LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO

Į S A K Y M A S

DĖL PAŠARŲ TYRIMŲ TECHNINIŲ REGLAMENTŲ PATVIRTINIMO

2004 m. gruodžio 17 d. Nr. 3D-667

Vilnius

Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos pašarų įstatymu (Žin., 2000, Nr. 34-952; 2004, Nr. 73-2541) ir siekdamas pašarų kokybės tikslaus įvertinimo:

1. Tvirtinu pridedamus:

1.1. Pašarų tyrimo cheminės analizės metodų įteisinimo metodikos techninį reglamentą;

1.2. Tetra-, penta-, heksa-, hepta-, okta-chlordibenzo-p-dioksinų ir tetra-, penta-, heksa-, hepta-, okta-dibenzofuranų kiekių pašaruose nustatymo izotopų skiedimo metodu techninį reglamentą.

2. Šis įsakymas įsigalioja nuo 2005 m. sausio 1 d.

ŽEMĖS ŪKIO MINISTRĖ KAZIMIERA DANUTĖ PRUNSKIENĖ

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro

2004 m. gruodžio 17 d. įsakymu Nr. 3D-667

PAŠARŲ TYRIMO CHEMINĖS ANALIZĖS METODŲ ĮTEISINIMO METODIKOS TECHNINIS REGLAMENTAS

Parengtas pagal 2002 m. rugpjūčio 14 d. Europos Komisijos sprendimą 2002/657/EB dėl Tarybos direktyvos 96/23/EB nuostatų dėl analizės metodų tinkamumo ir rezultatų aiškinimo įgyvendinimo.

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Pašarų tyrimo cheminės analizės metodų įteisinimo metodikos techninis reglamentas (toliau – techninis reglamentas) numato analizės metodų, taikomų pašarų kokybės tyrimams, taikymo reikalavimus bei nustato bendruosius akredituotose (pripažintose) laboratorijose atliekamų tyrimų rezultatų aiškinimo kriterijus. Šis techninis reglamentas netaikomas medžiagoms, dėl kurių kituose teisės aktuose yra nustatytos ypatingos taisyklės.

2. Šio techninio reglamento reikalavimų privalo laikytis visos pašarų mėginių, paimtų valstybinę kontrolę atliekančios institucijos, tyrimus atliekančios laboratorijos ir pašarų kokybės valstybinę kontrolę vykdanti institucija.

3. Pašarų kokybės valstybinę kontrolę vykdanti institucija užtikrina, kad pašarų kokybės valstybinei kontrolei paimti mėginiai būtų analizuojami tyrimų metodais, kurie atitinka šio techninio reglamento priedo Pašarų tyrimo cheminės analizės metodų įteisinimo metodika (toliau – priedas) 2 dalies nuostatas, yra įteisinti minėto priedo 3 dalyje aprašyta tvarka bei patenkina mažiausiųjų privalomų aptikti kiekių (MPAK) reikalavimus (pageidautina pagal ISO 78-2 [5.6]). Pastarasis reikalavimas taikomas analitiniams metodams, įgalinantiems analizuoti medžiagas, kurioms nėra nustatyti ribiniai leistini kiekiai.

4. Pašarų kokybės valstybinės kontrolės tyrimams paimtų mėginių analizės rezultatų kokybė turi būti garantuojama vadovaujantis ISO 17025 [5.1] 5.9 dalies nuostatomis.

5. Pašarų kokybės valstybinės kontrolės tyrimų rezultatai vertinami vadovaujantis šiomis nuostatomis:

5.1. analizės rezultatas laikomas teigiamu, jei viršijama patvirtinančio metodo analitės sprendimo riba; 5.2. jei nustatytas ribinis leistinas medžiagos kiekis, sprendimo riba yra tokia koncentracija, kurią viršijus 1 – a statistiniu patikimumu galima būtų spręsti, kad leistino kiekio riba yra iš tikrųjų viršyta; 5.3. Jei ribinis leistinas medžiagos kiekis nenustatytas, sprendimo riba yra žemiausias koncentracijos lygis, kuriam esant 1 – a statistiniu patikimumu būtų galima teigti, kad esama būtent tos analitės.

II. SĄVOKOS, TERMINAI IR SUTRUMPINIMAI

6. Vartojamos sąvokos ir terminai pateikti techninio reglamento priedo 1 dalyje. 7. Vartojami sutrumpinimai pateikti techninio reglamento priedo 4 dalyje.

III. CHEMINĖS ANALIZĖS METODŲ ĮTEISINIMAS

8. Pašarų tyrimų cheminės analizės metodai įteisinami taikant šio techninio reglamento priede nurodytą metodiką.

______________

Pašarų tyrimo cheminės analizės metodų

įteisinimo metodikos techninio reglamento

priedas

PAŠARŲ TYRIMO CHEMINĖS ANALIZĖS METODŲ ĮTEISINIMO METODIKA

I. Sąvokos ir terminai

1. Šioje metodikoje vartojamos sąvokos ir terminai:

Alfa (a) paklaida – tikimybė, kad ištirtas mėginys yra neigiamas, nors buvo gautas teigiamas matavimo rezultatas (neteisingas sprendimas dėl teigiamo rezultato);

Analitė – medžiaga (bei analizės metu iš jos susidarę dariniai), kurią reikia aptikti, identifikuoti ir (arba) nustatyti jos kiekį;

Aptikimo geba (CCb) – mažiausias medžiagos kiekis, kurį su b paklaidos tikimybe galima aptikti, identifikuoti ir (arba) nustatyti mėginyje. Jei ribinis leistinas medžiagų kiekis nenustatytas, aptikimo geba yra tokia mažiausia koncentracija, kuriai esant tuo metodu 1 – b statistiniu patikimumu galima nustatyti tikrai užterštus mėginius. Jei ribinis leistinas medžiagų kiekis nustatytas, tai yra tokia koncentracija, kuriai esant tuo metodu 1 – b statistiniu patikimumu galima nustatyti ribinio leistino kiekio koncentraciją;

Atkuriamumas – glaudumas atkuriamumo sąlygomis [5.2];

Atkuriamumas laboratorijoje – glaudumas toje pačioje laboratorijoje nurodytomis (iš anksto nustatytomis) sąlygomis (pvz., dėl metodo, tiriamųjų medžiagų, laborantų, aplinkos), tyrimus atliekant pagrįstai ilgais laiko tarpais;

Atkuriamumo sąlygos – sąlygos, kuriomis tyrimų rezultatai gaunami skirtingose laboratorijose, dirbant skirtingiems laborantams, naudojant skirtingą įrangą, taikant tą patį metodą ir tiriant tapačius mėginius [5.2, 5.4];

Atrankos metodas – tyrimo metodas, taikomas aptikti medžiagas ar medžiagų klasę dominančiu lygiu. Toks metodas pasižymi dideliu mėginių tyrimo našumu ir taikomas dideliems kiekiams tokių mėginių, kurių rezultatai yra potencialiai teigiami, išanalizuoti. Jie specialiai skirti tam, kad būtų išvengta neteisingų neigiamų rezultatų;

Atsparumas – analizės metodo jautrumas tiems eksperimentinių sąlygų pokyčiams, kuriuos galima išreikšti kaip mėginio medžiagų, analičių, sandėliavimo sąlygų, aplinkos ir (arba) mėginio paruošimo sąlygų derinį, kuriam esant metodą galima taikyti pagal nurodymus arba su nurodytais nedideliais pakeitimais. Reikia nurodyti visų eksperimentinių sąlygų, kurios iš tikrųjų gali kisti (pvz., reagentų stabilumas, mėginio sudėtis, pH, temperatūra), pokyčius, kurie gali turėti įtakos analizės rezultatams;

Beta (b) paklaida – tikimybė, kad ištirtas mėginys yra teigiamas, nors buvo gautas neigiamas matavimo rezultatas (neteisingas sprendimas dėl neigiamo rezultato);

Dominantis lygis – medžiagos ar analitės koncentracija mėginyje, kuri yra svarbi nustatant medžiagos atitikimą teisės aktų reikalavimus;

Etaloninė analitė – žinomos ir patvirtintos sudėties bei grynumo analitė, skirta naudoti kaip analizės etalonas;

Etaloninė priemaiša – procedūra, pagal kurią tiriamasis mėginys padalijamas į dvi (ar daugiau) tiriamųjų dalių. Viena dalis analizuojama tokia, kokia yra, o į kitas tiriamąsias dalis prieš analizę pridedamas tam tikras žinomas kiekis etaloninės analitės. Etaloninės analitės pridedama 2-5 kartus daugiau, nei numatomas analitės kiekis mėginyje. Ši procedūra skirta nustatyti analitės kiekį mėginyje, atsižvelgiant į analizės procedūros aptinkamosios dalies rodiklį;

Glaudumas – nepriklausomų tyrimų rezultatų, gautų pagal nurodytas (iš anksto nustatytas) sąlygas, panašumas. Glaudumas dažniausiai išreiškiamas netikslumu ir apskaičiuojamas kaip tyrimo rezultato standartinis nuokrypis. Didesnis standartinis nuokrypis reiškia mažesnį glaudumą [5.2];

Išgava – tikrosios medžiagos koncentracijos procentinė dalis, aptikta atliekant analizės procedūrą;

Jungtinis tyrimas – to paties mėginio analizavimas tuo pačiu metodu, norint nustatyti to metodo tinkamumo požymius. Tokiu tyrimu analizuojamos atsitiktinės matavimo paklaidos ir laboratorijos nuokrypiai;

Kalibracinis etalonas – matavimų priemonė, kuria išreiškiamas dominančios medžiagos kiekis, jo vertę susiejus su pamatine baze;

Kiekybinis metodas – analizės metodas, kuriuo medžiagos kiekis ar masės dalis nustatomi taip, kad juos galima būtų išreikšti atitinkamų vienetų skaitmenine verte;

Kochromatografija – procedūra, kurią taikant ekstraktas prieš chromatografavimo etapus padalijamas į dvi dalis. Viena dalis ekstrakto chromatografuojama. Antra dalis sumaišoma su etalonine analite, kurios kiekį ir reikia išmatuoti. Tuomet šis mišinys taip pat chromatografuojamas. Etaloninės analitės pridedama maždaug tiek, kiek jo turėtų būti ekstrakte. Šis metodas skirtas geriau identifikuoti analitę taikant chromatografijos metodiką, ypač tuomet, kai negalima naudotis jokiu tinkamu vidiniu etalonu;

Kokybinis metodas – analizės metodas, kuriuo medžiaga identifikuojama pagal jos chemines, biologines ar fizines savybes;

Kvalifikacijos tyrimas – to paties mėginio analizavimas leidžiant laboratorijoms pasirinkti savą metodiką, jei tokia metodika taikoma pagal nustatytus reikalavimus. Tyrimas turi būti atliekamas pagal ISO vadovus 43-1 [5.3] bei 43-2 [5.4] ir gali būti naudojamas įvertinti metodų atkartojamumą.

Laboratorinis mėginys – mėginys, paruoštas siųsti į laboratoriją ir skirtas tikrinti ar tirti;

Ribinis leistinas kiekis – didžiausia likučių koncentracija, didžiausias lygis arba kitas didžiausias leistinas kiekis, nustatytas teisės aktais;

Mažiausiasis privalomas aptikti kiekis (MPAK) – mažiausias analitės kiekis mėginyje, kurį būtina aptikti ir patvirtinti. Šis rodiklis skirtas suderinti metodų, taikomų toms medžiagoms, kurių ribinis leistinas kiekis nenustatytas, analitinį tinkamumą;

Medžiaga – tam tikros ar apibrėžtos cheminės sudėties substancija ir jos metabolitai;

Nuokrypis – skirtumas tarp laukiamo tyrimų rezultato ir priimtinos pamatinės vertės [5.2];

Pakartojamumas – glaudumas pakartojamumo sąlygomis [5.2];

Pakartojamumo sąlygos – sąlygos, kuriomis toje pačioje laboratorijoje, dirbant tam pačiam laborantui, naudojant tą pačią įrangą, taikant tą patį metodą ir tiriant tapačius mėginius gaunami nepriklausomi tyrimų rezultatai [5.2];

Pamatinė medžiaga – medžiaga, kurios viena ar keletas savybių yra patvirtintos taikant pripažintą metodą, todėl ją galima naudoti prietaisams kalibruoti arba matavimo metodams tikrinti;

Papildyta mėginio medžiaga – mėginys, į kurį pridėtas tam tikras žinomas kiekis analitės, kurią reikia aptikti;

Patvirtinamasis metodas – metodas, suteikiantis visą ar papildomą informaciją, pagal kurią galima neabejotinai identifikuoti medžiagą, o prireikus nustatyti jos kiekį dominančiu lygiu;

Paliudytoji pamatinė medžiaga (PPM) – medžiaga, kurioje yra tam tikras nustatytas jai priskirtos analitės kiekis;

Specifiškumas – metodo geba išskirti matuojamą analitę ir kitas medžiagas. Šis rodiklis daugiausia priklauso nuo nurodytos matavimo technologijos, tačiau gali priklausyti nuo junginio klasės ar matricos;

Sprendimo riba (CCa) – riba, kurią pasiekus arba viršijus galima a paklaidos patikimumu spręsti, kad mėginys yra teigiamas;

Tarplaboratorinis tyrimas (palyginimas) – to paties mėginio tyrimų organizavimas, atlikimas ir įvertinimas dviejose ar daugiau laboratorijų iš anksto nustatytomis sąlygomis tyrimo tinkamumui nustatyti. Pagal tyrimų tikslus juos galima skirstyti į jungtinius ir kvalifikacijos tyrimus;

Teisingumas – didelės tyrimų rezultatų serijos vertės vidurkio panašumas į priimtiną pamatinę vertę. Teisingumas paprastai išreiškiamas nuokrypiu [5.2];

Tikslumas – tyrimo rezultato ir priimtinos pamatinės vertės atitikimo artumas [5.2]. Jis nustatomas nustačius teisingumą ir glaudumą;

Tinkamumo kriterijai – tinkamumo požymio reikalavimai, pagal kuriuos galima spręsti, ar analizės metodas yra tinkamas ir ar jį taikant gaunami patikimi rezultatai;

Tinkamumo požymis – funkcinė kokybė, kurią galima priskirti analizės metodui. Ja gali būti, pvz.: specifiškumas, tikslumas, teisingumas, glaudumas, pakartojamumas, atkuriamumas, aptinkamoji dalis, aptikimo geba ir atsparumas;

Tiriamasis mėginys – iš laboratorinio mėginio paruoštas mėginys, iš kurio imamos tiriamosios dalys;

Tiriamoji dalis – iš tiriamojo mėginio paimtas medžiagos kiekis atlikti tyrimą ar stebėjimą;

Tuščiojo mėginio tyrimas – visa analizės procedūra, atliekama su mėginio, kuriame nėra analitės, tiriamąja dalimi;

Tuščiojo reagento tyrimas – visa analizės procedūra, atliekama be mėginio arba vietoj mėginio dalies naudojant tokį patį kiekį tinkamo tirpiklio;

Įteisinimas – patvirtinimas objektyviais įrodymais, kad specifinio ketinamo naudojimo ir taikymo reikalavimai yra įvykdyti (LST EN ISO 9000:2001);

Vidinis etalonas (VE) – mėginyje nesanti medžiaga, kurios fizinės ir cheminės savybės yra kaip galima panašesnės į tos analitės, kurią reikia identifikuoti ir kurios pridedama į kiekvieną mėginį ir į kalibracinį etaloną;

Vidinis laboratorinis atkuriamumas (vietinis pripažinimas) – analizinis tyrimas, kurį atlieka viena laboratorija, taikydama vieną metodą tai pačiai arba skirtingoms tiriamosioms medžiagoms tirti skirtingomis sąlygomis ir pagrįstai ilgais laiko tarpais.

II. Analizės metodų tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai

2. Atrankos ar patvirtinimo tikslais gali būti naudojami ir kiti nei toliau aprašyti analizės metodai ar jų deriniai įrodžius, kad jie atitinka pašarų tyrimo cheminės analizės metodų įteisinimo metodikos techniniu reglamentu (toliau – metodika) nustatytus reikalavimus.

2.1. Bendrieji reikalavimai

2.1.1. Mėginių paruošimas

Mėginiai gaunami, tvarkomi ir apdorojami taip, kad būtų kuo daugiau galimybių aptikti medžiagą. Mėginio paruošimo procedūrų metu turi būti išvengta galimybių atsitiktinai užteršti analites ar sumažinti jų kiekį.

2.1.2. Tyrimų tinkamumas

2.1.2.1. Išgava

Jei naudojamas fiksuotas išgavos pataisos daugiklis, analizuojant mėginius nustatoma kiekvienos mėginių partijos išgava. Jei išgava yra leistino dydžio, galima taikyti fiksuotą pataisos daugiklį. Priešingu atveju naudojamas konkrečiai vienos rūšies mėginių serijai nustatytas išgavos daugiklis, nebent reikia taikyti savitąjį mėginio analitės išgavos daugiklį – tuomet analitei mėginyje kiekybiškai nustatyti naudojama etaloninės priemaišos procedūra (žr. 3.5 punktą) arba vidinis etalonas.

2.1.2.2. Specifiškumas

Metodas turi būti toks, kad eksperimento sąlygomis galima būtų išskirti analitę ir kitas medžiagas. Reikia pateikti apytikrį tokių galimybių įvertinimą. Reikia imtis priemonių, kad taikant aprašytą matavimo metodą būtų išvengta bet kokios numatomos sąveikos su kitomis medžiagomis, pvz., reikia naudoti dominančių likučių homologus, analogus ar metabolitus. Svarbiausia išnagrinėti galimą matricos komponentų sąveiką.

2.2. Atrankos metodai. Atrankai galima naudoti tik tokius analizės metodus, kurie yra įteisinti ir kurių neteisingų sprendimų dėl neigiamo rezultato koeficientas dominančiu lygiu yra mažesnis už 5 % (b paklaida). Visa tai turi būti įrodyta dokumentais, kuriuos galima patikrinti. Jei gaunamas abejotinas teigiamas rezultatas, jis patikrinamas patvirtinamuoju metodu.

2.3. Patvirtinamieji metodai taikomi organiniams likučiams ir teršalams, suteikia informacijos apie cheminę analitės sandarą. Todėl vien chromatografine analize paremti metodai, nenaudojant spektrometrinės detekcijos, patvirtinimui netinka. Tačiau jei vieno metodo specifiškumas yra nepakankamas, norimas specifiškumas pasiekiamas kelių analizės procedūrų tinkamu deriniu – gryninimo, chromatografinio atskyrimo ir spektrometrinės detekcijos.

1 lentelėje pateikti metodai arba metodų deriniai laikomi tinkamais nurodytų medžiagų grupių organiniams likučiams ar teršalams identifikuoti:

1 lentelė. Tinkami organinių likučių ir teršalų nustatymo patvirtinamieji metodai

Matavimo metodas	Medžiagos^{^[1]}	Apribojimai
SCh arba DCh su masių spektrometrine detekcija	A ir B grupės	Tik atliekant po tiesioginio arba netiesioginio chromatografinio atskyrimo Tik taikant viso spektro skenavimo metodiką, o jei visas masių spektras nėra fiksuojamas – naudojant ne mažiau kaip 3 (B grupė) arba 4 (A grupė) identifikavimo taškus
SCh arba DCh su IR spektrometrine detekcija	A ir B grupės	Reikia laikytis ypatingųjų IR absorbcinės spektrometrijos reikalavimų
SCh su viso spektro skenavimo diodinės matricos detekcija (DMD)	B grupė	Reikia laikytis ypatingųjų UV absorbcinės spektrometrijos reikalavimų
SCh su fluorescencine detekcija	B grupė	Tik molekulėms, kurios natūraliai fluorescuoja arba kurios fluorescuoja po transformavimosi arba derivatizacijos
Dvimatė PSCh su viso spektro skenavimo UV/VIS	B grupė	Privaloma dvimatė EPSCh ir kochromatografija
DCh su elektronų pagava	B grupė	Tik naudojant dvi skirtingo poliškumo kapiliarines kolonėles
SCh su imunograma	B grupė	Tik naudojant bent dvi skirtingas chromatografines sistemas arba taikant antrą nepriklausomą detekcijos metodą
SCh su UV/VIS (vieno bangos ilgio)	B grupė	Tik naudojant bent dvi skirtingas chromatografines sistemas arba taikant antrą nepriklausomą detekcijos metodą

2.3.1. Bendrieji tinkamumo kriterijai ir reikalavimai Taikant patvirtinamuosius metodus gaunama informacija apie cheminę analitės sandarą. Jei tą patį atsaką sukelia daugiau kaip vienas junginys, tuomet tuo metodu šių junginių atskirti neįmanoma. Vien chromatografine analize paremtų metodų, nenaudojant spektrometrinės detekcijos, negalima taikyti kaip patvirtinamųjų. Jei taikant metodą naudojamas tinkamas vidinis etalonas, tuomet jo pridedama į tiriamąją dalį pradedant ekstrahavimo procedūra. Gali būti naudojamos stabilios žymėtųjų izotopų analitės formos, kurios ypač tinka masių spektrometrinei detekcijai arba panašios į analitę sandaros junginiai (atsižvelgiant į tai, kuriuos lengviau gauti). Kai tinkamu vidiniu etalonu naudotis negalima, analitės identifikacija patvirtinama kochromatografija. Tokiu atveju gaunama tik viena smailė, o padidėjęs smailės aukštis (arba plotas) atitinka pridėtos analitės kiekį. Naudojant dujų chromatografiją (DCh) arba skysčių chromatografiją (SCh), smailės plotis pusės smailės aukštyje sudaro 90-110 % tikrojo pločio, o sulaikymo trukmė skiriasi ne daugiau kaip 5 %. Taikant plonasluoksnės chromatografijos (PSCh) metodus, suintensyvėti gali tik numanomai analitei priklausantis taškas; naujo taško neatsiranda, chromatograma nepasikeičia. Geriausia, jei per visą procedūrą pamatinė arba papildyta medžiaga, kurioje yra žinomas analitės kiekis, lygus arba artimas ribiniam leistinam kiekiui arba sprendimo ribai (teigiamas kontrolinis mėginys), kaip ir tinkamos kontrolinės medžiagos ir tuštieji reagentai, yra tiriama kartu su kiekviena iš analizuojamų vienos rūšies mėginių serija. Ekstraktai analizuojami tokia tvarka: tuščiasis reagentas, neigiamas kontrolinis mėginys, patvirtintinas mėginys (ar mėginiai), vėl neigiamas kontrolinis mėginys ir galiausiai teigiamas kontrolinis mėginys. Bet koks nukrypimas nuo šios sekos turi būti pagrįstas.

2.3.2. Papildomi kiekybinių analizės metodų tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai

2.3.2.1. Kiekybinių metodų teisingumas. Daugkartinės paliudytos pamatinės medžiagos analizės atveju eksperimentiškai nustatytos išgavos pakoreguotosios vidutinės masės dalies nuokrypio nuo patvirtintos vertės rekomenduojamo nuokrypio sritys pateikiamos 2 lentelėje.

2 lentelė. Mažiausiasis kiekybinių metodų teisingumas

Masės dalis	Nuokrypio sritis
≤ 1 µg/kg nuo 1 µg/kg iki 10 µg/kg ≥ 10 µg/kg	Nuo -50 % iki +20 % Nuo -30 % iki +10 % Nuo -20 % iki +10 %

Kai PPM nėra, leidžiama matavimų teisingumą įvertinti pagal pridėto žinomo analitės kiekio išgavą tuščioje matricoje. Pagal išgavos vidurkį pakoreguoti duomenys priimtini tik tuomet, jei jie patenka į 2 lentelėje nurodytas sritis.

2.3.2.2. Kiekybinių metodų glaudumas. Daugkartinės pamatinės arba papildytos medžiagos analizės tarplaboratorinis nuokrypio koeficientas (CV) atkuriamumo sąlygomis turi neviršyti Horwitz lygtimi apskaičiuoto lygio:

CV = 2^{(1 – 0,5 log C)}

čia C yra masės dalis, išreikšta skaičiaus 10 laipsnio rodikliu (pvz., 1 mg/g = 10^-3). Pavyzdžiai pateikti 3 lentelėje.

3 lentelė. Kiekybinių metodų atkuriamumo CV pavyzdžiai atitinkamų masės frakcijų srityse

Masės dalis	Atkuriamumas CV (%)
1 µg/kg	*
10 µg/kg	*
100 µg/kg	23
1 000 µg/kg (1 mg/kg)	16
* Jei masės dalis yra mažesnė kaip 100 µg/kg, taikant Horwitz lygtį gaunamos nepriimtinai didelės vertės. Todėl jei koncentracija mažesnė kaip 100 µg/kg ir CV turi būti kuo mažesnis.

Jei analizė atliekama pakartojamumo sąlygomis, tarplaboratorinis CV paprastai būna nuo pusės iki dviejų trečdalių aukščiau nurodytų verčių dydžio. Jei analizė atliekama atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis, laboratorijos CV turi būti ne didesnis už atkuriamumo CV. Jei nustatytas ribinis leistinas medžiagos kiekis, metodo atkuriamumas vienoje laboratorijoje turi būti ne didesnis už atitinkamą atkuriamumo CV, kai medžiagos koncentracija lygi pusei ribinio leistino kiekio.

2.3.3. Masių spektrometrinės detekcijos tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai Masių spektrometrijos metodus galima pasirinkti kaip patvirtinamuosius metodus tik tuomet, jei prieš tai atliktas tiesioginis arba netiesioginis chromatografinis atskyrimas.

2.3.3.1. Chromatografinis atskyrimas Vykdant DCh-MS procedūras, dujų chromatografinis atskyrimas atliekamas naudojant kapiliarines kolonėles. Vykdant SCh-MS procedūras, chromatografinis atskyrimas atliekamas naudojant atitinkamas SCh kolonėles. Bet kuriuo atveju trumpiausia priimtina tiriamos analitės sulaikymo trukmė yra dvigubai ilgesnė už tą sulaikymo trukmę, kuri atitinka tuščios kolonėlės tūrį. Tiriamosios dalies analitės sulaikymo trukmė (arba santykinė sulaikymo trukmė) turi atitikti kalibracinio etalono sulaikymo trukmę ir tilpti nurodytos sulaikymo trukmės ribose. Sulaikymo trukmės ribos turi būti proporcingos chromatografinės sistemos skiriamajai gebai. Analitės chromatografinio sulaikymo trukmės santykis su vidinio etalono sulaikymo trukme, t. y. analitės santykinė sulaikymo trukmė, turi atitikti kalibracinio tirpalo santykinę trukmę taikant 5 % leistinąjį nuokrypį DCh atveju ir 2,5 % – SCh atveju.

2.3.3.2. Masių spektrometrinė detekcija. Masių spektrometrinė detekcija atliekama taikant MS metodus, pvz., registruojant visą masių spektrą (viso spektro skenavimas) arba atliekant pasirinktų jonų stebėseną (toliau – PJS), MS-MS(n) metodus, pvz., atliekant pasirinktos reakcijos stebėseną (toliau – PRS), arba kitus tinkamus MS arba MS-MS(n) metodus kartu su atitinkamu jonizavimo būdu. Atliekant didelės skiriamosios gebos masių spektrometriją (DSGMS), skiriamoji geba visoje masių srityje esant 10 % įdubai tarp smailių paprastai turi būti didesnė kaip 10 000. Viso spektro skenavimas. Kai masių spektrometrinis nustatymas atliekamas registruojant visą spektrą, būtina, kad visi matuojami diagnostiniai jonai (molekulinis jonas, molekuliniam jonui būdingi aduktai, būdingi fragmentiniai jonai ir izotopų jonai), kurių intensyvumas yra didesnis kaip 10 %, būtų kalibracinio etalono pamatiniame spektre. PJS. Kai masių spektrometrinis nustatymas atliekamas taikant fragmentografiją; parankiausia, jei molekulinis jonas yra vienas iš pasirinktųjų diagnostinių jonų (molekulinis jonas, molekuliniam jonui būdingi aduktai, būdingi fragmentiniai jonai ir visų jų izotopų jonai). Pasirinktieji diagnostiniai jonai neturi būti vien iš tos pačios molekulės dalies. Kiekvieno diagnostinio jono signalo ir triukšmo santykis turi būti lygus ar didesnis už 3:1. Viso spektro skenavimas ir PJS. Aptiktų jonų santykinis intensyvumas, išreikštas intensyviausio jono intensyvumo procentine dalimi arba pereiga, turi atitikti leistinu nuokrypiu kalibracinio etalono iš panašių koncentracijų kalibracinių tirpalų arba iš papildyto mėginio atitinkamus parametrus išmatuotus tokiomis pačiomis sąlygomis (4 lentelė).

4 lentelė. Santykinio jonų intensyvumo didžiausi leistini nuokrypiai naudojant skirtingus masių spektrometrijos metodus

Santykinis intensyvumas (bazinės smailės dalis, %)	EJ-DCh-MS (santykinis)	CJ-DCh-MS, DCh-MSⁿ, SCh-MS, SCh-MSⁿ (santykinis)
> 50 %	±10 %	±20 %

nuo 20 % iki 50 %	±15 %	±25 %

nuo 10 % iki 20 %	±20 %	±30 %

≤ 10 %	±50 %	±50 %

Masių spektro duomenų aiškinimas: diagnostinių jonų ir/arba prekursoriaus/fragmento jonų porų intensyvumą reikia nustatyti sulyginant spektrus arba integruojant pavienių masių pėdsakų signalus. Foninė pataisa (jei taikoma) turi būti vienoda visai vienodos rūšies mėginių serijai (žr. 2.3.1 punkto ketvirtą pastraipą) ir aiškiai nurodyta. Viso spektro skenavimas: registruojant visą skenuojamą spektrą, kai atliekama pavienių masių spektrometrija, turi būti ne mažiau kaip keturi jonai, kurių santykinis intensyvumas sudaro ne mažiau 10 % bazinės smailės. Molekulinį joną galima įskaičiuoti, jei jis yra tokiame pamatiniame spektre ir jo santykinis intensyvumas sudaro ne mažiau kaip 10 %. Mažiausiai keturi jonai turi būti didžiausiais leistinais nuokrypiais apibrėžtose ribose (5 lentelė). Galima naudotis paieška kompiuterinėje bibliotekoje. Tokiu atveju tiriamųjų mėginių ir kalibracinio tirpalo masių spektro duomenų atitiktis turi viršyti ribinį atitikties koeficientą. Šis koeficientas nustatomas atliekant kiekvienos analitės įteisinimo procesą, remiantis tokiu spektru, kuris atitinka toliau aprašytus kriterijus. Tikrinamas spektro kintamumas, atsirandantis dėl mėginio matricos ir detektoriaus sąveikos.

5 lentelė. Masės fragmentų klasių kategorijų ir identifikacijos taškų santykis

MS metodas	Vieno jono suteikiami identifikacijos taškai
Mažos skiriamosios gebos masių spektrometrija (MSG-MS)	1,0
MSG-MSⁿ prekursorius	1,0
MSG-MSⁿ tarpiniai produktai	1,5
DSG-MS	2,0
DSG-MSⁿ prekursorius	2,0
DSG-MSⁿ tarpiniai produktai	2,5
PASTABOS: 1. Kiekvieną joną galima skaičiuoti tik vieną kartą. 2. DCh-MS naudojant elektronų smūgių jonizaciją ir DCh-MS naudojant cheminę jonizaciją laikomi skirtingais metodais. 3. Naudoti skirtingas analites identifikacijos taškų skaičiui padidinti galima tik tuomet, jei dariniai susidaro dėl skirtingų cheminių reakcijų. 4. A grupės medžiagoms galima priskirti ne daugiau kaip vieną identifikacijos tašką, jei analizuojama ESCh su viso spektro skenavimo diodų matricos spektrometrija (DAD), ESCh su fluorescencine detekcija, ESCh su imunograma, dvimate PSCh su spektrometrine detekcija ir su sąlygą kad laikomasi šiems metodams taikomų kriterijų. 5. Tarpiniai produktai – pirminiai ir antriniai fragmentai.

PJS: Kai masių fragmentai matuojami taikant kitus viso spektro skenavimo metodus, duomenims aiškinti naudojamasi identifikacijos taškų sistema. A grupės medžiagoms patvirtinti reikia ne mažiau kaip 4 taškų. B grupės medžiagoms patvirtinti reikia ne mažiau kaip 3 taškų. 6 lentelėje pateiktas pagrindiniais masių spektrometrijos metodais galimų gauti identifikacijos taškų skaičius

6 lentelė. Identifikacijos taškų skaičius, kurį galima gauti taikant tam tikrus metodus ar jų derinius (n – sveikasis skaičius)

Metodas (-ai)	Jonų skaičius	Identifikacijos taškai
DCh-MS (EJ arba CJ)	N	n
DCh-MS (EJ ir CJ)	2 (EJ) + 2 (CJ)	4
DCh-MS (EJ ir CJ)	2 (EJ) + 2 (CJ)	4
DCh-MS (EJ arba CJ) du dariniai	2 (A darinio) + 2 (B darinio)	4
DCh-MS (EJ arba CJ) du dariniai	2 (A darinio) + 2 (B darinio)	4
SCh-MS	N	n
DCh-MS-MS	1 prekursorius ir 2 fragmentai	4
SCh-MS-MS	1 prekursorius ir 2 fragmentai	4
DCh-MS-MS	2 prekursoriaus jonai, kiekvienas po 1 fragmentą	5
SCh-MS-MS	2 prekursoriaus jonai, kiekvienas po 1 fragmentą	5
SCh-MS-MS-MS	1 prekursorius, 1 pirminis fragmentas ir 2 antriniai fragmentai	5,5
DSGMS	N	2 n
DCh-MS ir SCh-MS	2 + 2	4
DCh-MS ir SCh-MS	2 + 2	4
DCh-MS ir DSGMS	2 + 1	4
DCh-MS ir DSGMS	2 + 1	4

Tačiau tam, kad reikiami identifikacijos taškai galėtų būti patvirtinti ir būtų apskaičiuota identifikacijos taškų suma reikia: a) išmatuoti bent vieną jonų santykį; b) visi išmatuoti jonų santykiai turi atitikti anksčiau aprašytus kriterijus; c) mažiausiam būtinam identifikacijos taškų skaičiui surinkti galima derinti ne daugiau kaip tris atskirus metodus.

2.3.4. Chromatografijos su infraraudonąja detekcija tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai Būdingosios smailės – tai absorbcijos maksimumai kalibracinio etalono infraraudonųjų spindulių spektre, atitinkantys toliau nurodytus reikalavimus.

2.3.4.1. Infraraudonoji detekcija Absorbcijos maksimumas turi būti nuo 4 000 cm^-1 iki 500 cm^-1 bangų skaičių intervale. Absorbcijos intensyvumas turi būti ne mažesnis kaip: a) savitoji molinė absorbcija, lygi 40, nustatant pagal smailės bazinę liniją; arba b) santykinė absorbcija, lygi 12,5 % intensyviausios smailės, esančios intervale nuo 4 000 cm^-1 iki 500 cm^-1, absorbcijos, kai matuojama pagal nulinę absorbciją, ir 5 % intensyviausios smailės, esančios intervale nuo 4 000 cm^-1 iki 500 cm^-1, absorbcijos, kai matuojama pagal smailių bazinę liniją.

PASTABA. Teoriškai priimtinesnės a punkte nurodytos smailės, praktiškai lengviau nustatyti nurodytąsias b punkte. Nustatomas analitės infraraudonųjų spindulių spektro smailių, kurių dažniai atitinka kalibracinio standarto būdingosios smailės dažnį ± 1 cm^-1 nuokrypiu, skaičius.

2.3.4.2. Infraraudonųjų spindulių spektro duomenų aiškinimas. Absorbcija turi būti visose analitės spektro dalyse, kurios atitinka būdingąją smailę kalibracinio etalono pamatiniame spektre. Kalibracinio etalono infraraudonųjų spindulių spektre turi būti ne mažiau kaip šešios būdingosios smailės. Jei smailių yra mažiau [5.7], tuo spektru negalima naudotis kaip pamatiniu. „Rezultatas“, t. y. analitės infraraudonųjų spindulių spektre rastų būdingųjų smailių procentinė dalis, turi būti ne mažesnis kaip 50 %. Kai negalima tiksliai nustatyti, ar smailė yra būdinga, ta analitės spektro dalis turi turėti tinkamos smailės buvimo požymių. Tai taikoma tik toms absorbcijos smailėms mėginio spektre, kurių intensyvumas yra bent tris kartus didesnis už foninį intensyvumą.

2.3.5. Analitės nustatymo naudojant SCh su kitais detekcijos metodais tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai

2.3.5.1. Chromatografinis atskyrimas. Vidinis etalonas naudojamas turint tam tikslui tinkamos medžiagos. Geriausia, jei tai giminingas etalonas, kurio sulaikymo trukmė panaši į analitės. Analitės eliuavimo sulaikymo trukmė turi būti tokia pat kaip atitinkamo kalibracinio etalono esant vienodomis eksperimento sąlygomis. Mažiausioji priimtina analitės sulaikymo trukmė turi būti dvigubai ilgesnė už sulaikymo trukmę, atitinkančią tuščios kolonėlės tūrį. Analitės sulaikymo trukmės ir vidinio etalono sulaikymo trukmės santykis, t. y. santykinė sulaikymo trukmė, turi būti tokia pati kaip kalibracinio etalono sulaikymo trukmė atitinkamoje matricoje (leistinas ± 2,5 % nuokrypis).

2.3.5.2. Viso spektro skenavimo UV/VIS detekcija. Būtina laikytis SCh metodų tinkamumo kriterijų. Absorbcijos maksimumas analitės spektre turi būti ties tomis pačiomis bangos ilgio vertėmis kaip ir kalibracinio etalono; leistinas nuokrypis priklauso nuo detekcijos sistemos skiriamosios gebos. Taikant detekcijos diodų matrica metodą, leistinas nuokrypis paprastai būna ± 2 nm. Virš 220 nm esančios analitės spektro dalys, kurių dviejų spektrų santykinė absorbcija yra ne mažesnė nei 10 %, vizualiai neturi skirtis nuo kalibracinio etalono spektro. Šio kriterijaus reikalavimų laikomasi, jei yra vienodi maksimumai, o skirtumai tarp abiejų spektrų nė viename taške nėra didesni nei 10 % skaičiuojant nuo kalibracinio etalono absorbcijos Jei naudojamasi kompiuterizuota paieška bibliotekoje ir taikomas sulyginimas, tiriamųjų mėginių ir kalibracinio tirpalo spektro duomenų atitiktis turi viršyti ribinį atitikties koeficientą. Šis koeficientas nustatomas atliekant kiekvienos analitės įteisinimo procesą remiantis tokiu spektru, kuris atitinka toliau aprašytus kriterijus. Turi būti tikrinamas spektro kintamumas, atsirandantis dėl mėginio matricos ir detektoriaus sąveikos.

2.3.5.3. Fluorimetrinės detekcijos tinkamumo kriterijai. Būtina laikytis SCh metodų tinkamumo kriterijų. Fluorimetrinės detekcija taikoma analizuoti molekulėms, kurios natūraliai fluorescuoja arba kurios fluorescuoja po transformavimosi arba derivatizacijos. Sužadinimo ir emisijos bangų ilgiai pagal chromatografijos sąlygas parenkami taip, kad tuščių mėginių ekstraktuose atsirastų kuo mažiau trukdančių komponentų. Tarp artimiausio smailės maksimumo chromatogramoje ir priskirtosios analitės smailės ties 10 % analitės smailės maksimalaus aukščio turi būti bent vienos visos smailės pločio tarpas.

2.3.5.4. Analitės nustatymo SCh imunograma tinkamumo kriterijai. Vien SCh imunograma negali būti naudojama kaip patvirtinamasis metodas. Būtina laikytis SCh metodams taikomų kriterijų. Iš anksto nustatyti kokybės parametrai, pvz., nebūdingos jungtys, santykinės jungtys kontroliniuose mėginiuose, tuščio mėginio absorbcijos vertė, turi būti tarp ribų nustatytų įteisinimo metu. Imunogramą turi sudaryti mažiausiai penkios frakcijos. Kiekviena frakcija turi būti mažesnė kaip pusės smailės pločio. Frakcija, kurioje yra didžiausias analitės kiekis, turi būti vienoda tiriant įtariamą mėginį, teigiamą kontrolinį mėginį ir etaloną.

2.3.5.5. Analitės nustatymas taikant SCh kartu su UV/VIS detekcija (vienas bangos ilgis). Vien SCh su UV/VIS detekcija (vienas bangos ilgis) negali būti taikomos kaip patvirtinamasis metodas. Tarp artimiausio smailės maksimumo chromatogramoje ir priskirtosios analitės smailės ties 10 % analitės smailės maksimalaus aukščio turi būti bent vienos visos smailės pločio tarpas.

2.3.6. Analitės nustatymo taikant dvimatę PSCh sykiu su viso spektro skenavimo UV/VIS spektrometrine detekcija tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai Privalu atlikti dvimatę EPSCh ir kochromatografiją. Analitės Rf vertės negali skirtis nuo etalonų R_f verčių daugiau kaip ± 5 %. Analitė neturi atsiskirti nuo etalono. Jei dėmės vienodos spalvos, artimiausios dėmės centras turi būti nutolęs nuo analitės dėmės ne mažiau kaip per pusę dėmių skersmenų sumos. Analitės spektras vizualiai neturi skirtis nuo etalono spektro, kaip nurodyta viso spektro skenavimo UV/VIS detekcijai. Jei naudojamasi kompiuterizuota paieška bibliotekoje ir taikomas sulyginimas, tiriamųjų mėginių ir kalibracinio tirpalo spektro duomenų atitiktis turi viršyti ribinį atitikties koeficientą. Šis koeficientas nustatomas atliekant kiekvienos analitės įteisinimo procesą, remiantis spektru, kuris atitinka toliau aprašytus kriterijus. Turi būti tikrinamas spektro kintamumas, atsirandantis dėl mėginio matricos ir detektoriaus sąveikos.

2.3.7. Analitės nustatymo taikant DCh kartu su elektronų pagavos detekcija tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai Vidinis etalonas naudojamas turint tam tikslui tinkamos medžiagos. Geriausia, jei tai giminingas etalonas, kurio sulaikymo trukmė panaši į analitės. Analitės eliuavimo sulaikymo trukmė vienodomis eksperimento sąlygomis turi būti tokia pati kaip atitinkamo kalibracinio etalono. Mažiausioji priimtina analitės sulaikymo trukmė turi būti dvigubai ilgesnė už sulaikymo trukmę, atitinkančią tuščios kapiliarinės kolonėlės tūrį. Analitės sulaikymo trukmės ir vidinio etalono sulaikymo trukmės santykis, t. y. santykinė sulaikymo trukmė, turi būti tokia pati, kaip ir kalibracinio etalono sulaikymo trukmė atitinkamoje matricoje (leistinas ± 0,5 % nuokrypis). Tarp artimiausio smailės maksimumo chromatogramoje ir priskirtosios analitės smailės ties 10 % analitės smailės maksimalaus aukščio turi būti mažiausiai vienos visos smailės pločio tarpas.

2.4. Patvirtinamieji elementų nustatymo metodai Patvirtinamieji cheminių elementų metodai grindžiami aiškios identifikacijos koncepcija ir tiksliu bei glaudžiu kiekio nustatymu pasinaudojant unikaliomis turimo cheminio elemento fizinėmis cheminėmis savybėmis (pvz., elementui būdingu skleidžiamos arba sugeriamos spinduliuotės bangos ilgiu, atomine mase) dominančiu lygiu. Cheminiams elementams identifikuoti tinkami metodai ir metodų deriniai išvardyti 7 lentelėje.

2.4.1. Bendrieji patvirtinamųjų metodų tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai Geriausia, jei per visą procedūrą pamatinė arba papildyta medžiaga, kurioje yra žinomas analitės kiekis, lygus arba artimas leistinam kiekiui arba sprendimo ribai (teigiamas kontrolinis mėginys), kaip ir tinkamos kontrolinės medžiagos ir tuštieji reagentai, yra tiriama kartu su kiekvienu iš analizuojamų tiriamųjų mėginių. Ekstraktai analizuojami tokia tvarka: tuščiasis reagentas, neigiamas kontrolinis mėginys, patvirtintinas mėginys (ar mėginiai), vėl neigiamas kontrolinis mėginys ir galiausiai teigiamas kontrolinis mėginys. Bet koks nukrypimas nuo šios sekos turi būti pagrįstas.

7 lentelė. Tinkami patvirtinamieji cheminių elementų nustatymo metodai

Metodas	Matuojamas parametras
Diferencinė impulsinė grįžtamojo vyksmo anodinė voltamperometrija (DIGVAV)	Elektros signalas
Atominė absorbcinė spektrometrija:
Atomizacija liepsnoje	Absorbuojamų bangų ilgis
Hidrido sudarymas	Absorbuojamų bangų ilgis
Šaltasis garas	Absorbuojamų bangų ilgis
Elektroterminė atomizacija (grafito krosnis)	Absorbuojamų bangų ilgis
Atominė emisinė spektrometrija:
Indukciškai sujungta plazma	Emisijos bangų ilgis
Masių spektrometrija:
Indukciškai sujungta plazma	Masės ir krūvio santykis

Daugelyje analizės metodų prieš nustatant analitę būtina visiškai sudeginti organinę matricą. Tai galima padaryti atliekant mineralizaciją mikrobangomis, kuri labiausiai sumažina pavojų, kad dominanti analitė bus užteršta ir (arba) dalis jos prarasta. Naudojami aukštos kokybės dezaktyvuoti tefloniniai indai. Jei pasirenkami kiti drėgnojo ar sausojo sudeginimo metodai, dokumentais patvirtinama, kad juos taikant neįmanoma prarasti ar užteršti medžiagą. Analitėms iš matricos komponentų išskirti ir (arba) koncentruoti tam tikromis aplinkybėmis vietoj sudeginimo galima pasirinkti išskyrimo procedūras (pvz., ekstrahavimą). Atliekant kalibravimą – tiek išorinį, tiek taikant etaloninės priemaišos metodą, pasirūpinama, kad nebūtų viršyta nustatyta darbinė analizės riba. Jei atliekamas išorinis kalibravimas, kalibraciniai etalonai ruošiami tokiame tirpale, kurio sudėtis yra kaip galima panašesnė į mėginio tirpalo sudėtį. Susiklosčius ypatingoms analizės aplinkybėms, taikoma foninė korekcija.

2.4.2. Papildomi kiekybinių analizės metodų tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai

2.4.2.1. Kiekybinių metodų teisingumas Daugkartinės paliudytos pamatinės medžiagos elementų analizės atveju eksperimentiškai nustatyto kiekio vidurkis gali skirtis nuo patvirtintos vertės ne daugiau kaip ± 10 %. Kai PPM nėra, leidžiama matavimų teisingumą įvertinti pagal žinomo kiekio elemento priemaišų nežinomuose mėginiuose išgavą. Atkreiptinas dėmesys į tai, kad skirtingai nei analitė primaišomas elementas nėra chemiškai susijęs su tikrąja matrica, todėl taikant šį metodą gauti rezultatai yra mažiau patikimi nei gautieji taikant PPM. Duomenys apie išgavą priimtini tik tuomet, jei skiriasi nuo tikslinės vertės ne daugiau kaip ± 10 %.

2.4.2.2. Kiekybinių metodų glaudumas Daugkartinės mėginio analizės tarplaboratorinis nuokrypio koeficientas (CV) atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis turi neviršyti 8 lentelėje nurodytų verčių.

8 lentelė. Kiekybinių metodų CV esant įvairioms analitės masės dalims

Masės dalis	Atkuriamumas CV (%)
nuo ≥ 10 µg/kg iki 100 µg/kg	20
nuo > 100 µg/kg iki 1 000 µg/kg	15
≥ 1 000 µg/kg	10

2.4.3. Ypatingieji reikalavimai diferencinės impulsinės grįžtamojo vyksmo anodinės voltamperometrijos metodams (DIGVAV).

Svarbiausia – iki DIGVAV tyrimo visiškai suardyti organinę medžiagą mėginiuose. Voltamperogramose neturi matytis organinių medžiagų sukeliamų plačių signalų. Neorganinės matricos sudėtinės dalys gali turėti įtakos DIGVAV smailių aukščiui. Todėl kiekis turi būti nustatomas etaloninės priemaišos metodu. Pateiktini mėginio tirpalų tipinių voltamperogramų pavyzdžiai.

2.4.4. Ypatingieji reikalavimai atominės absorbcinės spektrometrijos AAS metodams Šis metodas iš esmės yra monoelementinis ir todėl reikia optimizuoti eksperimento parametrus priklausomai nuo tiriamo elemento. Jeigu įmanoma, rezultatai tikrinami kokybiniu ir kiekybiniu būdu, pasinaudojant alternatyviomis absorbcijos linijomis (geriausia pasirinkti dvi skirtingas linijas). Kalibraciniai etalonai paruošiami tirpalo matricoje, kuri yra kaip galima panašesnė į mėginio matavimo tirpalą (pvz., rūgšties koncentracija ar modifikatoriaus sudėtimi). Tam, kad būtų mažiau negaliojančių verčių, visi reagentai turi būti kuo švaresni. Atsižvelgiant į tai, koks mėginio išgarinimo ir (arba) atomizacijos būdas pasirenkamas, išskiriamos įvairios AAS analizės rūšys.

2.4.4.1. Ypatingieji reikalavimai liepsnos AAS. Prietaisas turi būti optimaliai sureguliuojamas atitinkamai pagal kiekvieną elementą. Ypač reikia kontroliuoti dujų sudėtį ir debitą. Siekiant išvengti foninės absorbcijos sukeliamų trukdžių, naudojamas ištisinės aplinkos šaltinio korektorius. Jei matrica nežinoma, reikia patikrinti, ar būtina foninė korekcija.

2.4.4.2. Ypatingieji reikalavimai AAS su grafito krosnele. Dirbant ties pėdsakiniu lygiu su grafito krosnele, laboratorijos užterštumas neretai kenkia tikslumui. Todėl dirbant su mėginiu ir etalonu reikia naudoti labai švarius reagentus, dejonizuotą vandenį ir priemones iš inertinio plastiko. Ypač svarbu kontroliuoti išankstinio apdorojimo bei atomizacijos sąlygas (temperatūrą, trukmę) ir matricos pasikeitimą.

Matricos įtaka analitės atomizacijai sumažėja dirbant izoterminio atomizavimo sąlygomis (pvz., statmenai kaitinamame grafito vamzdyje su integruota Lvov platforma [5.8]. Kiekį leidžiama nustatyti pagal kalibracinę kreivę, gautą matuojant etaloninius vandens tirpalus, jei tai atliekama derinant matricos modifikavimą ir Zeeman foninę pataisą [5.9].

2.4.5. Ypatingieji reikalavimai atominei absorbcinei spektrometrijai sudarant hidridą.

Organiniai junginiai, kuriuose yra tokių elementų kaip arsenas, bismutas, germanis, švinas, stibis, selenas, alavas ir telūras, gali būti labai stabilūs ir visam elemento kiekiui nustatyti gali prireikti oksidacinio skaidymo. Todėl rekomenduojamas sudeginimas mikrobangomis arba esant aukštame slėgyje stipriai oksiduojant. Reikia kreipti ypatingą dėmesį į tai, kad elementai visiškai, bet atkuriamai, pavirstų atitinkamais hidridais.

Arseno hidrido susidarymas druskos rūgšties tirpale su NaBH4 priklauso nuo arseno oksidacijos laipsnio (As(III) susidaro greitai, As(V) formuojasi ilgiau). Tam, kad nustatant As(V) srauto įpurškimo metodu nesumažėtų jautrumas dėl trumpos reakcijos trukmės, po oksidacinio skaidymo As(V) reikia redukuoti iki As(III). Tam tinka kalio jodidas, askorbo rūgštis arba cisteinas. Tuštieji, kalibraciniai tirpalai ir mėginio tirpalai apdorojami tuo pačiu būdu. Dirbant su vienos rūšies mėginių serijomis, galima nustatyti abi arseno rūšis nepakenkiant tikslumui. Dėl uždelsto As(V) hidrido formavimosi kalibravimas atliekamas integruojant smailės plotą. Parenkami optimalūs prietaiso parametrai. Ypač svarbu kontroliuoti dujų srautą, kuris perneša hidridą į atomizatorių.

2.4.6. Ypatingieji reikalavimai šalto garo atominės absorbcinės spektrometrijos metodams.

Šaltas garas naudojamas tik gyvsidabriui tirti. Dėl elementinio gyvsidabrio nuostolių dėl lakumo ir adsorbcijos viso analizės proceso metu reikalingas ypatingas atsargumas. Reikia stropiai vengti teršalų patekimo iš reagentų ar iš aplinkos.

Tiksliam suminio gyvsidabrio kiekio organiniuose junginiuose nustatymui reikalingas oksidacinis skaidymas. Skaidymui reikia naudoti sandarias sudeginimo mikrobangomis sistemas arba aukšto slėgio įrenginį. Reikia itin atidžiai išvalyti įrangą, turėjusią sąlytį su gyvsidabriu.

Parankiausia naudotis srauto įpurškimo metodu. Jei sprendimo ribos žemesnės, rekomenduojama naudoti elementinio gyvsidabrio adsorbciją ant auksinio (platininio) adsorberio. Po to atliekama terminė desorbcija. Reikia saugoti, kad ant adsorberio ar ant celės nepakliūtų drėgmė, kadangi tai pakenktų matavimui.

2.4.7. Ypatingieji reikalavimai indukciškai sujungtos plazmos atominei emisinei spektrometrijai (ISP-AES).

Indukciškai sujungtos plazmos atominė emisinė spektrometrija [5.10] galima iškart matuoti keletą elementų. Kad būtų galima taikyti ISP-AES, iš pradžių mėginiai turi būti sudeginami siekiant suskaidyti organines matricas. Naudojamasi sandariomis sudeginimo mikrobangomis arba aukštame slėgyje sistemomis. Tam, kad ISP-AES analizė būtų atlikta tinkamai, labai svarbu sukalibruoti prietaisą ir tinkamai pasirinkti elementą ir bangos ilgį. Kalibruojant prietaisą pagal tiesines kalibracines kreives paprastai būtina išmatuoti tik keturių koncentracijų kalibracinius tirpalus, kadangi ISP-AES kalibracinės kreivės yra tiesinės per keturias – šešias koncentracijos vertės eiles. ISP- AES sistema paprastai kalibruojama tokiu daugiaelemenčio etalono tirpalu, kurio rūgšties koncentracija yra tokia pati kaip matuojamo tirpalo.

Elementų koncentracija kontroliuojama nustatant tiesines kreives. Elementų koncentracijoms nustatyti reikia pasirinkti analitės emisijos matavimo bangos ilgį. Jei analitės koncentracija nebepatenka į emisijos linijos darbinę sritį, reikia naudoti kitą emisijos liniją. Iš pradžių pasirenkama jautriausia emisijos linija (be interferencijos), po to – mažiau jautri. Dirbant ties arba netoli aptikimo ribos geriausia pasirinkti atitinkamos analitės jautriausią liniją. Taikant ISP-AES, daugiausia sunkumų sukelia spektriniai ir foniniai trukdžiai. Gali pasireikšti ir tokie trukdžiai, kaip, pvz., paprastasis foninis poslinkis, nuolaidusis foninis poslinkis, tiesioginis spektro persidengimas ir sudėtinis foninis poslinkis. Kiekviena iš šių trukdžių rūšių turi savas priežastis ir kovos su ja būdus. Atsižvelgiant į matricas, taikomos pataisos dėl trukdžių ir darbo parametrų optimizacija. Tam tikrų rūšių trukdžių galima išvengti skiedžiant arba priderinant matricas. Analizuojant kiekvieną vienos rūšies mėginių seriją, su pamatine bei papildyta medžiaga, kuriose yra tam tikras žinomas analitės (analičių) kiekis, tuščiąja medžiaga dirbama taip pat kaip ir su mėginiais. Tiriant rodmenų kitimą, etalonas tikrinamas, pvz., po 10 mėginių. Visi reagentai ir plazmos dujos turi būti kaip įmanoma grynesni.

2.4.8. Ypatingieji indukciškai sujungtos plazmos masių spektrometrijos (ISP-MS) reikalavimai [5.11]

Nustatant vidutinės atominės masės mikroelementus, pvz., chromą, varį ir nikelį, gali pasireikšti stipri interferencija iš kitų izobarinių ir daugiaatomių jonų. To galima išvengti tik naudojant ne mažesnę kaip 7 000-8 000 skiriamąją gebą. Taikant MS metodiką, susiduriama su tokiais sunkumais: prietaisų rodmenų kitimas, matricos efektai ir molekulinė jonų interferencija (m/z < 80). Prietaisų rodmenų kitimui ir matricos efektams koreguoti būtina atlikti daugkartinį vidinį standartizavimą, kuris tiktų elementų masei.

Prieš atliekant ISP-MS matavimus, būtina visiškai išskaidyti organinę medžiagą mėginiuose. Kaip ir AAS, po sudeginimo uždaruose induose lakiems elementams, pvz., jodui, turi būti sugrąžinamas stabilus oksidacijos būvis. Stipriausia trukdžiai pasireiškia dėl molekulinių jonų derinių iš argono (plazmos dujų), vandenilio, anglies, azoto bei deguonies atomų (tirpinamosios rūgštys, plazmos dujų nešvarumai ir įtrauktos atmosferos dujos) ir mėginio matricos. Trukdžiams išvengti būtina atlikti visišką sudeginimą, foninius matavimus, tinkamai pasirinkti analizės masę ir tirpinamąsias rūgštis, pvz., azoto rūgštį.

Nustatant elementus, trukdžiai šalinami tinkamai pasirenkant analitines mases, įskaitant izotopų santykių patvirtinimą. Kiekvienąsyk matuojant pagal vidinius etalonus tikrinamas prietaiso atsakas ir įvertinama Fano koeficientais.

III. Analizės metodų įteisinimas

3. Įteisinimu parodoma, kad analizės metodas atitinka tinkamumo požymiams taikomus kriterijus. Įvairiais kontrolės tikslais taikomi skirtingų kategorijų metodai. 9 lentelėje nurodyta, kokius kiekvienos rūšies metodų tinkamumo požymius reikia patikrinti.

9 lentelė. Analizės metodų klasifikacija pagal nustatomus tinkamumo požymius

		Aptikimo riba CCβ	Sprendimo riba CCα	Teisingumas/Išgava	Glaudumas	Atrankumas, specifiškumas	Pritaikomumas, atsparumas, stabilumas
Kokybiniai metodai	A	+	-	-	-	+	+

	P	+	+	-	-	+	+

Kiekybiniai metodai	A	+	-	-		+	+

	P	+	+	+	+	+	+

A – atrankos metodai; P – patvirtinamieji metodai; + – tinkamumą nustatyti privalu.

3.1. Įteisinimo procedūros

Šiame skyriuje pateikti analizės metodų įteisinimo procedūrų pavyzdžiai ir (arba) nuorodos. Patvirtinti, kad analizės metodas atitinka tinkamumo požymiams taikomus kriterijus, galima ir kitais būdais, jei jais gaunama tokio paties lygio ir kokybės informacija.

Įteisinti galima ir atlikus tarplaboratorinę studiją taip, kaip nurodyta Maisto kodekse (Codex Alimentarius), ISO arba IUPAC [5.12] arba alternatyviais metodais, pvz., tyrimais vienoje laboratorijoje arba pačių pripažinimu [5.13, 5.14]. Šioje dalyje daugiausia kalbama apie tyrimus vienoje laboratorijoje (pačių pripažinimą), taikant modulinį metodą. Šį metodą sudaro: a) visiems įteisinimo modeliams universalus bendrųjų tinkamumo požymių komplektas; b) 10 lentelėje nurodytos tam tikriems modeliams skirtos labiau savitos procedūros.

3.1.1. Universalūs tinkamumo požymiai

Neatsižvelgiant į pasirinktą įteisinimo būdą turi būti nustatyti toliau nurodomi tinkamumo požymiai. Darbo krūviui sumažinti galima taikyti stropiai suplanuotą ir statistiškai patikimą atliekamų eksperimentų derinimo metodą skirtingiems parametrams nustatyti.

10 lentelė. Universalūs ir tam tikriems modeliams skirti tinkamumo parametrai

Įteisinimas
Universalūs tinkamumo parametrai	Tam tikriems modeliams skirti tinkamumo parametrai
Bendrieji tinkamumo požymiai (žr. 3.1.1 punktą)	Įprastinis pripažinimo būdas (žr. 3.1.2 punktą)	Pačių pripažinimo būdas (žr. 3.1.3 punktą)
Specifiškumas Teisingumas Atsparumas: nežymūs pokyčiai Stabilumas	Išgava Pakartojamumas Atkuriamumas vienoje laboratorijoje Atkuriamumas Sprendimo riba (CCα) Aptikimo geba (CCβ) Kalibracinės kreivės Atsparumas: žymūs pokyčiai	Išgava Pakartojamumas Atkuriamumas vienoje laboratorijoje Atkuriamumas Sprendimo riba (CCα) Aptikimo geba (CCβ) Kalibracinė kreivė Atsparumas

3.1.1.1. Specifiškumas

Taikant analizės metodus, svarbi analitės ir į ją panašių medžiagų (izomerų, skilimo produktų, endogeninių medžiagų, matricos sudedamųjų dalių ir pan.) atskyrimo galia (įrangos skiriamoji geba). Trukdžių buvimui patikrinti reikia dviejų metodų.

Siekiant nustatyti, ar nėra galimų trukdžių, bei įvertinti trukdžių poveikį pasirenkamos potencialiai trukdančios medžiagos ir išanalizuojami atitinkami tuštieji mėginiai:

pasirenkama chemiškai giminingų junginių serija (metabolitai, dariniai ir kt.) ar kitos medžiagos, kurios galėjo turėti sąlytį su dominančiu junginiu ir kurių gali būti mėginiuose;

išanalizuojamas reikiamas tipiškų tuščiųjų mėginių skaičius (n => 20) ir patikrinama, ar dominančioje srityje, kurioje turėtų būti išplauta tikslinė analitė, nėra trukdžių (signalų, smailių, jonų pėdsakų);

tipiški tuštieji mėginiai papildomi iki reikiamos koncentracijos medžiagomis, kurios galėtų trukdyti identifikuoti ir (arba) nustatyti analitės kiekį;

atlikus analizę, patikrinama, ar:

esami trukdžiai negali būti klaidingo identifikavimo priežastimi;

identifikuoti tikslinę analitę trukdo vienas ar daugiau trukdžių;

žymiai pakinta kiekybinio nustatymo rezultatai.

3.1.1.2. Teisingumas

Teisingumą galima nustatyti tik pasinaudojus paliudyta pamatine medžiaga (PPM). PPM naudojama visuomet, jei tik jos turima. Procedūra išsamiai aprašyta ISO 5725-4 [5.5]. Toliau pateikiamas pavyzdys:

laikantis taikomo metodo tyrimo nurodymų, padaromos šešios kartotinės PPM analizės;

nustatomas kiekviename kartotiniame mėginyje esančios analitės kiekis;

apskaičiuojamas koncentracijų vidurkis, standartinis nuokrypis ir nuokrypio koeficientas procentais;

teisingumas apskaičiuojamas padalinant gautą koncentracijos vidurkį iš patvirtintos vertės (koncentracija) ir padauginant iš 100, siekiant rezultatą išreikšti procentais.

Teisingumas (%) = (koncentracijos vidurkis, patikslintas pagal išgavą x 100)/patvirtinta vertė.

Jei PPM nėra, vietoj teisingumo galima nustatyti išgavą taip, kaip aprašyta 4.1.2.1. punkte.

3.1.1.3. Pritaikomumas, atsparumas (nežymūs pokyčiai)

Tokiuose tyrimuose laboratorija specialiai padaro keletą pagrįstų nedidelių pakeitimų ir stebi jų pasekmes.

Pirminiai tyrimai turi būti atliekami pasirenkant tokius mėginių išankstinio paruošimo, gryninimo ir analizės veiksnius, kurie gali turėti įtakos matavimo rezultatams. Tie veiksniai gali būti tyrėjas, reagentų kilmė bei amžius, tirpikliai, etalonai bei mėginio ekstraktai, kaitinimo intensyvumas, temperatūra, pH vertė ir daugelis kitų veiksnių, galinčių pasireikšti laboratorijoje. Tuos veiksnius reikia pakoreguoti tiek, kad jie atitiktų skirtumus, paprastai galinčius būti tarp laboratorijų:

identifikuojami galimi veiksniai, kurie gali turėti įtakos rezultatams;

kiekvienas veiksnys šiek tiek pakeičiamas;

Youdeno metodu atliekamas atsparumo bandymas [5.15, 5.16]. (Galima naudoti ir kitus patvirtintus metodus, tačiau Youdeno metodas yra trumpiausias ir reikalaujantis mažiausiai pastangų.) Youdeno metodas grindžiamas daliniais veiksniais. Sąveikos tarp skirtingų veiksnių nustatyti negalima;

kai nustatoma, kad veiksnys žymiai pakeičia matavimo rezultatus, atliekami papildomi eksperimentai, siekiant nustatyti veiksnio priimtinumo ribas;

veiksniai, kurie žymiai pakeičia matavimo rezultatus, turi būti aiškiai nurodyti metodo protokole.

Pagrindinė mintis – pakeitimų netyrinėti atskirai po vieną, o padaryti iškart keletą pakeitimų. Pavyzdžiui, imami septyni skirtingi veiksniai, kurie gali turėti įtakos rezultatams, jei bus šiek tiek pakeistos jų nominalios vertės. Tos vertės pažymimos raidėmis A, B, C, D, E, F ir G. Alternatyvios vertės pažymimos atitinkamomis mažosiomis raidėmis a, b, c, d, e, f ir g. Taip susidaro 2-7 arba 128 galimi skirtingi deriniai.

Galima pasirinkti poaibį, kurį sudaro aštuoni iš šių derinių, turinčių po lygiai didžiųjų ir mažųjų raidžių (11 lentelė). Reikia atlikti aštuonis nustatymus, kuriuose bus panaudoti pasirinktų veiksnių deriniai (nuo A iki G). Nustatymų rezultatai pažymėti 11 lentelėje raidėmis nuo S iki Z.

3.1.1.4. Pastovumas

Yra pastebėta, kad dėl mėginio analitės ar matricos sudėtinių dalių nepakankamo pastovumo mėginio laikymo ar analizės metu gali žymiai kisti analizės rezultatai. Be to, reikia kontroliuoti kalibracinio etalono pastovumą. Paprastai analitės pastovumas gerai apibūdinamas pagal įvairias laikymo sąlygas. Laikymo sąlygų stebėsena sudaro dalį įprastinės laboratorijos akreditavimo sistemos. Toliau pateikiami pavyzdžiai, kaip galima nustatyti pastovumą.

11 lentelė. Eksperimentinė atsparumo tyrimo (nežymūs pokyčiai) sistema

Veiksnio vertė F	Nustatymo derinio numeris
Veiksnio vertė F	1	2	3	4	5	6	7	8
A/a	A	A	A	A	a	a	a	a
B/b	B	B	b	b	B	B	b	b
C/c	C	c	C	c	C	c	C	c
D/d	D	D	d	d	d	d	D	D
E/e	E	e	E	e	e	E	e	E
F/f	F	f	f	F	F	f	f	F
G/g	G	g	g	G	g	G	G	g
Gautas rezultatas R	S	T	U	V	W	X	Y	Z
Skaičiavimai pateikti atsparumo tyrimų pavyzdžiuose 3.3 punkte.

Analitės pastovumo tirpale nustatymas:

paruošiami nauji analitės (ar analičių) tirpalai ir atskiedžiami taip, kaip apibūdinta tyrimo nurodymuose reikiamam kiekvienos pasirinktos koncentracijos (jei medžiagai nenustatytas ribinis leistinas kiekis – maždaug ties mažiausiojo privalomo aptikti kiekio riba, kitų medžiagų – ties ribiniu leistinu kiekiu) alikvočių kiekiui gauti (pvz., 40). Paruošiami papildymui skirto analitės bei galutinės analizės tirpalai ir visi kiti reikalingi tirpalai (pvz., derivatiniai etalonai);

pagal tyrimo nurodymus išmatuojamas analitės kiekis šviežiai paruoštame tirpale; reikiamas tūris supilstomas į tinkamas talpyklas, jos paženklinamos ir laikomos pagal programą (12 lentelė);

12 lentelė. Analitės pastovumo tirpale nustatymo programa

- 20°C

+ 4°C

+ 20°C

Tamsa

Šviesa

10 mėginių

laikymo trukmė gali būti viena, dvi, trys ar keturios savaitės, o jei reikia – dar ilgesnė, pvz., kol identifikuojant ir (arba) nustatant kiekį bus pastebėti pirmieji irimo požymiai. Ilgiausiąją laikymo trukmę ir optimalias saugojimo sąlygas reikia užregistruoti;

analitės koncentracija kiekviename mėginyje skaičiuojama panaudojant analizės metu šviežiai paruoštą analitės tirpalą ir prilyginant jį 100 %.

Likusi analitė (%) = C_i x 100/C_šviež.

C_i – koncentracija matavimo metu;

C_šviež.. – šviežio tirpalo koncentracija.

Analitės (-ių) pastovumo tirpale nustatymas:

jei tik įmanoma, reikia naudoti neapdorotus mėginius. Jei neapdorotos medžiagos nėra, reikia naudoti matricą, papildytą analite;

kai yra neapdorotos medžiagos, koncentracija joje nustatoma kol medžiaga dar šviežia. Kitos medžiagos alikvotės gali būti imamos po vienos, dviejų, keturių arba 20 savaičių, po to taip pat nustatoma koncentracija. Audiniai laikomi -20°C, o jei reikia – dar žemesnėje temperatūroje;

jei neapdorotos medžiagos nėra, imama tuščioji medžiaga ir homogenizuojama. Medžiaga padalijama į penkias alikvotes. Kiekvienas mėginys papildomas tokia analite, kurią geriausia paruošti mažame kiekyje vandens tirpalo. Viena alikvotė tuoj pat išanalizuojamas. Likusios laikomos -20°C, o jei reikia – dar žemesnėje temperatūroje ir analizuojami po vienos, dviejų, keturių arba 20 savaičių.

3.1.1.5. Kalibracinės kreivės

Kai kiekiui nustatyti naudojamos kalibracinės kreivės:

kreivei sudaryti naudojami ne mažiau kaip penki lygiai (įskaitant nulį);

turi būti nurodyta kreivės darbinė sritis;

turi būti nurodyta kreivės matematinė formulė ir duomenų atitikties su kreive laipsnis;

turi būti nurodyta kreivės parametrų priimtinumo sritis.

Kai būtina atlikti serijinį kalibravimą pagal etaloninį tirpalą, nurodoma kalibracinės kreivės, parametrų priimtinumo ribos, kurios gali skirtis skirtingose serijose.

3.1.2. Įprastinės įteisinimo procedūros

Skaičiuojant parametrus įprastiniais metodais, reikia atlikti keletą atskirų eksperimentų. Reikia nustatyti kiekvieno žymaus pokyčio kiekvieną tinkamumo požymį (žr. 1.3.3.1 punktą). Daugiaanalitiniais metodais vienu metu galima analizuoti keletą analičių, jei prieš tai panaikinta potencialių trukdžių galimybė. Panašiu būdu galima nustatyti keletą tinkamumo savybių. Siekiant sumažinti darbo krūvį, patartina kuo labiau sujungti eksperimentus (pvz., pakartojamumo ir atkuriamumo vienoje laboratorijoje su specifiškumo, tuščiųjų mėginių analizės sprendimo ribai nustatyti ir specifiškumo tyrimo).

3.1.2.1. Išgavos nustatymas

Jei nėra PPM, išgava turi būti nustatyta eksperimentais, naudojant papildytą tuščiąją matricą: pasirenkami 18 tuščiosios medžiagos alikvočių, o šešios alikvotės papildomos iki koncentracijos, 1, 1,5 ir 2 kartus didesnės už mažiausią privalomą aptikti koncentraciją arba 0,5, 1 ir 1,5 karto didesnės už ribinį leistiną kiekį;

mėginiai išanalizuojami ir apskaičiuojama kiekviename mėginyje esanti koncentracija;

pagal toliau pateiktą lygtį kiekvienam mėginiui apskaičiuojama išgava;

atitinkamai pagal kiekvieno lygio šešis rezultatus apskaičiuojamas išgavos vidurkis ir CV;

išgava, % = 100 x išmatuotas kiekis/papildytas lygis.

Šis įprastinis išgavos nustatymo metodas yra 3.5 punkte aprašyto etaloninės priemaišos metodo variantas, kai:

mėginys laikomas ne analizuojamuoju, o tuščiuoju mėginiu;

abiejų tiriamųjų dalių išeiga^{^[2]} ir išgava^{^[3]} laikomos esančiomis panašaus dydžio;

mėginių masė yra vienoda, todėl ir tiriamųjų dalių ekstraktai yra vienodo tūrio;

į antrą tiriamąją dalį (papildytą) pridėto kalibracinio etalono kiekis pažymimas x_ADD. (x_ADD = ρ_AV_A);

x₁ yra išmatuota tuščiojo mėginio vertė, o x₂ – antros tiriamosios dalies (papildytos) vertė;

tuomet: išgava, % = 100 _{(x1 – x2)}/x_ADD.

Jei kurios nors iš pirmiau nurodytų sąlygų yra neįmanoma patenkinti, tuomet reikia atlikti visą 3.5 punkte aprašytą išgavos nustatymo, taikant etaloninės priemaišos metodą, procedūrą.

3.1.2.2. Pakartojamumo nustatymas:

paruošiamas komplektas vienodų matricų mėginių, papildytų analite iki koncentracijos, 1, 1,5 ir 2 kartus didesnės už mažiausią privalomą aptikti koncentraciją arba 0,5, 1 ir 1,5 karto didesnės už ribinį leistiną kiekį;

visų koncentracijų papildyti mėginiai analizuojami ne mažiau kaip šešis kartus (šešios kartotinės analizės);

išanalizuojami mėginiai;

apskaičiuojama kiekviename mėginyje esanti koncentracija;

apskaičiuojamas papildytų mėginių koncentracijos vidurkis, standartinis nuokrypis ir nuokrypio koeficientas (%);

ši procedūra pakartojama mažiausiai du kartus;

apskaičiuojamas papildytų mėginių bendrasis koncentracijų vidurkis ir CV.

3.1.2.3. Atkuriamumo vienoje laboratorijoje nustatymas:

paruošiamas komplektas nurodytos tiriamosios medžiagos (vienodų arba skirtingų) matricų mėginių, papildytų analite iki koncentracijos, 1, 1,5 ir 2 kartus didesnės už mažiausią privalomą aptikti koncentraciją arba 0,5, 1 ir 1,5 karto didesnę už ribinį leistiną kiekį;

visų koncentracijų papildyti mėginiai analizuojami ne mažiau kaip šešis kartus (šešios kartotinės analizės);

ši procedūra pakartojama mažiausiai du kartus, jei įmanoma, dirbant skirtingiems tyrėjams ir skirtingomis aplinkos sąlygomis, pvz., skirtingos reagentų, tirpiklių partijos ir pan., skirtingoje patalpos temperatūroje, su skirtingais prietaisais ir pan.;

išanalizuojami mėginiai;

apskaičiuojama kiekviename mėginyje esanti koncentracija;

nustatomas papildytų mėginių koncentracijų vidurkis, standartinis nuokrypis ir nuokrypio koeficientas (%).

3.1.2.4. Atkuriamumo nustatymas

Kai tikrinamas atkuriamumas, laboratorijos turi dalyvauti jungtiniame tyrime pagal ISO 5725-2 [5.5].

3.1.2.5. Sprendimo ribos (CCα) nustatymas

Sprendimo riba turi būti nustatoma pagal identifikacijos arba identifikacijos bei kiekio nustatymo reikalavimus taip, kaip nurodyta 2 punkte „Analizės metodų tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai“.

Jei medžiagos ribinis leistinas kiekis nenustatytas, CCα galima nustatyti:

taikant kalibracinės kreivės procedūrą pagal ISO 11843 [5.17] (čia vadinama galutinio būvio ribine verte). Naudojama tuščioji medžiaga, kuri tolygiais žingsniais papildoma iki ir virš mažiausiojo privalomo aptikti kiekio koncentracijos. Mėginiai išanalizuojami. Po identifikavimo nubraižoma signalo funkcijos priklausomybės nuo koncentracijos kreivė. Sprendimo riba yra koncentracija ties sankirta su y ašimi plius 2,33 karto padaugintas atkuriamumo vienoje laboratorijoje standartinis nuokrypis ties sankirta. Tai galioja tik kiekybinei analizei (α = 1 %);

analizuojant ne mažiau kaip po 20 tuščių medžiagų vienoje matricoje, siekiant apskaičiuoti signalo ir fono santykį tuo laiko tarpu, kuriuo tikimasi analitės pasirodymo. Sprendimo riba gali būti triguba signalo ir fono santykio vertė. Tai galioja kiekybinei ir kokybinei analizei.

Jei medžiagoms ribinis leistinas kiekis nustatytas, CCα galima nustatyti:

taikant kalibracinės kreivės procedūrą pagal ISO 11843 [5.1] (čia vadinama galutinio būvio ribine verte). Naudojama tuščioji medžiaga, kuri tolygiais žingsniais papildoma iki ribinio leistino kiekio. Mėginiai išanalizuojami. Po identifikavimo nubraižoma signalo funkcijos priklausomybės nuo koncentracijos kreivė. Sprendimo riba yra koncentracija ties ribiniu leistinu kiekiu plius 1,64 karto padidintas atkuriamumo vienoje laboratorijoje standartinis nuokrypis (α = 5 %);

analizuojant ne mažiau kaip po 20 tuščių medžiagų vienoje matricoje, papildytoje analite (ar analitėmis) iki ribinio leistino kiekio. Sprendimo riba yra koncentracija ties ribiniu leistinu kiekiu plius 1,64 karto padidintas atitinkamas standartinis nuokrypis (α = 5 %).

Taip pat žr. Bendrųjų nuostatų 4 punktą ir šio priedo 3.2 punktą.

3.1.2.6. Aptikimo gebos (CCβ) nustatymas

Aptikimo geba turi būti nustatyta pagal apibrėžtus atrankos, identifikacijos arba identifikacijos bei kiekio nustatymo reikalavimus (žr. 2 punktą).

Jei medžiagoms ribinis leistinas kiekis nenustatytas, CCβ galima nustatyti:

taikant kalibracinės kreivės procedūrą pagal ISO 11843 [5.17] (čia vadinama galutinio būvio ribine verte). Naudojama tuščioji medžiaga, kuri tolygiais žingsniais papildoma iki ir žemiau mažiausiojo privalomo aptikti kiekio. Mėginiai išanalizuojami. Identifikavus nubraižoma signalo funkcijos priklausomybės nuo koncentracijos kreivė. Aptikimo geba yra koncentracija ties sprendimo riba plius 1,64 karto padidintas išmatuoto kiekio vidurkio atkuriamumo vienoje laboratorijoje standartinis nuokrypis ties sprendimo riba (β = 5 %);

analizuojant ne mažiau kaip po 20 tuščių medžiagų vienoje matricoje, papildytoje analite (ar analitėmis) iki sprendimo ribos koncentracijos. Aptikimo geba yra sprendimo riba plius 1,64 karto padidintas išmatuoto kiekio vidurkio atkuriamumo vienoje laboratorijoje standartinis nuokrypis ties sprendimo riba (β = 5 %);

kai kiekybinių rezultatų nėra, aptikimo ribą galima nustatyti tiriant tuščiąją medžiagą, papildytą iki ir virš sprendimo ribos koncentracijos. Tokiu atveju metodo aptikimo geba yra koncentracijos lygis, kuriame lieka tik nedaugiau kaip 5 % neteisingų sprendimų dėl neigiamo rezultato. Siekiant patikimo nustatymo, reikia atlikti ne mažiau kaip 20 tyrimų ties bent vienu koncentracijos lygiu;

taikant kalibracinės kreivės procedūrą pagal ISO 11843 [5.17] (čia vadinama galutinio būvio ribine verte). Naudojama tuščioji medžiaga, kuri tolygiais žingsniais papildoma iki ribinio leistino kiekio. Mėginiai išanalizuojami ir identifikuojama analitė (ar analitės). Apskaičiuojamas išmatuoto kiekio vidurkio standartinis nuokrypis ties sprendimo riba. Aptikimo geba yra koncentracija ties sprendimo riba plius 1,64 karto padidintas atkuriamumo vienoje laboratorijoje standartinis nuokrypis (β = 5 %);

analizuojant ne mažiau kaip po 20 tuščių medžiagų vienoje matricoje, papildytoje analite (ar analitėmis) iki sprendimo ribos koncentracijos. Aptikimo riba yra sprendimo riba plius 1,64 karto padidintas atitinkamas standartinis nuokrypis (β = 5 %).

Taip pat žr. 3.2 punktą.

3.1.2.7. Atsparumas (žymūs pokyčiai)

Analizės metodas turi būti patikrintas įvairiomis eksperimentinėmis sąlygomis, pvz., su skirtingomis biologinėmis rūšimis, skirtingomis matricomis ar skirtingomis mėginių ėmimo sąlygomis. Pokyčiai turi būti žymūs. Šių pokyčių svarbą galima įvertinti, pvz., pritaikius Youdeno metodą [5.15, 5.16]. Reikia nustatyti visų žymių pokyčių, kurie smarkiai keičia analizės charakteristikas, tinkamumo požymius.

3.1.3. Įteisinimas alternatyviais būdais

Kai vykdomos alternatyvios vertinimo procedūros, jų būdas, strategija, išankstinės sąlygos, prielaidos ir formulės surašomos vertinimo protokole arba bent pateikiamos nuorodos, kur visa tai yra pateikta. Toliau pateikiamas alternatyvaus metodo pavyzdys. Taikant, pvz., pačių vertinimo metodą, tinkamumo požymiai nustatomi tokiu būdu, kad taikant tą pačią vertinimo procedūrą galima būtų įvertinti žymius pokyčius. Tam reikia sudaryti eksperimentinį vertinimo planą.

3.1.3.1. Eksperimentinis planas

Eksperimentinis planas turi būti sudarytas atsižvelgiant į skirtingų biologinių rūšių skaičių ir įvairius tiriamus veiksnius. Pirmuoju visos vertinimo procedūros žingsniu įvertinama tų mėginių, kurie ateityje bus analizuojami laboratorijoje, įvairovė, kad būtų pasirinktos svarbiausios biologinės rūšys ir veiksniai, kurie gali turėti įtakos matavimų rezultatams. Todėl pagal tikslą, atsižvelgus į dominantį lygį, pasirenkama koncentracijos sritis.

Pavyzdys:

vertinant analizės metodą galima kartu tyrinėti keletą analičių;

identifikuojamos dvi pagrindinių veiksnių variacijos (A ir B). Pagrindiniai veiksniai sudaro veiksnių lygių derinimo pamatą. Tokie pagrindiniai veiksniai gali būti biologinės rūšys ar matrica (13 lentelė). Šiame pavyzdyje pagrindinis veiksnys buvo varijuotas dviem lygiais, t. y. buvo nagrinėtos dvi skirtingos biologinės rūšys (A ir B rūšys). Paprastai įmanoma varijuoti pagrindinius veiksnius daugiau kaip dviem lygiais, tačiau reikia atlikti daugiau analizių;

pasirinkti veiksniai varijuojami dviem lygiais (pažymėtais + arba -) (14 lentelė).

Kiekvieną mėginį (kiekvieno veiksnio lygio derinį) reikia papildyti iki keturių skirtingų koncentracijų ties dominančiu lygiu, o kiekvienam lygiui analizuojamas vienas tuščiasis mėginys; visame įteisinimo eksperimente atliekama 5 x 16 = 80 analizių.

13 lentelė. Vertinimo procedūrai svarbiais laikomų veiksnių pavyzdžiai

Gyvūno lytis	(1 veiksnys)
Veislė	(2 veiksnys)
Vežimo sąlygos	(3 veiksnys)
Laikymo sąlygos	(4 veiksnys)
Mėginio šviežumas	(5 veiksnys)
Šėrimo sąlygos	(6 veiksnys)
Skirtingi laborantai, turintys nevienodą patirtį	(7 veiksnys)

14 lentelė. Galimas pateikto pavyzdžio eksperimentinis planas

Rūšis	1 veiksnys	2 veiksnys	3 veiksnys	4 veiksnys	5 veiksnys	6 veiksnys	7 veiksnys	Mėginio Nr.
A	+	+	+	+	-	+	-	1

A	+	+	-	-	+	-	-	2

A	+	-	+	-	-	-	+	3

Iš šių 80 matavimų [5.13, 5.14] galima apskaičiuoti:

pakartojamumą ties koncentracijos lygiu (s_ir);

atkuriamumą vienoje laboratorijoje ties koncentracijos lygiu (s_ir);

sprendimo ribą (CCα);

aptikimo gebą (CCβ);

pajėgumo kreivę (b paklaidos rodiklio priklausomybę nuo koncentracijos (žr. 3.1.3.2 punktą);

atsparumą žymiems pokyčiams; atsparumą nežymiems pokyčiams galima nustatyti, kaip nurodyta

3.1.1.3 punkte;

16 su mėginiais susijusių kalibracinių kreivių;

vieną bendrąją kalibracinę kreivę;

bendrosios kalibracinės kreivės prognozės intervalą;

matricos sukeltus nuokrypius(s_mat);

procedūros sukeltus nuokrypius (s_prot);

atskirų veiksnių poveikį matavimo rezultatams. Pagal šiuos tinkamumo požymius galima išsamiai įvertinti metodo tinkamumo lygį, kadangi ištiriama ne tik atskirų veiksnių įtaka, bet ir galimi jų deriniai. Pagal šią eksperimento sistemą galima nuspręsti, ar išbraukti vieną ar kitą pasirinktą veiksnį iš bendrosios kalibracinės kreivės, jei jie žymiai skiriasi nuo kitų veiksnių nuokrypių.

3.1.3.2. Pajėgumo kreivė

Pajėgumo kreivė suteikia informacijos apie metodo aptikimo gebą pasirinktoje koncentracijos srityje. Ji paremta β paklaidos rizika taikant ištirtąjį metodą. Pagal pajėgumo kreivę galima apskaičiuoti metodų kategorijų (atrankos, patvirtinimo) ar tipų (kokybinio ar kiekybinio) aptikimo gebą su tam tikra b paklaida (pvz., 5 %).

1 paveiksle pavaizduotas analizės metodo aptikimo gebos (CCb) grafikas. Taikant šį metodą, kai koncentracija yra 0,50 µg/kg, išlieka 5 % rizika, kad bus priimtas neteisingas sprendimas. Kai koncentracija yra 0,55 µg/kg, rizika, kad bus priimtas neteisingas sprendimas dėl neigiamo rezultato, sumažėja iki 1 %.

3.1.3.3. Atkuriamumas

Metodo atkuriamumo nustatymo vienos laboratorijos tyrimais (pačių pripažinimo) koncepcija reikalauja, kad būtų dalyvaujama daugkartiniuose kvalifikacijos tyrimuose pagal ISO vadovą 43-1 [5.3] ir 43-2 [5.4]. Laboratorijoms leidžiama pasirinkti savus metodus, jei jie taikomi įprastomis sąlygomis. Metodo atkuriamumui įvertinti galima naudoti standartinį laboratorijos nuokrypį.

3.2. Grafinis skirtingų analizės ribų vaizdavimas

2 pav. Medžiagoms, kurių ribinis leistinas kiekis nenustatytas: _S – Užteršto mėginio reakcijos vidutinė vertė, S_B – tuščiojo mėginio standartinis nuokrypis (nustatytas atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis), S_S – užteršto mėginio standartinis nuokrypis (nustatytas atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis), α – procentinė neteisingų sprendimų dėl teigiamo rezultato dalis, b – procentinė neteisingų sprendimų dėl neigiamo rezultato dalis, CCα – atsakas su nustatyta a paklaida ir 50 % β paklaida, CCβ – atsakas su labai mažomis a ir b paklaidomis.

3 pav. Medžiagoms, kurių nustatytas ribinis leistinas kiekis: _B – tuščiojo mėginio vidutinė „koncentracija“, _{PL –}mėginio, kuriame yra ribinis leistinas analitės kiekis, vidutinė koncentracija, _S – užteršto mėginio vidutinė koncentracija, S_PL – mėginio, kuriame yra ribinis leistinas analitės kiekis, standartinis nuokrypis (nustatytas atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis), S_S – mėginio, kuriame yra analitė, standartinis nuokrypis (nustatytas atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis), α – procentinė neteisingų sprendimų dėl teigiamo rezultato dalis, β – procentinė neteisingų sprendimų dėl neigiamo rezultato dalis, CCα – atsakas su nustatyta a paklaida ir 50 % b paklaida, CCβ – atsakas su labai maža a paklaida ir nustatyta β paklaida.

3.3. Atsparumo nežymiems pokyčiams tyrimo taikant Youden metodą [5.16] skaičiavimo pavyzdys

Vidurkių (A) palyginimas:

A_A = Σ (A_i)/4	Palyginkite didžiųjų raidžių vidurkius (nuo AA iki AG) su atitinkamų mažųjų raidžių vidurkiais (nuo Aa iki Ag). Jei veiksnys turi poveikį, skirtumas bus žymiai didesnis už kitų veiksnių skirtumus. Jei metodas patikimas, jam neturi turėti įtakos neišvengiamai esantys skirtumai tarp laboratorijų. Jei išskirtinių skirtumų nėra, atsitiktinės paklaidos matas realiausiai nurodomas septyniais skirtumais.
A_B = Σ (B_i)/4
A_C = Σ (C_i)/4
A_D= Σ (D_i)/4
A_E = Σ (E_i)/4
A_F = Σ (F_i)/4
A_G = Σ (G_i)/4
A_a = Σ (a_i)/4
A_b = Σ (b_i)/4
A_c = Σ (c_i)/4
A_d = Σ (d_i)/4
A_e = Σ (e_i)/4
A_f = Σ (f_i)/4
A_g = Σ (g_i)/4
Skirtumai (Di)	Skirtumų kvadratai
D_a = A – a = Σ (A_i) – Σ (a_i)	(Di-2)
D_b = B – b = Σ (B_i) – Σ (b_i)	D_a² = a vertė
D_c = C – c = Σ (C_i) – Σ (c_i)	D_b² = b vertė
D_d= D – d = Σ (D_i) – Σ (d_i)	D_c² = c vertė
D_e = E – e = Σ (E_i) – Σ (e_i)	D_d² = d vertė
D_f= F – f = Σ (F_i) – Σ (f_i)	D_e² = e vertė
D_g = G – g = Σ (G_i) – Σ (g_i)	D_f² = f vertė
	D_g² = g vertė

Skirtumų Di standartinis nuokrypis (S_Di):

Kai SDi yra žymiai didesnis už metodo, taikomo atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis, standartinį nuokrypį, iš anksto daroma išvada, kad visi veiksniai kartu turi poveikį rezultatui, net jei kiekvienas veiksnys atskirai žymios įtakos ir neturi, taip pat kad metodas nėra pakankamai atsparus pasirinktiems pokyčiams.

3.4. Pačių įteisinimo procedūros skaičiavimo pavyzdžiai

Pavyzdžiai ir pačių įteisinimo protokolui skirti skaičiavimai aprašyti 3.1.3 punkte „Įteisinimas alternatyviais būdais“ bei naudojant šaltinius [5.13, 5.14].

3.5. Etaloninės priemaišos metodo pavyzdžiai

Tiriamasis mėginys, kuriame yra T kiekis analitės, padalijamas į dvi tiriamąsias dalis: 1 ir 2, kurių masės atitinkamai yra m₁ ir m₂. Tiriamoji dalis 2 papildoma ρ_A koncentracijos analite, kurios tūris yra V_A. Ekstrahavus ir išgryninus gaunami du tiriamųjų dalių ekstraktai, kurių tūris yra atitinkamai V₁ ir V₂. Analitės išgava yra rc. Abu ekstraktai išanalizuojami taikant b jautrumo matavimo metodą, o jų analitinis atsakas yra atitinkamai x₁ ir x₂.

Daroma prielaida, kad analitės rc ir b yra vienodi tiek pradinio mėginio atveju, tiek ir papildyto mėginio atveju; tuomet kiekis T apskaičiuojamas taip:

T = x₁. V₁. ρ_A. V_A/(x₂. V₂. m₁ – x₁. V₁. m₂)

Taikant šį metodą, galima nustatyti išgavą rc. Atlikus pirmiau aprašytą analizę, 1 tiriamosios dalies ekstrakto dalis (tūris V₃) papildoma žinomu analitės kiekiu ρ_B. V_B ir išanalizuojama. Analitinis atsakas yra x₃, o išgava:

rc = x₂. V₁. V₂. ρ_B. V_B/[x₃. V₁. V₃(T. m₂ + ρ_A. V_A) – - x₂. V₂. T. m₁(V₃. V_B)]

Be to, galima apskaičiuoti jautrumą b:

b = x₁. V₁/rc. T. m₁

Visos taikymo sąlygos ir informacija aprašyta [5.18].

IV. Santrumpos

4. Šioje metodikoje vartojamos tokios raidinės santrumpos:

AES atominė emisinė spektrometrija;

AOAC tarptautinė oficialių chemikų analitikų asociacija;

AAS atominė absorbcinė spektrometrija;

B susijusi frakcija (imuninė analizė);

CJ cheminė jonizacija;

DCh dujų chromatografija;

DDM detektavimas diodų matrica;

DEP detektavimas elektronų pagava;

DIAPV Diferencialinio impulso anodinė pašalinamoji voltamperometrija;

DSGMS didelės skiriamosios gebos masių spektrometrija;

EPSCh efektyvioji plonasluoksnė chromatografija;

ESCh efektyvioji skysčių chromatografija;

EJ elektroninė smūgio jonizacija;

IR infraraudonoji spinduliuotė;

ISO tarptautinė standartizacijos organizacija;

ISP-AES indukciškai sujungtos plazmos atominė emisinė spektrometrija;

ISP-MS indukciškai sujungtos plazmos masių spektrometrija; m/z masės ir krūvio santykis;

MPAK mažiausiasis privalomas aptikti kiekis;

MS masių spektrometrija;

MSGMS mažos skiriamosios gebos masių spektrometrija;

VIS regimoji spinduliuotė;

PJS pasirinktų jonų stebėsena;

CV nuokrypio koeficientas;

PPM paliudytoji pamatinė medžiaga;

PSCh plonasluoksnė chromatografija;

SCh skysčių chromatografija;

SELN santykinis etaloninis laboratorijos nuokrypis;

SM santykinė migracija link tirpiklio (PSCh);

UV ultravioletinė spinduliuotė.

V. Literatūra

5. Literatūra naudojama pašarų tyrimo cheminės analizės metodų įteisinimo metodikai parengti:

5.1. ISO 17025: 1999 General requirement for the competence of calibration and testing laboratories.

5.2. ISO 3534-1: 1993 Statistical Methods for quality control – Vol. 1 vocabulary and symbols.

5.3. ISO Guide 43-1: 1997 Proficiency testing by interlaboratory comparisons – Part 1: Development and operation of proficiency testing schemes.

5.4. ISO Guide 43-2: 1997 Proficiency testing by interlaboratory comparisons – Part 2: Selection and use of proficiency testing schemes by laboratory accreditation bodies.

5.5. ISO 5725: 1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 1: General principles, and definitions; ISO 5725-2 Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method; Part 4: Basic methods for the determination of the trueness of a standard measurement method.

5.6. ISO 78-2: 1999 Chemistry – Layouts for standards – Part 2: Methods of chemical analysis.

5.7. W. G de Ruig and J. M Weseman „A new approach to confirmation by infrared spectrometry“ J. Chemometrics 4 (1990) 61-77.

5.8. See e. g. May, T. W., Brumbaugh, W. G., 1982, Matrix modifier and L'vov platform for elimination of matrix interferences in the analysis of fish tissues for lead by graphite furnace atomic absorption spectrometry: Analytical Chemistry 54(7): 1032-1037 (90353).

5.9. Applications of Zeeman Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry in the Chemical Laboratory and in Toxicology, C Minoia, S. Caroli (Eds.), Pergamon Press (Oxford), 1992, pp. xxvi + 675.

5.10. Inductively Coupled Plasmas in Analytical Atomic Spectrometry, A. Montaser, D.'W. Golighty (Eds.), VCH Publishers, Inc. (New York), 1992.

5.11. Plasma Source Mass Spectrometry Developments and Applications, G. Holland, S. D. Tanner (Eds.), The Royal Society of Chemistry, 1997, p. 329.

5.12. IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331.

5.13. Julicher, B., Gowik, P. and Uhlig, S. (1998) Assessment of detection methods in trace analysis by means of a statistically based in-house validation concept. Analyst, 120, 173.

5.14. Gowik, P., Julicher, B. and Uhlig, S. (1998) Multi- residue method for non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance liquid chromatography-photodiode- array detection. Method description and comprehensive in-house validation, j. Chromatogr., 716, 221.

5.15. AOAC-I Peer Verified Methods, Policies and Procedures, 1993, AOAC International, 2200 Wilson Blvd., Suite 400, Arlington, Virginia 22201-3301, USA.

5.16. W. J. Youden; Steiner, E. H.; „Statistical Manual of the AOAC-Association of Official Analytical Chemists“, AOAC-I, Washington DC: 1975, p. 35 ff.

5.17. ISO 11843: 1997 Capability of detection – Part 1: Terms and definitions, Part 2: Methodology in the linear calibration case Part 2: Methodology in the linear calibration case.

5.18. R. W. Stephany and L. A. van Ginkel: „Yield or recovery: a world of difference“. Proceedings Eight Euro Food Chem, Viena, Austria, September 18-20 (1995) Federation of European Chemical Societies, Event 206. ISBN 3-900554-17X, p. 2-9.

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos žemės ūkio minstro

2004 m. gruodžio 17 d. įsakymu Nr. 3D-667

TETRA-, PENTA-, HEKSA-, HEPTA-, OKTA-CHLORDIBENZO-P-DIOKSINŲ IR TETRA-, PENTA-, HEKSA-, HEPTA-, OKTA-DIBENZOFURANŲ KIEKIŲ PAŠARUOSE NUSTATYMO IZOTOPŲ SKIEDIMO METODU TECHNINIS REGLAMENTAS

Parengtas pagal Dioksinų, furanų ir PCB kiekių pašaruose nustatymo techninį reglamentą, patvirtintą Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2003 m. gegužės 29 d. įsakymu Nr. 3D-218 (Žin., 2003, Nr. 55-2471), bei atsižvelgiant į 2002 m. liepos 26 d. Europos Komisijos direktyvos 2002/70/EB dėl Bendrijos cheminės analizės metodų, kuriuos valstybės institucijos taiko dioksinų, furanų ir į dioksinus panašių PCB kiekiams nustatyti pašaruose, reikalavimus.

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Tetra-, penta- heksa-, hepta- okta-chlordibenzo-p-dioksinų ir tetra-, penta- heksa-, hepta- okta- dibenzofuranų kiekių pašaruose nustatymo izotopų skiedimo metodu techninis reglamentas (toliau – techninis reglamentas) nustato tetra-, penta- heksa-, hepta- okta-chlordibenzo-p-dioksinų ir tetra-, penta- heksa-, hepta- okta- dibenzofuranų kiekių pašaruose cheminės analizės metodą (toliau – metodas).

2. Jei pašarų analitei nustatyti taikomi du ar daugiau metodų, taikomą metodą, jei nenurodyta kitaip, pasirenka cheminę analizę atliekanti laboratorija, tačiau šis metodas turi būti nurodomas analizės sertifikate.

3. Šio techninio reglamento reikalavimų privalo laikytis visi pašarus gaminantys, laikantys, gabenantys, naudojantys, tarpininkaujantys juos parduodant ir jais prekiaujantys ūkio subjektai ir pašarų kokybės valstybinė kontrolės institucija.

4. Šio techninio reglamento reikalavimai netaikomi pašarams:

4.1. skirtiems eksportuoti į trečiąsias šalis;

4.2. gabenamiems uždarose transporto priemonėse arba uždarose pakuotėse tranzitu per Lietuvos Respublikos teritoriją.

II. SĄVOKOS IR SUTRUMPINIMAI

5. Šiame techniniame reglamente vartojamos sąvokos:

Aptikimo riba – kokybiškai nustatomo komponento mažiausias kiekis arba koncentracija, dar duodantys analizinį signalą;

Glaudumas – nepriklausomų bandymų rezultatų, gautų nurodytomis sąlygomis, tarpusavio atitikimo artumas (LST ISO 78-2:2001);

Išgava – tikrosios medžiagos koncentracijos procentinė dalis, aptikta atliekant analizės procedūrą;

Nustatymo riba – kiekybinės analizės metodu ieškomo komponento mažiausias kiekis arba koncentracija, dar duodantys išmatuojamą signalą;

Tuščiasis mėginys – mėginys be analitės ir be kitų medžiagų, duodančių panašų į analitės analizinį signalą.

6. Metodo aprašymuose vartojami cheminių junginių trivialieji pavadinimai ir juos atitinkantys IUPAC terminai:

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD – 1,2,3,4,6,7,8-heptachlordibenzo-p-dioksinas, C₁₂HCl₇O₂;

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF – 1,2,3,4,6,7,8-heptachlordibenzofuranas, C₁₂HCl₇O;

1,2,3,4,7,8,9-HpCDF – 1,2,3,4,7,8,9-heptachlordibenzofuranas, C₁₂HCl₇O;

1,2,3,4,7,8-HxCDD – 1,2,3,4,7,8-heksachlordibenzo-p-dioksinas, C₁₂H₂Cl₆O₂;

1,2,3,4,7,8-HxCDF – 1,2,3,4,7,8-heksachlordibenzofuranas, C₁₂H₂Cl₆O;

1,2,3,6,7,8-HxCDD – 1,2,3,6,7,8-hehsachlordibenzo-p-dioksinas, C₁₂H₂Cl₆O₂;

1,2,3,6,7,8-HxCDF – 1,2,3,6,7,8-hehsachlordibenzofuranas, C₁₂H₂Cl₆O;

1,2,3,7,8-PeCDD – 1,2,3,7,8-pentachlordibenzo-p-dioksinas, C₁₂H₃Cl₅O₂;

1,2,3,7,8-PeCDF – 1,2,3,7,8-pentachlordibenzofuranas, C₁₂H₃Cl₅O;

2,3,4,6,7,8-HxCDF – 2,3,4,6,7,8-heksachlordibenzofuranas, C₁₂H₂Cl₆O;

2,3,4,7,8-PeCDF – 2,3,4,7,8-pentachlordibenzofuranas, C₁₂H₃Cl₅O;

2,3,7,8-TCDD – 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioksinas, C₁₂H₄Cl₄O₂;

2,3,7,8-TCDF – 2,3,7,8-tetrachlordibenzofuranas, C₁₂H₄Cl₄O;

acetonas – propanonas, CH₃COCH₃;

aliuminio oksidas – dialiuminio trioksidas, Al₂O₃;

bis(2-etilheksil)ftalatas – dioktilftalatas, C₆H₄-1,2-[CO₂CH₂CH(C₂H₅)(CH₂)₃CH₃]₂;

cikloheksanas – C₆H₁₂;

dekachlordifenilo eteris – C₁₂Cl₁₀O;

difenilo eteris – C₁₂H₁₀O;

dioksinas -2,3,7,8,-tetrachlordibenz[b, e]-1,4-dioksinas, Cl₂C₆H₂:(O)₂:C₆H₂Cl₂;

druskos rūgštis – vandenilio chloridas, HCl;

florisilis – aktyvuotas magnio silikatas, magnio trioksosilikatas, MgSiO₃;

furanas – C₄H₄O;

heksachlordifenilo eteris – C₁₂Cl₆H₄O;

heksanas – CH₃(CH₂)₄CH₃;

heptachlordifenilo eteris – C₁₂Cl₇H₃O;

kalio hidroksidas – KOH;

kalio silikatas – dikalio trioksosilikatas, K₂SiO₃;

metanolis – CH₃OH;

metileno chloridas – dichlormetanas, CH₂Cl₂;

natrio chloridas – NaCl;

natrio sulfatas – dinatrio tetraoksosulfatas, Na₂SO₄;

natrio tiosulfatas – dinatrio triokstiosulfatas, Na₂S₂O₃;

nonachlordifenilo eteris – C₁₂Cl₉HO;

nonanas – CH₃(CH₂)₇CH₃;

oktachlordibenzo-p-dioksinas – C₁₂Cl₈O₂;

oktachlordibenzofuranas – C₁₂Cl₈O;

oktachlordifenilo eteris – C₁₂Cl₈H₂O;

pentachlornaftalenas – C₁₀H₃Cl₅;

perfluorokerosenas – perfluorangliavanenilių mišinys, verdantis 150°C – 300°C temperatūroje;

perilenas – dibenz[de, kl]antracenas, C₂₀H₁₂;

sieros rūgštis – divandenilio tetraoksosulfatas, H₂SO₄;

toluenas – C₆H₅CH₃;

7. Metodo aprašymuose vartojamos santrumpos:

1,2,3,7,8,9-HxCDD – 1,2,3,7,8,9-heksachlorodibenzo-p-dioksinas;

2,3,7,8-TCDD – 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioksinas;

2,3,7,8-TCDF – 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzofuranas;

AAV – aplinkos apsaugos valdyba, JAV (ang. EPA);

AJP – jono srovės profilis; tikrojo m/z signalo aprašoma linija;

CDD – tetra-, penta-, heksa-, hepta- ir okta-chlorodibenzo-p-dioksinai;

CDF – tetra-, penta-, heksa-, hepta- ir okta-chlorodibenzofuranai;

DCh – dujų chromatografija, dujų chromatografas;

DCh/MS – dujų chromatografija su masių spektrometrija;

DSGDCh/DSGMS – didelės skiriamosios gebos dujų chromatografijos metodai derinyje su didelės skiriamosios gebos masių spektrometrija;

DSGMS – didelės skiriamosios gebos masių spektrometrija, didelės skiriamosios gebos masių spektrometrija;

Ech – Efektyvioji skysčių chromatografija;

GI – glaudumas ir išgava;

GKT – gelfiltracijos kalibravimo tirpalas;

K-D – Kuderna-Danish koncentratorius;

KFE – kietafazis ekstrahavimas;

KK – kokybės kontrolė;

KKM – kokybės kontrolės mėginys;

KPS – kalibravimo patikrinimo standartas;

KS1 – KS5 – penki kalibraciniai standartai;

m/m – procentinis masių santykis;

m/z – masės ir krūvio santykis;

MDL – metodo aptikimo riba;

ML – minimalus lygis;

MS – masių spektrometrija, masių spektrometras;

NR – nustatymo riba;

OCDF – oktachlorodibenzofuranas;

PCDF – polichlordibenzofuranai;

PFK – fluorintų angliavandeilių mišinys;

PGI – pradinis glaudumas ir išgava;

SA – santykinis atsakas;

SDS – Soxhlet/Dean-Stark ekstrahavimo įrenginys;

TCDD – tetrachlorodibenzo-p-dioksinas;

TGI – tarpinis glaudumas ir išgava;

v/v – procentinis tūrių santykis.

III. MĖGINIŲ PARUOŠIMAS CHEMINEI ANALIZEI

8. Pašarų mėginiai šio techninio reglamento tetra-, penta-, heksa-, hepta-, okta-chlordibenzo-p-dioksinams ir tetra-, penta-, heksa-, hepta-, okta-dibenzofuranams nustatyti imami ir ruošiami taikant Dioksinų, furanų ir PCB kiekių pašaruose nustatymo techniniame reglamente aprašytas procedūras bei šio techninio reglamento nuostatas.

IV. MĖGINIŲ CHEMINĖ ANALIZĖ

9. Tetra-, penta-, heksa-, hepta-, okta-chlordibenzo-p-dioksinų ir tetra-, penta-, heksa-, hepta-, okta-dibenzofuranų kiekiams pašaruose nustatyti taikomas priede nurodytas metodas.

______________

Tetra-, penta-, heksa-, hepta-, okta-

chlordibenzo-p-dioksinų ir tetra-, penta-,

heksa-, hepta-, okta-dibenzofuranų kiekių

pašaruose nustatymo izotopų skiedimo metodo

techninio reglamento priedas

TETRA-, PENTA-, HEKSA-, HEPTA-, OKTA-CHLORDIBENZO-P-DIOKSINŲ IR TETRA-, PENTA-, HEKSA-, HEPTA-, OKTA-DIBENZOFURANŲ KIEKIŲ PAŠARUOSE NUSTATYMAS IZOTOPŲ SKIEDIMO METODU

1. Tikslas ir taikymo sritis:

1.1. Šiuo metodu nustatomas tetra-, penta-, heksa-, hepta- ir okta-chlorintų dibenzo-p-dioksinų (CDD) ir dibenzofuranų (CDF) kiekis vandenyje, dirvožemyje, nuosėdose, dumble, audiniuose ir kitokios matricos mėginiuose naudojant didelės skiriamosios gebos dujų chromatografiją su didelės skiriamosios gebos masių spektrometrija (DSGDCh/DSGMS). Metodas parengtas pagal Aplinkos apsaugos valdybos (JAV), pramoninių ir komercinių laboratorijų bei akademinius metodus [22.1 – 22.6];

1.2. Šiuo metodu nustatoma septyniolika CDD/CDF darinių su pakaitalais 2,3,7 ir 8 padėtyse, išvardytų 1 lentelėje. Taip pat yra detalizuotos 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioksino (2,3,7,8-TCDD) ir 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzofurano (2,3,7,8-TCDF) nustatymo sąlygos;

1.3. Radimo ir nustatymo ribos šiame metode paprastai priklauso labiau nuo trukdžių lygio nei nuo instrumento galimybių. Mažiausios CDD/CDF junginių nustatymo ribos (NR) pasiekiamos nesant trukdžių (2 lentelė). 2,3,7,8-TCDD junginio radimo riba yra 4,4 x 10^-12 g/l;

1.4. Šio metodo chromatografijos procedūras gali atlikti tyrėjai, turintys darbo patirtį su DSGDCh/DSGMS arba dirbantys tokią kvalifikaciją turinčių asmenų priežiūroje. Kiekviena laboratorija, taikanti šį metodą, privalo įrodyti, kad yra pajėgi gauti priimtinus rezultatus pagal 9.2 punkte nurodytą procedūrą;

1.5. Šis metodas pagrįstas tinkamumu. Siekiant pašalinti trukdžius ar sumažinti nustatymo kainą, tyrėjui leidžiama modifikuoti metodą su sąlyga, kad yra tenkinami visi šio metodo tinkamumo kriterijai. Modifikuoto metodo atitikties reikalavimai pateikti 9.1.2 punkte;

1.6. Bet koks šio metodo pakeitimas, išskyrus aiškiai leidžiamą, privalo būti įvertintas atliekant papildomas pagrindinio modifikuojamo objekto taikymo ir patvirtinimo išbandymo procedūras, nurodytas Federalinio statuto kodekso 40 dokumente, 136.4 ir 136.5 dalyse (JAV, 40 CFR (Code Federal Regulation) part 136.4 and 136.5).

2. Metodo santrauka: Mėginių paruošimo, ekstrahavimo ir analizės procedūrų schemos yra pateiktos 1 (vandens ir kietiems mėginiams), 2 (daugiafaziams mėginiams) ir 3 (audiniams) paveiksluose.

2.1. Ekstrahavimas:

2.1.1. Vandens mėginiai (mėginiai su mažiau nei 1 % netirpių medžiagų). Vienas litras mėginio yra papildomas 15 stabiliais izotopais žymėtų CDD/CDF darinių analogų su pakaitalais 2,3,7,8- padėtyse. Mėginiai ekstrahuojami naudojant vieną iš procedūrų:

2.1.1.1. mėginiai be matomų dalelių ekstrahuojami metileno chloridu dalomajame piltuve arba taikant kietafazio ekstrahavimo metodą, apibūdintą 2.1.1.3 punkte (4 paveikslas). Siekiant išgryninti ekstraktą, jis koncentruojamas;

2.1.1.2. mėginiai, turintys matomų dalelių, filtruojami vakuume per stiklo pluošto filtrą. Filtras ekstrahuojamas Soxhlet/Dean-Stark (SDS) ekstrahavimo įrenginyje (5 paveikslas) [22.7]. Filtratas ekstrahuojamas metileno chloridu dalomajame piltuve. Prieš valymą metileno chlorido ekstraktas koncentruojamas ir sujungiamas su SDS ekstraktu;

2.1.1.3. naudojant vakuumą, mėginys filtruojamas per stiklo pluošto filtrą, uždėtą ant kietafazio ekstrahavimo (KFE) plokštelės. Filtras ir plokštelė yra ekstrahuojami SDS ekstrahavimo įrenginyje. Siekiant išgryninti ekstraktą, jis koncentruojamas;

2.1.2. Kieti, pusiau kieti ir daugiafaziai mėginiai (išskyrus audinius). 10 g kietų medžiagų (svoris išdžiovinus) turintis mėginys papildomas žymėtaisiais junginiais. Daugiafaziai mėginiai filtruojami esant padidintam slėgimui, vandeninis skystis išpilamas. Rupios kietos medžiagos malamos arba homogenizuojamos. Daugiafazių mėginių nevandeninis skystis yra sujungiamas su kietomis medžiagomis ir ekstrahuojamas SDS ekstrahavimo įrenginyje. Siekiant išgryninti ekstraktą, jis koncentruojamas;

2.1.3. Gyvūnų ir augalų audiniai. Mėginys ekstrahuojamas naudojant vieną iš procedūrų:

2.1.3.1. Soxhlet arba SDS ekstrahavimas:

20 g mėginio homogenizuojama. 10 g homogenizuoto mėginio papildoma žymėtaisiais junginiais. Mėginys sumaišomas su natrio sulfatu, paliekamas džiūti 12 val.-24 val., ekstrahuojama 18 val.-24 val. metileno chlorido ir heksano (1:1) mišiniu Soxhlet ekstrahavimo įrenginyje. Ekstraktas išgarinamas iki sausos liekanos, nustatomas riebalų kiekis;

2.1.3.2. hidrolizė su HCl:

20 g mėginio homogenizuojama. 10 g homogenizuoto mėginio patalpinama į butelį ir papildoma žymėtaisiais junginiais. Paliekama nusistovėti. Užpilama 200 ml HCl, 200 ml metileno chlorido ir heksano (1:1) mišinio. Butelis purtomas 12 val.-24 val. Ekstraktas išgarinamas iki sausos liekanos, nustatomas riebalų kiekis;

2.2. Po ekstrakcijos, siekiant išmatuoti valymo efektyvumą, į kiekvieną ekstraktą pridedama ³⁷Cl₄ žymėtojo 2,3,7,8-TCDD. Mėginio valymui gali būti naudojamas grįžtamasis ekstrahavimas rūgštimi ir (ar) hidroksidu, gelchromatografija, kolonėlinė chromatografija naudojant aliuminio oksidą, silikagelį, Florisil ar aktyvuotą anglį. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESCh) gali būti taikoma tolesniam 2,3,7,8-izomerų, kitų specifinių izomerų ar giminingų junginių atskyrimui. Prieš ankščiau minėtas valymo procedūras, priklausomai nuo taikytos audinių ekstrahavimo procedūros, audinių ekstraktai valomi naudojant antropogeninę atskyrimo kolonėlę, adsorbciją silikageliu ar taikant grįžtamąjį ekstrahavimą sieros rūgštimi ir hidroksidu;

2.3. Po išvalymo ekstraktas koncentruojamas iki beveik sausos liekanos. Prieš pat įleidimą į kiekvieną ekstraktą įdedami vidiniai standartai. Dalis ekstrakto įleidžiama į dujų chromatografą. Analitės atskiriamos dujų chromatografijos pagalba ir nustatomos didelės skiriamosios gebos (≥10,000) masių spektrometrija. Kiekvienai analitei gaunamos dvi tikrosios m/z (masės ir krūvio santykis) vertės;

2.4. Individualūs CDD/CDF identifikuojami lyginant jų DCh sulaikymo trukmę ir dviejų tikrųjų m/z vertes su autentiško standarto sulaikymo trukme ir teorinėmis ar tikrosiomis dviejų m/z vertėmis. Izomerai be pakaitalų 2,3,7 ir 8 padėtyse ir giminingi junginiai yra identifikuoti, kai jų sulaikymo trukmės ir jonų masės ir krūvio santykiai atitinka iš anksto nustatytus parametrus. Specifiškumas 2,3,7,8-TCDD ir 2,3,7,8-TCDF izomerams pasiekiamas naudojant DCh kolonėles, kurios atskiria šiuos izomerus nuo kitų tetra-izomerų;

2.5. Kiekybinė analizė atliekama naudojant pasirinkto jono srovės kontūro plotus, vienu iš trijų būdų:

2.5.1. DCh/MS sistema penkiolikai CDD/CDF darinių su pakaitalais 2,3,7 ir 8 padėtyse ir žymėtiesiems analogams (1 lentelė) nustatyti kalibruojama ir kiekvieno junginio koncentracija nustatoma taikant skiedimo izotopais metodą;

2.5.2. DCh/MS sistema 1,2,3,7,8,9-HxCDD, OCDF ir žymėtiesiems junginiams nustatyti kalibruojama ir kiekvieno junginio koncentracija nustatoma taikant vidinio standarto metodą;

2.5.3. Visų izomerų su chloro pakaitalais 2,3,7 ir 8 padėtyse ir be pakaitalų šiose padėtyse (t. y. suminis TCDD kiekis) koncentracijos nustatomos taikant tokio paties chlorinimo lygio CDD/CDF kalibravimo parametrus;

2.6. Analizės kokybė garantuojama atliekant pakartotinį kalibravimą ir kontroliuojant ekstrahavimą, valymą bei pačią DCh/MS sistemą.

3. Apibrėžimai:

Analitė – šiuo metodu nustatomas CDD ar CDF. Analitės išvardytos 1 lentelėje;

GI standartas – glaudumo ir išgavos standartas; antrinis standartinis tirpalas, kurį skiedžiant ir papildant gaunami PGI ir TGI;

Kalibracinis standartas- tirpalas, paruoštas iš antrinio standarto bei (ar) pradinio standarto ir naudojamas analitės koncentracijos ir prietaiso rodmenų atitikimui patikrinti;

Kalibravimo patikrinimo standartas (KPS) – vidurinio taško kalibracinis standartas KS3, naudojamas kalibravimui patikrinti (žr. 4 lentelę);

Kokybės kontrolės mėginys (KKM) – mėginys su visomis ar kai kuriomis žinomų koncentracijų analitėmis. KKM gaminamas iš išorinių laboratorijai šaltinių arba iš kitų šaltinių nei pagaminti kalibraciniai tirpalai. Naudojamas siekiant patikrinti laboratorijos tinkamumą;

Minimalus lygis – lygis, kuriam esant analizinė sistema duoda atpažįstamą signalą ir priimtiną analitės kalibracinį tašką. Jis lygus „mažiausio“ kalibracinio tirpalo koncentracijai, tariant, kad taikomi šiame metode apibūdinti mėginio masė, tūriai, gryninimo procedūros;

Pradinis glaudumas ir išgava (PGI) – siekiant nustatyti gebą generuoti priimtiną glaudumą ir tikslumą, išanalizuojamos keturios skiesto GI standarto alikvotės. PGI nustatomas prieš pradedant taikyti šį metodą ir kiekvieną kartą jį modifikuojant;

Pradinis tirpalas – analitės tirpalas paruošiamas iš pamatinės medžiagos ar kito šaltinio, kurio autentiškumas ir grynumas patvirtintas kaip pamatinės medžiagos;

Tarpinio glaudumo ir išgavos (TGI) standartas – glaudumo ir išgavos standartas; tuščiasis mėginys papildytas žinomu kiekiu analitės. Analizuojamas tiksliai taip pat kaip mėginys. Jis naudojamas siekiant garantuoti, kad laboratorijoje gauti rezultatai atitinka šiuo metodu apibrėžtas glaudumo ir išgavos ribas;

Vanduo, naudojamas reagentams gaminti – vanduo be didesnės analičių ir potencialiai trukdančių medžiagų koncentracijos nei metodo analitės aptikimo riba.

4. Užteršimas ir trukdžiai:

4.1. Tirpikliai, reagentai, stikliniai indai ir kitos mėginių ruošimui naudojamos priemonės gali duoti artefaktus ir (ar) dėl pakilusios bazinės linijos tapti klaidingo chromatogramų vertinimo priežastimi [22.8, 22.9]. Gali būti reikalingas ypatingas reagentų parinkimas ir tirpiklių gryninimas distiliuojant tik stiklinėje sistemoje. Kur įmanoma, reagentai yra valomi ekstrahuojant ar plaunant tirpikliais;

4.2. Labai svarbus tinkamas stiklinių indų valymas, kadangi jie gali ne tik užteršti mėginius, bet ir adsorbuoti dominančias analites ant stiklo paviršiaus;

4.2.1. Panaudoti stikliniai indai turi būti kiek įmanoma greičiau skalaujami tirpikliu ir plaunami plovikliu. Valymą gali palengvinti stiklinius indus su plovikliu apie 30 sekundžių veikiant ultragarsu. Išardomi stikliniai indai, ypatingai dalomieji piltuvai su fluoropolimeriniais išleidimo kraneliais, prieš plovimą plovikliu turi būti išmontuojami;

4.2.2. Išplovus plovikliu, stikliniai indai turi būti nedelsiant skalaujami pirmiausia metanoliu, po to karštu vandentiekio vandeniu. Po skalavimo vandeniu vėl skalaujama metanoliu, tada acetonu ir po to metileno chloridu;

4.2.3. Pakartotinai naudojami stikliniai indai nekaitinami krosnyje. Kaitinimas gali būti taikomas tik po darbo su ypatingai užterštais mėginiais, bet ši procedūra turi būti sumažinta iki minimumo, kadangi dėl pasikartojančio stiklinių indų kaitinimo ant stiklo paviršiaus gali susidaryti aktyvios zonos, kuriose gali būti negrįžtamai adsorbuojami CDD/CDF junginiai;

4.2.4. Soxhlet aparatai prieš pat naudojimą apytiksliai tris valandas ekstrahuojami toluenu (žr. 12.3.1-12.3.3 punktus). Dalomieji piltuvai turi būti 2 min. skalaujami metileno chlorido ir tolueno (80: 20 v/v) mišiniu, džiovinami, po to 2 min. skalaujami grynu metileno chloridu;

4.3. Turi būti įrodoma, kad visi reikmenys, naudojami analizei, nėra trukdžių šaltiniai. Tai pasiekiama pradžioje atliekant tuščiuosius tyrimus su pamatine matrica ir su kiekviena mėginių serija (ne rečiau kaip kartą per 12 darbo valandų arba kiekvieną kartą atlikus 20 mėginių analizę):

4.3.1. Pamatinė matrica turi kaip įmanoma labiau imituoti tiriamo mėginio matricą. Geriausia, kad pamatinėje matricoje nebūtų aptinkamų CDD/CDF junginių kiekių, o potencialiai trukdančių medžiagų koncentracijos butų artimos randamoms analizuojamame mėginyje. Pavyzdžiui, žmogaus riebalinių audinių pamatinis mėginys su pentachlornaftalenu, gali būti naudojamas sistemos grynumui įvertinti, kai įtariama, kad mėginiuose yra pentachlornaftaleno;

4.3.2. Kai nėra galimybės įsigyti tiriamą mėginį imituojančios pamatinės matricos, vanduo, naudojamas reagentų gaminimui (7.6.1), gali būti naudojamas vandeninių tirpalų imitavimui; paplūdimio smėlis (7.6.2) ar baltas kvarcinis smėlis (7.3.2) gali imituoti dirvožemį; filtrinis popierius (7.6.3) gali imituoti popierių ar panašias medžiagas; kukurūzų aliejus (7.6.4) gali imituoti audinius;

4.4. Dėl mėginių paėmimo vietos įvairovės, iš mėginių išekstrahuotos trukdančios medžiagos labai skiriasi. Trukdančių junginių koncentracijos gali būti keletu eilių didesnės nei CDD/ CDF. Dažniausiai pasitaikančios trukdančios medžiagos yra chlorinti bifenilai, metoksibifenilai, hidroksibifenileteriai, benzilfenileteriai, polinukleininiai aromatiniai junginiai ir pesticidai. Kadangi šiuo metodu yra išmatuojami labai maži CDD/ CDF junginių kiekiai, labai svarbu pašalinti trukdžius. Siekiant sumažinti ar pašalinti trukdžius, gali būti taikomos 13 punkte pateiktos gryninimo procedūros. Tokiu būdu sudaroma galimybė patikimai nustatyti 2 lentelėje išvardytus CDD/CDF kiekius;

4.5. Kiekviena pakartotinai naudojama stiklinio indo dalis turi būti numeruota siekiant susieti tą stiklinį indą su konkretaus mėginio apdorojimu. Tai padės susekti galimus individualių mėginių užteršimo šaltinius, identifikuoti stiklinius indus, susijusius su labai užterštais mėginiais, kuriems reikalingas ypatingas valymas bei nustatyti, kada stikliniai indai turi būti išmetami kaip nebetinkami;

4.6. Audinių valymas. Natūralus riebalų kiekis audiniuose gali trukdyti CDD/CDF junginių nustatymui audinių mėginiuose. Riebalų kiekis skirtingose audinių rūšyse ir dalyse gali labai skirtis. Riebalai nevienodai tirpūs įvairiuose organiniuose tirpikliuose. Žymus jų kiekis gali apsunkinti kolonėline chromatografija pagrįstas mėginių ekstraktų valymo procedūras. Riebalai turi būti pašalinti pagal 13.7 punkte pateiktas riebalų pašalinimo procedūras, ir po to taikomas papildomas procedūras su aliuminio oksidu (13.4), su Florisil (13.8) ar anglimi (13.5). Mėginyje aptinkami chlorodifenilo eteriai, kuriuos parodo šių trukdžių m/ z, šalinami valant aliuminio oksidu ir (ar) Florisil.

5. Sauga:

5.1. Kiekvieno šiame metode naudojamo junginio ir reagento toksinis ar kancerogeninis poveikis nėra tiksliai nustatytas, todėl bet kuris cheminis junginys turi būti vertinamas kaip potencialiai pavojingas sveikatai. Kontaktas su šiais junginiais turi būti maksimaliai ribotas:

5.1.1. Bandymuose su laboratoriniais gyvūnais nustatyta, kad 2,3,7,8-TCDD izomeras pasižymi kancerogeniniu poveikiu, skatina apsigimimus bei odos ir riebalų liaukų susirgimus. Šis junginys tirpus vandenyje (200 ng/l) ir organiniuose tirpikliuose (0,14 %). Dėl galimo 2,3,7,8-TCDD toksinio ir fizinio poveikio su visais CDD/CDF junginiais dirbti gali tik aukštos kvalifikacijos personalas, nuodugniai susipažinęs su vartojimo ir apsaugos procedūromis bei galimu pavojumi;

5.1.2. Rekomenduojama laboratorijoms šiam metodui įsigyti skiestus analičių standartinius tirpalus. Tačiau, jei būtina ruošti pirminius tirpalus, turi būti naudojama efektyvi ventiliacinė įranga. Dirbant su didelėmis koncentracijomis turi būti užsidedamas nuo nuodingų dujų apsaugantis respiratorius (pvz.: rekomenduojamas NIOSH/MESA (The National Institute for oCcupational Safety and Health/The Mining Enforcement and Safety Administration, JAV) ar panašus);

5.2. Laboratorija yra atsakinga už saugų šiame metode apibrėžtų cheminių junginių naudojimą. Medžiagų saugos lapai turi būti prieinami visam analizėje dalyvaujančiam personalui. Patartina laboratorijoje vykdyti kiekvieno tyrėjo, dirbančio šiuo metodu, asmeninės higienos stebėseną. Šio stebėjimo rezultatai turi būti prieinami tyrėjui. Papildomą informaciją apie laboratorijos saugą galima rasti 10-13 nuorodose. 13 nuorodos bibliografija yra ypač išsami kalbant apie pagrindinius saugos laboratorijoje dalykus;

5.3. Su CDD/CDF junginiais ir mėginiais, įtariamais turint šių junginių, elgiamasi taip pat kaip su radioaktyviomis ar infekcinėmis medžiagomis. Laboratorijose būtina efektyvi ventiliacija ir kontroliuojamas įėjimas. CDD/CDF junginiai ypač nuodingi laboratoriniams gyvūnams. Kiekviena laboratorija turi sukurti griežtą darbo su šiais junginiais saugos programą. Ypač rekomenduojama praktika, pateikta 2 ir 14 nuorodose;

5.3.1. Visus darbus su mėginiais (dulkės, dirvožemis, sausi cheminiai reagentai), įskaitant mėginių išpakavimą, svėrimą, perpylimą ir maišymą, būtina atlikti sandariuose boksuose arba pakankamą ventiliaciją turinčiose traukos spintose. Neleistinas mėginių patekimas į laboratorijos ventiliacinę sistemą. Praskiesti tirpalai, įprastai naudojami analizėje ir bandymuose su gyvūnais, nekelia pavojaus kvėpuojant, išskyrus nelaimingus atsitikimus;

5.3.2. Turi būti naudojamos vienkartinės pirštinės, prijuostės ar laboratoriniai apsiaustai, apsaugos akiniai ar kaukės, analogiški darbui su radioaktyviom medžiagom boksai ar traukos spintos. Analitinių procedūrų metu, kai gali susidaryti aerozoliai ar dulkės, personalas turi dėvėti respiratorius su aktyvuotos anglies filtrais. Akių apsaugos priemonės (geriau veidą dengiantys skydai) turi būti dėvimos dirbant su pažeistais mėginiais ar grynais analitiniais standartais. Siekiant išvengti rankų pažeidimo dažniausiai naudojamos latekso pirštinės. Jei yra įtariama ar žinoma, kad mėginiuose yra didelės CDD/CDF junginių koncentracijos, po latekso pirštinėmis gali būti dėvimas papildomas pirštinių komplektas;

5.3.3. Darbuotojai turi būti mokomi teisingai nusiimti užterštas pirštines ir rūbus išvengiant kontakto su supančiais paviršiais;

5.3.4. Plaštakos ir dilbiai turi būti kruopščiai plaunami po kiekvienos manipuliacijos ir prieš pertraukas (kavos, pietų, pamainos gale);

5.3.5. Turi būti atskirtos ir paženklintos darbo vietos. Užteršimo galima išvengti naudojant atskirus stiklinius indus ir įrankius, absorbuojančio popieriaus lakštais uždengus stalviršius;

5.3.6. Siekiant sukondensuoti CDD/CDF garus, nuotekos iš dujų chromatografo mėginio dalytuvo ar masių spektrometro pirminio vakuuminio siurblio turi būti praleidžiamos per aktyvuotos medžio anglies kolonėlę, arba surenkami į indą su aliejumi ar aukštos virimo temperatūros alkoholiais;

5.3.7. Darbai turi būti organizuojami taip, kad susidarytų kiek galima mažiau užterštų atliekų. Atliekų konteineriuose turi būti naudojami plastikiniai įdėklai. Valytojai ir kitas personalas turi būti apmokyti saugiai elgtis su atliekomis;

5.3.8. Nukenksminimas:

5.3.8.1. personalo dezaktyvacija atliekama gausiai naudojant bet kokį muilą;

5.3.8.2. stikliniai indai, įrankiai ir paviršiai plaunami tirpikliu (pvz. mažai nuodingu Chlorothene NU Solvent ar kitu panašiu). Pakankama išskalauti tirpikliu Chlorothene, po to išplauti bet kuriuo plovikliu ir vandeniu. Jei indai pirmiausia skalaujami tirpikliu, plovimui naudotą vandenį galima išpilti į kanalizaciją. Toks atliekų šalinimo būdas leidžia sumažinti tirpiklių sąnaudas;

5.3.9. Užteršti rūbai turi būti renkami į plastikinius maišus. Asmenys, gabenantys maišus ir skalbiantys, rūbus turi būti informuoti apie pavojų ir mokomi tinkamai elgtis. Žinant apie galimą pavojų, rūbai į skalbimo mašinas turi būti įdedami vengiant kontakto su jais. Prieš skalbiant kitus rūbus, skalbimo mašinos turi atlikti tuščią skalbimo ciklą;

5.3.10. Siekiant įsitikinti darbinių paviršių ir įrankių švara, atliekamas tampono testas – paviršius valomas su filtrinio popieriaus gabalėliu. Ekstrahuojant ir analizuojant dujų chromatografu su elektronų pagavos detektoriumi tampone gali būti pasiekiama 0,1 µg aptikimo riba; analizė naudojant šį metodą įgalina pasiekti netgi mažesnę aptikimo ribą. Jei tampone yra mažiau nei 0,1 µg, švara yra pakankama. Kai tampone yra daugiau nei 10 µg kyla stiprus pavojus. Tokią įrangą ar darbo vietą, prieš pradedant darbą būtina skubiai valyti. Toks užteršimas rodo, kad laboratorijoje įgyvendinta nepriimtina darbo praktika;

5.3.11. Audinių ekstrahavimui naudojama stalinė ar sukamojo judesio purtyklė. Todėl yra galimybė, kad suduš ekstrahavimo indas ir išsilies rūgštis ar degus organinis tirpiklis. Nuo rūgšties ar tirpiklių išsiliejimo apsaugo antrinė apsaugos sistema aplink purtyklę. Purtymo greitis ir intensyvumas turi būti sureguliuotas taip, kad sumažėtų tokio dūžio galimybė.

6. Įranga ir medžiagos:

PASTABA. Čia nurodytos įmonės, tiekėjai, detalių numeriai pateikti tik kaip pavyzdžiai ir nėra privalomi. Gali būti naudojamos ir kitos medžiagos ir įranga, jeigu įrodoma, kad su jomis gaunami tokie patys rezultatai. Už metodo tinkamumo reikalavimų įvykdymą atsako laboratorija.

6.1. Įranga pavieniams ir sudėtiniams mėginiams paimti:

6.1.1. Buteliai ir kamščiai:

6.1.1.1. skystiems mėginiams (vanduo, dumblas ir panašūs, 5 % ar mažiau netirpių medžiagų turintys mėginiai) – rudo stiklo buteliai, mažiausiai 1,1 l talpos, su užsukamais kamščiais;

6.1.1.2. kietiems mėginiams (dirvožemis, nuosėdos, dumblas, popieriaus masė, filtro gabaliukai ar panašūs, daugiau nei 5 % netirpių medžiagų turintys mėginiai) – plačiagurkliai, rudo stiklo buteliai, mažiausiai 500 ml talpos;

6.1.1.3. jei rudo stiklo butelių nėra, mėginius reikia apsaugoti nuo šviesos;

6.1.1.4. butelių kamščiai su fluoropolimerinėm tarpinėm pritaikyti užsukti mėginiams skirtus butelius;

6.1.1.5. įrangos valymas:

6.1.1.5.1. prieš naudojimą buteliai išplaunami plovikliu, skalaujami vandeniu ir tirpikliais;

6.1.1.5.2. tarpinės prieš naudojimą plaunamos plovikliu, skalaujamos, reagentų gaminimui skirtu vandeniu (7.6.1), tirpikliais ir mažiausiai vieną valandą kaitinamos apytiksliai 200(o)C temperatūroje;

6.1.2. Įranga sudėtiniams mėginiams paimti:

Automatinė ar rankinė sudėtinių mėginių paėmimo sistema su stiklinėmis talpyklomis valoma minėtu butelių valymo būdu. Turi būti naudojami tik stikliniai ar fluoropolimeriniai vamzdeliai. Jei mėginiui paimti reikalingas peristaltinis siurblys, siurblyje gali būti naudojami tik trumpi susispaudžiantys silikoniniai vamzdeliai. Siekiant sumažinti mėginių užteršimą, prieš naudojimą vamzdeliai turi būti kruopščiai plaunami metanoliu, po to keletą kartų skalaujami reagentams gaminti skirtu vandeniu. Sudėtinių mėginių proporcingam paėmimui turi būti naudojamas integruojantis debito matuoklis;

6.2. Įranga stikliniams indams valyti tai traukos spintoje įrengta laboratorinė kriauklė;

6.3. Įranga mėginiams paruošti:

6.3.1. Laboratorinė traukos spinta, pakankamo dydžio toliau išvardintai mėginių paruošimo įrangai sutalpinti;

6.3.2. Boksas;

6.3.3. Audinių homogenizatorius su plienine homogenizavimo įranga;

6.3.4. Mėsmalė su 3-5 mm dydžio akutėmis sietelyje;

6.3.5. Įranga drėgniui nustatyti:

6.3.5.1. laboratorinė krosnis, tinkama palaikyti 110°C ± 5°C temperatūrą;

6.3.5.2. eksikatorius;

6.3.6. Svarstyklės:

6.3.6.1. analitinės, tinkamos sverti 0,1 mg tikslumu;

6.3.6.2. precizinės, tinkamos sverti 10 mg tikslumu;

6.4. Ekstrahavimo įranga:

6.4.1. Vandens mėginiams ekstrahuoti:

6.4.1.1. pH matuoklis, su kombinuotu stiklo elektrodu;

6.4.1.2. plataus intervalo pH indikatoriniai popierėliai;

6.4.1.3. graduoti matavimo cilindrai, 1l talpos;

6.4.1.4. dalomieji piltuvai, 250 ml, 500 ml ir 2000 ml talpos su fluoropolimeriniais išleidimo kraneliais skysčių-skysčių ekstrakcijai;

6.4.1.5. kietafazio ekstrahavimo įranga:

6.4.1.5.1. filtravimo įrenginys, 1 l talpos, susidedantis iš stiklinio piltuvo, stiklinio frito laikiklio, spaustuvo, sujungimo, kamščio, filtravimo kolbos ir vakuuminio vamzdelio (4 paveikslas). Nutekamojo vandens mėginiams įrenginyje turi būti įdedama 90 ar 144 mm skersmens plokštelė. Geriamo vandens ar kitiems, mažai tirpių medžiagų turintiems, mėginiams gali būti naudojamos mažesnės plokštelės;

6.4.1.5.2. vakuumo šaltinis, tinkamas gauti 84,7 kPa slėgį, su automatinio stabdymo įrenginiu ir vakuumo matuokliu;

6.4.1.5.3. stiklo pluošto filtras, Whatman GMF 15 ar panašus, porų dydis 1 µm, prijungiamas prie filtravimo įrenginio (6.4.1.5.1);

6.4.1.5.4. kietafazio ekstrahavimo plokštelė – inertinė matrica su tolygiai įterptu silikageliu su oktadecil grupėmis (C₁₈), pvz.: Fisher Scientific 14-378F ar panaši, prijungiama prie filtravimo įrenginio (6.4.1.5.1);

6.4.2. Soxhlet/ Dean-Stark (SDS) ekstrahavimo įrenginys (5 paveikslas):

6.4.2.1. Soxhlet įrenginys, 50 mm vidinis skersmuo, 200 ml talpos su 500 ml apvaliadugne kolba arba 300 ml plokščiadugne kolba (Cal-Glass LG-6900 ar panašus);

6.4.2.2. kapsulė, 43x123 mm, įdedama į Soxhlet įrenginį (Cal- Glass LG-6901-122 ar panaši);

6.4.2.3. Dean-Stark ar Barret drėgmės gaudyklė, su fluoropolimeriniu išleidimo kraneliu, prijungiama prie Soxhlet įrenginio;

6.4.2.4. kaitinimo gaubtas, pusiau sferinis, tinkantis 500 ml talpos apvaliadugnėms kolboms (Cal-Glass LG-8801-112 ar panašus);

6.4.2.5. reguliuojamos įtampos transformatorius;

6.4.3. Audinių ekstrahavimo įranga:

6.4.3.1. buteliai ekstrahuoti (naudojama, jei taikomas ekstrahavimas su HCl hidrolize), 500 ml – 600 ml talpos, plačiagurkliai, skaidraus stiklo, su fluoropolimerines tarpines turinčiais kamščiais;

6.4.3.2. buteliai grįžtamajam ekstrahavimui, 100 ml – 200 ml talpos, siauru kaklu, skaidraus stiklo, su fluoropolimerines tarpines turinčiais kamščiais;

6.4.3.3. mechaninė purtyklė, sukamojo judesio ar platforminė sukamoji purtyklė;

6.4.3.4. padėklas, prijungiamas prie purtyklės ir tinkamas vienu metu purtyti nuo 4 iki 9 mėginių;

6.4.4. Stiklinės, 400 ml-500 ml talpos;

6.4.5. Plieniniai pateliai;

6.5. Filtravimo įranga:

6.5.1. Pyrex stiklo vata, mažiausia 3 valandas ekstrahuota tirpikliais SDS įrenginyje.

PASTABA. Kaitinant stiklo vatą joje gali susidaryti aktyvios zonos, kuriose gali būti negrįžtamai adsorbuojami CDD/CDF junginiai;

6.5.2. Stiklinis piltuvas, 125 ml – 250 ml talpos;

6.5.3. Stiklo pluošto filtrinis popierius, Whatman GF/D ar panašus, tinkamas stikliniam piltuvui (6.5.2);

6.5.4. Džiovinimo kolonėlė, vidinis skersmuo15 mm – 20 mm, Pyrex stiklo chromatografinė kolonėlė su įlydyto rūpaus stiklo ar stiklo vatos kamščiu;

6.5.5. Buchner piltuvas, skersmuo 15 cm.;

6.5.6 Stiklo pluošto filtrinis popierius, tinkantis Buchner piltuvui (6.5.5);

6.5.7. Filtravimo kolba, 1,5 l – 2,0 l talpos, su atšaka šone;

6.5.8. Vakuuminio filtravimo įranga, Millipore YT30 142 HW ar panaši;

6.6. Centrifugavimo įranga:

6.6.1. Centrifuga, tinkama centrifuguoti 500 ml talpos centrifugavimo indus ar 15 ml talpos centrifugavimo mėgintuvėlius, mažiausias centrifugavimo greitis 5000 rpm;

6.6.2. Centrifugavimo indai, 500 ml talpos, su užsukamais dangteliais;

6.6.3. Centrifugavimo mėgintuvėliai, 12 ml – 15 ml talpos, su užsukamais dangteliais;

6.7. Gryninimo įranga:

6.7.1. Automatinis gelfiltracijos chromatografas (pvz. Analytical Biochemical Labs, Inc, Columbia, MO, Model GPC Autoprep 1002 ar panašus):

6.7.1.1. kolonėlė, ilgis 600 mm-700 mm, vidinis skersmuo 25 mm, užkrauta 70 g SX-3 Bio-beads (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA ar panaši);

6.7.1.2. švirkštas, 10 ml, su Luer jungtimi;

6.7.1.3. švirkšto filtrų laikiklis, plieninis, stiklo pluošto ar fluoropolimeriniai filtrai (Gelman 4310 ar panašūs);

6.7.1.4. UV detektorius, 254 nm, su preparatyvia ar pusiau preparatyvia pratekamąja kiuvete (Isco, Inc., Type 6; Schimadzu, optinio kelio ilgis 5 mm; Beckman-Altex 152W, 8 µL mikropreparatyvi pratekamoji kiuvetė, optinio kelio ilgis 2 mm; Pharmacia UV-1, 3 mm pratekamoji kiuvetė; LDC Milton-Roy UV-3, monitor #1203 ar panašus);

6.7.2. Atvirkštinių fazių efektyvusis skysčių chromatografas:

6.7.2.1. kolonėlių termostatas ir detektorius, Perkin-Elmer Model LC-65T ar panašus, jautrumas 0,02 AUFS esant 235 nm;

6.7.2.2. mėginio įleidimo įrenginys, su 50 µl talpos mėginio paėmimo kilpa;

6.7.2.3. kolonėlės, dvi nuosekliai sujungtos 6,2 mm x 250 mm Zorbax-ODS kolonėlės (DuPont Instruments Division, Wilmington, DE ar panašios), darbo temperatūra 50°C, debitas 2,0 ml/min, judančioji fazė metanolis, izokratinis gradientas;

6.7.2.4. siurblys, Altex ar panašus;

6.7.3. Pipetės:

6.7.3.1. vienkartinės Pasteur, ilgis 150 mm, vidinis skersmuo 5 mm;

6.7.3.2. vienkartinės serologinės, 10 ml, vidinis skersmuo 6 mm;

6.7.4. Stiklinės chromatografinės kolonėlės:

6.7.4.1. ilgis 150 mm, vidinis skersmuo 8 mm, su įlydyto rūpaus stiklo ar stiklo vatos kamščiu ir 250 ml talpos rezervuaru;

6.7.4.2. ilgis 200 mm, vidinis skersmuo 15 mm, su įlydyto rūpaus stiklo ar stiklo vatos kamščiu ir 250 ml talpos rezervuaru;

6.7.4.3. ilgis 300 mm, vidinis skersmuo 25 mm, su 300 ml talpos rezervuaru ir stikliniu ar fluoropolimeriniu išleidimo kraneliu;

6.7.5. Maišymo įranga audiniams valyti silikageliu:

6.7.5.1. mechaninė maišyklė;

6.7.5.2. buteliai, 500 ml – 600 ml talpos, plačiagurkliai, skaidraus stiklo;

6.7.6. Laboratorinė krosnis, skirta kaitinti ir saugoti adsorbentus, tinkanti išlaikyti pastovią temperatūrą (±5°C) 105°C – 250°C temperatūrų intervale;

6.8. Koncentravimo įranga:

6.8.1. Sukamasis garintuvas su reguliuojamos temperatūros vandens vonia:

6.8.1.1. vakuumo šaltinis sukamajam garintuvui su automatinio stabdymo įrenginiu ir vakuumo matuokliu;

6.8.1.2. recirkuliacinis vandens siurblys su aušintuvu (rekomenduojama naudoti, nes garintuvo atliekas aušinant vandeniu iš vandentiekio sunaudojama daug vandens, gali nukentėti aušinimo efektyvumas, nes gali kisti vandens temperatūra ir slėgis);

6.8.1.3. apvaliadugnė kolba, 100 ml ir 500 ml talpos ar didesnės, su šlifu;

6.8.2. Kuderna-Danish (K-D) koncentratorius:

6.8.2.1. koncentratoriaus mėgintuvėlis, 10 ml talpos, graduotas (Kontes K-570050-1025 ar panašus), su kalibravimo patikra. Ekstraktai nuo išgaravimo apsaugomi šlifo kamščiu (19/22 jungtis);

6.8.2.2. garinimo kolba, 500 ml talpos (Kontes K-570001-0500 ar panaši), spyruoklėmis (Kontes K-662750-0012 ar panašios) sujungta su koncentratoriaus mėgintuvėliu;

6.8.2.3. Snyder kolonėlė su trim makro burbulais (Kontes K- 503000-0232 ar panaši);

6.8.2.4. virimo agentas:

6.8.2.4.1. stiklas ar silicio karbidas, apytikriai 10/40 mešų, ekstrahuoti metileno chloridu, mažiausiai valandą kaitinti 450°C temperatūroje;

6.8.2.4.2. fluoropolimeras, ekstrahuotas metileno chloridu;

6.8.2.5. vandens vonia, kaitinama, uždengiama koncentriniais žiedais, palaikanti temperatūrą 2°C tikslumu, patalpinta traukos spintoje;

6.8.3. Išgarinimo azotu įranga su vandens vonia, kurios temperatūra gali būti reguliuojama 30°C-60°C temperatūros intervale;

6.8.4. Buteliukai mėginiams:

6.8.4.1. rudo stiklo, 2 ml – 5 ml talpos, su užsukamais kamšteliais su fluoropolimerinėmis tarpinėmis;

6.8.4.2. stikliniai, 0,3 ml talpos, su užsukamais kamšteliais su fluoropolimerinėmis tarpinėmis;

6.9. Dujų chromatografas turi būti su kapiliarinei kolonėlei tinkamu mėginio dalytuvu (dozatoriumi) arba turėti tiesioginio įleidimo įrenginį, temperatūros programavimą ir izoterminį režimą, ir turi atitikti visas darbo sąlygas nurodytas 10 punkte:

6.9.1. DCh kolonėlė CDD, CDF ir izomero 2,3,7,8,-TCDD nustatymui: silicio junginiu dengta kapiliarinė kolonėlė, ilgis – 60 m ± 5 m, vidinis skersmuo – 0,32 mm ± 0,02 mm, 0,25 µm nejudančioji fazė iš 94 % metilsilikono, 1 % vinilsilikono ir 5% fenilsilikono (J & W DB-5 ar panaši);

6.9.2. DCh kolonėlė izomero 2,3,7,8,-TCDF nustatymui: silicio junginiu dengta kapiliarinė kolonėlė, ilgis – 30 m ± 5 m, vidinis skersmuo – 0,32 mm ± 0,02 mm, 0,25 µm nejudančioji fazė (J & W DB-225 ar panaši);

6.10. Masių spektrometras – 28 eV – 40 eV elektronų smūgio jonizacijos energijos, galintis per maždaug vieną sekundę pakartotinai selektyviai registruoti bent 12 tikrųjų m/z esant didesnei nei 10000 skiriamajai gebai ir turi atitikti 10 punkte nurodytas eksploatacines sąlygas;

6.11. DCh-MS jungtis. Masių spektrometras turi būti sujungtas su DCh taip, kad ne daugiau 1 cm kapiliarinės kolonėlės galo būtų jonų šaltinyje, bet ne kirstų jonų ar elektronų pluošto;

6.12. Duomenų sistema galinti kaupti, registruoti ir saugoti MS duomenis.

7. Reagentai ir standartai:

7.1. pH reguliavimui ir grįžtamajam ekstrahavimui:

7.1.1. Kalio hidroksido tirpalas: ištirpinama 20 g analiziškai gryno KOH 100 ml vandens;

7.1.2. Sieros rūgštis, analiziškai gryna, ρ = 1,84;

7.1.3. Druskos rūgštis, analiziškai gryna, 6N;

7.1.4. Natrio chloridas, analiziškai grynas, 5 % (m/v) tirpalas vandenyje;

7.2. Tirpalams džiovinti ir garinti:

7.2.1. Tirpalams džiovinti: natrio sulfatas, analiziškai grynas, granuliuotas, bevandenis (Baker 3375 ar panašus), skalautas metileno chloridu (20 ml/g), mažiausiai vieną valandą kaitintas 400°C temperatūroje, atvėsintas eksikatoriuje ir laikomas švariame stikliniame butelyje su užsukamu kamščiu, apsaugančiu nuo drėgmės. Jei po kaitinimo natrio sulfatas įgyja pilkšvą atspalvį (ženklas, kad kristalo matricoje yra anglies), ši reagento partija yra netinkama naudojimui ir turi būti išmetama. Ekstrahuojant metileno chloridu (o ne paprastai plaunant) ir kaitinant žemesnėje temperatūroje gali būti gaunamas tinkamas naudojimui natrio sulfatas;

7.2.2. Audinių džiovinimui: natrio sulfatas, analiziškai grynas, miltelių pavidalo, paruoštas ir saugomas kaip nurodyta

7.2.1;

7.2.3. Išgrynintas azotas;

7.3. Ekstrahavimui:

7.3.1. Tirpikliai: acetonas, toluenas, cikloheksanas, heksanas, metanolis, metileno chloridas ir nonanas; distiliuoti stiklinėse sistemose, skirti pesticidų analizei, sertifikuoti, be trukdančių medžiagų;

7.3.2. Baltas kvarcinis smėlis, 60/70 mešų, Soxhlet/Dean-Stark (SDS) ekstrahavimui (Aldrich Chemical, Cat. No. 27-437-9 ar panašus), mažiausiai keturias valandas kaitintas 450°C temperatūroje;

7.4. Gelfiltracijos kalibravimo tirpalas (GKT) – sudėtis: 300 mg/ml kukurūzų aliejaus, 15 mg/ml bis(2-etilheksil)ftalato, 1,4 mg/ml pentachlorfenolio, 0,1 mg/ml perileno ir 0,5 mg/ml sieros;

7.5. Adsorbentai mėginiams valyti:

7.5.1. Silikagelis:

7.5.1.1. aktyvuotas silikagelis, 100-200 mešų (Supelco 1-3651 ar panašus), plautas metileno chloridu, mažiausiai vieną valandą kaitintas 180°C temperatūroje, atvėsintas eksikatoriuje ir laikomas švariame stikliniame butelyje su užsukamu kamščiu, apsaugančiu nuo drėgmės;

7.5.1.2. rūgštus silikagelis (30 % m/m) – švariame inde lazdele gerai išmaišoma 44,0 g koncentruotos sieros rūgšties ir 100,0 g aktyvuoto silikagelio, kol susidarys vienalytis mišinys. Laikomas butelyje su užsukamu kamščiu su fluoropolimerine tarpine;

7.5.1.3. bazinis silikagelis – švariame inde lazdele gerai išmaišoma 30 g 1 N natrio hidroksido ir 100,0 g aktyvuoto silikagelio, kol susidarys vienalytis mišinys. Laikomas butelyje su užsukamu kamščiu su fluoropolimerine tarpine;

7.5.1.4. kalio silikatas – 750 ml-1000 ml talpos plokščiadugnėje kolboje 300 ml metanolio ištirpinama 56 g ypatingai gryno kalio hidroksido (Aldrich ar panašus). Įdedama 100 g silikagelio ir valandą ar dvi maišoma 60°C-70°C temperatūroje ant įkaitintos plytelės. Skystis nupilamas, kalio silikatas plaunamas dviem 100 ml metanolio porcijom, po to 100 ml metileno chlorido. Kalio silikatas paskleidžiamas ant tirpikliu nuskalautos aliuminio folijos ir 2-4 valandas džiovinamas traukos spintoje. Aktyvuojamas per naktį kaitinant 200-250°C temperatūroje;

7.5.2. Siekiant, kad laboratorijos tinkamumas atitiktų 9.3 punkte aprašytus reikalavimus, mėginių ekstraktų gryninimui gali būti naudojamas rūgštus ar bazinis aliuminio oksidas. Tas pats aliuminio oksido tipas turi būti naudojamas visiems mėginiams, taip pat mėginiams, naudojamiems pradinio (9.2) bei nuolatinio (15.5) glaudumo ir išgavų patikrinimui;

7.5.2.1. rūgštus aliuminio oksidas (Supelco 19996-6C ar panašus). Aktyvuojamas ne trumpiau 12 valandų kaitinant 130 oC temperatūroje;

7.5.2.2. bazinis aliuminio oksidas (Supelco 19944-6 ar panašus). Aktyvuojamas ne trumpiau kaip 24 valandas kaitinant 600°C temperatūroje. Kitas aktyvavimo būdas – kaitinimas vamzdinėje krosnyje 650°C-700°C temperatūroje, esant 400 cm³/min. oro debitui. Negalima kaitinti aukštesnėje nei 700°C temperatūroje, nes tai gali sumažinti analitės sulaikymo galią. Laikomas uždarame inde 130°C temperatūroje. Po iškaitinimo turi būti sunaudojamas per penkias dienas;

7.5.3. Anglis:

7.5.3.1. Carbopak C (Supelco 1-0258 ar panašus);

7.5.3.2. celitas 545 (Supelco 2-0199 ar panašus);

7.5.3.3. gaminamas 18 % (m/m) mišinys, gerai išmaišant 9,0 g Carbopac C ir 41,0 g celito 545, aktyvuojamas ne trumpiau 6 valandas kaitinant 130°C temperatūroje, laikomas eksikatoriuje;

7.5.4. Antropogeninė atskyrimo kolonėlė. 6.7.4.3 punkte nurodyta kolonėlė nuo apačios iki viršaus užpildoma tokia seka:2 g silikagelio (7.5.1.1), 2 g kalio silikato (7.5.1.4), 2 g granuliuoto bevandenio natrio sulfato (7.2.1), 10 g rūgštaus silikagelio (7.5.1.2), 2 g granuliuoto bevandenio natrio sulfato (7.2.1);

7.5.5. Florisil kolonėlė:

7.5.5.1. Florisil, 60-100 mešų (Floridin Corp ar panašus), 500 g porcijos 24 valandas ekstrahuojamos Soxhlet įrenginiu;

7.5.5.2. nusmailintas graduotos serologinės pipetės (6.7.3.2) galas užkemšamas stiklo vatos kamščiu, įkraunama 1,5 g (apytiksliai 2 ml) Florisl, ant viršaus apytiksliai 1 ml natrio sulfato (7.2.1), užkemšama stiklo vatos kamščiu;

7.5.5.3. aktyvuojama mažiausiai 24 valandas kaitinant 130°C- 150°C temperatūroje, 30 min. vėsinama, turi būti panaudojama per 90 min.;

7.6. Pamatinės matricos, kuriose šiuo metodu neaptikta nei CDD/CDF junginių, nei trukdančių medžiagų:

7.6.1. Reagentų gaminimui skirtas vanduo, įsigytas ar paruoštas praleidžiant per aktyvintas anglis;

7.6.2. Didelio kietumo pamatinė matrica – paplūdimio smėlis ar panaši medžiaga. Paruošiama ekstrahuojant metileno chloridu ir (ar) kaitinant mažiausiai 4 valandas 450°C temperatūroje;

7.6.3. Popieriaus pamatinė matrica – stiklo pluošto filtras (Gelman Type A ar panašus). Popierius sukarpomas taip, kad imituotų tiriamo popieriaus mėginio paviršiaus plotą;

7.6.4. Audinio pamatinė matrica – kukurūzų ar kitoks augalinis aliejus. Gali būti paruošiamas ekstrahuojant metileno chloridu;

7.6.5. Kitos matricos. Šis metodas gali būti patikrinamas bet kokia matrica, atliekant 9.2 punkte nurodytus testus. Geriausia, jei matricoje nebūtų CDD/CDF junginių, bet jokiu būdu CDD/CDF fonas pamatinėje matricoje negali tris kartus viršyti 2 lentelėje pateiktų minimalių kiekių. Jei pamatinėje matricoje yra nedidelis CDD/CDF junginių fonas, 9.2 dalyje naudojamų analičių papildymo lygis turi būti padidintas taip, kad papildymo ir fono santykis butų intervale nuo 1:1 iki 5:1 [22.15];

7.7. Standartiniai tirpalai. Įsigyjami sertifikuoto grynumo, koncentracijos ir autentiškumo tirpalai ar mišiniai, arba gaminami iš žinomo grynumo ir sudėties medžiagų. Jei cheminio junginio grynumas siekia 98 % ir daugiau, jį galima sverti be standarto koncentracijos perskaičiavimo. Standartai saugomi tamsoje, kambario temperatūroje, buteliukuose su užsukamais kamšteliais su fluoropolimerinėmis tarpinėmis. Kad butų galima pastebėti tirpiklio išgaravimą, buteliuke esančio tirpalo lygis pažymimas. Jei buvo pastebėta, kad tirpiklis nugaravo, tirpalas turi būti pakeičiamas;

7.8. Pradiniai standartiniai tirpalai:

7.8.1. Gaminami nonane žemiau nurodytu būdu arba įsigyjami skiesti tirpalai (Cambridge Isotope Laboratories (CIL), Woburn, MA ar panašūs). Laikomasi 5 punkte nurodytų saugos priemonių ir 5.1.2 punkto rekomendacijų;

7.8.2. Tirpiklyje ištirpinamas tinkamas kiekis tiriamos pamatinės medžiagos, pvz.: į 10 ml talpos matavimo kolbutę, užkemšamą šlifo kamščiu, trijų reikšminių skaitmenų tikslumu pasveriama 1 mg-2 mg 2,3,7,8-TCDD, iki žymės pripilama nonano. Kai TCDD pilnai ištirpsta, tirpalas perpilamas į švarų 15 ml talpos buteliuką su kamšteliu su fluoropolimerine tarpine;

7.8.3 Prieš ruošiant kalibravimo ar tinkamumo testo standartus turi būti įsitikinama ar pradiniuose standartiniuose tirpaluose nėra skilimo požymių. Pamatinius standartus, kurie gali būti naudojami nustatant kalibracinių standartų tikslumą, galima įsigyti CIL arba iš kitų pardavėjų;

7.9. Pradinis standartinis tirpalas, skirtas glaudumui ir išgavos testui atlikti:

7.9.1. Visų CDD/CDF junginių nustatymui: naudojant 7.8 punkte nurodytus tirpalus paruošiamas pradinis standartinis tirpalas, kuriame CDD/CDF junginių koncentracijos prilygsta 3 lentelėje nurodytoms. Skiedžiant gaunamas glaudumo ir išgavos (GI) standartinis tirpalas (7.14).

7.9.2. Jei yra nustatomi tik 2,3,7,8-TCDD ar 2,3,7,8-TCDF, ruošiamas tik šiuos junginius turintis GI pradinis standartinis tirpalas;

7.10. Žymėtųjų junginių papildymo tirpalai:

7.10.1. Visų CDD/CDF junginių nustatymui: iš pradinių standartinių tirpalų ar iš įsigytų mišinių ruošiamas tirpalas, kuriame žymėtųjų junginių koncentracijos nonane prilygsta nurodytoms 3 lentelėje. Prieš naudojimą šis tirpalas skiedžiamas acetonu (žr. 7.10.3 punktą);

7.10.2. Jei yra nustatomi tik 2,3,7,8-TCDD ar 2,3,7,8-TCDF, ruošiamas tik šiuos junginius turintis žymėtųjų junginių pradinis standartinis tirpalas. Prieš naudojimą šis tirpalas skiedžiamas acetonu (žr. 7.10.3 punktą);

7.10.3. skiestas papildymo tirpalas ruošiamas pakankamą kiekį žymėtųjų junginių tirpalo (7.10.1 arba 7.10.2) 50 kartų skiedžiant acetonu. Į kiekvieną mėginį įpilama po 1,0 ml skiesto tirpalo. Tirpalo pasigaminama tiek, kiek sunaudojama per vieną dieną;

7.11. Standartas gryninimo efektyvumui matuoti. Nonane ruošiamas 3 lentelėje nurodytos koncentracijos -³⁷Cl4-2,3,7,8- TCDD tirpalas. Šis standartinis tirpalas dedamas į visus ekstraktus prieš gryninimo procedūrą, siekiant išmatuoti gryninimo proceso efektyvumą;

7.12. Vidiniai standartai:

7.12.1. Visų CDD/CDF junginių nustatymui: nonane ruošiamas 3 lentelėje nurodytų koncentracijų ¹³C₁₂-1,2,3,4 -TCDD ir ¹³C₁₂- 1,2,3,7,8,9 -HxCDD vidinio standarto tirpalas;

7.12.2. Jei yra nustatomi tik 2,3,7,8-TCDD ar 2,3,7,8-TCDF, ruošiamas tik ¹³C₁₂-1,2,3,4 -TCDD turintis vidinio standarto tirpalas;

7.13. Kalibraciniai standartai (KS1 – KS5). Sumaišant 7.9-7.12 tirpalus nonane ruošiami penki 4 lentelėje parodyti tirpalai. Šiais tirpalais galima nustatyti santykinį atsaką (žymėtojo junginio ir natyvaus junginio atsakų santykis) ir atsako faktorių kaip koncentracijos funkciją. KS3 tirpalas naudojamas kalibravimo patikrinimui. Jei yra nustatomi tik 2,3,7,8-TCDD ar 2,3,7,8-TCDF, maišomi tik šiuos junginius turintys tirpalai;

7.14. Standartinis tirpalas glaudumui nustatyti ir išgavos (GI) testui atlikti. Naudojamas nustatyti pradinį (9.2) ir tarpinį (15.5) glaudumą ir išgavą. 10 µl GI standarto (7.9.1 ar 7.9.2) acetonu skiedžiama iki 2,0 ml kiekvienai mėginio matricos rūšiai. Po vieną ml kiekvieno tirpalo reikia „tuščiajam“ tyrimui ir kiekvienos rūšies matricos tarpiniam glaudumui ir išgavai nustatyti;

7.15. DCh sulaikymo trukmės nustatymo tirpalas ir izomerų specifiškumo testo standartas naudojamas dioksinų ir furanų sulaikymo trukmių pradžios ir pabaigos nustatymui bei 2,3,7,8- TCDD ar 2,3,7,8-TCDF nustatymui įsigytų DCh kolonėlių specifiškumo izomerams įrodymui. Standarte (CIL EDF-4006 ar panašūs) turi būti 5 lentelėje išvardyti junginiai. Jei nustatomi tik 2,3,7,8-TCDD ar 2,3,7,8-TCDF, nebūtina tikrinti sulaikymo trukmės intervalą charakterizuojančius junginius. Šiuo atveju naudojamas specifiškumo izomerams testo standartas (CIL EDF-4033 ar panašūs), kuriame yra glaudžiausiai eliuojami izomerai, išvardyti 5 lentelėje;

7.16. Kokybės kontrolės mėginį (KKM) reikėtų įsigyti iš kito tiekėjo nei kalibracinius standartus. Geriausia naudoti sertifikuotą paliudytąją medžiagą, su žinoma CDD/CDF junginių koncentracija matricoje panašioje į mėginio matricą; 7.17. Kiekybinei analizei naudojami standartiniai tirpalai (7. 9-7.15) turi būti periodiškai analizuojami ir prieš naudojimą palyginami su pamatiniais standartais (7.8.3).

8. Mėginių ėmimas, konservavimas, saugojimas ir laikymo trukmė:

8.1. Mėginiai imami į rudo stiklo talpas vadovaujantis įprastine mėginių paėmimo praktika [22.16]. Laisvai tekančio vandens mėginiai imami naudojant automatinę mėginių ėmimo įrangą. Kieti mėginiai imami į plačiagurklius stiklainius naudojant specialią mėginių paėmimo įrangą;

8.2. Vandens mėginiai nuo paėmimo iki pristatymo į laboratoriją laikomi tamsoje 0°C-4°C temperatūroje. Jei vandens mėginiuose yra chloro likučių, į 1 l vandens dedama 80 mg natrio tiosulfato. Išmatuoti chloro likučių kiekį galima taikant Aplinkos apsaugos valdyba, JAV metodus 330.4 ir 330.5 [22.17]. Jei mėginio pH didesnis nei 9, rūgštinama sieros rūgštimi iki pH 7-9.

Kieti, pusiau kieti, aliejingi ir mišrių fazių mėginiai nuo paėmimo iki pristatymo į laboratoriją laikomi tamsoje 0°C-4°C temperatūroje.

Vandens mėginiai saugomi tamsoje 0°C-4°C temperatūroje. Kieti, pusiau kieti, aliejingi, mišrių fazių ir audinių mėginiai saugomi tamsoje žemesnėje nei -10°C temperatūroje;

8.3. Gyvūnų ir augalų audinių mėginiai:

8.3.1. Audinys supjaustoma gabaliukais ar paruošiama kitokiu būdu, priklausomai nuo to, ar laboratorija analizei pageidauja viso gyvūno, jo dalies ar atskirų audinių;

8.3.2. Tyrimui atrinkti audiniai turi būti suvyniojama į aliuminio foliją ir nuo mėginio paėmimo iki pristatymo į laboratoriją laikoma žemesnėje nei 4°C temperatūroje;

8.3.3. Pristatyti į laboratoriją mėginiai turi būti užšaldomi ir iki paruošimo laikomi tamsoje žemesnėje nei -10°C temperatūroje. Nenaudoti paruošti mėginiai taip pat laikomi tamsoje žemesnėje nei -10°C temperatūroje;

8.4. Laikymo trukmė:

8.4.1. Nėra nustatyta vandens, kietų, pusiau kietų, audinių ir kitokių mėginių, skirtų CDD/CDF junginių analizei, ilgiausia laikymo trukmė. Tamsoje, 0°C-4°C temperatūroje ir užkonservavus (jei reikia) kaip nurodyta ankščiau, vandens mėginiai gali būti saugomi iki vienerių metų. Kieti, pusiau kieti, daugiafaziai ir audinių mėginiai tamsoje, žemesnėje nei – 10°C temperatūroje, gali būti saugomi iki vienerių metų;

8.4.2. Mėginių ekstraktai iki analizės laikomi tamsoje, žemesnėje nei -10°C temperatūroje. Tokiomis laikymo sąlygomis ekstraktai gali būti saugomi iki vienerių metų.

9. Kokybės užtikrinimas ir kokybės kontrolė:

9.1. Kiekvienoje laboratorijoje, taikančioje šį metodą, turi veikti oficiali kokybės užtikrinimo programa [22.18]. Minimalūs šios programos reikalavimai susideda iš: a) laboratorijos galimybių įrodymo, b) papildytų žymėtaisiais junginiais mėginių analizių, siekiant apskaičiuoti duomenis ir įrodyti jų kokybę, c) einamojo tinkamumo patikrinimo – standartų ir tuščių mėginių analizių. Siekiant nustatyti, ar analizių rezultatai atitinka metodo eksploatacinius parametrus, laboratorijos tinkamumas lyginamas su nustatytais darbo kokybės kriterijais. Jei metodas taikomas ne vandens mėginiams (pvz.: dirvožemiui, filtro gabaliukams, kompostui, audiniams) tirti, atitinkamos pakaitinės matricos (7.6.2-7.6.5) visuose tinkamumo testuose yra pakeičiamos reagentų gaminimui skirtu vandeniu (7.6.1):

9.1.1. Analitikas turi įrodyti gebėjimą dirbant šiuo metodu gauti priimtiną glaudumą ir tikslumą. Šis gebėjimas nustatomas

9.2 punkte nurodytu būdu;

9.1.2. Atsižvelgiant į analitinės technologijos pažangą ir siekiant sudaryti galimybę tyrėjui įveikti mėginio matricos trukdžius, leidžiamas tam tikras pasirinkimas gerinant atskyrimą ar mažinant matavimų kainas. Leidžiama keisti ekstrahavimo, koncentravimo, gryninimo procedūras, keisti kolonėles ir detektorius. Draudžiama keisti nustatymo metodą ar daryti pakeitimus, mažinančius metodo tinkamumą. Jei yra naudojama kitokia nei šiame metode nurodyta analizinės įranga, tai pakeisto tyrimo būdo specifiškumas dominančioms analitėms turi būti toks pat ar geresnis nei aprašyta šiame metode:

9.1.2.1. kiekvieną kartą modifikuojant šį metodą tyrėjas turi pakartoti 9.2 punkte apibūdintą procedūrą. Jei pakeitimai paveiks metodo aptikimo ribą, laboratorija turi įrodyti, kad metodo aptikimo riba (MDL) (40 CFR Part 136, Appendix B) yra mažesnė nei 1/3 nustatyto normatyvo lygio ar lygi vienai trečiajai šio metodo minimalaus lygio (ML), priklausomai nuo to, kuris yra didesnis. Jei pakeitimai paveiks kalibravimą, tyrėjas privalo pakartotinai kalibruoti prietaisą (žr. 10 punktą);

9.1.2.2. laboratorija turi išsaugoti šio metodo modifikavimo įrašus. Šiuose įrašuose turi būti:

9.1.2.2.1. tyrėjų, atlikusių analizes ir modifikavimą, bei kokybės kontrolės pareigūno, atliksiančio analizių ir modifikacijų patikrą, liudijimas ir taip pat šių asmenų pavardės, pareigos, adresai, telefonų numeriai;

9.1.2.2.2. nustatytų teršalų pavadinimai ir CAS registro numeriai;

9.1.2.2.3. modifikavimo argumentai;

9.1.2.2.4. visų kokybės kontrolės testų, atliktų modifikuoto metodo palyginimui su šiuo metodu, rezultatai:

kalibravimas (žr. 10.5 – 10.7 punktus);

kalibravimo patikra (žr. 15.3 punktą);

pradinis glaudumas ir išgava (žr. 9.2 punktą);

žymėtojo junginio išgava (žr. 9.3 punktą);

tuščiųjų mėginių analizės (žr. 5 punktą);

tikslumo įvertinimas (žr. 9 punktą);

9.1.2.2.5. duomenys, kurie leistų nepriklausomam ekspertui patvirtinti kiekvieną analizę, pradedant prietaiso išvesties informacija (smailės aukštis, plotas ar kitas signalas) ir baigiant galutiniu rezultatu:

mėginio numeris ir kiti identifikatoriai;

ekstrahavimo data;

analizių data ir laikas;

analizės seka (procedūrų chronologiją);

mėginio svoris ar tūris (11);

ekstrakto tūris prieš kiekvieną valymo pakopą (13);

ekstrakto tūris po kiekvienos valymo pakopos (13);

galutinis ekstrakto tūris prieš įvedimą (14);

įleidimo tūris (14.3);

atskirai mėginio ir ekstrakto skiedimo duomenys (17.5);

prietaisas ir eksploatacijos sąlygos;

kolonėlė (matmenys, skystoji fazė, jos kietasis laikiklis, sluoksnio storis ir t. t);

eksploatavimo sąlygos (temperatūra, temperatūros programa, debitai);

detektoriai (tipas, eksploatavimo sąlygos ir t. t.);

chromatogramos, spausdintuvo įrašai ir kiti pirminių duomenų įrašai;

skaičiavimo protokolai, duomenų sistemos išvesties informacija ir kiti duomenys, siejantys pirminius duomenis su pateiktais rezultatais;

9.1.3. Siekiant įrodyti, kad visos naudojamos medžiagos neužterštos, būtina atlikti tuščiuosius tyrimus (4.3). Tuščiojo tyrimo procedūros ir kriterijai aprašyti 9.5 ir 15.6 punktuose;

9.1.4. Siekiant kontroliuoti metodo tinkamumą, visi mėginiai turi būti papildomi žymėtaisiais junginiais. Šis testas aprašytas

9.3 punkte. Jei dėl šių papildymų gaunami nebūdingi metodo tinkamumo parametrai, mėginiai skiedžiami, siekiant gauti parametrus tarp priimtinų ribų. Skiedimo procedūros pateiktos 17.5 punkte;

9.1.5. Laboratorijoje nuolat turi būti atliekama kalibravimo patikra ir kartotinė tarpinio glaudumo ir išgavos analizė (15.1 – 15.5 punktai). Tai įrodo, kad analitinė sistema yra kontroliuojama;

9.1.6. Laboratorijoje turi būti išsaugoti įrašai, charakterizuojantys gautų duomenų kokybę. Tikslumo suvestinės parengimas aprašytas 9.4 punkte;

9.2. Pradinis glaudumas ir išgava (PGI). Siekdamas įrodyti gebėjimą gauti priimtiną glaudumą ir išgavas, tyrėjas turi atlikti šias procedūras:

9.2.1. Mažai netirpių medžiagų turintys (vandens) mėginiai. Ekstrahuojami, koncentruojami ir analizuojami keturi vieno litro tūrio reagentams gaminti skirto vandens mėginiai, papildyti skiestu žymėtojo junginio papildymo tirpalu (7.10.3) ir glaudumo ir išgavos standartu (7.14) pagal 11-18 punktuose nurodytas procedūras. Kitokioms mėginių matricoms yra naudojami keturi tų pamatinių matricų mėginiai (7.6). Šis testas turi apimti visus mėginio paruošimo (žr. 11 punktą), ekstrahavimo (žr. 12 punktą) ir gryninimo (žr. 13 punktą) etapus;

9.2.2. Iš keturių analizių serijos rezultatų, gautų taikant skiedimą izotopais su žymėtuoju analogu CDD/CDF junginiams ir naudojant vidinį standartą 1,2,3,7,8,9-HxCDD, OCDF, apskaičiuojami kiekvieno junginio koncentracijos (ng/ml) ekstraktuose vidurkis (X) ir koncentracijos (ng/ml) standartinis nuokrypis (s);

9.2.3. Kiekvieno CDD/CDF ir žymėto junginio s ir X lyginami su 6 lentelėje pateiktomis atitinkamomis pradinio glaudumo ir išgavos intervalų ribomis. Jei yra nustatomi tik 2,3,7,8-TCDD ir 2,3,7,8-TCDF, jų s ir X lyginami su 6a lentelėje pateiktomis atitinkamomis pradinio glaudumo ir išgavos intervalų ribomis. Jei visų junginių s ir X atitinka tinkamumo kriterijus, sistemos darbo parametrai yra priimtini. Gali būti pradedami tuštieji tyrimai ir mėginių analizė. Jei kai kurių junginių s viršija glaudumo ribas, o kai kurie junginių X peržengia tikslumo intervalą, sistemos tinkamumas šiam junginiui yra nepriimtinas. Problema šalinama, testas (žr. 9.2 punktą) kartojamas;

9.3. Siekiant įvertinti metodo tinkamumą mėginio matricai, visi mėginiai laboratorijoje turi būti papildomi skiestu žymėtojo junginio papildymo tirpalu (7.10.3):

9.3.1. Kiekvienas mėginys analizuojamas taikant 11 – 18 punktuose apibūdintas procedūras;

9.3.2. Taikant vidinio standarto metodą (žr. 17.2 punktą) apskaičiuojamos žymėtųjų junginių ir gryninimo standarto išgavos;

9.3.3. Kiekvieno žymėtojo junginio išgavos vertė turi patekti tarp 7 lentelėje pateiktų ribų, kai nustatomi visi CDD/CDF su pakaitalais 2,3,7,8 padėtyse, bei patekti tarp 7a lentelėje pateiktų ribų, kai nustatomi tik 2,3,7,8-TCDD ir 2,3,7,8-TCDF. Jei kurio nors junginio išgava peržengia šias ribas, metodo tinkamumas šiam junginiui tame mėginyje nėra priimtini. Siekiant įveikti šiuos sunkumus pakartotinei analizei (žr. 18.4 punktą) imami labiau praskiesti vandens mėginiai, mažesni dirvožemio, dumblo, nuosėdų ir kitų matricų kiekiai;

9.4. Turi būti įvertinta žymėtų junginių išgava mėginiuose. Visi įrašai turi būti išsaugoti:

9.4.1. Atliekamos penkios kiekvieno pateiktos matricos tipo (vandens, dirvožemio, dumblo, vaisių ar augalų audinių minkštimo ir t. t.) mėginių su žymėtaisiais junginiais analizės (žr. 9.3 punktą). Apskaičiuojamos žymėtųjų junginių išgavos (%) R ir išgavų standartiniai nuokrypiai S_R. Kiekvienai matricai priimtina išgava turi būti verčių intervale nuo R-2_SR iki R+2_SR, pvz.: atlikus penkias vaisių minkštimo analizes buvo apskaičiuota, kad R = 90 %, o S_R = 10 %. Priimtina išgava šiai matricai yra 70 – 110 % intervale;

9.4.2. Reguliariai (kas 5 – 10 matavimų) turi būti įvertinamas kiekvieno žymėtojo junginio kiekvienoje matricoje nustatymo tikslumas;

9.5. Tuščiasis tyrimas. Tuščiuoju tyrimu analizuojamos pamatinės matricos siekiant įsitikinti, kad jos netrukdo tyrimui (4.3):

9.5.1. Tuščiasis tyrimas vykdomas kiekvienai mėginių rūšiai atliekant mėginių paruošimo, ekstrahavimo, gryninimo ir koncentravimo procedūras (nerečiau kaip kartą per 12 darbo valandų arba kiekvieną kartą atlikus 20 mėginių analizę). Tuščiajam tyrimui naudojama matrica turi būti panaši į tos rūšies mėginio matricą, pvz.: vienas litras reagentų gaminimui skirto vandens (7.6.1), tuščioji daug kietų medžiagų turinti pamatinė matrica (7.6.2), tuščioji popieriaus matrica (7.6.3), tuščiasis audinys (7.6.4) ar kitokia tuščioji pamatinė matrica (7.6.5). Tuščiasis tyrimas vykdomas atlikus tarpinio glaudumo ir išgavos testą (15.5);

9.5.2. Jei tuščiuoju tyrimu nustatytas kurio nors CDD/CDF su pakaitalais 2,3,7,8 padėtyse (1 lentelė) kiekis didesnis už 2 lentelėje nurodytą minimalų kiekį ar už 1/3 nustatyto normatyvo lygio, žiūrint, kuris iš jų yra didesnis, ar jei tuščiuoju tyrimu randamas potencialiai galinčio trukdyti junginio kiekis yra artimas minimaliems chlorintų junginių kiekiams išvardytiems 2 lentelėje (tariant, kad ¹³C₁₂-1,2,3,4-TCDD, naudojamo vidiniu standartu 1 lentelėje nepaminėtų junginių nustatymui, atsako daugiklis yra lygus 1) mėginių analizė nutraukiama, kol tuščiuoju tyrimu nebebus gaunama jokių užteršimo, minėtu lygiu, įrodymų. Prieš pateikiant mėginių tyrimo rezultatus oficialiai kontrolėi turi būti tinkamai atliktas tuščiasis tyrimas;

9.6. Kokybės kontrolės (KK) mėginys. Siekiant įsitikinti kalibravimo standartų tikslumu ir bendru analitinio proceso patikimumu, periodiškai analizuojamas KK mėginys (7.16). Rekomenduojama KK mėginį analizuoti mažiausiai kartą per ketvirtį;

9.7. Šiame metode pateiktos specifikacijos yra tinkamos, jei naudojami tinkamai kalibruoti prietaisai. Siekiant gauti tikslius rezultatus, turi būti naudojami vienodi standartai kalibravimui (žr. 10 punktą), kalibravimo patikrai (žr. 15.3 punktą), pradiniam (žr. 9.2 punktą) ir tarpiniam (žr. 15.5 punktą) glaudumui ir išgavai nustatyti. Su DCh/ MS įrenginiu bus gaunami geriau atkuriami rezultatai, jei bus sudaroma šiam metodui reikiama CDD/CDF junginių analizės aplinka ir sąlygos;

9.8. Priklausomai nuo poreikių, siekiant nustatyti mėginių paėmimo metodo glaudumą gali būti atliekami kartotiniai mėginių paėmimai, o naudojant vidinį standartą analizės tikslumui nustatyti, gali būti reikalingi papildyti mėginiai.

10. Kalibravimas:

10.1. Parenkamos darbo sąlygos, būtinos pasiekti mažiausias vidinio standarto (žr. 10.2.4 punktą) sulaikymo trukmes ir santykines CDD ir CDF sulaikymo trukmes (2 lentelė);

10.1.1. Rekomenduojamos dujų chromatografo darbo sąlygos:

įleidimo įrenginio temperatūra – 270°C;

sąsajos įtaiso temperatūra – 290°C;

pradinė temperatūra – 200°C;

pradinės temperatūros palaikymo trukmė – 2 min.;

temperatūros keitimo programa:

nuo 200°C iki 220°C – 5°C/min. sparta;

220°C 16 min.;

nuo 220°C iki 235°C – 5°C/min. sparta;

235°C 7 min.;

nuo 235°C iki 330°C – 5°C/min. sparta.

PASTABA. Siekiant išvengti mažiau lakių junginių kondensacijos analizės metu, visos kolonėlės dalys, jungiančios DCh su jonų šaltiniu, turi būti aukštesnėje temperatūroje nei sąsajos įtaiso temperatūra, nurodyta 10.1.1 punkte. Parenkamos geriausios DCh junginių atskyrimo sąlygos ir geriausias jautris. Tos pačios DCh sąlygos turi būti naudojamos visų standartų, tuščiųjų mėginių, PGI, TGI alikvočių, ir tiriamųjų mėginių analizei;

10.1.2. Masių spektrometro skiriamoji geba. Įleidus CDD ir CDF junginių standartus kiekvieną atskirai arba jų mišinio dalį be trukdančiųjų medžiagų tarp glaudžiai eliujuojamų komponentų, gaunamas kiekvienos analitės (3 lentelė) atskirtų jonų profilis (AJP) esant dviem tikrosioms m/z vertėms (8 lentelė) kai sklaidos galia 10000 ar didesnė:

10.1.2.1. esant CDD ir CDF junginių analizės trukmei didelei, masės dreifas gali įtakoti rimtus spektrometro veikimo efektus, todėl būtina masės dreifo pataisa. Dreifo pataisai, kaip pamatinei masei naudojamas m/z, gautas iš PFK smailės. Pamatinis m/z priklauso nuo tikrųjų m/z, užregistruotų kiekviename deskriptoriuje, kaip parodyta 8 lentelėje. DSGMS analizės metu turi būti parenkamas toks PFK kiekis, kad intensyviausio išskirto pamatinio m/z amplitudė (nepaisant deskriptoriaus numerio) neviršytų 10 % prietaiso detektoriaus matavimo skalės diapazono. Tokiomis sąlygomis gali būti efektyviau kontroliuojami jautrio pokyčiai, atsirandantys analizės metu.

PASTABA. PFK (ar kitos palyginamosios medžiagos) perteklius gali būti problemų, susijusių su signalo iškraipymu, jonų šaltinio užteršimo ir jo dažno valymo priežastimi;

10.1.2.2. jei analizės metu yra galimybė sekti DSGMS skiriamąją gebą, rekomenduojama analizę baigti, kai skiriamoji geba sumažėja iki 10000, siekiant sutaupyti laiką pakartotinės analizės sąskaita;

10.1.2.3. naudojant PFK, instrumentas sureguliuojamas siekiant gauti minimalią reikiamą 10000 skiriamąją gebą (10 % įduba) esant 304,9824 m/z (PFK) arba kokiam nors kitam palyginamajam signalui artimam 304 m/z (iš TCDF). Kiekvieno deskriptoriaus (8 lentelė) visame masių intervale gaunama ir užregistruojama skiriamoji geba ir 3 – 5 palyginamųjų smailių tikrieji m/z. Skiriamoji geba turi būti 10000 ar didesnė ir kiekvieno patikrinto tikrojo m/z nuokrypis nuo teorinio m/z (8 lentelė) turi būti mažesnis nei 5 mg/kg;

10.2. Jonų intensyvumų santykiai, minimalūs lygiai, signalo ir trukdžio santykiai ir absoliučios sulaikymo trukmės. Pagal DSGDCh/DSGMS instrumento galimybes įleidžiama 1 µl ar 2 µl KS1 kalibracinio tirpalo (4 lentelė). Taikomos 10.1.1 punkte nurodytos DCh sąlygos. Jei nustatomi tik 2,3,7,8,-TCDD ir 2,3,7, 8-TCDF taikomos tik minėtų junginių analizės ir techninės sąlygos:

10.2.1. Išmatuojamas kiekvienos analitės AJP plotas, apskaičiuojamas jonų kiekių santykiai kiekvienai tikrajai m/z vertei nurodytai 8 lentelėje. Apskaičiuotasis santykis palyginamas su teoriniu pateitu 9 lentelėje:

10.2.1.1. užregistruojamos kiekviename deskriptoriuje išvardytos (8 lentelė) tikrosios m/z vertės. Siekiant garantuoti, kad nustatomi visi CDD/CDF, kiekviena grupė ar deskriptorius turėtų būti registruojami iš eilės kaip DCh sulaikymo trukmės funkcija. Papildomai gali būti registruojami m/z kiekviename deskriptoriuje. Jei laboratorija gali registruoti m/z visų CDD/ CDF, kurie gali būti eliuuoti iš DCh tam tikrame sulaikymo trukmės intervale, tuomet m/z gali būti padalyti į daugiau nei penkis deskriptorius išvardytus 8 lentelėje. Jei nustatomi tik 2,3,7,8-TCDD ir 2,3,7,8-TCDF, deskriptoriai gali būti modifikuoti siekiant apimti tik tikrąsias tetraizomerų, pentaizomerų ir difenilų eterių m/z vertes ir pamatinius m/z;

10.2.1.2. siekiant gauti pamatinius m/z, masių spektrometras turi veikti masių dreifo kompensacijos režimu, naudojant PFK. 8 lentelėje išvardyti pamatiniai m/z visoms m/z verčių grupėms. Turi būti registruojama kiekviena pamatinė masė ir ji negali keistis daugiau nei ± 20 % visame atitinkamame sulaikymo trukmės intervale. Pamatinės masės nukrypimas daugiau nei 20 % reiškia kartu eliuojamų priemaišų buvimą. Tai gali ženkliai sumažinti masių spektrometro jautrumą. Pakartotinis mėginio įvedimas problemos neišspręs. Siekiant pašalinti trukdžius, gali tekti papildomai gryninti ekstraktą;

10.2.2. Visi CDD/CDF ir žymėtieji junginiai KS1 standarte turi atitikti KK reikalavimus (9 lentelė) atitinkamam jonų kiekių santykiui; priešingu atveju turi būti sureguliuotas masių spektrometras ir šis testas kartojamas, kol m/z santykis pateks tarp nurodytų ribų. Jei po sureguliavimo pasikeičia skiriamoji geba, prieš testo pakartojimą ji turi būti patikrinama (žr.

10.1.2 punktą);

10.2.3. Patikrinama, ar DSGDCh/DSGMS atitinka 2 lentelėje nurodytus minimalius lygius. KS1 kalibracinio standarto CDD, CDF ir žymėtųjų junginių smailių signalo/trukdžių santykiai turi būti didesni arba lygus 10,0. Priešingu atveju, prietaisas reguliuojamas ir testas kartojamas kol pasiekiami 2 lentelėje nurodyti minimalūs lygiai;

10.2.4. ¹³C₁₂-1,2,3,4-TCDD tikroji sulaikymo trukmė (žr. 7.12 punktą) naudojant DB-5 kolonėlę turi viršyti 25,0 min., o naudojant DB-225 kolonėlę turi viršyti 15 min. Priešingu atveju DCh temperatūros programa turi būti reguliuojama ir šis testas kartojamas kol bus gautos minėtos sulaikymo trukmės;

10.3. Taikant optimizuotą temperatūros programą (žr. 10.1 punktą), išanalizuojami sulaikymo trukmės intervalą apibūdinantys mišiniai (žr. 7.15 punktą). 5 lentelėje pateikta sulaikymo trukmės intervalą apibūdinančių junginių eliuavimo seka (pirmas- paskutinis). Šio testo nereikia atlikti jei analizuojami tik 2,3,7,8-TCDD ir 2,3,7,8-TCDF;

10.4. Specifiškumas izomerams:

10.4.1. Taikant procedūrą, aprašytą 14 punkte, ir optimizuotas mėginio analizės sąlygas (žr. 10.1.1 punktą), atliekama izomerų specifiškumo standarto (7.15) analizė;

10.4.2. Apskaičiuojamas įdubos aukščio procentas tarp DCh smailių, gautų arčiausia 2,3,7,8-TCDD ir TCDF izomerų, kaip parodyta 6 pav. ir 7 pav.;

10.4.3. Patikrinama, ar įdubos aukščio procentas tarp DCh smailių, gautų arčiausia 2,3,7,8-izomerų smailių, yra mažesnis nei 25 % (apskaičiuotas pagal formulę 100 x X/Y kaip parodyta 6 ir 7 pav.). Jei įdubos aukštis viršija 25 %, derinamos analizės sąlygos ir kartojamas testas arba pakeičiama kolonėlė ir kalibruojama iš naujo (žr. 10.1.2 – 10.7 punktus);

10.5. Nustatant 15 CDD ir (ar) CDF 2,3,7,8-izomerų, taikomas kalibravimas izotopų skiedimu, kai prieš ekstrahavimą į mėginį pridedama žymėtųjų junginių. Palyginamieji junginiai kiekvienam CDD ir CDF junginiui išvardyti 2 lentelėje:

10.5.1. Kiekvienam tiriamam junginiui sudaromos kalibracinės kreivės, apimančios visą tiriamos koncentracijos intervalą. Santykinė atsako (SA) (žymėtojo junginio: natyvaus junginio) vertė atidedama prieš standartinio tirpalo koncentraciją arba skaičiuojama taikant linijinę regresiją. Santykinis atsakas nustatomas taikant toliau aprašytą procedūrą. Naudojami penki kalibraciniai taškai;

10.5.2. Kiekvieno kalibracinio standarto kiekvieno CDD ir CDF ir jų atitinkamų žymėtųjų analogų atsakų santykis nustatomas naudojant pirminių ir antrinių tikrųjų m/z, išvardytų 8 lentelėje, plotus taikant formulę:

kuroje:

A₁n ir A2_n – CDD ir (ar) CDF pirminių ir antrinių m/z plotai,

A1₁ ir A2₁ – žymėtųjų junginių pirminių ir antrinių m/z plotai,

C₁ – žymėtojo junginio koncentracija kalibraciniame tirpale (4 lentelė),

C_n – natyvaus junginio koncentracija kalibraciniame tirpale (4 lentelė);

10.5.3. Siekiant sukalibruoti analitinę sistemą izotopų skiedimo būdu, įleidžiami KS1 – KS5 (7.13 punktas ir 4 lentelė) kalibracinių standartų tūriai lygus tūriui pasirinktam 10.2 punkte. Taikoma procedūra, aprašyta 14 punkte, ir sąlygos, nurodytos 10.1.1 punkte ir 2 lentelėje. Apskaičiuojami SA esant kiekvienai koncentracijai;

10.5.4. Linijiškumas. SA vertė taikoma junginiui, jei ji yra pastovi visų penkių kalibracinių taškų intervale (variacijos koeficientas mažesnis nei 20 %), priešingu atveju kalibravimas šiuo junginiu atliekama naudojant daugiau nei penkis kalibracinius taškus;

10.6. Kalibravimas su vidiniu standartu. Vidinio standarto metodas taikomas nustatant 1,2,3,7,8,9-HxCDD (žr. 17.1.2 punktą), OCDF (žr. 17.1.1 punktą) ir junginius neturinčius pakaitalų prie 2, 3, 7 ir 8 atomų, o taip pat nustatant žymėtuosius junginius tarplaboratorinių tyrimų tikslams (žr. 9.4 ir 15.5.4 punktus):

10.6.1. Atsako daugiklis: kalibruojant būtina nustatyti atsako daugiklį (RF), aprašomą šia formule:

kurioje:

A1_s ir A2_s – CDD ir (ar) CDF pirminių ir antrinių m/z plotai,

A1_is ir A2_is – vidinio standarto pirminių ir antrinių m/z plotai,

C_is – vidinio standarto koncentracija (žr. 4 lentelę),

C_s – junginio koncentracija kalibraciname standarte (žr. 4 lentelę).

PASTABA. Egzistuoja tik vienas junginio ³⁷Cl₄-2,3,7,8-TCDD m/z (žr. 8 lentelę);

10.6.2. Siekiant sukalibruoti analitinę sistemą vidinio standarto būdu, įleidžiama po 1,0 miul ar po 2,0 µl kalibracinių standartų KS1 – KS5 (žr. 7.13 punktą ir 4 lentelę). Taikoma procedūra, aprašyta 14 punkte, ir sąlygos, nurodytos 10. 1.1 punkte ir 2 lentelėje. Apskaičiuojamas atsako daugiklis esant kiekvienai koncentracijai;

10.6.3. Linijiškumas – atsako daugiklio vertė taikoma junginiui, jei ji yra pastovi visų penkių kalibracinių taškų intervale (variacijos koeficientas mažesnis nei 35 %), priešingu atveju kalibravimas šiuo junginiu atliekama naudojant daugiau nei penkis kalibracinius taškus;

10.7. Mišrus kalibravimo būdas – siekiant gauti kalibracines kreives mišriu izotopų skiedimo ir vidinio standarto būdu, gali būti taikoma viena analizių serija, naudojant CDD ir (ar) CDF, žymėtųjų junginių ir vidinių standartų kalibracinius tirpalus (žr. 7.13 ir 4 lentelę). Gautos kreivės patikrinamos (žr. 15.5 punktą) išanalizuojant kalibravimo patikrinimo standartą (KPS, 4 lentelė). Pakartotinis kalibravimas atliekamas, jei bent vienas iš kalibravimo patikrinimo kriterijų (žr. 15.3 punktą) neįvykdomas;

10.8. MS duomenys turi būti kaupiami, registruojami ir saugomi:

10.8.1. Kiekvieno tikrojo m/z signalo duomenys per visą kontrolės periodą turi būti kaupiami duomenų saugojimo įrenginyje;

10.8.2. Duomenų sistema turi būti naudojama kalibravimo duomenims ir atsako daugikliams dokumentuoti ir jų registrui palaikyti. Santykinio standartinio nuokrypio skaičiavimai (variacijos koeficientas) naudojami kalibravimo linijiškumui tikrinti. Statistiniai duomenys tiek apie pradinį tinkamumą (žr. 9.2 punktą) tiek ir apie tarpinį tinkamumą (žr. 15.5 punktą) apskaičiuojami ir eksploatuojami su prietaiso duomenų apdorojimo sistema ar atskiru kompiuteriu.

11. Mėginių paruošimas:

11.1. Mėginių paruošimo esmė – mėginio fizinės formos pakeitimas siekiant veiksmingo CDD/CDF junginių ekstrahavimo. Kad butų galima atlikti efektyvų ekstrahavimą mėginys paprastai turi būti skystame arba smulkių kietų dalelių pavidale. 10 lentelėje pateikti įvairių mėginių matricų pavyzdžiai, fazės ir ekstrahavimui rekomenduojamas mėginio kiekis.

Žinant ar įtariant, kad mėginiuose yra dideli CDD/CDF junginių kiekiai, turi būti naudojamas mažiausias, visam mėginiui tipingas, mėginio kiekis (žr. 17.5 punktą).

Visi mėginiai tuščiajam tyrimui, pradinio glaudumo ir išgavos ir (ar) tarpinio glaudumo ir išgavos testui atrinkti turi būti apdorojami taip pat, kaip mėginys, skirtas įvertinti galimą užteršimą ir nuostolius mėginių paruošimo metu:

11.1.1. Mėginiuose, turinčiuose dalelių, kietų medžiagų kiekis ir dalelių dydis nustatomi taikant 11.2 ir 11.3 punktuose nurodytas procedūras;

11.1.2. Vandens mėginių paruošimas priklauso nuo netirpių medžiagų kiekio mėginyje, kadangi suspenduotose dalelėse gali būti CDD/CDF junginių:

11.1.2.1. vandens mėginiai, kuriuose nėra pastebimų dalelių, ruošiami pagal 11.4 punkte aprašytą procedūrą ir ekstrahuojami tiesiogiai naudojant dalomąjį piltuvą ar taikant KFE metodą (žr. 12.1 ar 12.2 punktus);

11.1.2.2. vandens mėginiai, kuriuose yra pastebimų dalelių, o netirpių medžiagų yra 1 % ar mažiau, ruošiami taikant 11.4 punkte aprašytą procedūrą. Po paruošimo mėginiai ekstrahuojami tiesiogiai taikant KFE metodą (žr. 12.2 punktą) arba filtruojami (žr. 11.4.3 punktą). Po filtravimo dalelės ir filtras ekstrahuojami taikant SDS procedūrą (žr. 12.3 punktą), o filtratas ekstrahuojamas naudojant dalomąjį piltuvą (žr. 12.1 punktą);

11.1.2.3. vandens mėginių, kuriuose yra daugiau nei 1 % netirpių medžiagų, imama 10 g kietų medžiagų atitinkanti mėginio dalis (žr. 11.5 punktą);

11.1.3. Kieti mėginiai ruošiami pagal 11.5 punkte nurodytą procedūrą. Po to ekstrahuojama SDS metodu (žr. 12.3 punktą);

11.1.4. Daugiafazių mėginių fazė su CDD/CDF junginiais atskiriama, taikant slėginį filtravimą arba centrifugavimą (žr. 11.6 punktą). CDD/CDF junginiai būna daugiafazių mėginių organinėje fazėje;

11.1.5. Įvairių fazių mėginių smulkinimo, homogenizavimo ir išmaišymo procedūros apibūdintos 11.7 punkte;

11.1.6. Audinių paruošimo procedūros aprašytos 11.8 punkte; 11.2. Netirpių (kietų) medžiagų kiekio nustatymas:

PASTABA. Šioje dalyje pateikiamas netirpių medžiagų kiekio nustatymas mėginyje, bet ne CDD/CDF junginių kiekių nustatymas.

11.2.1. Vandenyje ir daugiafaziuose mėginiuose, kurių pagrindą sudaro vandeninė fazė:

11.2.1.1. išdžiovinamas ir 0,001 g tikslumu pasveriamas GF/D filtras (6.5.3);

11.2.1.2. filtruojama 10,0 ml ± 0,02 ml gerai išmaišyto mėginio;

11.2.1.3. filtras džiovinamas mažiausiai 12 valandų 110°C ± 5°C temperatūroje ir atvėsinamas eksikatoriuje;

11.2.1.4. netirpių medžiagų kiekis (%) skaičiuojamas taikant formulę:

kurioje

a – filtro masė gramais,

b – mėginio dalies masė gramais po džiovinimo;

11.2.2. Nevandeniuose skysčiuose, kietuose, pusiau kietuose, daugiafaziuose mėginiuose, kurių pagrindą sudaro nevandeninė fazė:

11.2.2.1. stiklinėje (atmetus indo svorį) 0,001 g tikslumu pasveriama 5 g – 10 g mėginio;

11.2.2.2. džiovinama mažiausiai 12 valandų 110°C ± 5°C temperatūroje ir atvėsinama eksikatoriuje;

11.2.2.3 netirpių medžiagų kiekis (%) skaičiuojamas taikant formulę:

kurioje

a – mėginio dalies masė gramais prieš džiovinimą,

b – mėginio dalies masė gramais po džiovinimo;

11.3. Dalelių dydžio nustatymas:

11.3.1. Išdžiovintas mėginys (žr. 11.2.2.2 punktą) paskleidžiamas traukos spintoje ar bokse ant gabalėlio filtrinio popieriaus ar aliuminio folijos;

11.3.2. Įvertinamas mėginio dalelių dydis. Jei didžiausios dalelės yra didesnės nei 1 mm, prieš ekstrahavimą (žr. 11.7 punktą) jos turi būti susmulkintos iki 1 mm ar mažesnio dydžio;

11.4. Vandens mėginių, kuriuose yra 1 % ir mažiau suspenduotų netirpių medžiagų, paruošimas:

11.4.1. Vandens mėginiai, kuriuose nėra pastebimų dalelių, ruošiami taikant toliau pateiktą procedūrą ir ekstrahuojami iš karto naudojant dalomąjį piltuvą ar taikant KFE metodą (žr. 12.1 ar 12.2 punktus). Vandens mėginiai, kuriuose yra pastebimų dalelių, o netirpių suspenduotų medžiagų yra 1 % ar mažiau, ruošiami taikant toliau pateiktą procedūrą. Po paruošimo mėginiai ekstrahuojami arba taikant KFE metodą (žr. 12.2 punktą), arba filtruojami (žr. 11.4.3 punktą). Po filtravimo dalelės ir filtras ekstrahuojami taikant SDS procedūrą (žr. 12.3 punktą), o filtratas ekstrahuojamas naudojant dalomąjį piltuvą (žr. 12.1 punktą). Po KFE procedūros atliekamas filtro ir plokštelės SDS ekstrahavimas;

11.4.2. mėginio ir KK mėginio paruošimas:

11.4.2.1. ant butelio su mėginiu pažymimas tikras mėginio lygis ir pasveriama 1 g tikslumu;

11.4.2.2. į butelį įpilamas 1,0 ml skiesto papildymo žymėtaisiais junginiais tirpalo (7.10.3). Butelis užsukamas, mėginys gerai išmaišomas rūpestingai purtant. Mėginys paliekamas 1-2 valandas nusistovėti, retkarčiais papurtant;

11.4.2.3. pradedant kiekvieno mėginio ar mėginių serijos (nedaugiau 20 mėginių), kurie bus išekstrahuojami per 12 valandų, tyrimą, į švarius butelius ar kolbas įpilamos dvi reagentams gaminti skirto vandens porcijos po 1,0 l;

11.4.2.4. į abu butelius su vandeniu įpilama po 1,0 ml skiesto žymėtųjų junginių papildymo tirpalo (7.10.3). Vienas iš šių vandens mėginių bus naudojamas tuščiajam tyrimui;

11.4.2.5. į kitą butelį su vandeniu įpilamas 1,0 ml pradinio glaudumo ir išgavos standarto (7.14). Šis vandens mėginys bus naudojamas tarpiniam glaudumo ir išgavos testui (žr. 15.5 punktą);

11.4.2.6. jei yra taikomas KFE, į mėginį įpilami 5 ml metanolio, butelis užsukamas ir purtomas. Po to ekstrahuojama (žr. 12.2 punktą). Jei KFE netaikomas, ir mėginyje nėra pastebimų dalelių, ekstrahuojama pagal 12.1 punktą. Jei KFE netaikomas ir mėginyje yra pastebimų dalelių, filtruojama kaip nurodyta 11.4.3 punkte.

11.4.3. Dalelių filtravimas:

11.4.3.1. Buchner piltuvas (6.5.5) sujungiamas su švaria filtravimo kolba. Prie kolbos prijungiamas vakuumas, mėginys filtruojamas per Buchner piltuve esantį stiklo pluošto filtrą (6.5.6), kaskart pasukant butelyje likusį mėginį;

11.4.3.2. siekiant, kad visos butelyje likusios dalelės butų išpiltos ant filtro, butelis skalaujamas dviem apytiksliai 5 ml švaraus vandens porcijomis;

11.4.3.3. Buchner piltuvo kraštai skalaujami nedideliu švaraus vandens kiekiu;

11.4.3.4. tuščias butelis pasveriamas 1 g tikslumu. Mėginio svoris apskaičiuojamas pagal svorių skirtumą. Butelis išsaugomas vėlesniam naudojimui;

11.4.3.5. filtratas ekstrahuojamas dalomajame piltuve (žr. 12.1 punktą);

11.4.3.6. filtras su dalelėmis ekstrahuojamas pagal 12.3 punkte aprašytą SDS procedūrą;

11.5. Mėginių, kuriuose yra daugiau nei 1 % netirpių medžiagų, paruošimas:

11.5.1. Į švarią stiklinę ar stiklinį indą pasveriama gerai išmaišyto 10 g kietų medžiagų atitinkanti mėginio dalis (kietų medžiagų kiekio nustatymą žr. 1.2 punkte);

11.5.2. Į mėginį įpilamas 1,0 ml skiesto žymėtųjų junginių papildymo tirpalo (7.10.3);

11.5.3. Ruošiant analizei kiekvieną mėginį ar mėginių seriją (daugiausia 20 mėginių), kurie bus išekstrahuoti per 12 val., į švarias stiklines ar stiklinius indus pasveriamos dvi po 10 g atitinkamų pamatinių matricų (7.6) porcijos;

11.5.4. Į kiekvieną pamatinės matricos alikvotę įpilama 1,0 ml skiesto žymėtųjų junginių papildymo tirpalo (7.10.3). Viena iš šių alikvočių bus naudojama tuščiajam tyrimui. Į kitą įpilamas 1,0 ml pradinio glaudumo ir išgavos standarto (7.14). Ši alikvotė bus naudojama tarpiniam glaudumo ir išgavos testui (žr. 15.5 punktą);

11.5.5. Alikvotės išmaišomos ir paliekamos 1 – 2 valandoms nusistovėti;

11.5.6. Vandens perteklius nupilamas. Jei būtina pašalinti visą vandenį, mėginys filtruojamas per stiklo pluošto filtrą, o vandeninis skystis išpilamas;

11.5.7. Jei mėginyje esančios dalelės yra didesnės nei 1 mm (nustatoma taikant 11.3.2 punkte apibūdintą procedūrą), mėginys paskleidžiamas ant švarios aliuminio folijos traukos spintoje. Išdžiovintas mėginys susmulkinamas (žr. 11.7 punktą);

11.5.8. Mėginys ir KK alikvotė ekstrahuojami taikant SDS procedūrą (žr. 12.3 punktą);

11.6. Daugiafazių mėginių paruošimas:

11.6.1. Pagal nustatytą kietų medžiagų kiekį (žr. 11.2.1 ar 11.2.2 punktus) apskaičiuojamas mėginio tūris, atitinkantis 10 g kietos medžiagos, bet ne daugiau 1 l mėginio;

11.6.2. Naudojant vakuuminio filtravimo įrangą pagal 11.6.1 punktą apskaičiuotas mėginio tūris filtruojamas per Whatman GF/D stiklo pluošto filtrinį popierių (6.5.3). Mėginiai, skirti tuščiajam tyrimui ir tarpinio glaudumo ir išgavos testui filtruojami per GF/D filtrinį popierių.. Jei būtina atskirti fazes ir (ar) nusodinti kietas netirpias medžiagas, prieš filtravimą, mėginiai centrifuguodami;

11.6.3. Vandeninė fazė (jei yra) išpilama. Bet koks nevandeninis skystis, viso mėginio (žr. 11.6.1 punktą) ar mėginio dalies, atitinkančios10 g kietos medžiagos (priklausomai nuo to, kuris yra mažesnis), nupilamas ir atidedamas vėlesniam sumaišymui su kietąja faze (žr. 12.3.5 punktą);

11.6.4. Jei mėginyje esančios dalelės yra didesnės nei 1 mm (žr. 11.3.2 punktą), o patį mėginį galima išdžiovinti, mėginys ir KK alikvotė paskleidžiami ant švarios aliuminio folijos traukos spintoje. Išdžiovinti mėginiai, o tais atvejais, kai mėginių išdžiovinti negalima, dalelės smulkinamos pagal 11.7 punkte pateiktas procedūras bei ekstrahuojamos taikant SDS procedūrą (žr. 12.3 punktą). Nesant didesnių nei 1 mm dalelių, mėginys ir KK alikvotės ekstrahuojami ir filtruojami iš karto taikant SDS procedūrą (žr. 12.3 punktą);

11.7. Mėginių malimas, homogenizavimas ar smulkinimas. Mėginiai, kurių dalelės didesnės nei 1 mm (žr. 11.3.2 punktą) yra smulkinami, homogenizuojami. Dalelių smulkinimo metodas pasirenkamas priklausomai nuo matricos. Dažniausiai kietos dalelės smulkinamos grūstuvėje. Minkštesnės dalelės gali būti smulkinamos Wiley malūnu, mėsmale, homogenizatoriumi ar smulkintuvu:

11.7.1. Prieš pradedant rutininius tyrimus, kiekviena bet kokios matricos smulkinimo procedūra turi būti patikrinta testais (žr. 9.2 punktą);

11.7.2. Siekiant išvengti darbo aplinkos užteršimo, malimas, homogenizavimas ar smulkinimas turi būti atliekami bokse ar traukos spintoje;

11.7.3. Popieriai, minkštimai, suspensijos, amorfinės kietos medžiagos gali būti smulkinamos Wiley malūnu ar didelio galingumo mėsmale. Kai kuriais atvejais, siekiant sumažinti mėginio temperatūrą, malimo metu gali būti taikomas šaldymas sausu ledu ar skystu azotu. Mėginiai (žr. 11.5.7 ar 11.6.4 punktus), tuštieji mėginiai ir pamatinės matricos malami švariame malūne. Mėginio temperatūra neturi pasiekti 50°C temperatūros;

11.7.4. Nepakankamai malimo metu susmulkintos dalelės (didesnės nei 1 mm) gali būti smulkinamos didelės spartos homogenizatoriumi ar smulkintuvu. Homogenizuojamos ar smulkinamos mėginių, mėginių, skirtų tuščiajam tyrimui ar tarpinio glaudomo ir išgavos testams, bei filtrų (žr. 11.5.7 ar 11.6.4 punktus) dalelės;

11.7.5. Mėginiai ekstrahuojami taikant SDS procedūrą (žr. 12.3 punktą);

11.8. Audininių paruošimas. Prieš apdorojant audinių mėginius turi būti nuspręsta, kurie audiniai bus analizuojami. Išaiškinus reikiamus organus, mėginys turi būti homogenizuojamas:

11.8.1. Homogenizavimas:

11.8.1.1. geriausia homogenizuoti sušaldytus mėginius. Jei, siekiant išimti reikiamus audinius, būtina žuvį išskrosti, nepanaudoti audiniai gali būti nedelsiant vėl užšaldomi ir saugomi švariame stikliniame inde vėlesniam naudojimui;

11.8.1.2. kiekvienai analizei reikia 10 g audinio (natūralaus drėgnio). Todėl turi būti homogenizuojama mažiausiai 20 g audinio tam atvejui, jei prireiktų pakartotinės mėginio analizės. Jei reikia analizuoti visą žuvį, homogenizuojama visa žuvis;

11.8.1.3. mėginys homogenizuojamas audinių homogenizatoriumi (6.3.3) ar malamas mėsmale (6.3.4). Stambūs gabalai prieš malimą supjaustomi į smulkesnius. Siekiant užtikrinti homogeniškumą, malama tris kartus;

11.8.1.4. apytiksliai 10 g homogenizuoto audinio (natūralaus drėgnio) perkeliama į pasvertą švarią 400 ml-500 ml talpos stiklinę. Papildomai hidrolizei (ekstrahavimui su HCl) audinys perkeliamas į švarų pasvertą 500 ml – 600 ml talpos plačiagurklį butelį;

11.8.1.5. likęs homogenizuotas audinys perkeliamas į švarų indą su dangteliu su fluoropolimerine tarpine. Indas uždengiamas, audinys laikomas žemesnėje nei -10°C temperatūroje. Nehomogenizuoti audiniai sudedami į pradinę pakuotę ir laikomi žemesnėje nei -10°C temperatūroje;

11.8.2. KK alikvotės paruošimas:

11.8.2.1. tuščiajam tyrimui į 400 ml – 500 ml talpos stiklinę įpilama apie 10 g aliejinio skysčio pamatinės matricos (7.6.4). Papildomai hidrolizei (ekstrahavimui su HCl) pamatinė matrica perkeliama į švarų 500 ml – 600 ml talpos plačiagurklį butelį. Svoris užrašomas 10 mg tikslumu;

11.8.2.2. ruošiant glaudumo ir išgavos alikvotę, į atskirą 400 ml-500 ml talpos stiklinę ar plačiagurklį butelį (priklausomai nuo pasirinktos ekstrahavimo procedūros) įpilama apie 10 g aliejinio skysčio pamatinės matricos (7.6.4). Svoris užrašomas 10 mg tikslumu. Jei atliekamas pradinio glaudumo ir išgavos testas, imamos keturios alikvotės, jei atliekamas tarpinio glaudumo ir išgavos testas, imama viena alikvotė;

11.8.3. Mėginio papildymas:

11.8.3.1. mėginys, tuščiojo tyrimo mėginys ir alikvotė, skirta tarpinio glaudumo ir išeigos testui, papildoma 1,0 ml skiesto papildymo žymėtaisiais junginiais tirpalo (7.10.3);

11.8.3.2. alikvotė, naudojama tarpinio glaudumo ir išgavos testui, papildoma 1,0 ml glaudumo ir išgavos standartinio tirpalo (7.14);

11.8.4. Alikvotės ekstrahuojamos taikant 12.4 punkte aprašytas procedūras.

12. Ekstrahavimas ir koncentravimas:

Vandeniniai skysčiai ekstrahuojami dalomajame piltuve (žr. 12.1 punktą) ir taikant kietafazio ekstrahavimo procedūrą (žr. 12.2 punktą); kietų medžiagų, filtrų, KFE plokštelių ekstrahavimui naudojamas Soxhlet ar Dean-Stark ekstraktorius (žr. 12.3 punktą); audinių ekstrahavimui naudojamas Soxhlet ekstraktorius (žr. 12.4.1 punktą) bei taikoma hidrolizė su HCl (žr. 12.4.2 punktą). Pradiniam ekstraktų gryninimui yra naudojamas grįžtamasis ekstrahavimas rūgštimi ar hidroksidu (žr. 12.5 punktą).

Dideli ekstraktų kiekiai koncentruojami sukamajame garintuve (žr. 12.6.1 punktą), kaitinimo gaubtu (žr. 12.6.2 punktą) ar Kuderna-Danish (K-D) garintuve (žr. 13.6.3 punktą). Maži ekstraktų kiekiai koncentruojami nupučiant azotu (žr. 12.7 punktą).

12.1. Filtratų ir vandens tirpalų be pastebimų dalelių ekstrahavimas naudojant dalomąjį piltuvą:

12.1.1. Papildyti mėginiai (žr. 11.4.2.2 punktą) ar filtratai (žr. 11.4.3.5 punktą) supilami į 2 l dalomąjį piltuvą. Butelis ar kolba du kartus skalaujamas 5 ml vandens porcijomis, kurios taip pat supilamos į dalomąjį piltuvą;

12.1.2. Į tuščią butelį (žr. 12.1.1 punktą) įpilama 60 ml metileno chlorido. Butelis užsukamas ir purtant 60 sekundžių skalaujamas jo vidus. Tirpiklis perpilamas į dalomąjį piltuvą. Mėginys ekstrahuojamas purtant piltuvą 2 min. ir periodiškai išleidžiant susikaupusius tirpiklio garus. Siekiant atskirti organinį sluoksnį nuo vandeninės fazės, mišinys paliekamas nusistoti mažiausiai 10 min. Jei susidarančios emulsijos tūris užima daugiau nei vieną trečdalį tirpiklio sluoksnio, fazių atskyrimas užbaigiamas mechaninių priemonių pagalba (žr. pastabą). Metileno chlorido sluoksnis džiovinamas filtruojant jį per granuliuotą bevandenį natrio sulfatą (žr. 7.2.1 punktą). Prieš tai į tirpikliu skalautą stiklinį piltuvą įdedamas švarus stiklo pluošto filtrinis popierius. Šis piltuvas apytiksliai iki pusės užpildomas bevandenio natrio sulfato granulėmis. Filtratas surenkamas į tirpikliu skalautą koncentravimo indą (žr. 12.6 punktą).

Patirtis ruošiant vandens mėginius, kuriuose yra daug ištirpusių organinių medžiagų (pvz.: popieriaus gamyklų nutekamieji vandenys) rodo, kad mėginio parūgštinimas prieš ekstrahavimą gali sumažinti emulsijų susidarymą. Metodai, taikomi popieriaus pramonėje, rodo, kad emulsijų susidarymą galima sumažinti į 1 l nuotekų įpylus 400 ml etanolio. Vis dėlto AAV studijos įrodė, kad efektyvus gali būti mėginio skiedimas, tame tarpe ir švariu vandeniu. Mechaninės priemonės gali būti reikalingos pabaigti fazių atskyrimą. Jei naudojamas rūgštinimas ar etanolio priedas, laboratorija turi atlikti pradinius 9.2 punkte aprašytus testus panaudojant juose tas pačias priemones.

PASTABA. Jei susidaro emulsija, galutiniam fazių atskyrimui tyrėjas turi imtis mechaninių priemonių. Pasirenkamos priemonės priklauso nuo mėginio prigimties ir gali būti naudojami ultragarso vonia su ledu, NaCl priedas, fazių atskyrimo popierius, taikoma maišymas, filtravimas per stiklo vatą, centrifugavimas, ar kiti fiziniai metodai. Siekiant išvengti emulsijos susidarymo gali būti taikomas kietafazis ekstrahavimas ar kitas ekstrahavimo metodas. Gali būti taikomi ir kiti alternatyvūs metodai, tačiau jie turi atitikti 9 punkte keliamus reikalavimus;

12.1.3. Vandens mėginiai ekstrahuojami dviem 60 ml metileno chlorido porcijomis. Kiekviena porcija filtruojama per natrio sulfatą. Filtratas surenkamas į koncentravimo indą. Po trečio ekstrahavimo dalomasis piltuvas skalaujamas mažiausiai 20 ml metileno chlorido, kuris filtruojamas per natrio sulfatą bei surenkamas į koncentravimo indą. Skalaujama mažiausiai du kartus. Filtravimas per natrio sulfatą atidedamas, jei ekstraktas bus jungiamas su ekstraktu, gautu išekstrahavus daleles.

12.1.4. Ekstraktai koncentruojami taikant vieną iš 12.6 punkte pateiktų procedūrų:

12.1.4.1. jei tai yra ekstraktas mėginio, kuriame nebuvo pastebimų dalelių (žr. 11.1.2.1 punktą), galutinis koncentruoto ekstrakto tūris skiedžiamas heksanu apytiksliai iki 10 ml, perpilamas į 250 ml dalomąjį piltuvą, atliekamas grįžtamasis ekstrahavimas (žr. 12.5 punktą);

12.1.4.2. jei tai yra vandeninio filtrato ekstraktas (žr. 11.4.3.5 punktą), koncentravimas atidedamas, kol prie minėto ekstrakto bus pridėtas dalelių SDS ekstraktas (žr. 12.3.9.1.2 punktą);

12.2. KFE mėginių, kuriuose yra daugiau nei 1 % netirpių medžiagų [22.19, 22.20],:

12.2.1. Plokštelės paruošimas:

12.2.1.1. KFE plokštelė uždedama ant filtro laikiklio pagrindo (4 paveikslas) ir suvilgoma toluenu. GMF 150 filtras, pincetu laikomas virš KFE plokštelės suvilgomas toluenu ir uždedamas ant KFE plokštelės, stebint, kad tarp filtro ir plokštelės neliktų oro. Filtras ir KFE plokštelė spaustuvu sujungiami su 1 l stikliniu rezervuaru ir vakuumine filtravimo kolba;

12.2.1.2. naudojant plovimo butelį ar švirkštą, filtravimo indas skalaujamas apytiksliai 15 ml tolueno. Trumpam, kol ant piltuvo galo pasirodys keli lašai, įjungiamas vakuumas. Atjungiamas vakuumas, filtras ir plokštelė paliekami minutei pamirkti. Įjungiamas vakuumas, visas toluenas praleidžiamas per filtrą ir plokštelę. Plovimas kartojamas su apytiksliai 15 ml acetono. Filtras ir plokštelė džiovinami ore;

12.2.1.3. filtras ir plokštelė sudrėkinami apytiksliai 15 ml metanolio, paliekant minutei pamirkti. Vakuumo pagalba metanolis praleidžiamas per filtrą ir plokštelę. Ant filtro paliekamas 1 mm storio metanolio sluoksnis. Nuo šio momento iki pat ekstrahavimo pabaigos plokštelė negali būti sausa;

12.2.1.4. Filtras ir plokštelė plaunami dviem 50 ml vandens porcijomis, paliekant virš filtro leistiną vandens sluoksnį;

12.2.2. Ekstrahavimas:

12.2.2.1. į rezervuarą supilamas papildytas mėginys (žr. 11.4. 2.2 punktą), tuščiasis mėginys (žr. 11.4.2.4 punktą) ar pradinio ir tarpinio glaudumo ir išgavos alikvotė (žr. 11.4.2.5 punktą). Ekstrahavimas pradedamas įjungiant vakuumą, kuris sureguliuojamas taip, kad ekstrahavimas tęstųsi ne mažiau 10 minučių. Mėginių, kuriuose yra didelė dalelių koncentracija, filtravimas gali užtrukti aštuonias valandas ar ilgiau;

12.2.2.2. nebaigus filtravimo, mėginio butelis skalaujamas 50 ml vandens porcijomis, kurios supilamos į rezervuarą. Skalaujama vandeniu, kol pašalinamos visos pastebimos kietos dalelės;

12.2.2.3. nelaukiant filtravimo pabaigos, mažomis vandens porcijomis skalaujamas rezervuaras;

12.2.2.4. filtras ir plokštelė paliekami džiūti. Po to filtras ir plokštelė išimami ir patalpinami stiklinėje Petri lėkštelėje. Filtras ir lėkštelė ekstrahuojami pagal 12.3 punkte apibūdintą procedūrą;

12.3. Mėginių, kuriuose yra dalelių, filtrų ir (ar) plokštelių SDS ekstrahavimas:

12.3.1. Į švarią ekstrahavimo kapsulę (6.4.2.2) įpilami 5,0 g 100/200 mešų silikagelio (7.5.1.1), ant kurio užpilama 100 g kvarcinio smėlio (7.3.2).

PASTABA. Silikagelio sluoksnis ekstrahavimo metu neturi būti suardytas;

12.3.2. Kapsulė įdedama į švarų ekstraktorių. Į surinktuvą įpilama ir 200 ml-250 ml tolueno, į kolbą – 30 ml – 40 ml;

12.3.3. Stikliniai indai iš anksto ekstrahuojami toluenu. Tolueno virimas sureguliuojamas taip, kad iš kondensatoriaus į surinktuvą per sekundę išlašėtų vienas-du lašai. Įrenginys ekstrahuojamas mažiausiai tris valandas;

12.3.4. Po ekstrahavimo įrenginys atvėsinamas ir išardomas. Kapsulė skalaujama toluenu ir džiovinama ore;

12.3.5. Drėgnas mėginys, filtras ir (ar) plokštelė (žr. 11.4.3.6, 11.5.8, 11.6.4, 11.7.3, 11.7.4 ar 12.2.2.4 punktus) ar bet koks nevandeninis skystis (žr. 11.6.3 punktą) supilamas į kapsulę, smėlio sluoksnis švariu metaliniu šaukšteliu išmaišomas, atsargiai susmulkinami visi didesni mėginio grumsteliai;

12.3.6. Iš anksto ekstrahuotas SDS įrenginys vėl surenkamas. Į surinktuvą ir į kolbą įpilamos naujos tolueno porcijos. Įjungiamas kaitinimas. Flegmos susidarymo sparta turi prilygti prasisunkimo per smėlį ir silikagelį spartai kol sumažės šalinamo vandens suvaržymas tolueno srautui. Jei pirmas dvi ekstrahavimo valandas susidaro putos, flegmos srautas sumažinamas, kol putojimas nuslūgs;

12.3.7. Per 8 – 9 ekstrahavimo valandas vanduo iš surinktuvo išleidžiamas kas 1-2 val. ar anksčiau kai tik surinktuvas prisipildo vandens. Mėginys ekstrahuojamas 16-24 valandas. Įrenginys atvėsinamas ir išardomas. Pasižymimas surinkto vandens tūris;

12.3.8. Nuimama destiliavimo kolba. Iš Dean-Stark surinktuvo išleidžiamas vanduo ir įpilama šiek tiek tolueno;

12.3.9. Ekstraktas koncentruojamas taikant vieną iš makrokoncentravimo procedūrų (žr. 12.6 punktą):

12.3.9.1. vandens mėginių, kuriuose yra mažiau nei 1 % kietų medžiagų, dalelių ekstraktai (11.4.3.6):

12.3.9.1.1. vakuuminiame garintuve ar kaitinimo gaubtu koncentruojami iki apytiksliai 5 ml (žr. 12.6.1 arba 12.6.2 punktą);

12.3.9.1.2. kiekybiškai filtruojami per natrio sulfatą (žr. 12.1.3 punktą) į koncentravimo indą (žr. 12.1.4.2 punktą) ir pakartotinai koncentruojami iki apytiksliai 5 ml;

12.3.9.1.3. skiedžiami heksanu apytiksliai iki 10 ml, perpilami į 250 ml dalomąjį piltuvą, atliekamas grįžtamasis ekstrahavimas (žr. 12.5 punktą);

12.3.9.2. dalelių (žr. 11.5 – 11.6 punktus), KFE filtro ir plokštelės (žr. 12.2.2.4 punktą) ekstraktai vakuuminiame garintuve ar kaitinimo gaubtu koncentruojami iki apytiksliai 10 ml (žr. 12.6.1 ar 12.6.2 punktą), perpilami į 250 ml dalomąjį piltuvą, atliekamas grįžtamasis ekstrahavimas (žr. 12.5 punktą);

12.4. Audinių ekstrahavimui galima taikyti dvi procedūras (žr.

12.4.1 ir 12.4.2 punktus):

12.4.1. Ekstrahavimas Soxhlet įranga [22.21]:

12.4.1.1. į kiekvieną stiklinę (žr. 11.8.4 punktą) įberiama 30 g-40 g bevandenio natrio sulfato ir kruopščiai išmaišoma. Stiklinės uždengiamos aliuminio folija ir paliekamos 12 val. – 24 val. Prieš ekstrahavimą pakartotinai išmaišoma;

12.4.1.2. iš anksto surenkamas ir ekstrahuojamas Soxhlet įrenginys (žr. 12.3.1-12.3.4 punktus). Ekstrahavimui ir skalavimui naudojamas metileno chlorido ir heksano (1:1) mišinys. Kvarcinis smėlis, Dean-Stark drėgmės gaudyklė gali būti nenaudojami;

12.4.1.3. iš anksto išekstrahuotas Soxhlet įrenginys išardomas, į virinimo kolbą įpilama nauja metileno chlorido ir heksano mišinio porcija;

12.4.1.4. mėginio ir natrio sulfato mišinys (žr. 12.4.1.1 punktą) perkeliamas į Soxhlet kapsulę, kuri įdedama į Soxhlet įrenginį;

12.4.1.5. stiklinė skalaujama keliomis tirpiklių mišinio porcijomis, kurios supilamos į kapsulę. Kapsulė ir surinktuvas užpildomas tirpikliu. Ekstrahuojama 18-24 valandas;

12.4.1.6. po ekstrahavimo įrenginys atvėsinamas ir išardomas;

12.4.1.7. ekstraktas kiekybiškai perkeliamas į makrokoncentravimo indą (žr. 12.6 punktą) ir koncentruojamas iki sausos liekanos. Koncentravimo įrenginys paruošiamas pakartotiniam koncentravimui;

12.4.1.8. tirpiklio likučiai pašalinami nupučiant azotu (žr. 12.7 punktą), vandens vonios temperatūrai esant 60°C. Surinktuvas pasveriamas, užrašomas jo svoris. Surinktuve esantis likutis pakartotinai pučiamas azotu iki pastovios masės;

12.4.1.9. riebalų kiekis nustatomas ekstrahuojant audinius ta pačia tirpiklių sistema (metileno chloridas, heksanas), kuri buvo naudojama VVA nacionalinėje dioksinų studijoje [22.22]:

12.4.1.9.1. likutis surinktuve tirpinamas heksane ir papildomas 1,0 ml standarto, skirto gryninimo efektyvumui matuoti (7.11);

12.4.1.9.2. heksane ištirpintas likutis perpilamas į antropogeninę atskyrimo kolonėlę (žr. 13.7.1 punktą) ar į butelį su rūgščiu silikageliu (žr. 13.7.2 punktą). paliekant virimo agentą koncentravimo inde. Siekiant garantuoti, kad visa medžiaga ištirpų, surinktuvas keletą kartų skalaujamas (jei reikia, jis gali būti patalpinamas į ultragarso vonelę arba pašildomas). Surinktuvas išdžiovinamas ir pasveriamas. Pasveriamas virimo agentas;

12.4.1.9.3. riebalų kiekis apskaičiuojamas trijų reikšminių skaitmenų tikslumu taikant formulę:

Riebalai % = kurioje

a – likučio svoris gramais,

b – audinio svoris gramais;

12.4.1.9.4. nustatyti riebalų kiekį tuščiajame mėginyje, pradinio ir tarpinio glaudumo ir išgavos alikvotėse nebūtina;

12.4.2. Hidrolizė su HCl, ekstrahavimas ir koncentravimas [22. 23-22.26]:

12.4.2.1. į mėginius ir KK alikvotes (žr. 11.8.4 punktą) įpilama 200 ml 6 N HCl ir 200 ml metileno chlorido ir heksano mišinio(1:1);

12.4.2.2. buteliai užsukami ir 1 – 3 kartus papurtomi. Kamštis atpalaiduojamas susikaupusiems tirpiklio garams išleisti. Kiekvienas butelis purtomas dar 10 – 30 sekundžių, po to išleidžiami susikaupę tirpiklio garai;

12.4.2.3. butelis tvirtai užsukamas, dedamas ant purtyklės ir purtomas 12 – 24 valandas. Rūgštis, tirpiklis ir audinys turi suktis pastoviu greičiu;

12.4.2.4. buteliai išimami iš purtyklės ir paliekami stovėti, kol atsiskirs rūgšties ir tirpiklio sluoksniai;

12.4.2.5. į tirpikliu skalautą stiklinį piltuvą įdedamas švarus stiklo pluošto filtrinis popierius (6.5.2 – 6.5.3) ir ant jo užpilama apie 10 g granuliuoto bevandenio natrio sulfato (7.2.1). Tirpiklis iš butelio nupilamas per natrio sulfatą į makrokoncentravimo įrenginį (žr. 12.6 punktą). Butelio turinys skalaujamas dviem 25 ml heksano porcijomis, kurios taip pat nupilamos per natrio sulfatą į įrenginį;

12.4.2.6. taikant makrokoncentravimo procedūrą (žr. 12.6 punktą) tirpiklis koncentruojamas kol pasidarys beveik sausas;

12.4.2.7. tirpiklio likučiai pašalinami nupučiant azotu (žr. 12.7 punktą), vandens vonios temperatūrai esant 60°C. Surinktuvas pasveriamas, užrašomas jo svoris. Surinktuve esantis likutis pakartotinai pučiamas azotu iki pastovaus svorio;

12.4.2.8. riebalų kiekis nustatomas ekstrahuojant audinius ta pačia tirpiklių sistema (metileno chloridas-heksanas), kuri buvo naudojama VVA nacionalinėje dioksinų studijoje [22.22]:

12.4.2.8.1. likutis surinktuve tirpinamas heksane ir papildomas 1,0 ml standarto, skirto gryninimo efektyvumui matuoti (7.11);

12.4.2.8.2. heksane ištirpintas likutis perpilamas į 100 ml – 200 ml talpos butelį siauru kaklu, paliekant virimo agentą koncentravimo inde. Siekiant garantuoti, kad visa medžiaga ištirpų, surinktuvas keletą kartų skalaujamas. Suminis skalavimui sunaudoto heksano kiekis neturi viršyti 70 ml. Surinktuvas išdžiovinamas ir pasveriamas. Pasveriamas virimo agentas;

12.4.2.8.3. riebalų kiekis apskaičiuojamas, kaip nurodyta 12.4.1.9.3 punkte. Nustatyti riebalų kiekį tuščiajame mėginyje, pradinio ir tarpinio glaudumo ir išgavos alikvotėse nebūtina;

12.4.2.9. ekstraktai gryninami kaip nurodyta 13.7.3 punkte;

12.5. Grįžtamasis ekstrahavimas su hidroksidu ir rūgštimi:

12.5.1. mėginio ir KK ekstraktai (žr. 12.1.4.1, 12.3.9.1.3 ar 12.3.9.2 punktus) dalomuosiuose piltuvuose papildomi 1,0 ml standarto, skirto gryninimo efektyvumui matuoti (7.11);

12.5.2. ekstraktas plaunamas 50 ml kalio hidroksido tirpalu (7.1.1). Purtoma 2 minutes, periodiškai išleidžiant susikaupusius tirpiklio garus. Vandeninis sluoksnis išleidžiamas ir išpilamas. Plovimas hidroksidu kartojamas, kol vandeninis sluoksnis nebeturės pastebimos spalvos (daugiausia 4 kartus). Ekstrakto ir hidroksido sąlyčio laikas mažinamas siekiant išvengti CDD/CDF junginių skilimo. Jei laboratorijos darbo rezultatai atitinka žymėtųjų junginių išgavų reikalavimus ir, taikant 9.2 punkte aprašytą procedūrą įrodomas priimtinas tinkamumas, grįžtamajam ekstrahavimui gali būti naudojamas didesnės koncentracijos kalio hidroksido tirpalas;

12.5.3. ekstraktas plaunamas 50 ml natrio chlorido tirpalu (7.1.4), taip pat kaip su hidroksidu. Vandeninis sluoksnis išpilamas;

12.5.4. ekstraktas plaunamas 50 ml sieros rūgšties (7.1.2), taip pat kaip su hidroksidu. Plovimas rūgštimi kartojamas, kol išnyks vandeninio sluoksnio spalva (daugiausia 4 kartus);

12.5.5. kartojamas plovimas natrio chlorido tirpalu, vandeninis sluoksnis išpilamas;

12.5.6. ekstraktas pilamas į džiovinimo kolonėlę, užpildytą 7 cm – 10 cm aukščio bevandenio natrio sulfato (7.2.1) sluoksniu. Dalomasis piltuvas skalaujamas 30 ml – 50 ml tirpiklio, kuris taip pat supilamas į džiovinimo kolonėlę. Ištekėjęs iš kolonėlės ekstraktas surenkamas į apvaliadugnę kolbą. Mėginys ir KK alikvotės pakartotinai koncentruojami (žr. 12.6 – 12.7 punktus) ir gryninami (žr. 13 punktą);

12.6. Makrokoncentravimas. Ekstraktai toluene koncentruojami sukamajame garintuve arba naudojant kaitinimo gaubtą; ekstraktai metileno chloride ar heksane koncentruojami sukamajame garintuve, naudojant kaitinimo gaubtą arba Kuderna-Danish įrenginį:

12.6.1. Sukamuoju garintuvu ekstraktai koncentruojami atskirose apvaliadugnėse kolbose:

12.6.1.1. pagal gamintojo instrukcijas surinktas sukamasis garintuvas kasdien praplaunamas sukoncentruojant 100 ml ekstrahavimui naudojamo tirpiklio, esant vandens vonios temperatūrai 45°C. Tirpiklis gaudyklėje ir koncentruotas tirpiklis išsaugomi, jei prireiktų atlikti užterštumo testą. Po kiekvieno mėginio koncentravimo sistemos tiekimo vamzdelis plaunamas trimis 2 ml-3 ml tirpiklio porcijomis, nuoplovas surenkamos į stiklinę su atliekomis;

12.6.1.2. apvaliadugnė kolba su mėginio ekstraktu prijungiama prie sukamojo garintuvo. Įjungiamas vakuumas, pradedama sukti kolba su mėginiu;

12.6.1.3. kolba nuleidžiama į vandens vonią. Sukimosi greitis ir vandens vonios temperatūra sureguliuojama taip, kad koncentravimas vyktų 15 min. – 20 min. Esant tinkamam koncentravimo intensyvumui, tirpiklis į surinkimo kolbą teka pastoviu srautu, neatsiranda bumbsėjimų ar pastebimo ekstrakto virimo. Jei koncentravimo intensyvumas per didelis, galimi analitės nuostoliai;

12.6.1.4. skysčio tūriui koncentravimo kolboje sumažėjus iki apytiksliai 2 ml, kolba iškeliama iš vandens vonios. Stabdomas sukimas. Į sistemą lėtai įleidžiama oro. Vožtuvo negalima atsukti staiga, nes mėginys gali būti išpūstas iš kolbos. Tiekimo vamzdelis skalaujamas 2 ml tirpiklio;

12.6.1.5. pasiruošiama grįžtamajam ekstrahavimui (žr. 12.6.4 punktą) ar mikrokoncentravimui ir tirpiklio keitimui;

12.6.2. Kaitinimo gaubtu ekstraktai koncentruojami atskirose apvaliadugnėse kolbose:

12.6.2.1. į apvaliadugnę kolbą įdedami vienas ar du virimo agento gabaliukai. Prie kolbos prijungiama Snyder kolonėlė su trimis makro burbulais. Kolonėlė iš viršaus suvilgoma 1 ml tirpiklio. Apvaliadugnė kolba patalpinama į kaitinimo gaubtą. Įjungiamas kaitinimas. Kaitinimas sureguliuojamas taip, kad koncentravimas vyktų 15 min. – 20 min. Esant tinkamam koncentravimo intensyvumui, kolonėlės burbulais aktyviai srovena tirpiklis, tačiau kameros neužpildomos;

12.6.2.2. kai skysčio apvaliadugnėje kolboje lieka apie 10 ml, kolba iškeliama iš kaitinimo gaubto, išleidžiamas tirpiklis ir mažiausiai 10 min. aušinama. Išimama Snyder kolonėlė, stiklinė jungtis skalaujama nedidelėmis tirpiklio porcijomis;

12.6.2.3. pasiruošiama grįžtamajam ekstrahavimui (žr. 12.6.4 punktą) ar mikrokoncentravimui ir tirpiklio keitimui;

12.6.3. Kuderna-Danish (K-D) koncentratoriumi ekstraktai koncentruojami atskirose 500 ml talpos K-D kolbose, kuriose įrengti 10 ml talpos koncentravimo mėgintuvėliai. K-D metodas taikomas metileno chlorido ir heksano tirpalų koncentravimui. Tolueno tirpalai taikant K-D metodą sunkiai koncentruojami, todėl naudojama vandens vonia su garų generatoriumi:

12.6.3.1. į surinktuvą įdedami vienas ar du švaraus virimo agento gabaliukai. Prijungiama Snyder trijų burbulų kolonėlė. Kolonėlė iš viršaus suvilgoma 1 ml tirpiklio. K-D įrenginys įleidžiamas į karštą vandens vonią taip, kad visas apatinis apvalus kolbos paviršius pasinertų į garus;

12.6.3.2. įrenginio pasvirimas ir vandens vonios temperatūra sureguliuojami taip, kad koncentravimas vyktų 15 min.- 20 min. Esant tinkamam koncentravimo intensyvumui, kolonėlės burbulais aktyviai srovena tirpiklis, tačiau kameros neužpildomos;

12.6.3.3. kai skysčio lieka apie 1 ml, K-D įrenginys iškeliamas iš vandens vonios, išleidžiamas tirpiklis ir mažiausiai 10 min. aušinama. Išimama Snyder kolonėlė, kolba ir jos apatinė stiklinė jungtis skalaujama 1 ml-2 ml tirpiklio, kuris surenkamas į koncentratoriaus mėgintuvėlį. Rekomenduojama skalauti su 5 ml talpos švirkštu;

12.6.3.4. išimama trijų burbulų Snyder kolonėlė. Įdedamas naujas virimo agentas, prie koncentratoriaus mėgintuvėlio prijungiama dviejų burbulų mikro Snyder kolonėlė. Kolonėlė iš viršaus suvilgoma 0,5 ml tirpiklio. Įrenginys įleidžiamas į karštą vandens vonią;

12.6.3.5. įrenginio pasvirimas ir vandens vonios temperatūra sureguliuojami taip, kad koncentravimas vyktų 5 min. – 10 min. Esant tinkamam koncentravimo intensyvumui, kolonėlės burbulais aktyviai srovena tirpiklis, tačiau kameros neužpildomos;

12.6.3.6. kai skysčio lieka apie 0,5 ml, įrenginys iškeliamas iš vandens vonios, išleidžiamas tirpiklis ir mažiausiai 10 min. aušinama;

12.6.3.7. pasiruošiama grįžtamajam ekstrahavimui (žr. 12.6.4 punktą) ar mikrokoncentravimui ir tirpiklio keitimui;

12.6.4. Pasiruošimas grįžtamajam ekstrahavimui ar mikrokoncentravimui ir tirpiklio keitimui:

12.6.4.1. grįžtamąjam ekstrahavimui (žr. 12.5 punktą) ekstraktas perkeliamas į 250 ml dalomąjį piltuvą. Koncentravimo indas skalaujamas nedidelėmis heksano porcijomis, kol heksano tūris dalomajame piltuve pasieks 10 ml – 20 ml. Atliekamas grįžtamasis ekstrahavimas (žr. 12.5 punktą);

12.6.4.2. siekiant nustatyti likučio kiekį ekstrakte ar atlikti kitas nei grįžtamasis ekstrahavimas gryninimo procedūras, ekstraktas du tris kartus skalaujamas tirpikliu ir perpilamas į nupūtimo dujomis buteliuką. Atliekamas mikrokoncentravimas ir keičiamas tirpiklis (žr. 12.7 punktą);

12.7. Mikrokoncentravimas ir tirpiklio keitimas:

12.7.1. gelfiltracijos ar ESCh būdu gryninami ekstraktai turi būti pervedami į metileno chloridą. Silikageliu, aliuminio oksidu, anglimi ir (ar) Florisil gryninami ekstraktai pervedami į heksaną;

12.7.2. buteliukas su ekstraktu patalpinamas nupūtimo azotu įrenginyje. Azoto srautas sureguliuojamas taip, kad tirpiklio paviršius šiek tiek judėtų. Dėl per didelio tirpiklio sūkuriavimo galimi analitės nuostoliai;

12.7.3. Koncentravimas tęsiamas buteliuką įleidžiant į 45°C temperatūros vandens vonią:

12.7.3.1. jei ekstraktas koncentruojamas liekanos svoriui nustatyti (žr. 12.4.1.8, 12.4.2.7 ir 13.7.1.4 punktus), tirpiklio likutis garinamas azotu, kol liekanos masė tampa pastovi;

12.7.3.2. jei ekstraktai koncentruojami siekiant juos įleisti į DCh/MS arba jei ekstraktų gryninimo tikslu keičiamas tirpiklis, dirbama kaip nurodyta toliau;

12.7.4. Kai skysčio lieka apie 100 µl, pridedami 2 ml – 3 ml reikiamo tirpiklio (taikant gelfiltravimą ar ESCh – metileno chlorido, taikant kitą būdą – heksano) ir vėl koncentruojama iki 100 µl. Pakartotinai pridedama tirpiklio ir dar kartą koncentruojama;

12.7.5. Jei bus gryninama gelfiltravimo būdu, ekstraktas metileno chloridu skiedžiamas iki 5,0 ml. Jei bus gryninama ESCh, ekstraktas koncentruojamas iki 30 µl. Toliau gryninama gelfiltracijos ar ESCh metodu (žr. 13.2 ar 13.6 punktą);

12.7.6. Jei bus gryninama naudojant chromatografinę kolonėlę (aliuminio oksidas, silikagelis, Carbopak/Celite ar Florisil), ekstraktas skiedžiamas heksanu iki 1,0 ml. Toliau gryninama naudojant chromatografinę kolonėlę (žr. 13.3 – 13.5 ir 13.8 punktus);

12.7.7. Jei koncentruojama įleisti į DCh/MS (žr. 14 punktą), ekstraktas kiekybiškai perkeliamas į 0,3 ml talpos konusinį buteliuką. Buteliukas, kuriame prieš tai buvo ekstraktas, skalaujamas heksanu. Skalavimui naudotas heksanas taip pat supilamas į konusinį buteliuką. Ekstraktas koncentruojamas iki apytiksliai 100 miul. Į buteliuką įpilama 10 µl nonano. Tirpiklis garinamas iki 10 µl. Buteliukas užkemšamas, ant jo pažymimas mėginio numeris. Buteliukas su mėginiu laikomas tamsoje kambario temperatūroje, kol bus pasiruošta DCh/MS tyrimui. Jei DCh/MS tyrimas nebus atliekamas tą pačią dieną, buteliukas turi būti laikomas žemesnėje nei -10°C temperatūroje.

13. Ekstraktų gryninimas:

13.1. Santykinai švarių mėginių (išvalytos nuotekos, gruntinis ir geriamas vanduo) gryninimas nėra būtinas. Jei tam tikrais atvejais reikalingas gryninimas, tyrėjas gali taikyti kurią nors ar visas toliau išvardintas, arba kitas tinkamas procedūras. Prieš taikant gryninimo procedūrą, tyrėjas turi įrodyti, kad ši procedūra atitinka 9.2 dalyje išdėstytus reikalavimus. Nustatant tik 2,3,7,8-TCDD ir 2,3,7,8-TCDF, parenkamos šiems junginiams tinkamos atskyrimo procedūros:

13.1.1. Gelfiltracijos pagalba (žr. 13.2 punktą) pašalinamos didelės molekulinės masės medžiagos, mažinančios DCh kolonėlių efektyvumą. Gelfiltracijos būdu turi būti gryninami visi dirvožemio ir nuosėdų ekstraktai. Šiuo metodu gali būti gryninami didelės molekulinės masės organiniais junginiais (polimerais, humuso rūgštimis) užteršto vandens ekstraktai;

13.1.2. Poliarinių ir nepoliarinių priemaišų pašalinimui naudojami rūgštus, neutralus ir bazinis silikagelis (žr. 13.3 punktą), aliuminio oksidas (žr. 13.4 punktą) ir Florisil (žr. 13.8 punktą). Aliuminio oksidas ir Florisil naudojami chlorodifenilo eteriams pašalinti;

13.1.3. Nepoliarinių priemaišų pašalinimui naudojamas Carbopak/Celite (žr. 13.5 punktą);

13.1.4. Siekiant užtikrinti CDD ir CDF su pakaitalais 2,3,7,8 padėtyse bei kitųjų izomerų, tyrimo specifiškumą, taikoma ESCh;

13.1.5. Riebalų pašalinimui iš audinių taikomi adsorbcijos antropogeninėje atskyrimo kolonėlėje (žr. 13.7.1 punktą), adsorbcijos rūgščiu silikageliu (žr. 13.7.2 punktą), grįžtamojo ekstrahavimo sieros rūgštimi ir hidroksidu (žr. 13.7.3 punktą) metodai;

13.2. Gelfiltracija:

13.2.2. Kolonėlės įkrova:

13.2.1.1. į 400 ml – 500 ml talpos stiklinę įpilama 70 g – 75 g SX-3 Bio-beads (6.7.1.1) granulių;

13.2.1.2. granulės užpilamos metileno chloridu ir brinkinamos per naktį;

13.2.1.3. išbrinkusios granulės supilamos į kolonėlę (6.7.1.1). Prieš prijungiant kolonėlę prie detektoriaus, per kolonėlę iš apačios į viršų 4,5 ml – 5,5 ml per minutę greičiu pumpuojamas tirpiklis;

13.2.1.4. tirpiklis pumpuojamas vieną – dvi valandas. Kolonėlėje nustatomas ir palaikomas 0,5x10⁵ Pa – 0,7x10⁵ Pa slėgis. Siekiant pašalinti orą, kolonėlė plaunama 4-5 valandas, po to prijungiama prie detektoriaus (6.7.1.4);

13.2.2. Kolonėlės kalibravimas:

13.2.2.1. į mėginio kilpą įtraukiami 5 ml kalibracinio tirpalo (7.4);

13.2.2.2. įleidžiamas kalibracinis tirpalas, užrašomas detektoriaus signalas. Eliucija gali būti imituojama kukurūzų aliejumi, bis(2-etilheksil)ftalatu, pentachlorofenoliu, perilenu ir siera;

13.2.2.3. „šiukšlių pasirodymo trukmė“ nustatoma, kai būna pašalinta daugiau nei 85 % kukurūzų aliejaus ir surinkta daugiau nei 85 % ftalato;

13.2.2.4. „surinkimo laikas“ pasirenkamas tarp perileno ir sieros smailių;

13.2.2.5. kalibravimas tikrinamas kalibraciniu tirpalu kas 20 ekstraktų. Kalibravimas patvirtinamas, kai pentachlorfenolio išgava yra didesnė nei 85 %. Jei kalibravimas nepatvirtinamas, sistema turi būti pakartotinai kalibruojama, o prieš tai gryninti mėginiai turi būti pakartotinai ekstrahuojami ir gryninami naujai kalibruota gelfiltracijos sistema;

13.2.3. Ekstrakto gryninimas. Dirbant gelfiltracijos metodu negalima perkrauti kolonėlės. Šiam metodui skirta kolonėlė iš 5 ml ekstrakto gali sujungti 0,5 g didelės molekulinės masės junginių. Jei numanoma, kad ekstrakte yra daugiau nei 0,5 g tokių junginių, ekstraktas skaidomas į dalis, kurios po eliucijos vėl sujungiamos. Ekstrakto liekanos kiekis gali būti nustatomas gravimetriškai, išgarinus 50 miul tirpiklio:

13.2.3.1. ekstraktas filtruojamas. 5,0 ml ekstrakto įpilama į kolonėlę;

13.2.3.2. ekstraktas eliuojamas vadovaujantis pagal 13.2.2 punkte aprašytą procedūrą nustatytais kalibravimo duomenimis. Eliuatas surenkamas į švarią 400 ml – 500 ml talpos stiklinę;

13.2.3.3. po kiekvieno ekstrahavimo metileno chloridu kruopščiai išplaunamas mėginio įleidimo vamzdelis;

13.2.3.4. jei buvo naudotas ypatingai nešvarus ekstraktas, sistemos pralaidumui patikrinti per ją turi būti praleistas 5,0 ml metileno chlorido tuščiasis mėginys;

13.2.3.5. Eliuatas koncentruojamas (žr. 12.6 ir 12.7 punktus) vėlesniam gryninimui arba DCh/MS tyrimui;

13.3. Gryninimas silikageliu:

13.3.1. 15 mm vidinio skersmens chromatografinė kolonėlė (6.7.4.2) užkemšama stiklo vatos kamšteliu. Kolonėlė nuo apačios iki viršaus užpildoma: 1 g silikagelio (7.5.1.1), 4 g bazinio silikagelio (7.5.1.3), 1 g silikagelio, 8 g rūgštaus silikagelio (7.5.1.2), 2 g silikagelio ir 4 g bevandenio natrio sulfato granulių (7.2.1). Adsorbentas sutankinamas atsargiai pabarbenant kolonėlę;

13.3.2. Kolonėlė preliminariai eliuojama 50 ml – 100 ml heksano. Kai virš natrio sulfato esančio heksano lieka apie 1 mm storio sluoksnis, kranelis užsukamas. Eliuatas išpilamas. Tikrinama kolonėlės protekis. Jei jis nustatomas, ši kolonėlė išmetama ir ruošiama nauja;

13.3.3. Į kolonėlę supilamas koncentruotas ekstraktas. Atidaromas kranelis, ekstraktas eliuojamas, kol virš natrio sulfato lieka apie 1 mm storio ekstrakto sluoksnis;

13.3.4. Surinktuvas skalaujamas dviem 1 ml heksano porcijomis, kurios atskirai supilamos į kolonėlę. CDD/CDF junginiai eliuojami 100 ml heksano. Eliuatas surenkamas;

13.3.5. Eliuatas koncentruojamas (žr. 12.6 ir 12.7 punktus) vėlesniam gryninimui, ESCh ar DCh/MS tyrimui;

13.3.6. Žinant, kad mėginiuose yra daug kitokių organinių junginių (pvz., popieriaus pramonės nuotekose), jų ekstraktų gryninimui rekomenduojama naudoti didesnės talpos kolonėlę. Ji padaroma didinant rūgštaus ir bazinio silikagelio kiekį kolonėlėje. Rūgštaus silikagelio (7.5.1.2) kiekis gali būti padidintas iki 44 % m/m (į 10 g silikagelio įpilami 7,9 g sieros rūgšties). Bazinio silikagelio (7.5.1.3) kiekis gali būti padidintas iki 33 % m/m (į 100 g silikagelio įpilama 50 ml 1N NaOH tirpalo). Gali būti naudojamas kalio silikatas (7.5.1.4).

PASTABA. Naudojant labiau rūgštų silikagelį (44 % m/m) galimas organinių junginių suanglėjimas. Suanglėjusios medžiagos gali užlaikyti kai kurias analites ir tokiu būdu sumažinti CDD/CDF junginių išgavas. Padidinus rūgštaus ir bazinio silikagelio kiekius analičių eliuavimui, gali prireikti kitokio, nei buvo nurodyta, heksano tūrio. Po tokio modifikavimo būtinas metodo tinkamumo patvirtinimas pagal 9.2 punkte pateiktus reikalavimus;

13.4. Gryninimas aliuminio oksidu:

13.4.1. 15 mm vidinio skersmens chromatografinė kolonėlė (6.7. 4.2) užkemšama stiklo vatos kamšteliu;

13.4.2. Į kolonėlę vienas po kito supilami 6 g rūgštaus aliuminio oksido (7.5.2.1) ir 6 g bazinio aliuminio oksido (7.5. 2.2). Adsorbentas sutankinamas atsargiai pabarbenant kolonėlę;

13.4.3. Kolonėlė pirmiausia eliuojama 50 ml – 100 ml heksano. Kai virš aliuminio oksido lieka apie 1 mm storio heksano sluoksnis, kranelis užsukamas;

13.4.4. Eliuatas išpilamas. Tikrinamos kolonėlės protekis. Jei jis nustatomas, kolonėlė išmetama ir ruošiama nauja;

13.4.5. Į kolonėlę supilamas koncentruotas ekstraktas. Atidaromas kranelis, ekstraktas eliuojamas, kol virš aliuminio oksido lieka apie 1 mm storio ekstrakto sluoksnis;

13.4.6. Surinktuvas skalaujamas dviem 1 ml heksano porcijomis, kurios atskirai supilamos į kolonėlę. Priemaišos eliuojamos 100 ml heksano. Eliuatas išpilamas;

13.4.7. Eliuavimo tirpiklis pasirenkamas priklausomai nuo naudojamo aliuminio oksido (rūgštus ar bazinis) (žr. 13.4.2 punktą):

13.4.7.1. naudojant rūgštų aliuminio oksidą, CDD/CDF junginiai eliuojami iš kolonėlės 20 ml metileno chlorido ir heksano mišinio (20:80 v/v). Eliuatas surenkamas;

13.4.7.2. naudojant rūgštų aliuminio oksidą, CDD/CDF eliuojami iš kolonėlės 20 ml metileno chlorido ir heksano mišinio (50:50 v/v). Eliuatas surenkamas;

13.4.8. Eliuatas koncentruojamas (žr. 12.6 ir 12.7 punktus) vėlesniam gryninimui, ESCh ar DCh/MS tyrimui;

13.5. Anglies kolonėlė:

13.5.1. Siekiant pagaminti 10 cm ilgio kolonėlę, nukerpami abu 10 ml talpos vienkartinės serologinės pipetės (6.7.3.2) galai. Abu galai aplydomi ir, jei reikia, praplatinami. Vienas kolonėlės galas užkemšamas stiklo vatos kamšteliu. Kolonėlė įkraunama 0,55 g Carbopak/Celite (7.5.3.3) suformuojant apie 2 cm storio adsorbento sluoksnį. Adsorbentas iš viršaus uždengiamas stiklo vatos kamšteliu;

13.5.2. Kolonėlė pirmiausia eliuojama 5 ml tolueno, po to 2 ml metileno chlorido, metanolio ir tolueno mišinio (15:4:1 v/v), 1 ml metileno chlorido ir cikloheksano mišinio (1:1 v/v) ir 5 ml heksano. Jei eliuato debitas viršija 0,5 ml/min., kolonėlė išmetama;

13.5.3. Kai virš kolonėlės įkrovos lieka apie 1 mm storio tirpiklio sluoksnis, į kolonėlę supilamas mėginio ekstraktas. Indas su ekstraktu skalaujamas dviem 1 ml heksano porcijomis, kurios atskirai supilamos į kolonėlę. Ekstrakto perkėlimui naudojami 2 ml heksano;

13.5.4. Priemaišos eliuojamos dviem 3 ml heksano porcijom, po to 2 ml metileno chlorido ir cikloheksano mišinio (1:1 v/v) ir 2 ml metileno chlorido, metanolio ir tolueno mišinio (15:4:1 v/v). Eliuatas išpilamas;

13.5.5. Kolonėlė apverčiama, CDD/CDF junginiai eliuojami 20 ml tolueno. Jei eliuate yra anglies dalelių, eliuatas filtruojamas per stiklo pluošto filtrinį popierių;

13.5.6. Eliuatas koncentruojamas (žr. 12.6 ir 12.7 punktus) vėlesniam gryninimui, ESCh ar DCh/MS tyrimui;

13.6. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESCh) [22.6]:

13.6.1. Kolonėlės kalibravimas:

13.6.1.1. paruošiamas kalibravimo standartinis tirpalas, kuriame yra izomerų su pakaitalais 2,3,7,8 padėtyse ir (ar) kitų dominančių izomerų. Jų koncentracija metileno chloride yra apie 500 pg/µl;

13.6.1.2. 30 µl kalibracinio tirpalo įleidžiama į ESCh ir užrašomas detektoriaus signalas. Eliuantas renkamas pakartotiniam naudojimui. Eliucija vyksta seka nuo tetra- iki okta-izomerų;

13.6.1.3. nustatomas tetra- ir kitų dominančių izomerų surinkimo laikas. Po kalibravimo sistema išplaunama dideliu metileno chlorido kiekiu, įskaitant mažiausiai penkis 50 µl turio įleidimus, kol detektorius parodys, kad iš sistemos visiškai pašalinti CDD/CDF junginių likučiai;

13.6.1.4. kalibravimas tikrinamas po 20 ekstraktų. Kalibravimas yra patvirtintas, kai kalibraciniame standartiniame tirpale (žr. 13.6.1.1 punktą) esančių CDD/CDF junginių išeiga siekia 75 % – 125 % lyginant su kalibravimu (žr. 13.6.1.2 punktą). Jei kalibravimas nepatvirtinamas, sistema turi būti pakartotinai kalibruojama naudojant kalibracinį tirpalą, o prieš tai ekstrahuoti 20 mėginių turi būti pakartotinai ekstrahuojami ir gryninami naudojant kalibruotą sistemą;

13.6.2. Ekstraktų gryninimas. Dirbant su ESCh, negalima perkrauti kolonėlės. Šiam metodui skirta kolonėlė gali sulaikyti daugiausia 30 µl ekstrakto. Jei ekstraktas negali būti sukoncentruotas iki 30 µl, ekstraktas skaidomas į dalis, kurios po eliuavimo vėl sujungiamos:

13.6.2.1. buteliukas skalaujamas dviem 30 µl metileno chlorido porcijom. Koncentruojama iki 30 µl (žr. 12.7 punktą);

13.6.2.2. 30 µl ekstrakto įleidžiama į ESCh;

13.6.2.3. ekstraktas eliuojamas vadovaujantis 13.6.1 punkte nustatytais kalibravimo duomenimis. Frakcijos renkamos į švarius 20 ml talpos koncentravimo mėgintuvėlius, pripildytus 5 ml heksano ir acetono mišinio (1:1 v/v);

13.6.2.4. jei ekstrakte suminis CDD ar CDF kiekis viršijo 100 ng/ml, sistemos pralaidumui patikrinti per ją turi būti praleistas 30 µl metileno chlorido tuščiasis mėginys;

13.6.2.5. eliuatas koncentruojamas (žr. 12.6 ir 12.7 punktus) vėlesniam gryninimui arba DCh/MS tyrimui;

13.7. Audinių riebalų gryninimas. Riebalai iš Soxhlet ekstrakto pašalinami naudojant antropogeninę atskyrimo kolonėlę (žr. 13.7.1 punktą) ar rūgštų silikagelį (žr. 13.7.2 punktą) arba atliekant su HCl hidrolizuoto ekstrakto grįžtamąjį ekstrahavimą su sieros rūgštimi ir hidroksidu (žr. 13.7.3 punktą):

13.7.1. Riebalų pašalinimui iš Soxhlet/SDS ekstraktų (žr. 12.4.1 punktą) naudojama antropogeninė atskyrimo kolonėlė [22.22, 22.27]:

13.7.1.1. paruošiama kolonėlė (žr. 7.5.4 punktą);

13.7.1.2. kolonėlė pirmiausia eliuojama 100 ml heksano. Heksanas leidžiamas, kol jo meniskas pasieks adsorbento paviršių, tačiau oras neturi patekti į natrio sulfato sluoksnį;

13.7.1.3. į kolonėlę supilamas mėginys ir skalavimui naudotas tirpiklis (žr. 12.4.1.9.2 punktą). Kiekviena porcija nuleidžiama iki kolonėlės adsorbento paviršiaus. CDD/CDF junginiai eliuojami 200 ml heksano į koncentravimo įrenginį (žr. 12.4.1.7 punktą);

13.7.1.4. išvalytas ekstraktas (žr. 12.6-12.7 punktus) koncentruojamas iki pastovaus svorio (žr. 12.7.3.1 punktą). Jei lieka daugiau nei 500 mg medžiagos, gryninimas kartojamas su nauja antropogenine atskyrimo kolonėle;

13.7.1.5. ekstraktas pakartotinai tirpinamas atitinkamame tirpiklyje (žr. 13.2-13.6 ir 13.8 punktus);

13.7.1.6. tirpiklyje ištirpintas likutis papildomas 1,0 ml gryninimo efektyvumo standartu (7.11);

13.7.1.7. ekstraktas gryninamas (žr. 13.2-13.6 ir 13.8 punktus). Papildomam gryninimui rekomenduojamas aliuminio oksidas (žr. 13.4 punktą) ar Florisil (žr. 13.8 punktą) ir anglis (žr. 13.5 punktą);

13.7.1.8. po gryninimo ekstraktas koncentruojamas (žr. 12.7 punktą) iki 10 µl ir analizuojamas (žr. 14 punktą);

13.7.2. Alternatyvi antropogeninei atskyrimo kolonėlei (žr. 13.7.1 punktą) procedūra taikoma riebalams pašalinti iš Soxhlet/SDS ekstraktų (žr. 12.4.1 punktą). – rūgštaus silikagelio panaudojimas [22.28]:

13.7.2.1. į butelį įpilama apytiksliai 200 ml heksano (žr. 12. 4.1.9.2 punktą);

13.7.2.2. tirpiklyje ištirpintas likutis papildomas 1,0 ml gryninimo efektyvumo standartu (7.11);

13.7.2.3. butelio turinys maišomas magnetine maišykle;

13.7.2.4. maišant į butelį įpilama 30 g – 100 g rūgštaus silikagelio (7.5.1.2). Maišoma 2-3 valandas.

PASTABA. 30 g silikagelio turėtų pakakti daugumai mėginių ir galėtų tik minimaliai juos užteršti;

13.7.2.5. ekstraktas filtruojamas per bevandenį natrio sulfatą (7.2.1) į makrokoncentravimui skirtą įrenginį (žr. 12.6 punktą). Butelis ir natrio sulfatas plaunami heksanu;

13.7.2.6. ekstraktas koncentruojamas (žr. 12.6 ir 12.7 punktus) ir gryninamas (žr. 13.2-13.6 ir 13.8 punktus). Papildomam gryninimui rekomenduojamas aliuminio oksidas (žr. 13.4 punktą) ar Florisil (žr. 13.8 punktą) ir anglis (žr. 13.5 punktą);

13.7.3. Su HCl hidrolizuotiems ekstraktams (žr. 12.4.2 punktą) taikomas grįžtamasis ekstrahavimas sieros rūgštimi ir hidroksidu:

13.7.3.1. tirpiklyje ištirpintas likutis (žr. 12.4.2.8.2 punktą) papildomas 1,0 ml gryninimo efektyvumo standartu (7.11);

13.7.3.2. į butelį įpilama 10 ml sieros rūgšties. Butelis nedelsiant užsukamas ir vieną – tris kartus papurtomas. Kamštis atpalaiduojamas susikaupusiems tirpiklio garams išleisti. Butelis užsukamas, purtoma tiek, kad liekana-tirpiklis sąveikautų su rūgštimi iš viso apie 45 sekundes;

13.7.3.3. heksanas nupilamas į 250 ml dalomąjį piltuvą stengiantis, kad į jį nepatektų rūgšties. Butelis kelis kartus skalaujamas heksanu, kuris supilamas į tą patį dalomąjį piltuvą;

13.7.3.4. tirpiklis-liekana ekstrahuojami su 50 ml kalio hidroksido tirpalo (žr. 12.5.2 punktą). Po to du kartus skalaujami vandeniu;

13.7.3.5. po maišymo ekstraktas filtruojamas per bevandenį natrio sulfatą (7.2.1) į makrokoncentravimui skirtą įrenginį (žr. 12.6 punktą);

13.7.3.6. išvalytas ekstraktas koncentruojamas iki papildomam gryninimui tinkamo tūrio (žr. 13.2-13.6 ir 13.8 punktus). Papildomam gryninimui rekomenduojama gelfiltracija (žr. 13.2 punktą), aliuminio oksidas (žr. 13.4 punktą) ar Florisil (žr. 13.8 punktą) ir anglis (žr. 13.5 punktą);

13.7.3.7. po gryninimo ekstraktas koncentruojamas iki 10 µl (žr. 12.7 punktą) ir tiriamas (žr. 14 punktą);

13.8. Gryninimas su Florisil [22.29]:

13.8.1. Aktyvuota Florisil kolonėlė (7.5.3) pirmiausia eliuojama 10 ml metileno chlorido, po to 10 ml heksano ir metileno chlorido (98:2 v/v) mišiniu. Tirpikliai išpilami.

13.8.2. Kai tirpiklio sluoksnio storis virš įkrovos lieka 1 mm, į kolonėlę įpilamas ekstraktas (heksane). Indas, kuriame buvo mėginys, skalaujamas dviem 1 ml heksano porcijomis, kurios supilamos į kolonėlę;

13.8.3. Priemaišos eliuojamos 20 ml heksano ir metileno chlorido mišiniu (98:2 v/v). Eliuatas išpilamas. 13.8.4. CDD/CDF junginiai eliuojami 35 ml metileno chlorido. Eliuatas surenkamas ir koncentruojamas (žr. 12.6, 12.7 punktus) gryninimui arba ESCh ar DCh/MS tyrimui.

14. Didelės skiriamosios gebos dujų chromatografija su didelės skiriamosios gebos masių spektrometrija (DSGDCh/DSGMS):

14.1. Nustatomos 10.1 punkte nurodytos darbo sąlygos;

14.2. Siekiant sumažinti galimus vidinio standarto nuostolius išgarinant adsorbcijos ar reakcijos metu, prieš pat įleidimą į mėginio ekstraktą įlašinama 10 µl atitinkamo vidinio standarto tirpalo (7.12). Jei išgarintas ekstraktas analizuojamas pakartotinai, vidinio standarto tirpalas papildomai nebelašinamas. Geriau ekstraktą skiesti iki buvusio jo tūrio (pvz., iki 19 µl) švariu nonanu (arba iki18 µl, jei buvo įleista 2 µl);

14.3. Naudojant tiesioginį ar dozuojamąjį įleidimo įrenginį, įleidžiama 1 µl ar 2 µl koncentruoto ekstrakto su vidiniu standartu. Įleisto ekstrakto tūris turi būti identiškas kalibravimo metu naudotam tūriui (žr. 10 punktą). Prieš įleidimą pasiekiama pradinė DCh kolonėlės temperatūra. MS duomenys renkami po tirpiklio smailės pasirodymo. Duomenų rinkimas nutraukiamas po OCDD ir OCDF eliuavimo. Jei nustatomi 2,3,7,8-TCDD ir 2,3,7,8- TCDF, duomenų rinkimas nutraukiamas po šių junginių eliuavimo. Prieš kito ekstrakto ar standarto analizę gražinama pradinė kolonėlės temperatūra.

15. Sistemos ir laboratorijos tinkamumas:

15.1. Kas 12 analizės valandų atliekama DCh/MS sistemos tinkamumo ir kalibravimo patikra visiems CDD/CDF junginiams ir žymėtiesiems junginiams. Šiems testams turi būti naudojami KS3 kalibracinis patikros standartas (žr. 7.13 punktą ir 4 lentelę) ir izomerų specifiškumo standartai (7.15 punktas, 5 lentelė). Reguliavimas ir (ar) kalibravimas (žr. 10 punktą) kartojami, kol bus pasiektas visų tinkamumo kriterijų atitikimas. Tik tuomet gali būti analizuojami mėginiai, tuštieji mėginiai, nustatomas pradinis ir tarpinis glaudumas ir išgava;

15.2. MS skiriamoji geba. Prieš atliekant bet kokią analizę, statinė skaidymo galia atitinkamam m/z turi siekti mažiausiai 10 000 (esant 10 % įdubos aukščiui). Statinė skaidymo galia turi būti tikrinama kas 12 val. taikant 10.1.2 punkte aprašytas procedūras. Neatitinkanti reikalavimų statinė skaidymo galia koreguojama;

15.3. Kalibravimo patikra:

15.3.1. Įleidžiamas kalibravimo patikros standartas (žr. 14 punktą).

15.3.2. Visų CDD/CDF junginių m/z turi tilpti į 9 lentelėje nurodytų intervalų ribas. Kitu atveju masių spektrometras turi būti reguliuojamas, kol m/z atitiks nurodytas vertes, patikra kartojama. Jei dėl reguliavimo kinta masių spektrometro skiriamoji geba, ji turi būti tikrinama (žr. 10.1.2 punktą) prieš kartojant patikrą;

15.3.3. Kalibravimo patikros standarte esančių CDD/CDF ir žymėtojo junginio smailių signalo/triukšmų santykis turi siekti mažiausiai 10. Kitu atveju masių spektrometras turi būti reguliuojamas. Kartojama patikra;

15.3.4. Kiekvieno CDD/CDF junginio koncentracija nustatoma naudojant žymėtuosius analogus (1 lentelė) junginių skiedimo izotopais metodu (žr. 10.5 punktą). Žymėtųjų junginių koncentracija nustatoma vidinio standarto metodu (žr. 10.6 punktą). Šios koncentracijos skaičiuojamos pagal kalibravimo (žr. 10 punktą) duomenis;

15.3.5. Kiekvieno junginio koncentracija lyginama su 6 lentelėje pateiktomis kalibravimo patikros vertėmis. Jei nustatomi tik 2,3,7,8-TCDD ir 2,3,7,8-TCDF, jų koncentracija lyginama su 6a lentelėje pateiktomis vertėmis. Jei visi junginiai atitinka reikiamus kriterijus – kalibravimo patikra atlikta. Pradedama standartų ir mėginių ekstraktų analizė. Jei, vis dėlto, kurio nors junginio patikros parametrai nepatenka tarp atitinkamų ribų, matavimo sistema nėra kaip reikiant pritaikyta šiam junginiui. Tokiu atveju ruošiamas naujas kalibracinis standartas arba šalinamos kitos netikslumo priežastys, kartojami skiriamosios gebos (žr. 15.2 punktą) ir patikros (žr. 15.3 punktą) testai arba kalibravimas (žr. 10 punktą);

15.4. Sulaikymo trukmė ir DCh skiriamoji geba:

15.4.1. Sulaikymo trukmė:

15.4.1.1. absoliuti DCh/MS vidinių standartų ¹³C₁₂-1,2,3,4- TCDD ir ¹³C₁₂-1,2,3,7,8,9-HxCDD sulaikymo trukmė patikros testo metu (žr. 15.3 punktą) gali skirtis nuo absoliučios sulaikymo trukmės kalibravimo metu (žr. 10.2.1 ir 10.2.4 punktus) ± 15 sekundžių;

15.4.1.2. santykinė CDD/CDF ir žymėtųjų junginių sulaikymo trukmės vertė, gauta patikros testu (žr. 15.3 punktą), turi patekti tarp 2 lentelėje pateikų ribų;

15.4.2. DCh skiriamoji geba:

15.4.2.1. į atitinkamas kolonėles įleidžiami izomerų specifiškumo standartai (7.15);

15.4.2.2. 2,3,7,8-TCDD ir kitų tetra-dioksinų izomerų įdubų aukštis esant m/z 319,8965 ir 2,3,7,8-TCDF bei kitų tetra-furanų izomerų įdubų aukštis esant m/z 303,9016 atitinkamose kolonėlėse neturi viršyti 25 % (6 ir 7 paveikslai);

15.4.3. Jei kurio nors junginio absoliuti sulaikymo trukmė netelpa į nustatytas ribas arba 2,3,7,8-izomerai neatskirti, DCh nėra tinkamai pritaikyta. Tokiu atveju sureguliuojamas DCh ir kartojama jo patikra (žr. 15.3 punktą), arba jis pakartotinai kalibruojamas (žr. 10 punktą). Gali būti keičiama DCh kolonėlė, atliekama jos kalibravimo patikra ar pakartotinis kalibravimas;

15.5. Tarpinis glaudumas ir išgava:

15.5.1. Prieš tos pačios rūšies mėginių serijos analizę analizuojamos tarpinio glaudumo ir išgavos alikvotės (žr. 11.4.2.5, 11.5.4, 11.6.2, 11.7.4 ar 11.8.3.2 punktus);

15.5.2. Kiekvieno CDD/CDF junginio koncentracija nustatoma naudojant žymėtuosius analogus (1 lentelė) junginių skiedimo izotopais metodu (žr. 10.5 punktą). Žymėtųjų junginių koncentracija nustatoma vidinio standarto metodu (žr. 10.6 punktą). Šios koncentracijos skaičiuojamos pagal kalibravimo (žr. 10 punktą) duomenis;

15.5.3. Kiekvieno CDD/CDF ir žymėtojo junginio koncentracija lyginama su 6 lentelėje pateiktomis tarpinio glaudumo ir išgavos vertėmis. Jei nustatomi tik 2,3,7,8-TCDD ir 2,3,7,8-TCDF, jų koncentracija lyginama su 6 a lentelėje pateiktomis vertėmis. Jei visi rodikliai atitinka reikiamus kriterijus – sistemos tinkamumas yra priimtinas ir galima pradėti standartų ir mėginių ekstraktų analizę. Jei vis dėlto kurio nors junginio koncentracija nepatenka į atitinkamas ribas, ekstrahavimo- koncentravimo procedūros yra netinkamos šiam junginiui. Tokiu atveju šalinamos netikslumo priežastys, mėginys pakartotinai ruošiamas, ekstrahuojamas ir gryninamas, kartojamas tarpinio glaudumo ir išgavos testas (žr. 15.5 punktą);

15.5.4. Panaudojant kiekvieno junginio kiekvienoje matricoje pradinius, tarpinius ir 15.5.3 punkte gautus rezultatus, brėžiama kokybės kontrolės kreivė, atspindinti laboratorijos tyrimų atkartojamumą. Laboratorijoje atliekamų nustatymų tikslumas patvirtinamas apskaičiuojant kiekvieno CDD/CDF įvairiose matricose vidutinę procentinę išgavą (R) ir procentinės išgavos standartinį nuokrypį (S_R). Tikslumas išreiškiamas išgavos intervalu nuo R-2S_R iki R+2 S_R. Pavyzdžiui: jei R = 95%, o S_R = 5 %, tikslumas yra 85 – 105 %;

15.6. Po tarpinio glaudumo ir išgavos alikvočių analizių yra atliekamas kiekvienos mėginių serijos tuščiasis tyrimas. Šiuo tyrimu įrodoma, kad naudojami reagentai neužteršti, o sistemoje nebėra tarpinio glaudumo ir išgavos analizės likučių. Tuščiojo tyrimo rezultatai turi atitikti 9.5.2 punkte nurodytus reikalavimus.

16. Kokybinis nustatymas: CDD, CDF ar žymėtasis junginys standarte, mėginyje ar tuščiajame mėginyje laikomas identifikuotu, kai rezultatai atitinka kriterijus, išvardytus 16.1 – 16.4 punktuose:

16.1. Dviejų tikrųjų m/z (8 lentelė) signalai turi pasirodyti ir pasiekti maksimumą per dvi sekundes.

16.2. Kiekvieno CDD ar CDF, nustatyto mėginio ekstrakte, DCh smailės kiekvieno tikrojo m/z signalo ir trukdžių stiprių santykis (S/T) turi būti lygus arba didesnis nei 2,5, o nustatyto kalibraciniame standarte – lygus ar didesnis nei 10 (žr. 10.2.3 ir 15.3.3 punktus).

16.3. Dviejų tikrųjų m/z, išvardytų 8 lentelėje, integruotų plotų santykis turi būti intervalo ribose, nurodytose 9 lentelėje, arba ± 10 % nuo vidurinio kalibravimo taško (KS3) ar (KPS) intervalo ribose.

16.4. Smailių santykinė sulaikymo trukmė turi būti nustatyto intervalo ribose (žr. 2 lentelę). CDD ir CDF junginių be pakaitalų 2,3,7 ir 8 padėtyse – sulaikymo trukmės intervaluose, nurodytuose 10.3 punkte.

16.5. Patvirtinančioji analizė. Dirbant su kolonėle DB-5, nepasiekiamas pakankamas specifiškumas izomerui 2,3,7,8-TCDF. Todėl, siekiant patvirtinti analizę, bet koks mėginys, kuriame, panaudojant DB-5 kolonėlę, identifikuojamas 2,3,7,8-TCDF, turi būti ištiriamas naudojant DB-225, SP-2330 ar panašias kolonėles. Analizei su antrąja DCh kolonėle gali būti taikomos darbo sąlygos, nurodytos 10.1.1 punkte, tačiau DCh/MS turi atitikti masių skyros ir kalibravimo sąlygas (žr. 10 punktą);

16.6. Jei identifikavimas neatitinka kriterijų (žr. 16.1 – 16.5 punktus), CDD ar CDF neįmanoma identifikuoti – rezultatai negali būti naudojami kontrolės tikslams. Jei identifikavimui trukdo priemaišos, turi būti ekstrahuojamas kartotinis mėginys, gryninamas ir analizuojamas.

17. Kiekybinis nustatymas:

17.1. Skiedimo izotopais įvertinimas. Į kiekvieną mėginį prieš ekstrahavimą pridedant žinomą kiekį žymėtojo junginio, gali būti gaunama CDD/CDF išgavos pataisa, nes ir CDD/CDF, ir jo žymėtasis analogas ekstrahavimo, koncentravimo ir dujų chromatografijos metu duoda panašius efektus. Jei mėginys papildomas vienodais žymėtojo junginio kiekiais, CDD/CDF koncentracijos ekstrakte (C_ex) nustatomos naudojant santykines atsako vertes ir 10.5 punkte aprašytus pirminio kalibravimo duomenis pagal tokią formulę:

kurioje RR – santykinės atsako vertės. Kiti šios formulės nariai apibūdinti 10.5.2 punkte:

17.1.1. Dėl galimų trukdžių žymėtasis OCDF analogas į mėginį nededamas. OCDF kiekybiniam įvertinimui naudojamas žymėtasis oCDD. Pagal žymėto OCDD išgavą koreguojama OCDF koncentracija. Atskirais atvejais, kai OCDD ir OCDF mėginio ekstrahavimo, koncentravimo ir gryninimo metu elgiasi skirtingai, gali sumažėti OCDF rezultatų glaudumas. Kadangi šio junginio toksinis poveikis lyginant su kitais dioksinais ir furanais yra mažas, galimas glaudumo sumažėjimas nelaikomas reikšmingu;

17.1.2. Kadangi ¹³C₁₂-1,2,3,7,8,9-HxCDD yra naudojamas kaip prietaiso vidinis standartas (t. y. jis nededamas į mėginį prieš ekstrahavimą), jis negali būti naudojamas kiekybiškai įvertinant 1,2,3,7,8,9-HxCDD, taikant tikslias skiedimo izotopais procedūras. Todėl 1,2,3,7,8,9-HxCDD kiekybiškai įvertinamas naudojant kitų dviejų su pakaitalais 2,3,7,8 padėtyse HxCDD žymėtųjų analogų – 1,2,3,4,7,8-HxCDD ir 1,2,3,6,7,8-HxCDD – atsakų vidurkius. 1,2,3,7,8,9-HxCDD koncentracija koreguojama pagal kitų dviejų HxCDD išgavų vidurkį;

17.1.3. Be pakaitalų 2,3,7,8 padėtyse CDD/CDF junginių smailės kiekybiškai įvertinamos naudojant visų to paties chlorinimo lygio žymėtųjų 2,3,7,8-izomerų atsako daugiklių vidurkį;

17.2. Kiekybinis įvertinimas pagal vidinį standartą. Žymėtojo junginio išgava:

17.2.1. 1,2,3,7,8,9-HxCDD, OCDF, ¹³C-žymėtųjų analogų ir ³⁷Cl-žymėtojo gryninimo standarto koncentracijos ekstrakte Cex apskaičiuojamos naudojant iš pirminių kalibravimo duomenų nustatytus atsako daugiklius pagal tokią formulę:

kurioje RF – atsako daugiklis. Kiti šios formulės nariai apibūdinti 10.6.1 punkte.

PASTABA. ³⁷Cl-žymėtajam standartui priskiriamas tiktai vienas m/z.;

17.2.2. Naudojantis anksčiau nustatyta koncentracija ekstrakte, apskaičiuojamos ¹³C-žymėtųjų junginių ir ³⁷Cl-žymėtojo gryninimo standarto išgavos pagal tokią formulę:

Išgava (%) =

kurioje:

a – nustatyta koncentracija (µg/ml);

b – papildymo koncentracija (µg/ml);

17.3. CDD/CDF koncentracija kietoje mėginio fazėje apskaičiuojama iš junginio koncentracijos ekstrakte ir mėginio masės (11.5.1), taikant formulę:

Koncentracija kietoje medžiagoje (ng/kg) =

kurioje:

C_ex – junginio koncentracija ekstrakte;

V_ex – ekstrakto tūris ml;

W_{s –}sauso mėginio svoris kg.

17.4. CDD/CDF koncentracija vandeninėje mėginio fazėje apskaičiuojama iš junginio koncentracijos ekstrakte ir ekstrahuoto vandens tūrio (žr. 11.4 ar 11.5 punktus), taikant formulę:

Koncentracija vandeninėje fazėje (pg/l) = ,

kurioje:

C_ex – junginio koncentracija ekstrakte;

V_ex – ekstrakto tūris mililitrais;

V_s – mėginio tūris litrais.

17.5. Jei AJP plotas nustatant kurio nors junginio m/z viršija sistemos kalibravimo ribą, ekstrahuojama mažesnė mėginio dalis:

17.5.1. Vandens mėginiai, kuriuose yra 1 % ar mažiau netirpių medžiagų, papildomai skiedžiami, pvz.: 100 ml ar 10 ml mėginio skiedžiama su vandeniu iki litro, ekstrahuojama, gryninama ir analizuojama (žr. 11 – 14 punktus);

17.5.2. Mėginių, kuriuose yra daugiau nei 1 % netirpių medžiagų, ekstrahavimui imama 1/10 ar 1/100 naudoto mėginio (žr. 11.5.1 punktą) dalis. Ekstrahuojama, gryninama ir analizuojama (žr. 11 – 14 punktus);

17.5.3. Jei neįmanoma gauti mažesnio vientiso mėginio, mėginio ekstraktas skiedžiamas 10 kartų, vidinio standarto koncentracija ekstrakte sureguliuojama iki 100 pg/miul. Skiestas ekstraktas analizuojamas taikant vidinio standarto metodą;

17.6. Visų randamų CDD/CDF ir žymėtųjų junginių kiekiai standartuose, tuščiuose mėginiuose ir mėginiuose pateikiami trijų reikšminių skaitmenų tikslumu:

17.6.1. Protokole pateikiami matų vienetai ir ribos:

17.6.1.1. vandens mėginių tyrimų rezultatai pateikiami pg/l;

17.6.1.2. mėginių, kuriuose netirpių medžiagų yra daugiau nei 1 % (dirvožemio, nuosėdų, dumblo), tyrimų rezultatai pateikiami ng/kg sauso mėginio. Pateikiamas ir netirpių medžiagų kiekis (%);

17.6.1.3. audinių tyrimų rezultatai pateikiami ng/kg natūralaus audinio, bet ne koncentracija mėginio riebaluose. Pateikiamas riebalų kiekis (%) mėginyje, jei reiktų duomenis perskaičiuoti į kiekį riebaluose;

17.6.1.4. ataskaitoje taikomos ribos:

17.6.1.4.1. standartų ir mėginių tyrimų rezultatai pateikiami, kai yra lygūs ar didesni už mažiausią nustatomą koncentraciją (2 lentelė). Rezultatai pateikiami kaip mažesni už minimalų kiekį, neaptikus junginio ar reikalaujant kontrolei;

17.6.1.4.2. tuščių mėginių tyrimų rezultatai pateikiami, kai yra didesni nei 1/3 minimalaus lygio (ML);

17.6.2. CDD/CDF junginių rezultatai skiestuose mėginiuose pateikiami esant mažiausiam skiedimui, kuriame kiekybiškai įvertintų m/z plotai patenka tarp kalibravimo ribų (žr. 17.5 punktą);

17.6.3. CDD/CDF junginio, turinčio žymėtąjį analogą, tyrimo rezultatai pateikiami esant mažiausiam skiedimui, kai kiekybiškai įvertinto m/z plotas patenka tarp kalibravimo ribų (žr. 17.5 punktą), o žymėtojo analogo išgava – tarp normalių metodo ribų (žr. 9.3 punktą ir 6, 6 a, 7, 7a lentelės);

17.6.4. Jei reikalaujama suminės kurio nors chlorinimo laipsnio izomerų koncentracijos (t. y. suminės TCDD, suminės TCDF ir t. t. koncentracijos), ataskaitoje gali būti pateikiamos susumuotos visų tokio chlorinimo laipsnio izomerų koncentracijos, įskaitant tiek su pakaitalais, tiek ir be pakaitalų 2,3,7,8 padėtyse izomerų koncentracijas.

18. Sudėtingų mėginių analizė:

18.1. Kai kuriuose mėginiuose gali būti dideli dominančių junginių (daugiau nei 10 ng/l ar 1000 ng/kg), trukdančių junginių ir (ar) polimerinių medžiagų kiekiai. Kai kurių ekstraktų negalima sukoncentruoti iki 10 miul (žr. 12.7 punktą); kiti gali perpildyti DCh kolonėlę ir (ar) masių spektrometrą;

18.2. Kai ekstrakto negalima sukoncentruoti iki 10 miul, analizuojamas mažesnis mėginio kiekis (žr. 12.7 punktą);

18.3. Jei chromatogramoje kurio nors CDD/CDF išskyrimo metu stebimi charakteringi chlorodifenileterių m/z (8 lentelė), turi būti atliekamos papildomos gryninimo procedūros, kol šios trukdančios medžiagos bus visiškai pašalintos. Chlorodifenileterius rekomenduojama pašalinti su aliuminio oksidu (žr. 13.4 punktą) ir Florisil (žr. 13.8 punktą);

18.4. Žymėtųjų junginių išgavos daugelyje mėginių turi būti panašios kaip vandenyje ar atitinkamose matricose (žr. 7.6 punktą):

18.4.1. Jei kurio nors žymėtojo junginio išgava peržengia normalias ribas (7 lentelė), turi būti analizuojamas skiestas mėginys (žr. 17.5 punktą);

18.4.2. Jei kurio nors žymėtojo junginio išgava skiestame mėginyje peržengia normalias ribas, turi būti analizuojamas kalibravimo patikros standartas (žr. 7.13 punktą) ir atliekama kalibravimo patikra (žr. 15.3 punktą);

18.4.3. Jei kalibravimo patikra negalima, turi būti kartojamas kalibravimas ir iš naujo analizuojamas pradinis mėginio ekstraktas;

18.4.4. Jei kalibravimo patikra atlikta, o žymėtųjų junginių išgavos skiestame mėginyje nepatenka tarp ribų, metodas nėra tinkamas esamo mėginio analizei, o rezultatai negali būti pateikiami ataskaitoje. Tokiu atveju turi būti naudojamos kitos ekstrahavimo ir gryninimo procedūros. Jei pritaikius visas šiame metode numatytas gryninimo procedūras žymėtųjų junginių išgavos išeina už ribų, mėginiai analizuojami taikant šiame metode nenurodytas ekstrahavimo ir (ar) gryninimo procedūras.

19. Aplinkos taršos prevencija:

19.1. Tinkamai tvarkomi šiame metode naudojami tirpikliai nekelia didelės grėsmės aplinkai. Naudojama tirpiklių išgarinimo įranga įgalina regeneruoti tirpiklius. Rekomenduojama laboratorijoje tirpiklius regeneruoti visais galimais atvejais;

19.2. Standartai turi būti ruošiami laboratorijos poreikius atitinkančiais tūriais, taip sumažinant standartų pertekliaus pašalinimą.

20. Atliekų tvarkymas:

20.1. Laboratorijos pareiga laikytis visų pagrindinių valstybės patvirtintų atliekų tvarkymo taisyklių, iš dalies pavojingų atliekų identifikavimo taisyklių ir jų šalinimo apribojimų, saugoti ir kontroliuoti orą, vandenį ir gruntą nuo teršalų, patenkančių iš traukos spintų ir nuo darbastalių. Taip pat reikia laikytis nutekamųjų vandenų šalinimo leidimų ir taisyklių;

20.2. Mėginiai, kuriuose yra HCl, o jų pH < 2, yra pavojingi ir prieš išpilant turi būti neutralizuojami arba traktuojami kaip pavojingos atliekos;

20.3. CDD/CDF junginiai suyra aukštesnėje nei 800°C temperatūroje. Nelabai užterštos atliekos (sugeriantis popierius, audiniai, gyvūnų liekanos, plastiko pirštinės) gali būti sudeginamos tinkamose krosnyse. Dideli kiekiai (miligramai) turi būti saugiai supakuoti ir perduoti komercinėms ar valstybinėms institucijoms, kurios gali saugoti ypatingai toksines atliekas;

20.4. Skystos ar tirpios atliekos turi būti ištirpintos metanolyje ar etanolyje ir keletą dienų švitinamos trumpesnio nei 290 nm bangos ilgio UV šviesa. Naudojamos F40 BL ar panašios lempos. Atliekos analizuojamos ir, neberadus CDD/CDF junginių, pašalinamos;

20.5. Informacijos apie atliekų tvarkymą galima rasti „The Waste Management Manual for Laboratory Personnel“ ir „Less is Better-Laboratory Chemical Mangement for Waste Reduction“, kurias galima įsigyti American Chemical Society`s Department of Government Relations and Science Policy, 1155 16 th Street N. W., Washington, D. C. 20036.

21. Metodo tinkamumas:

Metodo tinkamumas buvo įteisintas ir eksploatacijos techninės sąlygos parengtos vadovaujantis AAV (Aplinkos apsaugos valdyba, JAV) tarptautiniais tarplaboratoriniais tyrimais [22.30, 22.31] ir AAV – popieriaus pramonės nuotekų ilgalaikio kintamumo moksliniais tyrinėjimais (58 FR 66078).

22. Literatūra:

22.1. Tondeur, Yves. Method 8290: Analytical Procedures and Quality Assurance for Multimedia Analysis of Polychlorinated Dibenzo-p-dioxins and Dibenzofurans by High Resolution Gas Chromatography/High Resolution Mass Spectrometry. USEPA EMSL, Las Vegas, Nevada, June 1987;

22.2. Measurement of 2,3,7,8-Tetrachlorinated Dibenzo-p-dioxin (TCDD) and 2,3,7,8-Tetrachlor-inated Dibenzofuran (TCDF) in Pulp, Sludges, Process Samples and Wastewaters from Pulp and Paper Mills. Wright State University, Dayton, OH 45435, June 1988;

22.3. NCASI Procedures for the Preparation and Isomer Specific Analysis of Pulp and PaperIndustry Samples for 2,3,7,8-TCDD and 2,3,7,8-TCDF. National Council of the PaperIndustry for Air and Stream Improvement Inc., 260 Madison Avenue, New York, NY 10016, Technical Bulletin No. 551, Pre-Release Copy, July 1988;

22.4. Analytical Procedures and Quality Assurance Plan for the Determination of PCDD/PCDF in Fish. USEPA, Environmental Research Laboratory, 6201 Congdon Boulevard, Duluth, MN 55804, April 1988;

22.5. Tondeur, Yves. Proposed GC/MS Methodology for the Analysis of PCDDs and PCDFs in Special Analytical Services Samples. Triangle Laboratories, Inc., 801-10 Capitola Dr, Research Triangle Park, NC 27713, January 1988; updated by personal communication September 1988;

22.6. Lamparski, L. L. and Nestrick, T. J. Determination of Tetra-, Hexa-, Hepta-, and oCtachloro-dibenzo-p-dioxin Isomers in Particulate Samples at Parts per Trillion Levels. Analytical Chemistry, 52: 2045-2054, 1980;

22.7. Lamparski, L. L. and Nestrick, T. J. Novel Extraction Device for the Determination of Chlorinated Dibenzo-p-dioxins (PCDDs) and Dibenzofurans (PCDFs) in Matrices Containing Water. Chemosphere, 19:27-31, 1989;

22.8. Patterson, D. G., et. al. Control of Interferences in the Analysis of Human Adipose Tissue for 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo- p-dioxin. Environmental Toxicological Chemistry, 5:355-360, 1986;

22.9. Stanley, John S. and Sack, Thomas M. Protocol for the Analysis of 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin by High Resolution Gas Chromatography/High Resolution Mass Spectrometry. USEPA EMSL, Las Vegas, Nevada 89114, EPA 600/4- 86- 004, January 1986;

22.10. Working with Carcinogens. Department of Health, Education, & Welfare, Public Health Service, Centers for Disease Control, NIOSH, Publication 77-206, August 1977, NTIS PB-277256;

22.11. OSHA Safety and Health Standards, General Industry. OSHA 2206, 29 CFR 1910;

22.12. Safety in Academic Chemistry Laboratories. ACS Committee on Chemical Safety, 1979;

22.13. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 18th edition and later revisions, American Public Health Association, 1015 15th St, N. W., Washington, DC 20005, 1- 35: Section 1090 (Safety), 1992;

22.14. Method 613 – 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin. 40 CFR 136 (49 FR 43234), oCtober 26, 1984, Section 4.1;

22.15. Provost, L. P. and Elder, R. S. Interpretation of Percent Recovery Data. American Laboratory, 15: 56-83, 1983;

22.16. Standard Practice for Sampling Water. ASTM Annual Book of Standards, ASTM, 1916 Race Street, Philadelphia, PA 19103- 1187, 1980;

22.17. Methods 330.4 and 330.5 for Total Residual Chlorine. USEPA, EMSL, Cincinnati, OH 45268, EPA 600/4-79-020, March 1979;

22.18. Handbook of Analytical Quality Control in Water and Wastewater Laboratories. USEPA EMSL, Cincinnati, OH 45268, EPA- 600/4-79-019, March 1979;

22.19. Williams, Rick. Letter to Bill Telliard, June 4, 1993, available from the EPA Sample Control Center operated by DynCorp Viar, Inc., 300 N Lee St, Alexandria, VA 22314, 703-519-1140;

22.20. Barkowski, Sarah. Fax to Sue Price, August 6, 1992, available from the EPA Sample Control Center operated by DynCorp Viar, Inc., 300 N Lee St, Alexandria VA 22314, 703- 519-1140;

22.21. Analysis of Multi-media, Multi-concentration Samples for Dioxins and Furans, PCDD/PCDF Analyses Data Package. Narrative for Episode 4419, MRI Project No. 3091-A, op. cit. February 12, 1993, Available from the EPA Sample Control Center operated by DynCorp Viar Inc, 300 N Lee St, Alexandria, VA 22314 (703-519- 1140);

22.22. Analytical Procedures and Quality Assurance Plan for the Determination of PCDD/PCDF in Fish“, U. S. Environmental Protection Agency, Environmental Research Laboratory, Duluth, MN 55804, EPA/600/3-90/022, March 1990;

22.23. Afghan, B. K., Carron, J., Goulden, P. D., Lawrence, J., Leger, D., Onuska, F., Sherry, J., and Wilkenson, R. J., Recent Advances in Ultratrace Analysis of Dioxins and Related Halogenated Hydrocarbons. Can J. Chem., 65: 1086-1097, 1987;

22.24. Sherry, J. P. and Tse, H. A Procedure for the Determination of Polychlorinated Dibenzop- dioxins in Fish. Chemosphere, 20: 865-872, 1990;

22.25. Preliminary Fish Tissue Study. Results of Episode 4419, available from the EPA Sample Control Center operated by DynCorp Viar, Inc., 300 N Lee St, Alexandria, VA 22314, 703-519-1140;

22.26. Nestrick, Terry L. DOW Chemical Co., personal communication with D. R. Rushneck, April 8, 1993. Details available from the U. S. Environmental Protection Agency Sample Control Center operated by DynCorp Viar Inc, 300 N Lee St, Alexandria, VA 22314, 703-519-1140;

22.27. Barnstadt, Michael. Big Fish Column. Triangle Laboratories of RTP, Inc., SOP 129-90, 27 March 27, 1992;

22.28. Determination of Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins (PCDD) and Dibenzofurans (PCDF) in Environmental Samples Using EPA Method 1613. Chemical Sciences Department, Midwest Research Institute, 425 Volker Boulevard, Kansas City, MO 44110-2299, Standard Operating Procedure No. CS-153, January 15, 1992;

22.29. Ryan, John J. Raymonde Lizotte and William H. Newsome, J. Chromatog. 303 (1984) 351- 360;

22.30. Telliard, William A., McCarty, Harry B., and Riddick, Lynn S. Results of the Interlaboratory Validation Study of USEPA Method 1613 for the Analysis of Tetrathrough oCtachlorinated Dioxins and Furans by Isotope Dilution GC/MS. Chemosphere, 27, 41-46 (1993);

22.31. Results of the International Interlaboratory Validation Study of USEPA Method 1613. oCtober 1994, available from the EPA Sample Control Center operated by DynCorp Viar, Inc., 300 N Lee St, Alexandria, VA 22314, 703-519-1140.

1 lentelė. Chlorinti dibenzo-p-dioksinai ir chlorinti dibenzofuranai, nustatomi izotopų skiedimo ir vidinio standarto metodais su didelės skiriamosios gebos dujų chromatografija ir didelės skiriamosios gebos masių spektrometrija (DSGDCh/DSGMS)

CDD/CDF junginiai¹	CAS Registras	Žymėtieji analogai	CAS Registras
2,3,7,8-TCDD	1746-01-6	¹³C₁₂ -2,3,7,8-TCDD	76523-40-5
		³⁷Cl₄ -2,3,7,8-TCDD	85508-50-5
Visi TCDD	41903-57-5	-	-
2,3,7,8-TCDF	51207-31-9	¹³C₁₂ -2,3,7,8-TCDF	89059-46-1
Visi TCDF	55722-27-5	-	-
1,2,3,7,8-PeCDD	40321-76-4	¹³C₁₂-1,2,3,7,8-PeCDD	109719-79-1
Visi PeCDD	36088-22-9	-	-
1,2,3,7,8-PeCDF	57117-41-6	¹³C₁₂-1,2,3,7,8-PeCDF	109719-77-9
2,3,4,7,8-PeCDF	57117-31-4	¹³C₁₂ -2,3,4,7,8-PeCDF	116843-02-8
Visi PeCDF	30402-15-4	-	-
1,2,3,4,7,8-HxCDD	39227-28-6	¹³C₁₂ – 1,2,3,4,7,8-HxCDD	109719-80-4
1,2,3,6,7,8-HxCDD	57653-85-7	¹³C₁₂ – 1,2,3,6,7,8-HxCDD	109719-81-5
1,2,3,7,8,9-HxCDD	19408-74-3	¹³C₁₂ – 1,2,3,7,8,9-HxCDD	109719-82-6
Visi HxCDD	34465-46-8	-	-
1,2,3,4,7,8-HxCDF	70648-26-9	¹³C₁₂ – 1,2,3,4,7,8-HxCDF	114423-98-2
1,2,3,6,7,8-HxCDF	57117-44-9	¹³C₁₂ – 1,2,3,6,7,8-HxCDF	116843-03-9
1,2,3,7,8,9-HxCDF	72918-21-9	¹³C₁₂ – 1,2,3,7,8,9-HxCDF	116843-04-0
2,3,4,6,7,8-HxCDF	60851-34-5	¹³C₁₂ – 2,3,4,6,7,8-HxCDF	116843-05-1
Visi HxCDF	55684-94-1	-	-
1,2,3,4,6,7,8- HpCDD	35822-46-9	¹³C₁₂ – 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD	109719-83-7
Visi HpCDD	37871-00-4	-	-
1,2,3,4,6,7,8- HpCDF	67562-39-4	¹³C₁₂ – 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF	109719-84-8
1,2,3,4,7,8,9- HpCDF	55673-89-7	¹³C₁₂ – 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF	109719-94-0
Visi HpCDF	38998-75-3	-	-
OCDD	3268-87-9	¹³C₁₂ -OCDD	114423-97-1
OCDF	39001-02-0	nenaudojamas	-

TCDD – Tetrachlorodibenzo-p-dioksinas

PeCDD – Pentachlorodibenzo-p-dioksinas

HxCDD – Hexachlorodibenzo-p-dioksinas

HpCDD – Heptachlorodibenzo-p-dioksinas

OCDD – Octachlorodibenzo-p-dioksinas

TCDF – Tetrachlorodibenzofuranas

PeCDF – Pentachlorodibenzofuranas

HxCDF – Hexachlorodibenzofuranas

HpCDF – Heptachlorodibenzofuranas

OCDF – Octachlorodibenzofuranas

2 lentelė. Sulaikymo trukmės, kiekybinio įvertinimo etalonai, santykinės sulaikymo trukmės ir minimalūs CDD ir CDF junginių kiekiai

CDD/CDF	Sulaikymo trukmės ir kiekybinio įvertinimo etalonai	Santykinė sulaikymo trukmė	Minimalus kiekis¹
CDD/CDF	Sulaikymo trukmės ir kiekybinio įvertinimo etalonai	Santykinė sulaikymo trukmė	Vanduo (pg/L)	Kieta medžiaga (ng/kg)	Ekstraktas (pg/µl)
Junginiai, kuriems vidiniu standartu naudojamas ¹³C₁₂ -1,2,3, 4-TCDD
2,3,7,8-TCDF	¹³C₁₂ -2,3,7, 8-TCDF	0,999-1, 003	10	1	0,5
2,3,7,8-TCDD	¹³C₁₂ -2,3,7, 8-TCDD	0,999-1, 002	10	1	0,5
1,2,3,7,8-PeCDF	¹³C₁₂ -1,2,3, 7,8-PeCDF	0,999-1, 002	50	5	2,5
2,3,4,7,8-PeCDF	¹³C₁₂ -2,3,4, 7,8-PeCDF	0,999-1, 002	50	5	2,5
1,2,3,7,8-PeCDD	¹³C₁₂ -1,2,3, 7,8-PeCDD	0,999-1, 002	50	5	2,5
¹³C₁₂ -2,3, 7,8-TCDF	¹³C₁₂ -1,2,3, 4-TCDD	0,923-1, 103
¹³C₁₂ -2,3, 7,8-TCDD	¹³C₁₂ -1,2,3, 4-TCDD	0,976-1, 043
³⁷Cl₄ -2,3, 7,8-TCDD	¹³C₁₂ -1,2,3, 4-TCDD	0,989-1, 052
¹³C₁₂ -1,2, 3,7,8-PeCDF	¹³C₁₂ -1,2,3, 4-TCDD	1,000-1, 425
¹³C₁₂ -2,3, 4,7,8-PeCDF	¹³C₁₂ -1,2,3, 4-TCDD	1,011-1, 526
¹³C₁₂ -1,2, 3,7,8-PeCDD	¹³C₁₂ -1,2,3, 4-TCDD	1,000-1, 567
Junginiai, kuriems vidiniu standartu naudojamas ¹³C₁₂ -1,2,3, 7,8,9-HxCDD
1,2,3,4,7,8-HxCDF	¹³C₁₂ -1,2,3, 4,7,8-HxCDF	0,999-1, 001	50	5	2,5
1,2,3,6,7,8-HxCDF	¹³C₁₂ -1,2,3, 6,7,8-HxCDF	0,997-1, 005	50	5	2,5
1,2,3,7,8,9-HxCDF	¹³C₁₂ -1,2,3, 7,8,9-HxCDF	0,999-1, 001	50	5	2,5
2,3,4,6,7,8-HxCDF	¹³C₁₂ -2,3,4, 6,7,8,-HxCDF	0,999-1, 001	50	5	2,5
1,2,3,4,7,8-HxCDD	¹³C₁₂ -1,2,3, 4,7,8-HxCDD	0,999-1, 001	50	5	2,5
1,2,3,6,7,8-HxCDD	¹³C₁₂ -1,2,3, 6,7,8,-HxCDD	0,998-1, 004	50	5	2,5
1,2,3,7,8,9-HxCDD	²	1,000-1, 019	50	5	2,5
1,2,3,4,6,7, 8-HpCDF	¹³C₁₂ -1,2,3, 4,6,7,8-HpCDF	0,999-1, 001	50	5	2,5
1,2,3,4,7,8, 9-HpCDF	¹³C₁₂-1,2,3, 4,7,8,9-HpCDF	0,999-1, 001	50	5	2,5
1,2,3,4,6,7, 8-HpCDD	¹³C₁₂ -1,2,3, 4,6,7,8-HpCDD	0,999-1, 001	50	5	2,5
OCDF	¹³C₁₂ -OCDD	0,999-1, 008	100	10	5,0
OCDD	C -OCDD	0,999-1, 001	100	10	5,0
¹³C₁₂ -1,2, 3,4,7,8-HxCDF	¹³C₁₂-1,2,3, 7,8,9-HxCDD	0,944-0, 970
¹³C₁₂ -1,2, 3,6,7,8-HxCDF	¹³C₁₂ -1,2,3, 7,8,9-HxCDD	0,949-0, 975
¹³C₁₂ -1,2, 3,7,8,9-HxCDF	¹³C₁₂ -1,2,3, 7,8,9-HxCDD	0,977-1, 047
¹³C₁₂- 2,3,4,6,7,8,-HxCDF	¹³C₁₂ -1,2,3, 7,8,9-HxCDD	0,959-1, 021
¹³C₁₂- 1,2,3,4,7,8-HxCDD	¹³C₁₂ -1,2,3, 7,8,9-HxCDD	0,977-1, 000
¹³C₁₂ -1,2, 3,6,7,8-HxCDD	¹³C₁₂ -1,2,3, 7,8,9-HxCDD	0,981-1, 003
¹³C₁₂ -1,2, 3,4,6,7,8-HpCDF	¹³C₁₂ -1,2,3, 7,8,9-HxCDD	1,043-1, 085
¹³C₁₂ -1,2, 3,4,7,8,9-HpCDF	¹³C₁₂ -1,2,3, 7,8,9-HxCDD	1,057-1, 151
¹³C₁₂ -1,2, 3,4,6,7,8-HpCDD	¹³C₁₂-1,2,3, 7,8,9-HxCDD	1,086-1, 110
¹³C₁₂ -OCDD	¹³C₁₂ -1,2,3, 7,8,9-HxCDD	1,032-1, 311

3. lentelė. CDD/CDF ir žymėtųjų junginių pradinių standartinių ir naudojamų papildymui standartinių tirpalų koncentracijos

CDD/CDF	Pradinis žymėtųjų junginių standartinis tirpalas¹ (ng/ml)	Papildymui naudojamas žymėtųjų junginių standartinis tirpalas² (ng/ml)	Glaudumo ir išgavos pradinis standartinis tirpalas³ (ng/ml)	Papildymui naudojamas glaudumo ir išgavos standartinis tirpalas⁴ (ng/ml)
2,3,7,8-TCDD	-	-	40	0,8
2,3,7,8-TCDF	-	-	40	0,8
1,2,3,7,8-PeCDD	-	-	200	4
1,2,3,7,8-PeCDF	-	-	200	4
2,3,4,7,8-PeCDF	-	-	200	4
1,2,3,4,7,8-HxCDD	-	-	200	4
1,2,3,6,7,8-HxCDD	-	-	200	4
1,2,3,7,8,9-HxCDD	-	-	200	4
1,2,3,4,7,8-HxCDF	-	-	200	4
1,2,3,6,7,8-HxCDF	-	-	200	4
1,2,3,7,8,9-HxCDF	-	-	200	4
2,3,4,6,7,8-HxCDF	-	-	200	4
1,2,3,4,6,7,8-HpCDD	-	-	200	4
1,2,3,4,6,7,8-HpCDF	-	-	200	4
1,2,3,4,7,8,9-HpCDF	-	-	200	4
OCDD	-	-	400	8
OCDF	-	-	400	8
¹³C₁₂ -2,3,7,8-TCDD	100	2	-	-
¹³C₁₂ -2,3,7,8-TCDF	100	2	-	-
¹³C₁₂ -1,2,3,7,8-PeCDD	100	2	-	-
¹³C₁₂ -1,2,3,7,8-PeCDF	100	2	-	-
¹³C₁₂ -2,3,4,7,8-PeCDF	100	2	-	-
¹³C₁₂-1,2,3,4,7,8-HxCDD	100	2	-	-
¹³C₁₂ -1,2,3,6,7,8-HxCDD	100	2	-	-
¹³C₁₂ -1,2,3,4,7,8-HxCDF	100	2	-	-
¹³C₁₂-1,2,3,6,7,8-HxCDF	100	2	-	-
¹³C₁₂ -1,2,3,7,8,9-HxCDF	100	2	-	-
¹³C₁₂ -2,3,4,6,7,8-HxCDF	100	2	-	-
¹³C₁₂ -1,2,3,4,6,7,8-HpCDD	100	2	-	-
¹³C₁₂ -1,2,3,4,6,7,8-HpCDF	100	2	-	-
¹³C₁₂ -1,2,3,4,7,8,9-HpCDF	100	2	-	-
¹³C₁₂ -OCDD	200	4	-	-
Gryninimo standartinis tirpalas⁵
³⁷Cl₄ -2,3,7,8-TCDD, ng/ml	0,8
Vidinio standarto tirpalai⁶
¹³C₁₂ -1,2,3,4-TCDD, ng/ml	200
¹³C₁₂ -1,2,3,7,8,9-HxCDD, ng/ml	200

CDD/CDF	KS1 (ng/ml)	KS2 (ng/ml)	KS3 (ng/ ml)	KS4 (ng/ml)	KS5 (ng/ml)
2,3,7,8-TCDD	0,5	2	10	40	200
2,3,7,8-TCDF	0,5	2	10	40	200
1,2,3,7,8-PeCDD	2,5	10	50	200	1000
1,2,3,7,8-PeCDF	2,5	10	50	200	1000
2,3,4,7,8-PeCDF	2,5	10	50	200	1000
1,2,3,4,7,8-HxCDD	2,5	10	50	200	1000
1,2,3,6,7,8-HxCDD	2,5	10	50	200	1000
1,2,3,7,8,9-HxCDD	2,5	10	50	200	1000
1,2,3,4,7,8-HxCDF	2,5	10	50	200	1000
1,2,3,6,7,8-HxCDF	2,5	10	50	200	1000
1,2,3,7,8,9-HxCDF	2,5	10	50	200	1000
2,3,4,6,7,8-HxCDF	2,5	10	50	200	1000
1,2,3,4,6,7,8-HpCDD	2,5	10	50	200	1000
1,2,3,4,6,7,8-HpCDF	2,5	10	50	200	1000
1,2,3,4,7,8,9-HpCDF	2,5	10	50	200	1000
OCDD	5,0	20	100	400	2000
OCDF	5,0	20	100	400	2000
¹³C₁₂ -2,3,7,8-TCDD	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -2,3,7,8-TCDF	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -1,2,3,7,8-PeCDD	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -1,2,3,7,8-PeCDF	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -2,3,4,7,8-PeCDF	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -1,2,3,4,7,8- HxCDD	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -1,2,3,6,7,8- HxCDD	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -1,2,3,4,7,8- HxCDF	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -1,2,3,6,7,8- HxCDF	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -1,2,3,7,8,9- HxCDF	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -2,3,4,6,7,8- HxCDF	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -1,2,3,4,6,7,8- HpCDD	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -1,2,3,4,6,7,8- HpCDF	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -1,2,3,4,7,8,9- HpCDF	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -OCDD	200	200	200	200	200
Gryninimo standartinis tirpalas⁵ ³⁷Cl₄-2,3,7,8-TCDD	0,5	2	10	40	200
Vidinio standarto tirpalai⁶
¹³C₁₂-1,2,3,4-TCDD	100	100	100	100	100
¹³C₁₂ -1,2,3,7,8,9- HxCDD	100	100	100	100	100

5 lentelė. DCh sulaikymo trukmės intervalą charakterizuojantis tirpalas ir izomerų specifiškumo testo standartas (žr. 7.15 punktą)

DCh sulaikymo trukmės nustatymo tirpalas DB-5 kolonėlei
CDD/CDF	Pirmuoju eliuojamas	Paskutiniu eliuojamas
TCDF	1,3,6,8-	1,2,8,9-
TCDD	1,3,6,8-	1,2,8,9-
PeCDF	1,3,4,6,8-	1,2,3,8,9-
PeCDD	1,2,4,7,9-	1,2,3,8,9-
HxCDF	1,2,3,4,6,8-	1,2,3,4,8,9-
HxCDD	1,2,4,6,7,9-	1,2,3,4,6,7-
HpCDF	1,2,3,4,6,7,8-	1,2,3,4,7,8,9-
HpCDD	1,2,3,4,6,7,9-	1,2,3,4,6,7,8-
TCDD specifiškumo testo standartas DB-5 kolonėlei 1,2,3,7-TCDD +1,2,3,8-TCDD 2,3,7,8-TCDD 1,2,3,9-TCDD

TCDF izomerų specifiškumo testo standartas DB-225 kolonėlei 2,3,4,7-TCDF 2,3,7,8-TCDF 1,2,3,9-TCDF

6 lentelė. Priimtini tinkamumo testo kriterijai, kai tiriami visi CDD/CDF junginiai ¹

CDD/CDF	Koncentracija (ng/ml)	PGI ²³		TGI ⁴(ng/ml)	Kalibravimo patikra (ng/ml)
CDD/CDF	Koncentracija (ng/ml)	s (ng/ml)	X (ng/ml)	TGI ⁴(ng/ml)	Kalibravimo patikra (ng/ml)
2,3,7,8-TCDD	10	2,8	8,3-12,9	6,7-15,8	7,8-12,9
2,3,7,8-TCDF	10	2,0	8,7-13,7	7,5-15,8	8,4-12,0
1,2,3,7,8-PeCDD	50	7,5	38-66	35-71	39-65
1,2,3,7,8-PeCDF	50	7,5	43-62	40-67	41-60
2,3,4,7,8-PeCDF	50	8,6	36-75	34-80	41-61
1,2,3,4,7,8-HxCDD	50	9,4	39-76	35-82	39-64
1,2,3,6,7,8-HxCDD	50	7,7	42-62	38-67	39-64
1,2,3,7,8,9-HxCDD	50	11,1	37-71	32-81	41-61
1,2,3,4,7,8-HxCDF	50	8,7	41-59	36-67	45-56
1,2,3,6,7,8-HxCDF	50	6,7	46-60	42-65	44-57
1,2,3,7,8,9-HxCDF	50	6,4	42-61	39-65	45-56
2,3,4,6,7,8-HxCDF	50	7,4	37-74	35-78	44-57
1,2,3,4,6,7,8- HpCDD	50	7,7	38-65	35-70	43-58
1,2,3,4,6,7,8- HpCDF	50	6,3	45-56	41-61	45-55
1,2,3,4,7,8,9- HpCDF	50	8,1	43-63	39-69	43-58
OCDD	100	19	89-127	78-144	79-126
OCDF	100	27	74-146	63-170	63-159
¹³C₁₂ -2,3,7,8- TCDD	100	37	28-134	20-175	82-121
¹³C₁₂ -2,3,7,8- TCDF	100	35	31-113	22-152	71-140
¹³C₁₂ -1,2,3,7,8- PeCDD	100	39	27-184	21-227	62-160
¹³C₁₂ -1,2,3,7,8- PeCDF	100	34	27-156	21-192	76-130
¹³C₁₂ -2,3,4,7,8- PeCDF	100	38	16-279	13-328	77-130
¹³C₁₂ – 1,2,3,4,7,8-HxCDD	100	41	29-147	21-193	85-117
¹³C₁₂ – 1,2,3,6,7,8-HxCDD	100	38	34-122	25-163	85-118
¹³C₁₂ – 1,2,3,4,7,8-HxCDF	100	43	27-152	19-202	76-131
¹³C₁₂ – 1,2,3,6,7,8-HxCDF	100	35	30-122	21-159	70-143
¹³C₁₂ – 1,2,3,7,8,9-HxCDF	100	40	24-157	17-205	74-135
¹³C₁₂ – 2,3,4,6,7,8-HxCDF	100	37	29-136	22-176	73-137
¹³C₁₂ – 1,2,3,4,6,7,8- HpCDD	100	35	34-129	26-166	72-138
¹³C_{12 –}1,2,3,4,6,7,8- HpCDF	100	41	32-110	21-158	78-129
¹³C₁₂ – 1,2,3,4,7,8,9- HpCDF	100	40	28-141	20-186	77-129
¹³C₁₂ -OCDD	200	95	41-276	26-397	96-415
³⁷Cl₄ -2,3,7,8- TCDD	10	3,6	3,9-15,4	3,1-19,1	7,9-12,7

s – koncentracijos standartinis nukrypimas.

X – vidutinė koncentracija.

6 a lentelė. Priimtini tinkamumo testo kriterijai, kai tiriami tik tetra- junginiai¹

CDD/CDF	Koncentracija (ng/ml)	PGI		TGI (ng/ml)	Kalibravimo patikra (ng/ml)
CDD/CDF	Koncentracija (ng/ml)	s (ng/ml)	X (ng/ml)	TGI (ng/ml)	Kalibravimo patikra (ng/ml)
2,3,7,8-TCDD	10	2,7	8,7-12,4	7,3-14,6	8,2-12,3
2,3,7,8-TCDF	10	2,0	9,1-13,1	8,0-14,7	8,6-11,6
¹³C₁₂ -2,3,7,8-TCDD	100	35	32-115	25-141	85-117
¹³C₁₂ -2,3,7,8-TCDF	100	34	35-99	26-126	76-131
³⁷Cl₄ -2,3,7,8-TCDD	10	3,4	4,5-13,4	3,7-15,8	8,3-12,1

s – koncentracijos standartinis nukrypimas

X – vidutinė koncentracija.

7 lentelė. Žymėtųjų junginių išgavos mėginiuose, kai tiriami visi CDD/CDF junginiai

Junginys	Koncentracija (ng/ml)	Žymėtų junginių išgava
Junginys	Koncentracija (ng/ml)	(ng/ml)¹	(%)
¹³C₁₂ -2,3,7,8-TCDD	100	25-164	25-164
¹³C₁₂ -2,3,7,8-TCDF	100	24-169	24-169
¹³C₁₂ -1,2,3,7,8-PeCDD	100	25-181	25-181
¹³C₁₂ -1,2,3,7,8-PeCDF	100	24-185	24-185
¹³C₁₂-2,3,4,7,8-PeCDF	100	21-178	21-178
¹³C₁₂ -1,2,3,4,7,8-HxCDD	100	32-141	32-141
¹³C₁₂ -1,2,3,6,7,8-HxCDD	100	28-130	28-130
¹³C₁₂ -1,2,3,4,7,8-HxCDF	100	26-152	26-152
¹³C₁₂-1,2,3,6,7,8-HxCDF	100	26-123	26-123
¹³C₁₂ -1,2,3,7,8,9-HxCDF	100	29-147	29-147
¹³C₁₂ -2,3,4,6,7,8-HxCDF	100	28-136	28-136
¹³C₁₂ -1,2,3,4,6,7,8-HpCDD	100	23-140	23-140
¹³C₁₂ -1,2,3,4,6,7,8-HpCDF	100	28-143	28-143
¹³C₁₂ -1,2,3,4,7,8,9-HpCDF	100	26-138	26-138
¹³C₁₂ -OCDD	200	34-313	17-157
³⁷Cl₄ -2,3,7,8-TCDD	10	3,5-19,7	35-197

7a lentelė. Žymėtųjų junginių išgavos mėginiuose, kai tiriami tik tetra- junginiai

Junginys	Koncentracija (ng/ml)	Žymėtų junginių išgava
Junginys	Koncentracija (ng/ml)	(ng/ml)¹	(%)
¹³C₁₂ -2,3,7,8-TCDD	100	31-137	31-137
¹³C₁₂ -2,3,7,8-TCDF	100	29-140	29-140
³⁷Cl₄ -2,3,7,8-TCDD	10	4,2-16,4	42-164

8 lentelė. CDD/CDF junginių deskriptoriai, m/z, m/z tipai ir elementinė sudėtis

Deskriptorius	m/z¹	m/z tipas	Elementinė sudėtis	Junginys²
1	292,9825	Pamatinis	C7F11	PFK
	303,9016	M	C12H4-35Cl4O	TCDF
	305,8987	M+2	C12H4-35Cl3-37ClO	TCDF

	315,9419	M	13C12H4-35Cl4O	TCDF³
	317,9389	M+2	13C12H4-35Cl3-37ClO	TCDF³

	319,8965	M	C12H4-35Cl4O2	TCDD
	321,8936	M+2	C12H4-35Cl3-37ClO2	TCDD

	327,8847	M	C12H4-37Cl4O2	TCDD⁴
	330,9792	KK	C7F13	PFK
	331,9368	M	13C12H4-35Cl4O2	TCDD³
	333,9339	M+2	13C12H4-35Cl3-37ClO2	TCDD³

	375,8364	M+2	C12H4-35Cl5-37ClO	HxCDPE

2	339,8597	M+2	C12H3-35Cl4-37ClO	PeCDF

	341,8567	M+4	C12H3-35Cl3-37Cl2O	PeCDF

	351,9000	M+2	13C12H3-35Cl4-37ClO	PeCDF

	353,8970	M+4	13C12H3-35Cl3-37Cl2O	PeCDF³

	354,9792	Pamatinis	C9F13	PFK
	355,8546	M+2	C12H3-35Cl4-37ClO2	PeCDD

	357,8516	M+4	C12H3-35Cl3-37Cl2O2	PeCDD

	367,8949	M+2	13C12H3-35Cl4-37ClO2	PeCDD³

	369,8919	M+4	13C12H3-35Cl3-37Cl2O2	PeCDD³

	409,7974	M+2	C12H3-35Cl6-37ClO	HpCDPE

3	373,8208	M+2	C12H2-35Cl5-37ClO	HxCDF

	375,8178	M+4	C12H2-35Cl4-37Cl2O	HxCDF

	383,8639	M	13C12H2-35Cl6O	HxCDF³
	385,8610	M+2	13C12H2-35Cl5-37ClO	HxCDF³

	389,8157	M+2	C12H2-35Cl5-37ClO2	HxCDD

	391,8127	M+4	C12H2-35Cl4-37Cl2O2	HxCDD

	392,9760	Pamatinis	C9F15	PFK
	401,8559	M+2	13C12H2-35Cl5-37ClO2	HxCDD-3

	403,8529	M+4	13C12H2-35Cl4-37Cl2O2	HxCDD-3

	430,9729	KK	C9F17	PFK
	445,7555	M+4	C12H2-35Cl6-37Cl2O	OCDPE

4	407,7818	M+2	C12H-35Cl6-37ClO	HpCDF

	409,7789	M+4	C12H-35Cl5-37Cl2O	HpCDF

	417,8253	M	13C12H-35Cl7O	HpCDF-3
	419,8220	M+2	13C12H-35Cl6-37ClO	HpCDF-3

	423,7766	M+2	C12H-35Cl6-37ClO2	HpCDD

	425,7737	M+4	C12H-35Cl5-37Cl2O2	HpCDD

	430,9729	Pamatinis	C9F17	PFK
	435,8169	M+2	13C12H-35Cl6-37ClO2	HpCDD-3

	437,8140	M+4	13C12H-35Cl5-37Cl2O2	HpCDD-3

	479,7165	M+4	C12H-35Cl7-37Cl2O	NCDPE

5	441,7428	M+2	C12-35Cl7-37ClO	OCDF

	442,9728	Pamatinis	C10F17	PFK
	443,7399	M+4	C12-35Cl6-37Cl2O	OCDF

	457,7377	M+2	C12-35Cl7-37ClO2	OCDD

	459,7348	M+4	C12-35Cl6-37Cl2O2	OCDD

	469,7779	M+2	13C12-35Cl7-37ClO2	OCDD-3

	471,7750	M+4	13C12-35Cl6-37Cl2O2	OCDD-3

	513,6775	M+4	C12-35Cl8-37Cl2O	DCDPE

9 lentelė. Teoriniai jonų intensyvumų santykiai ir KK ribos.

Chloro atomų kiekis	m/z santykio išraiška	Teorinis santykis	KK riba¹
			Mažiausia	Didžiausia
4²	M/(M+2)	0,77	0,65	0,89

5	(M+2)/(M+4)	1,55	1,32	1,78

6	(M+2)/(M+4)	1,24	1,05	1,43

6³	M/(M+2)	0,51	0,43	0,59

7	(M+2)/(M+4)	1,05	0,88	1,20

7⁴	M/(M+2)	0,44	0,37	0,51

8	(M+2)/(M+4)	0,89	0,76	1,02

10 lentelė. Ekstrahavimui rekomenduojami įvairių matricų mėginių kiekiai¹

Matrica²	Mėginys	Kietų medžiagų %	Fazė	Ekstrahuojamas kiekis
Vienafazė:
Vanduo	Geriamas vanduo	< 1	-³	1000 ml
	Gruntinis vanduo
	Išvalytos nuotekos
Kieta	Sausas dirvožemis	> 20
	Kompostas		Kieta	10 g
	Pelenai
Organinė	Tirpiklių atliekos	< 1	Organinė
	Naftos produktų atliekos			10 g
	Organiniai polimerai
Audiniai	Žuvis	-	Organinė	10 g
	Riebalai	-	Organinė	10 g
Daugiafazė:
Skystis-kieta medžiaga
Vanduo-kieta medžiaga	Drėgnas dirvožemis Nevalytos nuotekos	1 - 30	Kieta	10 g
	Komunalinis dumblas
	Popieriaus masė
	Filtro gabaliukai
Organinė-kieta medžiaga	Pramoninis dumblas Naftos produktų turinčios atliekos	1 - 100	Abi	10 g
Skystis-skystis:
Vanduo-organinė	Procese naudojamos nuotekos	< 1	Organinė	10 g
	Nevalytos nuotekos
	Šalinamos nuotekos

1 pav. Vandens ir kietų mėginių analizės schema

2 pav. Daugiafazių mėginių analizės schema

3 pav. Audinių mėginių analizės schema

4 pav. Kietafazio ekstrahavimo įranga

5 pav. Soxhlet-Dean-Stark ekstraktorius

6 pav. 2,3,7,8-TCDD ir izomerų atskyrimas DB-5 kolonėlėje

7 pav. 2,3,7,8-TCDF ir izomerų atskyrimas DB-5 kolonėlėje

______________

^{^[1]} A ir B medžiagų grupės apibūdintos Tarybos direktyvos 96/23/EB 1 priede (OJ L 125, 23.05.1996, p. 10)

^{^[2]} Išeiga – mėginyje esančios analitės masės dalis, kuri išlieka galutiniame ekstrakte.

^{^[3]} Išgava – į mėginį pridėtos analitės masės dalis, kuri išlieka galutiniame ekstrakte. Likusioje dokumento dalyje daroma prielaida, kad išeiga ir išgava yra vienodos, todėl vartojamas tik terminas „išgava“.

¹ Chlorinti dibenzo-p-dioxinai ir chlorinti dibenzofuranai

¹ Kiekvienos analitės minimaliu lygiu (ML) laikomas toks kiekis, kuriam esant analitinė sistema turi duoti atpažįstamą signalą ir priimtiną kalibravimo tašką. Jis yra lygus mažiausio kalibracinio standarto koncentracijai tariant, kad laikomasi visų, metode nurodytų, mėginių svorių, tūrių ir gryninimo procedūrų.

¹ ruošiami nonane ir skiedžiami gaminant papildymo tirpalą (žr. 7.10 punktą).

² ruošiami acetone, iš pradinio tirpalo, gaminami kasdien (žr. 7.10.3 punktą).

³ ruošiami nonane ir skiedžiami gaminant papildymo tirpalą (žr. 7.9 punktą).

⁴ ruošiami acetone, iš pradinio tirpalo, gaminami kasdien (žr. 7.14 punktą).

⁵ ruošiami nonane ir pridedami į ekstraktą prieš gryninimą (žr. 7.11 punktą).

⁶ ruošiami nonane (žr. 7.12 punktą) ir pridedami į sukoncentruotą ekstraktą prieš pat įleidžiant į DCh (žr. 14.2 punktą).

¹ Visos charakteristikos atitinka koncentraciją galutiniame ekstrakte, tariant, kad jo tūris 20µl.

³ PGI – pradinis glaudumas ir išgava.

² PGI – pradinis glaudumas ir išgava.

¹ Visos charakteristikos atitinka koncentraciją galutiniame ekstrakte, tariant, kad jo tūris 20miul.

¹ Visos charakteristikos atitinka koncentraciją galutiniame ekstrakte, tariant, kad jo tūris 20 µl.

¹ Naudotos atominės masės:

H = 1,007825; C = 12,00000; -13C = 13,003355; F = 18,9984 O =

15,994915; -35Cl = 34.968853; -37Cl = 36.965903

² TCDD – Tetrachlorodibenzo-p-dioksinas;

PeCDD – Pentachlorodibenzo-p- dioksinas;

HxCDD – Heksachlorodibenzo-p- dioksinas;

HpCDD – Heptachlorodibenzo-p- dioksinas;

OCDD – Oktachlorodibenzo-p- dioksinas;

HxCDPE – Heksachlorodifenil eteris;

OCDPE – Oktachlorodifenil eteris;

DCDPE – Decachlorodifenil eteris;

TCDF – Tetrachlorodibenzofuranas;

PeCDF – Pentachlorodibenzofuranas;

HxCDF – Heksachlorodibenzofuranas;

HpCDF – Heptachlorodibenzofuranas;

OCDF – Oktachlorodibenzofuranas;

HpCDPE – Heptachlorodifenil eteris;

NCDPE – Nonachlorodifenil eteris;

PFK – fluorintų anglevandenilių mišinys

³ Žymėtieji junginiai.

⁴ 37Cl4 -2,3,7,8,-TCDD (gryninimo standartas) yra tik vienas m/z.

¹ KK ribos atitinka +- 15 % teorinio jonų perteliaus santykių

intervalą.

² Netaikoma -37Cl4-2,3,7,8-TCDD (gryninimo standartas).

³Taikoma tik -13C12-HxCDF.

⁴ Taikoma tik -13C12-HpCDF.

¹ Ekstrahuojamo mėginio kiekis pasirenkamas taip, kad jame butų 10 g kietos medžiagos (sveriant sausą). Viename litre

vandens mėginio, kuriame yra 1 % netirpių medžiagų, bus 10 g kietų medžiagų. Jei vandens mėginyje yra daugiau nei 1 % netirpių medžiagų, ekstrahavimui tokio mėginio imama atitinkamai mažiau.

². Kai kurių mėginių matrica gali būti amorfinė. Jei CDD/CDF junginiai kontaktuoja su daugiafaze sistema, kurių viena vanduo, dėl mažo šių junginių tirpumo vandenyje jie pirmiausia turi būti disperguojami arba adsorbuojami kitoje fazėje.

^3.Vandens mėginiai prieš filtravimą papildomi žymėtaisiais junginiais. Filtratas ir ant filtro likusios medžiagos

ekstrahuojamos atskirai. Abu ekstraktai sujungiami gryninimui ir analizei.