LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO

Į S A K Y M A S

DĖL 2000 M. LIEPOS 17 D. ĮSAKYMO NR. 223 „DĖL TECHNINIŲ REGLAMENTŲ PATVIRTINIMO“ DALINIO PAKEITIMO

2001 m. gruodžio 27 d. Nr. 461

Vilnius

Atsižvelgdamas į papildytų Europos Sąjungos teisės aktų reikalavimus:

1. Iš dalies pakeičiu 2000 m. liepos 17 d. įsakymu Nr. 223 „Dėl techninių reglamentų patvirtinimo“ (Žin., 2000, Nr. 99-3145) patvirtintą Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės metodų taikymo techninį reglamentą ir išdėstau jį nauja redakcija (pridedama).

2. Laikau netekusiu galios 2000 m. liepos 17 d. įsakymoNr. 223 „Dėl techninių reglamentų patvirtinimo“ (Žin., 2000, Nr. 99-3145) 1.3.2 papunktį.

3. Nustatau, kad Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės metodų taikymo techninio reglamento 3, 4, 5 ir 6 priedai įsigalioja praėjus 18 mėnesių nuo šio reglamento įsigaliojimo.

ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS                                                                   JERONIMAS KRAUJELIS

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro

2001 m. gruodžio 27 d. įsakymu Nr. 461

PIENO IR PIENO PRODUKTŲ PAMATINIŲ ANALIZĖS METODŲ TAIKYMO TECHNINIS REGLAMENTAS

Reglamentas parengtas pagal 2001 m. sausio 9 d. Europos Komisijos reglamentą Nr. 213/2001/EB, nustatantį detalias Europos Tarybos reglamento Nr. 1255/1999/EB taikymo taisykles, susijusias su pieno produktų analizės ir kokybės vertinimo metodais, ir pakeičiantį Europos Komisijos reglamentus Nr. 2771/1999/EB ir Nr. 2799/1999/EB.

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Šis techninis reglamentas nustato pieno ir pieno produktų cheminės, fizikinės ir mikrobiologinės analizės metodų taikymo ir juslinio vertinimo tvarką, kuri atitinka numatytą Europos Sąjungos reglamentuose, priimtuose dėl bendros pieno ir pieno produktų rinkos organizavimo. Jis taip pat reglamentuoja kai kuriuos iš paminėtų metodų.

2. Techninio reglamento reikalavimai privalomi juridiniams ir fiziniams asmenims, organizuojant bendrąją rinką ir teikiant pieno produktus rinkai.

3. Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės metodų sąrašas pateikiamas šio techninio reglamento 1 priede.

II. PAMATINIŲ IR ĮPRASTINIŲ ANALIZĖS METODŲ TAIKYMO TVARKA

4. Įprastinių metodų taikymas:

4.1. Įprastiniai metodai gali būti taikomi su sąlyga, kad jie būtų kalibruojami ir reguliariai tikrinami pagal pamatinius metodus.

4.2. Įprastiniais metodais gauti rezultatai, kurie atitinka reglamentuojamas ribas, gali būti tikrinami pagal šio reglamento 2 priede nurodytą procedūrą.

4.3. Ginčo atveju lemia pamatiniu metodu gauti rezultatai.

5. Pamatinių metodų įteisinimas:

5.1. Pamatiniai metodai įteisinami, jeigu atitinka nustatytus tikslumo kriterijus dėl pakartojamumo ir atkuriamumo ribų.

5.2. Jeigu reglamentuojamas pamatinis analizės metodas nebuvo įteisintas šalyje, bandymų laboratorijos turi nustatyti laikinas atkuriamumo ribas. Tokios ribos nustatomos pagal šio techninio reglamento 3 priedo b) dalyje nurodytą arba jai lygiavertę procedūrą per 18 mėnesių nuo šio techninio reglamento įsigaliojimo. Atitikimas nustatytoms riboms turi būti tikrinamas ne rečiau kaip kartą per metus.

5.3. Kai įteisintais pamatiniais metodais arba metodais, kurių tikslumo ribos apibrėžtos laikinai, gauti rezultatai viršija nustatytas ribas, analizės rezultatai gali būti vertinami pagal šio techninio reglamento 4 priede aprašytą procedūrą, kad būtų nustatytas kritinis nuokrypis nuo minėtų ribų.

6. Analizės rezultatų pripažinimas:

6.1. Analizė turi būti atliekama laboratorijose, kuriose įdiegta vidinė kokybės kontrolė pagal šio techninio reglamento 5 priedo a) dalyje nurodytą procedūrą arba atitinkamą standartą. Detalus vidinei kokybės kontrolei taikomos procedūros aprašymas turi būti prieinamas laboratorijoje.

6.2. Laboratorijos turi nustatyti jų pasiekiamą tikslumą visiems metodams pagal šio techninio reglamento 5 priedo b) dalyje aprašytą procedūrą arba pagal atitinkamai įteisintą ir paskelbtą procedūrą, kurioje nustatytas pakartojamumas. Atkuriamumo ribos turi būti tikrinamos ne rečiau kaip kartą per metus pagal šio techninio reglamento 3 priedo a) dalyje nurodytą procedūrą. Šie reikalavimai netaikomi laboratorijoms, kurios dalyvauja metiniuose kvalifikacijos tikrinimo testuose.

6.3. Laboratorijoje atliktų bandymų protokole turi būti pakankamai informacijos apie atliktos analizės rezultatų įvertinimą, kaip nurodyta šio techninio reglamento 4 ir 6 prieduose.

7. Juslinis vertinimas:

7.1. Sviesto juslinio vertinimo ekspertų atranka, vertinimo rezultatų patikimumo patikrinimas ir sviesto juslinis vertinimas atliekami pagal žemės ūkio ministro 1999 m. gegužės 20 d. įsakymu Nr. 210 „Dėl privalomųjų kokybės reikalavimų patvirtinimo“ (Žin., 1999, Nr. 46-1467) patvirtintus Privalomuosius pieno riebalų produktų kokybės reikalavimus.

8. Mėginių ėmimas ir ginčai dėl analizės rezultatų:

8.1. Numatytai analizei atlikti turi būti imami dubliuoti mėginiai.

8.2. Turi būti taikoma šio techninio reglamento 6 priede nustatyta procedūra, jeigu analizės rezultatai yra ginčytini.

III. ANALIZĖS METODAI IR JŲ TAIKYMO SRITIS

9. Sviesto drėgmės, sausosios neriebalinės medžiagos ir riebalų kiekio nustatymas:

9.1. Sviesto drėgmės kiekiui nustatyti turi būti taikomas šio techninio reglamento 7 priede aprašytas pamatinis metodas.

9.2. Sviesto sausosios neriebalinės medžiagos kiekiui nustatyti turi būti taikomas šio techninio reglamento 8 priede aprašytas pamatinis metodas.

9.3. Sviesto riebalų kiekiui nustatyti turi būti taikomas šio techninio reglamento 9 priede aprašytas pamatinis metodas.

10. Atsekamųjų medžiagų nustatymas:

10.1. Vanilino kiekiui koncentruotame svieste, svieste ir grietinėlėje nustatyti turi būti taikomas šio techninio reglamento 10 priede aprašytas pamatinis metodas.

10.2. Etilo esterių ir beta-karotino rūgšties kiekiui koncentruotame svieste ir svieste nustatyti turi būti taikomas šio techninio reglamento 11 priede aprašytas pamatinis metodas.

10.3. sitosterolio ir stigmasterolio kiekiui svieste ir koncentruotame svieste nustatyti turi būti taikomas žemės ūkio ministro 2001 m. rugsėjo 28 d. įsakymu Nr. 341 „Dėl techninio reglamento patvirtinimo“ (Žin., 2001, Nr. 87-3040) patvirtinto Sitosterolio arba stigmasterolio nustatymo svieste arba koncentruotame svieste techniniame reglamente aprašytas pamatinis metodas.

10.4. Koncentruotas sviestas, sviestas ir grietinėlė yra tinkamai apdoroti (pridedant atsekamąsias medžiagas), jeigu gauti rezultatai atitinka 10.1, 10.2 ir 10.3 punktuose nurodytų dokumentų 8 punktų reikalavimus.

11. Karvių pieno kazeino nustatymas:

11.1. Siekiant užtikrinti, kad sūriuose, kurie turi būti gaminami vien tik iš avių, ožkų ar buivolių pieno arba iš šių gyvulių pieno mišinio, faktiškai nebūtų karvių pieno kazeino, jų kokybei tikrinti turi būti taikomas žemės ūkio ministro 2000 m. liepos 17 d. įsakymu Nr. 223 „Dėl techninių reglamentų patvirtinimo“ (Žin., 2000, Nr. 99-3145) patvirtinto Karvių pieno nustatymo ožkų piene ir iš ožkų pieno pagamintuose sūriuose analizės metodų techninio reglamento 1 priede aprašytas pamatinis analizės metodas.

Laikoma, kad sūriuose yra karvių pieno kazeino, jeigu karvių pieno kazeino kiekis tiriamajame mėginyje yra lygus arba didesnis negu etaloniniame mėginyje, kuriame yra 1 % karvių pieno.

11.2. Karvių pieno kazeinui aptikti 11.1 punkte nurodytuose sūriuose įprastiniai metodai gali būti taikomi su sąlyga, jeigu:

11.2.1. aptikimo riba yra 0,5 % arba žemesnė;

11.2.2. nepasitaiko neteisingų teigiamų rezultatų;

11.2.3. karvių pieno kazeinas nustatomas reikalaujamu jautrumu netgi po ilgų brandinimo periodų, kas paprastai būna įprastinėje prekyboje.

11.3. Jeigu neišpildomi 11.2.2 punkto reikalavimai, visi mėginiai turi būti analizuojami taikant pamatinį metodą.

Jeigu 11.2.3 punkto reikalavimai neišpildomi viename iš 11.1 punkte nurodytų sūrio tipų, toks sūris turi būti analizuojamas taikant pamatinį metodą.

12. Koliforminių bakterijų nustatymas:

12.1. Koliforminėms bakterijoms svieste, nugriebto pieno milteliuose, kazeine ir kazeinatuose nustatyti turi būti taikomas šio techninio reglamento 12 priede nurodytas pamatinis metodas.

12.2. Įprastiniai metodai gali būti taikomi su sąlyga, jeigu pagal juos gauti rezultatai yra panašūs kaip ir gauti 12.1 punkte nurodytu pamatiniu metodu. Įprastiniais metodais atliekamų nustatymų ribos turi būti tokios pačios kaip pamatinių metodų nustatymo ribos. Jeigu negalima išvengti tariamai neigiamų rezultatų, teigiami rezultatai turi būti patvirtinami pamatiniu metodu.

13. Laktozės kiekiui gyvūnams šerti vartojamuose produktuose (KPN kodas 2309) nustatyti taikomas šio techninio reglamento 13 priede aprašytas metodas.

14. Fermentinių išrūgų nustatymas:

14.1. Fermentinėms išrūgoms viešajam saugojimui (intervenciniams pirkimams) skirtuose pieno milteliuose nustatyti taikomas šio techninio reglamento 14 priede aprašytas metodas.

14.2. Fermentinėms išrūgoms gyvulių pašarams skirtuose nugriebto pieno milteliuose ir mišiniuose nustatyti taikomas šio techninio reglamento 15 priede aprašytas metodas.

15. Pasukų kiekiui nugriebto pieno milteliuose nustatyti taikomas šio techninio reglamento 16 priede aprašytas metodas.

16. Antibiotikų ir sulfonamido/dapsono likučiams nugriebto pieno milteliuose aptikti taikomas šio techninio reglamento 17 priede aprašytas metodas.

17. Nugriebto pieno miltelių kiekiui kombinuotuosiuose pašaruose nustatyti taikomas šio techninio reglamento 18 priede aprašytas metodas.

18. Krakmolui aptikti nugriebto pieno milteliuose, denatūruoto pieno milteliuose ir kombinuotuosiuose pašaruose taikomas šio techninio reglamento 19 priede aprašytas metodas.

19. Pašarams skirtų sausųjų pasukų drėgmės kiekiui nustatyti taikomas šio techninio reglamento 20 priede aprašytas metodas.

20. Pašaliniams riebalams aptikti pieno riebaluose taikomas šio techninio reglamento 21 priede aprašytas metodas.

SUDERINTA

Lietuvos valstybinės maisto ir veterinarijos

tarnybos direktorius

Kazimieras Lukauskas

2001 m. gruodžio 5 d.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

1 priedas

PAMATINIŲ ANALIZĖS METODŲ SĄRAŠAS

Vartojamos santrumpos:

SNM – sausosios neriebalinės medžiagos; LRR – laisvosios riebalų rūgštys; PS – peroksidų skaičius; I – išvaizda; Sk– skonis; Ks – konsistencija; BBS – bendras bakterijų skaičius; IDF – Tarptautinė pienininkystės federacija; ISO -Tarptautinė standartizacijos organizacija; IUPAC – Tarptautinė teorinės ir taikomosios chemijos sąjunga; ADPI – Amerikos pienininkystės institutas; SSP – saldintas sutirštintas pienas; SPG – sutirštintas pienas ir grietinėlė; SNPM -sausosios neriebalinės pieno medžiagos; PKR – privalomieji kokybės reikalavimai; KPN – Kombinuotoji prekių nomenklatūra; en – standartas, perimtas viršelio būdu.

A dalis:

Produktas, Europos Komisijos reglamentas ir jo reguliuojama sritis	Rodikliai	Ribos	ES taikomas pamatinis metodas	Lietuvoje galiojantis atitinkamas pamatinis metodas	Pastabos dėl reikalavimų taikymo šalyje
Nesūdytas sviestas, Nr. 2771/1999/EB, taikomas superkant sviestą laikyti pagal intervencines schemas	Pieno riebalai Drėgmė SNM LLR PS Koliforminės bakterijos Ne pieno riebalai Sterolo pėdsakai Kitų atsekamųjų medžiagų pėdsakai: vanilinas karotino rūgšties etilo esteris enanto rūgšties trigliceridai Juslinis įvertinimas Vandens dispersija	Ne mažiau kaip 82 % Ne daugiau kaip 16% Ne daugiau kaip 2 % Ne daugiau kaip 1,2 mmol/100 g riebalų Ne daugiau kaip 0,3 mekv. deguonies/1000 g riebalų Turi nebūti 1 g Neaptinkami trigliceridų analize Turi nebūti Turi nebūti Turi nebūti Turi nebūti Ne mažiau kaip 4 balai iš 5 už I, SkirKs Ne mažiau kaip 4 balai	Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 34) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001IX priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 30) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 X priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 32) LDF Standard 6B:1989 LDF Standard 74A:1991 (angliška versija), pieno riebalai atskiriami pagal LDF Standard 6B:1989 Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XVI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 60); mėginys ruošiamas pagal LDF Standard 122C:1996 arba LDF Standard 73A:1985 Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XXV priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 86) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XIV priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 42) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 35) Europos Komisijos reglamentas (EC) Nr. 213/2001 XIII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 39) IUPAC 2.301 5 skyrius Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 VII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 25) LDF Standard 112 A:l989	Sio techninio reglamento 9 priedas Šio techninio reglamento 7 priedas Šio techninio reglamento 8 priedas LST ISO 1740:1996 ISO 3976:1977, pieno riebalai atskiriami pagal LST ISO 1740:1996 Šio techninio reglamento 12 priedas; LSTIS0 5541/l:1996en; LSTIS0 5541/2:1996en; LSTENISO8261:2001en Šio techninio reglamento 21 priedas Sitosterolio arba stigmasterolio nustatymo svieste arba koncentruotame svieste techninis reglamentas, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2001-09-28 įsakymu Nr. 341 (Žin.,2001, Nr. 87-3040) Šio techninio reglamento 10 priedas Šio techninio reglamento 11 priedas Nėra Pieno riebalų produktų PKR, patvirtinti LR žemės ūkio ministro 1999-05-20 įsakymu Nr. 210(Žin.,1999, Nr. 46-1467) LST ISO 7586	Vertinti sviesto kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip
Nesūdytas sviestas, Nr. 2771/1999/EB, taikomas skiriant paramą už privatų sviesto saugojimą	Pieno riebalai Drėgmė	Ne mažiau kaip 82 % Ne daugiau kaip 16 %	Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 34) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 IX priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 30)	Sio techninio reglamento 9 priedas Pieno riebalų produktų PKR, patvirtinti LR žemės ūkio ministro 1999-05-20 įsakymu Nr. 210(Žin.,1999, Nr. 46-1467) Šio techninio reglamento 7 priedas	Vertinti sviesto, kurio privatų saugojimą remia valstybė, kokybę, jeigu nenurodyta kitaip
Produktas, Europos Komisijos reglamentas ir jo reguliuojama sritis	Rodikliai	Ribos	ES taikomas pamatinis metodas	Lietuvoje galiojantis atitinkamas pamatinis metodas	Pastabos dėl reikalavimų taikymo šalyje
Sūdytas sviestas, Nr. 2771/1999/EB, taikomas skiriant paramą už privatų sviesto saugojimą	Pieno riebalai Drėgmė Valgomoji druska	Ne mažiau kaip 80 % Ne daugiau kaip 16% Ne daugiau kaip 2 %	Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 34) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 IX priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 30) IDF Standard 12B:1988	Sio techninio reglamento 9 priedas Pieno riebalų produktų PKR, patvirtinti LR žemės ūkio ministro 1999-05-20 įsakymu Nr. 210(Žin.,1999, Nr. 46-1467) Šio techninio reglamento 7 priedas LSTISO 1738:2000	Vertinti sviesto, kurio privatų saugojimą remia valstybė, kokybę, jeigu nenurodyta kitaip
Nesūdytas sviestas, Nr. 2571/97/EB, taikomas parduodant sviestą iš intervencinių saugyklų sumažintomis kainomis, skiriant paramą už sviesto, grietinėlės ir koncentruoto sviesto sunaudojimąkonditerijos gaminių ir valgomųjų ledų gamyboje	Pieno riebalai Drėgmė Atsekamųjų medžiagų pėdsakai: sterolai vanilinas karotino rūgšties etilo esteris enanto rūgšties trigliceridai	Ne mažiau kaip 82 % Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 34) Ne daugiau kaip 16 % Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 IX priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 30) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XIV priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 42) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 35) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XIII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 39) IUPAC 2.301 5 skyrius		Sio techninio reglamento 9 priedas Šio techninio reglamento 7 priedas Sitosterolio arba stigmasterolio nustatymo svieste arba koncentruotame svieste techninis reglamentas, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2001-09-28 įsakymu Nr. 341 (Žin.,2001, Nr. 87-3040) Šio techninio reglamento 10 priedas Šio techninio reglamento 11 priedas Nėra	Vertinti sviesto kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip
Sūdytas sviestas, Nr. 2571/97/EB, taikomas skiriant paramą už sviesto sunaudojimąkonditerijos gaminių ir valgomųjų ledų gamyboje	Pieno riebalai Drėgmė Valgomoji druska Atsekamųjų medžiagų pėdsakai: sterolai vanilinas karotino rūgšties etilo esteris enanto rūgšties trigliceridai	Ne mažiau kaip 80 % Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 34) Ne daugiau kaip 16 % Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 IX priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 30) Ne daugiau kaip 2 % IDF Standard 12B:1988 Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XIV priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 42) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 35) Europos Komisijos reglamentas (EC) Nr. 213/2001 XIII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 39) IUPAC 2.301 5 dalis		Sio techninio reglamento 9 priedas Šio techninio reglamento 7 priedas LSTISO 1738:2000 Sitosterolio arba stigmasterolio nustatymo svieste arba koncentruotame svieste techninis reglamentas, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2001-09-28 įsakymu Nr. 341 (Žin.,2001, Nr. 87-3040) Šio techninio reglamento 10 priedas Šio techninio reglamento 11 priedas Nėra	Vertinti sviesto kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė
Koncentruotas sviestas, Nr. 2571/97/EB, taikomas skiriant paramą už sviesto, grietinėlės ir koncentruoto sviesto sunaudojimąkonditerijos gaminių ir valgomųjų ledų gamyboje	Pieno riebalai Drėgmė SNPM LLR PS Ne pieno riebalai	Ne mažiau kaip 99,8 % Ne daugiau kaip 0,2% Ne daugiau kaip 0,2% Ne daugiau kaip 0,35% (oleino) Ne daugiau kaip 0,5mekv. deguonies/1000 g riebalų Turi nebūti	IDF Standard 24:1964 IDF Standard 23A:1988 IDF Standard 24:1964 IDF Standard 6B: 1989 IDF Standard 74A:1991 (angliška versija), pieno riebalai atskiriami pagal IDF Standard 6B: 1989 Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XXV priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 86)	Nėra Nėra Nėra LSTISO 1740:1996 ISO 3976:1977; pieno riebalai atskiriami pagal LSTISO 1740:1996 Šio techninio reglamento 21 priedas	Vertinti koncentruoto sviesto kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip

Produktas, Europos Komisijos reglamentas ir jo reguliuojama sritis	Rodikliai	Ribos	ES taikomas pamatinis metodas	Lietuvoje galiojantis atitinkamas pamatinis metodas	Pastabos dėl reikalavimų taikymo šalyje
	Skonis	Grynas
	Kvapas	Turi nebūti pašalinio kvapo
	Kiti	Turi nebūti neutralizuojančių medžiagų, antioksidantų ir konservantų
	Atsekamųjų
	medžiagų pėdsakai:
	sterolai		Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XIV priedas (OJL37, 2001 02 07, p. 42)	Sitosterolio arba stigmasterolio nustatymo svieste arba koncentruotame svieste techninis reglamentas, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2001-09-28 įsakymu Nr. 341 (Žin.,2001, Nr. 87-3040)
	vanilinas		Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 35)	Šio techninio reglamento 10 priedas
	karotino rūgšties		Europos Komisijos reglamento (EC)	Šio techninio reglamento 11 priedas
	etilo esteris		Nr. 213/2001 XIII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 39)
	enanto rūgšties		JJJPAC 2.301 5 skyrius	Nėra
	trigliceridai
Grietinėlė, Nr. 2571/97/EB,	Riebalai	35%	IDF Standard 16C:1987	LST EN ISO 2450:2000en	Vertinti grietinėlės
taikomas skiriant paramą už	Atsekamųjų				kokybę, kai taikoma pirmoje
sviesto,	medžiagų pėdsakai:				skiltyje nurodyta rinkos
grietinėlės ir koncentruoto	sterolai		Neparengti pamatiniai metodai, galioja kompetentingų institucijų	Nėra	reguliavimo priemonė, jeigu
sviesto sunaudojimą			patvirtintos metodikos		nenurodyta kitaip
konditerijos gaminių ir	vanilinas		Europos Komisijos reglamento (EC)	Šio techninio reglamento 10 priedas
valgomųjų ledų gamyboje			Nr. 213/2001 XII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 35)
	karotino rūgšties		Neparengti pamatiniai metodai, galioja kompetentingų institucijų	Šio techninio reglamento 11 priedas
	etilo esteris		patvirtintos metodikos
	enanto rūgšties		IUPAC 2.301 5 skyrius	Nėra
	trigliceridai
Koncentmotas sviestas,	Pieno riebalai	Ne mažiau kaip 96 %	Neparengti pamatiniai metodai, galioja kompetentingų institucijų	Nėra	Vertinti koncentruoto sviesto
Nr. 429/90/EEB			patvirtintos metodikos		kokybę, kai taikoma pirmoje
taikomas skiriant paramą už	SNM	Ne daugiau kaip 2%	Neparengti pamatiniai metodai, galioja kompetentingų institucijų	Nėra	skiltyje nurodyta rinkos
koncentmoto sviesto			patvirtintos metodikos		reguliavimo priemonė, jeigu
tiesioginį suvartojimą	Atsekamųjų				nenurodyta kitaip
Bendrijoje	medžiagų pėdsakai:
	stigmasterolis (95%)	15 g/100 kg koncentruoto	Europos Komisijos reglamento (EC)	Sitosterolio arba stigmasterolio nustatymo
		sviesto	Nr. 213/2001 XIV priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 42)	svieste arba koncentruotame svieste techninis reglamentas, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2001-09-28 įsakymu Nr. 341 (Žin.,2001, Nr. 87-3040)
	stigmasterolis (85%)	17 g/100 kg koncentruoto	Europos Komisijos reglamento (EC)	Sitosterolio arba stigmasterolio nustatymo
		sviesto	Nr. 213/2001 XIV priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 42)	svieste arba koncentruotame svieste techninis reglamentas, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2001-09-28 įsakymu Nr. 341 (Žin.,2001, Nr. 87-3040)
	enanto rūgšties	1,1 kg/100 kg sviesto	IUPAC 2.301 5 skyrius	Nėra
	trigliceridai	koncentrato
	stigmasterolis ir	Pagal šio techninio	Europos Komisijos reglamentas (EC)	Sitosterolio arba stigmasterolio nustatymo
	sviesto rūgšties etilo	reglamento 22 priede	Nr. 213/2001 XIV priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 42)	svieste arba koncentruotame svieste
	esteris	pateiktas formules		techninis reglamentas, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2001-09-28 įsakymu Nr. 341 (Žin.,2001, Nr. 87-3040)
	lecitinas (E 322)	Ne daugiau kaip 0,5%	Kompetentingų institucijų patvirtinti metodai	Nėra
	Valgomoji druska	Ne daugiau kaip 0,75%	IDF Standard 12B:1988	LST ISO 1738:2000

Produktas, Europos Komisijos reglamentas ir jo reguliuojama sritis	Rodikliai	Ribos	ES taikomas pamatinis metodas	Lietuvoje galiojantis atitinkamas pamatinis metodas	Pastabos dėl reikalavimų taikymo šalyje
	LRR PS Skonis Kvapas Kiti	Ne daugiau kaip 0,35% (oleino) Ne daugiau kaip 0,5 mekv. deguonies/ 1000 g Grynas Turi nebūti pašalinio kvapo Turi nebūti neutralizavimo medžiagų antioksidantų ir konservantų	PDF Standard 6B:1989 PDF Standard 74A:1991 (angliška versija), pieno riebalai atskiriami pagal PDF Standard 6B: 1989	LST ISO 1740:1996 ISO 3976:1977, pieno riebalai atskiriami pagal LST ISO 1740:1996
Nesūdytas sviestas, Nr. 2191/81/EEB, taikomas ne pelno organizacijoms perkant sviestą sumažintomis kainomis	Pieno riebalai Drėgmė	Ne mažiau kaip 82% Ne daugiau kaip 16%	Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 34) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 IX priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 30)	Sio techninio reglamento 9 priedas Šio techninio reglamento 7 priedas	Vertinti sviesto kokybę, kai taikoma pirmame stulpelyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip
Sūdytas sviestas, Nr. 2191/81/EEB, taikomas ne pelno organizacijoms perkant sviestą sumažintomis kainomis	Pieno riebalai Drėgmė Valgomoji draska	Ne mažiau kaip 80% Ne daugiau kaip 16% Ne daugiau kaip 2%	Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 34) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 IX priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 30) PDF Standard 12B:1988	Sio techninio reglamento 9 priedas Šio techninio reglamento 7 priedas LST ISO 1738:2000	Vertinti sviesto kokybę, kai taikoma pirmame stulpelyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip
Sūris, pagamintas iš avių ir/arba ožkų pieno, Nr. 1255/1999/EB, taikomas įvertinant avių ir (arba) ožkų pieno sūrių kokybę skiriant paramą už minėtų sūrių privatų saugojimą ir kt.	Karvių pienas	<1%	Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XV priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 51)	Techninis reglamentas, nustatantis karvių pieno nustatymo ožkų piene ir iš ožkų pieno pagamintuose sūriuose analizės metodus, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2000-07-17 įsakymu Nr. 223 (Žin., 2001, Nr. 99-3145)	Vertinti iš avių arba ožkų pieno pagamintų sūrių kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip
Rūgštinis kazeinas, Nr. 2921/90/EEB 1 priedas, taikomas skiriant paramą už nugriebto pieno perdirbimą į kazeiną ir kazematus	Drėgmė Riebalai Laisvasis rūgštingumas	Ne daugiau kaip 12,00% Ne daugiau kaip 1,75% Ne daugiau kaip 0,30% (pieno rūgšties)	PDF Standard 78C:1991 PDF Standard 127A:1988 PDF Standard 91:1979	LST ISO 5550:1996 LST ISO 5543:1996 LST ISO 5547	Vertinti rūgštinio kazeino kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip
Fermentinis kazeinas, Nr. 2921/90/EEB 1 priedas, taikomas skiriant paramą už nugriebto pieno perdirbimą į kazeiną ir kazematus	Drėgmė Riebalai Pelenai	Ne daugiau kaip 12,00% Ne daugiau kaip 1,00% Ne mažiau kaip 7,50%	PDF Standard 78C:1991 PDF Standard 127A:1988 PDF Standard 90:1979	LST ISO 5550:1996 LST ISO 5543:1996 LST ISO 5545	Vertinti fermentinio kazeino kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip
Kazematai, Nr. 2921/90/EEB 1 priedas, taikomas skiriant paramą už nugriebto pieno perdirbimą į kazeiną ir kazematus	Drėgmė Pieno baltymai Riebalai Pelenai	Ne daugiau kaip 6,0% Ne mažiau kaip 88% Ne daugiau kaip 6,0% Ne daugiau kaip 6,0%	PDF Standard 78C:1991 PDF Standard 92:1979 PDF Standard 127A:1988 PDF Standard 89:1979 arba PDF Standard 90:1979	LST ISO 5550:1996 LST ISO 5549 LST ISO 5543:1996 Laktoproteinų (kazeinų ir kazematų), skirtų žmonėms vartoti, techninis reglamentas, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2000-06-19 įsakymu Nr. 188 (Žin., 2000, Nr. 52-1514) arba LST ISO 5545	Vertinti kazematų kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip

Produktas, Europos Komisijos reglamentas ir jo reguliuojama sritis	Rodikliai	Ribos	ES taikomas pamatinis metodas	Lietuvoje galiojantis atitinkamas pamatinis metodas	Pastabos dėl reikalavimų taikymo šalyje
Rūgštinis kazeinas, Nr. 2921/90/EEB 2 priedas, taikomas skiriant paramą už nugriebto pieno perdirbimą į kazeiną ir kazematus	Drėgmė Riebalai Laisvasis rūgštingumas BBS Koliforminės bakterijos Termofilinės bakterijos	Ne daugiau kaip 10,0% Ne daugiau kaip 1,5% Ne daugiau kaip 0,20% (pieno rūgšties) Ne daugiau kaip 30000/1 g Turi nebūti 0,1 g Ne daugiau kaip 5000/1 g	IDF Standard 78C:1991 IDF Standard 127A:1988 IDF Standard 91:1979 IDF Standard 100B:1991, mėginys ruošiamas pagal IDF Standard 122C:1996 arba IDF Standard 73A:1985 Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XVI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 60), mėginys ruošiamas pagal IDF Standard 122C:1996 arba IDF Standard 73A:1985 IDF Standard 100B:1991 mėginys ruošiamas pagal IDF Standard 122C:1996 arba IDF Standard 73A:1985, inkubuojama 48 h 55 „C temperatūroje saugant, kad neišdžiūtų terpė	LST ISO 5550:1996 LST ISO 5543:1996 LST ISO 5547 LST 1559:1998; LST ISO 6610:1996en, mėginys ruošiamas pagal LST EN ISO 8261:2001en Šio techninio reglamento 12 priedas; LST ISO 5541/1:1996en; LSTIS0 5541/2:1996en; LST EN ISO 8261:2001en LST 1559:1998; LST ISO 6610:1996en; mėginys ruošiamas pagal LST EN ISO 8261:2001en; inkubuojama 48 h 55 „C temperatūroje saugant, kad neišdžiūtų terpė	Vertinti rūgštinio kazeino kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip
Fermentinis kazeinas, Nr. 2921/90/EEB 2 priedas, taikomas skiriant paramą už nugriebto pieno perdirbimą į kazeiną ir kazematus	Drėgmė Riebalai Pelenai BBS Koliforminės bakterijos Termofilinės bakterijos	Ne daugiau kaip 8,0% Ne daugiau kaip 1,0% Ne daugiau kaip 7,5% Ne daugiau kaip 30000/1 g Turi nebūti 0,1 g Ne daugiau kaip 5000/1 g	IDF Standard 78C:1991 IDF Standard 127A:1988 IDF Standard 90:1979 IDF Standard 100B:1991, mėginys ruošiamas pagal IDF Standard 122C:1996 arba IDF Standard 73A:1985 Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XVI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 60), mėginys ruošiamas pagal IDF Standard 122C:1996 arba IDF Standard 73A:1985 IDF Standard 100B:1991, mėginys ruošiamas pagal IDF Standard 122C:1996 arba IDF Standard 73A:1985, inkubuojama 48 h 55 „C temperatūroje saugant, kad neišdžiūtų terpė	LST ISO 5550:1996 LST ISO 5543:1996 LST ISO 5545 LST 1559:1998; LST ISO 6610:1996en, mėginys ruošiamas pagal LST EN ISO 8261:2001en Šio techninio reglamento 12 priedas; LST ISO 5541/1:1996en; LSTIS0 5541/2:1996en; LST EN ISO 8261:2001en LST 1559:1998; LST ISO 6610:1996en; mėginys ruošiamas pagal LST EN ISO 8261:2001en; inkubuojama 48 h 55 „C temperatūroje saugant, kad neišdžiūtų terpė	Vertinti fermentinio kazeino kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip
Kazematai, Nr. 2921/90/EEB 2 priedas, taikomas skiriant paramą už nugriebto pieno perdirbimą į kazeiną ir kazematus	Drėgmė Pieno baltymai Riebalai Pelenai BBS Koliforminės bakterijos Termofilinės bakterijos	Ne daugiau kaip 6,0% Ne mažiau kaip 88,0% Ne daugiau kaip 6,0% Ne daugiau kaip 6,0% Ne daugiau kaip 30000/1 g Turi nebūti 0,1 g Ne daugiau kaip 5000/1 g	IDF Standard 78C:1991 IDF Standard 92:1979 IDF Standard 127A:1988 IDF Standard 89:1979 arba IDF Standard 90:1979 IDF Standard 100B:1991, mėginys ruošiamas pagal IDF Standard 122C:1996 arba IDF Standard 73A:1985 Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XVI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 60), mėginys ruošiamas pagal IDF Standard 122C:1996 arba IDF Standard 73A:1985 IDF Standard 100B:1991, mėginys ruošiamas pagal IDF Standard 122C:1996 arba IDF Standard 73A:1985, inkubuojama 48 h 55 °C temperatūroje saugant, kad neišdžiūtų terpė	LST ISO 5550:1996 LST ISO 5549 LST ISO 5543:1996 Laktoproteinų (kazeinų ir kazematų), skirtų žmonėms vartoti, techninis reglamentas, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2000-06-19 įsakymu Nr. 188 (Žin., 2000, Nr. 52-1514) arba LST ISO 5545 LST 1559:1998; LST ISO 6610:1996en, mėginys ruošiamas pagal LST EN ISO 8261:2001en Šio techninio reglamento 12 priedas; LST ISO 5541/1:1996en; LSTIS0 5541/2:1996en; LST EN ISO 8261:2001en LST 1559:1998; LST ISO 6610:1996en; mėginys ruošiamas pagal LST EN ISO 8261:2001en; inkubuojama 48 h 55 „C temperatūroje saugant, kad neišdžiūtų terpė	Vertinti kazematų kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip

Produktas, Europos Komisijos reglamentas ir jo reguliuojama sritis	Rodikliai	Ribos	ES taikomas pamatinis metodas	Lietuvoje galiojantis atitinkamas pamatinis metodas	Pastabos dėl reikalavimų taikymo šalyje
Kazematai, Nr. 2921/90/EEB 3 priedas, taikomas skiriant paramą už nugriebto pieno perdirbimą į kazeiną ir kazematus	Drėgmė Pieno baltymai Riebalai Laktozė Pelenai BBS Koliforminės bakterijos Termofilinės bakterijos	Ne daugiau kaip 6,0% Ne mažiau kaip 85,0% Ne daugiau kaip 1,5% Ne daugiau kaip 1,0% Ne daugiau kaip 6,5% Ne daugiau kaip 30000/1 g Turi nebūti 0,1 g Ne daugiau kaip 5000/1 g	PDF Standard 7 8C: 1991 IDF Standard 92:1979 PDF Standard 127A:1988 PDF Standard 106:1982 PDF Standard 89:1979 arba PDF Standard 90:1979 PDF Standard 100B:1991, mėginys ruošiamas pagal PDF Standard 122C:1996 arba PDF Standard 73A:1985 Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XVI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 60), mėginys ruošiamas pagal PDF Standard 122C:1996 arba PDF Standard 73A:1985 PDF Standard 100B:1991 mėginys ruošiamas pagal PDF Standard 122C:1996 arba IDF Standard 73A:1985, inkubuojama 48 h 55 „C temperatūroje saugant, kad neišdžiūtų terpė	LST ISO 5550:1996 LST ISO 5549 LST ISO 5543:1996 ISO 5548:1980 Laktoproteinų (kazeinų ir kazematų), skirtų žmonėms vartoti, techninis reglamentas, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2000-06-19 įsakymu Nr. 188 (Žin., 2000, Nr. 52-1514) arba LST ISO 5545 LST 1559:1998; LST ISO 6610:1996en, mėginys ruošiamas pagal LST EN ISO 8261:2001en Šio techninio reglamento 12 priedas; LST ISO 5541/1:1996en; LSTIS0 5541/2:1996en; LST EN ISO 8261:2001en LST 1559:1998; LST ISO 6610:1996en; mėginys ruošiamas pagal LST EN ISO 8261:2001en; inkubuojama 48 h 55 °C temperatūroje saugant, kad neišdžiūtų terpė	Vertinti kazematų kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip
Kombinuotieji pašarai ir nugriebto pieno milteliai (NPM), skirti gyvuliams šerti, Nr. 2799/1999/EB, taikomas skiriant paramą už nugriebto pieno miltelių sunaudojimą gyvuliams šerti	Drėgmė (rūgščių pasukų miltelių) Baltymai Drėgmė (NPM) Riebalai (NPM) Fermentinės išrūgos (NPM) Krakmolas (NPM) Drėgmė (mišiniuose) Riebalinės medžiagos (mišiniuose) Fermentinės išrūgos (mišiniuose) NPM kiekis (galutiniame produkte) Riebalai (galutiniame produkte)	Ne daugiau kaip 5,0% Ne mažiau kaip 31,4% sausųjų neriebalinių medžiagų Ne daugiau kaip 5,0% Ne daugiau kaip 11,0% Turi nebūti Turi nebūti Ne daugiau kaip 5,0 % sausosios neriebalinės medžiagos Turi nebūti Ne mažiau kaip 50% Ne mažiau kaip 2,5% arba 5 %	Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XXIV priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 84) PDF Standard 20B:1993 PDF Standard 26A:1993 PDF Standard 9C:1987 Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XIX priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 69) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XXIII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 83) PDF Standard 26A:1993 Europos Komisijos direktyva 84/4/EEC (OJ L 15, 1984 01 18, p. 28) (OJ L 015,1984 01 18, p. 28) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XIX priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 69) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XXII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 80) Europos Komisijos direktyva 84/4/EEC (OJ L 15, 1984 01 18, p. 28)	Sio techninio reglamento 20 priedas LST PDF Standard 20B:1995 Dehidratuoto konservuoto pieno, skirto žmonėms vartoti, techninis reglamentas, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2000-06-19 įsakymu Nr. 188 (Žin., 2000, Nr. 52-1514) LST EN ISO 1736 Šio techninio reglamento 15 priedas Šio techninio reglamento 19 priedas Nėra Nėra Šio techninio reglamento 15 priedas Šio techninio reglamento 18 priedas Nėra	Vertinti kombinuotųjų pašarų ir nugriebto pieno miltelių kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip

Produktas, Europos Komisijos reglamentas ir jo reguliuojama sritis	Rodikliai	Ribos	ES taikomas pamatinis metodas	Lietuvoje galiojantis atitinkamas pamatinis metodas	Pastabos dėl reikalavimų taikymo šalyje
	Krakmolas (galutiniame produkte)	Ne mažiau kaip 2 %	Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XXIII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 83)	Sio techninio reglamento 19 priedas
	Varis (galutiniame produkte)	25 ppm (mg/kg)	Dir. 78/633/EEC (OJ L 206,1978 07 29, p. 43)	Cinko bacitracino, flavofosfolipolio, mikroelementų – geležies, vario, mangano ir cinko kiekio pašaruose nustatymo techninis reglamentas, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2001-09-27 įsakymu Nr. 337 (Žin., 2001, Nr. 84-2952)
Purkštinio džiovinimo NPM Nr. 322/96/EB, taikomas superkant NPM laikymui pagal intervencines schemas	Riebalai Baltymai Drėgmė Rūgštingumas (0,1 mol/1 NaOH) Laktatai Fosfatazė Tirpumas Suskrudę dalelės BBS Koliforminės bakterijos Pasukos Fermentinės išrūgos Rūgščios išrūgos Antimikrobinės medžiagos	Ne daugiau kaip 1 % Ne mažiau kaip 31,4% SNM Ne daugiau kaip 3,5% Ne daugiau kaip 19,5 ml Ne daugiau kaip 150 mg/100 g Neigiama Ne daugiau kaip 0,5 ml, 24 °C temperatūroje Diskas B (ne mažiau kaip 15,0 mg) 40000/1 g Turi nebūti 0,1 g Turi nebūti Turi nebūti Turi nebūti	IDF Standard 9C:1987 IDF Standard 20B:1993 IDF Standard 26A:1993 IDF Standard 86:1981 IDF Standard 69B:1987 ISO 3356:1975 IDF Standard 129A:1988 ADPI:1990 IDF Standard 100B:1991, mėginys ruošiamas pagal IDF Standard 122C:1996 arba IDF Standard 73A:1985 Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XVI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 60), mėginys ruošiamas pagal IDF Standard 122C:1996 arba IDF Standard 73A:1985 Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XX priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 74) Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XVIII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 63) Kompetentingų institucijų patvirtintas metodas Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 XXI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 79)	LSTEN ISO 1736 LSTIDF20B:1995 Dehidratuoto konservuoto pieno, skirto žmonėms vartoti, techninis reglamentas, patvirtintas LR žemės ūkio ministro 2000-06-19 įsakymu Nr. 188 (Žin., 2000, Nr. 52-1514) LST ISO 6091 LST ISO 8069:1998 LST ISO 3356:1998 LST ISO 8156 Nėra LST 1559:1998; LST ISO 6610:1996en, mėginys ruošiamas pagal LSTEN ISO 8261:2001en Šio techninio reglamento 12 priedas; LSTIS0 5541/l:1996en; LSTIS0 5541/2:1996en; LSTEN ISO 8261:2001en Šio techninio reglamento 16 priedas Šio techninio reglamento 14 priedas Nėra Šio techninio reglamento 17 priedas	Vertinti NPM kokybę, kai taikoma pirmoje skiltyje nurodyta rinkos reguliavimo priemonė, jeigu nenurodyta kitaip

B dalis. Šioje dalyje išvardyti metodai pagal ES reglamentus: Nr. 2658/87/EEB, Nr.2414/98/EB, Nr. 174/1999/EB, Nr. 1374/98/EB, Nr. 2508/97/EB taikomi produktams importo, eksporto ir, jei nenurodyta kitaip, tarptautinių sutarčių atvejais

Produktas, KPN kodas	Parametras	Ribos	Pamatinis metodas	Lietuvoje galiojantis pamatinis metodas
Pienas ir grietinėlė nekoncentruoti, be cukraus ir kitų šaldiklių, 0401	Riebalai (< 6 %) Riebalai (> 6%)	Ribos nurodytos KPN	IDF Standard 1D:1996 IDF Standard 16C:1987	LSTISO1211:2000en LST EN ISO 2450:2000en
Pienas ir grietinėlė koncentruoti arba saldinti cukrumi arba kitais šaldikliais, 0402	Riebalai (skysti) Riebalai (kieti) Baltymai	Ribos nurodytos KPN	IDF Standard 13C:1987 IDF Standard 9C: 1993 IDF Standard 20B:1993	LSTEN ISO 1737 LSTEN ISO 1736 LST IDF Standard 20B:1995
	Sacharozė (normalus kiekis) Sacharozė (mažas kiekis) Sausosios medžiagos (SSP) Sausosios medžiagos (SPG)		IDF Standard 35A:1992 Nėra Europos ar tarptautinio pamatinio metodo, galioja kompetentingų institucijų patvirtintas metodas IDF Standard 15B:1991 IDF Standard 21B:1987	LST 1494:1997 Nėra LST ISO 6734:1998 LSTIDF21B:1996

Produktas, KPN kodas	Parametras	Ribos	Pamatinis metodas	Lietuvoje galiojantis pamatinis metodas
	Drėgmė (sausasis pienas ir grietinėlė)		IDF Standard 26A: 1993
Pasukos, raugintas pienas ar grietinėlė, koncentruoti arba nekoncentruoti, saldinti arba nesaldinti, 0403	Riebalai Baltymai Sacharozė (normalus kiekis) Sacharozė (mažas kiekis) Drėgmė (rūgščių pasukų milteliai) Drėgmė (saldžių pasukų milteliai) Sausosios medžiagos (kiti produktai)	Rbos nurodytos KPN	IDF Standard 1D:1996, IDF Standard 9C:1987, IDF Standard 16C:1987, IDF Standard 22B:1987 IDF Standard 126A:1988 IDF Standard 20B:1993 IDF Standard 35A: 1992 Nėra Europos ar tarptautinio pamatinio metodo, galioja kompetentingų institucijų patvirtintas metodas Europos Komisijos reglamentas (EC) Nr. 213/2001 XXIV priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 84) IDF Standard 26A: 1993 Nėra Europos ar tarptautinių pamatinių metodų, galioja kompetentingų institucijų patvirtinti metodai	LSTISO1211:2000en LSTEN ISO 1736 LST EN ISO 2450:2000en LSTEN ISO 7208:2000en ISO 8262/3:1987 LST 1494:1997 Nėra Šio techninio reglamento 20 priedas
Išrūgos, koncentruotos arba ne, saldintos cukrumi ar kitais šaldikliais; produktai, pagaminti iš natūralių pieno komponentų, 0404	Riebalai Baltymai Sacharozė (normalus kiekis)	Rbos nurodytos KPN Rbos nurodytos KPN	IDF Standard 9C:1987, IDF Standard 16C:1987, IDF Standard 22B:1987 IDF Standard 20B:1993 IDF Standard 35A: 1992	LSTEN ISO 1736 LST EN ISO 2450:2000en LSTEN ISO 7208:2000en LSTJX)F20B:1995 LST 1494:1997
0404 90	Sacharozė (mažas kiekis) Baltymai Drėgmė Sausosios medžiagos (Koncentruotų produktų)		Nėra Europos ar tarptautinio pamatinio metodo, galioja kompetentingų institucijų patvirtintas metodas IDF Standard 20B:1993 IDF Standard 26A: 1993 IDF Standard 15B:1991 IDF Standard 21B:1987	Nėra LST IDF Standard 20B:1995 LST ISO 6734:1998 ISO 6731:1989
Sviestas ir kiti pieno kilmės riebalai; tepamieji pieno riebalai, 0405	Riebalai O'eigu jų <85%)	Rbos nurodytos KPN	Europos Komisijos reglamento (EC)Nr. 213/2001 XI priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 34)	Šio techninio reglamento 9 priedas
Sviestas Lydytas sviestas	Drėgmė SNM Valgomoji druska Riebalai O'eigu jų >99%) Drėgmė (j'eigu riebalų > 99%)		Europos Komisijos reglamento (EC) Nr. 213/2001 IX priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 30) Europos Komisijos reglamento (EC)Nr. 213/2001 X priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 32) IDF Standard 12B:1988 IDF Standard 24:1964 IDF Standard 23A:1988	Sio techninio reglamento 7 priedas Šio techninio reglamento 8 priedas LST ISO 1738:2000 Nėra Nėra
Sūris ir varškė, 0406	Rebalai Sausosios medžiagos Sausosios medžiagos (sūris Ricotta) Valgomoji druska Laktozė	Rbos nurodytos KPN	IDF Standard 5B:1986 IDF Standard 4A: 1982 IDF Standard 58:1970 IDF Standard 88A:1988 IDF Standard 79B: 1991	LST ISO 1735:1997 LSTJX)F4A:1996 ISO 2920:1974 LST ISO 5943:2000 Nėra
Kombinuotieji pašarai, 2309	Laktozė	Rbos nurodytos KPN	Europos Komisijos reglamento (EC)Nr. 213/2001 XVII priedas (OJ L 37, 2001 02 07, p. 61)	Sio techninio reglamento 13 priedas

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių

analizės metodų taikymo

techninio reglamento

2 priedas

ĮPRASTINIAIS METODAIS GAUTŲ REZULTATŲ, KURIE YRA ARTIMI NURODYTIEMS SUDĖTIES IR KOKYBĖS REIKALAVIMŲ REGLAMENTUOSE, TIKRINIMO PROCEDŪRA

Jeigu m₀ yra riba, nurodyta sudėties ir kokybės reikalavimų reglamente, tai nustatymo

(sprendimo) ribai yra:

L = m₀;

jeigu R_įpr/R_pam<l;

R^ – įprastinio metodo atkuriamumo riba; R_pam – pamatinio metodo atkuriamumo riba. Jeigu m₀ yra viršutinė riba, o R^/R_{? llm} > 1, tai nustatymo riba apskaičiuojama pagal formulę:

L = m_c– [(R^ I R_pam) -1] x CrD_9i.

Jeigu tokiomis pačiomis sąlygomis m₀ yra apatinė riba, tai nustatymo riba apskaičiuojama pagal formulę:

L = m_c+[( R_įpr/R_pam)-l]xCrD₉₅;

kur CrD₉₅ – pamatinio metodo kritinis skirtumas (žr. 4 priedą).

Kai m₀ yra viršutinė riba, įprastiniu metodu gautas galutinis rezultatas, viršijantis nustatymo ribą, turi būti pakeičiamas pamatiniu metodu gautu galutiniu rezultatu. Šis galutinis rezultatas turi būti grindžiamas ne mažesniu skaičiumi analizių (mėginių) kaip įprastiniu metodu gautas galutinis rezultatas.

Kai m₀ yra apatinė riba, tokia pati procedūra turi būti taikoma įprastiniu metodu gautam galutiniam rezultatui, esančiam žemiau nustatymo ribos.

PASTABA. Aukščiau aprašyta metodika gali būti taikoma, jeigu nėra aptinkamų matricos efektų.

Matricos efektai gali būti aptinkami nustatant kiekvieno kalibravimui naudojamo mėginio analizės rezultatų, gautų pamatiniu ir įprastiniu metodu, skirtumą .

Standartinis nuokrypis, apskaičiuojamas pagal formulę:

kur m – kalibravimui naudojamų mėginių skaičius; palyginamas su pamatinio ir įprastinio metodų standartinių pakartojamumo nuokrypių aritmetiniu vidurkiu:

Matricos efekto negalima atmesti, jeigu:

kur:

f= m (f– laisvės laipsnių skaičius);

a-paklaidos tikimybė; a= 0,05.

Šiuo atveju reikia papildomo tyrimo, kad galėtų būti fiksuojama nustatymo riba.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių

analizės metodų taikymo techninio reglamento

3 priedas

ATKURIAMUMO RIBŲ NUSTATYMO PROCEDŪROS

a) Atitikimo su žinoma atkuriamumo riba nustatymo procedūra (cheminė analizė)

Kaip paisoma atkuriamumo ribos, tikrinama palyginant laboratorijos rezultatus su patyrusios laboratorijos“ rezultatais, gautais naudojant tapačius mėginius. Abiejose laboratorijose nustatymas atliekamas po du kartus, o rezultatai įvertinami pagal formulę:

kur:

CrD₉₅ -kritinis skirtumas (P = 0,95);

y-,      – dviejų 1-osios laboratorijos gautų rezultatų aritmetinis vidurkis;

y₂         – dviejų 2-osios laboratorijos gautų rezultatų aritmetinis vidurkis;

R       – atkuriamumo riba, nustatoma interpoliavimo būdu;

R       – pakartojamumo riba, jei tikslumas reikiamo lygio.

Jeigu kritinis skirtumas viršijamas, tai per du mėnesius turi būti atliktas kitas eksperimentas. Jeigu antrojo eksperimento rezultatai neatitinka atkuriamumo ribos, įgaliotos institucijos privalo imtis būtinų priemonių.

b) Laikinosios atkuriamumo ribos nustatymo procedūra (cheminė analizė)

Laikinoji atkuriamumo riba «_ki]c nustatoma pagal lygtį:

kur:

yt – dviejų 1-osios laboratorijos gautų rezultatų vidurkis;

y₂ – dviejų 2-osios laboratorijos gautų rezultatų vidurkis (žr. 3 a priedą);

r – pakartojamumo riba arba laikinoji pakartojamumo riba.

PASTABOS:

1. R_laik gali būti naudojama skaičiuojant kritinius skirtumus.

2. R_laik prilyginamas Ir, jeigu apskaičiuotoji R_laik vertė yra mažesnė kaip Ir.

Patyrusioj i laboratorija turėtų būti viena iš laboratorijų, sėkmingai dalyvavusių atestuojant tyrimų metodą arba sėkmingai pasirodžiusių tikrinant laboratorijų patyrimą.

3. Jeigu apskaičiuotoji vertė yra didesnė kaip 3r arba viršija IR, prognozuojamą iš Honvitz^*) lygties, tai R_laik vertė yra nepriimtinai didelė ir jos negalima naudoti kritiniam skirtumui skaičiuoti.

4. R_laik turi būti nustatomas mažiausiai kartą per metus remiantis dviejose laboratorijose gautais rezultatais (žr. 4 priedą).

5. Kritiniams skirtumams skaičiuoti turi būti naudojamas R_laik vidurkis. R_Mk vidurkiui taikomos 2-ojoje ir 3-iojoje pastabose nurodytos taisyklės.

Atkuriamumo riba (R vertė) gaunama iš apskaičiuotos RSDr vertės pagal formulę:

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių

analizės metodų taikymo techninio reglamento

4 priedas

ĮTEISINTAIS METODAIS GAUTŲ ANALIZĖS REZULTATŲ ĮVERTINIMO

PROCEDŪRA

Jeigu analizės rezultatas rodo, kad leidžiamoji riba yra viršijama, apskaičiuojamas dviejų ar daugiau gautų rezultatų aritmetinis vidurkis. Tai turi būti daroma taip:

1. Kai analizės rezultatas atitinka vienintelio nustatymo rezultatą, turi būti atliekama kita analizė pakartojamumo sąlygomis. Jeigu dvi analizės negali būti atliktos pakartojamumo sąlygomis, atliekamos papildomos dvi analizės pakartojamumo sąlygomis ir šie rezultatai naudojami įvertinti, ar paisoma kritinio skirtumo.

2. Nustatomas absoliutinis skirtumas tarp pakartojamumo sąlygomis gautų rezultatų aritmetinio vidurkio ir leistinos ribos. Jeigu skirtumo absoliutinė vertė viršija kritinį skirtumą, tai reiškia, kad analizuotas mėginys neatitinka reikalavimų.

Kritinis skirtumas nustatomas pagal formulę:

kur:    y                    – gautų rezultatų aritmetinis vidurkis;

mo                 – riba;

n                    – analizių (mėginių) skaičius.

Jeigu tikslumas reikiamo lygio, tai r iri? gali tekti nustatyti interpoliavimo būdu. Paprastai pateiktas galutinis mėginio analizės rezultatas turi rodyti, kad jis atitinka ribas. Galutiniai rezultatai:

– nuo m₀ iki m₀ + CrD₉₅ (| y -m₀\), jeigu riba yra maksimali;

– nuo m₀ iki m₀ – CrD₉₅ (| y -m₀\), jeigu riba yra minimali, gali pasitaikyti tik išimtinais atvejais.

Galutiniai rezultatai, patenkantys į minėtus ruožus, yra priimtini tik tuo atveju, jeigu pasitaiko ne daugiau kaip kartą iš kiekvienų penkių siuntos mėginių. Jeigu yra analizuojami mažiau kaip penki mėginiai iš siuntos, tai yra priimtinas tik vienas rezultatas, patenkantis į minėtus ruožus. Tačiau jeigu gamintojas pakartotinai tiekia siuntas, turi būti laikomasi taisyklės, kad gali būti priimtinas tik vienas rezultatas, patenkantis į minėtus ruožus per penkis tikrintus mėginius.

3. Jeigu galutinis rezultatas x yra apskaičiuojamas pagal formulę x=_yi±y₂ (pvz., skaičiuojant sviesto riebalų kiekį, reikia drėgmės plius sviesto sausosios neriebalinės medžiagos kiekio), o _yi ir y₂ yra vieno tipo analizių galutiniai rezultatai, tai x galutinių rezultatų pakartojamumas r_x ir atkuriamumas R_x apskaičiuojami taip:

kur r\ ir r₂ atitinkamaiyraj>i iry₂pakartojamumo ribos, o R\ ir R₂ – atkuriamumo ribos.

x palyginamas su m₀, vadovaujantis 1 ir 2 punktuose nurodytomis taisyklėmis. Kritinis skirtumas nustatomas pagal formulę:

kur x – gautų _Xl rezultatų aritmetinis vidurkis.

4. Jeigu galutinis rezultatas apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

(pavyzdys – sūrio sausosios medžiagos riebalų kiekis), o yi ir y₂ yra vieno tipo analizės galutiniai rezultatai, tai absoliučias pakartojamumo r_x ir atkuriamumo R_x ribas galima apskaičiuoti taip:

kur:

fti – riba arba norima vertė, atitinkanti >>i (pvz., riebalai);

ĮH – riba arba norima vertė, atitinkanti y₂ (pvz., sausoji medžiaga);

kur:

n – pakartojamumo riba, _yi;

r₂ – pakartojamumo riba, y₂;

kur:

Ri– atkuriamumo riba, yv,

R₂– atkuriamumo riba, y₂.

r_x ir R_x apskaičiavimo procedūros tinka tik tuo atveju, kai santykinės pakartojamumo ir atkuriamumo ribos (r₁*, R₁*, r₂*, R₂) yra ne didesnės kaip 0,15.

x yra lyginamas su riba įi_x vadovaujantis 1 ir 2 punktuose nurodytomis taisyklėmis. Kritinis skirtumas nustatomas pagal formulę:

kur x – chronologine tvarka^*) gautų x rezultatų aritmetinis vidurkis.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

5 priedas

VIDINĖ KOKYBĖS KONTROLĖ

a) Vidinės kokybės kontrolės (VKK; angį. IQC) procedūra (cheminė analizė)

Kontrolinės medžiagos apibūdinimas

VKK tikslams naudojama medžiaga tiriama visai pagal tokią pat arba iš dalies tokią pat

procedūrą kaip ir tikrinamos (tiriamosios) medžiagos.

Kontroline medžiaga gali būti:

sertifikuota etaloninė medžiaga;

savoji etaloninė medžiaga;

tarplaboratoriniais testais patvirtinta medžiaga;

medžiaga su pridėtu ieškomu komponentu.

VKK diegimo procedūra

Laboratorija turėtų diegti VKK pagal IUPAC dokumente „Vieningos vidinės kokybės kontrolės analizinėse laboratorijose taisyklės“ (Harmonized Guidelines for Internal Quality Control in analytical laboratories¹) aprašytą procedūrą.

VKK atliekama įterpiant kontrolines medžiagas į analizių seką arba kartojant tiriamojo mėginio analizę. Kontrolinių medžiagų cheminė sudėtis turi būti panaši kaip tiriamųjų mėginių, jos turi būti pakankamai stabilios reikiamą laiką. Turi būti akivaizdu, kad jos gali būti tinkamai padalytos į identiškas dalis su reikiamas ribas atitinkančia analitės koncentracija.

Kontrolinės medžiagos turi būti įterpiamos ne mažiau kaip vieną kartą į kiekvieną analizių seriją o gautos vertės turi būti atidedamos kontrolės diagramoje, kad būtų galima įvertinti ilgalaikes paklaidas. Be to, laboratorija turi periodiškai parodyti, kad analizių serijoje išlaikomos pakartojamumo sąlygos. Tai gali būti padaroma kartojant kontrolinės medžiagos ir (arba) tiriamosios medžiagos analizes. Šių analizių rezultatai turėtų būti palyginami su paskelbtais pakartojamumo duomenimis ir turimais pačios laboratorijos tikslumo duomenimis.

Kai naudojamos kontrolinės medžiagos, tai gautos kontrolinių medžiagų tarpserijinių analizių parametrų vertės turi būti atidedamos Shewhart'o diagramoje (ISO 8258:1991) su reikiamomis kontrolinėmis ribomis. Kontrolinės ribos turi būti nurodomos ties

kur s, – bendrasis standartinis nuokrypis;

o įspėjamosios ribos-ties:

Bendrasis standartinis nuokrypis:

kur:

s_b – tarpserijinis standartinis nuokrypis;

s_w – serijos standartinis nuokrypis;

n– analizių skaičius.

Tuo atveju, kai kontrolinės medžiagos nenaudojamos (pvz., dėl stabilumo stokos), kiekvienoje analizių serijoje mažiausiai vienos iš tiriamųjų medžiagų analizė turi būti kartojama.

Serijos dubliuojamų analizių (žr. 3 priedą) rezultatų absoliutusis skirtumas turi būti atidedamas diagramoje. Centrinė linija yra 1,128 s_w, žemutinė riba – 0, viršutinė kontrolinė riba -3,686 s_w. (Kur s_w yra serijos standartinis nuokrypis.)

Kai koncentracijos ribos plačios, kontrolės metodika turi numatyti mažos ir didelės koncentracijos medžiagas.

Jeigu tiriamosios medžiagos apima platų analitės koncentracijų ruožą laboratorija turi nustatyti ryšį tarp tikslumo ir koncentracijos lygio. Jeigu tikslumas yra proporcingas koncentracijai, tolesnė kontrolė turi būti grindžiama santykiniu tikslumu (t. y. absoliutiniu skirtumu, išreikštu vidurkio procentais).

Analizių sistemos būsena nekontroliuojama, jeigu yra bet kuri iš šių sąlygų:

a) diagramoje užrašoma vertė patenka už kontrolinių ribų;

b) užrašoma vertė ir ankstesnioji vertė patenka už perspėjamųjų ribų, bet lieka tarp kontrolinių ribų;

c) kai naudojamos kontrolinės medžiagos, – devynios iš eilės vertės patenka į tą pačią pusę nuo vidurkio linijos.

Į nekontroliuojamą būseną laboratorija turi reaguoti:

a) sustabdydama analizes, iki bus padaryti diagnostiniai tyrimai ir imtasi korekcinių veiksmų, arba

b) atmesdama rezultatų seriją ir pakartodama tiriamosios medžiagos analizę.

b) Savų kontrolinių medžiagų parinkimo ir pačios laboratorijos tikslumo ribų nustatymo procedūra (cheminė analizė)

Pačioje laboratorijoje tikslumo duomenys gali būti gauti kartotine kontrolinių medžiagų ir (arba) tiriamųjų mėginių analize.

Laboratorijos, nustatydamos analizių serijų rezultatų kitimo ir tarpserijinio kitimo tikslumo parametrus, vėliau naudojamus sudarant kontrolės diagramas, turi vadovautis toliau aprašoma procedūra. Laboratorijos gali pritaikyti ir kitokias procedūras su sąlyga, jeigu jas taikant gaunami duomenys yra patikimo tikslumo.

1. Kontrolinių medžiagų parinkimas

Kai laboratorija naudoja kontrolines medžiagas, pirmiausia turi būti sukaupiami duomenys, kad būtų galima nustatyti ribas. Kai įmanoma, turi būti naudojamos sertifikuotos etaloninės medžiagos (SEM). Galimos kontrolinės medžiagos turi būti analizuojamos pakartojamumo sąlygomis analizių serijoje, į seriją atsitiktine tvarka įterpiant tinkamas SEM, su pakartojimu. Kai šis būdas yra neįmanomas, laboratorijos turi stengtis dalyvauti patyrimo nustatymo testuose ir sutarimu nustatyti sutartinius vidurkius (priskirtines vertes), kurie gali būti laikomi sutartiniu tikruoju vidurkiu, kuriam būdinga tam tikra neapibrėžtis. Kitos procedūros numato tikrųjų verčių nustatymą skaičiuojant arba specialiai užkrėstų (angį spiked) kontrolinių medžiagų naudojimą.

Be to, kai laboratorija reguliariai atlieka tokias analizes ir jau yra įdiegusi statistinę kontrolę, kokios nors naujos kontrolinės medžiagos (pvz., reikalingos todėl, kad pasibaigė atsargos) turi būti parenkamos atsižvelgiant į analizes, kurios yra kontroliuojamos naudojant esamas medžiagas.

2. Ribų nustatymas

Turėdama parinktą kontrolinę medžiagą laboratorija turi naudoti ją nustatydama serijos ir tarpserijinio tikslumo parametrus.

Reikalaujama, kad nustatant tikslumą serijoje dviguba kontrolinės medžiagos analizė būtų atliekama mažiausiai 12 kartų. Dubliuojamos analizės turi būti daromos pakartojamumo sąlygomis, t. y. to paties analitiko, su tais pačiais reagentais ir t. t. Dubliuojamos kontrolinės medžiagos analizės turi būti įterptos į analizių seriją atsitiktine tvarka. Kiekviena dubliuojamoji analizė turi būti daroma atskirą dieną per laiko tarpą, kad teisingai atspindėtų kitimą tarp serijų, įvertinant normalius kitimus, pavyzdžiui, reagentų, matuoklių pakartotinio kalibravimo ir, jeigu reikia, skirtingų analitikų.

PASTABA. Duomenų, kurie netiksliai reprezentuoja tarpserijinį kitimą naudojimas gali lemti nereikalingą analizių kartojimą dėl nustatytų pernelyg griežtų ribų. Priešingai, laboratorija, pateikianti pernelyg netikslius tikslumo duomenis, gali negebėti atitikti pamatiniuose metoduose nustatytų ribų, gali pasirodyti kaip prastesnė lyginant su panašaus lygio laboratorijomis ir gali negauti numatytam tikslui tinkamų duomenų.

2.1. Tikslumo serijoje nustatymas

2.1.1. Tikslumas serijoje, kai naudojama kontrolinė medžiaga

Dubliuojami duomenys (mažiausiai 12 porų) pirmiausia turi būti tikrinami pagal Cochran'o didžiausiosios dispersijos kriterijų. Tai atitinka didžiausio dubliuojamų duomenų poros skirtumo kvadrato ir duomenų porų skirtumų kvadratų sumos santykį:

kur d¹– dubliuoj amų duomenų poros skirtumas.

Cochran'o kriterijaus c vertė lyginama su lentelėse pateiktomis vertėmis (ISO 5725:1994). Kai vertė gali būti priskirta išsimėčiusioms arba atmestinoms, toks rezultatas turi būti ištirtas, kad būtų nustatyta, ar tai yra, pavyzdžiui, techninė klaida, skaičiavimo klaida, apsirikimas atliekant analizę, blogo mėginio analizė. Jeigu išaiškinta techninės klaidos esmė yra tokia, kad ji rodo, jog abejotino rezultato negalima pakeisti, jis turi būti atmestas kaip tikrai netinkamas. Jeigu lieka išsimėčiusių arba atmestinų rezultatų, kurių neįmanoma paaiškinti, išsimėtę rezultatai yra laikomi tinkamais, o statistiškai atmestini atmetami. Laboratorija turi stengtis gauti papildomų rezultatų verčių.

Kai laboratorija jau yra įsitikinusi, kad nebėra atmestinų duomenų, serijos standartinis nuokrypis s_w gaunamas taip, kaip toliau aprašyta.

Kiekvienos iš p dubliuojamų duomenųporos x_ū, x_a suma

ir dubliuojamų duomenų skirtumas

apskaičiuojami ir susumuojami taip:

Serijos standartinis nuokrypis yra:

Laboratorijoje pasiekiamo tikslumo riba yra 2,8 s_w.

Jeigu naudojamas pamatinis metodas, laboratorijoje pasiekiamo tikslumo riba turi būti palyginama su paskelbta pakartojamumo riba. Laboratorija turi vykdyti pamatinio metodo reikalavimus. Jeigu pakartojamumo riba neatitinka, turi būti ištirtos neatitikimo priežastys.

Apibrėžtos ribos turi būti laikomos laikinomis ir peržiūrimomis.

2.1.2. Tikslumas serijoje, kai kontrolinės medžiagos nėra

Laboratorija gali nuspręsti nustatyti tikslumą serijoje dubliuojamomis reprezentatyviųjų mėginių analizėmis (mažiausiai 12 dubliuojamų analizių). Tais atvejais, kai neįmanoma naudoti kontrolinių medžiagų, pavyzdžiui, dėl nestabilumo, dubliuojami duomenys turi būti renkami pagal šį metodą.

PASTABA. Laikoma, kad šios analizės apima palyginti siaurą verčių ruožą todėl visiems mėginiams gali būti priskirta viena vertė. Tais atvejais, kai rezultatų ruožas yra platesnis, pavyzdžiui, viršija didumo eilę, o tikslumas priklauso nuo koncentracijos lygio, laboratorijos turi ištirti galimybę naudoti santykinius standartinius nuokrypius.

Duomenys turi būti tikrinami pagal Cochran'o kriterijų, kaip nurodoma 2.1.1. Kai laboratorija įsitikina, kad duomenys yra be atmestinųjų, serijos standartinis nuokrypis ir sava tikslumo riba gaunama taip, kaip aprašyta.

Serijos standartinis nuokrypis s_w gali būti naudojamas kontrolės diagramoms sudaryti (žr. 2 priedą). Apibrėžtos ribos turi būti laikomos laikinomis ir peržiūrimomis.

2.2. Tikslumo serijoje nustatymas

Apskaičiuojamas kiekvienos poros vidurkis sJ2 ir jie tikrinami pagal Grubbs'o kriterijų (ISO 5725:1994). Atmestinųjų ar išsimėčiusiųjų duomenų atmetimo ir priėmimo kriterijus yra toks, koks aprašytas 2.1.1 punkte. Laboratorija turi stengtis gauti pakaitinių verčių bet kuriam atmestam rezultatui pakeisti. Kai laboratorija jau yra įsitikinusi, kad duomenys yra be atmestinųjų, apskaičiuojamas tarpserijinis standartinis nuokrypis s_b

arba j is yra lygus nuliui, j eigų pošaknio reiškinio ženklas yra neigiamas.

Bendrasis standartinis nuokrypis s_h naudojamas n analizių vidurkio kontrolės diagramoms sudaryti (žr. 2 priedą). Apibrėžtos ribos turi būti laikomos laikinomis ir peržiūrimomis.

3. Pradinių ribų peržiūra

Kontrolinės ribos, apibrėžtos taip, kaip aprašyta anksčiau, turi būti laikomos pradiniais įverčiais.

Kad būtų galima atnaujinti ribų rinkinį, tai grindžiant priimtinų tikslumų serijoje (žr. 2.1.2), turi būti surinkta naujų dubliuojamų duomenų naudojant tiriamuosius mėginius. Laikotarpis iki

peržiūros priklausys mio analizių dažnio. Galima vadovautis nuostata, kad duomenys turi būti peržiūrimi, kai tik gaunami kiti 10 dubliuojamų duomenų. Tada visi tie duomenys turi būti tikrinami Cochran'o kriterijumi, o ribos iš naujo apibrėžiamos, jas grindžiant nauja standartinio nuokrypio verte. Kiti sprendimai dėl kontrolinių ribų galiojimo turi būti daromi pagal tolesnius duomenis.

Pradinių tarpserijinio tikslumo duomenų peržiūra taip pat priklauso nuo analizių dažnio. Galima vadovautis nuostata, kad pradinės prielaidos dėl standartinio nuokrypio ir vidurkio turi būti peržiūrimos, iš kontrolinės medžiagos analizių gavus kitus 10 duomenų taškų, kai dažnis yra viena analizė serijoje.

Visi šie duomenys turi būti tikrinami Grubbs'o kriterijumi ieškant atmestinųjų. Vidurkis ir standartinis nuokrypis turi būti perskaičiuojami iš naujų duomenų.

Be to, šiame tarpsnyje laboratorija turi taikyti Cusum'o diagramą (BS 5700:1984 ir keitimas 5480:1987), kad ištirtų bet kurias problemas, kurios gali būti susijusios, pvz., sų reagentų senėjimų. Bet kuris atskiras rezultatas, patenkantis už Cusųm'o „V-mask“ ribų, privalo būti ištirtas.

Naujos ribos (vidurkio ir standartinio nuokrypio) turi būti reguliariai kontroliuojamos Cusum'o metodu. Turi būti atidžiai ištiriami bet kurie požymiai, jeigu kontrolinės medžiagos galiojimas kelia abejonių.

4. Ataskaita apie tikslumo duomenis

Laboratorijos privalo siųsti kompetentingai nacionalinei institucijai informaciją, kurioje būtų tokie duomenys: taikytas metodas;

serijos standartinis nuokrypis s_w ir sava tikslumo riba; tarpserijinis standartinis nuokrypis s_b; bendrasis standartinis nuokrypis s,; analizių skaičius, panaudotas gaunant tikslumo duomenis.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

6 priedas

PROCEDŪRA, TAIKYTINA GINČYTINŲ ANALIZĖS REZULTATŲ ATVEJU (CHEMINĖ ANALIZĖ)

1. Kai pranešti pirmosios analizės rezultatai ginčytini, bandymų laboratorijai paprašius per septynias darbo dienas, gali būti atliekama papildoma analizė su sąlyga, jeigu turima užplombuotų dubliuojamų produkto mėginių ir jeigu jie buvo laikomi pagal kompetentingosios institucijos reikalavimus.

2. Kompetentingoji institucija siunčia tuos mėginius į kitą laboratoriją. Ta laboratorija privalo būti įgaliota atlikti oficialiąsias analizes ir turi būti įrodžiusi būtent tokių analizių kompetenciją. Ši kompetencija turi būti patvirtinta dokumentais, liudijančiais sėkmingai dalyvavus profesionalumo testuose arba palyginamuosiuose tarplaboratoriniuose bandymuose. Kita laboratorija turi taikyti pamatinį metodą. Abiejose laboratorijose gauti rezultatai turi būti įvertinami taip:

2.1. Kai abi laboratorijos atitinka pakartojamumo ir atkuriamumo reikalavimus: Abiejų laboratorijų gautų rezultatų aritmetinis vidurkis pateikiamas kaip galutinis rezultatas. Galutinis rezultatas įvertinamas apskaičiuojant kritinį skirtumą pagal tokią formulę:

kur:

y        – visų rezultatų, gautų abiejose laboratorijose, aritmetinis vidurkis;

m₀       – riba;

R       – atkuriamumas;

R       – pakartojamumas;

«i – 1 -osios laboratorijos gautų rezultatų skaičius; «₂ – 2-osios laboratorijos gautų rezultatų skaičius.

PASTABA. Jeigu galutinis rezultatas skaičiuojamas pagal formulę: x = y-\ ± j>2 arba x = y-\ I j>2 (žr. atitinkamai 4 priedo 3 ir 4 punktus), tada formulėje vietoj R ir r įrašoma

2.2. Kai abi laboratorijos atitinka pakartojamumo reikalavimus, bet neatitinka atkuriamumo reikalavimų:

Jeigu antroji analizė patvirtina pirmąją analizės rezultatas turi būti atmestas kaip netinkamas. Priešingu atveju turi būti priimtas.

2.3. Kai tik viena laboratorija atitinka pakartojamumo reikalavimus:

Sprendžiant, ar galima priimti analizės rezultatus, naudojamas vienos laboratorijos, atitinkančios pakartojamumo reikalavimus, galutinis rezultatas.

2.4. Kai nė viena laboratorija neatitinka pakartojamumo reikalavimų, bet atitinka atkuriamumo reikalavimus:

Taikomas 2.1 punktas.

2.5. Kai nė viena laboratorija neatitinka pakartojamumo reikalavimų arba atkuriamumo reikalavimų:

Analizės rezultatai turi būti priimti, jeigu vienos laboratorijos gauti rezultatai leidžia daryti tokią išvadą.

2.6. Kai rezultatai buvo gauti naudojant neatestuotus metodus:

Analizės rezultatai turi būti priimti, jeigu vienos laboratorijos gauti rezultatai leidžia daryti tokią išvadą.

3. Gautus antrosios analizės rezultatus kompetentingoji institucija turi nedelsdama pranešti analitikui. Jeigu analizės rezultatai atmetami, antrosios analizės išlaidas padengia analitikas.

4. Jeigu per penkias darbo dienas nuo mėginių paėmimo bandymų laboratorija (analitikas) gali įrodyti, kad mėginių ėmimas buvo netinkamas, mėginių ėmimas turi būti pakartotas, jeigu tai įmanoma. Jeigu mėginių ėmimas negali būti pakartotas, analizės rezultatai turi būti priimti.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

7 priedas

SVIESTO DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMO METODAS

1. Taikymo sritis

Šis metodas taikomas sviesto drėgmės kiekiui nustatyti.

2. Nuorodos

LST EN ISO 707. Pienas ir pieno produktai. Bandinių ėmimo taisyklės.

3. Apibrėžimas

Sviesto drėgmės kiekis – masės nuostolis, gautas užbaigus šioje metodikoje apibūdintą kaitinimo procesą, išreiškiamas gramais 100 gramų produkto.

4. Metodo esmė

Drėgmės išgarinimas iš su pemza sumaišyto sviesto mėginio 102 °C temperatūroje džiovinimo krosnelėje.

5. Įranga ir medžiagos:

Naudojama įprastinė ir toliau nurodyta laboratorinė įranga:

5.1. 1 mg tikslumo analizinės svarstyklės;

5.2. eksikatorius, kuriame yra tinkama drėgmę sugerianti medžiaga, pavyzdžiui, tik ką išdžiovintas silikagelis su drėgmės indikatoriumi;

5.3. džiovinimo krosnelė, ventiliuojama, termostatiškai palaikanti 102°C±2°C visoje darbo erdvėje;

5.4. stikliniai, porcelianiniai arba metaliniai (nerūdijantys) indeliai, kurių aukštis vidutiniškai 20 mm, skersmuo nuo 60 mm iki 80 mm;

5.5. pemzos granulės, išplautos, (0,8-10) mm skersmens.

6. Mėginių ėmimas pagal LST EN ISO 707.

7. Metodika:

7.1. Mėginio paruošimas: Uždaroje stiklinėje arba plastikinėje taroje esantis mėginys, užimantis nuo pusės iki dviejų

trečdalių jos tūrio, šildomas iki temperatūros, kurioje jis būtų pakankamai minkštas ir nesunkiai sumaišomas (mechaniniu maišikliu arba rankomis) iki vienalytės masės. Temperatūra neturėtų viršyti 35 °C. Mėginys atvėsinamas iki aplinkos temperatūros. Atvėsinus atidaroma mėginio tara ir, prieš sveriant mėginį, kiek galima greičiau (ne ilgiau kaip per 10 s) mėginys išmaišomas tinkama priemone, pvz., šaukštu arba mentele.

7.2. Drėgmės kiekio nustatymas:

7.2.1. į indelį (5.4) įpilama apie 10 g pemzos;

7.2.2. indelis su pemza džiovinamas krosnelėje (5.3) 102 °C ± 2 °C temperatūroje ne mažiau kaip 1 valandą.

PASTABA 7.2.2, 7.2.5 ir 7.2.7 punktuose minimas džiovinimo procesas prasideda, kai krosnelės temperatūra pasiekia 102 °C ± 2 °C;

7.2.3. indelis atvėsinamas eksikatoriuje iki kambario, kuriame sveriama, temperatūros ir pasveriamas 1 mg tikslumu;

7.2.4. į indelį 1 mg tikslumu atsveriamas maždaug 5 g mėginys;

7.2.5. indelis statomas į džiovinimo krosnelę (6.3), kurioje palaikoma 102 °C ± 2 °C temperatūra, ir paliekamas 3 vai.;

7.2.6. indelis atvėsinamas eksikatoriuje iki kambario, kuriame sveriama, temperatūros ir pasveriamas 1 mg tikslumu;

7.2.7. džiovinimo procesas atvėsinant ir sveriant indelį, kaip nurodyta 7.2.6 punkte, kartojamas kas valandą kol mėginio masė nebekinta (masės skirtumas neturi viršyti 1 mg).

Masei pradėjus didėti, skaičiuojant imama mažiausia jos vertė.

8. Rezultatų apskaičiavimas:

8.1. Apskaičiavimo metodas ir formulė:

drėgmės kiekis Wmasės procentais apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kur:

mo – indelio su pemza masė gramais (7.2.3);

nu – indelio su pemza ir mėginio prieš džiovinimą masė gramais (7.2.4);

m₂ – indelio su pemza ir mėginio po džiovinimo masė gramais (7.2.7).

Rezultatai užrašomi vieno skaitmens po kablelio tikslumu.

8.2. Pakartojamumas

Skirtumas dviejų atskirų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje ir naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 0,2 %.

8.3. Atkuriamumas

Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 0,3 %.

9. Bandymų protokolas

Bandymų protokole nurodomas taikomas metodas ir gauti rezultatai, taip pat visos (ir neprivalomos) metodikos, šioje metodikoje nenurodytos sąlygos bei visos aplinkybės, kurios galėjo daryti poveikį gautam rezultatui. Protokole išdėstoma visa informacija, reikalinga mėginiui identifikuoti.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

8 priedas

SVIESTO SAUSOSIOS NERIEBALINĖS MEDŽIAGOS KIEKIO NUSTATYMO

METODAS

1. Taikymo sritis

Šis metodas taikomas sviesto sausosios nenebalmės medžiagos kiekiui nustatyti.

2. Nuorodos

LST EN ISO 707. Pienas ir pieno produktai. Bandinių ėmimo taisyklės.

3. Apibrėžimas

Sviesto sausosios neriebalinės medžiagos kiekis – procentinė masės dalis, nustatoma apibūdintu metodu, išreiškiama gramais 100 gramų produkto.

4. Metodo esmė

Drėgmės išgarinimas iš tam tikro kiekio sviesto masės, riebalų ekstrahavimas petroleteriu ir likusios masės svėrimas.

5. Reagentas

Petroleteris, kurio virimo temperatūra tarp 30 °C ir 60 °C. Išgarinus 100 ml šio reagento, neturi likti daugiau kaip 1 mg nuosėdų.

6. Įranga ir medžiagos:

6.1. 1 mg tikslumo analizinės svarstyklės;

6.2. eksikatorius, kuriame yra tinkama drėgmei sugerti medžiaga, pavyzdžiui, tik ką išdžiovintas silikagelis su drėgmės indikatoriumi;

6.3. džiovinimo krosnelė, ventiliuojama, termostatiškai palaikanti 102 °C ± 2 °C visoje darbo erdvėje;

6.4. stikliniai, porcelianiniai arba metaliniai (nerūdijantys) indeliai, kurių aukštis vidutiniškai 20 mm, skersmuo nuo 60 mm iki 80 mm, su įdėtomis stiklinėmis lazdelėmis;

6.5. filtravimo tigliai su stikliniais filtrais, kurių porų skersmuo nuo 16 um iki 40 um, su siurbiamąja kolba.

7. Mėginių ėmimas pagal LST EN ISO 707.

8. Metodika:

8.1. Mėginio paruošimas:

Uždaroje stiklinėje arba plastikinėje taroje esantis mėginys, užimantis nuo pusės iki dviejų trečdalių jos tūrio, šildomas iki temperatūros, kurioje jis būtų pakankamai minkštas ir nesunkiai sumaišomas (mechaniniu maišikliu arba rankomis) iki vienalytės masės. Temperatūra neturėtų viršyti 35 °C. Mėginys atvėsinamas iki aplinkos temperatūros. Atvėsinus atidaroma mėginio tara ir, prieš sveriant mėginį, kiek galima greičiau (ne ilgiau kaip per 10 s) mėginys išmaišomas tinkama priemone, pavyzdžiui, šaukštu arba mentele.

8.2. Nustatymas:

8.2.1. indelis su lazdele (6.4) ir tiglis (6.5) džiovinamas krosnelėje (6.3) 1 valandą. Indelis, lazdelė ir tiglis atvėsinami eksikatoriuje iki kambario, kuriame sveriama, temperatūros ir pasveriami 1 mg tikslumu (mo).

PASTABA: Paprastai atvėsinimui užtenka 45 minučių. Jeigu analizuojama daugiau negu vienas tos pačios partijos sviesto mėginys, svarbu, kad kiekvieno iš jų analizei būtų naudojamas analogiškas indelio, lazdelės ir tiglio derinys;

8.2.2. tiglis nuimamas, indelis su lazdele pasveriami 1 mg tikslumu (m,);

8.2.3. į indelį 1 mg tikslumu atsveriama apie 5 g mėginio (8.1) (m₂);

8.2.4. indelis (su lazdele ir sviesto mėginiu) dedamas į džiovinimo krosnelę, kurioje nustatyta 102 °C ± 2 °C temperatūra, ir paliekamas per naktį;

8.2.5. indelis (8.2.3) atvėsinamas iki kambario temperatūros;

8.2.6. į indelį įpilama 15 ml šilto (maždaug 25 °C) petroleterio ir stikline lazdele atskiriama kiek galima daugiau nuosėdų, prilipusių prie indelio. Tirpalas perpilamas į tiglį ir leidžiama jam filtruotis įnusiurbimo kolbą;

8.2.7. procedūra (8.2.6) kartojama dar keturis kartus. Jeigu ant indelio sienelių nelieka riebalų likučių, ketvirtojo plovimo metu į tiglį perpilamos (be masės nuostolių) nuosėdos. Priešingu atveju procedūra (8.2.6) kartojama, iki riebalų likučių nelieka;

8.2.8. nuosėdos tiglyje perplaunamos 25 ml šilto petroleterio;

8.2.9. indelis, lazdelė ir tiglis (kartu) džiovinami krosnelėje (6.3) 102 „C i 2 „C temperatūroje 30 minučių;

8.2.10. indelis, lazdelė ir tiglis atvėsinami eksikatoriuje iki kambario, kuriame sveriama, temperatūros ir pasveriami 1 mg tikslumu. Procedūros (8.2.9 ir 8.2.10) kartojamos, kol indelio, lazdelės ir tiglio masė (m₃) nebekinta (masės skirtumai neturi viršyti 1 mg).

9. Rezultatų apskaičiavimas:

9.1. Sausosios neriebalinės medžiagos kiekio apskaičiavimas:

Sausosios neriebalinės medžiagos kiekis SNM masės procentais apskaičiuojamas pagal formulę:

kur:

mo-tuščio indelio su lazdele ir tiglio masė gramais (8.2.1);

mj -tuščio indelio su lazdele masė gramais (8.2.2);

m₂ – indelio su lazdele ir mėginiu masė gramais (8.2.3);

m₃ – galutinė indelio su lazdele ir filtravimo tiglio su nuosėdomis masė gramais (8.2.11).

Rezultatai apskaičiuojami vieno skaitmens po kablelio tikslumu.

9.2. Pakartojamumas

Skirtumas dviejų atskirų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje ir naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 0,1%.

9.3. Atkuriamumas

Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 0,2 %.

10. Bandymų protokolas

Bandymų protokole turi būti nurodomas taikomas metodas ir gauti rezultatai, taip pat visos (ir neprivalomos) metodikos, šioje metodikoje nenurodytos sąlygos bei aplinkybės, kurios galėjo daryti poveikį gautam rezultatui. Protokole išdėstoma visa informacija, reikalinga mėginiui identifikuoti.

PASTABA. Jeigu analizuojamas sūdytas sviestas, tai druska nustatoma kaip sausoji neriebalinė medžiaga. Norint nustatyti sausosios neriebalinės pieno medžiagos kiekį, pridėtos druskos kiekis turi būti atimtas iš sausosios neriebalinės medžiagos kiekio. Apskaičiuoto sausosios neriebalinės medžiagos kiekio rezultatų tikslumas:

pakartojamumas:    r = 0,104%;

atkuriamumas:        R = 0,206 %.

Rezultatų tikslumas, gautas nustatant sausąją neriebalinę medžiagą galioja tik nustatant sausąją neriebalinę pieno medžiagą.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

9 priedas

SVIESTO RIEBALŲ KIEKIO NUSTATYMO METODAS

Riebalų kiekis nustatomas ne tiesiogiai, o nustatant drėgmės kiekį pagal šio techninio reglamento 7 priedą ir sausosios neriebalinės medžiagos kiekį pagal šio techninio reglamento 8 priedą. Riebalų kiekis masės procentais bus lygus:

kur:

W – drėgmės kiekis masės procentais;

SNM – sausosios neriebalinės medžiagos kiekis masės procentais. Rezultatų tikslumas nustatant riebalus: pakartojamumas                 r = 0,22 %;

atkuriamumas                               R = 0,36 %.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

10 priedas

VANILINO KIEKIO KONCENTRUOTAME SVIESTE, SVIESTE ARBA GRIETINĖLĖJE

NUSTATYMO METODAS

1. Taikymo sritis

Metodas taikomas vanilino kiekiui koncentruotame svieste, svieste arba grietinėlėje nustatyti.

2. Metodo esmė

Žinomas mėginio kiekis ekstrahuojamas izopropanolio/etanolio/acetonitrilo mišiniu (1:1:2). Riebalai atšaldomi minus 15 °C – minus 20 °C temperatūroje, po to centrifuguojami.

Ekstraktą atskiedus vandeniu, vanilino kiekis nustatomas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu (ESCh, angį. trumpinys – HPLC).

3. Įranga:

Įprastinė ir toliau nurodyta laboratorinė įranga:

3.1. šaldiklis, kuriame palaikoma minus 15 °C – minus 20 °C temperatūra;

3.2. vienkartiniai 2 ml talpos švirkštai;

3.3. membraniniai mikrofiltrai, kurių poros 0,45 um dydžio, atsparūs tirpalui, kuriame yra 5 % ekstrakcijos tirpalo (4.4);

3.4. skysčių chromatografijos sistema, kurią sudaro: siurblys (srautas – l,0ml/min), inžektorius (20 ui įšvirkštimas automatiniu arba rankiniu būdu), UV detektorius (veikiantis esant 306 nm banga“ mažiausia skalės padalos vertė 0,01), savrrašis ir kolonėlės termostatas, nustatytas 25 °C;

3.5. analizinė kolonėlė (250 mm x 4,6 mm d_k), užpildyta LiChrospher RP 18 (Merck, vidutinis dalelių skersmuo 5 um) arba jai lygiavertė;

3.6. prieškolonė (apsauginė kolonėlė) (20 mm x 3 mm d_k), užpildyta Perisorb RP 18 (vidutinis dalelių skersmuo nuo 30 um iki 40 um) arba jai lygiavertė.

4. Reagentai: 4.1. izopropanolis;

4.2. 96 procentų (tūrio) etanolis;

4.3. acetonitrilas;

4.4. ekstrakcijos tirpalas: izopropanolis (4.1) sumaišomas su etanoliu (4.2) ir acetonitrilu (4.3) santykiu 1:1:2 (tūrio);

4.5. vanilinas (4-hidroksi-3-metoksibenzaldehidas):

4.5.1. pagrindinis vanilino tirpalas (500 ug/ml): į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 50 mg vanilino (4.5), įpilama 25 ml ekstrakcijos tirpalo (4.4) ir skiedžiama vandeniu iki žymės;

4.5.2. etaloninis vanilino tirpalas (10 ug/ml): pipete įpilama 5 ml pagrindinio vanilino tirpalo (4.5.1) į 250 ml matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki žymės;

4.6. metanolis, skirtas ESCh analizei;

4.7. ledinė acto rūgštis;

4.8. vanduo, skirtas ESCh analizei;

4.9. ESCh judančioji fazė: 1000 ml matavimo kolboje sumaišoma 300 ml metanolio (4.6), apie 500 ml vandens (4.8) ir 20 ml acto rūgšties (4.7) ir skiedžiama vandeniu (4.8) iki žymės. Mišinys filtruojamas per filtrą (3.3), kurio poros 0,45 um.

Visi naudojami reagentai turi būti analiziškai gryni.

5. Metodika:

5.1. Mėginio paruošimas:

5.1.1. sviestas: mėginys šildomas, kol pradeda lydytis. Vengiama perkaitinti per 40 °C. Kai mėginys tampa pakankamai plastiškas, jis homogenizuojamas purtant. Prieš paimant mėginį, sviestas maišomas 15 s. Į 100 ml talpos matavimo kolbą 1 mg tikslumu pasveriama apie 5 g (SM g) sviesto;

5.1.2. koncentruotas sviestas: prieš imant mėginį indas su koncentruotu sviestu įstatomas į krosnelę, įkaitintą nuo 40 °C iki 50 °C, kol visiškai išsilydo. Mėginys maišomas sukant arba maišant, kad nesusidarytų oro burbuliukų. Į 100 ml matavimo kolbą 1 mg tikslumu pasveriama apie

4 g (SM g) koncentruoto sviesto;

5.1.3. grietinėlė: mėginys Šildomas nuo 35 °C iki 40 °C temperatūros vandens vonioje arba termostate. Riebalai paskirstomi vienodai sukant arba, jei reikia, pamaišant. Mėginys greitai atšaldomas iki 20 °C + 2 °C. Mėginys turi būti homogeniškas, priešingu atveju procedūrą reikia pakartoti. Į 100 ml matavimo kolbą 1 mg tikslumu pasveriama apie 10 g (SM g) grietinėlės.

5.2. Tiriamojo tirpalo paruošimas:

Į mėginius (5.1.1, 5.1.2 arba 5.1.3) įpilama maždaug 75 ml ekstrakcijos tirpalo (4.4), maišoma arba smarkiai purtoma apie 15 min ir skiedžiama ekstrakcijos tirpalu (4.4) iki žymės. Apie 10 ml šio ekstrakto pilama į užkemšamą mėgintuvėlį. Mėgintuvėlis statomas į šaldiklį (3.1) ir laikomas jame apie 30 min. Atšaldytas ekstraktas centrifuguojamas 5 min maždaug 2000 aps/min greičiu ir tuoj pat dekantuojamas. Dekantuotam tirpalui leidžiama atvėsti iki kambario temperatūros. 5 ml dekantuoto tirpalo pipete įpilama į 100 ml matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki žymės. Tirpalas filtruojamas per membraninį mikrofiltrą (3.3). Toks filtratas yra paruoštas ESCh analizei.

5.3. Kalibravimas

Į 100 ml matavimo kolbą pipete įpilama 5 ml etaloninio vanilino tirpalo (4.5.2). Dar įpilama

5 ml ekstrakcijos tirpalo (4.4) ir skiedžiama vandeniu iki žymės. Tirpale yra 0,5 ug/ml vanilino.

5.4. Chromatografinis nustatymas:

Chromatografinei sistemai leidžiama stabilizuotis apie 30 min. Įšvirkščiama etaloninio tirpalo (5.3). Tai kartojama tol, kol dviejų, vienas po kito atliekamų įšvirkštimų smailės ploto arba smailės aukščio skirtumas yra mažesnis kaip 2 %. Šiomis sąlygomis vanilino sulaikymo trukmė yra maždaug 9 minutės. Etaloninis tirpalas (5.3) analizuojamas du kartus, kaskart įšvirkščiama po 20 ui tiriamųjų tirpalų (5.2). Nustatomas gautos vanilino smailės plotas arba aukštis. Po 10 tiriamųjų tirpalų (5.2) įšvirkštimų vėl du kartus analizuojamas etaloninis tirpalas (5.3).

6. Rezultatų apskaičiavimas:

Apskaičiuojamas vidutinis vanilino smailės plotas arba aukštis (AC) iš smailių, gautų atliekant po du kiekvieno tiriamojo tirpalo įšvirkštimus (iš viso keturi plotai).

Apskaičiuojamas perskaičiavimo koeficientas (angį. – response factor) (R):

R=AC/CM;

kur CM – vanilino masė miligramais tirpale (4.5.1); Vanilino (C) kiekis (mg/kg) tiriamajame mėginyje yra apskaičiuojamas pagal formulę:

kur:

AS – tiriamojo mėginio vanilino smailės plotas; SM-mėginio (5.1.1, 5.1.2 arba 5.1.3) masė gramais.

Kai vanilino kiekis nustatomas grietinėlėje, jis išreiškiamas mg/kg pieno riebalų. Dėl to C dauginamas iš 100/f kur/– grietinėlės riebumas masės procentais; 20 – etaloninio ir tiriamojo mėginio atskiedimo faktorius;

0,96 – pataisos koeficientas dėl riebalų kiekio pirmajame tiriamojo mėginio skiedime. PASTABA. Vietoj smailės ploto galima naudoti smailės aukštį (žr. 8.3).

7. Metodo tikslumas 7.1. Pakartojamumas(r)

Skirtumas dviejų atskirų analizių rezultatų gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 16 mg/kg;

7.2. Atkuriamumas (R)

Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 27 mg/kg.

8. Leistinas nuokrypis:

8.1. turi būti imami 3 tiriamojo produkto (su žinomu atsekamosios medžiagos priedu) mėginiai jo vienodumui patikrinti;

8.2. kaip atsekamoji medžiaga (angį tracer) naudojama vanilė arba sintetinis vanilinas:

8.2.1. 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehido pridėjimo norma yra 250 g/t koncentruoto sviesto arba sviesto, grietinėlei šios medžiagos pridėjimo norma – 250 g/t pieno riebalų;

8.2.2. trijų produkto mėginių analizės rezultatai, gauti tikrinant atsekamosios medžiagos (vanilino) pridėjimo normą ir pasiskirstymo vienodumą, [priimant kritinį verčių skirtumą su 95 % tikimybe (CrD₉₅)] yra lyginami tarp šių ribų:

– 221,5 mg/kg (95 % minimalios normos);

– 159,0 mg/kg (70 % minimalios normos).

Mažiausia atsekamosios medžiagos koncentracija yra naudojama interpoliuojant vertes tarp 221,5 mg/kg ir 159,0 mg/kg,

8.3. kaip atsekamoji medžiaga naudojama vanilė, gaunama tik iš vanilės pupelių arba jos ekstraktų:

8.3.1. 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehido pridėjimo norma yra 250 g/t koncentruoto sviesto arba sviesto, grietinėlei šios medžiagos pridėjimo norma – 250 g/t pieno riebalų;

8.3.2. trijų produkto mėginių analizės rezultatai, gauti tikrinant atsekamosios medžiagos (vanilino) pridėjimo normą ir pasiskirstymo vienodumą, [priimant kritinį verčių skirtumą su 95 % tikimybe (CrD₉₅)] yra lyginami tarp šių ribų:

– 79,0 mg/kg (95 % minimalios normos);

– 54,0 mg/kg (70 % minimalios normos).

Mažiausia atsekamosios medžiagos koncentracija mėginyje yra naudojama interpoliuojant vertes tarp 79,0 mg/kg ir 54,0 mg/kg.

PASTABOS:

1. Pakartojamumas r yra vertė, žemiau kurios absoliutus skirtumas tarp dviejų atskirų analizių rezultatų, gautų naudojant tą patį metodą ir identiškas medžiagas tomis pačiomis sąlygomis (ta pati įranga, ta pati laboratorija ir trumpas laiko tarpas), gali būti tikėtinas su tiksliai apibrėžta tikimybe; nesant kitų požymių, tikimybė yra 95 %.

2. Atkuriamumas R yra vertė, žemiau kurios skirtumas tarp atskirų analizių rezultatų, gautų naudojant tą patį metodą ir identiškas medžiagas skirtingomis sąlygomis (skirtingi operatoriai, įranga, laboratorijos ir/arba skirtingas laikas), gali būti tikėtinas su tiksliai apibrėžta tikimybe; nesant kitų požymių, tikimybė yra 95 %.

3. Nustatymas pridėto vanilino (250 mg/kg sviesto riebalų) svyruoja nuo 97,0 % iki 103,8 %. Nustatymo vidurkis buvo 99,9 % su standartiniu nuokrypiu 2,7 %.

4. Etaloniniame tirpale yra 5 % ekstrakcijos tirpalo, kompensuojančio smailės plėtimąsi, kurio priežastis – 5 % ekstrakcijos tirpalo, esančio tiriamuosiuose mėginiuose. Tai leidžia kiekį apskaičiuoti pagal smailės aukštį.

5. Šios analizės pagrindas – tiesinė kalibravimo linija, prasidedanti nuo koordinačių pradžios.

Ši priklausomybė turėtų būti tikrinama naudojant tinkamus etaloninio tirpalo (4.5.2) skiedinius analizės pradžioje, o toliau tai daroma vienodais laiko tarpais ir pakeitus arba pataisius ESCh įrangą.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

11 priedas

BETA-APO-8'-KAROTINO RŪGŠTIES ETILO ESTERIŲ NUSTATYMO SVIESTE IR KONCENTRUOTAME SVIESTE SPEKTROMETRINIS METODAS

1. Taikymo sritis

Šis metodas taikomas beta-apo-8'-karotmo rūgšties etilo esterių (apo-karotmo esterių) kiekiui svieste ir koncentruotame svieste nustatyti. Apo-karotino esteriai – tai visuma cheminių medžiagų, esančių pagal šią metodiką gautame mėginio ekstrakte ir absorbuojančių šviesą esant 440 nm bangos ilgiui.

2. Metodo esmė

Matuojama petroleteryje ištirpintų pieno riebalų absorbcija esant 440 nm bangos ilgiui. Apo-karotino esterių kiekis nustatomas remiantis kalibracine kreive.

3. Įranga:

3.1. Graduotos 0,25, 0,50, 0,75 ir 1,0 mlpipetės;.

3.2. Spektrofotometras, tinkamas naudoti esant 440 nm (ir 447 nm-449 nm), naudojant 1 cm optinio kelio ilgio kiuvetes.

3.3. 20 ml ir 100 ml matavimo kolbos.

3.4. Analizinės svarstyklės, kurių svėrimo paklaida ne didesnė kaip 0,1 mg. 4. Reagentai:

4.1. Apo-karotino esterių suspensija (apie 20 %):

4.1.1. suspensij os grynumas nustatomas tokiu būdu:

400 mg suspensijos atsveriama į 100 ml matavimo kolbą ir ištirpinama 20 ml chloroformo (4.4), ir kolba pripildoma iki žymės cikloheksanu (4.5). 5,0 ml šio tirpalo cikloheksanu praskiedžiama iki 100 ml (tirpalas A). 5,0 ml tirpalo A cikloheksanu praskiedžiama iki 100 ml. Gauto tirpalo absorbcija matuojama lyginant su cikloheksanu ir esant 447 nm-149 nm bangos ilgiui.

Apo-karotino esterių koncentracija (%) apskaičiuojama:

kur:

P        – suspensijos grynumas procentais,

A_m     – maksimali tiriamojo tirpalo absorbcija,

A       – mėginio masė gramais,

2550 – konstanta, nurodanti 1% suspensijos absorbciją 1 cm kiuvetėje. PASTABA. Apo-karotino esterių suspensija yra jautri šviesos, karščio ir atmosferos oro poveikiui. Neatidarytoje originalioje pakuotėje (uždarytoje azoto atmosferoje) suspensija šaltoje vietoje gali būti laikoma apie 12 mėn. Atidarius pakuotę, suspensiją reikia sunaudoti per trumpą laiką

4.1.2. apo-karotino esterių etaloninis tirpalas, apie 0,2 mg/ml:

0,1 mg tikslumu atsveriama 0,100 g apo-karotino esterių suspensijos (4.1.1) (Wg), ištirpinama petroleteryje (4.2), be nuostolių perpilama į 100 ml matavimo kolbą ir petroleteriu praskiedžiama iki žymės. Šio tirpalo apo-karotmo esterių koncentracija yra (WxP)/l 0 mg/ml.

PASTABA. Tirpalas laikomas šaltoje tamsioje vietoje ne daugiau kaip mėnesį.

4.2. Petroleteris (40 °C–60 °C);

4.3. Bevandenis granuliuotas natrio sulfatas, kuris prieš naudojimą 2 h džiovinamas 102 °C temperatūroje.

4.4. Chloroformas.

4.5. Cikloheksanas.

Visi naudojami reagentai turi būti analiziškai gryni. 5. Metodika:

5.1. Mėginio paruošimas:

5.1.1. koncentruoto sviesto mėginys išlydomas krosnelėje, kurioje nustatyta 45 °C temperatūra;

5.1.2. sviesto mėginys išlydomas krosnelėje, kurioje nustatyta 45 °C temperatūra, ir per filtrą, kuriame yra 10 g bevandenio natrio sulfato (4.3), filtruojamas į apsaugotą nuo šviesos indą palaikant apie 45 °C temperatūrą. Surenkamas pakankamas pieno riebalų kiekis.

5.2. Nustatymas

1 mg tikslumu pasveriama 1 g koncentruoto sviesto (arba išekstrahuotų pieno riebalų (5.1.2)) (Mg) ir be nuostolių perpilama į 20 ml (Vml) matavimo kolbą, praskiedžiama petroleteriu (4.2) iki žymės, gerai išmaišoma. Gauto tirpalo absorbcija matuojama lyginant su petroleteriu ir esant 440 nm bangos ilgiui. Pagal kalibracine kreivę nustatoma apo-karotino esterių koncentracija (C|ig/ml).

5.3. Kalibracine kreivė

Įpilama 0 ml, 0,25 ml, 0,5 ml, 0,75 ml ir 1,0 ml apo-karotino esterio etaloninio tirpalo (4.1.2) į penkias 100 ml matavimo kolbas. Praskiedžiama petroleteriu (4.2) iki žymės, gerai išmaišoma.

Apytikslė šių tirpalų koncentracija yra nuo 0 |ig/ml iki 2 (ig/ml. Tiksli tirpalų koncentracija apskaičiuojama lyginant su etaloninio tirpalo koncentracija (4.1.2) (WxP)/10 mg/ml. Gautų tirpalų absorbcija matuojama lyginant su petroleteriu (4.2) ir esant 440 nm bangos ilgiui.

Anty ašies atidedamos absorbcijos vertės, o apo-karotino esterių koncentracijos vertės – ant x ašies.

6. Rezultatų apskaičiavimas:

6.1. Apo-karotino esterio kiekis, išreikštas mg/kg, apskaičiuojamas taip:

koncentruotas sviestas:                (CxV)/M

sviestas:                                        0,82(CxV)/M

kur:

C       – apo-karotino esterio kiekis |ig/ml, pagal kalibracinę kreivę (5.3),

V       – tiriamo tirpalo (5.2) tūris mililitrais,

M      – mėginio masė (5.2) gramais,

0,82   – pataisos koeficientas, įvertinantis pieno riebalų kiekį svieste.

7. Metodo tikslumas: 7.1. Pakartojamumas:

7.1.1. sviesto analizė. Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 1,4 mg/kg;

7.1.2. koncentruoto sviesto analizė. Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 1,6 mg/kg.

7.2. Atkuriamumas:

7.2.1. sviesto analizė. Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 4,7 mg/kg;

7.2.2. koncentruoto sviesto analizė. Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 5,3 mg/kg.

PASTABA. Tyrimų tikslumas nustatytas 1995 metais vykusių tarplaboratorinių bandymų metu, dalyvaujant 11 laboratorijų, kurių kiekviena ištyrė 12 sviesto mėginių ir 12 koncentruoto sviesto mėginių.

8. Leistinas nuokrypis:

8.1. Apo-karotino esterio suspensijos pasiskirstymo vienodumui patikrinti turi būti imami trys produkto mėginiai.

8.2. Sviestas:

8.2.1. pridėjimo norma sviestui (įskaitant foninę absorbciją) yra 22 mg/kg;

8.2.2. trijų mėginių rezultatai, gauti tikrinant pridėto kiekio ir pasiskirstymo vienodumą, ir mažiausia gauta rezultato vertė yra lyginama su šiais reikalavimais [priimant kritinį verčių skirtumą su 95% tikimybe (DCr₉₅)]:

– 18,0 mg/kg (95% minimalios pridėjimo normos),

– 13,0 mg/kg (70% minimalios pridėjimo normos).

Mažiausia gauta apo-karotino koncentracijos vertė mėginyje turi būti naudojama interpoliuojant vertes tarp 18,0 mg/kg ir 13,0 mg/kg. 8.3. Koncentruotas sviestas:

8.3.1. pridėjimo norma koncentruotam sviestui (įskaitant foninę absorbciją) yra 24 mg/kg;

8.3.2. trijų mėginių rezultatai, gauti tikrinant pridėto kiekio ir pasiskirstymo vienodumą, ir mažiausia gauta rezultato vertė yra lyginama su šiais reikalavimais [priimant kritinį verčių skirtumą su 95% tikimybe (DCr₉₅)]:

– 20,0 mg/kg (95% minimalios pridėjimo normos),

– 14,0 mg/kg (70% minimalios pridėjimo normos).

Mažiausia gauta apo-karotino koncentracijos vertė mėginyje turi būti naudojama interpoliuojant vertes tarp 20,0 mg/kg ir 14,0 mg/kg.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

12 priedas

KOLIFORMINIŲ BAKTERIJŲ NUSTATYMO SVIESTE, NUGRIEBTO PIENO MILTELIUOSE, KAZEINE IR KAZEINATUOSE METODAS

Normatyvinės nuorodos:

LST ISO 5541-1:1996 en Pienas ir pieno produktai. Koliforminių bakterijų skaičiavimas.

1 dalis: Kolonijų skaičiaus nustatymas 30 °C temperatūroje.

LST ISO 5541-2:1996 en Pienas ir pieno produktai. Koliforminių bakterijų skaičiavimas.

2 dalis: Labiausiai tikėtino skaičiaus nustatymas 30 °C temperatūroje.

LST EN ISO 8261:2001en Pienas ir pieno produktai. Bendrieji tiriamųjų mėginių, pradinių suspensijų ir dešimtkarčių skiedinių ruošimo mikrobiologiniams tyrimams reikalavimai.

Nustatymas

1 g sviesto mėginiai sėjami į mitybinę terpę, jeigu koliforminės bakterijos nustatomos svieste.

0,1 g mėginiai sėjami į mitybinę terpę, jeigu koliforminės bakterijos nustatomos nugriebto pieno milteliuose arba kazeine ir kazematuose.

Analizė atliekama pagal LST ISO 5541-2:1996, taikant šias modifikacijas:

1. Mėginiai ruošiami pagal LST EN ISO 8261:2001en. Rūgštinio kazeino mėginiams ruošti taip pat gali būti taikoma LST ISO 5541-1:1996 aprašyta mėginių paruošimo procedūra.

2. Inkubuojami ir vertinami tiktai mėgintuvėliai, į kuriuos pasėta 1 g sviesto ir 0,1 g sausojo nugriebto pieno, kazeino ar kazematų mėginiai. Dešimtkarčiai skiediniai nedaromi.

Rezultatų vertinimas:

Trys neigiami rezultatai:                            atitinka reikalavimus;

Du arba trys teigiami rezultatai:                neatitinka reikalavimų;

Du neigiami rezultatai:                              ištiriami dar du mėginiai atitinkamai po 1 g

(sviesto) arba 0,1 g (nugriebto pieno

miltelių,kazeino ar kazematų);

atitinka reikalavimus, jeigu paskutiniai

du rezultatai neigiami. Kitu atveju reikalavimų

neatitinka.

PASTABOS:

1. Koliforminių bakterijų kiekis vidutiniškai: 1/10 g sviesto; l/g nugriebto pieno miltelių arba kazeino ir kazematų – tai reikalavimų atitikimą rodantys rezultatai, gauti su 93 % tikimybe.

2. Koliforminių bakterijų kiekis vidutiniškai: l/g sviesto; 1/0,1 g nugriebto pieno miltelių arba kazeino ir kazematų – tai reikalavimų neatitikimą rodantys rezultatai, gauti su 91 % tikimybe.

[Daroma prielaida, kad galioja Puasono (Poisson) skirstinys].

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

13 priedas

LAKTOZĖS KIEKIO NUSTATYMO METODAS GYVŪNŲ PAŠARAMS VARTOJAMUOSE PRODUKTUOSE¹

1. Taikymo sritis

Metodas taikomas tais atvejais, kai laktozės kiekis didesnis nei 0,5 %.

2. Metodo esmė

Mielėms (Saccharomyces cerevisiae) veikiant vandenyje ištirpintus sacharidus laktozė lieka nesuskaldyta. Tirpalą nuskaidrinus ir nufiltravus laktozės kiekis nustatomas Luff-Schoorl metodu.

3. Reagentai

3.1. Dinatrio tiosulfato 0,05 mol/1 tirpalas.

3.2. Indikatorius: krakmolo tirpalas. Jis paruošiamas 5 g tirpiojo krakmolo sumaišant su 30 ml vandens (galima dėti 10 mg gyvsidabrio dijodido kaip konservanto). Gautas mišinys supilamas į 1 1 verdančio vandens, maišant virinamas 3 minutes ir paliekamas atvėsti.

3.3. Kalio jodido apie 30 % (30 g/100 ml) tirpalas.

3.4. Sulfato rūgšties 3 mol/1 tirpalas.

3.5. Luff-Schoorl reagentas:

a) vario (II) sulfato tirpalas. 25 g vario sulfato pentahidrato (CuS0₄-5H₂0) (neturinčio geležies) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 100 ml;

b) citrinų rūgšties tirpalas. 50 g citrinų rūgšties monohidrato (C₆H₈0₇-H₂0) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 50 ml;

c) dinatrio karbonato tirpalas. 143,8 g bevandenio dinatrio karbonato (Na₂C0₃) ištirpinama 300 ml karšto vandens, atvėsinama.

Atsargiai maišant b tirpalas pilamas į c tirpalą tada įpilamas a tirpalas. Praskiedžiama iki 1 1, leidžiama stovėti per naktį ir tada filtruojama. Patikrinama tokiu būdu gauto reagento molingumas (Cu 0,05 mol/1, Na₂C0₃ 1 mol/1). pH turėtų būti maždaug 9,4.

3.6. Carrez tirpalas I: 23,8 g cinko acetato dihidrato Zn (C₂H₃0₂)₂-2H₂0 ir 3 g ledinės acto rūgšties (CHjCOOH) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 100 ml.

3.7. Carrez tirpalas II: 10,6 g kalio heksacianoferato (II) trihidrato K4Fe(CN)₆-3H₂0 ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 100 ml.

3.8. Pemzos granulės, virintos druskos rūgšties tirpale, išplautos vandeniu taip, kad visiškai neliktų rūgšties, ir išdžiovintos.

3.9. Saccharomyces cerevisiae suspensija: 25 g šviežių mielių ištirpinama 100 ml vandens (šaldytuve laikoma ne ilgiau kaip savaitę).

4. Analizė:

4.1. 1 g tiriamojo mėginio pasveriama 1 mg tikslumu ir supilama į 100 ml matavimo kolbą. Įpilama nuo 25 ml iki 30 ml vandens. Kolba trisdešimt minučių laikoma verdančio vandens vonioje, po to atvėsinama iki maždaug 35 °C temperatūros.

4.2. Į kolbą su mėginiu įpilama 5 ml mielių suspensijos² ir sukratoma. Matavimo kolba su mišiniu dvi valandas paliekama 38 °C^Į0 °C temperatūros vandens vonioje.

4.3. Po fermentacijos kolba su mišiniu atvėsinama iki maždaug 20 °C temperatūros. Įpilama 2,5 ml Carrez tirpalo I, maišoma pavartant trisdešimt sekundžių, po to įpilama 2,5 ml Carrez tirpalo II ir vėl maišoma pavartant trisdešimt sekundžių. Po to praskiedžiama vandeniu iki 100 ml, sumaišoma ir filtruojama. Pipete paimamas ne didesnis kaip 25 ml filtrato kiekis, apytikriai turintis nuo 40 mg iki 80 mg laktozės; jeigu reikia, vandens papildoma iki 25 ml ir Luff-Schoorl metodu nustatomas bevandenės laktozės kiekis.

4.4. Atliekamas visas tuščias bandymas tik su mielėmis.

5. Laktozės kiekio nustatymas Luff-Schoorl metodu:

5.1. Į 300 ml Erlenmejerio kolbą pipetėmis įpilama 25 ml Luff-Schoorl reagento ir tiksliai išmatuoti 25 ml skaidraus tiriamojo tirpalo.

5.2. Įdėjus dvi pemzos granules ranka purtant kaitinama virš atviros vidutinio aukščio liepsnos. Tirpalas turi užvirti per dvi minutes. Nedelsiant Erlenmejerio kolba dedama ant asbestinio tinklelio, po kuriuo liepsna buvo anksčiau uždegta. Patikrinama, kad būtų kaitinamas tiktai Erlenmejerio kolbos dugnas, tada uždedamas ant kolbos grįžtamasis šaldytuvas. Nuo užvirimo momento virinama tiksliai dešimt minučių. Nedelsiant atšaldoma šaltame vandenyje ir maždaug po penkių minučių tiriama taip:

5.2.1. į tirpalą įpilama 10 ml kalio jodido, po to nedelsiant, bet atsargiai (kadangi gali labai putoti) įpilama 25 ml 3 mol/1 sulfato rūgšties. Titruojama su dinatrio tiosulfatu, kol atsiranda geltona matinė spalva; titravimo pabaigoje dedamas krakmolo indikatorius;

5.2.2. tas pats titravimas atliekamas su tiksliai 25 ml Luff-Schoorl reagento ir 25 ml vandens (vietoj tiriamojo tirpalo) mišiniu, įpylus 10 ml kalio jodido ir 25 ml sulfato rūgšties, šį kartą nevirinant.

Produktams, turintiems daugiau nei 40 % fermentuojamo cukraus, suspensijos kiekis padidinamas.

6. Naudojantis lentele nustatomas laktozės kiekis mg, atitinkantis dviejų tyrimų rezultatų skirtumus (išreikštus 0,05 mol/1 dinatrio tiosulfato mililitrais).

25 ml Luff-Schoorl reagento lentelė

Dinatrio tiosulfato 0,05 mol/1 tirpalas	Laktozė Ci2H22Oii2		Dinatrio tiosulfato 0,05 mol/1 tirpalas	Laktozė Ci2H22Oii2
ml	mg	skirtumas	ml	mg	skirtumas
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8	12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

14 priedas

FERMENTINIŲ IŠRŪGŲ APTIKIMAS VIEŠAJAM SAUGOJIMUI SKIRTUOSE NUGRIEBTO PIENO MILTELIUOSE: GLIKOMAKROPEPTIDŲ NUSTATYMAS EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS (ESCh) METODU

1. Taikymo sritis

Šiuo metodu, nustatant glikomakropeptidus, galima aptikti fermentines išrūgas viešajam saugojimui skirtuose nugriebto pieno milteliuose.

2. Nuorodos

LST EN ISO 707:1999. Pienas ir pieno produktai. Bandinių ėmimo taisyklės.

3. Apibrėžimas

Glikomakropeptidų kiekis nugriebto pieno milteliuose: glikomakropeptidų kiekis, išreikštas masės procentais, nustatytas toliau aprašytu metodu.

4. Metodo esmė

Nugriebto pieno milteliai regeneruojami, paveikus trichloracto rūgštimi atskiriami baltymai ir riebalai, kurie nusodinami centrifuguojant. Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESCh) metodu nustatomas glikomakropeptidų (GMP) kiekis. Gautas rezultatas sulyginamas su etaloninių miltelių, kuriuose nėra fermentinių išrūgų arba yra žinomas jų kiekis, tyrimo rezultatu.

5. Reagentai:

5.1. Trichloracto rūgšties tirpalas. 240 g trichloracto rūgšties (CCl₃COOH) ištirpinama nedideliame vandens kiekyje ir praskiedžiama iki 1000 ml.

5.2. Eliuentas, pH 6,0. 1,74 g dikalio hidrofosfato (K2HPO4), 12,37 g kalio dihidrofosfato (KH2PO4) ir 21,41 g natrio sulfato (Na₂S0₄) ištirpinama maždaug 700 ml vandens. Eliuento pH reguliuojamas fosforo rūgšties arba kalio hidroksido tirpalu. pH turi būti 6,0 vnt. Praskiedžiama vandeniu iki 1000 ml ir homogenizuojama. Prieš vartojimą eliuento tirpalas filtruojamas per membraninį filtrą, kurio akučių skersmuo 0,45 um.

5.3. Plovimo tirpalas. Iš vienos dalies acetonitrilo (CH3CN) ir devynių dalių vandens paruošiamas tirpalas. Prieš vartojimą tirpalas filtruojamas per membraninį filtrą, kurio akučių skersmuo 0,45 um;

PASTABA. Gali būti naudojamas ir kitas antiseptinis tirpalas, jei jis neblogina kolonėlės skiriamosios gebos.

5.4. Etaloniniai mėginiai:

5.4.1. nugriebto pieno milteliai, atitinkantys nustatytus reikalavimus [0];

5.4.2. tie patys nugriebto pieno milteliai, į kuriuos įmaišyta 5 % (pagal masę) fermentinių išrūgų miltelių [5].

Visi reagentai turi būti analiziškai gryni, vanduo – distiliuotas arba tokio pat grynumo.

6. Įranga:

6.1. Analizinės svarstyklės.

6.2. Centrifuga, galinti išvystyti 2200 x g išcentrinę jėgą, su maždaug 25 ml talpos užkemšamomis centrifugavimo kiuvetėmis.

6.3. Mechaninė purtyklė.

6.4. Magnetinė maišyklė.

6.5. Apie 7 cm skersmens stikliniai piltuvai.

6.6. Vidutinės filtravimo gebos, maždaug 12,5 cm skersmens popieriniai filtrai.

6.7. Filtravimo per stiklinį filtrą įranga su 0,45 um akučių skersmens membraniniu filtru.

6.8. 10 ml graduotos pipetės (ISO 648, A klasė arba ISO/R 835).

6.9. Vandens vonia, kurioje palaikoma pastovi 25 °C±0,5 °C temperatūra.

6.10. Efektyviosios skysčių chromatografijos įranga:

6.10.1. siurblys;

6.10.2. rankinis arba automatinis švirkštas, kurio talpa nuo 15 ui iki 30 ui;

6.10.3. dvi nuosekliai sujungtos TSK 2000-SW-LKB (arba ekvivalentiškos) kolonėlės (ilgis – 30 cm, vidinis skersmuo 0,75 cm) su prieškolone (3 cm x 0,3 cm), užpildyta I 125 arba ekvivalentiško efektyvumo medžiaga;

6.10.4. termostatas kolonėlėms, kuriame palaikoma 35 °C±1 °C temperatūra;

6.10.5. keičiamo bangos ilgio ultravioletinių spindulių (UV) detektorius, kuriuo galima matuoti esant 205 nm bangos ilgiui, esant 0,008 A jautrumui;

6.10.6. integratorius.

PASTABA. Kolonėles galima laikyti kambario temperatūroje, tačiau jų skiriamoji galia bus šiek tiek mažesnė. Šiuo atveju temperatūra bet kuriame analizės etape neturi skirtis daugiau kaip ± 5 „C.

7. Mėginių ėmimas:

7.1. Mėginiai imami pagal LST EN ISO 707.

7.2. Mėginiai laikomi tokiomis sąlygomis, kad nebūtų sugadinti ar kitaip pakitę.

8. Metodika

8.1. Mėginio ruošimas tyrimui:

Milteliai suberiami į indą su sandariu dangčiu, kuris tuoj pat uždaromas. Indo tūris turi būti maždaug dvigubai didesnis už miltelių tūrį. Vartant uždarytą indą, milteliai gerai sumaišomi.

8.2. Tiriamoji mėginio dalis:

Į centrifugos kiuvetę (6.2) atsveriama 2,000 g+ 0,001 g tiriamojo mėginio.

8.3. Riebalų ir baltymų pašalinimas:

8.3.1. Į kiuvetę su tiriamuoju mėginiu įpilama 20 g šilto (50 °C) vandens. Milteliai ištirpinami purtant juos 5 minutes mechanine purtykle (6.3). Atvėsinama iki 25 °C.

8.3.2. Maišant magnetine maišykle (6.4), per 2 minutes įpilama 10,0 ml trichloracto rūgšties tirpalo (5.1). Kiuvetė įstatoma į vandens vonią (6.9) ir laikoma joje 60 minučių.

8.3.3. Centrifugoje (6.2), esant 2200 x g išcentrinei jėgai, sukama 10 minučių arba filtruojama per popierinį filtrą (6.6). Pirmieji 5 ml filtrato išpilami.

8.4. Chromatografmis nustatymas:

8.4.1. Į ESCh (6.10) įšvirkščiama nuo 15 ui iki 30 ui tiksliai pamatuoto nucentrifuguoto arba nufiltruoto tirpalo (8.3.3). Nustatomas 1,0 ml per minutę eliuento (5.2) greitis.

Darant ilgesnę nei 24 valandų pertrauką kolonėles reikia išplauti vandeniu, po to mažiausiai tris valandas plauti plovimo tirpalu (5.3), nustačius 0,2 ml per minutę srauto greitį. PASTABOS:

1. Eliuento tirpalo (5.2) temperatūra analizės metu turi būti 85 °C, siekiant išlaikyti jį degazuotą ir išvengti bakterijų dauginimosi. Galima naudoti bet kurias kitas, panašiai veikiančias, priemones.

2. Darant pertrauką kolonėles reikia išplauti vandeniu. Jokiu būdu negalima palikti jose eliuento (5.2).

8.4.2. Mėginio [E] tyrimo rezultatai užrašomi chromatograma, kurios smailės identifikuojamos pagal sulaikymo trukmę RT taip:

II smailė:                antroji chromatogramos smailė, kurios RT yra apie 12,5 minučių;

III smailė:               trečioji chromatogramos smailė, atitinkanti GMP, kurios RT yra 15,5+1,0 minučių;

IV smailė:               ketvirtoji chromatogramos smailė, kurios RT yra apie 17,5 minučių. Kolonėlių kokybė gali turėti įtakos atskirų smailių sulaikymo trukmei. Integratorius (6.10.6) automatiškai skaičiuoja smailių plotus A:

A_n:     II smailės plotas;

A_m:    III smailės plotas;

Arv:   IV smailės plotas.

Prieš kiekybinę duomenų interpretaciją labai svarbu išnagrinėti kiekvieną chromatograma ir atmesti visus labai išsiskiriančius rezultatus, galėjusius atsirasti arba dėl įrenginio bei kolonėlių darbo sutrikimų arba dėl nagrinėjamo tiriamojo mėginio rodiklių.

Jei yra abejonių tyrimas kartojamas.

8.5. Kalibravimas:

8.5.1. Nuo 8.2 iki 8.4.2 nurodyti veiksmai tiksliai pakartojami, tiriamąjį mėginį pakeičiant etaloniniais mėginiais (5.4).

Tam naudojami tik ką paruošti tirpalai, nes 8 % acto rūgštyje GMP skyla. Esant 30 °C temperatūrai, skilimo greitis yra 0,2 % per valandą.

8.5.2. Prieš mėginių analizę kolonėlės kondicionuojamos, etaloninį mėginį (5.4.2) kelis kartus įšvirkščiant į tirpalą (8.5.1), kol GMP atitinkančios smailės plotas ir sulaikymo trukmė tampa pastovūs.

8.5.3. Perskaičiavimo koeficientai R nustatomi įšvirkščiant tokius pat filtratų (8.5.1) kiekius, kaip ir tiriant mėginį.

9. Rezultatų apdorojimas.

9.1. Skaičiavimo metodas ir formulės:

9.1.1. Smailių perskaičiavimo koeficientų skaičiavimas:

II ir IV smailių perskaičiavimo koeficientai;

etaloninio mėginio [0] atitinkami II ir IV smailių plotai, nustatyti 8.5.3 p.

III smailės perskaičiavimo koeficientas; etaloninių mėginių [0] ir [5] III smailių plotai; išrūgų kiekis etaloniniame mėginyje [5], t. y. 5.

9.1.2. Mėginio [E] smailių santykinių plotų skaičiavimas:

kur:

S_n [E], ĄrfE], S_/F[E]                     – mėginio [E] II, III ir IV smailių santykiniai plotai;

A_M[ElA_m[E] iiAjrfE]                    – mėginio [E] II, III ir IV smailių plotai, gauti 8.4.2 p.

R_n, Riii, Riv– 9.1.1 p. apskaičiuoti perskaičiavimo koeficientai.

9.1.3. Mėginio [E] III smailės santykinės sulaikymo trukmės skaičiavimas:

kur:

RRTn[E] -mėginio [E] III smailės santykinė sulaikymo trukmė; RTjjj[E] – mėginio [E] III smailės, gautos 8.4.2, sulaikymo trukmė; RTm[5] – mėginio [5] III smailės, gautos pagal 8.5.3, sulaikymo trukmė.

9.1.4. Eksperimentais nustatyta, kad tarp III smailės santykinės sulaikymo trukmės RRTin [E] ir fermentinių išrūgų miltelių kiekio procentais, kai jų dedama iki 10 %, yra tiesinė priklausomybė.

RRTn][E] yra < 1,000, kai išrūgų kiekis yra >5%; RRTn][E] yra > 1,000, kai išrūgų kiekis yra <5 %. RRTjjj vertėms leistina neapibrėžtis yra ±0,002.

Normali RRTm [0] vertė yra artima 1,034. Atsižvelgiant į kolonėlių būklę, ši vertė gali priartėti prie 1,000, tačiau ji visuomet turi būti didesnė už 1.

9.2. Fermentinių išrūgų miltelių kiekis mėginyje procentais skaičiuojamas pagal formulę:

W = Sw[E] – [1,3 + (S_m[0] – 0,9)]

kur:

W                            – fermentinių išrūgų kiekis masės procentais tiriamame mėginyje [E];

Sw[E]                     – santykinis mėginio [E] III smailės plotas, apskaičiuotas 9.1.2 p.;

1,3                              – vidutinis santykinis III smailės plotas, išreikštas fermentinių išrūgų

gramais 100 gramų miltelių, nustatytas įvairios kilmės nefalsifikuotuose nugriebto pieno milteliuose. Šis skaičius gautas eksperimentiniu būdu; S,“m – santykinis III smailės plotas, kuris yra lygus Rm x Am[0]. Šios vertės gautos pagal 9.1.1 ir 8.5.3 atitinkamai;

(S_m[0] – 0,9)            – pataisa vidutiniam santykiniam plotui 1,3, jei Sm [0] nėra lygus

0,9.Bandymais nustatyta, kad vidutinis santykinis etaloninio mėginio [0] III smailės plotas yra lygus 0,9.

9.3. Metodo tikslumas:

9.3.1. Pakartojamumas

Skirtumas tarp dviejų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas, turi būti ne didesnis kaip 0,2 % masės dalimis.

9.3.2. Atkuriamumas

Skirtumas tarp dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas, turi būti ne didesnis kaip 0,4 % masės dalimis.

9.4. Rezultatų aiškinimas:

Konstatuojama, kad fermentinių išrūgų mėginyje nėra, jei santykinis III smailės plotas Sw[E], išreikštas fermentinių išrūgų gramais 100 gramų produkto, yra < 2,0 + (SjrfO] – 0,9);

kur:

2,0 – didžiausias galimas santykinis III smailės plotas, atsižvelgiant į santykinį III smailės

plotą, t. y. 1,3, ir neapibrėžti dėl nugriebto pieno miltelių sudėties kitimo bei metodo atkuriamumą (9.3.2);

(S_m[0] – 0,9)– pataisa, kai plotas Sm [0] nėra lygus 0,9 (žr. 9.2 p.).

9.4.2. Jei III smailės santykinis plotas Sm [E] yra > 2,0 + (Sm [0] – 0,9) ir II smailės santykinis plotas Sn [E] < 160, fermentinių išrūgų kiekis nustatomas, kaip nurodyta 9.2 p.

9.4.3. Jei III smailės santykinis plotas SnI [E] yra > 2,0 + (Sm [0] – 0,9) ir II smailės santykinis plotas SM [E] < 160, nustatomas bendras baltymų kiekis (P %) ir analizuojami 1 ir 2 paveikslai.

1 pav. III smailės santykinio ploto priklausomybė nuo baltymų kiekio

9.4.3.1. Duomenys, gauti analizuojant nefalsifikuotus nugriebto pieno miltelius, kuriuose yra didelis baltymų kiekis, pateikti 1 ir 2 pav. grafikuose.

Ištisine linija pavaizduota tiesinė regresija, kurios koeficientai apskaičiuoti mažiausių kvadratų metodu.

Punktyrine linija pažymėta viršutinė III smailės santykinio ploto riba, kuri nebuvo peržengta 90 % tyrimų.

1 ir 2 pav. punktyrinėmis linijomis pavaizduotų grafikų lygtys:

(1 pav.)

(2 pav.)

kur:

S_m – III smailės santykinis plotas, apskaičiuotas pagal bendrą baltymų kiekį arba pagal santykinį smailės Sn [E] plotą;

P % – bendras baltymų kiekis masės procentais;

S_n[E] – mėginio smailės santykinis plotas, apskaičiuotas pagal 9.1.2 p. Šios lygtys atitinka skaičių 1,3, aptartą 9.2.

2 pav. Priklausomybė tarp II ir III smailių santykinių plotų nugriebto pieno milteliuose

Skirtumai tarp nustatyto santykinio ploto 5į/[E] ir santykinio ploto Sm (Ji ir T2) reiškiami lygtimis:

T₁ = Sin[E] – [(0,376 P% – 10,7) + Sm[0] – 0,9)]

T₂ = Sm[E] – [(0,0123 Sn[E] + 0,93) + (SHI[0] – 0,9)]

9.4.3.2. Jei Ti ir/arba T2 yra lygūs arba mažesni už nulį, fermentinių išrūgų aptikti negalima. Jei Ti ir T2 yra didesni už nulį, fermentinių išrūgų yra. Fermentinių išrūgų kiekis apskaičiuojamas pagal formulę:

W=T2+ 0,91

kur:

0,91 – atstumas vertikalioje ašyje tarp ištisinės ir punktyrinės linijų.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

15 priedas

FERMENTINIŲ IŠRŪGŲ KIEKIO NUGRIEBTO PIENO MILTELIUOSE IR MIŠINIUOSE NUSTATYMO METODAS

1. Tikslas

Nustatyti fermentinių išrūgų pridėjimą į:

1.1. nugriebto pieno miltelius, kuriuose yra ne daugiau kaip 11 % riebalų ne daugiau kaip 5% drėgmės ir ne mažiau kaip 31,4 % sausosios neriebalinės medžiagos sudaro baltymai. Nugriebto pieno milteliai – produktas, gaunamas pašalinant vandenį iš nugriebto pieno;

1.2. mišinius, skirtus kombinuotiesiems pašarams gaminti, kurių sudedamosios dalys yra šios:

nugriebto pieno milteliai,

riebalai,

vitaminai,

mineralinės medžiagos,

sacharozė,

nuo sulipimo į gumulėlius apsaugančios medžiagos (ne daugiau kaip 0,3 %),

kitos riebaluose tirpios medžiagos, įskaitant antioksidantus ir emulguojančiąsias medžiagas.

2. Nuorodos

LST EN ISO 707. Pienas ir pieno produktai. Bandinių ėmimo taisyklės.

3. Apibrėžimas

Fermentinių išrūgų kiekis – tai pagal toliau aprašytą metodiką nustatytas medžiagų kiekis masės procentais.

4. Metodo esmė

Glikomakropeptido (GMP) A kiekis nustatomas pagal šio techninio reglamento 14 priedą. Teigiamus rezultatus rodantys mėginiai analizuojami dėl makropeptido A efektyviosios skysčių chromatografijos (ESCh) atvirkštinių fazių metodu. Rezultatai vertinami lyginant su etaloniniais mėginiais, sudarytais vien tik iš pieno miltelių ir pieno miltelių su žinomu išrūgų miltelių priedu. Jeigu analizės rezultatas didesnis kaip 1 % (masės), reiškia, produkte yra išrūgų sausųjų medžiagų.

5. Reagentai

Reagentai, reikalingi šio techninio reglamento 14 priede aprašytai metodikai, ir toliau nurodyti reagentai, reikalingi atvirkštinių fazių ESCh.

5.1. Trichloracto rūgšties tirpalas

Ištirpinti vandenyje 240 g trichloracto (CCI3COOH) rūgšties ir skiesti iki 1000 ml.

5.2. EliuentaiAirB:

Eliuentas A: 150 ml acetonitrilo (CH3CN), 20 ml izopropanolio (CH3CHOHCH3) ir 1 ml trifloracto rūgšties (TFA, CF3COOH) supilama į 1000 ml matavimo kolbą. Skiedžiama vandeniu iki žymės. Eliuentas B: 550 ml acetonitrilo, 20 ml izopropanolio ir 1 ml TFA supilama į 1000 ml matavimo kolbą. Skiedžiama vandeniu iki žymės. Prieš naudojimą eliuento tirpalas filtruojamas per membraninį filtrą, kurio porų diametras 0,45 um.

5.3. Kolonėlės konservavimas

Baigus analizę, kolonėlė perplaunama eliuentu B (per gradientą) ir po to plaunama acetonitrilu (gradientas per 30 minučių). Kolonėlė laikoma acetonitrile.

5.4. Etaloniniai mėginiai:

5.4.1. nugriebto pieno milteliai (0), atitinkantys valstybinėse saugyklose laikomiems pieno milteliams nurodytus reikalavimus:

5.4.2. tokie patys nugriebto pieno milteliai, į kuriuos primaišyta 5 % (masės) etaloninės sudėties fermentinių išrūgų miltelių* (5);

5.4.3. tokie patys nugriebto pieno milteliai, į kuriuos primaišyta 50 % (masės) etaloninės sudėties fermentinių išrūgų miltelių* (50).

Visi reagentai turi būti analiziškai gryni. Analizei naudojamas vanduo turi būti distiliuotas arba ekvivalentiško grynumo. Acetonitrilas turi būti spektroskopijai ar ESCh tinkamos kokybės.

6. Įranga

Įranga, nurodyta šio techninio reglamento 14 priede aprašytai procedūrai atlikti, kuri aprašyta ten pat, ir toliau nurodyta.

6.1. Analizinės svarstyklės.

6.2. Centrifuga, galinti pasiekti centrifugavimo jėgą 2200xg, kurioje yra maždaug 50 ml talpos kamščiais užkemšami centrifugavimo mėgintuvėliai.

6.3. Mechaninė purtyklė, galinti purtyti esant 50 °C.

6.4. Magnetinė maišyklė.

6.5. Stikliniai piltuvai apie 7 cm skersmens.

6.6. Popieriniai filtrai, vidutinio tankio, apie 12,5 cm skersmens.

6.7. Stiklinis filtravimo įrenginys su membraniniais filtrais, kurių poros 0,45 um skersmens.

6.8. Graduotos pipetės, kuriomis galima atmatuoti 10 ml (ISO 648, A klasė arba ISO/R 835) arba sistema, galinti matuoti (skirstyti) 10 ml per 2 minutes.

* Etaloninės sudėties fermentinių išrūgų miltelių ir išrūgomis falsifikuotų pieno miltelių galima gauti iš NIZO (Nyderlandų pienininkystės institutas). Kernhemseweg 2, PO Box 20-NL-6710 BA Ede. Tačiau taip pat gali būti naudojami ir kiti ekvivalentiškos kokybės milteliai.

6.9. Termostatinė vandens vonia, kurioje nustatyta 25 °C ± 0,5 °C temperatūra.

6.10. ESCh įranga, kurią sudaro:

6.10.1. binario (dvigubo) gradiento įsiurbimo sistema;

6.10.2. rankinis arba automatinis 100 ml talpos inžektorius (švirkštas);

6.10.3. kolonėlė Dupont Protein Plūs (20mm x 4,6 mm d_t.) arba ekvivalentiška stambiaporiu kvarcu užpildyta atvirkštinių fazių kolonėlė;

6.10.4. kolonėlės termostatas, kuriame nustatyta 35 °C ± 1°C temperatūra;

6.10.5. kintamo bangos ilgio UV detektorius, kuriuo galima matuoti 0,02 A tikslumu esant 210 nm (jeigu reikia gali būti naudojamas iki 220 nm) bangos ilgiui;

6.10.6. integratorius smailės plotui matuoti.

PASTABA. Kolonėlė gali veikti kambario temperatūroje, jeigu ji nesvyruoja daugiau kaip 1°C, priešingu atveju gaunami per dideli GMP sulaikymo trukmės svyravimai.

7. Mėginių ėmimas:

7.1. Mėginiai imami pagal LST EN ISO 707 reikalavimus.

7.2. Mėginiai laikomi tokiomis sąlygomis, kurios užkirstų kelią bet kokiam gedimui ar sudėties pasikeitimui.

8. Procedūra:

8.1. Tiriamojo mėginio paruošimas

Milteliai supilami į sandariai uždaromą tarą kurios tūris turi būti maždaug dvigubai didesnis negu miltelių.

8.2. Mėginys

Sveriama 2,000 g ± 0,001 g mėginio į centrifugavimo mėgintuvėlį (6.2) arba tinkamas 50 ml kolbutes, užkemšamas kamščiais.

8.3. Riebalų ir baltymų pašalinimas:

8.3.1. įpilama 20,0 g šilto (50 °C) vandens. Milteliai ištirpinami purtant 5 minutes (pasukos 30 minučių) mechanine purtyklė (6.3). Mėgintuvėlis dedamas į vandens vonią (6.9) ir paliekamas, kad jo turinys sušiltų iki 25 °C;

8.3.2. vienodu tempu per 2 minutes supilama 10,0 ml 25 °C trichloracto rūgšties tirpalo (5.1) smarkiai maišant magnetine maišykle (6.4). Mėgintuvėlis dedamas į vandens vonią (6.9) ir paliekamas 60 minučių;

8.3.3. centrifuguojama (6.2) 10 minučių esant 2200 x g arba filtruojama per filtrą (6.6); pirmieji 5 ml filtrato išpilami.

8.4. Chromatografinis nustatymas:

8.4.1. ESCh analizė atliekama kaip aprašyta šio techninio reglamento 14 priede. Jeigu gaunami neigiami rezultatai, tai tiriamajame mėginyje nėra tokio fermentinių išrūgų kiekio, kurį

būtų galima aptikti. Jeigu rezultatai teigiami, turi būti taikoma toliau aprašyta atvirkštinių fazių ESCh procedūra. Rūgščių pasukų milteliai gali rodyti klaidingai teigiamus rezultatus. Atvirkštinių fazių ESCh metodas atmeta tokią galimybę;

8.4.2. prieš atliekant atvirkštinių fazių ESCh analizę turi būti nustatomos optimalios gradiento sąlygos. GMPa sulaikymo trukmė – 26 min ± 2 min yra optimali gradientų sistemai su 6 ml nuliniu sulaikymo tūriu (nuo momento, kai tirpalai kartu ateina į įsiurbimo kilpą imtinai). Gradientų sistemose su mažesniu nuliniu tūriu (pvz., 2 ml) optimali sulaikymo trukmė turėtų būti 22 minutės.

Imami etaloninių mėginių (5.4) be išrūgų ir su 50 % išrūgų tirpalai.

Įsiurbiama 100 ui supernatanto arba filtrato (8.3.3) į ESCh aparatą veikiantį 1 lentelėje nurodytomis sąlygomis.

1 lentelė. Gradiento parinkimo sąlygos chromatografijai optimizuoti

Laikas (min)	Greitis (ml/min)	%A	%B	Kreivė
Pradžia	1,0	90	10	*
27	1,0	60	40	lin
32	1,0	10	90	lin
37	1,0	10	90	lin
42	1,0	90	10	lin

Dviejų chromatogramų palyginimas turi parodyti GMP_A smailės vietą.

Naudojant toliau pateiktą formulę galima apskaičiuoti pradinę tirpalo sudėtį, naudojamą

normaliam gradientui (žr. 8.4.3).

% B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RtgmpA – 26)/6*30/27

% B = 7,5 + (13,5 + (RtgmpA – 26)/6*l, l 1,

kur:

RtgmpA – GMP_A išlaikymo trukmė paieškos gradiente; 10 – pradinis % B paieškos gradiente;

2,5 – % B viduriniame taške minus % B pradiniame taške normaliame gradiente; 13,5 – paieškos gradiento viduriniojo taško trukmė; 26 – pageidaujama GMP_A išlaikymo trukmė; 6 – apskaičiuoto ir normalaus gradiento nuolydžių santykis; 30 – % B pradinis minus % B 27-ą gradiento parinkimo minutę;

27 – gradiento parinkimo laikas.

8.4.3. Mėginių tirpalai

Tiksliai matuojant įsiurbiama 100 ui supernatanto arba filtrato (8.3.3) į ESCh aparatą veikiantį taip, kad tėkmės greitis būtų 1,0 ml eliuento tirpalo (5.2) per minutę.

Eliuento sudėtis analizės pradžioje nustatoma pagal 8.4.2. Normaliai ji artima A:B = 76:24 (5.2). Iškart po įsiurbimo nustatomas linijinis gradientas, kuris duoda 5 % aukštesnį procentą B po 27 minučių. Vėliau paleidžiamas linijinis gradientas, kuris nustato eliuento sudėtį iki 90 % B per 5 minutes. Ši sudėtis palaikoma 5 minutes, po to sudėtis keičiama iki pradinės sudėties gradiento per 5 minutes greičiu.

Priklausomai nuo įsiurbimo sistemos vidinio tūrio kitas įsiurbimas gali būti atliekamas 15 minučių po to, kai pasiekiamos pradinės sąlygos.

PASTABOS:

1. Glikomakropeptido sulaikymo trukmė turėtų būti 26 min ± 2 min. Tai gali būti pasiekiama keičiant pradines ir galutines pirmojo gradiento sąlygas. % B skirtumas pradinėmis ir galutinėmis pirmojo gradiento sąlygoms turi išlikti 5 % B.

2. Eliuentai turėtų būti pakankamai degazuoti ir tokie išlikti. Tai svarbu, kad galėtų tinkamai veikti gradiento siurbimo sistema. GMP smailės išlaikymo trukmės standartinis nuokrypis turėtų būti mažiau kaip 0,10 minutės (n = 10).

3. Kiekvieni penki etaloninio mėginio (5) mėginiai turėtų būti įsiurbiami ir naudojami apskaičiuojant naują perskaičiavimo koeficientą R (9.1.1).

8.4.4. Mėginio (E) chromatografinės analizės rezultatai gaunami chromatogramos forma, kurioje GMP smailė identifikuojama pagal maždaug 26 minučių sulaikymo trukmę.

Integratorius (6.40.6) automatiškai skaičiuoja GMP smailės aukštį H. Kiekvienoje chromatogramoje turi būti patikrinta pagrindo linijos vieta. Analizė arba integracija turi būti kartojama, jeigu neteisingai nustatyta pagrindo linijos vieta.

Prieš atliekant kiekybinę interpretaciją svarbu patikrinti kiekvienos chromatogramos išvaizdą siekiant nustatyti bet kokį nukrypimą galimą arba dėl aparato ar kolonėlės veikimo sutrikimo arba dėl analizuojamo mėginio kilmės ar prigimties. Esant abejonių, analizė kartojama.

8.5. Kalibravimas:

8.5.1. etaloniniams mėginiams (5.4.1-5.4.2) taikoma procedūra, aprašyta punktuose (8.2-8.4.4). Naudojami šviežiai pagaminti tirpalai, kadangi GMP skyla 8 % trichloracto rūgšties aplinkoje kambario temperatūroje. 4°C temperatūroje tirpalas išlieka stabilus 24 valandas. Ilgos analizių serijos atveju automatiniame inžektoriuje pageidaujama naudoti šaldomą mėginių padėklą.

PASTABA. 8.4.2 punktas gali būti praleidžiamas, jeigu % B pradinėmis sąlygomis yra žinomas iš ankstesnės analizės.

Etaloninio mėginio (5) chromatograma turi būti analogiška kaip 1 paveiksle: prieš GMPA smailę yra dvi mažos smailės. Svarbu gauti panašius at(si)skyrimus.

1 pav.Standartinio bendrinio chromatograma

8.5.2. Prieš atliekant mėginių chromatografiją, įsiurbiama 100\A etaloninio mėginio be fermentinių išrūgų (0) (5.4.1).

Chromatograma neturi rodyti smailės per GMPA smailės sulaikymo trukmę.

8.5.3. Nustatomas perskaičiavimo koeficientas R įsiurbiant tą patį filtrato (8.5.1) tūrį, koks buvo įsiurbiamas mėginio.

9. Rezultatų apskaičiavimas:

9.1. Apskaičiavimo metodas ir formulė Perskaičiavimo koeficiento R apskaičiavimas:

GMP smailės: R = W/H,

kur:

R – GMP smailės perskaičiavimo koeficientas; H – GMP smailės aukštis; W – išrūgų kiekis etaloniniame mėginyje (5).

9.2. Fermentinių išrūgų kiekio mėginyje apskaičiavimas:

W(E) = R x H(E),

kur:

W(E) – fermentinių išrūgų kiekis mėginyje (E) masės procentais;

R – GMP smailės perskaičiavimo koeficientas (9.1.1);

H(E) – mėginio (E) GMP smailės aukštis.

Jeigu W(E) yra didesnis kaip 1 % ir skirtumas tarp sulaikymo trukmės mėginio ir etaloninio mėginio (5) mažesnis kaip 0,2 minutės, tai mėginyje yra fermentinių išrūgų sausųjų medžiagų.

9.3. Tikslumas:

9.3.1. Pakartojamumas

Skirtumas dviejų to paties mėginio analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje ir naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 0,2 masės procento.

9.3.2. Atkuriamumas Dar nenustatytas.

9.3.3. Tiesinė priklausomybė

Esant nuo 0 iki 16 procentų fermentinių išrūgų, turėtų būti gaunama tiesinė priklausomybė su didesniu kaip 0,99 koreliacijos koeficientu.

9.4. Interpretacija

Laikoma, kad išrūgų turi būti, jeigu pagal 9.2 punktą gautas rezultatas didesnis kaip 1 % (masės) ir GMP smailės sulaikymo trukmė daugiau kaip 0,2 minutės skiriasi nuo etaloninio mėginio (5) sulaikymo trukmės. 1 % riba nustatyta pagal šio techninio reglamento 14 priedo nuostatas.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

16 priedas

NUGRIEBTO PIENO MILTELIAI: FOSFATIDILSERINO IR FOSFATIDILETANOLAMINO KIEKIO NUSTATYMAS ATVIRKŠTINIŲ FAZIŲ ESCh METODU

1. Taikymo sritis

Šiame metode aprašytas fosfatidilserino (FS) ir fosfatidiletanolamino (FE) kiekio nugriebto pieno milteliuose (NPM) tyrimas, pagal kurį nustatomas juose esantis pasukų kiekis.

2. Apibrėžimas

FS+FE kiekis: medžiagos masės dalis, kuri nustatoma atliekant žemiau nurodytus veiksmus. Rezultatas išreiškiamas fosfatidiletanolamino dipalmitoilo (FEDP) miligramais 100 gramų miltelių.

3. Metodo esmė

Iš regeneruotų nugriebto pieno miltelių metanoliu ekstrahuojami aminofosfolipidai. FS ir FE, kaip o-ftalio dialdehidų (OFA) dariniai, nustatomi efektyviosios skysčių chromatografijos (ESCh) atvirkščių fazių metodu, naudojant fluorescensinį detektorių. FS ir FE kiekiai tiriamajame mėginyje nustatomi lyginant rezultatus su etaloniniu mėginiu, kuriame FEDP kiekis yra žinomas.

4. Reagentai:

4.1. Etaloninė medžiaga: FEDP, mažiausiai 99 % grynumo

4.2. Reagentai etaloniniam ir tiriamajam mėginiams paruošti:

4.2.1. metanolis, skirtas ESCh analizei;

4.2.2. chloroformas, skirtas ESCh analizei;

4.2.3. triptamino monohidrochloridas.

4.3. Reagentai o-ftalio dialdehido dariniams gauti:

4.3.1. natrio hidroksidas, 12 mol/1 vandeninis tirpalas;

4.3.2. boro rūgštis. 0,4 mol/1 vandeninis tirpalas, natrio hidroksidu (4.3.1) sunormintas iki pH 10,0;

4.3.3. 2-merkaptoetanolis;

4.3.4. o-oftalio dialdehidas (OFA). 4.4. ESCh eliuavimo tirpalai:

Eliuavimo tirpalai ruošiami iš reagentų, skirtų ESCh analizei:

4.4.1. vanduo, skirtas ESCh analizei;

4.4.2. fluorescensiškai patikrinto grynumo metanolis;

4.4.3. tetrahidrofuranas;

4.4.4. natrio dihidrofosfatas;

4.4.5. natrio acetatas;

4.4.6. Acto rūgštis.

Visi reagentai turi būti analiziškai gryni, vanduo – distiliuotas arba tokio pat grynumo.

PASTABA. Etaloninė medžiaga turi būti laikoma minus 18 °C temperatūroje.

5. Įranga:

5.1. analizinės svarstyklės;

5.2. 25 ml ir 100 ml laboratorinės stiklinės;

5.3. lmlirlOmlpipetės;

5.4. magnetinė maišyklė;

5.5. 0,2 ml, 0,5 ml ir 5 ml graduotos pipetės;

5.6. 10 ml, 50 ml ir 100 ml matavimo kolbos;

5.7. 20 ui ir 100 ui švirkštai;

5.8. ultragarsinė vonia;

5.9. centrifuga, galinti išvystyti 27000 x g išcentrinę jėgą;

5.10. apie 5 ml stikliniai buteliukai;

5.11. 25 ml graduotas cilindras;

5.12. pH metras;

5.13. ESCh įranga:

5.13.1. judančiosios fazės gradiento formavimo sistema, kurios našumas 1,0 ml/min, esant 200 barų slėgiui;

5.13.2. automatinis mėginių ėmiklis, kuriame galima sintetinti darinius;

5.13.3. 30 °C temperatūrą palaikantis kolonėlės šildytuvas;

5.13.4. fluorescencinis detektorius, nustatytas 330 nm sužadinimo bangos ilgiui ir 440 nm emisijos bangos ilgiui;

5.13.5. integratorius arba duomenis apdorojanti programinė įranga, kuria galima nustatyti smailės plotą;

5.13.6. kolonėlė „Lichrosphere-100“ (250x4,6 mm) arba jai lygiavertė, užpildyta oktadecil-silanu (C18), dalelių dydis 5 um.

6. Mėginių paėmimas

Mėginiai imami pagal LST EN ISO 707.

7. Metodika:

7.1. Vidinio etalono tirpalo ruošimas

Į 100 ml matavimo kolbą (5.6) pasveriama 30,0 g±0, l g triptamino monohidrochlorido (4.2.3) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. 1 ml šio tirpalo pipete (5.3) įpilama į 10 ml matavimo kolbą

(5.6) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. Gaunamas 0,15 mmol/1 koncentracijos triptamino tirpalas.

7.2. Tiriamojo mėginio tirpalo ruošimas

Į 25 ml laboratorinę stiklinę (5.2) pasveriama 1,000 g±0,001 g tiriamojo mėginio. Pipete (5.3) įpilama 10 ml iki 40 °C pašildyto distiliuoto vandens ir 30 min maišoma magnetinė maišykle (5.4), kad neliktų jokių neištirpusių gumuliukų. 0,2 ml regeneruoto pieno pipete (5.5) įlašinami į 10 ml matavimo kolbą (5.6), švirkštu (5.7) įšvirkščiama 100 ųl 0,15 mmol/1 triptamino tirpalo (7.1) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. Kruopščiai sumaišoma, vartant kolbą, ir 15 min apdorojama ultragarsu (5.8). 10 min sukama centrifugoje (5.9), esant 27000 x g išcentrinei jėgai, gautas skystis supilamas į stiklinį buteliuką(5.10).

PASTABA. Mėginio tirpalas iki ESCh analizės turi būti laikomas 4 °C temperatūroje.

7.3. Išorinio etalono tirpalo ruošimas

Į 50 ml matavimo kolbą (5.6) pasveriama 55,4 mg FEDP (4.1) ir naudojant graduotą cilindrą (5.11) įpilama apie 25 ml chloroformo (4.2.2). Kolba užkemšama kamščiu ir, atsargiai maišant, šildoma iki 50 °C, kol ištirpsta FEDP. Kolba atvėsinama iki 20 °C, praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės ir, vartant kolbą sumaišoma. 1 ml šio tirpalo pipete (5.3) įpilamas į 100 ml matavimo kolbą (5.6) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. 1 ml šio tirpalo pipete (5.3) įpilamas į 10 ml matavimo kolbą (5.6), švirkštu (5.7) įšvirkščiama 100 ųl 0,15 mmol/1 triptamino tirpalo (7.1) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. Vartant kolbą tirpalas sumaišomas.

PASTABA. Etaloninis tirpalas iki chromatografmės analizės turi būti laikomas 4 °C temperatūroje.

7.4. Sintezuojančio reagento ruošimas

Į 10 ml matavimo kolbą (5.6) pasveriama 25,0±0,1 mg OFA (4.3.4), pipete (5.5) įlašinami 0,5 ml metanolio (4.2.1) ir atsargiai maišoma, kol OFA ištirpsta. Praskiedžiama boro rūgšties tirpalu (4.3.2) iki žymės ir švirkštu (5.7) įšvirkščiama 20 ųl 2-merkaptoetanolio (4.3.3).

PASTABA. Sintezuojantis tirpalas turi būti laikomas tamsiame inde 4 °C temperatūroje ir yra tinkamas vieną savaitę.

7.5. Chromatografmis nustatymas: 7.5.1. Eliuavimo tirpalai (4.4): Eliuentas A:

0,3 mmol/1 natrio dihidrofosfato ir 3 mmol/1 natrio acetato tirpalas (acto rūgštimi normalizuotas iki pH6,5): metanolis: tetrahidrofuranas = 558: 440: 2 (tūrio dalimis). Eliuentas B: – metanolis

7.5.2. Siūlomas eliuento gradientas:

Laikas (min)	Eliuentas A (%)	Eliuentas B (%)	Tekėjimo greitis, (ml/min)
Pradžia	40	60	0
0,1	40	60	0,1
5,0	40	60	0,1
6,0	40	60	1,0
6,5	40	60	1,0
9,0	36	64	1,0
10,0	20	80	1,0
11,5	16	84	1,0
12,0	16	84	1,0
16,0	10	90	1,0
19,0	0	100	1,0
20,0	0	100	1,0
21,0	40	60	1,0
29,0	40	60	1,0
30,0	40	60	0

Kolonėlės temperatūra: 30 °C.

PASTABA. Norint atkartoti paveiksle pavaizduotą atskyrimą eliuento gradientą gali tekti šiek tiek pakeisti.

7.5.3. Įšvirkščiamas tūris: 50 ųl sintezuojančio reagento ir 50 ųl mėginio tirpalo.

7.5.4. Kolonėlės pusiausvyros nustatymas:

Kiekvieną kartą paleidžiant sistemą kolonėlė 15 min plaunama grynu tirpikliu B, po to nustatomas tirpiklių santykis A: B = 40: 60 ir, nustačius 1 ml/min greitį, 15 min laukiama, kol nusistovės pusiausvyra. Atliekamas tuščiasis bandymas, įšvirkščiant metanolį (4.2.1).

PASTABA. Paliekant kolonėlę nenaudojamą ilgesniam laikui, ji 30 min plaunama metanolio chloroformo mišiniu = 80: 20 (tūrio dalimis).

7.5.5. FS + FE kiekio nustatymas tiriamajame mėginyje.

7.5.6. Atliekamos kelios chromatografmės analizės iš eilės vienodais laiko tarpais, siekiant gauti vienodą sulaikymo trukmę. Atlikus 5-10 mėginių tyrimus, įšvirkščiamas išorinis etaloninis tirpalas (7.3) ir pasitikslinama ar nepakito skyrimas.

PASTABA. Po 20-25 analizių kolonėlė mažiausiai 30 min turi būti plaunama grynu tirpikliu B (7.5.1).

7.6. Integravimas:

7.6.1. FEDP smailė

FEDP atskiriama viena smaile. Smailės plotas nustatomas integruojant tarp minimumų.

7.6.2. Triptamino smailė

Triptaminas išplaunamas viena smaile (žr. pav.). Smailės plotas nustatomas integruojant tarp minimumų.

7.6.3. FS ir FE smailių grupės

Aprašytomis sąlygomis (žr. pav.) FS išplaunamas dviem iš dalies neatsiskyrusiomis smailėmis, prieš kurias yra mažesnė smailė. FE išplaunamas trimis iš dalies neatsiskyrusiomis smailėmis. Visas kiekvienos smailių grupės plotas nustatomas, nubrėžus pagrindo liniją, kaip parodyta paveiksle.

8. Rezultatų skaičiavimas:

FS ir FE kiekis tiriamajame mėginyje skaičiuojamas pagal formulę:

kur:

C       – FS arba FE kiekis (mg/100 g miltelių) tiriamajame mėginyje;

A₁      – FEDP smailės plotas etaloninio mėginio (7.3) chromatogramoje;

A₂      – FS arba FE smailės plotas tiriamojo mėginio (7.2) chromatogramoje;

T₁      – triptamino smailės plotas etaloninio mėginio (7.3) chromatogramoje;

T₂      – triptamino smailės plotas tiriamojo mėginio (7.3) chromatogramoje.

Minutės

Pav. Regeneruoto nugriebto pieno miltelių fosfatidilserino (FS)ir fosfatidiletanolamino (FE) OFA darinių ekstrakto metanolyje chromatograma. Pateiktas FS, FE ir triptamino (vidinio etalono tirpalo) smailių integravimo būdas

9. Tikslumas: 9.1. Pakartojamumas

Santykinio standartinio pakartojamumo skirtumas tarp dviejų analizių rezultatų gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą

pačią įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 2 %. Jei šiomis sąlygomis atliekamos dvi analizės, santykinis skirtumas tarp dviejų rezultatų turi neviršyti 6 % šių rezultatų aritmetinio vidurkio.

9.2. Atkuriamumas

Santykinis skirtumas tarp dviejų atskirų ir nepriklausomų rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose, naudojant skirtingą aparatūrą ir identiškas tyrimo medžiagas, turi neviršyti 11 % jų aritmetinio vidurkio.

PASTABA. Pakartojamumo vertės apskaičiuotos pagal IDF standartą¹. Apytikslė atkuriamumo riba apskaičiuota pagal šio reglamento 3 b priedą.

10. Literatūra

Resmini P., Pellegrino L, Hogenboom J. A., Sadini V., Rampilli M. Detection of buttermilk solids in skimmilkpowder by HPLC ąuantification ofaminophospholipids. Sci. Tech. Latt.-Cas. 39,395 (1988).

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

17 priedas

ANTIBIOTIKŲ IR SULFAMIDO/DAPSONO LIEKANŲ APTIKIMO NUGRIEBTO PIENO MILTELIUOSE METODAS

Inhibitorinės medžiagos nustatomos mikrobiologiniu metodu. Kaip testo kultūra naudojama Bacittus stearothermophilus var. calidolactis C953, kuri yra pakankamai jautri, kad aptiktų piene 4 ug benzilpenicilino ir 100 įig sulfadimidino. Komercinius testų rinkinius taip pat galima naudoti, jei jie yra pakankamai jautrūs benzilpenicilinui ir sulfadimidinui rasti¹

Tyrimui naudojamas iš nugriebto pieno miltelių regeneruotas pienas (1 g miltelių + 9 ml distiliuoto vandens). Tyrimas atliekamas taip, kaip aprašyta LST 1263:1999 „Pienas. Inhibitorių nustatymo metodai“ arba pagal analizės rinkinio gamintojo instrukciją.

Gavus teigiamą rezultatą, elgiamasi taip:

1. Bandymas pakartojamas, į terpę dedant penicilinazę:

Jei gaunamas teigiamas rezultatas: šiuo metodu inhibitoriaus identifikuoti negalima.

Jei gaunamas neigiamas rezultatas: inhibitorinė medžiaga yra p-laktamininis antibiotikas.

2. Bandymas pakartojamas, į terpę dedant gamino benzoinę rūgštį:

Jei gaunamas teigiamas rezultatas: šiuo metodu inhibitoriaus identifikuoti negalima. Jei gaunamas neigiamas rezultatas: inhibitorinė medžiaga yra sulfamidas/dapsonas.

3. Bandymas pakartojamas, į terpę dedant penicilinazės + gamino benzoinės rūgšties: Jei gaunamas teigiamas rezultatas: šiuo metodu inhibitoriaus identifikuoti negalima.

Jei gaunamas neigiamas rezultatas: inhibitorinės medžiagos yra p-laktamininis antibiotikas ir sulfamidas/dapsonas.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

18 priedas

PIENO MILTELIŲ KIEKIO KOMBINUOTUOSIUOSE PAŠARUOSE NUSTATYMO FERMENTINĖS PARAKAZEINO KOAGULIACIJOS BŪDU METODAS

1. Tikslas

Pieno miltelių kiekio sudėtiniuose pašaruose nustatymas fermentinės parakazeino koaguliacijos būdu.

2. Taikymo sritis

Šis metodas taikomas kombinuotiesiems pašarams, kurių sudėtyje yra ne mažiau kaip 10 % sausojo pieno miltelių. Dideli kiekiai pasukų ir (arba) ne pieno baltymų gali trukdyti nustatymui.

3. Metodo esmė:

3.1. kombinuotuosiuose pašaruose esančio kazeino ištirpinimas ekstrahuojant natrio citrato tirpalu;

3.2. kalcio jonų koncentracijos reguliavimas iki reikiamo nusodinti parakazeinui lygio; kazeino pavertimas parakazeinu šliužo fermento pagalba;

3.3. azoto kiekis parakazeino nuosėdose nustatomas Kjeldalio metodu, kaip aprašyta LST IDF 20B; pieno miltelių kiekis paskaičiuojamas priimant, kad minimalus kazeino kiekis juose yra 27,5 % (žr. 9.1).

4. Reagentai:

4.1. trinatrio citrato dihidrato (C₆Fį07Na3-2H₂0) 1 % (1 g/100 ml) vandeninis tirpalas;

4.2. kalcio chloridas (2 mol/1 tirpalas): sveriama 20,018 g CaCOj į tinkamo dydžio (150 ml -200 ml) porcelianinį indą arba stiklinę. Užpilama distiliuotu vandeniu (kad apsemtų) ir indas su gaminamu tirpalu statomas į verdančio vandens vonią. Lėtai supilama nuo 50 ml iki 60 ml druskos rūgšties tirpalo (HCl:vanduo = 1:1), kad visiškai ištirptų karbonatas ir tirpalas nuskaidrėtų. Pagamintas tirpalas laikomas virš vandens garų vonios, kad būtų pašalinta nesureagavusi HC1 ir gaunamas sausas CaCl₂. Gauta druska su distiliuotu vandeniu perpilama į 100 ml matavimo kolbą ir skiedžiama iki žymės. Pamatuojamas pH, kuris turi būti ne mažesnis kaip 4,0. Tirpalas laikomas šaldytuve;

4.3. 0,1 mol/1 natrio hidroksidas;

4.4. 0,1 mol/1 druskos rūgštis;

4.5. skystas šliužo fermentas (standartinio aktyvumo 1:10 000), laikomas šaldytuve 4 °C -6 °C temperatūroje;

4.6. Reagentai, reikalingi kiekybiniam azoto nustatymui Kjeldalio metodu pagal LST IDF 20B.

Visi naudojami reagentai turi būti analizinio grynumo. Naudojamas tik distiliuotas arba ekvivalentiško grynumo vanduo. Išskyrus šliužo fermentą (4.5), visuose reagentuose turi nebūti azotinių medžiagų.

5. Įranga:

Naudojama įprastinė ir toliau išvardyta laboratorinė įranga:

5.1. piestelė arba homogenizatorius;

5.2. analizinės svarstyklės;

5.3. centrifuga 2000 aps/min – 3000 aps/min su 50 ml talpos mėgintuvėliais;

5.4. magnetinė maišyklė su įdedamais 10 mm-15 mm ilgio strypeliais;

5.5. 150 ml-200 ml talpos stiklinės;

5.6. 250 ml ir 500 ml talpos stiklinės;

5.7. 60 mm-80 mm skersmens piltuvai;

5.8. 150 mm skersmens reti (greitai filtruojantys) bepelemai filtrai (S. S. 589², S. S. 595 1/2);

5.9. įvairaus nominalaus tūrio pipetės;

5.10. termostatiškai reguliuojama 37 °C vandens vonia; 5.11. pHmetras;

5.12. Kjeldalio aparatai deginimui ir distiliacijai bei pagalbiniai įrenginiai prie jų;

5.13. 25 ml graduotos biuretės;

5.14. plastikinė plovyklė distiliuotam vandeniui;

5.15. nerūdijančio plieno mentelės;

5.16. termometrai;

5.17. termostatiškai reguliuojama džiovinimo krosnis.

6. Metodika:

6.1. Mėginio paruošimas:

Sugrūdama piestelėje arba sumalama malūnėliu iki vienodos konsistencijos nuo 10 g iki 20 g mėginio.

6.2. Pieno miltelių tirpinimas ir netirpių liekanų atskyrimas:

6.2.1. pasveriama 1,000 g ± 0,002 g gerai susmulkintų kombinuotųjų pašarų (6.1) tiesiai į 50 ml centrifugavimo mėgintuvėlį. Įpilama 30 ml prieš tai pašildyto iki 45 °C natrio citrato tirpalo (4.1). Maišoma magnetine maišykle ne mažiau kaip 5 minutes;

6.2.2. centrifuguojama 10 minučių, esant 500 x g (2000 aps/min-3000 aps/min), ir skaidrus supernatantas dekantuojamas į 150 ml-200 ml stiklines saugant, kad nuo mėgintuvėlio dugno nepakiltų purios nuosėdos;

6.2.3. likučiai mėgintuvėliuose ekstrahuojami dar du kartus pagal tą pačią procedūrą, o ekstraktas supilamas prie pirmojo;

6.2.4. jeigu paviršiuje susidaro skystų riebalų sluoksnis, ekstraktas palaikomas šaldytuve, o sukietėję riebalai nuimami mentele.

6.3. Kazeino sutraukdinimas šliužo fermentu:

6.3.1. į gautą vandeninį ekstraktą (apie 100 ml) nuolat maišant įlašinama 3,4 ml sotaus kalcio chlorido (4.2). Nustatomas pH 6,4-6,5 su NaOH (4.3) ar HC1 (4.4) tirpalu. Dedama į nustatytą 37 °C vandens vonią 15-20 minučių, kad pasiektume druskų pusiausvyrą. Tai parodo lengvas tirpalo drumstimasis;

6.3.2. skystis supilamas į vieną arba du centrifugavimo mėgintuvėlius ir centrifuguojamas 10 minučių, esant 2000 x g, kad būtų pašalintos nuosėdos. Supernatantas, neplaunant nuosėdų, supilamas į vieną (arba du) centrifugavimo mėgintuvėlį;

6.3.3. supernatantas vėl pašildomas iki 37 °C. Nuolat maišant ekstraktą įlašinama 0,5 ml skysto šliužo fermento (4.5). Sutrauka susidaro per vieną-dvi minutes;

6.3.4. mėginys dedamas atgal į vandens vonią ir paliekamas 15 minučių 37°C temperatūroje. Išėmus mėginį iš vandens vonios, maišant suardoma jo sutrauka. Centrifuguojama 10 minučių, esant 2000 x g. Supernatantas filtruojamas per retą bepelenį filtrą (Whatman Nr. 541 arba ekvivalentišką), filtras išsaugomas. Nuosėdos centrifugos mėgintuvėlyje, maišant perplaunamos 50 ml maždaug 35°C temperatūros vandens. Vėl centrifuguojama 10 minučių, esant 2000 x g. Supernatantas filtruojamas per anksčiau išsaugotą filtrą.

6.4. Kazeino azoto nustatymas:

6.4.1. perplautos nuosėdos, naudojant distiliuotą vandenį, be nuostolių perpilamos ant filtro, išsaugoto iš 6.3.4 punkto. Filtras įdedamas į Kjeldalio kolbą. Nustatomas azotas Kjeldalio metodu pagal LST IDF 20B.

7. Tuščiasis bandymas:

7.1. tuščiasis bandymas turi būti atliekamas reguliariai, naudojant bepelenį filtrą (5.8), sudrėkintą mišiniu, gautu iš 90 ml natrio citrato (4.1), 1 ml sotaus kalcio chlorido (4.2) ir 0,5 ml skysto šliužo fermento (4.5), ir perplaunant 3 x 15 ml distiliuotu vandeniu prieš mineralizuojant Kjeldalio metodu pagal LST IDF 20B;

7.2. rūsčiajam bandymui sunaudotas rūgšties (4.4) kiekis turi būti atimamas iš mėginio titravimui sunaudoto rūgšties kiekio.

8. Kontrolinis bandymas

8.1. Nurodytai metodikai ir reagentams patikrinti atliekamas kontrolinis nustatymas etaloninių kombinuotųjų pašarų su žinomu nugriebto pieno miltelių kiekiu, nustatytu atliekant

bendrus tyrimus. Dviejų lygiagrečių analizių rezultatų vidurkis neturi skirtis daugiau kaip 1 % nuo rezultatų, gautų atliekant bendrus tyrimus.

9. Rezultatų apskaičiavimas

Sausojo pieno miltelių kiekis kombinuotuosiuose pašaruose procentais apskaičiuojamas pagal formulę:

kur:

N – parakazeino azoto kiekis procentais;

27,5 – koeficientas perskaičiuoti nustatyto kazeino kiekį į nugriebto pieno miltelių kiekį procentais;

2,81 ir 0,908 – regresinės analizės būdu gauti pataisos koeficientai.

10. Metodo tikslumas:

10.1. Pakartojamumas

Ne mažiau kaip 95 % atvejų skirtumas dviejų to paties mėginio analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje ir naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 2,3 g nugriebto pieno miltelių 100 g kombinuotųjų pašarų.

10.2. Atkuriamumas

Ne mažiau kaip 95 % atvejų skirtumas dviejų atskirų to paties mėginio analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 6,5 g nugriebto pieno miltelių 100 g kombinuotųjų pašarų.

11. Leistinas nuokrypis

Kritinio skirtumo (KrN) vertė (95 % tikimybės atveju) apskaičiuojama pagal formulę:

kur:

R-atkuriamumas;

r-pakartojamumas.

Dvikartinio nustatymo KrN₉₅ = 4,5 g.

Jeigu cheminės analizės (dvikartinio nustatymo) rezultatai skiriasi nuo deklaruojamo nugriebto sausojo pieno kiekio ne daugiau kaip 4,5 g, laikoma, kad siunta atitinka šio reglamento reikalavimus.

PASTABOS:

1. Didelis kiekis kai kurių ne pieno kilmės baltymų, o ypač sojos baltymų, jeigu jie kaitinami kartu su nugriebtu sausuoju pienu, gali duoti per didelius rezultatus dėl jų nusėdimo kartu su pieno parakazeinu.

2. Pasukos gali turėti įtakos rezultatų sumažėjimui, nes nustatoma tik jų neriebalinė dalis. Raugintos pasukos gali duoti palyginti mažus rezultatus dėl nepilno jų ištirpimo citrato tirpale.

3. Lecitinas (0,5 % ir daugiau) taip pat gali sumažinti rezultatus.

4. Aukšta temperatūra apdoroto nugriebto sausojo pieno milteliai gali padidinti rezultatus dėl kai kurių išrūgų baltymų nusėdimo su parakazeinu.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

19 priedas

KRAKMOLO APTIKIMO NUGRIEBTO PIENO MILTELIUOSE, DENATŪRUOTUOSE PIENO MILTELIUOSE IR SUDĖTINIUOSE PAŠARUOSE KOKYBINIS METODAS

1. Taikymo sritis

Šis metodas skirtas aptikti krakmolą, kuris naudojamas kaip denatūruotų pieno miltelių atsekamoji medžiaga.

Aptikimo riba šiuo metodu yra maždaug 0,05 g krakmolo 100 g bandinio.

2. Metodo esmė:

Metodas remiasi šiomis jodometrijoje naudojamomis reakcijomis:

– laisvo jodo fiksavimu koloidais vandeniniuose tirpaluose,

– krakmolo micelių absorbcija ir spalvos susidarymu.

3. Reagentai: 3.1. jodo tirpalas:

– jodas                                         1 g,

– kalio jodidas                             2 g,

– distiliuotas vanduo                   100 ml.

4. Įranga:

4.1. analizinės svarstyklės;

4.2. vandens vonia;

4.3. mėgintuvėliai, 25mm x 200 mm.

5. Analizė:

Pasveriamas 1 g mėginio ir perpilamas į mėgintuvėlį (4.3). Įpilama 20 ml distiliuoto vandens ir supurtoma, kad ištirptų. Dedama į verdančio vandens vonią (4.2) ir palaikoma 5 minutes. Išimama iš vonios ir atvėsinama iki kambario temperatūros. Įpilama 0,5 ml jodo tirpalo (3.1) ir stebima susidaranti spalva.

6. Rezultatų išraiška

Nusidažymas mėlyna spalva rodo, kad mėginyje yra natyvaus krakmolo. Kai mėginyje yra modifikuoto krakmolo, spalva gali būti ne mėlyna. PASTABOS:

1. Spalva, jos intensyvumas ir mikroskopinis krakmolo vaizdas keisis priklausomai nuo mėginyje esančio natyvaus krakmolo kilmės (pvz., kukurūzų ar bulvių) ir modifikuoto krakmolo tipo.

2. Esant modifikuotų krakmolų, susidaro violetinė, raudona arba ruda spalva priklausomai nuo natyvaus krakmolo kristalinės struktūros ir modifikacijos laipsnio.

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

20 priedas

RŪGŠČIŲ PASUKŲ MILTELIŲ DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMO METODAS

1. Taikymo sritis

Nustatyti drėgmės kiekį gyvulių pašarams skirtuose rūgščių pasukų milteliuose.

2. Metodo esmė

Mėginys džiovinamas vakuume. Masės nuostoliai nustatomi sveriant.

3. Įranga:

3.1. analizinės svarstyklės;

3.2. nerūdijantys metaliniai arba stikliniai indeliai, uždengiami oro nepraleidžiančiais dangteliais, todeliai turi būti tokios talpos, kad juose būtų galima paskleisti apie 0,3 g/cm² mėginio;

3.3. elektra kaitinama vakuuminė krosnelė, kurioje įtaisytas alyvos siurblys ir koks nors mechanizmas paduoti karštam orui arba džiovinimo agentui (pvz., kalcio oksidui);

3.4. eksikatorius su efektyviu džiovinimo agentu;

3.5. ventiliuojama džiovinimo krosnelė, termostatiškai palaikanti 102 °C ± 2 °C.

4. Metodika:

Indelis (3.2) ir jo dangtelis kaitinami krosnelėje (3.5) ne mažiau kaip 1 vai. Po to, uždengus dangteliu, indelis perkeliamas į eksikatorių (3.4), leidžiama atvėsti iki kambario temperatūros.

Indelis (3.2) kartu su dangteliu pasveriamas 0,5 mg tikslumu. Į pasvertą indelį 1 mg tikslumu atsveriama apie 5 g mėginio ir vienodai paskleidžiama. Indelis nudengiamas ir dedamas į vakuuminę krosnelę (3.3), pašildytą iki 83 °C. Indelis įdedamas kaip galima greičiau, kad pernelyg nenukristų krosnelės temperatūra.

Slėgis sumažinamas iki 100 torų (13,3 kPa) ir esant šiam slėgiui džiovinama keturias valandas karšto sauso oro srove arba naudojant džiovinimo agentą (apie 300 g 20-čiai mėginių). Pasiekus reikiamą slėgį vakuuminis siurblys atjungiamas. Džiovinimo laikas skaičiuojamas nuo to momento, kai temperatūra krosnelėje pasiekia 83 °C. Po to, slėgis krosnelėje iš lėto pakeliamas iki atmosferinio. Krosnelė atidaroma, indelis tuoj pat uždengiamas ir išimamas iš krosnelės, paliekamas nuo 30 iki 45 minučių eksikatoriuje (3.4), kad atvėstų ir pasveriamas 1 mg tikslumu. Dar kartą džiovinamas vakuuminėje krosnelėje (3.3), kurioje palaikoma 83 „C temperamra, 30 minučių ir vėl sveriamas. Dviejų svėrimų skirtumas turi būti ne didesnis kaip 0,1 % drėgmės kiekio.

5. Apskaičiavimas

kur:

W – drėgmės kiekis procentais;

E – pradinė mėginio masė gramais;

m– išdžiovinto mėginio masė gramais.

6. Tikslumas

6.1. Pakartojamumas

Skirtumas dviejų atskirų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje ir naudojant identiškas medžiagas, turi nebūti didesnis kaip 0,4 g drėgmės 100 g rūgščių pasukų miltelių.

6.2. Atkuriamumas

Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų naudojant identiškas medžiagas, neturi būti didesnis kaip 0,6 g drėgmės lOOg rūgščių pasukų miltelių.

PASTABA. Tikslumo duomenys buvo nustatyti remiantis 1995 metais vykdyto eksperimento rezultatais. Eksperimente dalyvavo aštuonios laboratorijos ir buvo tirta 12 mėginių (6 akli dublikatai).

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

21 priedas

PAMATINIS PAŠALINIŲ RIEBALŲ APTIKIMO PIENO RIEBALUOSE METODAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJA TIRIANT TRIGLICERIDUS

1. Taikymo sritis

Šis metodas taikomas pašalinių augalinės ir gyvūninės kilmės riebalų (pvz., jautinių ir kiaulinių taukų) pieno ir pieno produktų riebaluose nustatyti, taikant trigliceridų dujų chromatografijos analizę.

Augaliniai ir gyvūniniai riebalai grynuose pieno riebaluose yra nustatomi kokybiniu ir kiekybiniu metodais taikant trigliceridų formules.

PASTABOS:

1. Remiantis vien tik pieno riebaluose esančia sviesto rūgštimi (C4) galima nustatyti nežymų pieno riebalų kiekį aliejuje, tačiau kiekybinė ir kokybinė informacija gali būti patikima tik pridėjus mažiausiai 20 % (masės) pašalinių riebalų, kadangi C4 kiekis pieno riebaluose svyruoja tarp 3,5-4,5 masės procentų.

2. Kiekybinius rezultatus galima gauti tik taikant trigliceridų analizę, kadangi sterolio kiekis aliejuje svyruoja priklausomai nuo aliejaus žaliavos ir apdorojimo sąlygų.

2. Apibrėžimas

Pašaliniai riebalai pieno riebaluose – visi augalinės ir gyvūninės kilmės riebalai, išskyrus pieno riebalus.

3. Metodo esmė

Išekstrahavus pieno riebalus, paruošiamas pagrindinis tirpalas. Naudojant dujų chromatografą su užpildyta kolonėle, šiame tirpale nustatomi trigliceridai (bendras anglies atomų skaičius). Į trigliceridų formulę įrašius skirtingos molekulinės masės trigliceridų (C24-C54 tik lyginio C atomų skaičiaus) svorio procentus, pašaliniai riebalai nustatomi kokybiniu arba kiekybiniu metodais.

PASTABA. Galima taikyti kapiliarinę dujų chromatografiją, jei užtikrinamas rezultatų pakartojamumas.¹

4. Reagentai

Naudojami tik analiziškai gryni reagentai:

4.1. Nešančiosios dujos: azotas, grynumas >99,996%.

4.2. Sotieji etaloniniai trigliceridai², taip pat cholesterolis pieno riebalams standartizuoti pagal 6.5.4 punktą.

4.3. Metanolis bevandenis.

4.4. n-heksanas.

4.5. n-heptanas.

4.6. Toluolas.

4.7. Dimetilchlorsilano tirpalas: 50 ml dimetilchlorsilano ištirpinama 283 ml toluolo.

4.8. Degiosios dujos: vandenilis ir oras.

4.9. Nejudančioji fazė: 125/150 _m stambumo (100/120 meš) Gas ChromQ, padengto 3% OV-1³.

4.10. 10 % kakavos sviesto tirpalas. 5. Įranga

Naudojama įprastinė laboratorinė įranga ir toliau nurodyta.

5.1. Dujų chromatografas, tinkamas naudoti esant 400^Į50°C temperatūrai, su liepsnos jonizuojamu detektoriumi (LJD) ir nešančiųjų dujų masės pastovumo kontrole: degiosios dujos (H₂) – 30 ml/min, oras – 270 ml/min. Esant dideliam nešančiųjų dujų srautui, liepsna turi būti ypatingai didelė.

Dujų chromatografo tarpinės turi būti atsparios aukštai temperatūrai ir mažo pralaidumo. Tarpines reikia reguliariai keisti, pvz., apytikriai po 100 analizių arba pablogėjus atskyrimui (žr. 4 pav.).

PASTABOS:

1. Dėl aukštos temperatūros trigliceridų analizės metu detektoriaus ir įpurškimo sistemos stikliniai įdėklai turi būti dažnai valomi.

2. Tinka naudoti Chromblue (tm) tarpinę (Chrompack).

5.2. Chromatografinė kolonėlė

Tai U raidės formos kolonėlė (vidinis skersmuo 2 mm, ilgis 500 mm), kurios stiklinis paviršius pirmiausia inaktyvuojamas pagal 6.1 punkte aprašytą procedūrą silanizuojant dimetilchlorsilanu.

PASTABA. Galima naudoti ir ilgesnes (80-200 mm) užpildytas kolonėles, tada pasiekiamas truputį geresnis rezultatų pakartojamumas. Tačiau darbo metu nejudančioje fazėje atsiranda įtrūkimų, kurių pasekmė – blogesni kiekybiniai rezultatai. Be to, LJD liepsna lengvai užgęsta dėl didelio nešančiųjų dujų greičio nuo 75 ml/min iki 85 ml/min.

5.3. Kolonėlės užpildymo įrenginys (žr. 1 pav.):

5.3.1. plastikinė kolonėlė su užsukamais kamščiais bei žyma, iki kurios kolonėlė turi būti užpildyta nejudančiąja faze;

5.3.2. tankus sietas (tinklo akučių dydis apie 100 ixm) su užsukamu kamščiu, tinkamu užsandarinti stiklinę kolonėlę (1 pav.);

5.3.3. silanizuota stiklo vata;

5.3.4. vibratorius, skirtas tolygiam nejudančiosios fazės paskirstymui pripildymo metu.

1 pav. Kolonėlės pripildymas

5.4. Nuo 1 iki 3 ml Extrelut kolonėlė su silikageliu4 Ši kolonėlė naudojama alternatyviojoje pieno riebalų ekstrakcijoje;

5.5. 6,4 mm (1/4 colio) grafitinė tarpinė su 6 mm anga;

5.6. Įrenginiai kolonėlės silanizavimui pagal 6.1 punktą: 5.6.1. Vulfo kolba;

5.6.2. vandens siurblys.

5.7. Vandens vonia, palaikanti (50 ± 2)°C temperatūrą;

5.8. Džiovinimo spinta, palaikanti (50 ± 2)°C ir (100 ± 2)°C temperatūrą.

5.9. Mikropipetė.

5.10. Graduota 5 ml pipetė, skirta dozuoti 1,5 ml metanolio.

5.11. 50 ml apvaliadugnė kolba.

5.12. 50 ml Erlenmejerio kolba.

5.14. Filtras smulkiomis poromis.

5.15. Rotacinis garintuvas.

5.16. 1 ml buteliukai, užsandarinti aliumininiu kamščiu su tarpine.

5.17. Įpurškimo švirkštas: švirkšto stūmoklis neturi liesti adatos galo.

Adatos smaigalį reikia nuolatos tikrinti (pvz, stereomikroskopu), kad nepažeistų tarpinės.

PASTABA. Naudojant švirkštus yra geresnis rezultatų pakartojamumas.

6. Metodika

6.1. Kolonėlės paruošimas (silanizacija)

2 pav. Silanizavimo įrenginys

Vulfo kolba prijungiama (pagal 2 pav.) prie vandens siurblio, žarnelė (2) panardinama į tirpalą (4.7). Uždarius čiaupą, kolonėlė pildoma tirpalu (4.7). Po to abi žarnelės nuimamos. Kolonėlė pritvirtinama prie stovo ir pipete pilnai pripildoma dimetilchlorsilano tirpalu. Po 20-30 min Vulfo kolba pakeičiama vakuumine kolba, ir kolonėlės turinys išsiurbiamas (3 pav.).

6.2. Kolonėlės pripildymas

Kolonėlės pripildymas atliekamas po kolonėlės plovimo su 75 ml toluolo, 50 ml metanolio ir apytikriai 30 min džiovinimo spintoje, esant apie 100°C temperatūrai. Kolonėlė pripildoma pagal 1 pav. pateiktą schemą. Plastikinė kolonėlė iki žymės užpildoma nejudančiąja faze (4.9). Apatinis stiklinės kolonėlės galas užkemšamas apie 1 cm ilgio iš anksto silanizuotos stiklo vatos gabaliuku, kuris įspaudžiamas plieniniu strypeliu. Po to kolonėlės galas užsandarinamas sietu su kamščiu (5.3.2). Kolonėlė nejudančiąja faze pildoma esant 3 barų slėgiui N2 atmosferoje. Proceso metu vibratorius turi judėti aukštyn-žemyn, kad nejudančioji fazė stiklinėje kolonėlėje pasiskirstytų vienodai.

Pripildžius nejudančiąja faze, kitas kolonėlės galas užkemšamas tvirtai suspaustos silanizuotos stiklo vatos gabaliuku, išlindęs pluoštas nupjaunamas ir kamštelis mentele įstumiamas keletą milimetrų į kolonėlę.

Stiklinė kolonėlė

3 pav. Plovimo įranga.

6.3. Mėginių paruošimas

Mėginių paruošimui naudojamas vienas iš trijų pateiktų metodų:

6.3.1. pieno riebalų išskyrimas iš sviesto. 5-10 g sviesto išlydoma inde, įstatytame į 50°C temperatūros vandens vonią (5.7). 50 ml Erlenmejerio kolba ir piltuvas su filtru (5.14) pašildomi džiovinimo spintoje iki 50°C temperatūros. Išlydyto sviesto riebalinis sluoksnis nufiltruojamas per pašildytą įrangą. Šiuose pieno riebaluose beveik nėra fosfolipidų;

6.3.2. riebalų ekstrakcija Rose-Gotllieb metodu. Ekstrakcija atliekama pagal LST ISO 1211:2000, LST EN ISO 2450:2000, LST EN ISO 7328:2000, LST EN ISO 7208:2000. Taip paruoštuose pieno riebaluose esantys fosfolipidai cholesterolio smailę padidina 0,1 %. Jeigu chromatogramoje trigliceridų ir cholesterolio smailių plotas bus laikomas 100, tai šis cholesterolio smailės padidėjimas neturės žymesnės įtakos trigliceridų analizės rezultatams;

6.3.3. ekstrakcija naudojant silikagelio kolonėles. 0,7 ml 20°C temperatūros pieno mėginio mikropipete supilama į Extrelut kolonėlę (5.4) ir paliekama maždaug 5 minutėms, kad tolygiai pasiskirstytų ant silikagelio. Baltymų-lipidų komplekso denatūravimui pipete įlašinama 1,5 ml metanolio. Po to mėginys ekstrahuojamas su 20 ml n-heksano. n-heksanas pilamas mažais kiekiais,

o ištekantis tirpalas surenkamas į iki pastovaus svorio iškaitintą 50 ml apvaliadugnę kolbą. Po ekstrakcijos visas tirpalas išleidžiamas iš kolonėlės. Tirpiklis iš apvaliadugnės kolbos išdistiliuojamas rotaciniu garintuvu esant vandens vonios temperatūrai nuo 40 iki 50°C. Kolba išdžiovinama, o joje esančių riebalų kiekis nustatomas svėrimo būdu.

PASTABA. Pieno riebalų ekstrakcijos pagal Gerber, Weibull-Berntrop, Schmid-Bondzynski-Ratzlaff ar detergentiniu (BDI) metodais trigliceridų analizei taikyti negalima. Taikant šiuos metodus, į riebalų fazę pereina didesnė ar mažesnė dalis nevisiškai esterifikuotų gliceridų ar fosfolipidų.

6.4. Mėginio tirpalo paruošimas

Dujų chromatografijoje naudojamas riebalų (6.3) 5% tirpalas n-heptane. Ruošiant šį mėginio tirpalą, pasveriami atitinkami mėginių (6.3.1 ir 6.3.2) kiekiai ir ištirpinami atitinkamame kiekyje n-heptano. Ruošiant mėginio (6.3.3) tirpalą, pirmiausia apskaičiuojamas išskirtų riebalų kiekis, po to – reikalingo jų ištirpinimui n-heptano kiekis. Apytiksliai 1 ml mėginio tirpalo perpilama į buteliuką(5.16).

6.5. Chromatografinis trigliceridų nustatymas

Aukštoje, 350°C temperatūroje eliuojant ilgų grandinių C52-C56 trigliceridus, šiek tiek pakyla nulinė linija, ypač tais atvejais, jei kolonėlės nebuvo tinkamai apdorotos. Šio bazinės linijos pakilimo galima išvengti naudojant dvi kolonėles arba kitaip koreguojant nulinę liniją. Pasirinkus nulinės linijos koregavimo kompensacinį būdą ar dirbant su viena kolonėle, įpurškimo sistemos ir detektoriaus stiklo įdėklams reikia naudoti grafitines tarpines (5.5).

6.5.1. nulinės linijos korekcija

Siekiant išvengti nulinės linijos pakilimo reikia taikyti vieną iš šių keturių metodų:

6.5.1.1. kolonėlių derinimas

Taikant kompensacinį metodą naudojamos dvi kolonėlės;

6.5.1.2. nulinės linijos koregavimas dujų chromatografu

Atliekant bandymą be riebalų tirpalo, dujų chromatografu nustatoma ir koreguojama nulinė linija, išvengiant jos pakilimo;

6.5.1.3. nulinės linijos koregavimas kompiuterine programa

Atliekant bandymą be riebalų tirpalo, kompiuterine programa nustatoma ir koreguojama nulinė linija, išvengiant jos pakilimo;

6.5.1.4. nulinės linijos koregavimas atliekant tinkamą išankstinį kolonėlės kondicionavimą

Tinkamai kondicionavus kolonėlę ir maždaug 20 kartų atlikus pieno riebalų tirpalo dujų chromatografiją, nulinės linijos pakilimas aukštoje temperatūroje dažniausiai yra toks nežymus, kad galima atsisakyti jos koregavimo.

6.5.2. įpurškimo technika

Siekiant geresnių kiekybinių rezultatų ir užtikrinti, kad aukštoje temperatūroje verdantys trigliceridai būtų atskirti, taikoma „karšto įpurškimo technika“. Riebalų tirpalas įtraukiamas į švirkštą, šalta adata apytikriai 3s šildoma įpurškimo sistemoje, po to švirkšto turinys greitai įpurkščiamas.

PASTABA. Taikant šią įpurškimo techniką, išvengiama riebalų sustingimo švirkšte ir įpurškimo sistemoje. Neatliekamas tiesioginis įpurškimas viršutinėje, labiau šildomoje kolonėlės dalyje, nes čia gali kauptis tarpinės fragmentai ir teršalai, kuriuos galima lengvai pašalinti, reguliariai keičiant įpurškimo sistemos įdėklus, neišardant kolonėlės.

Reikia vengti adatos smaigalio lietimosi su indo, kuriame yra mėginys, dugnu, kad sulinkusi adata (net jeigu vizualiai tai nepastebima) nepažeistų tarpinės.

4 pav. Pieno riebalų trigliceridų chromatograma: a – blogas atskyrimas dėl tarpinės pažeidimo;

b – geras atskyrimas

6.5.3. pripildytos kolonėlės kondicionavimas

Atliekant operacijas nuo a) iki c) kolonėlė su detektoriumi nesujungiama, siekiant išvengti jo užteršimo.

Pagal 6.2 punktą pripildyta kolonėlė kondicionuojama taip:

a) 15 min leidžiamas N2 40 ml/min esant 50°C temperatūrai;

b) kaitinama iki 355°C, temperatūros kilimo greitis 1 °C/min, N2 srauto greitis 10 ml/min;

c) 12-15 h laikoma esant 355°C temperatūrai;

d) esant nustatytai temperatūrai 2 kartus atliekama kakavos sviesto analizė, įšvirkščiant po 1 ui tirpalo (4.10);

e) 20 kartų per 2-3 dienas atliekama pieno riebalų analizė, įšvirkščiant po 0,5 ui tirpalo (6.4).

PASTABA. Kakavos sviestas sudarytas beveik vien iš aukštose temperatūrose verdančių C50-C56 trigliceridų. Naudojant kakavos sviestą, kolonėlė specialiai paruošiama ilgų grandinių trigliceridų analizei. Aukštose temperatūrose verdančių trigliceridų C50-C54 analizės duomenų pataisos koeficientas yra iki 1,20. Pakartotinai atliekant pieno riebalų tirpalo analizę, pradinis aukštas analizės duomenų pataisos koeficientas, gautas tiriant trigliceridų kurių anglies atomų skaičius nuo C50 iki C54, sumažėja. Trigliceridų kurių riebalų rūgščių anglies atomų skaičius yra mažas, šis koeficientas yra 1. Paprastai paruošiamos trys poros pripildytų kolonėlių (6.2). Kondicionuotų kolonėlių poros tikrinamos atliekant įprastinę pieno riebalų analizę.

Tolesnei analizei naudojama ta kolonėlių pora, su kuria gauti geriausi kiekybiniai rezultatai (analizės duomenų pataisos koeficientas yra artimiausias 1). Kolonėlės, kurių pataisos koeficientas > 1,20, nenaudojamos.

6.5.4. kalibravimas

Trigliceridų ir cholesterolio analizės duomenų pataisos koeficientų nustatymui naudojami etaloniniai trigliceridai (bent jau sotieji C24, C30, C36, C42, C48 ir C54 trigliceridai, bei cholesterolis; dar geriau, jei bus papildomai panaudoti C50 ir C52 etaloniniai trigliceridai). Tarpinių trigliceridų analizės duomenų pataisos koeficientai nustatomi matematinės interpoliacijos būdu. Naudojant etaloninius riebalus, kalibravimą reikia atlikti 2-3 kartus per dieną. Jei gaunami identiški rezultatai, tai atliekant mėginių trigliceridų analizę, pasiekiamas geras kiekybinių rezultatų pakartojamumas. Etaloniniai pieno riebalai, laikant ne aukštesnėje nei -18 °C temperatūroje, tinkami naudojimui keletą mėnesių.

PASTABA. Kiekvienos iš sudedamųjų dalių pataisos koeficientas gali būti nustatomas naudojant etaloninius pieno riebalus su sertifikuota trigliceridų sudėtimi, pavyzdžiui, CRM 519 (bevandeniai pieno riebalai), kuriuos galima įsigyti Belgijoje (Institute for Reference Materials and Measurements, Geel, Belgium).

6.5.5. temperatūros režimas, nešančiosios dujos ir kitos trigliceridų analizės sąlygos Temperatūros režimas: 210°C pradinė kolonėlės temperatūra išlaikoma 1 min, tada keliama

6 °C/min iki 350°C ir laikoma šioje temperatūroje 5 minutes. Detektoriaus ir įpurškimo sistemos temperatūra 370°C.

Nešančiosios dujos: azotas, srauto greitis 40 ml/min.

Analizės trukmė 29,3 minutės; įpurškimo tūris 0,5 ui.

Liepsnos jonizuojamo detektoriaus režimas: turi atitikti 5.1 punktą. Jis įkaitinamas kiekvienos darbo dienos pradžioje.

PASTABOS:

1. Detektoriaus, įpurškimo sistemos ir kameros pradinė temperatūra palaikoma pastovi (taip pat naktį, savaitgalį, atostogų metu).

2. Naudojant 80 cm ilgio kolonėles, N2 srauto greitis turi būti ne mažesnis kaip 75 ml/min ir palaikomas pastovus (taip pat naktį, savaitgalį, atostogų metu). Tikslus dujų srauto greitis turi būti sureguliuotas taip, kad C54 būtų eliuojamas 341°C temperatūroje, nepriklausomai nuo kolonėlės ilgio.

3. Po kiekvieno įpurškimo švirkštą reikia keletą kartų perplauti heptanu. 7. Rezultatų įvertinimas ir matavimo sąlygų kontrolė

Nelyginio acyl-c skaičiaus (2n+l) trigliceridų smailių plotai sujungiami su atitinkamų žemesnių turinčių lyginį acyl-c skaičių (2n) trigliceridų smailių plotais. Mažiau pakartojamos mažos C56 smailės nepriskaičiuojamos. Likusiųjų trigliceridų smailių plotas chromatogramoje, įskaitant cholesterolio smailę (greta C24 smailės), yra dauginamas iš etaloninių riebalų (paskutinis kalibravimas) atitinkamų analizės duomenų pataisos koeficiento, ir visų smailių plotų suma prilyginama 100. Apskaičiuojamas C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52, C54 trigliceridų ir laisvojo cholesterolio smailių plotų suma prilyginama 100. Rezultatai išreiškiami masės procentais (g/lOOg).

Chromatogramos smailės ploto įvertinimui naudojamas integratorius, kuris nubrėžia nulinę liniją. Taip pat galima nulinės linijos reintegracija su optimizuotais integraciniais parametrais.

5 ir 6 pav. pateikti du trigliceridų chromatogramų pavyzdžiai. 5 pav. pavaizduota taisyklinga chromatograma, o 6 pav. vaizduojama atsitiktinė klaida tarp C50 ir C54 smailių, nes nulinė linija, palyginti su 5 pav., yra netaisyklinga. Tik naudojant integratorių, kuris nubrėžia nulinę liniją yra didelė tikimybė pastebėti tokias klaidas ir jų išvengti.

Matavimo sąlygoms kontroliuoti gali būti naudojami santykiniai standartiniai nuokrypiai RSD: (variacijos koeficientas x 100), gauti atlikus tų pačių riebalų 19 analizių kurių vertės skirtingiems trigliceridams pateiktos 1 lentelėje.

1 lentelė. Trigliceridų kiekio santykinis standartinis nuokrypis (RSD), n=19

Trigliceridas	RSD (%)
C24 C26 C28 C30 C32 C34 C36 C38 C40 C42 C44 C46 C48 C50 C52 C54	10,00 2,69 1,76 3 03 1,03 0,79 0,25 0,42 0,20 0,26 0,34 0,37 0,53 0,38 0,54 0,60

5 pav. Pieno riebalų trigliceridų chromatograma su teisingai nubrėžta nuline linija

6 pav. Klaidingai integruota pieno riebalų chromatograma

Esant didesniems santykiniams standartiniams nuokrypiams (RSD), nei nurodyta 1 lentelėje, chromatografijos atlikimo sąlygos nėra tinkamos ir reikia patikrinti tarpinę ar nešančiųjų dujų srautą. Smulkios tarpinės dalelės gali nusėsti ant stiklo vatos kolonėlės pradžioje arba kolonėlė yra nebetinkama naudoti dėl nusidėvėjimo, temperatūros poveikio ir 1.1, (žr. 3 pav.).

PASTABA. 1 lentelėje pateiktos vertės nėra privalomos, bet suteikia informaciją apie kokybę. Tačiau jei yra priimamos didesnės RSD vertės, pakartojamumo ir atitikimo ribos, nurodytos 11 punkte, vis dėlto turi atitikti.

8. Kokybinis pašalinių riebalų nustatymas

Pašalinių riebalų trigliceridams nustatyti buvo sudarytos formulės (2 lentelė) ir grynųjų pieno riebalų S ribos (3 lentelė), nes galima grynųjų pieno riebalų S verčių fliuktuacija. Jei šios ribos viršijamos, tai daroma prielaida, kad yra pašalinių riebalų.

Tiksliausia formulė, padedanti nustatyti kiaulinių taukų priemaišą yra ši:

6,5125 x C26 + 1,2052 x C32 + 1,7336 x C34 + 1,7557 x C36 + 2,2325 x C42 + 2,8006 x C46 + 2,5432 x C52 + 0,9892 xC54 = S                                                                           (1)

PASTABA. 755-iems pieno riebalų mėginiams nustatytas S pasikliovimo intervalas 97,96-102,04, esant visų grynųjų pieno riebalų pavyzdžių S verčių standartiniam nuokrypiui SD 0,39897, esant 99 % tikimybei.

Jei reikia ištirti nežinomos sudėties riebalų mėginį, tai ši formulė suteikia galimybę paprastomis priemonėmis, nenaudojant kompiuterio, įsitikinti, ar trigliceridų kiekio suma, čia pateikta su atitinkamais pataisos koeficientais, išeina už 97,96-102,04 intervalo ribų, ir jeigu taip, tai yra didelė pašalinių riebalų priemaišų tikimybė.

2 lentelėje pateiktos atitinkamos trigliceridų formulės pašalinių sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejaus, hidrogenizuotų žuvies taukų, kokoso ir palmių riešutų aliejaus, taip pat palmių aliejaus ir galvijų lajaus priemaišoms kokybiškai nustatyti.

Pašalinių riebalų trigliceridų sudėtis kinta, todėl atliekama iki keturių skirtingų to paties tipo trigliceridų matavimų. (Naudojant tuos pačius pašalinių riebalų tipus, įskaitoma „nepalankiausia“ nustatymo riba (žr. 4 lentelę)).

Geri visų pašalinių riebalų nustatymo rezultatai gaunami pagal šią bendrąją formulę:

-2,7575 x C26 + 6,4077 x C28 + 5,5437 x C30 – 15,3247 x C32 + 6,2600 x C34 + 8,0108 x C40 –5,0336 x C42 + 0,6356 x C44 + 6,0171 x C46 = S                     (2)

Skaičiavimai bet kokių pašalinių riebalų deriniui nustatyti pieno riebaluose parodė, kad, pvz., taikant 2 lentelėje nurodytą kiaulinių taukų formulę, kiaulinių taukų nustatymo riba yra nuo

2,7%, bet taikant šią formulę kitiems riebalams, pvz., kokoso, palmių, palmių riešutų aliejui nustatyti, nustatymo riba yra atitinkamai nuo 26,8%, 12,5% ar 19,3%, t. y. šių aliejų priemaiša gali būti nustatyta pagal kiaulinių taukų formulę tik tada, jeigu jų į pieno riebalus pridedami labai dideli kiekiai. Tai pasakytina ir apie kitas 2 lentelėje pateiktas formules.

2 lentelė. Trigliceridų formulės pašalinių riebalų priemaišoms nustatyti pieno riebaluose S vertės ir jų standartiniai nuokrypiai SD

Pašalinių sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejaus ir žuvų taukų nustatymo formulės:

2,0983 x C30 + 0,7288 x C34 + 0,6927 x C36 + 0,6353 x C38 + 3,7452 xC40 – 1,2929 x C42 + 1,3544 x C44 + 1,7013 x C46 + 2,5283 x C50 = S; SD = 0,38157

Pašalinių kokoso ir palmių riešutų aliejaus nustatymo formulės:

3,7453 x C32 + 1,1134 x C36 + 1,3648 x C38 + 2,1544 xC42 + 0,4273 x C44 + 0,5809 x C46 + 1,1226 x C48 + 1,0306 x C50 + 0,9953 x C52 + 1,2396 x C54 = S; SD = 0,11323

Pašalinių palmių aliejaus ir j autinių taukų arba taukų nustatymo formulės:

3,6644 x C28 + 5,2297 x C30 – 12,5073 x C32 + 4,4285 x C34 – 0,2010 xC36 + 1,2791 x C38 + 6,7433 x C40 -4,2714 x C42 + 6,3739 x C46 = S; SD = 0,81094

Pašalimų kiaulinių taukų nustatymo formulė:

6,5125 x C26 + 1,2052 x C32 + 1,7336 x C34 + 1,7557 x C36 + 2,2325 x C42 + 2,8006 x C46 + 2,5432 x C52 + 0,9892 x C54 = S; SD = 0,39897

Tiriant nežinomų riebalų mėginį (jei mėginyje yra pieno riebalų ir vienas iš (arba visų) 14 pašalinių riebalų mišinys), taikomos visos 2 lentelėje pateiktos formulės ir bendroji formulė (2). Jei nors pagal vieną iš penkių formulių apskaičiuotos S vertės yra už 3 lentelėje pateiktų verčių ribų, tai daroma prielaida, kad mėginyje yra modifikuotų pieno riebalų. Pašalinių riebalų nustatymas piene, remiantis viena iš keturių formulių pagal 2 lentelę, neleidžia daryti išvados, kokių pašalinių riebalų pridėta.

3 lentelė. Pieno riebalų S-ribos

Formulė pašaliniams riebalams nustatyti:	S – ribos
Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, linų sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų Kokoso ir palmių riešutų aliejų Palmių aliejaus ir jautiniai taukai Kiaulinių taukų Bendroji formulė	98,05-101, 95 99, 42-100, 58 95, 90-104, 10 97,96-102, 04 95,68-104,32

4 lentelėje nurodytos įvairių pašalinių riebalų nustatymo ribos, kai tikimybė – 99 %. Pirmoje skiltyje pateiktos minimalios nustatymo ribos, taikant 2 lentelės formules, antroje skiltyje – bendrąją formulę. Vien pastarosios formulės pakanka nustatyti nežymius pašalinių riebalų kiekius. Taikant visas formules, nustatomi įvairių pašalinių riebalų deriniai. Pašalinių riebalų trigliceridų sudėties fliuktuacija neturi žymesnės įtakos nustatymo ribai.

4 lentelė. Pašalinių riebalų nustatymo ribos (%), esant tikimybei 99 %

Pašaliniai riebalai	Individuali formulė	Bendroji formulė
Sojų aliejus	2,1	4,4
Saulėgrąžų aliejus	2,3	4,8
Alyvų aliejus	2,4	4,7
Kokoso aliejus	3,5	4,3
Palmių aliejus	4,4	4,7
Palmių riešutų aliejus	4,6	5,9
Rapsų aliejus	2,0	4,4
Sėmenų aliejus	2,0	4,0
Kviečių gemalų aliejus	2,7	6,4
Kukurūzų gemalų aliejus	2,2	4,5
Medvilnės aliejus	3,3	4,4
Kiauliniai taukai	2,7	4,7
Jautiniai taukai	5,2	5,4
Hidrogenizuoti žuvų taukai	5,4	6,1

PASTABA. Tokiu būdu S ribos yra apskaičiuojamos tuomet, kai daroma prielaida, kad yra pašalinių riebalų priemaiša arba nustatymo pagal individualias formules ribų viršijimas (žr. 4 lentelę).

9. Kiekybinis pašalinių riebalų nustatymas

Pašalinių riebalų kiekiui X (%) apskaičiuoti pieno riebaluose yra taikoma ši formulė:

Šioje formulėje X reiškia nežinomų pašalimų riebalų arba pašalimų riebalų mišinio kiekį nežinomuose pieno riebaluose. S apskaičiuojamas į bendrąją formulę įrašius pašalinių riebalų ar pašalinių riebalų ir pieno riebalų mišinio trigliceridų analizės rezultatus. Jei pašaliniai riebalai nežinomi, tai nustatomos grynųjų pašalinių riebalų S vertės, į bendrąją formulę įrašius grynųjų pašalinių riebalų trigliceridų analizės rezultatus, ir apskaičiuojamas S vidurkis (S_F = 7,46). Geri kiekybiniai pašalinių riebalų nustatymo rezultatai gaunami pagal palmių aliejaus ir jautinių taukų formulę (2 lentelė) ir S_F = 10,57.

Jei pašaliniai riebalai žinomi, tai į formulę (3) įrašomos S_F vertės, paimtos iš 5 lentelės, ir parenkama atitinkama pašalinių riebalų formulė apskaičiuoti S iš 2 lentelės.

5 lentelė. Įvairių pašalinių riebalų S_F vertės

Pašaliniai riebalai	SF
Kokoso aliejus	118,13
Palmių aliejus	7,55
Palmių riešutų aliejus	112,32
Rapsų aliejus	3,30
Sėmenų aliejus	4,44
Kviečių gemalų aliejus	27,45
Kukurūzų gemalų aliejus	9,29
Medvilnės aliejus	41,18
Kiauliniai taukai	177,55
Jautiniai taukai	17,56
Žuvų taukai	64,12

10. Metodo taikymo sritis:

Aprašytasis metodas taikomas pieno partijai ir gavus reprezentatyvųjį mėginį.

Galimas specialus reprezentatyviojo mėginio tyrimas, jei mėginys sudarytas skirtingose šalyse pagal aukščiau nurodytas formules.

Galimybės nustatymui galėtų būti labai geros, jeigu skirtingų šalių formulėse, kurios aprašytos šiame dokumente, būtų nustatytas reprezentatyvus pieno riebalų mėginių kiekis.

Jei yra taikomi 2 lentelėje pateikti trigliceridų deriniai, nereikia sudėtingų kompiuterinių programų, o pataisos koeficientai yra nustatomi iš naujo, taikant mažiausių kvadratų metodą.

Taikant 3 lentelėje pateiktas S ribas, formules galima taikyti bendrai, esant ypatingoms šėrimo sąlygoms, pvz., jei šeriama nepakankamai arba pašarinėmis mielėmis, kalcio muilu. Tik esant ekstremalioms šėrimo sąlygoms (pvz., sušertas didelis kiekis aliejingų pašarų, kalcio muilų kartu su pašarų riebalais ir t. t), pritaikius formules randama pieno riebalų modifikaciją.

PASTABA. Viršijus ribinius dydžius ir darant prielaidą, kad gali būti modifikacija, frakcionuoti pieno riebalai iš esmės atpažįstami kaip nemodifikuoti riebalai. Pieno riebalų frakcijos su neįprasta pieno riebalų sudėtimi (pvz., kietoji frakcija, gaunama fizikiniais metodais esant apie 30°C temperatūrai ir mažai išeigai arba naudojant ypatingas sąlygas C0₂ atmosferoje) identifikuojamos kaip modifikuoti riebalai.

Pieno riebalų frakcionavimą galima nustatyti taikant ir kitus metodus, pvz., diferencinę skanavimo kalorimetriją.

11. Tikslumas

Metodo tikslumas nustatytas pagal pieno riebalus, taikant 2 lentelėje pateiktas formules ir 3 lentelėje-S ribų vertes.

11.1. Pakartojamumas

Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų S verčių, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas.

6 lentelė. Pakartojamumo (r) ribos, taikant skirtingas trigliceridų formules

Formulė pašaliniams riebalams nustatyti	r
Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų
gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų	0,67
Kokosų ir palmių riešutų aliejų	0,12
Palmių aliejaus ir jautinių taukų	1,20
Kiaulinių taukų	0,58
Bendroji	1,49

11.2. Atkuriamumas

Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų S verčių, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas.

7 lentelė. Atkuriamumo ribos (R), taikant skirtingas trigliceridų formules

Formulė pašaliniams riebalams nustatyti	R
Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų
gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų	1,08
Kokosų ir palmių riešutų aliejų	0,40
Palmių aliejaus ir jautinių taukų	1,81
Kiaulinių taukų	0,60
Bendroji	2,07

11.3. Leistinas nuokrypis

Remiantis pakartojamumo (r) ir atkuriamumo (R) vertėmis, galima apskaičiuoti visų 3 lentelėje pateiktų S verčių leistinąjį nuokrypį (du analizės pakartojimai). Atitinkamos vertės pateiktos 8 lentelėje.

8 lentelė. Visų trigliceridų formulių leistini nuokrypiai

Formulė pašaliniams riebalams nustatyti	Ribos
Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų
gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų	97,43-102,57
Kokosų ir palmių riešutų aliejų	99,14-100,86
Palmių aliejaus ir jautinių taukų	94,91-105,09
Kiaulinių taukų	97,65-102,35
Bendroji	94,58-105,42

11.4. Rezultatų priimtinumas

Visi apskaičiuoti ir suapvalinti šimtųjų tikslumu C24, C26, C28 iki C54 trigliceridų kiekiai turi būti pakoreguoti taip, kad jų suma atitiktų 100.

Dviejų analizės pakartojimų rezultatai taikomi pakaitojamumui patikrinti. Pakartojamumas laikomas priimtinu, jei absoliutusis S verčių, apskaičiuotų pagal visas 5 trigliceridų formules, skirtumas tarp dviejų analizių neviršija pakartojamumo (r) ribų pagal 6 lentelę.

Kad būtų užtikrintos optimalios dujų chromatografijos sąlygos, ypač kolonėlės kokybė, 10 kartų pakartotų analizių metu apskaičiuotos pagal penkias trigliceridų formules maksimalios ir

minimalios S vertės turi neviršyti X x r ribos, čia X = 1,58 (žr.: 10 analizės pakartojimų – [16], r – 6 lentelėje).

12. Nurodyti standartai

DIN 10 336:1994 Nachweis and Bestimmung von Fremdfetten in Milchfett anhand einer

gaschromatograpischenTriglyceridanalyse.

LST ISO 1211:2000 Pienas. Riebalų kiekio nustatymas. Gravimetrinis metodas (pamatinis

metodas).

LST EN ISO 2450:2000 Grietinė. Riebalų kiekio nustatymas. Gravimetrinis metodas (pamatinis

metodas).

LST EN ISO 7328:2000 Pieniniai valgomieji ledai ir ledų mišiniai. Riebalų kiekio nustatymas.

Gravimetrinis metodas (pamatinis metodas).

LST EN ISO 7208:2000 Liesas pienas, išrūgos ir pasukos. Riebalų kiekio nustatymas.

Gravimetrinis metodas (pamatinis metodas).

13. Literatūra

1. Commission of the European Communities: Detection of foreign fats in milk fat by means of gas chromatographic triglyceride analysis, Doc. No V1/5202/90-EN, Vl/2645/91.

2. Commission of the European Communities: Control of butter fat purity of 100 different samples of different feeding periods from 11 EEC countries; Doc. No Vl/4577/93.

3. Commission of the European Communities: Consideration of results from the first, second, third, fourth, fifth and sixth EEC collaborative trial: Determination of triglycerides in milk fat: Doc. No Vl/2644/91, W8. ll.91, Vl/1919/92, Vl/3842/92, Vl/5317/92, Vl/4604/93.

4. Timms, R. E.: Detection and ąuantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47295-303 (1980).

5. Precht, D., Heine. K: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen, 41 406-410 (1986).

6. Luf, W., Stock, A., Brandi, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett ūber die Triglyceridanalyse. Osterr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 29-35 (1987).

7. Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 143-157 (1989).

8. Precht, D.: Schnelle Extraktion von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 119-128 (1990).

9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 139-154 (1990).

10. Precht, D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 43 (3) 219-242 (1991).

6 lentelė. Pakartojamumo (r) ribos, taikant skirtingas trigliceridų formules

Formulė pašaliniams riebalams nustatyti	r
Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų
gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų	0,67
Kokosų ir palmių riešutų aliejų	0,12
Palmių aliejaus ir jautinių taukų	1,20
Kiaulinių taukų	0,58
Bendroji	1,49

11.2. Atkuriamumas

Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų S verčių, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas.

7 lentelė. Atkuriamumo ribos (R), taikant skirtingas trigliceridų formules

Formulė pašaliniams riebalams nustatyti	R
Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų
gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų	1,08
Kokosų ir palmių riešutų aliejų	0,40
Palmių aliejaus ir jautinių taukų	1,81
Kiaulinių taukų	0,60
Bendroji	2,07

11.3. Leistinas nuokrypis

Remiantis pakartojamumo (r) ir atkuriamumo (R) vertėmis, galima apskaičiuoti visų 3 lentelėje pateiktų S verčių leistinąjį nuokrypį (du analizės pakartojimai). Atitinkamos vertės pateiktos 8 lentelėje.

8 lentelė. Visų trigliceridų formulių leistini nuokrypiai

Formulė pašaliniams riebalams nustatyti	Ribos
Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų
gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų	97,43-102,57
Kokosų ir palmių riešutų aliejų	99,14-100,86
Palmių aliejaus ir jautinių taukų	94,91-105,09
Kiaulinių taukų	97,65-102,35
Bendroji	94,58-105,42

11.4. Rezultatų priimtinumas

Visi apskaičiuoti ir suapvalinti šimtųjų tikslumu C24, C26, C28 iki C54 trigliceridų kiekiai turi būti pakoreguoti taip, kad jų suma atitiktų 100.

Dviejų analizės pakartojimų rezultatai taikomi pakaitojamumui patikrinti. Pakartojamumas laikomas priimtinu, jei absoliutusis S verčių, apskaičiuotų pagal visas 5 trigliceridų formules, skirtumas tarp dviejų analizių neviršija pakartojamumo (r) ribų pagal 6 lentelę.

Kad būtų užtikrintos optimalios dujų chromatografijos sąlygos, ypač kolonėlės kokybė, 10 kartų pakartotų analizių metu apskaičiuotos pagal penkias trigliceridų formules maksimalios ir

minimalios S vertės turi neviršyti X x r ribos, čia X = 1,58 (žr.: 10 analizės pakartojimų – [16], r – 6 lentelėje).

12. Nurodyti standartai

DIN 10 336:1994 Nachweis and Bestimmung von Fremdfetten in Milchfett anhand einer

gaschromatograpischenTriglyceridanalyse.

LST ISO 1211:2000 Pienas. Riebalų kiekio nustatymas. Gravimetrinis metodas (pamatinis

metodas).

LST EN ISO 2450:2000 Grietinė. Riebalų kiekio nustatymas. Gravimetrinis metodas (pamatinis

metodas).

LST EN ISO 7328:2000 Pieniniai valgomieji ledai ir ledų mišiniai. Riebalų kiekio nustatymas.

Gravimetrinis metodas (pamatinis metodas).

LST EN ISO 7208:2000 Liesas pienas, išrūgos ir pasukos. Riebalų kiekio nustatymas.

Gravimetrinis metodas (pamatinis metodas).

13. Literatūra

1. Commission of the European Communities: Detection of foreign fats in milk fat by means of gas chromatographic triglyceride analysis, Doc. No V1/5202/90-EN, Vl/2645/91.

2. Commission of the European Communities: Control of butter fat purity of 100 different samples of different feeding periods from 11 EEC countries; Doc. No Vl/4577/93.

3. Commission of the European Communities: Consideration of results from the first, second, third, fourth, fifth and sixth EEC collaborative trial: Determination of triglycerides in milk fat: Doc. No Vl/2644/91, W8. 11.91, Vl/1919/92, Vl/3842/92, Vl/5317/92, Vl/4604/93.

4. Timms, R. E.: Detection and ąuantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47295-303 (1980).

5. Precht, D., Heine. K: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen, 41 406-410 (1986).

6. Luf, W., Stock, A., Brandi, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett ūber die Triglyceridanalyse. Osterr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 29-35 (1987).

7. Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 143-157 (1989).

8. Precht, D.: Schnelle Extraktion von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 119-128 (1990).

9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 139-154 (1990).

10. Precht, D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 43 (3) 219-242 (1991).

______________

Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės

metodų taikymo techninio reglamento

22 priedas

FORMULĖS, AUGALINIŲ RIEBALŲ PĖDSAKŲ RIBOMS KONCENTRUOTAME SVIESTE NUSTATYTI

Parengtos pagal 1990 m. vasario 20 d. Europos Komisijos reglamento Nr. 429/90/EB priedą.

Toliau nurodytų medžiagų pėdsakai skaičiuojami 100 kg tiesiogiai vartoti skirto koncentruoto sviesto.

I formulė:

- arba 15 g ne mažesnio kaip 95 % grynumo stigmasterolio (C29H480=D 5,22-stigmastene-3-beta-ol), paskaičiuoto gatavam ingredientui,

- arba 17 g ne mažesnio kaip 85 % grynumo stigmasterolio (C29H480=D 5,22-stigmastene-3-beta-ol), paskaičiuoto gatavam ingredientui ir turinčio ne daugiau kaip 7,5 % brasikasterolio (C28H460=D 5,22-ergostene-3-beta-ol) ir ne daugiau kaip 6 % sitosterolio (C29H50O=D5-stigmastene-3-beta-ol),

- arba 1,1 kg ne mažesnio kaip 95 % grynumo enanto (n-heptano) rūgšties trigliceridų, paskaičiuotų trigliceridais gatavam ingredientui, kurio rūgščių skaičius ne didesnis kaip 0,3, apmuilinimo skaičius tarp 385 ir 395, ir ne mažiau kaip 95 % enanto rūgšties esterifikuota.

II formulė:

- arba 10 g sviesto (butano) rūgšties etilo esterio ir 15 g stigmasterolio (C29H480=D 5,22-stigmastene-3-beta-ol), ne mažesnio kaip 95 % grynumo, paskaičiuotų gatavam ingredientui,

- arba 10 g sviesto (butano) rūgšties etilo esterio ir arba 17 g ne mažesnio kaip 85 % grynumo stigmasterolio (C29H480=D 5,22-stigmastene-3-beta-ol), paskaičiuoto gatavam ingredientui ir turinčio ne daugiau kaip 7,5 % brasikasterolio (C28H460=D 5,22-ergostene-3-beta-ol) ir ne daugiau kaip 6 % sitosterolio (C29H50O=D 5-stigmastene-3-beta-ol),

-arba 10 g sviesto (butano) rūgšties etilo esterio irl,l kg ne mažesnio kaip 95 % grynumo enanto (n-heptano) rūgšties trigliceridų, paskaičiuotų trigliceridais gatavam ingredientui, kurio rūgščių skaičius ne didesnis kaip 0,3, apmuilinimo skaičius tarp 385 ir 395, ir ne mažiau kaip 95 % enanto rūgšties esterifikuota.

______________

---

^* Honvitz lygtis:

RSD_R(%) = 2¹-^05,°

kur:

RSD_R – santykinis standartinis atkuriamumo nuokrypis;

c – koncentracija, išreikšta dešimtaine trupmena (pvz., 10 g/100 g = 0,1). R = 0,0283 jc-RSDr;

kur x – aritmetinis gautų rezultatų vidurkis. Keletas apskaičiuotų RSD_R verčių pavyzdžių:

Koncentracija                                                              RSDr, %

1 g/100 g                                                                              4

0,01 g/100 g                                                                        8

1 mg/l 000 g                                                                       16

Kai analitės koncentracija yra 1 g/100 g, gaunama:

R = 0,0283*1*4 = 0,11 g/100 g.

Naudota literatūra:

Peeler J. T., Honvitz W., Albert R. Journal of the Association of Official Analytical Chemists. 1989. Vol. 72, No.5. P. 784-806.

^*) „PASTABA. Pavyzdžiui, jeigu yra gauti y₁₁, y₁₂, y₂₁ ir y₂₂ rezultatai, turi būti apskaičiuojamiy₁₁/y₁₂  ir y₁₂/y₂₂ aritmetiniai vidurkiai.

¹ „M. Thompson and R. Wood. Pure and Applied Chemistry, 67 (4), P. 649-666 (1995)

¹ KPN 2309 kodu klasifikuojamuose produktuose, kurių sudėtyje yra KPN kodus 0401, 0402, 0403, 0404 atitinkančių pieno produktų.

¹ IDF 135B/1991. Pienas ir pieno produktai. Analizės metodų tikslumo charakteristikos. Bendrų tyrimų metodikos apžvalga. (International Dairy Federation Standard 135B/1991. Milk and milk products. Precision characteristics of analytical methods. Outline ofcollaborative study procedure).

¹ PASTABA. Analizuojant pieno miltelius, gali būti gauti klaidingi teigiami rezultatai. Todėl labai svarbu tikrinti, kad, taikant naudoj amą bandymo sistemą, nebūtą gauti klaidingi teigiami rezultatai.

¹ Tinkamą metodą aprašė D. Precht and J. Molkentin: Quantative triglyceride analysis using short capillary columns, ChrompackNews 4, 16-17 (1993).

² Tinkamas produktas yra prekyboje.

³Tinkamas naudoti produktas, kurio prekinis pavadinimas Extrelut, Gas ChromQ, Chrompack, yra specializuotoje prekyboje. Ši informacija palengvina standarto naudojimą tačiau neprivaloma. Nurodyta dalelių dydžio dimensija gali būti paversta į SI sistemos vienetus pagal BS 410:1988 „British Standard Speciflcation for tęst sieves“.