v);

3.8. Silikagelis, chromatografijai kolonėlėje, dalelių dydis 0,05 mm–0,20 mm;

3.9. Higroskopinė vata, naudojama pašalinus riebalus chloroformu, arba stiklo vata;

3.10. Natrio sulfatas, bevandenis, granuliuotas;

3.11. Inertinės dujos, pvz.: azotas;

3.12. Druskos rūgštis, 1 mol/l;

3.13. Sieros rūgštis, c = 50 % (v/v);

3.14. Diatomitas (arba Hyflo Super Cel), plautas rūgštyje;

3.15. Silikagelis G-HR arba panašus, tinkantis PSCh;

3.16. Standartinis aflatoksino B₁ tirpalas: 0,1 mg/ml chloroforme (3.2) arba benzeno ir acetonitrilo mišinyje (3.6), paruoštas ir patikrintas, kaip nurodyta 7 punkte;

3.17. Standartinis tirpalas kokybiniam patikrinimui: 0,1mg aflatoksino B₁ ir aflatoksino B₂viename mililitre chloroformo (3.2) arba benzeno ir acetonitrilo mišinio (3.6). Šios koncentracijos yra orientacinės. Jos turi būti sureguliuotos taip, kad abiem aflatoksinams būtų pasiektas toks pat fluorescencijos intensyvumas;

3.18. Tirpiklių sistemos atskyrimui:

3.18.1. Chloroformo (3.2) ir acetono (3.1) mišinys: 9/1 (v/v), chromatografinė kamera neprisotinama tirpiklių garais;

3.18.2. Dietileterio (3.5), metanolio (3.4) ir vandens mišinys: 96/3/1 (v/v/v), chromatografinė kamera neprisotinama tirpiklių garais;

3.18.3. Dietileterio (3.5), metanolio (3.4) ir vandens mišinys: 94/4,5/1,5 (v/v/v), chromatografinė kamera prisotinama tirpiklių garais;

3.18.4. Chloroformo (3.2) ir metanolio (3.4) mišinys: 94/6 (v/v), chromatografinė kamera prisotinama tirpiklių garais;

3.18.5. Chloroformo (3.2) ir metanolio (3.4) mišinys: 97/3 (v/v), chromatografinė kamera prisotinama tirpiklių garais;

4. Įranga:

4.1. Laboratorinis malūnas;

4.2. Laboratorinė purtyklė arba magnetinė maišyklė;

4.3. Klostuotas filtrinis popierius, Schleicher and Schull Nr. 588 ar panašus, 24 cm skersmens;

4.4. Stiklinis vamzdelis chromatografijai (su įrengtu PTFE čiaupu ir apytikriai 250 ml tūrio talpa, vidinis skersmuo 22 mm, ilgis 300 mm);

4.5. Sukamasis vakuuminis garintuvas;

4.6. 500 ml konusinės kolbos su šlifo kamščiais;

4.7. PSCh prietaisas;

4.8. Stiklo plokštelės plonasluoksnei chromatografijai, 200×200 mm, paruoštos tokiu būdu (nurodyto kiekio pakanka padengti 5 plokštelėms): 30 g silikagelio G-HR (3.15) supilama į konusinę kolbą. Įpilama 60 ml vandens, užkemšama ir purtoma vieną minutę. Gauta suspensija paskleidžiama ant plokštelių taip, kad būtų gautas tolygus 0,25 mm storio sluoksnis. Plokštelės išdžiovinamos ore ir laikomos eksikatoriuje su silikageliu. Prieš naudojimą plokštelės aktyvuojamos vieną valandą laboratorinėje krosnyje 110^oC temperatūroje.

Paruoštos naudojimui plokštelės yra taip pat tinkamos, jei jas naudojant gaunami panašūs rezultatai.

4.9. Didelio bangos ilgio (360 nm) UV lempa. Tokio intensyvumo apšvietimas turi išryškinti 10 cm nuo lempos esančioje PSCh plokštelėje 1 ng aflatoksino B₁ dėmę.

4.10. 10 ml graduoti mėgintuvėliai su polietileniniais kamščiais;

4.11. UV spektrofotometras;

4.12. Fluorodensitometras (nebūtinas).

5. Darbo procedūra

5.1. Mėginio paruošimas (žr. 1 pastabą)

Mėginys sumalamas taip, kad visas persisijotų per sietą su kvadratinėmis akutėmis, kurių kraštinės ilgis 1 mm (pagal rekomendaciją ISO R565).

5.2. Ekstrahavimas

Į 500 ml konusinę kolbą (4.6) suberiama 50 g sumalto, išmaišyto mėginio. Pridedama 25 g diatomito (3.14), įpilama 25 ml vandens ir 250 ml chloroformo (3.2). Kolba užkemšama, 30 min. purtoma arba maišoma (4.2). Filtruojama per klostuotą filtrinį popierių (4.3). Pirmieji 10 ml filtrato išpilami, surenkama 50 ml filtrato.

5.3. Gryninimas kolonėlėje

Mažas stiklo vatos kamštelis (3.9) įkišamas į apatinį stiklinio vamzdelio (4.4) galą. Du trečdaliai vamzdelio užpildomi chloroformu (3.2). Į vamzdelį suberiami 5 g natrio sulfato (3.10).

Natrio sulfato sluoksnio paviršius turėtų būti lygus. Po to nedidelėmis porcijomis įberiama 10 g silikagelio (3.8). Po kiekvienos įbertos porcijos atsargiai pamaišoma, siekiant pašalinti oro burbuliukus. Paliekama 15 minučių nusistoti, po to atsargiai įberiama 15 g natrio sulfato (3.10). Skystis išleidžiamas, kol jo meniskas susilygins su viršutinio natrio sulfato sluoksnio paviršiumi.

50 ml surinkto ekstrakto (5.2) sumaišoma su 100 ml n-heksano (3.3). Mišinys kiekybiškai perpilamas į kolonėlę. Skystis išleidžiamas, kol jo meniskas susilygins su viršutinio natrio sulfato sluoksnio paviršiumi. Išleistas skystis išpilamas. Tada į kolonėlę įpilama 100 ml dietileterio (3.5). Skystis vėl išleidžiamas, kol jo meniskas susilygins su viršutinio natrio sulfato sluoksnio paviršiumi. Reikia stebėti, kad šių procedūrų metu debitas būtų 8 ml/min.–12 ml/min. ir kad į kolonėlę nepatektų oro. Ištekėjęs skystis išpilamas. Po to plaunama su 150 ml chloroformo ir metanolio mišinio (3.7). Visas eliuatas surenkamas.

Eliuatas inertinių dujų (3.11) aplinkoje sukamuoju garintuvu (4.5) išgarinamas iki sausos liekanos temperatūroje, neviršijančioje 50^oC. Naudojant chloroformą (3.2) ar benzeno ir acetonitrilo mišinį (3.6), likutis kiekybiškai perpilamas į 10 ml graduotą mėgintuvėlį (4.10). Tirpalas koncentruojamas inertinių dujų aplinkoje (3.11), po to chloroformu (3.2) ar benzeno ir acetonitrilo mišiniu (3.6) praskiedžiamas iki 2 ml.

5.4. Plonasluoksnė chromatografija

Ant PSCh plokštelės (4.8) 2 cm atstumu nuo apatinio krašto ir 2 cm intervalais užlašinami standartinis tirpalas ir ekstraktas:

10 μl 15 μl 20 μl, 30 μl, ir 40 μl, aflatoksino B₁ standartinio tirpalo (3.16);

10 μl ekstrakto (5.3) ir ant to paties taško 20 μl standartinio tirpalo (3.16);

10 μl ir 20 μl ekstrakto (5.3).

Chromatografuojama tamsoje su viena iš tirpiklių sistemų (3.18). Tirpiklių sistema parenkama iš anksto. Ant plokštelės užlašinami 25 μl kokybiniam patikrinimui skirto standartinio tirpalo (3.17). Po chromatografavimo aflatoksinas B₁ ir aflatoksinas B₂turi visiškai atsiskirti.

Tirpikliai išgarinami tamsoje. Švitinama UV šviesoje, laikant plokštelę 10 cm atstumu nuo lempos (4.9). Aflatoksino B₁ dėmė fluorescuoja mėlynai.

5.5. Kiekybinis nustatymas

Matuojama vizualiai arba fluorodensitometru, kaip nurodyta toliau.

5.5.1. Vizualus matavimas

Aflatoksino B₁kiekis ekstrakte nustatomas lyginant ekstrakto ir vieno iš standartinių tirpalų dėmių fluorescencijos intensyvumus. Jei reikia interpoliuojama. Fluorescencija, gauta užlašinant standartinį tirpalą ant ekstrakto, turi būti intensyvesnė nei 10 μl ekstrakto fluorescencija, o matoma dėmė turi būti viena. Jei 10 μl ekstrakto fluorescencija intensyvesnė už 40 μl standartinio tirpalo dėmės fluorescenciją, ekstraktas skiedžiamas chloroformu (3.2) ar benzeno ir acetonitrilo mišiniu 10 arba 100 kartų. Vėl chromatografuojama.

5.5.2. Matavimas fluorodensitometru

Matuojant aflatoksino B₁dėmės fluorescencijos intensyvumą fluorodensitometru (4.12), sužadinimo bangos ilgis turi būti 365 nm, emisijos – 443 nm. Aflatoksino B₁ kiekis ekstrakto dėmėje nustatomas lyginant jos fluorescencijos intensyvumą su standartinio tirpalo dėmių fluorescencijos intensyvumu.

5.6. Aflatoksino B₁ tapatumo patvirtinimas

Aflatoksino B₁tapatumas ekstrakte patvirtinamas toliau nurodytais metodais.

5.6.1. Poveikis sieros rūgštimi.

Plokštelė apipurškiama sieros rūgštimi (3.13). Aflatoksino B₁ dėmės fluorescencija švitinant UV keičiasi iš mėlynos į geltoną.

5.6.2. Dvimatė chromatografija, apimanti susidariusio aflatoksino B₁ hemiacetalio (aflatoksino B_2a) atskyrimą. Toliau aprašytos procedūros turi būti atliekamos tiksliai pagal 3 piešinyje pateiktą schemą.

5.6.2.1. Tirpalų panaudojimas

Siekiant apriboti tirpiklio fronto kilimą, ant plokštelės (4.8) lygiagrečiai gretimiems kraštams nubrėžiamos dvi tiesios linijos (6 cm atstumu nuo kiekvieno krašto). Naudojant kapiliarines pipetes arba mikrošvirkštus ant plokštelės užlašinami šie tirpalai:

taške A: toks išgryninto mėginio ekstrakto (5.3) tūris, kuriame būtų apie 2,5 ng aflatoksino B₁;

taškuose B ir C: 25 μl standartinio tirpalo (3.16).

5.6.2.2. Atskyrimas

Chromatografuojama 1-ąja kryptimi, tamsoje, su tirpiklių sistema (3.18.1)(į chromatografinę kamerą įpilamas 1 cm storio tirpiklio sluoksnis, kamera tirpiklio garais neprisotinama), kol tirpiklio frontas pasieks tirpiklio kilimą ribojančią liniją.

Plokštelė išimama iš chromatografinės kameros, džiovinama 5 min. kambario temperatūroje, tamsoje. Po to druskos rūgštimi apipurškiama 2,5 cm aukščio juosta, dengianti taškus A ir B (šis plotas schemoje brūkšniuotas), kol patamsės, likusią plokštelės dalį pridengus stiklu. Paliekama reaguoti tamsoje 10 min. Plokštelė džiovinama kambario temperatūros oro srove.

Toliau chromatografuojama 2-ąja kryptimi, tamsoje, su tirpiklių sistema (3.18.1) (į chromatografinę kamerą įpilamas 1 cm storio tirpiklio sluoksnis, kamera tirpiklio garais neprisotinama), kol tirpiklio frontas pasieks tirpiklio kilimą ribojančią liniją. Plokštelė išimama iš chromatografinės kameros, džiovinama kambario temperatūroje, tamsoje.

5.6.2.3. Chromatogramos interpretavimas

Chromatograma apžiūrima UV šviesoje (4.9), tikrinami tokie požymiai:

(a) mėlynai fluorescuojanti aflatoksino B₁ dėmė, atsirandusi iš C taške užlašinto standartinio tirpalo (migracija 1-ąja kryptimi);

(b) mėlynai fluorescuojanti nesureagavusio su druskos rūgštimi aflatoksino B₁ dėmė ir intensyvesnė mėlynai fluorescuojanti aflatoksino B₁-hemiacetalio dėmė, atsirandusios iš B taške užlašinto standartinio tirpalo (migracija 2-ąja kryptimi);

(c) dėmės, atitinkančios apibūdintas (b), atsiradusios iš A taške užlašinto mėginio ekstrakto. Šių dėmių padėtys apsprendžiamos taške A užlašinto aflatoksino B₁kilimo 1-ąja kryptimi atstumo (tokio pat, kaip judant taške C užlašintam standartui) bei aflatoksino B₁-hemiacetalio kilimo iš to paties taško 2-ąja kryptimi atstumo (tokio pat, kaip judant taške B užlašintam standartui). Hemiacetalio dėmių fluorescencijos intensyvumai, atsiradę iš ekstrakto ir standartinio tirpalo, užlašinto taške B, turi sutapti.

6. Rezultatų apskaičiavimas

6.1. Matuojant vizualiai

Aflatoksino B₁ kiekis w mikrogramais kilograme mėginio apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

kurioje:

Y ir X – atitinkamai aflatoksino B₁ standartinio tirpalo (3.16) ir ekstrakto, fluorescuojančių vienodu intensyvumu, tūriai mikrolitrais;

S – aflatoksino B₁ koncentracija standartiniame tirpale (3.16) mikrogramais mililitre;

V – galutinis ekstrakto tūris, susidaręs reikiamai praskiedus, mikrolitrais;

m – mėginio, atitinkančio kolonėlėje gryninto ekstrakto tūrį, svoris gramais.

6.2. Matuojant fluordensitometru

Aflatoksino B₁ kiekis w mikrogramais kilograme mėginio apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

kurioje:

Y – ant plokštelės užlašinto ekstrakto tūris mikrolitrais (10 μl ar 20 μl)

S – aflatoksino B₁ kiekis ekstrakto dėmėje nanogramais proporcingas tūriui Y, nustatytas matuojant;

V – galutinis ekstrakto tūris, susidaręs reikiamai praskiedus, mikrolitrais;

m – mėginio, atitinkančio kolonėlėje gryninto ekstrakto tūrį, svoris gramais.

7. Standartinio tirpalo (3.16) paruošimas ir patikrinimas

7.1. Aflatoksino B1 koncentracijos nustatymas

Ruošiamas 8 μg/ml–10 μg/ml koncentracijos aflatoksino B₁ pradinis standartinis tirpalas chloroforme (3.2) ar benzeno ir acetonitrilo mišinyje (3.6). Absorbcijos spektras nustatomas spektrofotometru (4.11) 330 nm–370 nm srityje.

Chloroformo tirpalo optinis tankis A matuojamas 363 nm bangos ilgyje, tirpalo su benzeno ir acetonitrilo mišiniu – 348 nm bangos ilgyje.

Aflatoksino B1 koncentracija mikrogramais mililitre tirpalo apskaičiuojama pagal formules:

tirpalui chloroforme (312 x A x 1000)/20600;

tirpalui benzeno ir acetonitrilo mišinyje (312 x A x 1000)/19800.

Siekiant gauti darbinį 0,1 μg/ml aflatoksino B₁ koncentracijos standartinį tirpalą, pradinis standartinis tirpalas tinkamai skiedžiamas, saugant jį nuo dienos šviesos. Laikomas šaldytuve 4oC temperatūroje, tirpalas būna stabilus dvi savaites.

7.2. Chromatografinio grynumo tyrimas

Ant plokštelės (4.8) užlašinami 5 μl standartinio tirpalo, kuriame yra 8 μg/ml–10 μg/ml aflatoksino B₁. Chromatografuojama kaip nurodyta 5.4 punkte. UV šviesoje turi būti matoma tik viena dėmė, nuosėdinė sritis neturėtų fluorescuoti.

8. Pakartojamumas

Skirtumas tarp dviejų lygiagrečių to paties mėginio matavimų rezultatų, atliktų to paties tyrėjo, neturi viršyti:

25 % didžiausios vertės, kai aflatoksino B₁ kiekis yra nuo 10 μg/kg; iki 20 μ g/kg;

5 μg absoliučiu dydžiu, kai aflatoksino B₁ kiekis yra nuo 20 μg/kg iki 50 μg/kg;

10 % didžiausios vertės, kai aflatoksino B₁ kiekis yra didesnis nei 50 μg/kg.

9. Atkartojamumas

Žr. pastabų 2 punktą.

II. Dvimatės plonasluoksnės chromatografijos metodas

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatomas aflatoksino kiekis pašaruose, kai negalima taikyti I metodo. Apatinė nustatymo riba – 0,01 mg/kg. Metodas netaikomas pašarams su citrusų išspaudomis.

2. Metodo esmė

Mėginys ekstrahuojamas chloroformu. Ekstraktas filtruojamas, alikvotinė dalis išvaloma silikagelio kolonėlėje. Eliuatas išgarinamas ir liekana ištirpinama tiksliame chloroformo arba benzeno ir acetonitrilo mišinio kiekyje. Šio tirpalo alikvotinė dalis naudojama dvimatei plonasluoksnei chromatografijai PSCh. Aflatoksino B₁ kiekis nustatomas lyginant mėginio ir žinomo aflatoksino B₁ kiekio chromatogramas vizualiai ar fluorodensitometru UV šviesoje. Aflatoksino B1, išekstrahuoto iš pašarų, identiškumas patvirtinamas pagal nurodytą metodiką.

3. Reagentai:

Visi reagentai, jei nenurodyta kitaip, turi būti analiziškai gryni.

3.1. Acetonas;

3.2. Chloroformas stabilizuotas 0,5 %–1 % etanoliu (96 %, v/v);

3.3. n-Heksanas;

3.4. Metanolis;

3.5. Dietilo eteris, bevandenis, be peroksidų;

3.6. Benzeno ir acetonitrilo mišinys 98/2 (v/v);

3.7. Chloroformo (3.2) ir metanolio (3.4) mišinys 97/3 (v/v);

3.8. Silikagelis chromatografijai kolonėlėje, dalelių dydis 0,05 mm–0,20 mm;

3.9. Higroskopinė vata, naudojama pašalinus riebalus chloroformu, arba stiklo vata;

3.10. Natrio sulfatas, bevandenis, granuliuotas;

3.11. Inertinės dujos pvz.: azotas;

3.12. Druskos rūgštis, 1 mol/l;

3.13. Diatomitas (arba Hyflo Super Cel) plautas rūgštyje;

3.14. Silikagelis G-HR ar panašus, tinkantis PSCh;

3.15. Tirpiklių sistemos atskyrimui:

3.15.1. dietilo eterio (3.5), metanolio (3.4) ir vandens mišinys, 94:4,5:1,5 (v/v/v);

3.15.2. chloroformo (3.2) ir acetono (3.1) mišinys, 9:1 (v/v);

3.16. Standartinis aflatoksino tirpalas 0,1 µg/ml chloroforme (3.2) ar benzeno ir acetonitrilo mišinyje (3.6), pagamintas ir patikrintas, kaip aprašyta I metodo 7 punkte.

4. Įranga:

Žr. I metodo 4 punktą.

5. Darbo procedūra:

5.1. Mėginys paruošiamas, kaip nurodyta I metodo 5.1 punkte;

5.2. Ekstrahuojama, kaip nurodyta I metodo 5.2 punkte;

5.3. Gryninama kolonėlėje, kaip nurodyta I metodo 5.3 punkte.

5.4. Dvimatė plonasluoksnė chromatografija:

5.4.1. Tirpalų panaudojimas (pagal 1 pav.)

Siekiant apriboti tirpiklių fronto judėjimą, ant plokštelės (4.8) įbrėžiamos dvi tiesios linijos, lygiagrečios dviem gretimoms kraštinėms, atitinkamai 5cm ir 6 cm nuo krašto. Kapiliarinėmis pipetėmis ar mikrošvirkštais ant plokštelės užlašinami tirpalai:

taške A – 20 µl išgryninto mėginio ekstrakto (5.3);

taške B – 20 µl standartinio tirpalo (3.16);

taške C – 10 µl standartinio tirpalo (3.16);

taške D – 20 µl standartinio tirpalo (3.16);

taške E – 40 µl standartinio tirpalo (3.16).

Plokštelė išdžiovinama oro arba inertinių dujų (3.11) sraute. Dėmės ant plokštelės turi būti apie 5 mm skersmens.

5.4.2. Atskyrimas (žr. 1 pav. diagramą)

Chromatografuojama 1-ąja kryptimi, tamsoje, su tirpiklių sistema (3.15.1) (į chromatografinę kamerą įpilamas 1 cm storio tirpiklio sluoksnis, kamera prisotinama tirpiklio garų), kol tirpiklio frontas pasieks tirpiklio kilimą ribojančią liniją. Plokštelė išimama iš chromatografinės kameros, džiovinama 15 min. kambario temperatūroje, tamsoje.

Toliau chromatografuojama 2-ąja kryptimi, tamsoje, su tirpiklių sistema (3.15.2) (į chromatografinę kamerą įpilamas 1 cm storio tirpiklio sluoksnis, kamera tirpiklio garų neprisotinama), kol tirpiklio frontas pasieks tirpiklio kilimą ribojančią liniją. Plokštelė išimama iš chromatografinės kameros, džiovinama kambario temperatūroje, tamsoje.

5.4.3. Chromatogramos interpretavimas (pagal 2 pav. diagramą)

Plokštelė apšviečiama UV šviesa, laikant plokštelę 10 cm atstumu nuo lempos (4.9). Surandamos standartinio tirpalo aflatoksino B₁ mėlynai florescuojančios dėmės B, C, D ir E. Per šiuos taškus, statmenai chromatografavimo kryptims, vedamos dvi įsivaizduojamos linijos. Linijų susikirtimo taškas P yra tikėtina mėginio ekstrakto aflatoksino B₁ dėmė. Tačiau tikroji aflatoksino B₁ vieta galėtų būti taške Q, kuriame susikerta dvi tiesės, jungiančios dėmes B ir C ir sudarančios 100^o kampą. Nustatomas aflatoksino B₁ kiekis mėginio ekstrakte, kaip nurodyta 5.5 punkte.

5.4.4. Papildomas chromatografavimas

Ant naujos plokštelės įbrėžiamos dvi tiesios linijos, lygiagrečios dviem gretimoms kraštinėms, kaip pavaizduota 1 pav. Ant taško A (1 pav.) užlašinama 20 µl išgryninto mėginio ekstrakto (5.3) ir po to – 20 µl standartinio tirpalo (3.16). Chromatografuojama kaip nurodyta 5.4.2 punkte. Chromatograma apšviečiama UV šviesa ir patikrinama, ar tikrai:

ekstrakto aflatoksino B₁ dėmė sutampa su standarto aflatoksino B₁ dėme;

ši dėmė florescuoja gerokai stipriau nei aflatoksino B₁dėmė taške Q pirmoje plokštelėje.

5.5. Kiekybinis nustatymas:

Matuojama vizualiai arba fluorodensitometru, kaip nurodyta toliau.

5.5.1. Vizualus matavimas

Aflatoksino B₁kiekis ekstrakte nustatomas lyginant ekstrakto ir standartinių tirpalų dėmių C, D ir E fluorescencijos intensyvumus. Jei reikia, interpoliuojama. Jei 20 µl ekstrakto dėmės fluorescencija yra intensyvesnė už 40 µl standartinio tirpalo dėmės fluorescenciją, ekstraktas skiedžiamas chloroformu (3.2) ar benzeno ir acetonitrilo mišiniu (3.6) 10 arba 100 kartų ir vėl chromatografuojama;

5.5.2. Matavimas fluorodensitometru

Aflatoksino B₁dėmėsfluorescencijos intensyvumas matuojamas fluorodensitometru (4.12) esant sužadinimo bangos ilgiui 365 nm ir emisijos bangos ilgiui 443 nm. Aflatoksino B₁ kiekis ekstrakto dėmėje nustatomas lyginant jos fluorescencijos intensyvumą su standartinių tirpalų dėmių C, D ir E fluorescencijos intensyvumu.

5.6. Aflatoksino B₁tapatumo patvirtinimas

Žr. I metodo 5.6 punktą.

6. Rezultatų apskaičiavimas

Žr. I metodo 6 punktą.

7. Pakartojamumas

Žr. I metodo 8 punktą.

8. Atkartojamumas

Žr. 2 pastabą.

Pastabos:

1. Iš mėginių (paruoštų pagal 5.1) petrolio eteriu (virimo temperatūra 40^oC–60^oC) pašalinami riebalai, jei jų yra per 5 %. Tokiu atveju analizės rezultatas turi būti išreikštas mėginio su nepašalintais riebalais masės vienetais.

2. I metodu gautų rezultatų atkartojamumas, t. y. nuokrypis tarp to paties mėginio tyrimo rezultatų, gautų dviejose ar daugiau laboratorijų, turėtų būti:

± 50 % vidurkio vertės, kai aflatoksino B₁ kiekio vidurkio vertės yra nuo 10 µg/kg iki 20 µg/kg imtinai;

±10 µg/kg vidurkio vertės, kai aflatoksino B₁kiekio vidurkio vertės yra nuo 20 µg/kg iki 50 µg/kg;

± 50 % vidurkio vertės, kai aflatoksino B₁ kiekio vidurkio vertės yra per 50 µg/kg

1 pav.

2 pav.

3 pav.

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro

2002 m. gegužės 27 d. įsakymu Nr. 196

halofuginono kiekio pašaruose nustatymo techninis reglamentas

Parengtas pagal 1993 m. liepos 28 d. Europos Komisijos direktyvą 93/70/EEB „Dėl Bendrijos cheminės analizės metodų, kuriuos valstybės institucijos taiko pašarams kontroliuoti“.

I. Bendrosios nuostatos

1. Šis techninis reglamentas nustato į rinką tiekiamų pašarinių žaliavų, kombinuotųjų pašarų halofuginono analizės metodus pašarų kokybės valstybinei kontrolei vykdyti. (Tačiau kai kuriems pašarams dėl jiems būdingų sudėties savybių reikia taikyti atskirus, tik jiems tinkamus cheminės analizės metodus. Šie atvejai nurodyti metodų aprašymuose su nuoroda „Pastabos“.)

4. Šio techninio reglamento reikalavimai netaikomi pašarams:

4.1. skirtiems eksportuoti ne į Europos Sąjungos valstybes nares;

4.2. gabenamiems uždarose transporto priemonėse arba uždarose pakuotėse tranzitu per Lietuvos Respublikos teritoriją.

II. Sąvokos, terminai ir sutrumpinimai

5. Šiame techniniame reglamente vartojamos sąvokos:

Drėgnis – laisvo vandens procentinis kiekis medžiagoje;

Nustatymo riba – kiekybinės analizės metodu ieškomo komponento mažiausias kiekis arba koncentracija, dar duodantys išmatuojamą signalą;

„Tuščiasis“ pašaras – pašaras be analitės ir be kitų medžiagų, duodančių panašų į analitės analizinį signalą;

Kitos šiame reglamente vartojamos sąvokos turi tą pačią reikšmę kaip Pašarų įstatyme ir Pašarų klasifikatoriuje.

6. Metodų aprašymuose vartojami cheminių junginių trivialieji pavadinimai ir juos atitinkantys IUPAC terminai:

acetonitrilas – etannitrilas, CH₃CN;

acto rūgštis – etano rūgštis, CH₃COOH;

amonio acetatas – amonio etanoatas, CH₃COONH₄;

druskos rūgštis – vandenilio chloridas, HCl;

etilacetatas – etiletanoatas, CH₃COOC₂H₅;

etilendiaminotetraacto rūgšties natrio druska – etilendinitrilotetraacto rūgšties dinatrio druska, C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈;

halofuginonas – DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-(hidroksi-2-piperidil)acetonil]-chinazolin-4-(3H) vandenilio bromidas;

metanolis – CH₃OH;

– laktono natrio druska, Cnatrio askorbatas – 2,3-dehidro-L-gulono rūgšties ₆H₇NaO₆;

natrio chloridas – NaCl;

natrio karbonatas – natrio trioksokarbonatas, NaCO₃;

sidabro nitratas – sidabro trioksonitratas, AgNO₃.

7. Metodų aprašymuose vartojamos santrumpos:

HPLC – efektyvioji skysčių chromatografija;

ρ₂₀– tankis;

c – koncentracija;

UV – ultravioletinis.

III. Mėginių paruošimas cheminei analizei

8. Pašarų cheminių analizių metodų bendrosios nuostatos:

8.1. Mėginių paruošimas cheminėms analizėms:

8.1.2. galutiniai mėginiai turi būti paruošti tokiu būdu, kad pasverti kiekiai, numatyti analizių metoduose, būtų homogeniniai ir atitiktų galutinį mėginį.

8.2. Būtinos atsargumo priemonės mėginių paruošimo metu:

8.2.1. visi būtini veiksmai turi būti atliekami išvengiant mėginio užteršimo ir jo sudėties pokyčio. Malimas, maišymas ir sijojimas turi būti atliekami kaip galima greičiau, kuo trumpiau mėginį veikiant oru ir šviesa. Neturi būti naudojami malūnai ir smulkintuvai, pastebimai įšildantys mėginį. Pašarus, kurie yra ypatingai jautrūs šilumai, rekomenduojama smulkinti rankomis. Reikėtų įsitikinti, ar patys prietaisai nėra mikroelementų taršos šaltinis;

8.3. Galutinio mėginio paruošimo eiga:

8.3.1. galutinis mėginys kruopščiai sumaišomas maišytuvu arba rankomis. Mėginys padalijamas į dvi lygias dalis (jei tinka, turi būti naudojamas ketvirčiavimo metodas). Viena dalis saugoma tinkamoje, švarioje, sausoje talpykloje su oro nepraleidžiančiu kamščiu, antroji dalis (arba jai būdinga mažiausiai 100 g dalis) paruošiama, kaip nurodyta toliau:

8.3.1.1. pašarai gali būti malami iš karto, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip.

8.3.1.2. pašarai gali būti sumalami juos išdžiovinus, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip; mėginys džiovinamas, siekiant sumažinti drėgnį iki 8 %–12 % pagal parengtinio džiovinimo procedūrą, nurodytą drėgnio nustatymo metodo 4.3 punkte. Toliau dirbama, kaip nurodyta šio techninio reglamento 8.3.1.1 punkte;

8.5. Reikalavimai reagentams ir prietaisams, naudojamiems cheminės analizės metoduose:

8.6. Cheminės analizės metodų taikymas ir rezultatų išraiška:

8.6.1. kiekviena medžiaga pašaruose paprastai nustatoma atskiru metodu. Jei yra pateikta keletas metodų, kontrolės laboratorijoje naudotas metodas turi būti nurodomas analizės ataskaitoje;

IV. Mėginių cheminė analizė

9. Halofuginono kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento priede nurodytą metodą.

SUDERINTA SUDERINTA

Nacionalinės veterinarijos Lietuvos gyvulininkystės

laboratorijos direktorius instituto direktorė

Jonas Milius Violeta Juškienė

2002 m. gegužės 20 d. 2002 m. gegužės 17 d.

______________

Halofuginono kiekio pašaruose

nustatymo techninio reglamento

priedas

halofuginono nustatymas

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatomas halofuginono kiekis pašaruose. Nustatymo riba – 1 mg/kg.

2. Metodo esmė

Po apdorojimo karštu vandeniu halofuginonas laisvos bazės pavidalu ekstrahuojamas etilacetatu ir išskiriamas vandenilio chlorido pavidalu vandeniniu rūgšties tirpalu. Ekstraktas išvalomas jonų mainų chromatografija. Halofuginono kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviąja skysčių chromatografija (HPLC) su UV detektorium.

3. Reagentai:

3.1. Acetonitrilas, grynas HPLC;

3.2. Amberlitas XAD-2;

3.3. Amonio acetatas;

3.4. Etilacetatas;

3.5. Ledinė acto rūgštis;

3.6. Halofuginono standartinė medžiaga (DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-(hidroksi-2-piperidil) acetonil]-chinazolin-4-(3H) vandenilio bromidas, E 764:

3.6.1. halofuginono pradinis standartinis tirpalas, 100 µg/ml: į 500 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 50 mg halofuginono (3.6), ištirpinama amonio acetato buferiniame tirpale (3.18), iki žymės skiedžiama buferiniu tirpalu ir išmaišoma. Tirpalas stabilus tris savaites tamsoje, žemesnėje nei 5^oC temperatūroje

3.6.2. kalibraciniai tirpalai: į penkias 100 ml matavimo kolbutes įpilama 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml ir 6,0 ml pradinio standartinio tirpalo (3.6.1). Praskiedžiama iki žymės judančiąja faze (3.21) ir išmaišoma. Šiuose tirpaluose yra atitinkamai 1,0 µg/ml, 2,0 µg/ml, 3,0 µg/ml, 4,0 µg/ml ir 6 µg/ml halofuginono. Šie tirpalai turi būti ruošiami iš naujo prieš kiekvieną matavimą.

3.7. Druskos rūgštis (ρ₂₀ apie 1,16 g/ml);

3.8. Metanolis;

3.9. Sidabro nitratas;

3.10. Natrio askorbatas;

3.11. Natrio chloridas;

3.12. Natrio karbonatas;

3.13. EDTA (etilendiaminotetraacto rūgšties natrio druska);

3.14. Vanduo, grynas HPLC;

3.15. Natrio karbonato tirpalas, c = 10 g/100 ml;

3.16. Natrio karbonato tirpalas, c = 5 g/100 ml sočiajame natrio chlorido tirpale: 50 g natrio karbonato (3.11) ištirpinama vandenyje, skiedžiama iki 1 l ir tirpinamas natrio chloridas, kol tirpalas prisisotina;

3.17. Druskos rūgštis, apie 0,1 mol/l: 10 ml HCl skiedžiama vandeniu iki 1 l;

3.18. Amonio acetato buferinis tirpalas, apie 0,25 mol/l; 19,3 g amonio acetato (3.3) ir 30 ml acto rūgšties (3.5) ištirpinama vandenyje (3.14) ir skiedžiama iki litro;

3.19. Amberlito XAD-2 paruošimas: tinkamas amberlito (3.2) kiekis plaunamas vandeniu, kol visiškai pašalinami chlorido jonai. Panaudotas vanduo tikrinamas su sidabro nitratu (3.20). Derva plaunama su 50 ml metanolio (3.8), metanolis išpilamas. Derva laikoma užpylus švariu metanoliu;

3.20. Sidabro nitrato tirpalas, apie 0,1 mol/l: 0,17 g sidabro nitrato (3.9) ištirpinama 10 ml vandens;

3.21. HPLC judančioji fazė: sumaišoma 500 ml acetonitrilo (3.1), 300 ml amonio acetato buferinio tirpalo (3.18) ir 1200 ml vandens (3.14), su acto rūgštimi (3.5) pH sureguliuojamas iki 4,3, filtruojama per 0,22 mm filtrą (4.8) ir degazuojama (pvz., su ultragarsu 10 min.). Gautas tirpalas stabilus mėnesį, jei laikomas tamsoje ir uždaroje talpykloje.

4. Įranga:

4.1. Ultragarso vonia;

4.2. Sukamasis garintuvas;

4.3. Centrifuga;

4.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos įrenginys su kintamo bangos ilgio UV arba diodinės matricos detektormiumi; skysčių chromatografinė kolonėlė (300 mm x 4 mm), C18, 10 μm įkrova, arba panaši kolonėlė;

4.5. Stiklinė kolonėlė (300 mm x 10 mm) su įlydytu stiklo filtru ir čiaupu;

4.6. Stiklo pluošto filtrai 150 mm diametro;

4.7. Membraniniai filtrai, 0,45 µm;

4.8. Membraniniai filtrai, 0,22 µm.

5. Darbo procedūra (žr. 1 pastabą)

5.1. Bendrosios nuostatos:

5.1.1. Turėtų būti ištiriamas „tuščiasis“ pašaras siekiant patikrinti, ar jame nėra nei halofuginono, nei trukdančių medžiagų;

5.1.2. Išgavos testą reiktų atlikti pridėjus į „tuščiąjį“ pašarą halofuginono kiekį, panašų į esantį mėginyje. Siekiant gauti koncentraciją 3 mg/kg, 300 ml pradinio standartinio tirpalo pridedama (3.6.1) į 10 g tuščiojo pašaro, išmaišoma ir paliekama 10 min. Toliau ekstrahuojama (5.2) žr. 2 pastabą).

5.2. Ekstrahavimas

Į 200 ml centrifugos mėgintuvėlį 0,1 g tikslumu pasveriama 10 g paruošto mėginio, pridedama 0,5 g EDTA (3.13) ir 20 ml vandens, išmaišoma. Mėgintuvėlis penkioms minutėms įdedamas į vandens vonią (80^oC). Atvėsinus iki kambario temperatūros pridedama 20 ml natrio karbonato tirpalo (3.15) ir išmaišoma. Tuojau pat pridedama 100 ml etilacetato (3.4) ir 15 s energingai purtoma. Neužkimštas mėgintuvėlis tris minutes laikomas ultragarso vonioje (4.1) ir dvi minutes centrifuguojama. Etilacetato fazė per stiklo pluošto filtrą nupilama į 500 ml dalijamąjį piltuvą. Mėginio ekstrahavimas pakartojamas su kita 100 ml etilacetato porcija. Jungtinis ekstraktas vieną minutę plaunamas su 50 ml natrio karbonato ir natrio chlorido tirpalu (3.16). Vandeninis sluoksnis atmetamas.

Organinis sluoksnis vieną minutę ekstrahuojamas su 50 ml druskos rūgšties tirpalu (3.17). Apatinis rūgšties sluoksnis išleidžiamas į 250 ml dalinamąjį piltuvą. Organinis sluoksnis 1,5 min. dar kartą ekstrahuojamas su kita 50 ml druskos rūgšties porcija. Abu rūgštiniai ekstraktai sujungiami ir 10 sekundžių sukamuoju judesiu plaunami su 10 ml etilacetato (3.4). Vandeninis sluoksnis kiekybiškai perpilamas į apvaliadugnę kolbą. Organinis sluoksnis išmetamas. Etilacetato likutis iš rūgšties tirpalo pašalinamas sukamajame garintuve (4.2). Vandens vonios temperatūra neturi viršyti 40^oC. Esant 2500 Pa slėgiui ir 38^oC temperatūrai visas etilacetatas turėtų būti pašalintas per 5 min.

5.3. Išvalymas

5.3.1. Amberlito kolonėlės paruošimas

XAD-2 kolonėlė ruošiama kiekvienam mėginio ekstraktui. 10 g paruošto amberlito supilama į stiklinę kolonėlę (4.5) su metanoliu (3.8). Ant dervos sluoksnio uždedamas nedidelis stiklo vatos kamštis. Iš kolonėlės išleidžiamas metanolis, derva plaunama 100 ml vandens. Vanduo išleidžiamas tiek, kad skysčio paviršius siektų dervos sluoksnio viršų. Prieš panaudojimą kolonėlė paliekama 10 min. nusistovėti. Visas dervos sluoksnis visada turi būti skystyje.

5.3.2. Mėginio išvalymas

Ant paruoštos amberlito kolonėlės (5.3.1) paviršiaus kiekybiškai pernešamas ekstraktas (5.2) ir eliuojama, eliuatas išmetamas. Eliavimo greitis neturi viršyti 20 ml/min. Apvaliadugnė kolba skalaujama 20 ml druskos rūgšties tirpalu (3.17), kuriuo po to plaunama kolonėlė. Likęs rūgšties tirpalas sustumiamas oro srautu. Išplova išmetama. Į kolonėlę įpilama 100 ml metanolio (3.8). Į 250 ml apvaliadugnę kolbą surenkam 5 ml–10 ml eliuato. Kolonėlė su metanoliu paliekama 10 min. nusistovėti. Eliuavimas tęsiamas ne didesniu nei 20 ml/min. greičiu. Eliuatas surenkamas į tą pačią apvaliadugnę kolbą. Metanolis išgarinamas sukamajame garintuve (4.2). Vandens vonios temperatūra neturi viršyti 40^oC. Su judančiąja faze (3.21) liekana kiekybiškai perpilama į 10 ml kalibruotą kolbą. Skiedžiama judančiąja faze iki žymės. Alikvotinė dalis filtruojama per membraninį filtrą (4.7). Gautas tirpalas naudojamas HPLC chromatografijai (5.4).

5.4. HPLC matavimas:

5.4.1. Parametrai:

Siūloma taikyti šias arba kitas sąlygas, jei jos duoda panašius rezultatus:

skysčių chromatografijos kolonėlė (4.4);

HPLC judančioji fazė (3.21);

debitas – 1,5 ml/min.–2 ml/min.;

matavimo bangos ilgis – 243 nm;

lįleidimo tūris – 40 µl–100 µl

Chromatografinės sistemos stabilumas patikrinamas keletą kartų įleidžiant 3,0 mg/ml kalibravimo tirpalą (3.6.3), kol smailės aukštis ir sulaikymo trukmė nesikeis;

5.4.2. Kalibracinė kreivė

Įleidžiama po keletą kartų kiekvienas kalibracinis tirpalas (3.6.2) ir išmatuojami kiekvienos koncentracijos smailių aukščiai (pločiai). Nubraižoma kalibracinė kreivė ant ordinačių ašies atidedant kalibracinių tirpalų smailių aukščių (plotų) vidurkius, ant abscisių – atitinkamas koncentracijas mg/ml.

5.4.3. Mėginio tirpalas

Keletą kartų įleidžiamas tokio pat tūrio mėginio ekstraktas (5.3.2) kaip ir kalibravimo tirpalų ir išmatuojamas halofuginono smailių aukščių (plotų) vidurkis.

6. Rezultatų apskaičiavimas

Pagal mėginio tirpalo halofuginono smailių aukščių (plotų) vidurkį, remiantis kalibracine kreive (5.4.2), nustatoma mėginio tirpalo koncentracija mikromoliais mililitre. Halofuginono kiekis w miligramais kilograme mėginio apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

kurioje:

c – halofuginono koncentracija mėginio tirpale mikrogramais mililitre;

m – matavimui paimto mėginio dalies svoris gramais.

7. Rezultatų patvirtinimas

7.1. Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtinta kochromatografija ar diodine matrica, lyginant mėginio ekstrakto ir 6,0 µg/ml kalibracinio tirpalo (3.6.2) spektrus.

7.1.1. Kochromatografija

Mėginio ekstraktas papildomas pridedant į jį tinkamą kalibravimo tirpalo (3.6.2) kiekį. Pridedamo halofuginono kiekis turėtų būti panašus į išmatuotą halofuginono kiekį mėginio ekstrakte.

Atsižvelgiant tiek į pridėtą kiekį, tiek į ekstrakto praskiedimą, padidėti turėtų tik halofuginono smailės aukštis. Smailės plotis pusėje jos aukščio turėtų būti ± 10 % nepapildyto mėginio ekstrakto halofuginono smailės pločio.

7.1.2. Detekcija diodine matrica

Rezultatai vertinami remiantis šiais kriterijais:

7.1.2.1. Mėginio ir standarto spektrų absorbcijos maksimumų bangų ilgiai, užregistruoti chromatogramų smailės viršūnėje, turi būti vienodi ir paklaida neturi viršyti detekcinės sistemos skiriamosios gebos sąlygojamų ribų. Šios ribos detekcijai diodine matrica paprastai yra ± 2 nm.

7.1.2.2. Tarp 225 nm ir 300 nm užregistruoti mėginio ir standarto chromatogramų smailių viršūnių spektrai neturi skirtis, kai santykinė absorbcija yra nuo 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai, esant tam pačiam absorbcijos maksimumui, nėra nei vieno taško, kuriame nuokrypis tarp dviejų spektrų viršytų 15 % standarto analitės absorbcijos.

7.1.2.3. Tarp 225 nm ir 300 nm mėginio ekstrakto chromatogramos smailės pakilimo, viršūnės ir nusileidimo spektrai neturi skirtis vienas nuo kito, kai santykinė absorbcija yra nuo 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai esant tam pačiam absorbcijos maksimumui, visuose stebimuose taškuose nuokrypis tarp spektrų neviršija 15 % smailės viršūnės spektro absorbcijos.

Jei nors vienas iš šių kriterijų nepatenkinamas, analitės buvimas nėra patvirtintas.

7.2. Pakartojamumas

Skirtumas tarp dviejų lygiagrečiai atliktų to paties mėginio matavimų rezultatų neturi viršyti 0,5 mg/kg, kai halofuginono yra iki 3 mg/kg.

7.3. Išgava

Išgava su tuščiuoju papildytu mėginiu turi būti ne mažesnė kaip 80 %.

8. Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai

Buvo organizuoti tarplaboratoriniai tyrimai (The Analyst 108, 1983, p. 1252-1256), kurių metu vienuolikoje laboratorijų išanalizuoti trys mėginiai.

1 lentelė. Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai.

	1 mėginys („tuščiasis“ pašaras) nustačius nedelsiant	Mėginys B (miltai)		Mėginys C (granulės)
	1 mėginys („tuščiasis“ pašaras) nustačius nedelsiant	Nustačius nedelsiant	Po dviejų mėnesių	Nustačius nedelsiant	Po dviejų mėnesių
Vidurkis (mg/kg)	nerasta	2,80	2,42	2,89	2,45
S_r (mg/kg)	–	0,45	0,43	0,40	0,42
CV_r (%)	–	16	18	14	17
Išgava (%)	–	86	74	88	75

S_r – pakartojamumo standartinis nuokrypis;

CV_r – pakartojamumo variacijos koeficientas;

PASTABOS:

1. Halofuginonas laisvos bazės formoje yra nestabilus šarminiuose ir etilacetato tirpaluose. Jo negalima laikyti etilacetate ilgiau nei 30 min.

2. „Tuščiasis“ pašaras turi būti panašios rūšies kaip tiriamasis ir jame šiuo metodu neturi būti nustatoma halofuginono.

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro

2002 m. gegužės 27 d. įsakymu Nr. 196

robenidino ir metilbenzokvato kiekio pašaruose nustatymo techninis reglamentas

Parengtas pagal 1993 m. gruodžio 17 d. Europos Komisijos direktyvą 93/117/EB „Dėl Bendrijos cheminės analizės metodų, kuriuos valstybės institucijos taiko pašarams kontroliuoti“

I. Bendrosios nuostatos

1. Šis techninis reglamentas nustato į rinką tiekiamų pašarinių žaliavų, kombinuotųjų pašarų robenidino ir metilbenzokvato analizės metodus pašarų kokybės valstybinei kontrolei vykdyti. (Tačiau kai kuriems pašarams dėl jiems būdingų sudėties savybių reikia taikyti atskirus, tik jiems tinkamus cheminės analizės metodus. Šie atvejai nurodyti metodų aprašymuose su nuoroda „Pastabos“).

4. Šio techninio reglamento reikalavimai netaikomi pašarams:

4.1. skirtiems eksportuoti ne į Europos Sąjungos valstybes nares;

4.2. gabenamiems uždarose transporto priemonėse arba uždarose pakuotėse tranzitu per Lietuvos Respublikos teritoriją.

II. Sąvokos, terminai ir sutrumpinimai

5. Šiame techniniame reglamente vartojamos sąvokos:

Drėgnis – laisvo vandens procentinis kiekis medžiagoje;

Nustatymo riba – kiekybinės analizės metodu ieškomo komponento mažiausias kiekis arba koncentracija, dar duodantys išmatuojamą signalą;

„Tuščiasis“ pašaras – pašaras be analitės ir be kitų medžiagų, duodančių panašų į analitės analizinį signalą;

Kitos šiame reglamente vartojamos sąvokos turi tą pačią reikšmę kaip Pašarų įstatyme ir Pašarų klasifikatoriuje.

6. Metodų aprašymuose vartojami cheminių junginių trivialieji pavadinimai ir juos atitinkantys IUPAC terminai:

acetonitrilas – etannitrilas, CH₃CN;

aliuminio oksidas – dialiuminio trioksidas, Al₂O₃

dichlormetanas – CH₂Cl₂;

dinatrio-vandenilio fosfatas – dinatrio-vandenilio tetraoksofosfatas, Na₂HPO₄;

druskos rūgštis – vandenilio chloridas, HCl;

kalio-divandenilio fosfatas – kalio- divandenilio tetraoksofosfatas, KH₂PO₄;

metanolis – CH₃OH;

metansulfonrūgštis – CH₃SO₃H;

metilbenzokvatas – 7-benziloksi-6-butil-3-metoksikarbonil-4-kvinolonas;

robenidinas – 1,3-bis[(4-chlorobenziliden) amino] guanidinas vandenilio chloridas.

7. Metodų aprašymuose vartojamos santrumpos:

HPLC – efektyvioji skysčių chromatografija;

ρ₂₀– tankis;

c – koncentracija;

v/v – tūrių santykis;

UV – ultravioletinis.

III. Mėginių paruošimas cheminei analizei

8. Pašarų cheminių analizių metodų bendrosios nuostatos:

8.1. Mėginių paruošimas cheminėms analizėms:

8.1.2. galutiniai mėginiai turi būti paruošti tokiu būdu, kad pasverti kiekiai, numatyti analizių metoduose, būtų homogeniniai ir atitiktų galutinį mėginį.

8.2. Būtinos atsargumo priemonės mėginių paruošimo metu:

8.2.1. visi būtini veiksmai turi būti atliekami išvengiant mėginio užteršimo ir jo sudėties pokyčio. Malimas, maišymas ir sijojimas turi būti atliekami kaip galima greičiau, kuo trumpiau mėginį veikiant oru ir šviesa. Neturi būti naudojami malūnai ir smulkintuvai, pastebimai įšildantys mėginį. Pašarus, kurie yra ypač jautrūs šilumai, rekomenduojama smulkinti rankomis. Reikėtų įsitikinti, kad patys prietaisai nėra mikroelementų taršos šaltinis;

8.3. Galutinio mėginio paruošimo eiga:

8.3.1.1. pašarai gali būti malami iš karto, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip.

8.3.1.2. pašarai gali būti sumalami juos išdžiovinus, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip; mėginys džiovinamas, siekiant sumažinti drėgnį iki 8 %–12 % pagal parengtinio džiovinimo procedūrą, nurodytą drėgnio nustatymo metodo 4.3 punkte. Toliau dirbama, kaip nurodyta šio techninio reglamento 8.3.1.1 punkte;

8.5. Reikalavimai reagentams ir prietaisams, naudojamiems cheminės analizės metoduose:

8.6. Cheminės analizės metodų taikymas ir rezultatų išraiška:

8.6.1. kiekviena medžiaga pašaruose paprastai nustatoma atskiru metodu. Jei yra pateikta keletas metodų, kontrolės laboratorijoje naudotas metodas turi būti nurodomas analizės ataskaitoje;

IV. Mėginių cheminė analizė

9. Robenidino kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento 1 priede nurodytą metodą.

10. Metilbenzokvato kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento 2 priede nurodytą metodą.

SUDERINTA SUDERINTA

Nacionalinės veterinarijos Lietuvos gyvulininkystės

laboratorijos direktorius instituto direktorė

Jonas Milius Violeta Juškienė

2002 m. gegužės 20 d. 2002 m. gegužės 20 d.

______________

Robenidino ir metilbenzokvato

kiekio pašaruose nustatymo

techninio reglamento

1 priedas

robenidino nustatymas

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatomas robenidino kiekis pašaruose. Nustatymo riba – 5 mg/kg.

2. Metodo esmė

Mėginys ekstrahuojamas parūgštintu metanoliu. Ekstraktas džiovinamas. Alikvotinė ekstrakto dalis išvaloma aliuminio oksido kolonėlėje. Robenidinas iš kolonėlės išplaunamas metanoliu, koncentruojamas ir iki atitinkamo tūrio praskiedžiamas judančiąja faze. Robenidino kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviąja skysčių chromatografija (HPLC) su UV detektoriumi.

3. Reagentai:

3.1. Metanolis;

3.2. Parūgštintas metanolis: į 500 ml matavimo kolbą įpilami 4,0 ml druskos rūgšties (ρ₂₀= 1,18 g/ml), skiedžiama metanoliu (3.1) iki žymės ir išmaišoma. Šis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš kiekvieną matavimą;

3.3. Acetonitrilas, grynas HPLC;

3.4. Molekulinis sietas: tipas 3A, mešas 8 ar 12, (1,6–2,5 mm rutuliukai iš kristalinio aliumo-silikato, porų skersmuo 0,3 mm);

3.5. Aliuminio oksidas: I laipsnio rūgštinis aktyvumas, skirtas chromatografijai kolonėlėje. Į indą suberiama 100 g aliuminio oksido, įpilama 2,0 ml vandens. Užkemšama ir purtoma apytikriai 20 min. Laikoma gerai užkimštame inde;

3.6. Kalio-divandenilio fosfato tirpalas, c = 0,025 mol/l: 1000 ml matavimo kolboje vandenyje (grynas HPLC) ištirpinama 3,4 g kalio-divandenilio fosfato, skiedžiama vandeniu (grynas HPLC) iki žymės ir išmaišoma;

3.7. Dinatrio-vandenilio fosfato tirpalas, c = 0,025 mol/l: 1000 ml matavimo kolboje vandenyje (grynas HPLC) ištirpinama 3,55 g bevandenio dinatrio-vandenilio fosfato (arba 4,45 g dihidrato, arba 8,95 g dodekahidrato), skiedžiama vandeniu (grynas HPLC) iki žymės ir išmaišoma;

3.8. Judančioji fazė efektyviajai skysčių chromatografijai. Sumaišomi tokie reagentai: 650 ml acetonitrilo (3.3), 250 ml vandens (grynas HPLC), 50 ml kalio-divandenilio fosfato tirpalo (3.6) ir 50 ml dinatrio-vandenilio fosfato tirpalo (3.7). Tirpalas filtruojamas per 0,22 μm membraninį filtrą (4.6) ir degazuojamas (pvz., 10 min. ultragarso vonioje);

3.9. Standartinė medžiaga: grynas robenidinas, 1,3-bis[(4-chlorobenziliden)amino] guanidinas vandenilio chloridas, E 750;

3.9.1. Robenidino pradinis standartinis tirpalas, 300 µg/ml: į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 30 mg robenidino (3.9), ištirpinama parūgštintame metanolyje (3.2), skiedžiama iki žymės tuo pačiu tirpikliu ir išmaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija ir laikoma tamsoje;

3.9.2. Robenidino tarpinis standartinis tirpalas, 12 µg/ml: 10 ml pradinio standartinio tirpalo (3.9.1) 250 ml matavimo kolboje iki žymės skiedžiama judančiąja faze (3.8) ir išmaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija ir laikoma tamsoje:

3.9.3. Kalibraciniai tirpalai: į 50 ml matavimo kolbutes įpilama 5,0 ml, 10,0 ml, 15,0 ml, 20,0 ml ir 25,0 ml tarpinio standartinio tirpalo (3.9.2). Praskiedžiama iki žymės judančiąja faze (3.8) ir išmaišoma. Šiuose tirpaluose yra atitinkamai 1,2 µg/ml, 2,4 µg/ml, 3,6 µg/ml, 4,8 µg/ml ir 6,0 µg/ml robenidino. Šie tirpalai turi būti ruošiami iš naujo prieš kiekvieną matavimą.

4. Įranga:

4.1. Stiklinė kolonėlė: pagaminta iš rudo stiklo su įrengtu čiaupu ir apytikriai 150 ml tūrio talpa, vidinis skersmuo 10–15 mm, ilgis 250 mm;

4.2. Laboratorinė purtyklė;

4.3. Sukamasis garintuvas;

4.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos įranga su kintamo bangos ilgio UV detektoriumi arba diodinės matricos detektoriumi, kurio darbinis intervalas yra nuo 250 nm iki 400 nm; skysčių chromatografinė kolonėlė: 300 mm x 4 mm, C18, 10 µm įkrova, ar panaši;

4.5. Stiklo pluošto filtrinis popierius (Whatman GF/A ar panašus);

4.6. Membraninis filtras, 0,22 µm;

4.7. Membraninis filtras, 0,45 µm.

5. Darbo procedūra

5.1. Bendrosios nuostatos:

5.1.1. „Tuščiasis“ pašaras

Turėtų būti ištiriamas „tuščiasis“ pašaras siekiant patikrinti, ar jame nėra robenidino ar trukdančių medžiagų. „Tuščiasis“ pašaras turi būti panašios rūšies kaip tiriamasis, be robenidino.

5.1.2. Išgavos testas

Išgavos testą reiktų atlikti pridėjus į „tuščiąjį“ pašarą (5.1.1) robenidino kiekį, panašų į esantį mėginyje. Siekiant gauti koncentraciją 60 mg/kg, į 250 ml konusinę kolbą įpilama 3,0 ml pradinio standartinio tirpalo (3.9.1). Azoto aplinkoje tirpalas nugarinamas iki maždaug 0,5 ml. Pridedama 15 g „tuščiojo“ pašaro, gerai išmaišoma ir paliekama 10 min. Pereinama prie ekstrahavimo (5.2).

5.2. Ekstrahavimas

0,01 g tikslumu pasveriama 15 g mėginio. Supilama į 250 ml konusinę kolbą, įpilama 100 ml parūgštinto metanolio (3.2). Kolba užkemšama ir 1 val. purtoma purtykle (4.2). Tirpalas filtruojamas per stiklo pluošto filtrinį popierių (4.5). Visas filtratas surenkamas į 150 ml konusinę kolbą. Pridedama 7,5 g molekulinio sieto (3.4), kolba užkemšama ir purtoma 5 min. Nedelsiant filtruojama per stiklo pluošto filtrinį popierių. Po to šis tirpalas gryninamas (5.3).

5.3. Gryninimas

5.3.1. Aliuminio oksido kolonėlės paruošimas

Mažas stiklo vatos kamštelis stikline lazdele įkišamas į apatinį kolonėlės (4.1) galą. Pasveriama 11 g paruošto aliuminio oksido (3.5) ir supilama į kolonėlę. Reikia pasirūpinti, kad šiame etape sąlytis su atmosfera būtų minimalus. Aliuminio oksidas nusodinamas švelniai padaužant per siaurąjį pakrautos kolonėlės galą.

5.3.2. Mėginių gryninimas

5 ml filtruoto ekstrakto (5.2) pipete supilami į aliuminio oksido kolonėlę. Pipetės galiukas priglaudžiamas prie kolonėlės sienelės ir tirpalui leidžiama absorbuotis į aliuminio oksidą. Robenidinas išplaunamas iš kolonėlės į 250 ml apvaliadugnę kolbą 100 ml metanolio (3.1), nustatant 2 ml/min.–3 ml/min. debitą. Metanolio tirpalas iki sausos liekanos išgarinamas sukamuoju garintuvu (4.3) vakuume 40^oC temperatūroje. Likutis ištirpinamas 3 ml–4 ml judančiosios fazės (3.8) ir kiekybiškai perpilamas į 10 ml matavimo kolbutę. Apvaliadugnė kolba skalaujama keliomis 1 ml–2 ml judančiosios fazės porcijomis, kurios po to supilamos į matavimo kolbutę. Iki žymės skiedžiama tuo pačiu tirpikliu ir išmaišoma. Dalis tirpalo filtruojama per 0,45 mm filtrą (4.7). Šis tirpalas naudojamas HPLC matavimui (5.4).

5.4. HPLC matavimas:

5.4.1. Parametrai:

Siūloma taikyti šias arba kitas sąlygas, jei jos duoda panašius rezultatus:

skysčių chromatografijos kolonėlė (4.4): 300 mm x 4 mm, C18, 10 µm įkrova;

judančioji fazė (3.8): acetonitrilo (3.3), vandens (grynas HPLC), kalio- divandenilio fosfato tirpalo (3.6) ir dinatrio-vandenilio fosfato tirpalo (3.7) mišinys: 650:250:50:50 (v/v/v/v);

debitas: 1,5 ml/min.–2 ml/min.;

matavimo bangos ilgis: 317 nm;

įleidimo tūris: 20 µl–50 ml

Chromatografinės sistemos stabilumas patikrinamas keletą kartų įleidžiant 3,6 µg/ml kalibravimo tirpalą (3.9.3), kol smailės aukštis ir sulaikymo trukmė nesikeis;

5.4.2. Kalibracinė kreivė

Įleidžiamas po keletą kartų kiekvienas kalibracinis tirpalas (3.9.3) ir išmatuojami kiekvienos koncentracijos smailių aukščių (plotų) vidurkiai. Nubraižoma kalibracinė kreivė ant ordinačių ašies atidedant kalibracinių tirpalų smailių aukščių (plotų) vidurkius, ant abscisių – atitinkamas koncentracijas µg/ml.

5.4.3. Mėginio tirpalas

Keletą kartų įleidžiamas mėginio ekstraktas (5.3.2) imant tokį pat tūrį, kaip ir kalibravimo tirpalų, ir išmatuojamas robenidino smailių aukščių (plotų) vidurkis.

6. Rezultatų apskaičiavimas

Pagal mėginio tirpalo robenidino smailių aukščių (plotų) vidurkį, remiantis kalibracine kreive (5.4.2), nustatoma mėginio tirpalo koncentracija mikrogramais mililitre. Robenidino kiekis w miligramais kilograme mėginio apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

kurioje:

c – robenidino koncentracija mėginio tirpale mikrogramais mililitre;

m – matavimui paimto mėginio dalies svoris gramais.

7. Rezultatų patvirtinimas

7.1. Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtintas kochromatografijos ar diodinės matricos pagalba, lyginant mėginio ekstrakto ir 6,0 µg/ml kalibracinio tirpalo (3.9.3) spektrus.

7.1.1. Kochromatografija

Mėginio ekstraktas papildomas pridedant į jį tinkamą kalibravimo tirpalo (3.9.3) kiekį. Pridedamo robenidino kiekis turėtų būti panašus į išmatuotą robenidino kiekį mėginio ekstrakte.

Atsižvelgiant tiek į pridėtą kiekį, tiek į ekstrakto praskiedimą, padidėti turėtų tik robenidino smailės aukštis. Smailės plotis pusėje jos aukščio turėtų būti ± 10 % nepapildyto mėginio ekstrakto robenidino smailės pločio.

7.1.2. Detekcija diodine matrica

Rezultatai vertinami remiantis šiais kriterijais:

7.1.2.2. Tarp 250 nm ir 400 nm užregistruoti mėginio ir standarto chromatogramų smailių viršūnių spektrai neturi skirtis, kai santykinė absorbcija yra nuo 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai esant tam pačiam absorbcijos maksimumui, nėra nei vieno taško, kuriame nuokrypis tarp dviejų spektrų viršytų 15 % standarto analitės absorbcijos.

7.1.2.3. Tarp 250 nm ir 400 nm mėginio ekstrakto chromatogramos smailės pakilimo, viršūnės ir nusileidimo spektrai neturi skirtis vienas nuo kito, kai santykinė absorbcija yra nuo 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai esant tam pačiam absorbcijos maksimumui, visuose stebimuose taškuose nuokrypis tarp spektrų neviršija 15 % smailės viršūnės spektro absorbcijos.

Jei nors vienas iš šių kriterijų nepatenkinamas, analitės buvimas nėra patvirtintas.

7.2. Pakartojamumas

Skirtumas tarp dviejų lygiagrečiai atliktų to paties mėginio matavimų rezultatų neturi viršyti 10 % didesnės vertės, kai robenidino koncentracija yra per 15 mg/kg.

7.3. Išgava

Išgava su tuščiuoju papildytu mėginiu turi būti ne mažesnė kaip 85 %.

8. Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai

Buvo organizuoti tyrimai, kurių metu 12 laboratorijų išanalizuoti keturi malti ir granuliuoti pašarai paukščiams ir triušiams. Kiekvienam mėginiui analizė atlikta dviem pakartojimais. Rezultatai pateikiami lentelėje.

	Pašaras paukščiams		Pašaras triušiams
	Miltai	Granulės	Miltai	Granulės
Vidurkis (mg/kg)	27,00	27,99	43,6	40,1
S_r (mg/kg)	1,46	1,26	1,44	1,66
CV_r (%)	5,4	4,5	3,3	4,1
S_R (mg/kg)	4,36	3,36	4,61	3,91
CV_R (%)	16,1	12,0	10,6	9,7
Išgava (%)	90,0	93,3	87,2	80,2

S_r – pakartojamumo standartinis nuokrypis;

CV_r – pakartojamumo variacijos koeficientas;

S_R – atkartojamumo standartinis nuokrypis;

CV_R – atkartojamumo variacijos koeficientas.

PASTABA. Robenidinas jautrus šviesai, todėl visi matavimai turi būti atlikti naudojant rudo stiklo indus.

______________

Robenidino ir metilbenzokvato kiekio

pašaruose nustatymo techninio reglamento

2 priedas

metilbenzokvato nustatymas

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatomas metilbenzokvato kiekis pašaruose. Nustatymo riba – 1,0 mg/kg.

2. Metodo esmė

Metilbenzokvatas ekstrahuojamas iš mėginio su metansulfonrūgšties tirpalu metanolyje. Ekstraktas gryninamas dichlormetanu, jonų mainų chromatografija, po to vėl dichlormetanu. Metilbenzokvato kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviąja skysčių chromatografija (HPLC) su UV detektorium.

3. Reagentai:

3.1. Dichlormetanas;

3.2. Metanolis, grynas HPLC;

3.3. Judančioji fazė efektyviajai skysčių chromatografijai: metanolio (3.2) ir vandens (HPLC gryno) mišinys 75/25 (v/v). Mišinys filtruojamas per 0,22 mm membraninį filtrą (4.5) ir degazuojamas (pvz. 10 min. ultragarso vonioje);

3.4. Metansulfonrūgšties tirpalas, c = 2 %: 20,0 ml metansulfoninės rūgšties skiedžiama metanoliu (3.2) iki 1000 ml;

3.5. Druskos rūgštis, c = 10 %: 100 ml druskos rūgšties (ρ₂₀ = 1,18 g/ml) skiedžiama vandeniu iki 1000 ml;

3.6. Katijonų mainų derva Amberlitas CG-120 (Na), mešas 100-200;

Derva ruošiama prieš naudojimą: 100 g dervos ir 500 ml druskos rūgšties (3.5) suspensija pastoviai maišant kaitinama ant kaitinimo plytelės, kol užvirs. Paliekama atvėsti, rūgštis nupilama. Filtruojama per filtrinį popierių vakuumu. Derva plaunama dviem 500 ml vandens porcijomis, po to 250 ml metanolio (3.2). Derva skalaujama papildoma 250 ml metanolio porcija ir džiovinama traukiant orą per sukepintą filtrą. Išdžiovinta derva laikoma uždarame inde;

3.7. Standartinė medžiaga: grynas metilbenzokvatas, – 7-benziloksi-6-butil-3-metoksikarbonil-4-kvinolonas;

3.7.1. Metilbenzokvato pradinis standartinis tirpalas, 500 µg/ml: į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 50 mg standartinės medžiagos (3.7) ir ištirpinama metansulfonrūgšties tirpale (3.4), skiedžiama iki žymės ir išmaišoma.

3.7.2. Metilbenzokvato tarpinis standartinis tirpalas, 50 µg/ml: į 50 ml matavimo kolbą įpilama 5,0 ml pradinio standartinio tirpalo (3.7.1), skiedžiama iki žymės metanoliu (3.2) ir išmaišoma.

3.7.3 Kalibraciniai tirpalai: į 25 ml matavimo kolbutes įpilama 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml ir 5,0 ml tarpinio standartinio tirpalo (3.7.2). Praskiedžiama iki žymės judančiąja faze (3.3) ir išmaišoma. Šiuose tirpaluose yra atitinkamai 2,0 µg/ml 4,0 µg/ml, 6,0 µg/ml, 8,0 µg/ml, ir 10,0 µg/ml metilbenzokvato. Šie tirpalai turi būti ruošiami iš naujo prieš kiekvieną matavimą.

4. Įranga:

4.1. Laboratorinė purtyklė;

4.2. Sukamasis garintuvas;

4.3. Stiklinė kolonėlė (250 mm × 15 mm) apytikriai 200 ml tūrio talpa su įrengtu čiaupu;

4.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos įranga su kintamo bangos ilgio UV detektoriumi arba diodinės matricos detektoriumi; 4.4.1. skysčių chromatografinė kolonėlė: 300 mm x 4 mm, C18, 10 µm įkrova, ar panaši;

4.5. Membraninis filtras, 0,22 µm;

4.6. Membraninis filtras, 0,45 µm.

5. Darbo procedūra

5.1. Bendrosios nuostatos:

5.1.1. Turėtų būti ištiriamas „tuščiasis“ pašaras siekiant patikrinti, ar jame nėra metilbenzokvato ar trukdančių medžiagų. „Tuščiasis“ pašaras turi būti panašios rūšies kaip tiriamasis, be metilbenzokvato.

5.1.2. Išgavos testas

Išgavos testą reiktų atlikti pridėjus į „tuščiąjį“ pašarą (5.1.1) metilbenzokvato kiekį, panašų į esantį mėginyje. Siekiant gauti koncentraciją 15 mg/kg, į 20 g „tuščiojo“ pašaro įpilama 600 µml pradinio standartinio tirpalo (3.7.1), išmaišoma ir paliekama 10 min. Pereinama prie ekstrahavimo (5.2).

5.2. Ekstrahavimas

0,01 g tikslumu pasveriama 20 g mėginio. Supilama į 250 ml konusinę kolbą, įpilama 100 ml metansulfonrūgšties tirpalo (3.4) ir 30 min. mechaniškai purtoma (4.1). Tirpalas filtruojamas per filtrinį popierių. Filtratas naudojamas skystų fazių perskyrimui (5.3).

5.3. Skystų fazių perskyrimas

Į 500 ml talpos dalomąjį piltuvą supilama 100 ml druskos rūgšties tirpalo (3.5), 25,0 ml filtrato (5.2), 100 ml dichlormetano (3.1) ir 1 minutę purtoma. Leidžiama sluoksniams atsiskirti, apatinis sluoksnis (dichlormetano) išleidžiamas į 500 ml talpos apvaliadugnę kolbą. Vandeningos fazės ekstrahavimas kartojamas su dviem papildomom 40 ml dichlormetano porcijomis, jas po to prijungiant prie pirmojo ekstrakto apvaliadugnėje kolboje. Sukamuoju garintuvu (4.2) vakuume, temperatūroje, neviršijančioje 40^oC, dichlormetano ekstraktas išgarinamas iki sausos liekanos. Likutis ištirpinamas 20 ml–25 ml metanolio (3.2), kolba užkemšama. Visas ekstraktas laikomas jonų mainų chromatografijai (5.4).

5.4. Jonų mainų chromatografija

5.4.1. Katijonų mainų kolonėlės paruošimas

Mažas stiklo vatos kamštelis įkišamas į apatinį stiklinės kolonėlės (4.3) galą. Paruošiama 5,0 g paruoštos katijonų mainų dervos (3.6) ir 50 ml druskos rūgšties (3.5) suspensija, supilama į stiklinę kolonėlę ir paliekama nusistoti. Rūgšties perteklius nuleidžiamas tiek, kad skysčio meniskas sutaptų su viršutiniu dervos paviršiumi. Kolonėlė plaunama vandeniu, kol ištekantis skystis bus neutralus pagal lakmusą. Į kolonėlę įpilama 50 ml metanolio (3.2) ir leidžiama susigerti iki dervos paviršiaus.

5.4.2. Kolonėlės chromatografija

Pasinaudojant pipete, ekstraktas (5.3) atsargiai supilamas į kolonėlę. Apvaliadugnė kolba skalaujama dviem 5 ml-10 ml metanolio (3.2) porcijomis, kurios po to supilamos į kolonėlę. Ekstraktas išleidžiamas iki dervos paviršiaus. Kolonėlė plaunama 50 ml metanolio, nustatant neviršijantį 5 ml/min. debitą. Ištekėjęs skystis išpilamas. Metilbenzokvatas išplaunamas iš kolonėlės 150 ml metansulfonrūgšties tirpalu (3.4). Eliuatas surenkamas į 250 ml konusinę kolbą.

5.5. Skystų fazių perskyrimas

Eliuatas (5.4.2) supilamas į 1000 ml dalomąjį piltuvą. Konusinė kolba skalaujama 5 ml–10 ml metanolio (3.2), kuris po to supilamas į tą patį dalomąjį piltuvą. Įpilama 300 ml druskos rūgšties tirpalo (3.5) ir 130 ml dichlormetano (3.1). Vieną minutę purtoma, leidžiama fazėms atsiskirti. Apatinis sluoksnis (dichlormetano) išleidžiamas į 500 ml talpos apvaliadugnę kolbą. Vandeningos fazės ekstrahavimas kartojamas su dviem papildomom 70 ml dichlormetano porcijomis, jas po to prijungiant prie pirmojo ekstrakto apvaliadugnėje kolboje.

Sukamuoju garintuvu (4.2) vakuume, temperatūroje, neviršijančioje 40^oC, dichlormetano ekstraktas išgarinamas iki sausos liekanos. Likutis ištirpinamas 5 ml metanolio (3.2). Šis tirpalas kiekybiškai perpilamas į 10 ml matavimo kolbutę. Apvaliadugnė kolba skalaujama papildomai dviem 1 ml – 2 ml metanolio porcijomis, kurios po to supilamos į tą pačią matavimo kolbutę. Iki žymės skiedžiama metanoliu ir išmaišoma. Dalis šio tirpalo filtruojama per membraninį filtrą (4.6). Šis tirpalas naudojamas HPLC matavimui (5.6).

5.6. HPLC matavimas:

5.6.1. Parametrai:

Siūloma taikyti šias arba kitas sąlygas, jei jos duoda panašius rezultatus:

skysčių chromatografijos kolonėlė (4.4): 300 mm x 4 mm, C18, 10 µm įkrova, ar panaši;

HPLC judančioji fazė: metanolio (3.2) ir vandens (HPLC gryno) mišinys 75/25 (v/v);

debitas: 1,0 µl/min. – 1,5 µl/min.;

įleidimo tūris: 20 ml–50 ml;

matavimo bangos ilgis: 265 nm

Chromatografinės sistemos stabilumas patikrinamas keletą kartų įleidžiant 4,0 µg/ml kalibravimo tirpalą (3.7.3), kol smailės aukštis ir sulaikymo trukmė nesikeis;

5.6.2. Kalibracinė kreivė

Įleidžiamas po keletą kartų kiekvienas kalibracinis tirpalas (3.7.3) ir išmatuojami kiekvienos koncentracijos smailių aukščiai (plotai). Nubraižoma kalibracinė kreivė, ant ordinačių ašies atidedant kalibracinių tirpalų smailių aukščių arba plotų vidurkius, ant abscisių – atitinkamas koncentracijas mikrogramais mililitre.

5.3.3. Mėginio tirpalas

Keletą kartų įleidžiamas mėginio ekstraktas (5.5), imant tokį pat tūrį, kaip ir kalibravimo tirpalų, ir išmatuojamas metilbenzokvato smailių aukščių (plotų) vidurkis.

6. Rezultatų apskaičiavimas:

Pagal mėginio tirpalo metilbenzokvato smailių aukščių (plotų) vidurkį, remiantis kalibracine kreive (5.6.2), nustatoma mėginio tirpalo koncentracija mikrogramais mililitre. Metilbenzokvato kiekis w miligramais kilograme mėginio apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

kurioje:

c – metilbenzokvato koncentracija mėginio tirpale mikrogramais mililitre;

m – matavimui paimto mėginio dalies svoris gramais.

7. Rezultatų patvirtinimas

7.1. Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtintas kochromatografija ar diodine matrica, lyginant mėginio ekstrakto ir 10,0 µg/ml kalibracinio tirpalo (3.7.3) spektrus.

7.1.1. Kochromatografija

Mėginio ekstraktas papildomas pridedant į jį tinkamą tarpinio kalibravimo tirpalo (3.7.2) kiekį. Pridedamo metilbenzokvato kiekis turėtų būti panašus į išmatuotą metilbenzokvato kiekį mėginio ekstrakte.

Atsižvelgiant tiek į pridėtą kiekį, tiek į ekstrakto praskiedimą, padidėti turėtų tik metilbenzokvato smailės aukštis. Smailės plotis pusėje jos aukščio turėtų būti ± 10 % nepapildyto mėginio ekstrakto metilbenzokvato smailės pločio.

7.1.2. Detekcija diodine matrica

Rezultatai vertinami remiantis šiais kriterijais:

7.1.2.1. mėginio ir standarto spektrų absorbcijos maksimumų bangų ilgiai, užregistruoti chromatogramų smailės viršūnėje, turi būti vienodi ir paklaida neturi viršyti detekcinės sistemos skiriamosios gebos sąlygojamų ribų. Šios ribos detekcijai diodine matrica paprastai yra ± 2 nm;

7.1.2.2. tarp 220 nm ir 350 nm užregistruoti mėginio ir standarto chromatogramų smailių viršūnių spektrai neturi skirtis, kai santykinė absorbcija yra nuo 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai, esant tam pačiam absorbcijos maksimumui, nėra nei vieno taško, kuriame nuokrypis tarp dviejų spektrų viršytų 15 % standarto analitės absorbcijos;

7.1.2.3. tarp 220 nm ir 350 nm mėginio ekstrakto chromatogramos smailės pakilimo, viršūnės ir nusileidimo spektrai neturi skirtis vienas nuo kito, kai santykinė absorbcija yra nuo. 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai esant tam pačiam absorbcijos maksimumui, visuose stebimuose taškuose nuokrypis tarp spektrų neviršija 15 % smailės viršūnės spektro absorbcijos.

Jei nors vienas iš šių kriterijų nepatenkinamas, analitės buvimas nėra patvirtintas.

7.2. Pakartojamumas

Skirtumas tarp dviejų lygiagrečiai atliktų to paties mėginio matavimų rezultatų neturi viršyti 10 % santykinai didesnės vertės, kai metilbenzokvato koncentracija yra nuo 4 mg/kg iki 20 mg/kg.

7.3. Išgava

Išgava su tuščiuoju papildytu mėginiu turi būti ne mažesnė kaip 90 %.

8. Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai

10 laboratorijų išanalizavo penkis mėginius. Kiekvienam mėginiui analizė atlikta dviem pakartojimais.

	„Tuščiasis“	Miltai 1	Granulės 1	Miltai 2	Granulės 2
Vidurkis (mg/kg)	Nenustatyta	4,50	4,50	8,90	8,70
S_r (mg/kg)	–	0,30	0,20	0,60	0,50
CV_r (%)	–	6,70	4,40	6,70	5,70
S_R (mg/kg)	–	0,40	0,50	0,90	1,00
CV_R (%)	–	8,90	11,10	10,10	11,50
Išgava (%)	–	92,00	93,00	92,00	89,00

S_r – pakartojamumo standartinis nuokrypis;

CV_r – pakartojamumo variacijos koeficientas;

S_R – atkartojamumo standartinis nuokrypis;

CV_R – atkartojamumo variacijos koeficientas.

______________