LIETUVOS RESPUBLIKOS VALSTYBINĖS MAISTO IR VETERINARIJOS TARNYBOS DIREKTORIUS
Į S A K Y M A S
DĖL KLASIKINIO KIAULIŲ MARO DIAGNOZAVIMO VADOVO PATVIRTINIMO
2003 m. birželio 30 d. Nr. B1-591
Vilnius
Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos veterinarijos įstatymu (Žin., 1992, Nr. 2-15) ir įgyvendindamas Lietuvos Respublikos Vyriausybės 2003 m. kovo 5 d. nutarimu Nr. 292 „Dėl Lietuvos pasirengimo narystei Europos Sąjungoje programos (Nacionalinė ACQUIS priėmimo programa) teisės derinimo priemonių ir ACQUIS įgyvendinimo priemonių 2003 metų planų patvirtinimo“ (Žin., 2003, Nr. 25-1019) patvirtintą Teisės derinimo priemonių 2003 metų planą:
2. Pavedu įsakymo vykdymo kontrolę Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos Gyvūnų sveikatingumo skyriui.
PATVIRTINTA
Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos
direktoriaus 2003 m. birželio 30 d. įsakymu
Nr. B1-591
KLASIKINIO KIAULIŲ MARO DIAGNOZAVIMO VADOVAS
Klasikinio kiaulių maro diagnozavimo vadovas (toliau – Vadovas) parengtas vadovaujantis Lietuvos Respublikos veterinarijos įstatymu (Žin., 1992, Nr. 2-15) ir įgyvendina 2002 m. vasario 1 d. Komisijos sprendimą 2002/106/EB, patvirtinantį vadovą, nustatantį klasikinio kiaulių maro diagnozavimo tvarką, mėginių ėmimo metodus ir ligos patvirtinimo kriterijus.
I SKYRIUS
BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Norint užtikrinti vienodą klasikinio kiaulių maro (toliau – KKM) diagnozavimo tvarką, šiame Vadove:
1.1. pateikiami diagnostinių procedūrų, mėginių ėmimo metodų, klinikinių ir patologinių anatominių tyrimų bei laboratorinių tyrimų nurodymai ir minimalūs reikalavimai teisingai KKM diagnozei nustatyti;
1.2. nustatomi minimalūs biologinės saugos reikalavimai ir kokybės standartai, kurių privaloma laikytis KKM diagnostinėms laboratorijoms ir pristatant mėginius;
2. Vadovas yra skirtas VMVT, kuri yra atsakinga už KKM kontrolę, todėl jame nurodomi laboratorinių tyrimų principai ir taikymas bei rezultatų vertinimas, o ne detalizuojami laboratorinių tyrimų metodai.
3. Vartojamos sąvokos:
Kontaktavusios kiaulės – kiaulės, kurios paskutines 21 dieną ūkyje tiesiogiai kontaktavo su viena arba daugiau kiaulių, įtariamų užsikrėtus KKM.
Pavienės teigiamai reaguojančios kiaulės – kiaulės, kurioms nustatyta teigiama serologinė reakcija į KKM, tačiau nėra epidemiologinio tyrimo duomenų apie jų kontaktus su KKM virusu, ir kurios neplatina ligos kitoms kiaulėms.
Ūkis (laikymo vieta), kurio (-ios) kiaulėms įtariamas KKM (toliau – įtariamas ūkis (laikymo vieta)) – kiaulių laikymo vieta, kurioje yra viena ar daugiau kiaulių, kurioms įtariamas KKM, arba ūkis, kurio kiaulės turėjo kontaktą su užkrėsto ar įtariamo ūkio kiaulėmis, kaip nurodyta Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimuose (Žin., 2002, Nr. 71-2999), parengtuose pagal 2001 m. spalio 23 d. Tarybos direktyvą 2001/89/EB dėl ES priemonių klasikiniam kiaulių marui kontroliuoti.
Valstybinė maisto ir veterinarijos tarnyba (toliau – VMVT) – Lietuvos Respublikos kompetentinga institucija.
Kitos vartojamos sąvokos nurodytos Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimuose.
4. VMVT turi užtikrinti, kad KKM būtų patvirtinamas pagal Vadovo reikalavimus, nustačius:
II SKYRIUS
KLASIKINIS KIAULIŲ MARAS
I SKIRSNIS
BENDRIEJI DUOMENYS
6. KKM sukelia RNR virusas, priklausantis flaviviridae šeimos pestivirusų rūšiai. Virusas yra giminingas atrajotojų pestivirusams, kurie sukelia galvijų virusinę diarėją (toliau – GVD) ir sienos ligą (toliau – SL). Dėl šios priežasties gali kilti kryžminės reakcijos, kurios sąlygoja klaidingus teigiamus laboratorinių tyrimų rezultatus.
7. KKM virusas yra sąlyginai stabilus KKM užsikrėtusių kiaulių drėgnose išskyrose, kiaulių skedenose, šviežioje kiaulienoje ir kai kuriuose kiaulienos produktuose. Jį gerai inaktyvuoja detergentai, riebalų tirpikliai, proteazės ir dezinfekavimo medžiagos.
8. Pagrindinis natūralus infekcijos patekimo būdas yra per burną-nosį, tiesiogiai arba netiesiogiai kontaktuojant su infekuotomis kiaulėmis arba šeriant virusu užkrėstais pašarais. Teritorijoje esant dideliam kiaulių populiacijos tankumui, virusas paprastai išplinta į gretimus kiaulių ūkius. Infekcija taip pat gali būti perduodama per užkrėstų kuilių spermą.
9. Inkubacijos periodas atskiriems gyvuliams gali trukti nuo vienos savaitės iki 10 dienų, tačiau natūraliomis sąlygomis klinikiniai požymiai kiaulių ūkyje gali išryškėti praėjus 2-4 savaitėms ar net ilgiau po užsikrėtimo, jeigu laikomos tik suaugusios veislinės kiaulės arba pasitaiko vidutinio virulentiškumo viruso padermės.
10. Klinikiniai KKM požymiai yra labai įvairūs, juos galima painioti su daugelio kitų ligų klinikiniais požymiais. Ligos eiga ir klinikiniai požymiai daugiausiai priklauso nuo gyvulio amžiaus ir viruso virulentiškumo. Paršeliai serga sunkiau nei vyresnės kiaulės. Vyresnės veislinės kiaulės serga lengva arba subklinikine forma.
II SKIRSNIS
ŪMI KKM EIGA
12. Atjunkytos ir penimos kiaulės dažnai serga ūmia KKM eiga. Pirmieji KKM požymiai yra anoreksija, letargija, karščiavimas, konjunktyvitas, limfinių mazgų pabrinkimas, kvėpavimo takų uždegimas, vidurių užkietėjimas, po kurio prasideda viduriavimas. Būdingos kraujosruvos paprastai matomos ant ausų, uodegos, pilvo ir vidinėse kojų pusėse. Jos atsiranda praėjus 2–3 savaitėms nuo užsikrėtimo ir išlieka iki mirties. Dažnai būna neurologinių požymių – kiaulės eidamos svirduliuoja, sutrinka judesių koordinacija ir atsiranda konvulsijos. Kiaulės nuolat karščiuoja. Kūno temperatūra paprastai yra didesnė kaip +40 °C, bet suaugusių kiaulių gali neviršyti +39,5 °C.
13. KKM virusas sukelia sunkią leukopeniją ir imuninės sistemos nepakankamumą, dėl kurių liga komplikuojasi žarnų arba kvėpavimo takų antrine infekcija. Šių antrinių infekcijų požymiai gali paslėpti arba užgožti tipiškiausius KKM požymius ir suklaidinti ūkininką arba veterinarijos gydytoją. Kiaulės nugaišta per vieną mėnesį. Kiaulės gali pasveikti, joms susidaro antikūnai. Dažniausiai pasveiksta suaugusios veislinės kiaulės, kurios neturi ryškių KKM klinikinių požymių. KKM antikūnus galima nustatyti nuo infekcijos praėjus 2–3 savaitėms.
14. Patologiniai pokyčiai patologinio anatominio tyrimo metu dažniausiai nustatomi limfiniuose mazguose ir inkstuose. Limfiniai mazgai sutinsta, pabrinksta, juose matomi pakraujavimai. Pakraujavimai inkstuose būna įvairaus dydžio – nuo vos matomų taškinių iki echimozinių. Panašūs pakraujavimai gali būti šlapimo pūslėje, ryklėje, antgerklyje ir širdyje, kartais jie būna išplitę pilvaplėvėje ir krūtinplėvėje. Dažnai būna nepūlingas encefalitas. Infarktas blužnyje laikomas patognominiu požymiu, tačiau jis pasireiškia retai.
15. Ūmi afrikinio kiaulių maro eiga savo klinikiniais požymiais ir patologiniais anatominiais pokyčiais yra labai panaši į KKM. Atsiradę lengvai pastebimi pakraujavimai odoje ir ausų odoje leidžia įtarti afrikinį arba klasikinį kiaulių marą. Panašius pokyčius sukelia nedaugelis kitų ligų. Ūmi KKM eiga turi būti įtarta kiaulėms, įtariamoms, kad serga raudonlige, paršelių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromu, kad apsinuodijo kumarinu, hemoragine purpura, nujunkytų paršelių multisisteminiu išsekimo sindromu, paršelių dermatito ir nefropatijos sindromu, salmonelių arba Pasteurella bakterijų sukeltomis infekcijomis arba bet kokiu žarnų arba kvėpavimo organų uždegimo sindromu, kai jos karščiuoja ir liga nepasiduoda gydymui antibiotikais.
III SKIRSNIS
LĖTINĖ KKM EIGA
17. Lėtinė KKM eiga išsivysto tada, kai kiaulėms nesusidaro pakankamas imunitetas prieš KKM virusą. Pirminiai lėtinės KKM eigos požymiai yra panašūs į ūmios KKM eigos klinikinius požymius. Vėliau išsivysto nespecifiniai požymiai, pvz.: nepastovus karščiavimas, lėtinis enteritas, liesėjimas. Nebūna būdingų odos pakraujavimų. Tokioms kiaulėms 2–3 mėnesius iki mirties gali reikštis KKM klinikiniai požymiai. KKM virusas yra nuolat išskiriamas nuo klinikinių požymių pradžios iki mirties. Serumo mėginiuose galima laikinai aptikti antikūnus.
18. Patologiniai pokyčiai yra ne tokie tipiški, gali nebūti pakraujavimų organuose ir serozinėse plėvėse. Nuolat viduriuojančioms kiaulėms nekroziniai pažeidimai atsiranda klubinėje žarnoje, klubinės žarnos perėjime į gaubtinę žarną ir tiesiojoje žarnoje.
IV SKIRSNIS
PRENATALINĖ KKM EIGA IR VĖLYVA KKM PRADŽIA
20. Paršavedėms, sergančioms subklinikine forma, KKM virusas gali patekti į placentą ir užkrėsti vaisius. Transplacentinio vaisių užsikrėtimo baigtis priklauso nuo paršingumo periodo ir viruso virulentiškumo. Ankstyvo nėštumo periodu infekcija gali sukelti abortą, negyvų paršelių gimimus, mumifikaciją ir išsigimimus. Visa tai mažina kiaulių ūkio produktyvumo rodiklius. Paršavedėms, užsikrėtusioms iki 90 paršingumo dienos, gimsta KKM virusą išskiriantys paršeliai, kurie gali gimti kliniškai normalūs ir išgyventi keletą mėnesių. Gimę paršeliai blogai auga, būna išsekę, galimas įgimtas raumenų drebėjimas. Tokia infekcijos eiga vadinama vėlyva KKM pradžia. Tokie paršeliai gali platinti KKM ir išlaikyti virusą kiaulių populiacijoje, kadangi iki mirties jie nuolat išskiria virusą į aplinką.
21. KKM gali būti ypač sunku nustatyti veislinių kiaulių ūkiuose, nes KKM eiga gali būti nebūdinga ir painiojama su kitomis patologinėmis būsenomis. Sumažėjusį produktyvumą ir abortus gali sukelti KKM bei parvovirusinė infekcija, paršelių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromas, leptospirozė ir Aujeskio liga. Pagal patologinius pokyčius KKM sukelto aborto negalima atskirti nuo aborto, sukelto kitų ligų. Įtarus dauginimosi organų pažeidimą dėl infekcinės ligos, reikia nedelsiant atlikti tyrimą dėl KKM, jeigu kiaulių ūkis yra padidintos rizikos zonoje (pvz., kiaulių ūkis yra teritorijoje, kurioje šernai serga KKM) ir bet kuriuo atveju, kai atmetamos kitos dauginimosi organų infekcinės ligos.
III SKYRIUS
KRITERIJAI, KURIAIS REMIANTIS ŪKYJE ĮTARIAMAS KKM
22. Ūkis pripažįstamas įtariamu ūkiu remiantis šiais kriterijais:
22.1. pagal klinikinius požymius ir patologinius anatominius pokyčius:
22.1.9. taškiniai ir dėminiai pakraujavimai, ypač limfiniuose mazguose, inkstuose, blužnyje, šlapimo pūslėje ir ryklėje,
22.2. pagal epidemiologinio tyrimo duomenis, jeigu:
22.2.6. kiaulės buvo šeriamos maisto atliekomis, kurios, kaip įtariama, nebuvo taip apdorotos, kad būtų sunaikintas KKM virusas,
22.3. pagal serologinių tyrimų duomenis:
22.3.1. teigiama serologinė reakcija gaunama dėl užsikrėtimo KKM virusu ar kiaulių vakcinacijos; jeigu kiaulės buvo vakcinuotos nuo KKM standartine vakcina, joms teigiamą serologinę reakciją gali sąlygoti vakcinacijos arba slaptos vakcinuotų kiaulių infekcijos,
22.3.2. tarp KKM viruso ir kitų pestivirusų nustatomos kryžminės reakcijos; apie 10 % bandoje tiriamų kiaulių gali teigiamai serologiškai reaguoti dėl užsikrėtimo galvijų virusinės diarėjos ir sienos ligos virusų, pvz., jeigu kiaulės kontaktavo su galvijų virusine diarėja užsikrėtusiais galvijais arba sienos liga užsikrėtusiomis avimis, arba medžiagomis, užkrėstomis šių atrajotojų pestivirusais,
IV SKYRIUS
KIAULIŲ TYRIMO IR MĖGINIŲ ĖMIMO TVARKA
I SKIRSNIS
KIAULIŲ KLINIKINIO TYRIMO IR MĖGINIŲ ĖMIMO ĮTARIAMAME ŪKYJE TVARKA
23. VMVT turi užtikrinti, kad atitinkami klinikiniai tyrimai, mėginių ėmimas ir laboratoriniai tyrimai būtų atliekami įtariamame ūkyje, siekiant patvirtinti ar atmesti KKM, pagal reikalavimus, nurodytus 24–35 punktuose. Nepriklausomai nuo priemonių, nurodytų Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimuose, patvirtinimo tiriamame ūkyje, 24–35 punktų nuorodos ir procedūros turi būti taikomos tuo atveju, kai kiaulių klinikiniai požymiai ir epidemiologinis ligos modelis rodo esant nedidelę KKM galimybę. Visais kitais atvejais, kai vienai ar daugiau kiaulių įtariamas KKM, priemonės, nurodytos Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimuose, turi būti patvirtintos įtariamame ūkyje. Įtarus KKM skerdykloje ar transporto priemonėje, turi būti taikomos priemonės, nurodytos 24–35 punktuose.
24. Kai valstybinis veterinarijos gydytojas aplanko įtariamą ūkį, norėdamas patvirtinti arba paneigti KKM, turi būti:
24.1. atliktas produktyvumo ir sveikatos būklės dokumentų patikrinimas, jeigu tokia dokumentacija saugoma;
25. Atliekant klinikinį tyrimą turi būti matuojama kūno temperatūra, ypač tokių kiaulių ar jų grupių:
25.4. kiaulių, laikomų padaliniuose, kuriuose neseniai lankėsi pašaliniai asmenys, neseniai turėję artimą kontaktą su KKM įtariamomis ar užsikrėtusiomis kiaulėmis, arba asmenys, kurie kontaktavo su potencialiu KKM šaltiniu;
26. Jeigu patikrinus įtariamą ūkį nenustatoma kiaulių arba jų grupių, nurodytų 25 punkte, VMVT, nepažeisdama reikalavimų, kurie turi būti taikomi įtariamame ūkyje pagal Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimus, ir atsižvelgusi į epidemiologinę situaciją, turi:
26.2. užtikrinti, kad kiaulėms, laikomoms įtariamame ūkyje, būtų paimti kraujo mėginiai laboratoriniams tyrimams; šiuo atveju taikomi 32–33 ir 52 punktuose nurodyti mėginių ėmimo reikalavimai;
26.3. įdiegti ar toliau vykdyti priemones, nurodytas Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimuose, kol įtariamame ūkyje nebus atlikti tolesni tyrimai;
27. Ūkyje klinikinis tyrimas turi būti atliekamas grupių, kuriose yra nustatytas ar įtariamas KKM viruso patekimo pavojus, atsitiktinai atrinktoms kiaulėms. Turi būti tiriamas toks minimalus kiaulių skaičius, kad būtų galima nustatyti 10 % kiaulių karščiavimo paplitimą 95 % patikimumu tose kiaulių grupėse. Turi būti tiriamas toks minimalus veislinių kiaulių skaičius, kad būtų galima nustatyti 5 % kiaulių karščiavimo paplitimą 95 % patikimumu. Spermos surinkimo centruose turi būti tiriami visi kuiliai.
28. Jeigu įtariamame ūkyje yra nugaišusių ar sergančių kiaulių, turi būti atliktas bent penkių kiaulių patologinis anatominis tyrimas, kurios:
29. Jeigu tyrimų metu nenustatoma būdingų KKM pokyčių, bet dėl epidemiologinės būklės būtina tęsti tyrimus:
29.1. kiaulių grupėse, kuriose buvo laikomos sergančios ar nugaišusios kiaulės, turi būti atliktas klinikinis tyrimas pagal 27 punktą ir pagal 32–33 punktus turi būti paimti kraujo mėginiai;
30. Neatsižvelgiant į tai, ar buvo nustatyti KKM būdingi patologiniai anatominiai pokyčiai, turi būti imami tirtų kiaulių organų ar audinių mėginiai virusologiniams tyrimams atlikti pagal 63 punkto reikalavimus. Geriau imti neseniai nudvėsusių kiaulių mėginius.
31. VMVT turi užtikrinti, kad atliekant patologinį anatominį tyrimą:
32. Jeigu nustatomi klinikiniai požymiai arba patologiniai anatominiai pokyčiai, pagal kuriuos ūkyje galima įtarti KKM, bet VMVT mano, kad šių duomenų nepakanka KKM protrūkiui patvirtinti ir reikalingi laboratoriniai tyrimai, KKM įtariamoms kiaulėms ir kitoms kiekvienos grupės kiaulėms, kurios įtariamos KKM, imami kraujo mėginiai laboratoriniams tyrimams. Minimalus serologiniams tyrimams imamų mėginių skaičius turi būti toks, kad tiriamoje kiaulių grupėje būtų galima nustatyti 10 % serologinį paplitimą 95 % patikimumu. Tačiau paršavedėms imamas toks mėginių skaičius, kad būti galima aptikti 5 % serologinį paplitimą 95 % patikimumu. Tuo atveju, kai ūkyje laikoma nedaug jaunų kiaulių ir užsikrėtusių kiaulių gali būti nedaug, kraujo mėginius reikia imti didesniam paršavedžių skaičiui. Spermos surinkimo centruose turi būti imami visų kuilių kraujo mėginiai.
33. Virusologiniams tyrimams imamų mėginių skaičių nustato VMVT, atsižvelgusi į ketinamus atlikti tyrimus, laboratorinio tyrimo metodų jautrumą ir epidemiologinę situaciją.
34. Jeigu KKM įtariama ūkyje pagal anksčiau atliktų serologinių tyrimų rezultatus, turi būti imami 25.5 punkte nurodytų kiaulių kraujo mėginiai ir turi būti taikomos tokios priemonės:
34.1. jeigu serologiškai teigiamos yra paršingos paršavedės, ne mažiau kaip trys kiaulės turi būti nužudytos ir joms atliktas patologinis anatominis tyrimas; prieš kiaules nužudant reikia paimti kraujo mėginius serologiniams tyrimams; embrionai turi būti tiriami dėl KKM viruso, viruso antigeno ar viruso genomo, kaip nurodyta VI skyriuje, kad būtų nustatyta intrauterinė infekcija;
II SKIRSNIS
MĖGINIŲ ĖMIMAS ŪKYJE PATVIRTINUS KKM
36. Norint nustatyti, kaip KKM virusas pateko į užkrėstą ūkį, kuriame KKM protrūkis patvirtintas pagal Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimus, ir kiek laiko praėjo nuo jo patekimo į ūkį iki jo nustatymo, kiaulės žudomos, o nužudytų kiaulių kraujo mėginiai serologiniams tyrimams imami atsitiktinės atrankos būdu.
37. Minimalus serologiniams tyrimams imamų mėginių skaičius turi būti toks, kad būtų galima nustatyti 10 % serologinį paplitimą 95 % patikimumu. Jeigu taikoma Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimų 18 punkte nurodyta išimtis, mėginiai turi būti imami iš ūkyje laikomų kiaulių grupių, jei kiaulės žudomos nepažeidžiant reikalavimų dėl tolimesnių tyrimų ir mėginių ėmimo, kurie turi būti atliekami pagal VMVT nurodymus kitoms ūkyje laikomoms kiaulėms. Mėginiai virusologiniams tyrimams gali būti imami pagal VMVT nurodymus, kuri turi atsižvelgti į taikytinus tyrimų metodus, jų jautrumą ir epidemiologinę situaciją.
III SKIRSNIS
MĖGINIŲ ĖMIMAS ŪKYJE ĮTARUS KKM
39. Norint patvirtinti ar paneigti KKM susirgimo galimybę ir surinkti papildomos epidemiologinės informacijos, kiaulės prevencijos tikslu žudomos įtariamame ūkyje pagal Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimų 14.1 arba 22 punktų nuorodas, imami kraujo mėginiai serologiniams tyrimams, taip pat kraujo ar migdolinių liaukų mėginiai virusologiniams tyrimams atlikti pagal 40 punkte nurodytą tvarką.
40. Mėginiai pirmiausiai turi būti imami:
40.1. kiaulėms, kurios turi KKM klinikinių požymių arba patologinių anatominių pokyčių, ir su jomis kontaktavusioms kiaulėms;
41. 40 punkte nurodytoms kiaulėms mėginiai turi būti imami pagal VMVT nurodymus, kuri turi atsižvelgti į epidemiologinę situaciją. Šiuo atveju mėginių ėmimo tvarka, kuri nurodyta 42–43 punktuose, turi būti naudojama preliminariems rezultatams gauti.
42. Be to, mėginiai turi būti imami pasirinktinai iš kiekvienos grupės kiaulių. Šiuo atveju minimalus serologiniams tyrimams imamų mėginių skaičius turi būti toks, kad tiriamoje kiaulių grupėje būtų galima nustatyti 10 % serologinį paplitimą 95 % patikimumu. Jei VMVT nurodymu pagal Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimų 14.1 punktą kiaulės prevencijos tikslu žudomos tik dalyje ūkio, kurioje laikomos KKM įtariamos kiaulės arba užsikrėtusios kiaulės, mėginiai turi būti imami tose kiaulių grupėse, kuriose jos žudomos, nepažeidžiant likusių ūkio kiaulių tolimesnio tyrimo ir mėginių ėmimo tvarkos, kuri turi būti atliekama pagal VMVT nurodymus. Tačiau minimalus ištirtų paršavedžių skaičius turi būti toks, kad būtų galima nustatyti 5 % serologinį paplitimą 95 % patikimumu, o spermos surinkimo centruose turi būti imami visų kuilių kraujo mėginiai. Tuo atveju, kai KKM įtariamas ūkyje, kuriame laikoma nedaug jaunų kiaulių ir užsikrėtusių paršavedžių skaičius gali būti nedidelis, tiriama daugiau paršavedžių.
IV SKIRSNIS
MĖGINIŲ ĖMIMO IR TYRIMO TVARKA PRIEŠ LEIDŽIANT IŠGABENTI KIAULES IŠ APSAUGOS AR PRIEŽIŪROS ZONŲ IR TADA, KAI KIAULĖS SKERDŽIAMOS AR ŽUDOMOS
44. Nepažeidžiant Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimų, norint gauti leidimą išgabenti kiaules iš apsaugos ar priežiūros zonose esančių ūkių, valstybinis veterinarijos gydytojas turi atlikti klinikinį tyrimą:
45. Jeigu kiaulės išgabenamos į kitą ūkį neatlikus 44 punkte nurodyto klinikinio tyrimo, kiekvienoje ūkio kiaulių grupėje, į kurią atvežtos kiaulės, turi būti atliktas klinikinis kiaulių tyrimas. Jeigu kiaulės yra vyresnės negu 3–4 mėnesių amžiaus, atliekant tyrimą tam tikram kiaulių skaičiui turi būti matuojama kūno temperatūra. Minimalus tiriamų kiaulių skaičius grupėje turi būti toks, kad būtų galima nustatyti karščiavimą 10 % kiaulių 95 % patikimumu. Tačiau minimalus ištirtų paršavedžių skaičius turi būti toks, kad būtų galima nustatyti karščiavimą 5 % atvežtų kiaulių 95 % patikimumu. Turi būti tiriami visi atvežti kuiliai.
46. Jeigu kiaulės išvežamos į skerdyklą, perdirbimo įmonę ar kitą vietą paskersti ar nužudyti neatlikus tyrimų, nurodytų 44 punkte, klinikinis tyrimas turi būti atliktas kiekvienoje kiaulių grupėje, į kurią atvežtos tokios kiaulės. Jeigu kiaulės yra vyresnės negu 3–4 mėnesių amžiaus, atliekant tyrimą tam tikram kiaulių skaičiui turi būti matuojama kūno temperatūra. Minimalus tiriamų kiaulių skaičius turi būti toks, kad galima būtų nustatyti karščiavimą 20 % kiaulių 95 % patikimumu. Tačiau minimalus tiriamų paršavedžių ar kuilių skaičius turi būti toks, kad būtų galima nustatyti karščiavimą 5 % kiaulių 95 % patikimumu.
47. Prieš 46 punkte nurodytų kiaulių skerdimą ar žudymą imami visos grupės kiaulių kraujo mėginiai serologiniams tyrimams, taip pat kraujo ar migdolinių liaukų mėginiai virusologiniams tyrimams. Minimalus imamų mėginių skaičius turi būti toks, kad būtų galima nustatyti 10 % serologinį paplitimą ar KKM virusą kiaulėms 95 % patikimumu kiekvienoje kiaulių grupėje. Tačiau minimalus tiriamų paršavedžių ar kuilių skaičius turi būti toks, kad būtų galima nustatyti 5 % serologinį paplitimą ar KKM virusą 95 % patikimumu kiekvienoje laikomų kiaulių grupėje. Mėginiai imami ir tyrimai atliekami pagal VMVT, kuri turi atsižvelgti į naudotinų tyrimų metodus, jų jautrumą ir epidemiologinę situaciją, nurodymus.
V SKIRSNIS
MĖGINIŲ ĖMIMO IR TYRIMO TVARKA ŪKYJE ATNAUJINANT KIAULIŲ BANDĄ
49. Kai ūkyje, kuriame buvo likviduotos kiaulės, norima atnaujinti kiaulių bandą, pagal Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimus turi būti imami mėginiai:
49.1. kai ūkyje pirmiausiai pradedama laikyti kiaules, neturinčias antikūnų prieš KKM virusą, kraujo mėginiai serologiniam tyrimui turi būti imami pasirinktinai tokiam kiaulių skaičiui, kad būtų galima nustatyti 10 % serologinį paplitimą 95 % patikimumu;
49.2. kai atkuriama visa banda, kraujo mėginiai serologiniam tyrimui turi būti imami pasirinktinai tokiam kiaulių skaičiui, kad būtų galima nustatyti 20 % serologinį paplitimą 95 % patikimumu; reikia imti tokį veislinių kiaulių ar kuilių mėginių skaičių, kad būtų galima nustatyti 10 % serologinį paplitimą 95 % patikimumu.
VI SKIRSNIS
VEIKSMAI APSAUGOS ZONOS KIAULIŲ ŪKIUOSE PRIEŠ APRIBOJIMŲ PANAIKINIMĄ
51. Kad visuose apsaugos zonoje esančiuose ūkiuose būtų galima panaikinti Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimų 31 punkte nurodytas priemones, turi būti:
52. Minimalus imamų mėginių skaičius turi būti toks, kad būtų galima nustatyti 10 % serologinį paplitimą 95 % patikimumu. Minimalus ištirtų paršavedžių skaičius turi būti toks, kad būtų galima nustatyti 5 % paplitimą 95 % patikimumu, o spermos surinkimo centre kraujo mėginiai turi būti imami visiems kuiliams.
VII SKIRSNIS
VEIKSMAI PRIEŽIŪROS ZONOS KIAULIŲ ŪKIUOSE PRIEŠ APRIBOJIMŲ PANAIKINIMĄ
53. Kad visuose priežiūros zonoje esančiuose ūkiuose būtų galima panaikinti Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimų 37 punkte nurodytas priemones, turi būti atliktas klinikinis tyrimas pagal 24–26 punktuose nurodytą tvarką. Be to, kraujo mėginiai serologiniams tyrimams turi būti imami kiaulėms:
VIII SKIRSNIS
SEROLOGINĖ STEBĖSENA IR MĖGINIŲ ĖMIMO TVARKA TERITORIJOSE, KUR KKM BUVO ĮTARIAMAS AR BUVO PATVIRTINTAS ŠERNAMS
55. Jeigu serologinė stebėsena atliekama tose teritorijose, kur buvo patvirtintas ar įtartas KKM, turi būti nustatytas šernų populiacijos dydis ir geografinė teritorija, kad būtų galima nustatyti, kiek mėginių reikia paimti. Mėginių skaičius nustatomas pagal paskaičiuotą teritorijoje esantį gyvų šernų skaičių.
56. Jeigu nėra duomenų apie šernų populiacijos tankumą ir dydį, reikia nustatyti geografinės teritorijos, kurioje bus imami mėginiai, ribas, atsižvelgiant į joje nuolat gyvenančių šernų skaičių bei į esamus natūralius ar dirbtinius barjerus, kurie gali riboti didelio skaičiaus šernų nuolatinį judėjimą. Netaikant minėtų kriterijų arba jeigu teritorijos yra didelės, rekomenduojama nustatyti ne didesnę kaip 200 kvadratinių kilometrų mėginių ėmimo teritoriją, kurioje paprastai nuolat gyvena 400-1000 šernų.
56. Nepažeidžiant Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimų 55.9 punkto nuostatų, minimalus tiriamų šernų skaičius turi būti toks, kad būtų galima nustatyti 5 % serologinį paplitimą 95 % patikimumu. Šiuo tikslu kiekvienoje nustatytoje teritorijoje reikia imti ne mažiau kaip 59 žvėrių mėginius. Taip pat rekomenduojama, kad:
56.1. tose teritorijose, kur medžiojama intensyviai ir reguliariai arba vykdoma atrankinė medžioklė dėl KKM stebėsenos, apie 50 % tiriamų žvėrių būtų nuo 3 mėnesių iki vienerių metų amžiaus, 35 % – nuo vienerių iki dvejų metų ir 15 % – vyresni kaip dvejų metų amžiaus;
56.2. tose teritorijose, kur medžiojama retai ar visai nemedžiojama, būtų ištirta ne mažiau kaip po 32 kiekvienos amžiaus grupės, nurodytos 56.1 punkte, žvėris;
57. Nušautų ar rastų negyvų šernų mėginiai virusologiniams tyrimams turi būti imami kaip nurodyta 63 punkte. Jeigu reikalinga vykdyti nušautų šernų virusologinę stebėseną, ji turi būti atliekama nuo trijų mėnesių iki vienerių metų amžiaus šernams.
V SKYRIUS
MĖGINIŲ PAĖMIMO IR TRANSPORTAVIMO BENDROJI TVARKA
I SKIRSNIS
BENDROJI TVARKA
59. Prieš imant mėginius įtariamame ūkyje, turi būti parengtas ūkio planas ir nustatytos ūkyje laikomų kiaulių grupės.
60. Jei numatoma imti pakartotinius mėginius, visos kiaulės, iš kurių imami mėginiai, turi būti individualiai paženklinamos taip, kad būtų lengva paimti pakartotinius mėginius.
61. Nepažeidžiant 32 punkto nuostatų, mėginiai serologiniams tyrimams negali būti imami jaunesniems negu 8 savaičių amžiaus paršeliams.
62. Visi mėginiai turi būti siunčiami į laboratoriją su atitinkamos formos lydraščiais pagal VMVT nustatytus reikalavimus. Šiuose lydraščiuose turi būti duomenys apie tiriamas kiaules bei informacija apie pastebėtus klinikinius požymius ar patologinius anatominius pokyčius. Jei kiaulės laikomos ūkyje, turi būti nurodyta informacija apie kiaulių amžių, kategoriją ir kilmės vietą. Rekomenduojama nurodyti kiekvienos kiaulės, kuriai buvo paimtas mėginys, unikalų identifikavimo ženklą.
II SKIRSNIS
MĖGINIŲ ĖMIMAS VIRUSOLOGINIAMS TYRIMAMS
63. Norint nustatyti KKM virusą, viruso antigeną ar genomą nugaišusioms ar nužudytoms kiaulėms, geriausia imti migdolinių liaukų, blužnies ir inkstų audinių mėginius. Be to, rekomenduojama paimti du limfinių mazgų mėginius, pvz.: užryklinio, paausinio, pažandinio ar žarnų pasaito ir klubinės žarnos mėginį. Jeigu lavonai suirę, reikia imti ilgųjų kaulų ir krūtinkaulio mėginius.
64. Apdoroto antikoaguliantu ar sukrešėjusio kraujo mėginiai turi būti imami pagal VMVT nurodymus kiaulėms, kurios karščiuoja ar turi kitų ligos požymių.
65. Virusologinius tyrimus patariama atlikti, jei gyvuliai serga. Virusologiniai tyrimai turi nedidelę vertę, jeigu jie atliekami stebėsenos tikslais kiaulėms ar šernams, neturintiems KKM klinikinių požymių. Jeigu stebėsenos tikslais imamas didelis kiekis kiaulių ar šernų mėginių, norint nustatyti KKM virusą ligos inkubaciniu laikotarpiu, geriausia imti migdolinių liaukų mėginius.
III SKIRSNIS
MĖGINIŲ TRANSPORTAVIMAS
66. Rekomenduojama, kad visi mėginiai:
66.4. būtų laikomi tokioje pakuotėje, kurioje reikiamai temperatūrai palaikyti naudojami ledo paketai, o ne šlapias ledas;
66.5. audinių ar organų mėginiai būtų sudėti į atskirą sandarų plastmasinį maišelį ir tinkamai pažymėti; be to, jie turi būti sudėti į didesnius konteinerius ir supakuoti naudojant pakankamą absorbuojančios medžiagos kiekį nuo pažeidimo apsaugoti ir išskyroms sugerti;
67. Ant išorinės pakuotės turi būti nurodytas laboratorijos, į kurią gabenama, adresas bei toks užrašas: Gyvūninė patologinė medžiaga. Neatspari. Trapi. Atidaryti tik klasikinio kiaulių maro kontrolinėje laboratorijoje.
68. Laboratorijai, į kurią siunčiami mėginiai, turi būti iš anksto pranešta apie mėginių atgabenimą, pristatymo laiką ir būdą.
69. Oro transportu pristatant mėginius į ES KKM kontrolinę laboratoriją iš ES šalių, išskyrus Vokietiją, ir iš trečiųjų šalių, mėginių siunta turi būti paženklinta pagal Tarptautinės oro transporto asociacijos nuostatus. ES KKM kontrolinė laboratorija turi teisę priimti mėginius KKM diagnozuoti bei KKM išskirtus virusus.
VI SKYRIUS
VIRUSOLOGINIAI TYRIMAI IR JŲ REZULTATŲ ĮVERTINIMAS
I SKIRSNIS
VIRUSO ANTIGENO NUSTATYMAS
70. Fluorescuojančių antikūnų tyrimo tikslas – nustatyti viruso antigeną plonuose šaldomuoju mikrotomu atpjautuose organų, paimtų KKM įtariamoms kiaulėms, mėginiuose. Viruso antigenas ląstelėse aptinkamas naudojant FITC konjuguotus antikūnus. Teigiamas tyrimo rezultatas turi būti patvirtintas naudojant specifinius monokloninius antikūnus. Tyrimui tinkamiausi organai yra migdolinės liaukos, inkstai, blužnis, įvairūs limfiniai mazgai ir klubinė žarna. Jeigu tiriant šernus šių organų nėra arba jie suirę, galima naudoti kaulų čiulpų ląstelių tepinėlius. Tyrimą galima atlikti per vieną dieną. Kadangi organų mėginius galima gauti tik iš negyvų gyvulių, šio tyrimo naudojimas stebėsenos tikslais yra ribotas. Tyrimo rezultatų patikimumas sumažėja neteisingai atliekant tyrimą, ypač jeigu trūksta patirties arba kai tiriami organai yra suirę.
71. Virusinis antigenas nustatomas naudojant įvairius imunofermentinės analizės (toliau – IFA) tyrimo metodus. Antigeno IFA jautrumas turėtų būti pakankamai didelis, kad būtų gaunamas teigiamas tyrimo rezultatas tiriant kiaules, kurios turi klinikinių KKM požymių. IFA metodą rekomenduojama naudoti tiriant kiaulių, kurios turėjo KKM klinikinių požymių arba patologinių anatominių pokyčių, mėginius. Atskirų gyvulių tyrimui IFA netinka. IFA tyrimui tinkamiausi yra leukocitų, serumo, nesukrešėjusio kraujo, taip pat organų, nurodytų 70 punkte, suspensijos mėginiai, kurie buvo paimti KKM įtariamoms arba užsikrėtusioms kiaulėms. IFA galima atlikti per vieną dieną. Jai atlikti galima naudoti automatinę įrangą. Šio metodo didžiausias privalumas yra tas, kad per trumpą laiko tarpą galima ištirti didelį mėginių skaičių. Atliekant tyrimą rekomenduojama naudoti teigiamą kontrolinį mėginį. Atliekant tyrimus IFA metodu, būtina atsižvelgti į tai, kad šis metodas yra ne toks jautrus kaip viruso išskyrimas ląstelių kultūroje, bet jo jautrumas yra gerokai didesnis tiriant paršelių kraujo mėginiais negu suaugusių kiaulių kraujo mėginius.
II SKIRSNIS
VIRUSO IŠSKYRIMAS
72. Viruso išskyrimas yra pagrįstas mėginių medžiagos inkubavimu KKM virusui jautriose kiaulių ląstelių kultūrose. Jeigu mėginyje yra KKM virusas, jis pasidaugina ląstelėse tokiais kiekiais, kuriuos ląstelėse galima nustatyti imunocitocheminiu tyrimo metodu, naudojant konjuguotus antikūnus. Specifiniai KKM antikūnai yra reikalingi diferencinei kitų pestivirusų diagnostikai.
73. Geriausia KKM virusą išskirti leukocituose, plazmoje arba nesukrešėjusiame kraujyje, arba 70 punkte nurodytų organų ląstelių kultūrose.
74. Viruso išskyrimą geriausiai taikyti tiriant nedidelio skaičiaus gyvulių mėginius. Viruso išskyrimo tvarka reikalauja daug darbo ir bent trijų dienų rezultatams gauti. Gali prireikti dar dviejų ląstelių kultūrų virusų pasažui, kol nustatomas nedidelis virusų kiekis mėginyje. Todėl galutinis tyrimo rezultatas gali būti gautas po 10 dienų. Suirę mėginiai gali būti citotoksiški ląstelių kultūroms ir riboti jų naudojimą.
75. Viruso išskyrimą rekomenduojama atlikti tada, kai KKM buvo patvirtintas kitais tyrimo metodais. Jis turi būti naudojamas kaip kontrolinis tyrimas ankstesniems teigiamiems tyrimų rezultatams, gautiems atliekant antigeno IFA, polimerazės grandininę reakciją (toliau – PGR) ar fluorescuojančių antikūnų tyrimą, ar netiesioginę imunoperoksidazės reakciją, patvirtinti. Šiuo būdu išskirtas KKM virusas gali būti naudojamas viruso savybėms tirti, genetiniam tipizavimui ir molekulinei epidemiologijai.
76. Visi išskirti KKM virusai pirminių protrūkių atvejais, pirminių šernų susirgimų ar susirgimų skerdyklose ar transporto priemonėse atvejais turi būti genetiškai tipizuoti Nacionalinėje veterinarijos laboratorijoje ar ES KKM kontrolinėje laboratorijoje pagal VI skyriaus V skirsnio reikalavimus. Bet kokiu atveju išskirti virusai turi būti nedelsiant siunčiami į ES KKM kontrolinę laboratoriją.
III SKIRSNIS
VIRUSO GENOMO NUSTATYMAS
77. Polimerazės grandininė reakcija taikoma viruso genomui nustatyti kraujo, audinių ar organų mėginiuose. Maži virusinių RNR fragmentai paverčiami DNR fragmentais, kurie PGR būdu padauginami iki aptinkamo kiekio. Kadangi šiuo metodu galima aptikti viruso genomo fragmentą, PGR gali būti teigiama net tada, kai nėra KKM galinčio sukelti viruso, pvz., suirusiuose audiniuose ar sveikstančių kiaulių audinių mėginiuose.
78. PGR gali būti naudojama tirti nedideliam mėginių, kurie buvo rūpestingai paimti iš KKM įtariamų kiaulių, skaičiui arba abortuotiems gemalams. PGR galima naudoti šernų mėginiams tirti, jeigu medžiaga yra suirusi ir viruso negalima išskirti ląstelių kultūroje dėl citotoksiškumo.
79. Tinkamiausi PGR tyrimui yra viruso išskyrimui naudojamų organų arba nesukrešėjusio kraujo mėginiai.
80. PGR galima atlikti per 48 valandas. Tyrimui reikalinga atitinkama laboratorinė įranga, atskiros patalpos ir kvalifikuotas personalas. Šiuo tyrimo metodu galima nustatyti KKM virusą esant nedideliam jo kiekiui mėginiuose. Metodas yra labai jautrus, bet gali lengvai įvykti mėginio tarša virusais, dėl kurios galima gauti neteisingus teigiamus rezultatus. Dėl to būtina griežta laboratorinės kokybės kontrolės tvarka. Kai kurie tyrimo metodai yra daugiau pritaikyti tirti pestivirusus ir mažiau specifiški tiriant KKM virusą, todėl reikalingi patvirtinantys tyrimai, pvz., PGR metodu.
IV SKIRSNIS
VIRUSOLOGINIŲ TYRIMŲ REZULTATŲ VERTINIMAS
81. Virusologiniai tyrimai yra būtini norint patvirtinti KKM. Viruso išskyrimas turi būti laikomas kontroliniu virusologiniu tyrimu ir turi būti naudojamas kaip patvirtinantis tyrimas. Jį ypač rekomenduojama naudoti tuo atveju, kai fluorescuojančių antikūnų metodu, IFA ar PGR gaunami teigiami tyrimo rezultatai tiriant mėginius, paimtus kiaulėms, neturėjusioms klinikinių ar patologinių anatominių pokyčių, ar kitais abejotinais atvejais. Pirminį KKM protrūkį galima patvirtinti, jeigu kiaulėms nustatyti klinikiniai požymiai ar patologiniai anatominiai pokyčiai ir jeigu ne mažiau kaip dviem tyrimo metodais buvo nustatytas antigenas ar viruso genomas. Antrinį KKM protrūkį galima patvirtinti, jeigu be epidemiologinių sąsajų su patvirtintu protrūkiu ar susirgimu kiaulėms nustatomi ligos klinikiniai požymiai ar patologiniai anatominiai pokyčiai ir antigeno ar viruso genomo tyrimų rezultatai yra teigiami. Pirminis KKM susirgimas šernams gali būti patvirtintas išskyrus virusą arba jeigu ne mažiau kaip dviem tyrimo metodais buvo nustatytas antigenas ar viruso genomas. Tolesni šernų KKM susirgimai, kuriems nustatyti epidemiologiniai ryšiai su anksčiau patvirtintais susirgimais, gali būti patvirtinti, jeigu antigeno ar viruso genomo tyrimo rezultatai yra teigiami.
V SKIRSNIS
GENETINIS IŠSKIRTŲ KKM VIRUSŲ TIPIZAVIMAS
83. Išskirtas KKM virusas genetiškai tipizuojamas nustatant viruso genomo nukleotidų seką 5' nekoduojančio regiono ir (arba) E2 glikoproteino geno specifinėje dalyje. Šių sekų panašumas su anksčiau išskirtų virusų genomo sekomis gali parodyti, ar ligos protrūkį sukėlė naujos ar jau anksčiau tipizuotos virusų padermės. Tuo būdu galima pagrįsti ar atmesti hipotezes apie ligos patekimo būdus, kurie buvo nustatyti epidemiologinio atsekimo būdu. Išskirto KKM viruso genetinis tipizavimas yra labai svarbus nustatant ligos šaltinį. Tačiau didelis genetinis virusų, gautų skirtingų protrūkių metu, panašumas nėra absoliutus tiesioginio epidemiologinio ryšio įrodymas.
84. Jeigu Nacionalinėje veterinarijos laboratorijoje negalima greitai tipizuoti viruso, mėginys ar išskirtas virusas turi būti nedelsiant siunčiami į ES KKM kontrolinę laboratoriją. KKM diagnozuojančių laboratorijų turimi duomenys apie išskirto KKM viruso tipizavimą ir genetinę seką turi būti perduoti ES KKM kontrolinei laboratorijai, kad ši medžiaga būtų įtraukta į laboratorijoje turimą duomenų bazę. Į duomenų bazę įtraukta informacija turi būti prieinama visų ES šalių KKM kontrolinėms laboratorijoms. Jeigu dėl publikacijų moksliniuose žurnaluose nacionalinė KKM kontrolinė laboratorija prašo neviešinti šių rezultatų, ES KKM kontrolinė laboratorija turi užtikrinti duomenų konfidencialumą tol, kol jie nebus paskelbti spaudoje.
VII SKYRIUS
SEROLOGINIŲ TYRIMŲ PRINCIPAI IR NAUDOJIMAS IR REZULTATŲ VERTINIMAS
I SKIRSNIS
BENDRIEJI PRINCIPAI IR DIAGNOSTINĖ VERTĖ
85. KKM virusu užsikrėtusioms kiaulėms antikūnai paprastai nustatomi kraujo serumo mėginiuose 2–3 savaites po infekcijos. Pasveikusioms kiaulėms antikūnai gali būti nustatomi keletą metų arba visą gyvenimą. Antikūnai taip pat kartais aptinkami sporadiškai gaištančioms kiaulėms. Kai kurioms lėtine KKM eiga sergančioms kiaulėms antikūnai gali būti aptinkami kelias dienas, praėjus mėnesiui po užsikrėtimo. Paršeliai, užsikrėtę paršingumo laikotarpiu, gali toleruoti KKM virusus ir negaminti specifinių antikūnų. Tačiau iš paršavedės gauti antikūnai paršeliams gali būti nustatomi pirmosiomis gyvenimo dienomis. Motininių antikūnų dvigubo sunykimo trukmė sveikų paršelių organizme yra apie dvi savaitės. Jeigu antikūnai nustatomi vyresniems negu trijų mėnesių amžiaus paršeliams, tai gali būti ne motininiai antikūnai.
86. Antikūnų prieš KKM virusą tyrimas serumo ar plazmos mėginiuose atliekamas siekiant diagnozuoti KKM įtariamame ūkyje, nustatyti infekcijos trukmę patvirtintų protrūkių atveju ir stebėsenos bei priežiūros tikslais. Tačiau serologinis tyrimas yra mažiau tinkamas KKM diagnozuoti, kai infekcija neseniai pateko į ūkį. Keletas serologiškai teigiamų kiaulių, kurios turi nedidelį neutralizuojančių antikūnų titrą, gali rodyti, kad į ūkį neseniai pateko infekcija (prieš 2–4 savaites). Ūkyje esant daug kiaulių, kurios turi didelį neutralizuojančių antikūnų titrą, gali rodyti, kad virusas pateko į ūkį daugiau kaip prieš mėnesį. Serologiškai teigiamų kiaulių išsidėstymas ūkyje gali suteikti vertingos informacijos apie tai, kaip KKM virusas pateko į ūkį. Tačiau, vertinant serologinių tyrimų rezultatus, turi būti atsižvelgiama į visus klinikinius, virusologinius ir epizootinius duomenis, kurie gaunami atliekant tyrimą, kuris, įtarius ar patvirtinus KKM, turi būti atliekamas pagal Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimų 25 punktą.
II SKIRSNIS
REKOMENDUOJAMI SEROLOGINIAI TYRIMAI
87. KKM serologiniam diagnozavimui naudojamas viruso neutralizacijos tyrimas (toliau – VNT) ir IFA. Nacionalinių KKM kontrolinių laboratorijų atlikto serologinio diagnozavimo kokybė ir efektyvumas turi būti reguliariai tikrinami palyginamaisiais tyrimais tarp laboratorijų, kuriuos reguliariai organizuoja ES KKM kontrolinė laboratorija.
88. VNT yra pagrįstas serumo mėginio antikūnų viruso neutralizacinio aktyvumo nustatymu, išreikštu 50 % neutralizacija. Nuolatinis KKM viruso kiekis inkubuojamas 37 °C temperatūroje su atskiestu serumu. Stebėsenos tikslais serumas pradžioje atskiedžiamas santykiu 1:10. Jeigu reikalingas išsamus titravimas, gali būti paruošiami skiesto serumo mėginiai, pradedant skiesti santykiu 1:2 ar 1:5. Kiekvienas serumo skiedinys sumaišomas su tokios pat apimties viruso suspensija, kurioje yra 100 infekcinių dozių (TCID 50 – vidutinė audinių kultūros infekcinė dozė 50). Po inkubacijos mišiniu apkrečiamos ląstelių kultūros, kurios inkubuojamos 3–5 dienas. Atlikus inkubaciją, ląstelių kultūros fiksuojamos, ir bet koks viruso pasidauginimas infekuotose ląstelėse nustatomas imunocitocheminėmis reakcijomis. Galima naudoti imunoperoksidazės arba imunofluorescencijos reakcijas. VNT rezultatai išreiškiami atitinkamu pirminio serumo atskiedimu, kuriame esantys virusus neutralizuojantys antikūnai apsaugo 50 % ląstelių nuo citopatinio virusų poveikio.
89. VNT yra jautriausias ir patikimiausias KKM viruso antikūnų nustatymo metodas. Todėl jis rekomenduojamas serologiškai tiriant tiek vieną gyvulį, tiek visą gyvulių bandą. Tačiau šiuo tyrimu kiaulėms galima nustatyti antikūnus, susidariusius prieš atrajotojų pestivirusus. Antikūnų prieš galvijų virusinės diarėjos ir sienos ligos virusus nustatymas, naudojant VNT, yra pagrįstas principu, nurodytu 88 punkte, ir naudojamas diferentinei KKM diagnozei.
90. Neutralizacijos tyrimams naudojamos pestivirusų padermės turi atitikti ES KKM kontrolinės laboratorijos rekomendacijas.
91. Tyrimams, naudojant monokloninius antikūnus, gali būti naudojama konkuruojanti arba blokuojanti IFA ir nekonkuruojanti IFA. Konkuruojanti arba blokuojanti IFA paremta tuo, kad serumo mėginyje esantys antikūnai prieš KKM virusą nuslopina peroksidaze konjuguotų monokloninių antikūnų prisijungimą prie viruso antigeno, todėl susilpnėja skleidžiamas impulsas. Tiriant nekonkuruojančios IFA metodu, serumo antikūnų prisijungimas prie antigeno nustatomas naudojant peroksidaze konjuguotus antikūnus prieš kiaulių antikūnus.
92. Kiekvienos IFA partijos jautrumo ir specifiškumo kokybės kontrolė turi būti reguliariai tikrinama naudojantis ES KKM kontrolinės laboratorijos atsiųstais kontrolinių serumų komplektais, kuriuos sudaro:
92.1. ankstyvos KKM stadijos kiaulių serumai (gauti praėjus ne daugiau kaip 21 dienai po infekcijos);
93. KKM serologiniam diagnozavimui naudojama IFA turi aptikti visus kontrolinius sveikstančių kiaulių serumus. Turi būti galimybė pakartoti gautus rezultatus, naudojant kontrolinius serumus. Be to, turi būti nustatomi teigiami ankstyvos KKM stadijos kiaulių serumai ir turi būti minimali kryžminė reakcija su atrajotojų pestivirusais infekuotų kiaulių serumu. Gauti rezultatai tiriant ankstyvos KKM stadijos kiaulių serumą parodo IFA jautrumą.
94. IFA jautrumas yra mažesnis negu VNT. IFA rekomenduojama naudoti bandų stebėsenai. Tačiau IFA galima atlikti greičiau, nes tam reikia mažiau specializuotų priemonių ir ją gali atlikti automatizuotos sistemos. IFA turi užtikrinti KKM nustatymą visomis kiaulių sveikimo stadijomis ir duoti kuo mažiau kryžminių reakcijų su atrajotojų pestivirusais.
III SKIRSNIS
GALVIJŲ VIRUSINĖS DIARĖJOS IR SIENOS LIGOS SEROLOGINIŲ TYRIMŲ REZULTATŲ INTERPRETACIJA IR DIFERENCINĖ DIAGNOZĖ
95. Nepažeidžiant Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimų, nustačius, kad KKM viruso neutralizacijos titras yra lygus ar didesnis negu 10 ND(50) vienos ar daugiau kiaulių serumo mėginiuose ar gautas teigiamas IFA tyrimo rezultatas tiriant grupės kiaulių serumo mėginius, priemonės, nurodytos Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimų 13 punkte, turi būti pradėtos taikyti įtariamame ūkyje nedelsiant arba jos tęsiamos. Ūkyje paimti mėginiai turi būti pertirti VNT, atliekant palyginamąjį neutralizuojančių antikūnų prieš KKM virusą ir atrajotojų pestivirusus titravimą.
96. Jeigu palyginamuoju tyrimu nustatomi antikūnai prieš atrajotojų pestivirusus ir nenustatomi antikūnai prieš KKM virusą arba jų titras yra mažas (mažiau negu triskart), KKM įtarimas atmetamas, jeigu nėra kitų priežasčių, dėl kurių laikymo vietoje reikia toliau taikyti Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimų 13 punkte nurodytas priemones.
97. Jeigu palyginamuoju tyrimu nustatoma, kad daugiau negu vienos kiaulės viruso neutralizacijos titras yra lygus ar didesnis negu 10 ND(50) ir šis titras yra lygus ar didesnis negu kitų pestivirusų titrai, VMVT turi užtikrinti, kad būtų patvirtintas KKM, jeigu yra epidemiologinių ligos įrodymų.
98. Nepažeidžiant Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimų 14 punkto nuostatų, jeigu nenustatoma epidemiologinių ligos įrodymų arba jei ankstesnių tyrimų rezultatai yra abejotini, VMVT turi užtikrinti, kad ūkyje būtų:
99. Jeigu tolesni tyrimai, nurodyti 98 punkte, neleidžia atmesti KKM galimybės, ūkyje turi būti toliau imami kraujo mėginiai serologiniam tyrimui praėjus ne mažiau kaip dviem savaitėms nuo ankstesnių tyrimų. Tirtoms kiaulėms mėginiai turi būti imami palyginamajam tyrimui, siekiant palyginti antikūnų susidarymo prieš KKM virusą ir atrajotojų pestivirusus kitimą. Jeigu šie tyrimai neleidžia patvirtinti KKM, priemonės, nurodytos
Klasikinio kiaulių maro kontrolės reikalavimų 11–15 punktuose, gali būti atšauktos.
VIII SKYRIUS
ATSKIRIAMIEJI VAKCINUOTŲ KIAULIŲ TYRIMAI
IX SKYRIUS
MINIMALŪS SAUGOS REIKALAVIMAI KLASIKINIO KIAULIŲ MARO LABORATORIJOMS
101. Bet kuri su KKM virusu dirbanti laboratorija, net jei darbo apimtys nedidelės, turi laikytis 1 lentelėje pateiktų minimalių reikalavimų, kai atliekamas viruso išskyrimas ir VNT. Tačiau patologinis anatominis tyrimas, audinių apdorojimas fluorescuojančių antikūnų metodu ir serologiniai tyrimai, naudojant inaktyvuotą antigeną, gali būti atliekami taikant mažesnius saugos reikalavimus, jeigu užtikrinamos higienos sąlygos, atlikus tyrimus atliekama dezinfekcija, saugiai sunaikinami audiniai ir serumas.
102. Bet kuri laboratorija, kurioje ekstensyviai dauginami virusai, turi laikytis 1 lentelėje nurodytų papildomų reikalavimų.
103. Bet kuri laboratorija, kuri atlieka gyvulių eksperimentus su KKM virusu, turi laikytis 2 lentelėje nurodytų reikalavimų.
104. Bet kuriuo atveju visos KKM viruso atsargos turi būti laikomos saugiai, giliai užšaldytos ar liofilizuotos. Nerekomenduojama šaldiklių ir šaldytuvų naudoti kitais tikslais negu KKM virusams ar kitoms su KKM diagnozavimu nesusijusioms medžiagoms laikyti. Kiekviena atskira ampulė turi būti aiškiai paženklinta ir ant jos turi būti išsami informacija apie viruso atsargas su nurodytomis datomis ir kokybės kontrolės tikrinimų rezultatais. Taip pat turi būti saugomi duomenys apie viruso atsargų papildymą su nurodymais apie jų šaltinį bei informacija apie į kitas laboratorijas atiduotus virusus.
105. Rekomenduojama, kad Nacionalinėje veterinarijos laboratorijoje būtų patalpa, kurioje dirbama su KKM virusu ir kurioje taikomi biologinės saugos reikalavimai, ir patalpos, kuriose nedirbama su KKM virusu. Šios papildomos patalpos reikalingos laboratorinėms priemonėms, terpėms paruošti, neužkrėstoms ląstelių kultūroms laikyti, serumui paruošti ir serologiniams tyrimams (naudojant inaktyvuotą KKM virusą) atlikti bei administraciniam darbui.
______________
REIKALAVIMAI DIAGNOSTINĖMS LABORATORIJOMS
1 lentelė
| Objektas |
Papildomi reikalavimai |
Minimalūs reikalavimai |
| Bendra aplinka |
Normalus atmosferos slėgis. Išleidžiamo oro filtravimas per dvigubą HEPA filtrą. Patalpos, skirtos tik KKM diagnozavimui. |
Normalus atmosferos slėgis. Patalpos, skirtos nustatytoms procedūroms. |
| Naudojama apranga |
Įeinant persirengti visus drabužius. Laboratorinę aprangą dėvėti tik patalpoje, kurioje dirbama su KKM virusu. Vienkartinės pirštinės darbui su infekuota medžiaga. Drabužiai sterilizuojami prieš išeinant iš patalpos, kurioje dirbama su KKM virusu, ar skalbiami toje patalpoje. |
Viršutiniai drabužiai skirti dėvėti tik patalpoje, kurioje dirbama su KKM virusu. Vienkartinės pirštinės darbui su infekuota medžiaga. Viršutiniai drabužiai sterilizuojami prieš išeinant iš patalpos, kurioje dirbama su KKM virusu, ar skalbiami toje patalpoje. |
| Personalas |
Į patalpą, kurioje dirbama su KKM virusu, leidžiami tik asmenys pagal įstaigos vadovo patvirtintą sąrašą. Išeinant iš patalpos, kurioje dirbama su KKM virusu, plaunamos ir dezinfekuojamos rankos. Išėjus iš patalpos, kurioje dirbama su KKM virusu, asmenims 48 val. draudžiama lankytis kiaulių laikymo vietose. |
Į patalpą, kurioje dirbama su KKM virusu, leidžiami tik asmenys pagal įstaigos vadovo patvirtintą sąrašą. Išeinant iš patalpos, kurioje dirbama su KKM virusu, plaunamos ir dezinfekuojamos rankos. Išėjus iš patalpos, kurioje dirbama su KKM virusu, asmenims 48 val. draudžiama lankytis kiaulių laikymo vietose. |
| Įrengimai |
Biologinės saugos spinta (I ar II klasės) darbui su gyvais virusais. Spinta turi turėti dvigubą HEPA filtrą išleidžiamam orui. Visi laboratorijos darbui reikalingi įrengimai turi būti šiai veiklai skirtoje laboratorijos dalyje. |
|
BIOLOGINĖS SAUGOS REIKALAVIMAI PATALPOMS, KURIOSE LAIKOMI LABORATORINIAI GYVŪNAI
2 lentelė
| Objektas |
Reikalavimai |
| Bendra aplinka |
Neigiamo slėgio kontroliuojama ventiliacija. Išleidžiamo oro dviguba HEPA filtracija. Visos fumigacijos/dezinfekavimo galimybės eksperimento pabaigoje. Visos išskyros apdorojamos karščiu ar chemikalais, kad būtų inaktyvuotas KKM virusas. |
| Naudojama apranga |
Prieš įeinant į patalpą pakeičiami visi drabužiai. Vienkartinės pirštinės visoms operacijoms. Drabužiai sterilizuojami prieš išeinant iš patalpos ar skalbiami toje patalpoje. |
| Personalas |
Į patalpą leidžiami tik sąraše nurodyti asmenys. Prausimasis po dušu prieš išeinant iš patalpos. Išėjus iš patalpos 48 val. draudžiama lankytis kiaulių laikymo vietose. |
| Įrengimai |
Visi darbui su gyvūnais reikalingi įrengimai turi būti toje pačioje patalpoje. Prieš išgabenimą iš patalpos visos medžiagos turi būti sterilizuojamos. Pristatomi gyvūnų mėginiai turi būti dvigubai įvynioti į nepralaidų vandeniui konteinerį, kurio paviršius dezinfekuojamas prieš vežant į KKM laboratoriją. |
| Gyvūnai |
Prieš išgabenimą iš patalpos visi gyvūnai turi būti paskersti, biologinės saugos zonoje jiems turi būti atliktas patologinis anatominis tyrimas, atlikus tyrimą lavonai turi būti sudeginti. |