LIETUVOS RESPUBLIKOS APLINKOS MINISTERIJA
Į S A K Y M A S
DĖL LIETUVOS APLINKOS APSAUGOS NORMATYVINIŲ DOKUMENTŲ LAND 74-2005, LAND 75-2005, LAND 76-2005 IR LAND 77-2005 PATVIRTINIMO
2005 m. spalio 3 d. Nr. D1-478
Vilnius
Vadovaudamasis Cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmogaus sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos, patvirtintos sveikatos apsaugos ministro ir aplinkos ministro 2000 m. gruodžio 29 d. įsakymu Nr. 762/556 (Žin., 2001, Nr. 3-60), 11 punktu,
1. Tvirtinu pridedamus Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos normatyvinius dokumentus:
2. Nustatau, kad 1 punkte nurodyti Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos normatyviniai dokumentai yra privalomi juridiniams ir fiziniams asmenims, nustatyta tvarka atliekantiems cheminių medžiagų ir preparatų tyrimus.
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos aplinkos ministro
2005 m. spalio 3 d. įsakymu Nr. D1-478
LAND 74-2005 „DIRVOŽEMIO MIKROORGANIZMAI. AZOTO TRANSFORMAVIMO TYRIMAS (C.21)“
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Šiame aplinkos apsaugos normatyviniame dokumente aprašytas laboratorinis metodas, skirtas tirti ilgalaikius cheminių medžiagų vienkartinio veikimo poveikius azoto transformavime dalyvaujančių dirvožemio mikroorganizmų aktyvumui. Tyrimų metodas daugiausia pagrįstas Europos ir Viduržemio jūros augalų apsaugos organizacijos (European and Mediterranean Plant Protection Organization) rekomendacijomis (1). Tačiau buvo atsižvelgta ir į kitus nurodymus, įskaitant Vokietijos Biologische Bundesanstalt (2), JAV Aplinkos apsaugos agentūros (3), SETAC (4) ir Tarptautinės standartizacijos organizacijos (5) rekomendacijas. Belgirate, Italijoje, 1995 m. vykusiame Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacijos (OECD – Organization for Economic Cooperation and Development) seminare dėl dirvožemių ir nuosėdų atrankos (6) buvo susitarta dėl šiam tyrimui skirtų naudoti dirvožemių tipo ir skaičiaus. Dirvožemio mėginių ėmimo, tvarkymo ir laikymo rekomendacijos pagrįstos ISO vadovu (7) ir Belgirate seminaro rekomendacijomis. Įvertinant tiriamųjų medžiagų toksiškumo charakteristikas, gali tekti nustatyti jų poveikio dirvožemio mikrobiniam aktyvumui efektus, pvz., kai reikia turėti duomenis apie galimus šalutinius augalų apsaugos produktų poveikius (šalutinius efektus) dirvožemio mikroflorai arba kai tikimasi kitų, nei augalų apsaugos produktai, cheminių medžiagų galimo poveikio dirvožemio mikroorganizmams. Azoto transformavimo tyrimas atliekamas siekiant nustatyti tokių cheminių medžiagų poveikio dirvožemio mikroflorai efektus. Jei tiriamos agrocheminės medžiagos (pvz., augalų apsaugos produktai, trąšos, miškininkystėje naudojamos cheminės medžiagos), atliekami azoto ir anglies transformavimo tyrimai. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, pakanka azoto transformavimo tyrimo. Tačiau, jei atliekant tokių cheminių medžiagų azoto transformavimo tyrimą, jų EC50 vertės patenka į intervalą, nustatytą prekyboje esantiems nitrifikacijos inhibitoriams (pvz., nitrapirinui), papildomai informacijai gauti gali būti atliekamas anglies junginių transformavimo tyrimas.
Dirvožemis susideda iš gyvųjų ir negyvųjų komponentų, esančių sudėtiniuose ir heterogeniniuose mišiniuose. Mikroorganizmai vaidina svarbų vaidmenį derlingų dirvožemių organinių medžiagų visumos skaidyme ir transformavime, kur didelis skaičius rūšių daro poveikį dirvožemio derlingumui. Visoks ilgalaikis tokių biocheminių procesų trukdymas gali pažeisti mitybinių komponentų ciklą, ir tai gali pakeisti dirvožemio derlingumą. Anglies ir azoto junginių transformavimas vyksta visuose derlinguose dirvožemiuose. Nors mikroorganizmų bendrijos, kurių dėka šie procesai vykdomi, įvairiuose dirvožemiuose vienas nuo kito skiriasi, transformavimo keliai iš esmės yra tie patys.
Aprašytas tyrimo metodas skirtas nustatyti tiriamosios medžiagos ilgalaikius neigiamus poveikius (efektus) azoto transformavimui aerobiniuose paviršiniuose dirvožemiuose. Be to, šis tyrimų metodas leidžia įvertinti tiriamosios medžiagos poveikio efektus mikrofloros vykdomam anglies junginių transformavimui. Nitratų susidarymas vyksta po anglies ir azoto jungčių skilimo. Taigi jei yra nustatyta, kad apdorotame ir kontroliniame dirvožemiuose nitratų sudarymo greitis yra vienodas, yra labai tikėtina, kad pagrindiniai anglies junginių skilimo keliai yra nepaliesti ir funkcionuoja. Tyrimui parinktas substratas (liucernos šieno milteliai) turi tinkamą anglies ir azoto santykį (paprastai nuo 12/1 iki 16/1). Dėl šios priežasties anglies trūkumas tyrimo metu būna sumažintas ir, jei cheminė medžiaga pažeistų mikroorganizmų bendrijas, jos galėtų atsistatyti per laikotarpį iki 100 parų.
Tyrimai, kurių pagrindu parengtas šis tyrimų metodas, iš pradžių buvo skirti medžiagoms, kurių atveju kiekį, pasiekiantį dirvožemį, buvo galima numatyti. Taip būna, pvz., naudojant augalų apsaugos produktus, kurių laukuose naudojama medžiagos norma yra žinoma. Tiriant agrochemines medžiagas pakanka dviejų dozių, atitinkančių numatomą arba prognozuojamą naudojimo normą. Agrochemines medžiagas galima tirti skaičiuojant arba tyrimui imti kaip veikliuosius ingredientus (a. i.), arba kaip preparatus. Tačiau tyrimo galimybės nėra apribotos agrocheminėmis medžiagomis. Keičiant tiek į dirvožemį dedamos tiriamosios medžiagos kiekį, tiek ir duomenų įvertinimo būdą, tyrimo metodą dar galima panaudoti ištirti cheminėms medžiagoms, kurių kiekis, tikėtinai patenkantis į dirvožemį, nėra žinomas. Taigi jei tai neagrocheminės medžiagos, nustatoma kaip kelių skirtingų koncentracijų medžiaga veikia azoto transformavimą. Šių tyrimų duomenys yra naudojami dozės ir atsako santykio kreivei sudaryti ir ECx vertei apskaičiuoti, kur x yra apibrėžiamas kaip poveikio efekto %.
II. NUORODOS
III. APIBRĖŽIMAI
3. Azoto transformavimas – mikroorganizmų atliekamas azoto turinčių organinių medžiagų visumos galutinis skaidymas, praeinantis per amonifikacijos ir nitrifikacijos procesus iki būdingo galutinio produkto – nitrato.
4. ECx (efektyvioji koncentracija) – tiriamosios medžiagos dirvožemyje koncentracija, dėl kurios azoto transformavimas iki nitrato inhibuojamas x procentų.
V. PRINCIPAS
7. Prasijotas dirvožemis yra pagerinamas augalinių pašarų milteliais ir apdorojamas įmaišant tiriamosios medžiagos arba paliekamas neapdorotas (kontrolinis). Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, rekomenduojama naudoti bent dvi tiriamosios medžiagos koncentracijas, kurios parenkamos pagal didžiausią laukuose numatomą koncentraciją. Po 0, 7, 14 ir 28 inkubavimo parų apdoroti ir kontroliniai dirvožemio mėginiai ekstrahuojami tinkamu tirpikliu ir ekstraktuose nustatomas nitrato kiekis. Lyginamas nitrato sudarymo greitis apdorotuose ir kontroliniuose mėginiuose ir apskaičiuojamas apdorotojo mėginio procentinis nuokrypis nuo kontrolinio mėginio. Visi tyrimai vykdomi ne mažiau kaip 28 paras. Jei 28 parą skirtumas tarp apdoroto ir neapdoroto dirvožemio yra 25 % arba didesnis, matavimai tęsiami ne daugiau kaip iki 100 parų. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, sudaromos serijos į dirvožemio mėginius dedant kelių koncentracijų tiriamosios medžiagos, ir susidariusio nitrato kiekis apdorotuose ir kontroliniuose mėginiuose matuojamas po 28 inkubavimo parų. Daugelio koncentracijų tyrimo rezultatai analizuojami pagal regresijos modelį ir apskaičiuojama ECx vertė (t. y. EC50, EC25 ir/arba EC10). Žr. apibrėžimus.
VI. TYRIMO PAGRĮSTUMAS
8. Tyrimų su agrocheminėmis medžiagomis rezultatų įvertinimas yra pagrįstas sąlyginai mažu [t. y. vidutinė vertė (±25 %)] nitrato koncentracijos skirtumu tarp kontrolinių ir apdorotų dirvožemio mėginių, taigi didelė kontrolinių mėginių duomenų sklaida gali būti klaidingų rezultatų priežastis. Todėl kartotinių kontrolinių mėginių rezultatų skirtumas turi būti mažesnis kaip (±15) %.
VII. TYRIMO EIGA
9. Aparatūra
9.1. Naudojami tyrimui skirti indai, pagaminti iš chemiškai inertinės medžiagos. Jie turi būti reikiamos talpos, atsižvelgiant į esamą dirvožemių inkubavimo procedūrą, t. y. inkubavimą vieno vientiso mėginio arba serijos atskirų dirvožemio vienkartinių mėginių (žr. 15.1.2 punktą). Reikia imtis priemonių kiek įmanoma sumažinti vandens nuostolius, bet tuo pačiu užtikrinti dujų mainus tyrimo metu (pvz., indai gali būti uždengiami polietileno plėvele, kurioje padaryta skylučių). Tiriant lakias medžiagas, reikia naudoti sandariai uždaromus ir nepralaidžius dujoms indus. Jų dydis pasirenkamas taip, kad dirvožemio mėginys sudarytų maždaug vieną ketvirtąją indo talpos.
9.2. Naudojama standartinė laboratorinė įranga, įskaitant šią:
9.2.2. centrifuga (3 000 g) arba filtravimo įtaisas (kuriame naudojamas filtrinis popierius turi būti be nitratų);
10. Dirvožemių parinkimas ir skaičius
Naudojamas vienas ir tas pats dirvožemis. Rekomenduojamos dirvožemio charakteristikos yra tokios, kaip čia nurodyta:
- smėlio kiekis: ne mažesnis kaip 50 % ir ne didesnis kaip 75 %;
- pH: 5,5-7,5;
- organinės anglies kiekis: (0,5-1,5) %;
- mikrobinės biomasės kiekis turi būti išmatuotas (8)(9) ir jos anglies kiekis turi sudaryti ne mažiau kaip 1 % bendros dirvožemio organinės anglies.
Daugeliu atvejų tokių charakteristikų dirvožemis atitinka blogiausio atvejo būseną, kadangi tiriamosios cheminės medžiagos absorbcija tuo atveju yra mažiausia, o jos prieinamumas mikroflorai yra didžiausias. Taigi tyrimai su kitais dirvožemiais paprastai nereikalingi. Tačiau tam tikromis aplinkybėmis, pvz., jei medžiagą daugiausia numatoma naudoti kokiame nors apibrėžtame dirvožemyje, pvz., tokiame kaip rūgštus miško dirvožemis, arba jei naudojamos elektrostatinį krūvį turinčios cheminės medžiagos, gali tekti naudoti papildomą kitos rūšies dirvožemį.
11. Dirvožemio mėginių rinkimas ir laikymas
11.1. Rinkimas
Reikia turėti detalią informaciją apie lauko vietos, iš kurios imamas tyrimams skirtas dirvožemis, istoriją. Nurodoma tiksli vietos padėtis, augalų danga, apdorojimo augalų apsaugos produktais datos, apdorojimas organinėmis ir neorganinėmis trąšomis, biologinių priedų dėjimas arba atsitiktiniai užteršimai. Dirvožemio ėmimui parinkta vieta turėtų užtikrinti ilgalaikį vartojimą. Tinka nuolatinės ganyklos, laukai su vienmečių grūdinių kultūrų pasėliais (išskyrus kukurūzų) arba tankiai apsėtų žaliųjų trąšų laukai. Parinkta mėginio ėmimo vieta neturi būti buvusi apdorota augalų apsaugos produktais bent vienerius metus iki mėginių ėmimo. Be to, bent šešis mėnesius neturėjo būti įterpiama organinių trąšų. Mineralines trąšas naudoti leistina tik tuo atveju, jei tai buvo daryta pasėlių poreikiams užtikrinti, o dirvožemio mėginiai imami ne anksčiau kaip trys mėnesiai po tręšimo. Reikia nenaudoti dirvožemo, apdoroto trąšomis, turinčiomis žinomas biocidines savybes (pvz., kalcio cianamidu).
Reikia neimti mėginių esant ilgalaikiam (ilgiau kaip 30 parų) sausros arba potvynio laikotarpiui arba iš karto jam pasibaigus. Suartų dirvožemių mėginiai imami iš viso, nuo 0 iki 20 cm gylio, sluoksnio. Pievose (ganyklose) arba kituose ilgą laiką (bent vieną auginimo sezoną) neartuose dirvožemiuose didžiausias mėginio ėmimo gylis gali būti šiek tiek didesnis kaip 20 cm (pvz., iki 25 cm).
Dirvožemio mėginiai vežami tokiose talpose ir esant tokiai temperatūrai, kurios garantuotų, kad pradinės dirvožemio savybės nebus reikšmingiau pakeistos.
11.2. Laikymas
Pirmenybė teikiama atvejui, kai naudojami šviežiai lauke paimti dirvožemiai. Jei laikymo laboratorijoje išvengti neįmanoma, dirvožemiai gali būti laikomi tamsoje, esant (4±2) °C ne ilgiau kaip tris mėnesius. Dirvožemių laikymo metu turi būti užtikrintos aerobinės sąlygos. Jei dirvožemiai imami iš vietų, kuriose jie būna įšalę bent tris mėnesius per metus, galima numatyti šešių mėnesių laikymą, esant nuo (-18) °C iki (-22) °C. Laikomo dirvožemio mikrobinės biomasės kiekis matuojamas prieš kiekvieną tyrimą ir biomasės anglies kiekis turi sudaryti ne mažiau kaip 1 % viso dirvožemio organinės anglies kiekio (žr. 1.6.2 punktą).
12. Dirvožemio tvarkymas ir ruošimas bandymui
12.1. Pradinis inkubavimas
Jei dirvožemis buvo laikomas saugykloje (žr. 11.2 punktą), rekomenduojama daryti pradinį inkubavimą, kurio trukmė būtų nuo 2 iki 28 parų. Temperatūra ir dirvožemio drėgmės kiekis pradinio inkubavimo laikotarpiu turi atitikti tyrimo sąlygas (žr. 12.2 ir 15.1.3 punktus).
12.2. Fizinės ir cheminės charakteristikos
Iš dirvožemio rankiniu būdu pašalinami dideli daiktai (pvz., akmenys, augalų dalys ir t. t.), tuomet drėgnas dirvožemis sijojamas iki 2 mm arba mažesnio dalelių dydžio, neleidžiant jam per daug išdžiūti. Drėgmės kiekis dirvožemio mėginyje reguliuojamas distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu iki vertės, sudarančios 40 %-60 % didžiausios vandens sulaikymo gebos.
12.3. Gerinimas pridedant organinio substrato
Dirvožemį reikia pagerinti tinkamu organiniu substratu, pvz., liucernos žaliosios masės šieno milteliais (pagrindinis komponentas: Medicago sativa), kurių C/N santykis yra nuo 12/1 iki 16/1. Rekomenduojamas liucernos ir dirvožemio santykis yra 5 g liucernos vienam kilogramui dirvožemio (sausos medžiagos masės).
13. Tiriamosios medžiagos paruošimas įterpti į dirvožemį
Tiriamoji medžiaga paprastai įterpiama naudojant nešiklį. Nešiklis gali būti vanduo (vandenyje tirpioms medžiagoms) arba inertinė kieta medžiaga, pvz., smulkus kvarcinis smėlis (dalelių dydis: 0,1–0,5 mm). Kitų nei vanduo skystų nešiklių (pvz., organinių tirpiklių, tokių kaip acetonas, chloroformas) nereikia naudoti, kadangi jie gali pakenkti mikroflorai. Jei kaip nešiklis naudojamas smėlis, jo daleles galima padengti tiriamąja medžiaga, ištirpinta arba suspenduota tinkamame tirpiklyje. Tokiais atvejais, prieš maišant su dirvožemiu, tirpiklis išgarinamas. Siekiant optimaliai paskirstyti tiriamąją medžiagą dirvožemyje, rekomenduojama naudoti 10 g smėlio vienam kilogramui dirvožemio (sausos medžiagos masės). Kontroliniai mėginiai apdorojami maišant tik su lygiaverčiu vandens ir/arba kvarcinio smėlio kiekiu.
Jei tiriamos lakios cheminės medžiagos, apdorojimo metu reikia kiek įmanoma išvengti nuostolių ir imtis priemonių užtikrinti tolygų pasiskirstymą dirvožemyje (pvz., bandomąją medžiagą reikėtų įšvirkšti keliose dirvožemio mėginio vietose).
14. Tyrimui naudojamos koncentracijos vertės
Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, naudojamos ne mažiau kaip dvi koncentracijos.
Mažiausioji koncentracija turėtų atitikti ne mažiau kaip didžiausią kiekį, kuris tikėtinai pasiektų dirvožemį praktinėmis sąlygomis, tuo tarpu didesnioji koncentracija turėtų būti mažesniosios koncentracijos kartotinis dydis. Į dirvožemį įterpiamos tiriamosios medžiagos koncentracijos apskaičiuojamos laikant, kad įterpimas yra tolygus iki 5 cm gylio ir dirvožemio sąlyginis tankis yra 1,5. Agrocheminių medžiagų, tiesiogiai įterpiamų į dirvožemį, arba cheminių medžiagų, kurių atveju dirvožemį pasiekiantis kiekis gali būti numatytas ar spėjamas, rekomenduojamos tiriamosios koncentracijos vertė yra didžiausia numatoma aplinkos koncentracija (Predicted Environmental Concentration – PEC) ir penkis kartus už ją didesnė koncentracija. Medžiagos, kurias numatoma įterpti į dirvožemį kelis kartus per vieną sezoną, tiriamos esant koncentracijoms, gautoms PEC vertę padauginus iš didžiausio numatomo įterpimų skaičiaus. Tačiau viršutinė tiriamoji koncentracija neturi būti daugiau kaip dešimt kartų didesnė už didžiausią vienkartinio įterpimo dydį. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, naudojama ne mažiau kaip penkių koncentracijų eilė pagal geometrinę progresiją. Tiriamosios koncentracijos turi atitikti intervalą, reikalingą ECx vertei nustatyti.
15. Procedūra
15.1. Veikimo sąlygos
15.1.1. Apdorojami ir kontroliniai mėginiai
Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, dirvožemio mėginys dalijamas į tris vienodos masės dalis. Dvi dalys maišomos su produkto turinčiu nešikliu, o trečioji maišoma su produkto neturinčiu nešikliu (kontrolinis tyrimas). Rekomenduojama paruošti bent tris tokias apdorotų dirvožemio dalių ir neapdorotos dalies kartotines serijas. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, dirvožemio mėginys dalijamas į šešias vienodos masės dalis. Penki mėginiai maišomi su tiriamosios medžiagos turinčiu nešikliu, o šeštasis mėginys sumaišomas su nešikliu be šios cheminės medžiagos. Rekomenduojama paruošti bent tris apdorotų dirvožemio mėginių dalis ir neapdorotos dirvožemio mėginio dalies kartotines serijas. Reikia, kad būtų užtikrintas tolygus tiriamosios medžiagos pasiskirstymas apdorotuose dirvožemio mėginiuose. Maišant reikia vengti dirvožemio sutankinimo ir grumstų susidarymo.
15.1.2. Dirvožemio mėginių inkubavimas
Dirvožemio mėginius galima inkubuoti dviem būdais: kaip vientisus kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio mėginius arba kaip serijas atskirų kiekvieno apdoroto ir neapdoroto vienodo dydžio dirvožemio mėginių. Tačiau tiriant lakias medžiagas, tyrimas atliekamas tik vienu būdu, naudojant atskirų mėginių seriją. Kai dirvožemis inkubuojamas kaip vientisas mėginys, paruošiami dideli kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio kiekiai ir prireikus tyrimo metu imami jos mėginiai analizei. Kiekvienam apdorojimui ir kontroliniams mėginiams iš pradžių paruoštas kiekis priklauso nuo mėginių dydžio, analizei naudojamų kartotinių mėginių skaičiaus ir nuo numatomo didžiausio mėginių ėmimo kartų skaičiaus. Dirvožemiai, inkubuojami kaip vientisas mėginys, prieš imant mėginius turi būti gerai sumaišomi. Kai dirvožemiai inkubuojami kaip serija atskirų dirvožemio mėginių, kiekvienas apdorotas ir neapdorotas vientisas dirvožemio mėginys dalijamas į reikiamą mėginių skaičių, kurie prireikus yra naudojami. Atliekant tyrimus, kuriuose gali būti numatyta mėginius imti daugiau kaip du kartus, reikia paruošti pakankamą skaičių mėginių, kad būtų galima atsižvelgti į visus kartotinius mėginius ir mėginių ėmimo kartų skaičių. Bent trys tyrimui skirti dirvožemio kartotiniai mėginiai inkubuojami aerobinėmis sąlygomis (žr. 15.1.1 punktą). Atliekant visus tyrimus turi būti naudojami atitinkami indai su pakankamo tūrio laisvąja erdve, kad būtų išvengta anaerobinių sąlygų susidarymo. Kai tiriamos lakios medžiagos, tyrimas turi būti atliekamas naudojant atskirų mėginių serijas.
15.1.3. Tyrimo sąlygos ir trukmė
Tyrimai atliekami tamsoje, esant (20±2) °C temperatūrai. Drėgmės kiekis dirvožemio mėginiuose visą tyrimo laiką turi būti palaikomas (±5) % tikslumu ir turi sudaryti nuo 40 % iki 60 % dirvožemio didžiausios vandens sulaikymo gebos (žr. 12.2 punktą). Prireikus galima įpilti distiliuoto arba dejonizuoto vandens.
Mažiausia tyrimų trukmė – 28 dienos. Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, lyginamas nitratų sudarymo greitis apdorotuose ir kontroliniuose ėminiuose. Jei 28 parą jis skiriasi daugiau kaip 25 %, tyrimas tęsiamas tol, kol gaunamas 25 % arba mažesnis skirtumas, bet ne ilgiau kaip 100 parų. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, tyrimas baigiamas po 28 parų. 28 parą nustatomas nitratų kiekis apdorotuose ir kontroliniuose dirvožemio mėginiuose ir apskaičiuojama ECx vertė.
15.2. Dirvožemio mėginių ėmimas ir analizė
15.2.1. Dirvožemio mėginių ėmimo grafikas
Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, dirvožemio mėginiai nitratui nustatyti analizuojami 0, 7, 14 ir 28 parą. Jei tyrimą reikia tęsti, papildomi matavimai po 28 dienos atliekami kas 14 parų.
Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, naudojamos bent penkios tiriamosios koncentracijos ir dirvožemio mėginiai nitratui nustatyti analizuojami prieš tyrimo pradžią (0 para) ir veikimo (ekspozicijos) laikotarpiui pasibaigus (28 parą). Jei laikoma, kad būtinas tarpinis matavimas, jį galima atlikti, pvz., 7 parą. Duomenys, gauti 28 parą, naudojami cheminės medžiagos ECx vertei nustatyti. Jei pageidaujama, 0 dienos kontrolinių mėginių duomenys gali būti naudojami pradinei nitrato koncentracijai dirvožemyje pateikti.
15.2.2. Dirvožemio mėginių analizė
Nitrato kiekis, sudarytas kiekviename ir apdorotame, ir neapdorotame kartotiniame mėginyje, nustatomas kaskart, kai tam paimami mėginiai. Nitratas ekstrahuojamas iš dirvožemio, mėginius kratant atitinkamame ekstrahavimo tirpiklyje, pvz., 0,1 mol/l kalio chlorido tirpale. Rekomenduojamas santykis – 5 ml KCl tirpalo vienam gramui dirvožemio, skaičiuojant sauso dirvožemio masei. Ekstrahavimui optimizuoti dirvožemio ir ekstrahavimo tirpalo bendras tūris turi būti ne didesnis kaip pusė indo tūrio. Mišiniai kratomi 60 min. esant 150 min-1. apsukų dažniui. Mišiniai centrifuguojami arba filtruojami ir skystoji fazė analizuojama nustatyti nitratui. Dalelių neturinčius skystus ekstraktus galima laikyti prieš analizę ne ilgiau kaip šešis mėnesius, esant minus (20±5) °C.
16. Duomenys
16.1. Rezultatų apdorojimas
Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, sužymimas kiekviename kartotiniame dirvožemio mėginių serijos mėginyje sudaryto nitrato kiekis ir visų kartotinių serijų vidutinė vertė pateikiama lentelių pavidalu. Azoto transformacijos greitis įvertinamas naudojant atitinkamus visuotinai priimtus statistinius metodus (pvz., F kriterijus, 5 % reikšmingumo lygmuo). Sudaryto nitrato kiekis išreiškiamas nitrato miligramais vienam sauso dirvožemio kilogramui per parą. Nitrato sudarymo kiekviename apdorotame mėginyje greitis lyginamas su greičiu, gautu kontroliniuose mėginiuose, ir apskaičiuojama procentais išreikšta nuokrypio nuo kontrolinio mėginio (arba mėginių) vertė.
Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, nustatomas kiekvienoje kartotinėje mėginių serijoje sudaryto nitrato kiekis, ir ECx vertėms įvertinti sudaroma dozės ir atsako santykio kreivė. Nitrato kiekis (t. y. nitrato kiekis mg vienam sauso dirvožemio kilogramui), nustatytas apdorotuose mėginiuose po 28 parų, lyginamas su kontroliniuose mėginiuose nustatytu kiekiu. Pagal šiuos duomenis kiekvienai tiriamajai koncentracijai apskaičiuojama inhibavimo procentinė vertė.
Šie procentiniai duomenys pateikiami grafike kaip koncentracijos funkcija, ir ECx vertei apskaičiuoti naudojamos statistinės procedūros. Be to, pagal tipines procedūras (10)(11)(12) nustatomi apskaičiuotos ECx vertės pasikliovimo rėžiai (p = 0,95).
Didelį azoto kiekį turinčios bandomosios medžiagos gali prisidėti prie susidariusio nitrato kiekio padidėjimo atliekant tyrimą. Jei šios medžiagos tiriamos esant didelei jų koncentracijai (pvz., cheminės medžiagos, kurias numatoma naudoti dedant kelis kartus), į tyrimo eigą turi būti įtraukti atitinkami kontroliniai mėginiai (t. y. dirvožemis su tiriamąja medžiaga, bet be augalinių miltelių). Į šių kontrolinių mėginių duomenis turi būti atsižvelgta apskaičiuojant ECx vertę.
16.2. Rezultatų interpretavimas
Jei įvertinant agrocheminių medžiagų tyrimų rezultatus mėginyje, turinčiame mažesniąją apatinę koncentraciją (t. y. maksimalią numatomą koncentraciją), ir kontroliniame mėginyje nitrato sudarymo greičio skirtumas yra lygus 25 % arba mažesnis, bet kuriuo mėginių ėmimo metu po 28 paros produktą galima įvertinti kaip nepasižymintį ilgalaikiu poveikiu azoto transformacijai dirvožemiuose. Kai įvertinami kitų nei agrocheminės medžiagos cheminių medžiagų tyrimo rezultatai, naudojama EC50, EC25 ir/arba EC10 vertė.
VIII. BAIGIAMOSIOS NUOSTATOS
17. Tyrimų ataskaita
Tyrimų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
17.1. Išsamus naudojamo dirvožemio identifikavimas, įskaitant:
- geografinę vietos nuorodą (platuma, ilguma);
- informaciją apie vietos istoriją (t. y. augalinė danga, apdorojimas augalų apsaugos produktais, apdorojimas trąšomis, atsitiktinis užteršimas ir t. t.);
- naudojimo tipą (pvz., žemės ūkio paskirties žemė, miškas ir t. t.);
- mėginio ėmimo gylį (cm);
- smėlio, dumblo ir molio kiekį (išreikštas sausos medžiagos masės procentais);
- pH vertę (vandenyje);
- organinės anglies kiekį (išreikštas sausos medžiagos masės procentais);
- azoto kiekį (išreikštą sausos medžiagos masės procentais);
- pradinę nitrato koncentraciją (nitrato kiekis mg sausos medžiagos masės kilogramui);
- jonų mainų talpą (mmol/kg);
- mikrobinę biomasę (išreikšta bendros organinės anglies kiekio procentine dalimi);
- metodų nuorodas kiekvienam parametrui nustatyti;
- visą informaciją apie dirvožemio mėginių ėmimą ir laikymą;
- pradinio dirvožemio inkubavimo, jei buvo atliekamas, detales.
17.2. Tiriamoji medžiaga:
- fizinė būsena ir, jei tinka, fizinės ir cheminės savybės;
- cheminio identifikavimo duomenys, jei tinka, įskaitant struktūrinę formulę, grynumą
(t. y. augalų apsaugos produktų atveju veikliojo ingrediento procentinę dalį), azoto kiekį.
17.3. Substratas:
- substrato šaltinis;
- sudėtis (t. y. liucernos milteliai, liucernos žaliosios masės milteliai);
- anglies, azoto kiekis (išreikštas sausos medžiagos masės procentais);
- sieto akučių dydis (mm).
17.4. Tyrimo sąlygos:
- dirvožemio gerinimo organiniu substratu detalės (smulkesnis apibūdinimas);
- naudotų tiriamosios medžiagos koncentracijų skaičius ir, jei reikia, pasirinktų koncentracijų pagrindimas;
- bandomosios medžiagos įterpimo į dirvožemį detalės;
- inkubavimo temperatūra;
- drėgmės kiekis dirvožemyje pradedant tyrimą ir jo metu;
- naudotas dirvožemio inkubavimo metodas (t. y. kaip vientisas mėginys arba kaip mėginių serija);
- kartotinių mėginių skaičius;
- mėginių ėmimo analizei skaičius;
- metodas, naudotas nitratui iš dirvožemio ekstrahuoti.
17.5. Rezultatai:
- analizės procedūra ir įranga, naudota nitratui analizuoti;
- duomenys, pateikti lentelių pavidalu, įskaitant atskirus ir vidutinius nitrato analizės
rezultatus;
- apdorotų ir kontrolinių kartotinių mėginių serijų rezultatų tarpusavio nuokrypis;
- apskaičiavimuose daromų pataisų paaiškinimas, jei tinka;
- procentais išreikštas nitrato sudarymo greičio nuokrypis iš kiekvieną kartą paimtų mėginių, arba, jei tinka, EC50 vertė esant 95 procentų pasikliovimo rėžiui, kitos ECx vertės (t. y. EC25 arba EC10) ir pasikliovimo rėžiai, dozės ir atsako priklausomybės kreivės;
- statistinis rezultatų apdorojimas;
- visa informacija ir stebėjimai, kurie padėtų interpretuoti rezultatus.
______________
LAND 74-2005
„Dirvožemio mikroorganizmai.
Azoto transformavimo tyrimas“ priedas
BIBLIOGRAFIJA
1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Bruxelles.
5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality – Biological Methods.
6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18-20 janvier 1995.
7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.
9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
10) Litchfield, J.T. and Wilcokson F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos aplinkos ministro
2005 m. spalio 3 d. įsakymu Nr. D1-478
LAND 75-2005 „DIRVOŽEMIO MIKROORGANIZMAI. ANGLIES TRANSFORMAVIMO TYRIMAS (C.22)“
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Šiame aplinkos apsaugos normatyviniame dokumente aprašytas laboratorinis metodas, skirtas tirti ilgalaikius augalų apsaugos produktų ir galbūt kitų cheminių medžiagų vienkartinio veikimo poveikius anglies transformavime dalyvaujančių dirvožemio mikroorganizmų aktyvumui. Tyrimas iš esmės pagrįstas Europos ir Viduržemio jūros augalų apsaugos organizacijos rekomendacijomis (1). Tačiau buvo atsižvelgta į kitus nurodymus, įskaitant Vokietijos Biologische Bundesanstalt (2), JAV Aplinkos apsaugos agentūros (3) SETAC (4) rekomendacijas. Belgirate, Italijoje, 1995 m. vykusiame Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacijos (OECD – Organization for Economic Cooperation and Development) seminare dėl dirvožemių/nuosėdinių uolienų atrankos (5) buvo susitarta dėl šiame tyrime naudojamų dirvožemių skaičiaus ir tipo. Dirvožemio mėginių ėmimo, tvarkymo ir laikymo rekomendacijos pagrįstos ISO vadovu (6) ir Belgirate seminaro rekomendacijomis.
Įvertinant tiriamų medžiagų toksiškumo charakteristikas, gali tekti nustatyti jų poveikį dirvožemio mikrobiniam aktyvumui, pvz., kai reikia turėti duomenis apie galimus šalutinius augalų apsaugos produktų poveikio dirvožemio mikroflorai efektus arba kai tikimasi kitų nei augalų apsaugos produktai cheminių medžiagų poveikio dirvožemio mikroorganizmams. Anglies transformavimo tyrimas atliekamas siekiant nustatyti tokių cheminių medžiagų poveikio dirvožemio mikroflorai efektus. Jei tiriamos agrocheminės medžiagos (pvz., augalų apsaugos produktai, trąšos, miškininkystėje naudojamos cheminės medžiagos), atliekami ir anglies, ir azoto transformavimo tyrimai. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, pakanka azoto transformavimo tyrimo. Tačiau, jei atliekant tokių cheminių medžiagų azoto transformavimo tyrimą, jų EC50 vertė patenka į intervalą, būdingą prekyboje esantiems nitrifikacijos inhibitoriams (pvz., nitrapirinui), papildomai informacijai gauti gali būti atliekamas anglies transformavimo tyrimas.
Dirvožemiai susideda iš gyvųjų ir negyvųjų komponentų, esančių sudėtiniuose ir heterogeniniuose mišiniuose. Mikroorganizmai atlieka svarbų vaidmenį derlingų dirvožemių organinių medžiagų visumos skaidyme ir transformavime, kur daugelio rūšių indėlis apsprendžia įvairius dirvožemio derlingumo aspektus. Visoks ilgalaikis tokių biocheminių procesų trukdymas gali pažeisti mitybinių komponentų ciklus, o tai gali pakeisti dirvožemio derlingumą. Anglies ir azoto transformavimas vyksta visuose derlinguose dirvožemiuose. Nors mikroorganizmų bendrijos atsakingos už šių procesų vykdymą įvairiuose dirvožemiuose, vienos nuo kitų skiriasi, transformavimo keliai yra iš esmės tie patys.
Šis tyrimo metodas skirtas nustatyti tiriamosios medžiagos ilgalaikius neigiamus poveikius (efektus) anglies transformavimui aerobiniuose paviršiniuose dirvožemiuose. Šis tyrimas yra jautrus už anglies transformavimą atsakingų mikroorganizmų bendrijų dydžio ir aktyvumo pokyčiams, kadangi vykdant tyrimą šios bendrijos verčiamos patirti cheminio poveikio įtampą ir anglies badą. Naudojamas smėlėtas dirvožemis, turintis mažai organinių medžiagų. Šis dirvožemis apdorojamas tiriamąja medžiaga ir inkubuojamas sąlygomis, kurios užtikrina greitą mikroorganizmų medžiagų apykaitą. Šiomis sąlygomis greitai išsenka lengvai iš dirvožemio įsisavinamos anglies šaltiniai. Tai sukelia anglies badą, dėl kurio mikrobų ląstelės žūsta, pereina į ramybės būseną arba sporuliuoja. Jei tyrimas vyksta daugiau kaip 28 paras, galima išmatuoti šių atsakų sumą (neapdoroto dirvožemio) kontroliniuose mėginiuose kaip nuoseklų metaboliškai aktyvios mikrobinės biomasės mažėjimą (7). Jei dirvožemyje su anglies trūkumu biomasei tyrimo sąlygomis yra pakenkusi dirvožemyje esanti cheminė medžiaga, biomasės kiekis gali negrįžti iki kontroliniame ėminyje esančio kiekio. Todėl bet kuriuo tyrimo metu tiriamosios medžiagos keliami trukdymai dažnai tęsiasi iki tyrimo pabaigos.
Tyrimai, kurių pagrindu buvo parengtas šis tyrimo metodas, iš pradžių buvo skirti medžiagoms, kurių atveju kiekį, pasiekiantį dirvožemį, buvo galima numatyti. Taip būna, pvz., naudojant augalų apsaugos produktus, kurių laukuose naudojama medžiagos norma yra žinoma. Tiriant agrochemines medžiagas, pakanka dviejų dozių, atitinkančių numatomą arba prognozuojamą naudojimo normą. Agrochemines medžiagas galima tirti skaičiuojant kaip veikliuosius ingredientus (a. i.) arba kaip preparatus. Tačiau tyrimo galimybės nėra apribotos vien cheminėmis medžiagomis, turinčiomis prognozuojamas aplinkoje koncentracijos vertes. Keičiant tiek į dirvožemį dedamos tiriamosios medžiagos kiekį, tiek duomenų įvertinimo būdą, tyrimo metodą dar galima panaudoti ištirti cheminėms medžiagoms, kurių kiekis, tikėtinai patenkantis į dirvožemį, nėra žinomas. Taigi jei tai neagrocheminės medžiagos, nustatomi medžiagos kelių koncentracijų serijos poveikio anglies transformavimui efektai. Šių tyrimų duomenys yra naudojami dozės ir atsako santykio kreivei sudaryti ir ECx vertei apskaičiuoti, kur x yra apibrėžiamas kaip poveikio (efekto) %.
II. NUORODOS
III. APIBRĖŽIMAI
3. Anglies transformavimas – mikroorganizmų atliekamas organinių medžiagų visumos skaidymas, sudarant galutinį neorganinį produktą – anglies dioksidą.
4. ECx (efektyvioji koncentracija) – dirvožemyje esanti tiriamosios medžiagos koncentracija, dėl kurios buvimo anglies transformavimas į anglies dioksidą inhibuojamas X procentų.
V. PRINCIPAS
7. Prasijotas dirvožemis apdorojamas tiriamąja medžiaga arba paliekamas neapdorotas (kontrolinis). Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, rekomenduojama naudoti bent dvi tiriamosios medžiagos koncentracijas, kurios parenkamos pagal didžiausią lauke numatomą koncentraciją. Po 0, 7, 14 ir 28 inkubavimo parų apdoroti ir kontroliniai dirvožemio mėginiai maišomi su gliukoze ir 12 h nepertraukiamai matuojamas gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis. Kvėpavimo greitis yra išreiškiamas kaip išskirto anglies dioksido (mg anglies dioksido/kg sauso dirvožemio/h) arba suvartoto deguonies (mg deguonies/kg dirvožemio/h) kiekis. Vidutinis kvėpavimo greitis apdorotame dirvožemyje lyginamas su kvėpavimo greičiu kontroliniame mėginyje ir apskaičiuojamas apdorotojo mėginio procentinis nuokrypis nuo kontrolinio mėginio. Visi tyrimai vykdomi ne mažiau kaip 28 paras. Jei 28 parą skirtumas tarp apdoroto ir neapdoroto dirvožemio yra 25 % arba didesnis, matavimai tęsiami kas 14 parų, bet ne daugiau kaip iki 100 parų. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, sudaromos serijos į dirvožemio mėginius dedant tiriamosios medžiagos iki kelių koncentracijų ir po 28 parų matuojamas gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis (t. y. sudaryto anglies dioksido arba suvartoto deguonies vidutinis kiekis). Koncentracijų serijos tyrimų rezultatai analizuojami pagal regresijos modelį ir apskaičiuojama ECx vertė (t. y. EC50, EC25 ir/arba EC10). Žr. apibrėžimus.
VI. TYRIMO PAGRĮSTUMAS
8. Tyrimų su agrocheminėmis medžiagomis rezultatų įvertinimas yra pagrįstas sąlyginai mažu [t. y. vidutinė vertė (±25) %] išskirto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekio kontroliniame ir apdorotame dirvožemio mėginiuose skirtumu, taigi didelė kontrolinių mėginių duomenų sklaida gali būti klaidingų rezultatų priežastis. Todėl kartotinių kontrolinių mėginių rezultatų skirtumas turi būti mažesnis kaip (±15) %.
VII. TYRIMO EIGA
9. Aparatūra
Naudojami tyrimams skirti indai, pagaminti iš chemiškai inertinės medžiagos. Jie turi būti reikiamos talpos, atsižvelgiant į esamą dirvožemių inkubavimo procedūrą, t. y. inkubavimą vieno vientiso mėginio arba serijos atskirų dirvožemio vienkartinių mėginių (žr. 15.1.2 punktą). Reikia imtis priemonių kiek įmanoma sumažinti vandens nuostolius, bet tuo pačiu užtikrinti dujų mainus tyrimo metu (pvz., indai gali būti uždengiami polietileno plėvele, kurioje padaryta skylučių). Tiriant lakias medžiagas, reikia naudoti sandariai uždaromus ir nepralaidžius dujoms indus. Jų dydis pasirenkamas taip, kad dirvožemio mėginys sudarytų maždaug vieną ketvirtąją indo talpos.
Gliukozės sukeliamam kvėpavimui nustatyti reikia turėti inkubavimo sistemas ir prietaisus anglies dioksido sudarymui arba deguonies suvartojimui matuoti. Tokių sistemų prietaisų pavyzdžiai aprašyti literatūroje (8)(9)(10)(11).
10. Dirvožemių pasirinkimas ir skaičius
Naudojamas vienas ir tas pats dirvožemis. Rekomenduojamos dirvožemio charakteristikos yra tokios, kaip čia nurodyta:
- smėlio kiekis: ne mažesnis kaip 50 % ir ne didesnis kaip 75 %;
- pH: 5,5-7,5;
- organinės anglies kiekis: 0,5–1,5 %;
- mikrobinės biomasės kiekis turi būti išmatuotas (12)(13), ir jos anglies kiekis turi sudaryti ne mažiau kaip 1 % bendros dirvožemio organinės anglies.
Daugeliu atvejų tokių charakteristikų dirvožemis atitinka blogiausio atvejo būseną, kadangi tiriamosios cheminės medžiagos absorbcija tuo atveju yra mažiausia, o jos prieinamumas mikroflorai yra didžiausias. Taigi tyrimai su kitais dirvožemiais paprastai nebereikalingi. Tačiau tam tikromis aplinkybėmis, pvz., jei medžiagą daugiausia numatoma naudoti kokiame nors apibrėžtame dirvožemyje, tokiame kaip rūgštus miško dirvožemis, arba jei naudojamos elektrostatinį krūvį turinčios cheminės medžiagos, gali tekti jį pakeisti papildomu dirvožemiu.
11. Dirvožemio mėginių rinkimas ir laikymas
11.1. Rinkimas
Reikia turėti detalią informaciją apie lauko vietos, iš kurios imamas tyrimams skirtas dirvožemis, istoriją. Nurodoma tiksli vietos padėtis, augalų danga, apdorojimo augalų apsaugos produktais datos, apdorojimas organinėmis ir neorganinėmis trąšomis, biologinių priedų dėjimas arba atsitiktiniai užteršimai. Dirvožemio ėmimui pasirinkta vieta turėtų užtikrinti ilgalaikį vartojimą. Tinka nuolatinės ganyklos, laukai su vienmečių grūdinių kultūrų (išskyrus kukurūzų) pasėliais arba tankiai apsėtų žaliųjų trąšų laukai. Parinkta mėginio ėmimo vieta neturi būti apdorota augalų apsaugos produktais bent vienerius metus iki mėginių ėmimo. Be to, bent šešis mėnesius neturi būti buvę dėta organinių trąšų. Mineralines trąšas naudoti leistina tik tuo atveju, jei tai buvo daryta pasėlių poreikiams, o dirvožemio mėginiai imami ne anksčiau kaip trys mėnesiai po tręšimo. Reikia nenaudoti dirvožemio, apdoroto trąšomis, turinčiomis žinomas biocidines savybes (pvz., kalcio cianamidu).
Reikia neimti mėginių esant ilgalaikiam (ilgiau kaip 30 parų) sausros arba potvynio laikotarpiui arba iš karto jam pasibaigus. Suartų dirvožemių ėminiai imami iš viso nuo 0 iki 20 cm gylio sluoksnio. Pievose (ganyklose) arba kituose ilgą laiką (bent vieną auginimo sezoną) neartuose dirvožemiuose didžiausias mėginio ėmimo gylis gali būti šiek tiek didesnis kaip 20 cm (pvz., iki 25 cm). Dirvožemio mėginiai vežami tokiose talpose ir esant tokiai temperatūrai, kurios garantuotų, kad pradinės dirvožemio savybės nebus reikšmingiau pakeistos.
11.2. Laikymas
Pirmenybė teikiama atvejui, kai naudojami šviežiai lauke paimti dirvožemiai. Jei laikymo laboratorijoje išvengti neįmanoma, dirvožemiai gali būti laikomi tamsoje, esant (4±2)° C ne ilgiau kaip tris mėnesius. Laikant dirvožemius, turi būti užtikrintos aerobinės sąlygos. Jei dirvožemiai imami iš vietų, kuriose jie būna įšalę bent tris mėnesius per metus, galima numatyti šešių mėnesių laikymą, esant nuo (-18) °C iki (-22) °C. Laikomo dirvožemio mikrobinės biomasės kiekis matuojamas prieš kiekvieną tyrimą, ir biomasės anglies kiekis turi sudaryti ne mažiau kaip 1 % viso dirvožemio organinės anglies kiekio (žr. 1.6.2 punktą).
12. Dirvožemio tvarkymas ir ruošimas bandymui
12.1. Pradinis inkubavimas
Jei dirvožemis buvo laikomas saugykloje (žr. 12.2 ir 15.1.3 punktus), rekomenduojama daryti pradinį inkubavimą, kurio trukmė būtų nuo 2 iki 28 parų. Temperatūra ir dirvožemio drėgmės kiekis pradinio inkubavimo laikotarpiu turi atitikti tyrimo sąlygas (žr. 12.2 ir 15.1.3 punktus).
12.2. Fizinės ir cheminės charakteristikos
Iš dirvožemio rankiniu būdu pašalinami dideli daiktai (pvz., akmenys, augalų dalys ir t. t.), tuomet drėgnas dirvožemis sijojamas iki 2 mm arba mažesnio dydžio dalelių. Drėgmės kiekis dirvožemio mėginyje reguliuojamas distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu iki vertės, sudarančios (40–60) % didžiausios vandens sulaikymo gebos.
13. Tiriamosios medžiagos ruošimas įterpti į dirvožemį
Tiriamoji medžiaga paprastai įterpiama naudojant nešiklį. Nešiklis gali būti vanduo (vandenyje tirpioms medžiagoms) arba inertinė kieta medžiaga, pvz., smulkus kvarcinis smėlis (dalelių dydis: 0,1–0,5 mm). Kitų nei vanduo skystų nešiklių (pvz., organinių tirpiklių, tokių kaip acetonas, chloroformas) nereikia naudoti, kadangi jie gali pakenkti mikroflorai. Jei kaip nešiklis naudojamas smėlis, jo daleles galima padengti tiriamąja medžiaga, ištirpinta arba suspenduota tinkamame tirpiklyje. Tokiais atvejais, prieš maišant su dirvožemiu, tirpiklis išgarinamas. Siekiant optimaliai paskirstyti tiriamąją medžiagą dirvožemyje, rekomenduojama naudoti 10 g smėlio vienam kilogramui dirvožemio (sausos medžiagos masės). Kontroliniai mėginiai apdorojami maišant tik su lygiaverčiu vandens ir/arba kvarcinio smėlio kiekiu.
Jei tiriamos lakios cheminės medžiagos, apdorojimo metu reikia kiek įmanoma vengti nuostolių ir imtis priemonių užtikrinti tolygų pasiskirstymą dirvožemyje (pvz., tiriamąją medžiagą reikėtų įšvirkšti keliose dirvožemio vietose).
14. Tyrimui naudojamos koncentracijos vertė
Jei tiriami augalų apsaugos produktai arba cheminės medžiagos, kurių koncentracija aplinkoje gali būti nuspėjama, turi būti tiriamos ne mažiau kaip dvi koncentracijos. Mažesnioji (apatinė) koncentracija turėtų atitikti ne mažiau kaip didžiausią kiekį, kuris tikėtinai pasiektų dirvožemį praktinėmis sąlygomis, tuo tarpu didesnioji koncentracija turėtų būti mažesniosios koncentracijos kartotinis dydis. Į dirvožemį įterpiamos tiriamosios medžiagos koncentracijos vertė apskaičiuojama laikant, kad įterpimas yra tolygus iki 5 cm gylio ir dirvožemio sąlyginis (subertinis) tankis yra 1,5. Agrocheminių medžiagų, tiesiogiai įterpiamų į dirvožemį, arba cheminių medžiagų, kurių atveju dirvožemį pasiekiantis kiekis gali būti numatytas ar spėjamas, rekomenduojamos bandymo koncentracijos vertės yra didžiausia numatoma aplinkos koncentracija (Predicted Environmental Concentration – PEC) ir penkis kartus už ją didesnė koncentracija. Medžiagos, kurias numatoma įterpti į dirvožemį kelis kartus per vieną sezoną, tiriamos esant koncentracijos vertei, gautai PEC vertę padauginus iš didžiausio numatomo įterpimų skaičiaus. Tačiau didesnioji tiriamosios koncentracijos vertė neturi būti daugiau kaip dešimt kartų didesnė už didžiausią vienkartinio įterpimo dydį.
Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, naudojama ne mažiau kaip penkių koncentracijų eilė pagal geometrinę progresiją. Tiriamos koncentracijos vertė turi atitikti intervalą, reikalingą ECx vertei nustatyti.
15. Procedūra
15.1. Veikimo sąlygos
15.1.1. Apdorojami ir kontroliniai mėginiai
Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, dirvožemio mėginys dalijamas į tris vienodos masės dalis. Dvi dalys maišomos su produkto turinčiu nešikliu, o trečioji maišoma su produkto neturinčiu nešikliu (kontrolinis tyrimas). Rekomenduojama paruošti bent tris tokias apdorotų dalių ir neapdorotos dalies dirvožemio kartotines serijas. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, dirvožemio mėginys dalijamas į šešias vienodos masės dalis. Penki mėginiai maišomi su tiriamąją medžiagą turinčiu nešikliu, o šeštasis mėginys sumaišomas su nešikliu be šios cheminės medžiagos. Rekomenduojama paruošti bent tris apdorotų dirvožemio dalių ir neapdorotos dirvožemio dalies kartotines serijas. Reikia pasirūpinti, kad būtų užtikrintas tolygus tiriamosios medžiagos pasiskirstymas apdorotuose dirvožemio mėginiuose. Maišant reikia išvengti dirvožemio sutankinimo ir grumstų susidarymo.
15.1.2. Dirvožemio mėginių inkubavimas
Dirvožemio mėginius galima inkubuoti dviem būdais: kaip vientisus kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio mėginius arba kaip serijas atskirų ir vienodo dydžio kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio mėginių. Tačiau tiriant lakiąsias medžiagas, bandymas atliekamas tik vienu būdu, naudojant atskirų mėginių seriją. Kai dirvožemis inkubuojamas kaip vientisas mėginys, paruošiami dideli kiekvieno, apdoroto ir neapdoroto, dirvožemio kiekiai ir prireikus tyrimo metu imami jo mėginiai analizei. Kiekvienam apdorojimui ir kontroliniams mėginiams iš pradžių paruoštas kiekis priklauso nuo mėginių dydžio, analizei naudojamų kartotinių mėginių skaičiaus ir nuo numatomo didžiausio mėginių ėmimo kartų skaičiaus. Dirvožemiai, inkubuojami kaip vientisas mėginys, prieš imant mėginius turi būti gerai sumaišomi. Kai dirvožemiai inkubuojami kaip serija atskirų dirvožemio mėginių, kiekvienas apdorotas ir neapdorotas vientisas dirvožemio ėminys dalijamas į reikiamą mėginių skaičių, kurie prireikus yra naudojami. Atliekant tyrimus, kuriuose gali būti numatyta mėginius imti daugiau kaip du kartus, reikia paruošti pakankamą skaičių mėginių, kad būtų galima atsižvelgti į visus kartotinius mėginius ir mėginių ėmimo skaičių. Ne mažiau kaip trys tyrimui skirti dirvožemio kartotiniai mėginiai inkubuojami aerobinėmis sąlygomis (žr. 15.1.1 punktą). Atliekant visus tyrimus, turi būti naudojami atitinkami indai su pakankamo tūrio laisvąja erdve, kad būtų išvengta anaerobinių sąlygų susidarymo. Kai tiriamos lakios medžiagos, tyrimas turi būti atliekamas naudojant atskirų mėginių serijas.
15.1.3. Tyrimo sąlygos ir trukmė
Tyrimas vykdomas tamsoje, esant (20±2)° C temperatūrai. Drėgmės kiekis dirvožemio ėminiuose visą bandymo laiką turi būti palaikomas (±5) % tikslumu ir turi sudaryti nuo 40 % iki 60 % dirvožemio didžiausios vandens sulaikymo gebos (žr. 12.2 punktą). Prireikus galima įpilti distiliuoto arba dejonizuoto vandens.
Mažiausia tyrimų trukmė 28 dienos. Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, lyginami išskirto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekiai apdorotuose ir kontroliniuose ėminiuose. Jei 28 parą jie skiriasi daugiau kaip 25 %, bandymas tęsiamas tol, kol gaunamas 25 % arba mažesnis skirtumas, arba iki 100 parų, žiūrint kas trumpiau. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, tyrimas baigiamas po 28 parų. 28 parą nustatomas išskirto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis apdorotuose ir kontroliniuose dirvožemio mėginiuose ir apskaičiuojama ECx vertė.
15.2. Dirvožemių mėginių ėmimas ir analizė
15.2.1. Dirvožemio mėginių ėmimo grafikas
Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, dirvožemio mėginiai gliukozės sukeliamo kvėpavimo greičiui nustatyti analizuojami 0, 7, 14 ir 28 parą. Jei tyrimą reikia tęsti, papildomi matavimai po 28-tos dienos atliekami kas 14 parų.
Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, naudojamos bent penkios tiriamosios koncentracijos ir dirvožemio mėginiai gliukozės sukeliamo kvėpavimo greičiui nustatyti analizuojami prieš tyrimo pradžią (0 para) ir ekspozicijos (veikimo) laikotarpiui pasibaigus (28 parą). Jei laikoma, kad būtinas tarpinis matavimas, jį galima atlikti, pvz., 7 parą. Duomenys, gauti 28 parą, naudojami cheminės medžiagos ECx vertei nustatyti. Jei pageidaujama, 0 dienos kontrolinių mėginių duomenys gali būti naudojami pradiniams veikliosios mikrobinės biomasės, dalyvaujančios medžiagų apykaitoje, kiekiams dirvožemyje įvertinti (12).
15.2.2. Gliukozės sukeliamo kvėpavimo greičio matavimas
Gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis kiekviename ir apdorotame, ir kontroliniame kartotiniame mėginyje nustatomas kiekvieną kartą paėmus mėginius. Dirvožemio mėginiai maišomi su pakankamu gliukozės kiekiu didžiausiam to momento kvėpavimo atsakui nustatyti. Gliukozės kiekis, reikalingas konkretaus dirvožemio didžiausiam kvėpavimo atsakui nustatyti, gali būti nustatytas, atliekant pradinį tyrimą su kelių gliukozės koncentracijų serija (14). Tačiau smėlingiems dirvožemiams, turintiems (0,5–1,5) % organinės anglies, paprastai pakanka 2 000 mg-4 000 mg gliukozės vienam kg sauso dirvožemio. Gliukozę galima sumalti į miltelius su praplautu kvarciniu smėliu (10 g smėlio/kg sauso dirvožemio) ir sumaišyti su dirvožemiu, kol bus gautas vienalytis mišinys.
Gliukoze pagerinto dirvožemio mėginiai inkubuojami tinkamame aparate kvėpavimo greičiui matuoti nepertraukiamai, kas valandą arba kas dvi valandas (žr. 9 punktą), esant (20±2) °C. Išskirto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis matuojamas 12 valandų iš eilės, matavimus pradedant kiek įmanoma anksčiau, t. y. anksčiau nei 1 ar 2 h po gliukozės pridėjimo. Išmatuojamas suminis per 12 valandų išskirto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis ir nustatomas vidutinis kvėpavimo greitis.
16. Duomenys
16.1. Rezultatų apdorojimas
Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, užrašomas kiekviename kartotiniame dirvožemio mėginyje sudaryto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis, ir visų kartotinių mėginių vidutinė vertė pateikiama lentelių pavidalu. Rezultatai įvertinami visuotinai priimtais statistiniais metodais (pvz., F kriterijus, 5 % reikšmingumo lygmuo). Gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis išreiškiamas mg anglies dioksido/kg sauso dirvožemio/h. Vidutinis anglies dioksido išskyrimo arba deguonies suvartojimo greitis kiekviename apdorotame mėginyje lyginamas su greičiu, gautu kontroliniame mėginyje, ir apskaičiuojama procentais išreikšta nuokrypio nuo kontrolinio mėginio vertė.
Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, nustatomas kiekviename kartotiniame mėginyje išskirto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis, ir ECx vertei įvertinti braižoma dozės ir atsako priklausomybės kreivė. Gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis (t. y. mg anglies dioksido arba mg deguonies/kg sauso dirvožemio/h), nustatytas apdorotuose mėginiuose po 28 parų, lyginamas su kontroliniuose mėginiuose nustatytu greičiu. Iš šių duomenų kiekvienai tiriamajai koncentracijai apskaičiuojama inhibavimo procentinė (%) vertė. Šios procentinės vertės pateikiamos grafike kaip koncentracijos funkcija, ir ECx vertei apskaičiuoti naudojamos statistinės procedūros. Be to, naudojant tipines procedūras (15)(16)(17), nustatomi apskaičiuotos ECx vertės pasikliovimo rėžiai (p = 0,95).
16.2. Rezultatų interpretavimas
Jei, įvertinant agrocheminių medžiagų tyrimų rezultatus, mėginyje, turinčiame mažesniąją koncentraciją (t. y. didžiausią numatomą koncentraciją), bei kontroliniame mėginyje kvėpavimo greičio skirtumas bet kuriuo mėginio ėmimo metu po 28 paros yra lygus 25 % arba mažesnis, produktą galima įvertinti kaip nepasižymintį ilgalaikiu poveikiu anglies transformavimui dirvožemiuose. Kai įvertinami kitų nei agrocheminės medžiagos cheminių medžiagų tyrimo rezultatai, naudojama EC50, EC25 ir/arba EC10 vertė.
VIII. BAIGIAMOSIOS NUOSTATOS
17. Tyrimo ataskaita
Tyrimų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
17.1. Išsamus naudojamo dirvožemio identifikavimas, įskaitant:
- geografinę vietos nuorodą (platuma, ilguma);
- informaciją apie vietos istoriją (t. y. augalinė danga, apdorojimas augalų apsaugos produktais, apdorojimas trąšomis, atsitiktinis užteršimas ir t. t.);
- naudojimo tipą (pvz., žemės ūkio paskirties žemė, miškas ir t. t.);
- mėginio ėmimo gylį (cm);
- smėlio, dumblo ir molio kiekį (išreikštas sausos medžiagos masės procentais);
- pH vertę (vandenyje);
- organinės anglies kiekį (išreikštas sausos medžiagos masės procentais);
- azoto kiekį (išreikštas sausos medžiagos masės procentais);
- jonų mainų talpą (mmol/kg);
- pradinę mikrobinę biomasę (išreikšta bendro organinės anglies kiekio procentine dalimi);
- metodų kiekvienam parametrui nustatyti nuorodas;
- visą informaciją apie dirvožemio mėginių ėmimą ir laikymą;
- pradinio dirvožemio inkubavimo, jei buvo atliekamas, detales.
17.2. Tiriamoji medžiaga:
- fizikinė būsena ir, jei tinka, fizinės ir cheminės savybės;
- cheminio identifikavimo duomenys, jei tinka, įskaitant struktūrinę formulę, grynumą (t. y. augalų apsaugos produktų atveju veikliojo ingrediento procentinę dalį), azoto kiekį.
17.3. Tyrimo sąlygos:
- dirvožemio gerinimo organiniu substratu smulkesnis apibūdinimas;
- naudotų tiriamosios medžiagos koncentracijos verčių skaičius ir, jei reikia, pasirinktų koncentracijos verčių pagrindimas;
- tiriamosios medžiagos įterpimo į dirvožemį smulkesnis apibūdinimas;
- inkubavimo temperatūra;
- drėgmės kiekis dirvožemyje pradedant tyrimą ir jo metu;
- dirvožemio inkubavimo metodas (t. y. kaip vientisas mėginys arba kaip mėginių serija);
- kartotinių mėginių skaičius;
- mėginių ėmimo analizei skaičius (ir laikas).
17.4. Rezultatai:
- metodas ir įranga kvėpavimo greičiui matuoti;
- lentelių duomenys, įskaitant atskiras ir vidutines anglies dioksido arba deguonies vertes;
- apdorotų ir kontrolinių kartotinių mėginių serijų rezultatų tarpusavio nuokrypis;
- apskaičiavimuose daromų pataisų paaiškinimas, jei tinka;
- procentais išreikštas gliukozės sukeliamo kvėpavimo greičio nuokrypis iš kiekvieną kartą paimtų mėginių arba, jei tinka, EC50 vertė esant 95 procentų pasikliovimo rėžiui, kitos ECx vertės (t. y. EC25 arba EC10) ir pasikliovimo rėžiai, dozės ir atsako priklausomybės kreivė;
- statistinis rezultatų apdorojimas, kur to reikia;
- visa informacija ir stebėjimai, kurie padėtų interpretuoti rezultatus.
______________
LAND 75-2005 „Dirvožemio
mikroorganizmai.
Anglies transformavimo tyrimas (C.22)“
priedas
BIBLIOGRAFIJA
1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.
5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflora“. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.
8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties“. Agronomy Monograph N° 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831- 871.
9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.
10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
11) Heinemeyer O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.
13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120.
15) Litchfield, J.T. and Wilcokson, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos aplinkos ministro
2005 m. spalio 3 d. įsakymu Nr. D1-478
LAND 76-2005 „AEROBINIS IR ANAEROBINIS TRANSFORMAVIMAS DIRVOŽEMYJE (C.23)“
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Šiame aplinkos apsaugos normatyviniame dokumente aprašytas metodas skirtas cheminių medžiagų aerobiniam ir anaerobiniam transformavimui dirvožemyje įvertinti. Šis tyrimų metodas pagrįstas esamais nurodymais (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Tyrimai atliekami, siekiant nustatyti:
ii) transformavimo produktų, kurie gali veikti augalus bei dirvožemio organizmus, tipą ir susidarymo bei išnykimo greitį.
Taip turi būti tiriamos cheminės medžiagos, kurios tiesiogiai įterpiamos į dirvožemį arba kurios gali pasiekti dirvožemio aplinką. Be to, tokių laboratorinių tyrimų rezultatai gali būti naudojami atitinkamų lauko tyrimų mėginių ėmimo ir analizės protokolams kurti.
Aerobinių ir anaerobinių tyrimų, naudojant vieno tipo dirvožemį, paprastai pakanka transformavimo keliams įvertinti (8)(10)(11). Transformavimo greičiai turėtų būti nustatomi bent trijuose papildomuose dirvožemiuose (8)(10).
Belgirate, Italijoje, 1995 m. vykusiame Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacijos (OECD – Organization for Economic Cooperation and Development) seminare dėl dirvožemių ir nuosėdų atrankos (10) buvo konkrečiai sutarta dėl šiame tyrime naudojamų dirvožemių skaičiaus ir tipų. Tiriamų dirvožemių tipai turėtų atitikti aplinkos sąlygas, kuriose medžiagos bus naudojamos arba kur jos pasklinda. Pvz., cheminės medžiagos, kurios gali pasklisti subtropinio arba tropinio klimato sąlygomis, turėtų būti tiriamos Ferrasol arba Nitosol tipo dirvožemiuose (Maisto ir žemės ūkio organizacijos sistema) (FAO sistema). Be to, seminare buvo pateiktos dirvožemio mėginių ėmimo, tvarkymo ir laikymo rekomendacijos, pagrįstos ISO vadovu (15). Be to, šis metodas nagrinėja ryžių laukų dirvožemius.
II. NUORODOS
III. APIBRĖŽIMAI
3. Tiriamoji medžiaga – bet kuri medžiaga, ar tai būtų pradinis junginys, ar su tiriamuoju dalyku susiję jos transformavimo produktai.
4. Transformavimo produktai – visos medžiagos, susidariusios įvykus tiriamosios medžiagos biotinio transformavimo arba abiotinių virsmų reakcijoms, įskaitant CO2 ir surištuosius likučius.
5. Surištieji likučiai – sąvoka „surištieji likučiai“ reiškia dirvožemyje, augale arba gyvūne esančius junginius, kurie po ekstrahavimo lieka matricoje pradinės medžiagos arba jos metabolito, metabolitų bei transformavimo produktų pavidalu. Ekstrahavimo metodas turi iš esmės nepakeisti pačių junginių ar matricos struktūros. Ryšio prigimtį iš dalies galima išaiškinti naudojant matricą keičiančius ekstrahavimo ir sudėtingus analizės metodus. Pvz., tokiu būdu iki šiol buvo identifikuotos kovalentinės, joninės ir sorbcinio tipo jungtys, be to, pagautieji junginiai. Apskritai surištųjų likučių susidarymas labai mažina biologinį įsisavinamumą ir biologinį prieinamumą (12) [modifikuotas IUPAC 1984 (13) apibrėžimas].
8. Dirvožemis – mineralinių ir organinių cheminių sudedamųjų dalių mišinys, kuriame organinius komponentus sudaro didelį anglies ir azoto kiekį turintys ir didelės molekulinės masės junginiai, apgyvendinti smulkių organizmų, daugiausia mikroorganizmų. Galima apdoroti dviejų būsenų dirvožemį:
8.1. nepaliestą, kuris susidaro laikui bėgant, esantį tipiniuose įvairių dirvožemio tipų sluoksniuose;
9. Mineralizacija – visiškas organinio junginio suskaidymas į CO2 ir H2O aerobinėmis sąlygomis ir į CH4, CO2 ir H2O anaerobinėmis sąlygomis. Šiame tyrimo metode, kai naudojamas 14C žymėtas junginys, mineralizacija suprantama kaip didelio laipsnio suskaidymas, kurio metu žymėtasis anglies atomas yra suoksiduotas, išskiriant atitinkamą 14CO2 kiekį (14).
10. Pusėjimo trukmė – t0,5, laikas, sugaištas transformuoti 50 % tiriamosios medžiagos, kai transformavimą galima aprašyti pirmojo laipsnio kinetikos lygtimis; ji nepriklauso nuo koncentracijos.
11. DT50 (išnykimo trukmė 50) – laikas, per kurį tiriamosios medžiagos koncentracija sumažėja 50 %; ši trukmė skiriasi nuo pusėjimo trukmės t0,5, kai transformavimas neatitinka pirmojo laipsnio kinetikos.
IV. ETALONINĖS MEDŽIAGOS
V. TYRIMO TINKAMUMAS
15. Metodas tinka visoms cheminėms medžiagoms (nežymėtoms arba žymėtoms radioaktyviais izotopais), kurioms nustatyti gali būti pritaikytas pakankamo tikslumo ir jautrio analizės metodas. Jis tinka mažai lakiems, nelakiems, vandenyje tirpiems ar netirpiems junginiams. Tyrimas neturi būti taikomas cheminėms medžiagoms, kurios pasižymi savybe labai greit išgaruoti iš dirvožemio (pvz., fumigantai, organiniai tirpikliai), todėl negali būti laikomos dirvožemyje šio tyrimo sąlygomis.
VI. INFORMACIJA APIE TIRIAMĄJĄ MEDŽIAGĄ
16. Transformavimo greičiui matuoti gali būti naudojama nežymėta arba žymėta tiriamoji medžiaga. Žymėta medžiaga reikalinga transformavimo keliui tirti ir masių balansui nustatyti. Rekomenduojama žymėti 14C, bet gali būti naudingi ir kiti izotopai, pvz., 13C, 15N, 3H, 32P. Kiek įmanoma, žymė turi būti įjungta patvariausioje arba keliose patvariausiose molekulės dalyse ([1]).
Tiriamosios medžiagos grynumas turi būti ne mažiau kaip 95 %.
17. Prieš pradedant aerobinio ir anaerobinio transformavimo dirvožemyje tyrimą, turėtų būti surinkta tokia informacija apie tiriamąją medžiagą:
17.6. pKa, jei molekulė gali atiduoti arba prisijungti protonus [OECD 112 nurodymas] (16).
Kitą naudingą informaciją gali sudaryti duomenys apie tiriamosios medžiagos toksiškumą dirvožemio mikroorganizmams [tyrimo metodai C.21 ir C.22] (16).
Reikia turėti analizės metodus (įskaitant ekstrahavimo ir gryninimo metodus) tiriamajai medžiagai ir jos transformavimo produktams kiekybiškai nustatyti ir identifikuoti.
VII. PRINCIPAS
18. Dirvožemio mėginiai apdorojami tiriamąja medžiaga ir inkubuojami tamsoje, naudojant biometrines kolbas arba pratekamąsias sistemas kontroliuojamomis laboratorijos sąlygomis (esant pastoviai temperatūrai ir dirvožemio drėgmei). Po numatytų laiko tarpų dirvožemio mėginiai ekstrahuojami ir analizuojami pradinei medžiagai ir jos transformavimo produktams nustatyti. Be to, naudojant atitinkamus absorbcijos įtaisus, renkami ir analizuojami lakūs produktai. Naudojant 14C žymėtą medžiagą ir surenkant išskirtą 14CO2, galima išmatuoti tiriamosios medžiagos mineralizacijos greitį ir nustatyti masių balansą, įskaitant dirvožemiu surištus likučius.
VIII. KOKYBĖS KRITERIJAI
19. Išgavimo laipsnis
Ne mažiau dviejų kartotinių dirvožemio mėginių ekstrahavimas ir analizė iškart po tiriamosios medžiagos pridėjimo yra pirmasis analizės metodo pakartojamumo ir tiriamosios medžiagos įterpimo procedūros tolygumo rodiklis. Vėlesnių tyrimo stadijų išgavimo laipsniai gaunami matuojant atitinkamų masės verčių balansą. Žymėtųjų cheminių medžiagų išgavimo laipsniai turi būti nuo 90 % iki 110 % (8), nežymėtų cheminių medžiagų – nuo 70 % iki 110 % (3).
20. Analizės metodo pakartojamumas ir jautris
Tiriamosios medžiagos ir transformavimo produktų kiekybinės analizės metodo pakartojamumas (išskyrus pradinį ekstrahavimo efektyvumą) gali būti patikrintas atliekant kartotinę to paties dirvožemio, inkubuoto pakankamai ilgai, kad galėtų susidaryti transformavimo produktai, ekstrakto analizę.
Tiriamosios medžiagos ir virsmo produktų analizės metodo aptikimo riba (LOD) turi būti bent 0,01 mg × kg-1 dirvožemio (kaip bandomosios medžiagos) arba 1 % įterpiamos dozės, imant mažesniąją vertę. Turi būti apibrėžta kiekybinio nustatymo riba (LOQ).
21. Transformavimo duomenų tikslumas
Atliekant tiriamosios medžiagos koncentracijos vertės kaip laiko funkcijos regresinę analizę, gaunama atitinkama informacija apie transformavimo kreivės patikimumą, leidžianti apskaičiuoti pusėjimo trukmės pasikliovimo rėžius (jei reakcija atitinka pseudopirmojo laipsnio kinetiką) arba DT50 vertes ir, jei tinka, DT75 ir DT90 vertes.
IX. TYRIMO EIGA
22. Įranga ir cheminiai reagentai
Inkubavimo sistemas sudaro statinės uždaros sistemos arba tinkamos pratekamosios sistemos (7)(17). Tinkami pratekėjimo ir biometrinio tipo dirvožemio inkubavimo aparatai pavaizduoti 1 ir 2 paveiksluose. Kiekviena iš inkubavimo sistemų turi savo pranašumus ir apribojimus (7)(17).
Reikalinga standartinė laboratorinė įranga, ypač ši:
- analizės prietaisai, tokie kaip dujų ir skysčių chromatografijos (GLC), didelio efektyvumo skysčių chromatografijos (HPLC), plonasluoksnės chromatografijos (TLC) įranga, įskaitant atitinkamas detektavimo sistemas žymėtosioms arba nežymėtosioms medžiagoms analizuoti, arba atvirkštinio izotopų skiedimo metodas;
- identifikavimui skirti prietaisai (pvz., MS, GC-MS, HPLC-MS, MBR ir t. t.);
- skysčių scintiliacinis skaitiklis;
- aparatūra radioaktyviai medžiagai sudeginti;
- centrifuga;
- ekstrahavimo aparatūra (pvz., centrifugos mėgintuvėliai ekstrahavimui esant žemoms temperatūroms ir Soksleto aparatas nepertraukiamam ekstrahavimui su grįžtamuoju šaldytuvu);
- įranga tirpalams ir ekstraktams koncentruoti (pvz., sukamasis garintuvas);
- vandens vonia;
- mechaninio maišymo įtaisas (pvz., minkomasis maišytuvas, sukamasis maišytuvas).
Naudojami cheminiai reagentai, pvz.:
- NaOH, analiziškai grynas, 2 mol × dm-3, arba kitas tinkamas šarmas (pvz., KOH, etanolaminas);
- H2SO4, analiziškai gryna, 0,05 mol × dm-3;
- etilenglikolis, analiziškai grynas;
- kietosios sugeriančios medžiagos, natrio kalkės ir poliuretano kamščiai;
- organiniai tirpikliai, analiziškai gryni, pvz., acetonas, metanolis ir t. t.;
- scintiliacinis skystis.
23. Tiriamosios medžiagos įterpimas
Norint tiriamąją medžiagą įterpti ir paskirstyti dirvožemyje, ji turi būti ištirpinta vandenyje (dejonizuotame arba distiliuotame) arba prireikus kiek įmanoma mažesniame kiekyje acetono arba kitų organinių tirpiklių (6), kuriuose tiriamoji medžiaga būtų pakankamai tirpi ir patvari. Tačiau parinkto tirpiklio kiekis neturi daryti reikšmingos įtakos dirvožemio mikrobiniam aktyvumui (žr. 1.5 ir 1.9.2-1.9.3 punktus). Nereikia naudoti tirpiklių, kurie inhibuoja mikrobinį aktyvumą, pvz., chloroformo, dichlormetano ir kitų halogenintų tirpiklių.
Tiriamoji medžiaga gali būti įterpiama ir kaip kieta medžiaga, pvz., sumaišyta su kvarciniu smėliu (6) arba su mažu tiriamo dirvožemio mėginio kiekiu, kuris prieš tai išdžiovinamas ir sterilizuojamas. Jei tiriamoji medžiaga pridedama naudojant tirpiklį, tirpiklis išgarinamas prieš sodrinto mėginio įterpimą į pradinį nesterilų dirvožemio mėginį.
Daugeliui cheminių medžiagų, kurios į dirvožemį daugiausia patenka su nuotekų dumblu arba dirbant žemės ūkio darbus, tiriamoji medžiaga iš pradžių turi būti dedama į dumblą, kuris po to įterpiamas į dirvožemio mėginį (žr. 25.2 ir 25.3 punktus).
Nerekomenduojama sistemingai naudoti preparatus. Tačiau, pvz., jei tiriamoji medžiaga mažai tirpi, preparatų naudojimas gali būti tinkamas pakaitinis būdas.
24. Dirvožemiai
24.1. Dirvožemio atranka
Transformavimo keliui nustatyti galima naudoti tipinį dirvožemį; rekomenduojama naudoti smėlingą priemolį, rudąjį priemolį, priemolį arba priesmėlį [pagal FAO ir USDA klasifikaciją (18)], kurio pH vertė 5,5-8,0, organinės anglies kiekis (0,5-2,5) % ir mikrobinės biomasės kiekis sudaro ne mažiau kaip 1 % bendros dirvožemio organinės anglies (10).
Transformavimo greičiui tirti turi būti naudojami mažiausiai trys papildomi dirvožemiai, sudarantys tam tikrą dirvožemių eilutę. Dirvožemiai turi skirtis organinės anglies kiekiu, pH, molio ir mikrobinės biomasės kiekiu (10).
Visi dirvožemiai apibūdinami nurodant bent tekstūrą (smėlio, dumblo, molio procentais) [pagal FAO ir USDA klasifikaciją (18)], pH, katijonų mainų talpą, organinės anglies kiekį, bertinį tankį, vandens sulaikymo charakteristikas ([2]) ir mikrobinę biomasę (tik aerobiniams tyrimams). Rezultatams interpretuoti gali būti naudinga papildoma informacija apie dirvožemio savybes.
Dirvožemio charakteristikoms nustatyti gali būti taikomi metodai, rekomenduojami nuorodose (19)(20)(21)(22)(23). Mikrobinė biomasė turi būti nustatoma substrato sukeliamo kvėpavimo (SIR) metodu (25)(26) arba pakaitiniais metodais (20).
24.2. Dirvožemių mėginių ėmimas, tvarkymas ir laikymas
Reikia turėti detalią informaciją apie lauko vietą, iš kurios imamas tyrimui skirtas dirvožemis. Nurodoma tiksli vietos padėtis, augalų danga, apdorojimo cheminėmis medžiagomis datos, apdorojimas organinėmis ir neorganinėmis trąšomis, biologinių priedų dėjimas arba kitokie užteršimo atvejai. Jei per paskutinius ketverius metus dirvožemiai buvo apdorojami tiriamąja medžiaga arba jos struktūriniais analogais, tokie dirvožemiai neturi būti naudojami transformavimo tyrimams (10)(15).
Dirvožemis turi būti tik ką paimtas iš lauko (iš A horizonto arba viršutinio 20 cm sluoksnio), dirvožemiui turint tokį vandens kiekį, kad lengvai sijotųsi. Nereikia imti dirvožemių, išskyrus ryžių laukų dirvožemius, mėginių, esant ilgalaikiams (ilgiau kaip 30 parų) sausros, šalčių arba potvynių laikotarpiams arba iš karto jiems pasibaigus (14). Mėginiai turi būti transportuojami tokiu būdu, kad kiek įmanoma mažiau pasikeistų vandens kiekis dirvožemyje. Mėginiai turi būti laikomi tamsoje taip, kad kiek įmanoma geriau į juos patektų grynas oras. Paprastai šiam tikslui tinka nesandariai užrištas polietileninis maišas.
Dirvožemis, paėmus jo mėginius, turi būti apdorotas kiek įmanoma greičiau. Augmenija, stambesnė dirvožemio fauna ir akmenys turi būti pašalinti prieš dirvožemį sijojant per 2 mm sietą, ant kurio lieka maži akmenys, fauna ir augalų likučiai. Sijojant reikia išvengti per didelio dirvožemio džiūvimo ir smulkinimo (15).
Kai žiemą sunku imti mėginius lauke (dirvožemis įšalęs arba yra padengtas sniego sluoksniu), jį galima imti iš dirvožemio krūvos, laikomos šiltnamyje po augaline danga (pvz., žolės arba žolės ir dobilų mišinio danga). Griežtai teikiama pirmenybė dirvožemiams, tik ką paimtiems iš lauko, tačiau jei surinktą ir apdorotą dirvožemį tenka laikyti iki tyrimo pradžios, turi būti sudarytos tinkamos laikymo sąlygos mikrobiniam aktyvumui užtikrinti. Laikyti galima tik ribotą laiką [ne ilgiau kaip tris mėnesius, esant (4±2) °C] ([3]). Išsamios instrukcijos kaip imti, tvarkyti ir laikyti biologinio transformavimo tyrimams skirtus dirvožemių mėginius, pateiktos (8)(10)(15)(26)(27) nuorodose.
Prieš tai, kai apdorotas dirvožemis bus panaudotas šiam tyrimui, reikia atlikti pradinį jo inkubavimą, kad galėtų sudygti ir būtų pašalintos sėklos, ir būtų atkurta mikrobinio metabolizmo pusiausvyra, kai mėginių ėmimo arba laikymo sąlygas pakeičia inkubavimo sąlygos. Paprastai pakanka nuo 2 iki 28 parų pradinio inkubavimo laikotarpio, temperatūros ir drėgmės sąlygoms priartinti prie numatyto tyrimo sąlygų (15). Bendra laikymo ir pradinio inkubavimo trukmė neturi būti ilgesnė kaip trys mėnesiai.
25. Procedūra
25.1. Tyrimo sąlygos
25.1.1. Tyrimo temperatūra
Visą tyrimo laikotarpį dirvožemiai inkubuojami tamsoje, esant pastoviai temperatūrai, kuri atitinka klimatines naudojimo arba pasklidimo sąlygas. Visoms tiriamoms medžiagoms, kurios gali pasiekti dirvožemį vidutinio klimato sąlygomis, rekomenduojama (20±2)° C temperatūra. Temperatūra turi būti kontroliuojama.
Jei cheminės medžiagos naudojamos arba sklinda šaltesnio klimato sąlygomis (pvz., šiaurės šalyse, rudens ir žiemos laikotarpiu), inkubuojami papildomi dirvožemio mėginiai esant žemesnei temperatūrai (pvz., 10±2 °C).
25.1.2. Drėgmės kiekis
Atliekant transformavimo tyrimus aerobinėmis sąlygomis, turi būti nustatomas ir palaikomas dirvožemio drėgmės kiekis ([4]), atitinkantis pF nuo 2,0 iki 2,5 (3). Dirvožemio drėgmės kiekis išreiškiamas vandens mase sauso dirvožemio masės vienetui ir turi būti reguliariai tikrinamas (pvz., kas 2 savaites) pasveriant inkubavimo kolbas, o vandens nuostoliai kompensuojami įpilant vandens (geriausia filtravimu sterilizuoto vandentiekio vandens). Reikia imtis atsargumo priemonių, kad pilant vandenį būtų išvengta tiriamosios medžiagos ir/arba transformavimo produktų nuostolių dėl garavimo ir/arba fotodestrukcijos (jei vyksta), arba jie būtų kiek įmanoma sumažinti.
Atliekant transformavimo tyrimus anaerobinėmis ir ryžių lauko sąlygomis, dirvožemis yra prisotinamas vandeniu užtvindant.
25.1.3. Aerobinės inkubavimo sąlygos
Pratekamosiose sistemose aerobinės sąlygos užtikrinamos per sistemą pučiant arba ištisai ventiliuojant sudrėkintą orą. Biometrinėse kolbose oro mainai užtikrinami difuzija.
25.1.4. Sterilios aerobinės sąlygos
Informacijai apie abiotinių tiriamosios medžiagos virsmų galimybę gauti dirvožemio mėginiai gali būti sterilizuojami (sterilizavimo metodai pateikti 16 ir 29 nuorodose), apdorojami sterilia tiriamąja medžiaga (pvz., tirpalas praleidžiamas per sterilų filtrą) ir aeruojami sudrėkintu steriliu oru, kaip aprašyta 25.1.3 punkte. Jei tiriamas ryžių lauko dirvožemis, dirvožemis ir vanduo sterilizuojami ir inkubavimas vykdomas, kaip aprašyta 25.1.6 punkte.
25.1.5. Anaerobinės inkubavimo sąlygos
Anaerobinėms sąlygoms sudaryti ir palaikyti dirvožemis apdorojamas tiriamąja medžiaga ir inkubuojamas aerobinėmis sąlygomis 30 parų arba pusėjimo trukmės ar DT50 laikotarpiu (kuris trumpesnis), vėliau užpilamas vandeniu (1-3 cm vandens sluoksniu), o per inkubavimo sistemą prapučiamos inertinės dujos (pvz., azotas arba argonas) ([5]). Tyrimų sistema turi užtikrinti sąlygas matuoti tokius dydžius, kaip pH, deguonies koncentraciją ir oksidacijos-redukcijos potencialą, ir turėti lakių produktų gaudykles. Sistema turi būti uždara, kad būtų išvengta oro patekimo difuzijos būdu.
25.1.6. Ryžių laukų dirvožemio inkubavimo sąlygos
Transformavimui ryžių laukų dirvožemiuose tirti dirvožemis užpilamas maždaug 1-50 cm vandens sluoksniu ir tiriamoji medžiaga dedama į vandeninę fazę (9). Rekomenduojama naudoti ne mažiau kaip 5 cm gylio dirvožemio sluoksnį. Per sistemą ventiliuojamas oras kaip aerobinėmis sąlygomis. Turi būti stebimi ir pateikiami ataskaitoje vandeninio sluoksnio pH, deguonies koncentracija ir oksidacijos-redukcijos potencialas. Prieš pradedant transformavimo tyrimus, būtinas ne mažiau kaip dviejų savaičių pradinio inkubavimo laikotarpis (žr. 24.2 punktą).
25.1.7. Tyrimo trukmė
Transformavimo greičio ir kelio tyrimai paprastai neturi trukti ilgiau kaip 120 parų ([6]) (3)(6)(8), kadangi po to tikėtinas dirvožemio mikrobinio aktyvumo mažėjimas dirbtinėje, nuo natūralaus pasipildymo atskirtoje laboratorinėje sistemoje. Jei būtina apibūdinti tiriamosios medžiagos išnykimą ir pagrindinių transformavimo produktų susidarymą ir išnykimą, tyrimai gali būti tęsiami ilgesnį laiką (pvz., 6 arba 12 mėnesių) (8). Ilgesni inkubavimo laikotarpiai turi būti pagrįsti tyrimų ataskaitoje, be to, papildyti biomasės matavimais šiais laikotarpiais ir jiems pasibaigus.
25.2. Tyrimo eiga
Maždaug nuo 50 iki 200 g dirvožemio (kaip sauso dirvožemio) dedama į kiekvieną inkubavimo kolbą (žr. 3 priedo 1 ir 2 paveikslus) ir dirvožemis apdorojamas tiriamąja medžiaga vienu iš metodų, aprašytų 23 punkte. Jei tiriamajai medžiagai įterpti buvo naudojami organiniai tirpikliai, jie turi būti pašalinti iš dirvožemio garinimu. Tuomet dirvožemis gerai sumaišomas mentele ir/arba purtant kolbą. Jei tyrimas atliekamas ryžių lauko sąlygomis, po tiriamosios medžiagos įterpimo dirvožemis ir vanduo turi būti gerai sumaišyti. Atliekama mažų alikvotinių apdoroto dirvožemio dalių (pvz., 1 g) analizė tiriamajai medžiagai nustatyti ir taip patikrinti pasiskirstymo tolygumą. Pakaitiniai metodai pateikti toliau.
Apdorojimo norma turi atitikti didžiausią augalų apsaugos produkto normą, rekomenduojamą naudojimo instrukcijose, ir atitinkamą tolygaus įterpimo lauke gylį (pvz., į viršutinį 10 cm dirvožemio sluoksnį ([7])). Pvz., jei cheminės medžiagos skirtos lapams arba dirvožemiui be įterpimo, atitinkamas gylis, pagal kurį apskaičiuojamas į kiekvieną kolbą dedamos cheminės medžiagos kiekis, lygus 2,5 cm. Jei cheminės medžiagos įterpiamos į dirvožemį, taikomas gylis, naudojimo instrukcijose apibrėžtas kaip įterpimo gylis. Jei tai dažniausiai pasitaikančios cheminės medžiagos, įterpimo norma turi būti įvertinta atsižvelgiant į patį tipiškiausią patekimo būdą; pvz., kai pagrindinis patekimo į dirvožemį būdas yra nuotekų dumblas, cheminė medžiaga turi būti dozuojama su dumblu, esant koncentracijai, kuri atitiktų tikėtiną medžiagos koncentraciją dumble, o į dirvožemį dedamo dumblo kiekis turi atitikti įprastą dumblo įkrovą į žemės ūkio paskirties dirvožemius. Jei šios koncentracijos nepakanka pagrindiniams transformavimo produktams identifikuoti, gali būti atliktas inkubavimas atskirų dirvožemio mėginių, turinčių didesnes medžiagos normas, tačiau reikėtų vengti per didelių normų, kurios gali lemti dirvožemio mikroorganizmų funkcijas (žr. 1.5 ir 1.8.2 punktus).
Taikant kitą būdą, tiriamąja medžiaga galima apdoroti didesnį dirvožemio maišinį [t. y. (1-2) kg], kruopščiai sumaišyti, naudojant atitinkamą maišymo įtaisą, ir mažomis 50-200 g dalimis padalyti į inkubavimo kolbas (pvz., naudojant ėminio dalytuvus). Tiriamosios medžiagos tolygiam pasiskirstymui patikrinti analizuojamos mažos apdoroto dirvožemio įkrovos alikvotinės dalys (pvz., 1 g). Tokiai procedūrai teikiama pirmenybė, kadangi tiriamąją medžiagą dirvožemyje galima paskirstyti tolygiau.
Tomis pačiomis (aerobinėmis) sąlygomis inkubuojami ir neapdoroti tiriamąja medžiaga dirvožemio mėginiai. Šie mėginiai yra naudojami biomasei nustatyti vykstant tyrimui ir jam pasibaigus.
Kai į dirvožemį įterpiama tiriamoji medžiaga ištirpinta organiniame (-iuose) tirpiklyje (-iuose), dirvožemio mėginiai, apdoroti tokiu pačiu tirpiklio (-ų) kiekiu, inkubuojami tokiomis pačiomis sąlygomis (aerobinėmis), kaip ir tiriamąja medžiaga apdoroti mėginiai. Šie mėginiai naudojami biomasei nustatyti tyrimo pradžioje, tyrimų metu ir juos užbaigus, kad būtų galima patikrinti tirpiklio (-ų) poveikio mikrobinei biomasei efektus.
Kolbos su apdorotu dirvožemiu arba prijungiamos prie pratekamosios sistemos, aprašytos 1 paveiksle, arba uždaromos 2 paveiksle pavaizduota sugėrimo kolonėle (žr. 3 priedą).
25.3. Mėginių ėmimas ir matavimas
Praėjus tam tikriems laiko intervalams, paimamos dvi inkubavimo kolbos, dirvožemio mėginiai ekstrahuojami atitinkamais skirtingo poliškumo tirpikliais, ir analizuojami tiriamajai medžiagai ir/arba transformavimo produktams nustatyti. Atliekant gerai suplanuotą tyrimą, naudojamas pakankamas kolbų skaičius, kad kiekvienam mėginio ėmimui būtų galima skirti dvi kolbas. Be to, visą kiekvieno dirvožemio inkubavimo laikotarpį ir jam pasibaigus, įvairiais laiko tarpais imami sugėrimui naudotų tirpalų arba kietųjų medžiagų mėginiai (pirmąjį mėnesį 7 parų intervalais ir vėliau 17 parų intervalais) ir atliekama jų analizė lakiems produktams nustatyti. Be dirvožemio mėginio, imamo iš karto po medžiagos įterpimo (0 paros mėginio), būtina numatyti papildomą mėginių ėmimą ne mažiau kaip 5 kartus. Laiko intervalai turi būti parinkti taip, kad būtų galima gauti tiriamosios medžiagos išnykimo ir transformavimo produktų susidarymo bei išnykimo kreives (pvz., 0, 1, 3, 7 para; 2, 3 savaitės; 1, 2, 3 mėnesiai ir t. t.).
Kai naudojama 14C žymėta tiriamoji medžiaga, nesiekstrahuojančios medžiagos radioaktyvumas kiekybiškai nustatomas sudeginant, ir kiekvienam mėginio ėmimo intervalui apskaičiuojamas masių balansas.
Jei inkubuojama anaerobinėmis ir ryžių lauko sąlygomis, dirvožemis ir vandeninės fazės analizuojami kartu tiriamajai medžiagai ir transformavimo produktams nustatyti, arba prieš ekstrahavimą ir analizę atskiriamos filtravimu ar centrifugavimu.
25.4. Neprivalomi tyrimai
Temperatūros ir dirvožemio drėgmės įtakai tiriamosios medžiagos ir/arba jos transformavimo produktų transformavimo dirvožemyje greičiams įvertinti gali būti naudingi aerobiniai tyrimai nesteriliomis sąlygomis, esant kitoms papildomoms temperatūros ir dirvožemio drėgmės vertėms.
Galima papildomai apibūdinti neekstrahuojamų medžiagų radioaktyvumą, pvz., ekstrahavimui naudojant virškritinę takiąją terpę.
26. Duomenys
26.1. Rezultatų apdorojimas
Tiriamosios medžiagos, transformavimo produktų, lakių medžiagų (tik procentais) ir neekstrahuojamų medžiagų kiekiai pateikiami kaip pradinės koncentracijos procentinė dalis ir, jei tinka, mg × kg-1 dirvožemio (sausojo dirvožemio masei) kiekvienam mėginio ėmimo intervalui. Masių balansas kiekvienam mėginio ėmimo intervalui turi būti pateiktas kaip naudotos pradinės koncentracijos procentinė dalis. Grafiškai pavaizdavus tiriamosios medžiagos koncentracijos ir laiko santykį, galima įvertinti jos transformavimo pusėjimo trukmę arba DT50. Turi būti identifikuoti pagrindiniai transformavimo produktai ir brėžiamos jų koncentracijos dydžių kitimo laike kreivės susidarymo ir išnykimo greičiams parodyti. Pagrindiniu transformavimo produktu laikomas kiekvienas produktas, kuris bet kuriuo tyrimo metu sudaro ≥ 10 % naudotos dozės.
Absorbuoti lakūs produktai tam tikru laipsniu rodo dirvožemyje esančios tiriamosios medžiagos ir jos transformavimo produktų lakumą.
Tiksliau, pusėjimo trukmės arba DT50 vertė ir, jei tinka, DT75 ir DT90 vertė nustatomos apskaičiuojant pagal atitinkamus kinetinius modelius. Pusėjimo trukmės ir DT50 vertė pateikiamos ataskaitoje kartu su taikyto modelio aprašymu, kinetikos laipsniu ir determinacijos koeficientu (r2). Geriau taikyti pirmojo laipsnio kinetikos lygtis, išskyrus kai r2 < 0,7. Be to, jei reikia, apskaičiavimų būdus galima pritaikyti pagrindiniams transformavimo produktams. Atitinkami modelių pavyzdžiai aprašyti 31-35 nuorodose.
Atlikus transformavimo greičio tyrimus esant įvairioms temperatūros vertėms, transformavimo greičiai turi būti aprašyti kaip temperatūros funkcija tyrimo temperatūros verčių intervale pagal tokią Arenijaus lygtį:
k = A × e-B/T arba ln k = ln A – 
,
kurioje
– ln A ir B yra regresijos tiesės, gautos naudojant tiesinę ln k kaip 1/T funkcijos regresiją;
– atkarpa ir krypties koeficientas k yra greičio konstanta, esant temperatūrai T;
– T yra temperatūra Kelvino laipsniais.
Reikia atkreipti dėmesį į ribotą temperatūros intervalą, kuriame Arenijaus lygtis galioja tuo atveju, kai transformavimas valdomas mikroorganizmų veikimo.
26.2. Rezultatų įvertinimas ir interpretavimas
Nors tyrimai atliekami dirbtinėje laboratorinėje sistemoje, rezultatai paprastai leidžia įvertinti tiriamosios medžiagos transformavimo greitį ir transformavimo produktų sudarymo bei išnykimo greitį lauko sąlygomis (36)(37).
Tiriamosios medžiagos transformavimo kelio tyrimas suteikia informacijos apie tai, kaip dirvožemyje keičiama įterptosios medžiagos struktūra, vykstant cheminėms ir mikrobinėms reakcijoms.
X. BAIGIAMOSIOS NUOSTATOS
27. Tyrimų ataskaita
Tyrimų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
27.1. Tiriamoji medžiaga:
- įprastas pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, struktūrinė formulė (rodanti žymės ar žymių padėtį, jei naudojama radioaktyviais atomais žymėtoji medžiaga) ir atitinkamos fizinės ir cheminės savybės (žr. 1.5 punktą);
- tiriamosios medžiagos grynumas (priemaišos);
- radiocheminis žymėtosios cheminės medžiagos grynumas ir savitasis aktyvumas (jei tinka).
27.2. Etaloninės medžiagos:
- etaloninių medžiagų, naudojamų transformavimo produktui apibūdinti ir/arba identifikuoti, cheminis pavadinimas ir struktūra.
27.3. Tyrimui naudojami dirvožemiai:
- ėmimo vietos detalės;
- dirvožemių ėmimo data ir procedūra;
- dirvožemių savybės, tokios kaip pH, organinės anglies kiekis, tekstūra ( % smėlio, % dulkių, % molio), katijonų mainų talpa, bertinis tankis, vandens sulaikymo charakteristika ir mikrobinės biomasės kiekis;
- dirvožemio laikymo trukmė ir sąlygos (jei buvo laikytas).
27.4. Tyrimo sąlygos:
- tyrimų atlikimo datos;
- įterptos tiriamosios medžiagos kiekis;
- naudoti tirpikliai ir tiriamosios medžiagos įterpimo būdas;
- iš pradžių apdoroto dirvožemio ir kiekvienai analizei imamo dirvožemio masė;
- naudotos inkubavimo sistemos aprašymas;
- oro srauto greičiai (tik pratekamosioms sistemoms);
- temperatūra eksperimento pradžioje;
- dirvožemio drėgmės kiekis inkubavimo metu;
- mikrobinė masė aerobinių tyrimų pradžioje, jų eigoje ir pabaigoje;
- pH, deguonies koncentracija ir oksidacijos-redukcijos potencialas anaerobinių ir ryžių lauko tipo tyrimų pradžioje, jų eigoje ir pabaigoje;
- ekstrahavimo metodas arba metodai;
- tiriamosios medžiagos, pagrindinių jos transformavimo dirvožemyje produktų bei sugertų medžiagų kiekybinio nustatymo ir identifikavimo metodai;
- kartotinių ir kontrolinių maišinių skaičius.
27.5. Rezultatai:
- mikroorganizmų aktyvumo nustatymo rezultatai;
- panaudotų analizės metodų pakartojamumas ir jautris;
- išgavimo laipsnio vertės (tinkamu patvirtinto tyrimo % vertės yra pateiktos 19 skirsnyje);
- rezultatų, išreiškiamų kaip įterptos pradinės dozės procentinė dalis ir, jei tinka, kaip mg × kg-1 dirvožemio (sauso dirvožemio), lentelės;
- masių balansas tyrimų eigoje ir juos užbaigus;
- dirvožemio nesiekstrahuojančio (surištojo) radioaktyvumo arba likučių apibūdinimas;
- išskirto CO2 ir kitų lakių medžiagų kiekybinis apskaičiavimas;
- tiriamosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindinių transformavimo produktų koncentracijos dirvožemyje kaip laiko funkcijos kreivės;
- tiriamosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindinių transformavimo produktų pusėjimo arba DT50, DT75 ir DT90 vertė su pasikliovimo rėžiais;
- abiotinio skilimo steriliomis sąlygomis greičio įvertinimas (rezultatai);
- tiriamosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindinių transformavimo produktų transformavimo kinetikos įvertinimas;
- pasiūlyti transformavimo keliai, jei reikia;
- rezultatų aptarimas ir interpretavimas;
- neapdoroti duomenys (t. y. mėginių chromatogramos, mėginių transformavimo greičių apskaičiavimai ir transformavimo produktams identifikuoti naudotos priemonės).
LAND 76-2005 „Aerobinis ir anaerobinis
transformavimas dirvožemyje (C.23)“
1 priedas
VANDENS ĮTEMPTIS (HIDRAULINIS POTENCIALAS), LAUKO DRĖGMĖS IMLUMAS (FC) IR VANDENS SULAIKYMO GEBA (WHC)([8])
| Vandens stulpelio aukštis [cm] |
pF(a) |
bar(b) |
|
Pastabos |
| 107 |
7 |
104 |
|
Sausas dirvožemis |
| 1,6 ×·104 |
4,2 |
16 |
|
Augalų vytimo drėgmės vertė |
| 104 |
4 |
10 |
|
|
| 103 |
3 |
1 |
|
|
| 6·× 102 |
2,8 |
0,6 |
|
|
| 3,3 × 102 |
2,5 |
0,33(c) |
|
|
| 102 |
2 |
0,1 |
|
|
| 60 |
1,8 |
0,06 |
|
Lauko drėgmės imlumo intervalas(d) |
| 33 |
1,5 |
0,033 |
|
|
| 10 |
1 |
0,01 |
|
WHC (apytikrė vertė) |
| 1 |
0 |
0,001 |
|
Vandeniu prisotintas dirvožemis |
| (a) pF = vandens stulpelio aukščio, išreikšto cm, logaritmas. (b) 1 bar = 105 Pa. (c) Atitinka apytikrį vandens kiekį 10 % smėlyje, 35 % priemolyje ir 45 % molyje. (d) Lauko drėgmės imlumas nėra pastovus dydis, bet atsižvelgiant į dirvožemio tipą kinta nuo F 1,5 iki 2,5. |
||||
Vandens įtemptis matuojama vandens stulpelio aukščio cm arba bar. Dėl didelio siurbimo įtempties intervalo ji išreiškiama tiesiog kaip pF vertė, kuri atitinka vandens stulpelio aukščio, išreikšto cm, logaritmą.
Lauko drėgmės imlumas apibrėžiamas kaip vandens kiekis, kurį, veikiant vandens sunkio jėgai, gali sulaikyti natūralus dirvožemis 2 paras po ilgesnio lietaus laikotarpio arba po pakankamo drėkinimo. Jis nustatomas nepaliestam dirvožemiui in situ, lauke. Taigi matavimas netinka paliesto dirvožemio laboratoriniams mėginiams. FC vertės, nustatytos paliestam dirvožemiui, gali turėti didelius sisteminguosius nuokrypius.
Vandens sulaikymo geba (WHC) nustatoma laboratorijoje nepaliestam ir paliestam dirvožemiui, dirvožemį kolonėlėje sotinant kapiliarais kylančiu vandeniu. Ji yra ypač naudinga apibrėžiant paliestą dirvožemį ir gali būti iki 30 % didesnė už lauko drėgmės imlumą (1). Be to, ją tyrimo keliu lengviau nustatyti nei patikimas FC vertes.
______________
LAND 76-2005 „Aerobinis ir anaerobinis
transformavimas dirvožemyje (C.23)“
2 priedas
DRĖGMĖS KIEKIS (g vandens 100 g sauso dirvožemio) ĮVAIRIŲ ŠALIŲ
ĮVAIRIŲ TIPŲ DIRVOŽEMYJE
| Dirvožemio tipas |
Šalis |
Drėgmės kiekis, kai |
||
| WHC (1) |
pF = 1,8 |
pF = 2,5 |
||
| Smėlis |
Vokietija |
28,7 |
8,8 |
3,9 |
| Rišlus smėlis |
Vokietija |
50,4 |
17,9 |
12,1 |
| Rišlus smėlis |
Šveicarija |
44,0 |
35,3 |
9,2 |
| Rudasis priemolis |
Šveicarija |
72,8 |
56,6 |
28,4 |
| Priemolis |
Brazilija |
69,7 |
38,4 |
27,3 |
| Priemolis |
Japonija |
74,4 |
57,8 |
31,4 |
| Priesmėlis |
Japonija |
82,4 |
59,2 |
36,0 |
| Rudasis priemolis |
JAV |
47,2 |
33,2 |
18,8 |
| Priesmėlis |
JAV |
40,4 |
25,2 |
13,3 |
| (1) Vandens sulaikymo geba (Water Holding Capacity) |
||||
______________
LAND 76-2005 „Aerobinis ir anaerobinis
transformavimas dirvožemyje (C.23)“
3 priedas
1 paveikslas
Pratekėjimo aparato cheminių medžiagų transformavimui dirvožemyje tirti pavyzdys (1)(2)
| 1: |
adatinis vožtuvas; |
| 2: |
dujų plovimo butelis su vandeniu; |
| 3: |
ultrafiltravimo membrana (tik steriliom sąlygom sudaryti), akučių dydis 0,2 μm; |
| 4: |
medžiagų apykaitos dirvožemyje kolba (vandens įpilama tik anaerobinių ir ryžių lauko dirvožemio sąlygoms sudaryti); |
| 5: |
lakių organinių junginių gaudyklė, užpildyta etilenglikoliu; |
| 6: |
lakių šarminių junginių gaudyklė, užpildyta sieros rūgštimi; |
| 7, 8: |
CO2 ir kitų rūgštinių medžiagų gaudyklė, užpildyta natrio šarmu; |
| 9: |
dujų srauto matuoklis (srautmatis) |
|
|
|
Biometrinio tipo kolbos cheminių medžiagų transformavimui dirvožemyje tirti pavyzdys (3)
|
|
Natrio kalkės CO2 sugerti |
| Alyva apdorota stiklo vata arba poliuretano putplastis lakioms organinėms medžiagoms sugerti |
|
|
Dirvožemio ir tiriamosios medžiaga mišinys |
1) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.
2) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.
LAND 76-2005 „Aerobinis ir anaerobinis
transformavimas dirvožemyje (C.23)“
4 priedas
BIBLIOGRAFIJA
1) US-Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.
3) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex II, Part A and Annex III, Part A: Fate and Behaviour in the Environment.
4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.
6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality – Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: Aerobic conditions.
7) ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.
9) MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).
10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J.Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.
13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).
15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.
18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26: 305 (1962).
19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221.
25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.
26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Tailor & Francis, 45-60,
27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and bio- transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105-120,
28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).
29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).
30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of etilene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197-200,
31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.
33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In „Environmental Dynamics of Pesticides“. R. Haque and V.H. Freed, Eds., 135-172.
34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 39, 188-204.
35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 47-60,
36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos aplinkos ministro
2005 m. spalio 3 d. įsakymu Nr. D1-478
LAND 77-2005 „AEROBINIS IR ANAEROBINIS TRANSFORMAVIMAS VANDENS TELKINIŲ DUGNO NUOSĖDŲ SISTEMOSE (C.24)“
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Cheminės medžiagos gali patekti į negilius arba gilius paviršinius vandenis, pvz., šiais būdais: tiesioginis pridėjimas, purškiamų medžiagų sklaida, nuotėkis, drenažas, atliekų šalinimas, pramoninės, buitinės arba žemės ūkio nuotekos ir pasklidimai iš atmosferos. Šiame tyrimų metode aprašytas metodas skirtas įvertinti organinių cheminių medžiagų aerobinį ir anaerobinį transformavimą vandens telkinių dugno nuosėdų sistemose. Jis yra pagrįstas turimomis rekomendacijomis (1)(2)(3)(4)(5)(6). Belgirate, Italijoje, 1995 m. vykusiame Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacijos (OECD – Organization for Economic Cooperation and Development) seminare dėl dirvožemių ir nuosėdų atrankos (7) buvo susitarta dėl šiame tyrime naudojamų dirvožemių skaičiaus ir tipų. Dirvožemio mėginių ėmimo, tvarkymo ir laikymo rekomendacijos pagrįstos ISO vadovu (8) ir Belgirate vykusio seminaro rekomendacijomis. Tokie tyrimai skirti cheminėms medžiagoms, kurios tiesiogiai dedamos į vandenį arba kurios gali pasiekti vandeninę aplinką pirmiau aprašytais būdais.
Gamtinių vandens telkinių dugno nuosėdų sistemų sąlygos dažnai yra aerobinės viršutinėje vandeninėje fazėje. Nuosėdų paviršiniame sluoksnyje sąlygos gali būti aerobinės arba anaerobinės, kai giliau esančiose nuosėdose jos paprastai yra anaerobinės. Siekiant aprėpti visus šiuos atvejus, šiame dokumente aprašyti aerobiniai ir anaerobiniai tyrimai. Atliekant aerobinį tyrimą, modeliuojamas aerobinio vandens stulpas virš aerobinių nuosėdų, po kuriomis yra sluoksnis su anaerobinių sąlygų gradientu. Atliekant anaerobinį tyrimą, modeliuojama anaerobinė vandens ir nuosėdų sistema. Jei aplinkybės rodo, kad būtina nukrypti nuo šių rekomendacijų, pvz., naudojant nepaliestų nuosėdų kernus arba nuosėdas, kurios galėjo būti veikiamos tiriamąja medžiaga, šiam tikslui yra skirti kiti metodai (9).
II. NUORODOS
III. APIBRĖŽIMAI
Visais atvejais turi būti naudojami tarptautinės vienetų sistemos (SI) vienetai.
3. Tiriamoji medžiaga – bet kuri medžiaga, ar tai būtų pradinis junginys, ar susiję su tiriamuoju dalyku jos transformavimo produktai.
4. Transformavimo produktai – visos medžiagos, susidariusios įvykus tiriamosios medžiagos biotinio transformavimo arba abiotinių virsmų reakcijoms, įskaitant CO2 ir surištuosiuos likučius.
5. Surištieji likučiai – sąvoka „surištieji likučiai“ reiškia dirvožemyje, augale arba gyvūne esančius junginius, kurie po ekstrahavimo lieka matricoje pradinės medžiagos arba jos metabolito, metabolitų bei transformavimo produktų pavidalu. Ekstrahavimo metodas turi iš esmės nepakeisti pačių junginių ar matricos struktūros. Ryšio prigimtį galima iš dalies išaiškinti naudojant matricą keičiančius ekstrahavimo metodus ir sudėtingus analizės metodus. Pvz., tokiu būdu iki šiol buvo identifikuotos kovalentinės, joninės ir sorbcinio tipo jungtys, be to, pagautieji junginiai. Apskritai surištųjų likučių susidarymas labai sumažina biologinį įsisavinamumą ir biologinį prieinamumą (10) [modifikuotas IUPAC 1984 (11) apibrėžimas].
6. Aerobinis transformavimas (oksidavimas) – reakcijos, vykstančios esant molekuliniam deguoniui (12).
9. Nuosėdos – mineralinių ir organinių komponentų mišinys, kurio organinius komponentus sudaro didelės molekulinės masės junginiai, turintys didelį anglies ir azoto kiekį. Jas nusodina gamtinis vanduo, su kuriuo nuosėdos sudaro sąlyčio paviršių.
10. Mineralizacija – visiškas organinio junginio suskaidymas į CO2 ir H2O aerobinėmis sąlygomis, ir į CH4, CO2 ir H2O anaerobinėmis sąlygomis. Šio tyrimo metodo kontekste, naudojant žymėtą junginį, mineralizacija suprantama kaip didelio laipsnio molekulės suskaidymas, kurio metu žymėtasis anglies atomas kiekybiškai oksiduojamas arba redukuojamas, susidarant atitinkamam 14CO2 arba 14CH4 kiekiui.
11. Pusėjimo trukmė – t0,5, laikas, sugaištas transformuoti 50 % tiriamosios medžiagos, kai transformavimą galima aprašyti pirmojo laipsnio kinetikos lygtimis; ji nepriklauso nuo pradinės koncentracijos.
IV. ETALONINĖS MEDŽIAGOS
V. INFORMACIJA APIE TIRIAMĄJĄ MEDŽIAGĄ
16. Transformavimo greičiui matuoti gali būti naudojama nežymėtų arba žymėtų atomų turinti tiriamoji medžiaga, bet geriau naudoti žymėtą medžiagą. Žymėta medžiaga reikalinga transformavimo keliui tirti ir masių balansui nustatyti. Rekomenduojama žymėti 14C, bet gali būti naudojami kiti izotopai, pvz., 13C, 15N, 3H, 32P. Kiek tai įmanoma, žymė turi būti patvariausioje arba keliose patvariausiose dalyse ([9]). Tiriamosios medžiagos cheminis ir/arba radiocheminis grynumas turi būti ne mažesnis kaip 95 %.
17. Prieš pradedant tyrimą, turi būti gauta tokia informacija apie tiriamąją medžiagą:
17.7. disociacijos konstanta (pKa), [OECD 112 nurodymas] (13).
Pastaba. Ataskaitoje turi būti nurodyta matavimų temperatūra.
Kitą naudingą informaciją gali sudaryti duomenys apie tiriamosios medžiagos toksiškumą mikroorganizmams, duomenys apie lengvą ir/arba būdingąjį biologinį skaidomumą, duomenys apie aerobinį arba anaerobinį transformavimą dirvožemyje.
Reikia turėti analizės metodus (įskaitant ekstrahavimo ir gryninimo metodus) tiriamajai medžiagai ir jos transformavimo vandenyje bei nuosėdose produktams kiekybiškai nustatyti ir identifikuoti (žr. 22 punktą).
VI. PRINCIPAS
18. Šiame tyrimų metode naudojama aerobinė ir anaerobinė vandeninių nuosėdų (žr. 1 priedą) sistema, kurioje galima:
18.3. matuoti tiriamosios medžiagos ir/arba transformavimo produktų mineralizacijos greitį (kai naudojama 14C žymėta tiriamoji medžiaga);
18.4. identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti transformavimo vandeninėje ir nuosėdų fazėse produktus, įskaitant masių balansą (kai naudojama žymėta tiriamoji medžiaga);
18.5. matuoti tiriamosios medžiagos ir jos transformavimo produktų pasiskirstymą tarp dviejų fazių inkubavimo tamsoje laikotarpiu (siekiant išvengti, pvz., dumblių žydėjimo), esant pastoviai temperatūrai. Nustatomos pusėjimo trukmės, DT50, DT75 ir DT90 vertė, kai tai leidžia atlikti turimi duomenys, bet jų nereikėtų ekstrapoliuoti gerokai ilgesnei nei tyrimo laikotarpis trukmei (žr. 1.2 punktą).
19. Aerobiniams ir anaerobiniams tyrimams atlikti reikia turėti ne mažiau kaip dviejų tipų nuosėdas ir jas atitinkančias vandenines fazes (7). Tačiau gali pasitaikyti atvejų, kai reikia naudoti daugiau kaip dviejų tipų vandenines nuosėdas, pvz., norint tirti cheminę medžiagą, kuri gali būti gėlame ir/arba jūros vandenyje.
VII. TYRIMO TINKAMUMAS
20. Metodas iš esmės tinka visoms cheminėms medžiagoms (nežymėtoms arba žymėtoms), kurioms nustatyti yra sukurtas pakankamo tikslumo ir jautrio analizės metodas. Jis tinka mažai lakiems, nelakiems, vandenyje tirpiems arba netirpiems junginiams. Tyrimas neturi būti taikomas cheminėms medžiagoms, kurios labai greit išgaruoja iš vandens (pvz., fumigantai, organiniai tirpikliai) ir todėl negali būti laikomos vandenyje ir/arba nuosėdose šio tyrimo sąlygomis.
Iki šiol metodas buvo taikomas cheminių medžiagų transformavimui gėlame vandenyje ir nuosėdose tirti, bet iš esmės jį taip pat galima taikyti upių žiočių ir jūros sistemoms. Jis netinka tekančio vandens (pvz., upių) arba atvirosios jūros sąlygoms modeliuoti.
VIII. KOKYBĖS KRITERIJAI
21. Išgavimo laipsnis
Ne mažiau kaip dviejų kartotinių vandens ir nuosėdų mėginių ekstrahavimas ir analizė iškart po tiriamosios medžiagos pridėjimo yra pirmasis analizės metodo pakartojamumo ir tiriamosios medžiagos įterpimo procedūros tolygumo rodiklis. Vėlesnių tyrimo stadijų išgavimo laipsniai gaunami matuojant atitinkamų masės verčių balansą (kai naudojama žymėtoji medžiaga). Žymėtų cheminių medžiagų išgavimo laipsniai turi būti nuo 90 % iki 110 % (6), nežymėtų cheminių medžiagų – nuo 70 % iki 110 %.
22. Analizės metodo pakartojamumas ir jautris
Tiriamosios medžiagos ir transformavimo produktų kiekybinės analizės metodo pakartojamumas (išskyrus pradinį ekstrahavimo efektyvumą) gali būti patikrintas atliekant pakartotinę to paties vandens arba nuosėdų mėginių, inkubuotų pakankamai ilgai, kad galėtų susidaryti transformavimo produktai, ekstrakto analizę.
Tiriamosios medžiagos ir transformavimo produktų analizės metodo aptikimo riba (LOD) turi būti bent 0,01 mg × kg-1 vandens arba nuosėdų (kaip tiriamosios medžiagos) arba 1 % į tyrimo sistemą įterpiamos pradinės dozės, imant mažesniąją vertę. Turi būti apibrėžta kiekybinio nustatymo riba (LOQ).
23. Transformavimo duomenų tikslumas
Atliekant tiriamosios medžiagos koncentracijos verčių kaip laiko funkcijos regresinę analizę, gaunama atitinkama informacija apie transformavimo kreivės patikimumą ir leidžia apskaičiuoti pusėjimo trukmės verčių pasikliovimo rėžius (jei reakcija atitinka pseudopirmojo laipsnio kinetikos lygtis) arba DT50 vertes ir, jei tinka, DT75 ir DT90 vertes.
IX. TYRIMO EIGA
24. Tyrimo sistema ir aparatūra
Tyrimas turi būti atliekamas naudojant stiklinius indus (pvz., butelius, centrifugavimo mėgintuvėlius), išskyrus kai išankstinė informacija (pvz., pasiskirstymo koeficientas tarp n-oktanolio ir vandens, sorbcijos duomenys ir t. t.) rodo, kad tiriamoji medžiaga gali sukibti su stiklu; šiam atvejui reikėtų numatyti pakaitinę medžiagą (pvz., tefloną). Jei žinoma, kad tiriamoji medžiaga gali sukibti su stiklu, šią problemą būtų galima iš dalies sumažinti, taikant vieną iš šių metodų:
- nustatyti stiklu sorbuotos tiriamosios medžiagos ir transformavimo produktų masę;
- užtikrinti, kad baigus tyrimą visi stikliniai indai būtų plaunami tirpikliu;
- naudoti produktų preparatus (žr. 28.2 punktą);
- naudoti padidintą antrojo tirpiklio kiekį tiriamajai medžiagai į sistemą įdėti; jei naudojamas antrasis tirpiklis, jame neturi vykti tiriamosios medžiagos solvolizė.
Tyrimo aparatūros pavyzdžiai, tokie kaip dujų pratekėjimo ir biometrinio tipo sistemos, pavaizduotos 2 ir 3 prieduose (14). Kitos tyrimui atlikti tinkamos inkubavimo sistemos aprašytos 15 nuorodoje. Tyrimo aparatūros konstrukcija turi užtikrinti oro ir azoto mainų, ir lakių produktų surinkimo sąlygas. Aparatūros matmenys turi atitikti tyrimo reikalavimus (žr. 28.1 punktą). Ventiliaciją galima užtikrinti nestipriai barbotuojant orą arba azotą, arba juos leidžiant virš vandens paviršiaus. Pastaruoju atveju patariama nestipriai maišyti viršutinį vandens sluoksnį, kad deguonis ir azotas geriau pasklistų vandenyje. Neturi būti naudojamas CO2 neturintis oras, kadangi dėl to gali padidėti vandens pH vertė. Bet kuriuo atveju drumsti nuosėdas nepageidautina ir to turi būti kiek įmanoma išvengta. Mažai lakios cheminės medžiagos turi būti tiriamos biometrinio tipo sistemoje, nestipriai maišant vandens paviršinį sluoksnį. Be to, galima naudoti uždarus indus su atmosferiniu oru arba azotu užpildyta laisvąja erdve ir buteliukus viduje lakiems produktams surinkti (16). Atliekant aerobinį tyrimą biomasės suvartotam deguoniui kompensuoti, reikia reguliariai keisti laisvoje erdvėje esančias dujas.
Tinkamos priemonės lakiems transformavimo produktams surinkti, kurių gali būti ir daugiau, yra:
- 1 mol × dm-3 kalio arba natrio hidroksido tirpalas anglies dioksidui sugerti([10]) ir etilenglikolis, etanolaminas arba 2 % parafino ksilene tirpalas organiniams junginiams sugerti;
- anaerobinėmis sąlygomis susidariusius lakiuosius produktus, pvz., metaną, galima rinkti, pvz., molekuliniais sietais. Tokie lakūs produktai gali būti sudeginti, pvz., iki CO2, leidžiant dujas CuO užpildytu kvarciniu vamzdeliu, kaitinamu iki 900° C temperatūros, o susidariusį CO2 sugerti absorberyje šarmo tirpalu (17);
- reikia turėti laboratorinius tiriamosios medžiagos ir transformavimo produktų analizės prietaisus (pvz., dujų ir skysčių chromatografijos (GLC), didelio efektyvumo skysčių chromatografijos (HPLC), plonasluoksnės chromatografijos (TLC), masių spektroskopijos (MS), dujų chromatografijos-masių spektroskopijos (GC-MS), skysčių chromatografijos-masių spektroskopijos (LC-MS), magnetinio branduolių rezonanso (MBR) ir t. t. įrangą), atitinkamas detektavimo sistemas žymėtoms arba nežymėtoms medžiagoms analizuoti. Be to, reikia turėti skysčių scintiliacinį skaitiklį ir oksidacinio sudeginimo aparatūrą (nuosėdų mėginiams sudeginti prieš atliekant radioaktyvumo analizę) žymėtoms medžiagoms analizuoti.
Būtina turėti kitą standartinę laboratorinę įrangą fizinei, cheminei ir biologinei analizei atlikti (žr. 25.2 punkto lentelę), stiklinius indus, atitinkamas chemines medžiagas ir reagentus.
25. Vandens telkinių dugno nuosėdų mėginių atranka ir skaičius
Kiekvienu atveju mėginių ėmimo vietos parenkamos atsižvelgiant į tyrimo tikslą. Pasirenkant mėginių ėmimo vietas, turi būti atsižvelgta į galimo žemės ūkio, pramonės arba buitinių nuotekų patekimo į vandens baseiną ir į prieš srovę esančius vandens šaltinius istoriją. Nuosėdos neturi būti naudojamos, jei per ankstesnius 4 metus jos buvo teršiamos tiriamąja medžiaga arba jos struktūriniais analogais.
25.1. Nuosėdų atranka
Aerobiniams tyrimams atlikti paprastai naudojamos dviejų rūšių nuosėdos (7). Pasirinktos dviejų rūšių nuosėdos turi skirtis organinės anglies kiekiu ir tekstūra. Vienos rūšies nuosėdos turi turėti didelį organinės anglies kiekį (2,5-7,5 %) ir smulkią tekstūrą, kitos rūšies nuosėdos turi turėti mažą organinės anglies kiekį (0,5-2,5 %) ir stambią tekstūrą. Organinės anglies kiekio skirtumas paprastai turi būti ne mažesnis kaip 2 %. „Smulki tekstūra“ apibrėžiama kaip turinti [molio + dumblo]([11]) kiekį > 50 %, o „stambi tekstūra“ apibrėžiama kaip turinti [molio + dumblo] kiekį < 50 %. Dviejų rūšių nuosėdų [molio + dumblo] kiekio skirtumas paprastai turi būti ne mažesnis kaip 20 %. Tais atvejais, kai cheminė medžiaga gali pasiekti jūros vandenį, bent viena iš vandens ir dumblo sistemų turi būti jūrinės kilmės.
Norint atlikti griežtai anaerobinį tyrimą, dviejų rūšių nuosėdos (įskaitant virš jų esantį vandenį) turi būti imamos iš anaerobinių paviršinio vandens tūrio zonų (7). Nuosėdos ir virš jų esančios vandeninės fazės turi būti tvarkomos ir vežamos atsargiai, apsaugant nuo deguonies patekimo.
Parenkant nuosėdas gali būti svarbūs ir kiti parametrai, į kuriuos turi būti atsižvelgta kiekvienu konkrečiu atveju. Pvz., nuosėdų pH verčių intervalas turėtų būti svarbus tiriant chemines medžiagas, kurių transformavimas ir/arba sorbcija gali priklausyti nuo pH vertės. Sorbcijos priklausomybę nuo pH vertės gali rodyti tiriamosios medžiagos pKa vertė.
25.2. Vandens ir nuosėdų mėginių apibūdinimas
Pagrindiniai vandens ir nuosėdų parametrai, kurie turi būti išmatuoti ir pateikti ataskaitoje (su taikyto metodo nuoroda), ir tyrimo stadija, kurioje šie parametrai turi būti nustatyti, yra apibendrinti pateiktoje lentelėje „Vandenį ir nuosėdas apibūdinančių parametrų matavimas“. Informacija apie šių parametrų nustatymo metodus pateikta nuorodose (18)(19)(20)(21).
Kiekvienu konkrečiu atveju gali tekti matuoti ir pateikti ataskaitoje ir kitus parametrus [pvz., gėlo vandens: daleles, šarmingumą, kietumą, laidį, NO3/PO4 (santykį ir atskiras vertes); nuosėdų: katijonų mainų talpą, vandens sulaikymo gebą, karbonatų kiekį, suminį azoto ir fosforo kiekį; jūros sistemoms: druskingumą]. Be to, gali būti naudinga nuosėdų ir vandens analizė nitratams, sulfatams, biologiškai kaupiamos geležies ir kitiems galimiems elektronų akceptoriams nustatyti įvertinant oksidacijos-redukcijos sąlygas, ypač anaerobinio transformavimo atveju.
Vandenį ir nuosėdas apibūdinančių parametrų matavimas (7)(22)(23)
| Parametras |
Tyrimo stadija |
|||||
| Mėginio ėmimas lauke |
Vėlesnis tvarkymas |
Aklimatizacijos pradžia |
Tyrimo pradžia |
Tyrimo eiga |
Tyrimo pabaiga |
|
| Vanduo |
||||||
| Kilmė ir šaltinis |
x |
|
|
|
|
|
| Temperatūra |
x |
|
|
|
|
|
| pH |
x |
|
x |
x |
x |
x |
| Bendra organinė anglis -BOA (TOC) |
|
|
x |
x |
|
x |
| O2 koncentracija* |
x |
|
x |
x |
x |
x |
| Oksidacijos-redukcijos potencialas* |
|
|
x |
x |
x |
x |
| Nuosėdos |
||||||
| Kilmė ir šaltinis |
x |
|
|
|
|
|
| Sluoksnio gylis |
x |
|
|
|
|
|
| pH |
|
x |
x |
x |
x |
x |
| Dalelių dydžio skirstinys |
|
x |
|
|
|
|
| BOA (TOC) |
|
x |
x |
x |
|
x |
| Mikrobinė biomasė** |
|
x |
|
x |
|
x |
| Oksidacijos-redukcijos potencialas* |
stebėjimas (spalva/ |
|
x |
x |
x |
x |
* Naujų tyrimų rezultatai parodė, kad vandens deguonies ir oksidacijos-redukcijos potencialo matavimai neturi mechanizmo nustatymo ir prognozavimo vertės, kai kalbama apie mikroorganizmų populiacijos paviršiniuose vandenyse augimą ir vystymąsi (24)(25). Biocheminio deguonies suvartojimo [BDS imant mėginį lauke, tyrimo pradžioje ir pabaigoje) ir mitybinių mikroelementų ir makroelementų Ca, Mg ir Mn vandenyje nustatymas (tyrimo pradžioje ir pabaigoje) ir bendro N bei bendro P kiekio nuosėdose nustatymas (imant mėginį lauke ir tyrimo pabaigoje) gali būti geresnė priemonė aerobinio biologinio transformavimo greičiams ir keliams interpretuoti bei įvertinti.
26. Mėginių ėmimas, tvarkymas ir laikymas
26.1. Mėginių ėmimas
Imant nuosėdas, būtina vadovautis ISO vadovo projektu dėl dugno nuosėdų mėginių ėmimo (8). Nuosėdų mėginiai turi būti imami iš viso viršutinio (5-10 cm) storio nuosėdų sluoksnio. Nuosėdos ir jas atitinkantis vanduo turi būti imamas iš tos pačios vietos arba vietovės ir tuo pačiu metu, kaip ir nuosėdos. Atliekant anaerobinį tyrimą, nuosėdos ir jas atitinkantis vanduo turi būti imami, apsaugant juos nuo deguonies patekimo (28) (žr. 25.1 punktą). Kai kurie mėginių ėmimo įtaisai aprašyti nuorodose (8)(23).
26.2. Tvarkymas
Nuosėdos atskiriamos nuo vandens filtravimu ir šlapios sijojamos per 2 mm sietą, naudojant toje pat vietoje buvusio vandens perteklių, kuris vėliau išpilamas. Tuomet žinomas nuosėdų ir vandens kiekis sumaišomi norimu santykiu (žr. 28.1 punktą) inkubavimo kolbose ir ruošiamas aklimatizacijai (žr. 27 punktą). Atliekant anaerobinį tyrimą, visos ruošimo operacijos turi būti vykdomos neleidžiant patekti deguoniui (29)(30)(31)(32)(33).
26.3. Laikymas
Rekomenduojama naudoti ką tik paruoštas nuosėdas ir vandenį, tačiau, jei būtina mėginius laikyti, nuosėdos su vandeniu sijojamos, kaip pirmiau aprašyta, užpilamos vandeniu (6-10 cm) ir laikomos tamsoje ne ilgiau kaip 4 savaites, esant (4 ± 2) °C ([12]) temperatūrai (7)(8)(23). Mėginiai, skirti aerobiniams tyrimams, turi būti laikomi leidžiant laisvai patekti orui (pvz., atviruose induose), mėginiai, skirti anaerobiniams tyrimams atlikti, laikomi neleidžiant patekti deguoniui. Nuosėdos su vandeniu neturi užšalti arba išdžiūti.
27. Nuosėdų ir vandens mėginių ruošimas tyrimui
Prieš pridedant tiriamosios medžiagos, turi būti aklimatizacijos laikotarpis. Kiekvienas nuosėdų ir vandens mėginys supilamas į pagrindiniame tyrime naudojamą inkubavimo indą ir aklimatizuojamas esant tiksliai tokioms pačioms kaip ir inkubavimo sąlygoms (žr. 28.1 punktą). Aklimatizacijos laikotarpis būtinas reikiamam sistemos stabilumui pasiekti, kurį rodo pH vertė, deguonies koncentracija vandenyje, nuosėdų ir vandens oksidacijos-redukcijos potencialas ir makroskopinis fazių atsiskyrimas. Paprastai aklimatizacijos laikotarpis turi trukti nuo vienos iki dviejų savaičių, bet neturi būti ilgesnis kaip keturios savaitės. Ataskaitoje turi būti pateikti šiuo laikotarpiu atliekamų matavimų rezultatai.
28. Procedūra
28.1. Tyrimo sąlygos
Tyrimas turi būti atliekamas inkubavimo aparate (žr. 24 punktą), esant vandens ir nuosėdų tūrio santykiui nuo 3 : 1 iki 4 : 1, ir 2,5 cm (± 0,5 cm) nuosėdų sluoksnio storiui. Rekomenduojama naudoti ne mažiau kaip 50 g nuosėdų (skaičiuojant sausai medžiagai) vienam inkubavimo indui.
Bandymas turi būti atliekamas tamsoje esant pastoviai (10-30) °C temperatūrai. Tikslinga naudoti (20±2) °C temperatūrą. Prireikus kiekvienam konkrečiam atvejui galima numatyti papildomą mažesnę temperatūrą (pvz., 10 °C), atsižvelgiant į informaciją, kurią turi suteikti tyrimas. Inkubavimo temperatūra turi būti kontroliuojama ir pateikiama ataskaitoje.
28.2. Tiriamosios medžiagos apdorojimas ir įdėjimas
Naudojama viena cheminės medžiagos tyrimo koncentracija ([13]). Augalų apsaugai skirtoms cheminėms medžiagoms, kurios tiesiogiai pilamos į vandens telkinius, didžiausia etiketėje nurodyta dozavimo koncentracija turi būti laikoma didžiausia taikoma norma, apskaičiuojama pagal tyrimo indo vandens paviršiaus plotą. Visais kitais atvejais naudojama koncentracija turi būti pagrįsta aplinkoje pasklindančio kiekio vertėmis. Būtina užtikrinti, kad būtų naudojama tinkama tiriamosios medžiagos koncentracija, siekiant apibūdinti transformavimo kelią ir transformavimo produktų susidarymą ir išnykimą. Tais atvejais, jei tiriamosios medžiagos koncentracijos vertės tyrimo pradžioje yra arti aptikimo ribos ir/arba jei pagrindiniai transformavimo produktai negali būti lengvai rasti, kai jie sudaro 10 % tiriamosios medžiagos įdėjimo normos, gali tekti naudoti didesnes dozes (pvz., 10 kartų). Tačiau, jei naudojamos didesnės tyrimo koncentracijos, medžiaga neturi daryti reikšmingo neigiamo poveikio vandens ir nuosėdų sistemos mikroorganizmų aktyvumui. Siekiant gauti pastovią tiriamosios medžiagos koncentraciją skirtingų matmenų induose, gali būti naudinga reguliuoti įdedamos medžiagos kiekį pagal vandens sluoksnio gylį inde ir jo gylį lauko sąlygomis (laikant, kad jis yra lygus 100 cm, bet galima naudoti ir kitas gylio vertes). Apskaičiavimo pavyzdys pateiktas 4 priede.
Geriausia tiriamąją medžiagą pilti į tyrimo sistemos vandeninę fazę kaip vandeninį tirpalą. Jei kitaip neįmanoma, tiriamajai medžiagai įpilti ir paskirstyti leidžiama naudoti nedidelius kiekius su vandeniu maišių tirpiklių (pvz., acetono, etanolio), tačiau jie neturi sudaryti daugiau kaip 1 % V/V ir neturi neigiamai veikti tyrimo sistemos mikroorganizmų aktyvumo. Reikia kruopščiai ruošti tiriamosios medžiagos vandeninius tirpalus, vienalytiškumui užtikrinti gali būti naudinga naudoti generavimo kolonėles ir išankstinį maišymą. Vandeninį tirpalą įpylus į tyrimo sistemą, rekomenduojama nestipriai maišyti vandeninę fazę, stengiantis kiek įmanoma mažiau liesti nuosėdas.
Paprastai nerekomenduojama naudoti preparatų, nes jų ingredientai gali veikti tiriamosios medžiagos ir/arba transformavimo produktų pasiskirstymą tarp vandens ir nuosėdų fazių. Tačiau, jei tiriamoji medžiaga yra mažai tirpi vandenyje, preparatas gali būti tinkamas pasirinkimas.
Inkubavimo indų skaičius priklauso nuo mėginių ėmimo kartų skaičiaus (žr. 28.3 punktą). Turi būti naudojamas pakankamas tyrimo sistemų skaičius, kad kiekvieną kartą imant mėginį būtų galima paaukoti dvi sistemas. Jei naudojami kiekvienos vandens ir nuosėdų sistemos kontroliniai mėginiai, jie neturi būti apdorojami tiriamąja medžiaga. Kontroliniai mėginiai gali būti naudojami nuosėdų mikrobinei biomasei ir vandens bei nuosėdų bendros organinės anglies kiekiui nustatyti tyrimo pabaigoje. Du iš kontrolinių mėginių (t. y. po vieną kontrolinį mėginį kiekvienoms vandeninėms nuosėdoms) gali būti naudojami reikiamiems nuosėdų ir vandens parametrams kontroliuoti aklimatizacijos laikotarpiu (žr. 25.2 punkto lentelę). Du papildomi kontroliniai mėginiai turi būti įtraukti tuo atveju, kai tiriamoji medžiaga pridedama naudojant tirpiklį, kad būtų galima matuoti jo neigiamą poveikį tyrimo sistemos mikroorganizmų aktyvumui.
28.3. Tyrimo trukmė ir mėginių ėmimas
Tyrimas paprastai neturi būti ilgesnis kaip 100 parų (6), ir turi vykti tol, kol nustatomas skilimo kelias ir pasiskirstymo tarp vandens ir nuosėdų charakteristika arba 90 % tiriamosios medžiagos išsisklaido transformavimo keliu ir/arba išgaruoja. Mėginiai turi būti imami ne mažiau kaip šešis kartus (įskaitant nulinį laiką), naudojant neprivalomą pradinį tyrimą (žr. 28.4 punktą) tinkamam mėginių ėmimo režimui ir tyrimo trukmei nustatyti, išskyrus, kai apie tiriamąją medžiagą yra pakankamas kiekis duomenų iš ankstesnių tyrimų. Jei tiriamos hidrofobinės medžiagos, pradiniu tyrimo laikotarpiu gali būti reikalingi papildomi mėginių ėmimo taškai pasiskirstymo tarp vandens ir nuosėdų fazių greičiui nustatyti.
Atitinkamu mėginio ėmimo laiku inkubavimo indai su visu turiniu (kartotiniai mėginiai) imami analizei atlikti. Nuosėdos ir virš jų esantis vanduo analizuojami atskirai([14]). Paviršinis vanduo atsargiai nupilamas, kiek įmanoma mažiau liečiant nuosėdas. Tiriamosios medžiagos ir transformavimo produktų ekstrahavimas ir apibūdinimas turi būti atliekamas taikant atitinkamas analizės metodikas. Reikia imtis priemonių pašalinti medžiagą, kuri galėjo adsorbuotis ant inkubavimo indo arba jungiamuosiuose vamzdeliuose, kurie naudojami lakioms medžiagoms surinkti.
28.4. Neprivalomas pradinis tyrimas
Jei trukmė ir mėginių ėmimo režimas negali būti įvertinti pagal ankstesnius atitinkamus tiriamosios medžiagos tyrimus, tikslinga atlikti pradinį tyrimą, kuris turi būti atliekamas tomis pačiomis sąlygomis, kurios yra numatytos galutiniam tyrimui atlikti. Ataskaitoje turi būti trumpai nurodytos išankstinio tyrimo, jei atliekamas, sąlygos ir rezultatai.
28.5. Matavimai ir analizė
Kiekvienu mėginio ėmimo laiku matuojama ir pateikiama ataskaitoje tiriamosios medžiagos ir transformavimo produktų koncentracija vandenyje ir nuosėdose (kaip koncentracijos ir įdėto kiekio procentinė dalis). Paprastai galioja taisyklė, kad transformavimo produktai, kurių randama ≥ 10 % nuo bendro vandens ir nuosėdų sistemos pradinio radioaktyvumo, turi būti identifikuoti, išskyrus, kai galima pagrįsti, kad tai neįmanoma. Be to, turi būti identifikuoti transformavimo produktai, kurių koncentracija visą tyrimo laiką didėja, netgi jei jų koncentracija nėra didesnė už pirmiau pateiktas ribines vertes, kadangi toks reiškinys gali rodyti jų išsilaikymą. Tai turi būti nagrinėjama kiekvienu konkrečiu atveju, ataskaitoje pateikiant pagrįstus paaiškinimus.
Ataskaitoje turi būti pateikti rezultatai, kiekvienu mėginio ėmimo metu gauti dujų ir lakiųjų medžiagų surinkimo sistemose (CO2 ir kiti produktai, t. y. lakūs organiniai junginiai). Turi būti pateiktos mineralizacijos greičio vertės. Kiekvienam mėginio ėmimo laikui pateikiamas neekstrahuojamų (surištųjų) likučių kiekis.
29. Duomenys
29.1. Rezultatų apdorojimas
Kiekvienam mėginio ėmimo laikui turi būti apskaičiuojamas įdėto radioaktyvumo bendras masių balansas arba išgavimo laipsnis (žr. 21 punktą). Rezultatai turi būti pateikiami kaip pridėto radioaktyvumo procentinė dalis. Ataskaitoje turi būti pateiktas radioaktyvumo pasiskirstymas tarp vandens ir nuosėdų kiekvienam mėginio ėmimo laikui, išreikštas kaip koncentracija ir kaip procentinės dalys.
Turi būti apskaičiuota tiriamosios medžiagos pusėjimo trukmė, DT50 ir, jei tinka, DT75 ir DT90, kartu nurodant pasikliovimo rėžius (žr. 23 punktą). Informaciją apie tiriamosios medžiagos pasklidimo vandenyje ir nuosėdose greitį galima gauti taikant atitinkamus įvertinimo būdus. Tai gali būti pseudopirmojo laipsnio kinetikos taikymas, empirinės geriausio kreivių atitikimo metodikos, kuriose taikomi grafinis arba skaitmeninis sprendimai, ir sudėtingesni įvertinimo būdai pagal, pvz., vieno arba kelių skyrių modelius. Daugiau detalių galima rasti atitinkamuose paskelbtuose literatūros šaltiniuose (35)(36)(37).
Visi būdai turi savo privalumus ir silpnąsias vietas ir labai skiriasi sudėtingumu. Prielaida apie pirmojo laipsnio kinetiką gali būti per didelis skilimo ir pasiskirstymo procesų supaprastinimas, tačiau, esant galimybei, gaunamas dydis (greičio konstanta arba pusėjimo trukmė), kurį lengva suprasti ir kuris yra labai naudingas, kuriant imitacinį modelį ir apskaičiuojant numatomas aplinkos koncentracijos vertes. Taikant empirinius metodus arba tiesines transformacijas, galima gauti geresnį kreivių ir duomenų atitikimą, taigi geriau įvertinti pusėjimo trukmę, DT50 ir, jei tinka, DT75 ir DT90 vertes. Tačiau gautųjų konstantų taikymas yra ribotas. Taikant modelius su skyriais, galima gauti kelias rizikos įvertinimui naudingas konstantas, kurios aprašo skilimo skirtinguose skyriuose greitį ir cheminės medžiagos pasiskirstymą. Be to, tokie modeliai turėtų būti naudojami pagrindinių transformavimo produktų susidarymo ir skilimo greičio konstantoms įvertinti. Visais atvejais pasirinktas metodas turi būti pagrįstas ir tyrėjas turi grafiškai ir/arba statistiškai parodyti gerą atitikimo kokybę.
X. BAIGIAMOSIOS NUOSTATOS
30. Tyrimų ataskaita
Tyrimų ataskaitoje turi būti ši informacija:
30.1. Tiriamoji medžiaga:
- įprastas pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, struktūrinė formulė (rodanti žymės ir žymių padėtį, jei naudojama radioaktyviais atomais žymėtoji medžiaga) ir atitinkamos fizinės ir cheminės savybės;
- tiriamosios medžiagos grynumas (priemaišos);
- radiocheminis žymėtosios cheminės medžiagos grynumas ir molinis aktyvumas (jei reikia).
30.2. Etaloninės medžiagos:
- etaloninių medžiagų, naudojamų transformavimo produktams apibūdinti ir/arba identifikuoti, cheminis pavadinimas ir struktūra.
30.3. Tyrimo nuosėdos ir vanduo:
- vandens telkinių dugno nuosėdų ėmimo vieta (-os), įskaitant, jei įmanoma, užteršimo istoriją;
- visa informacija apie vandens ir nuosėdų sistemų mėginių ėmimą, laikymą (jei taikomas) ir aklimatizavimą;
- vandens ir nuosėdų mėginių charakteristikos, išvardytos 25.2 skirsnio lentelėje.
30.4. Tyrimo sąlygos:
- naudota tyrimo sistema (pvz., pratekamoji, biometrinė, ventiliavimo būdas, maišymo būdas, vandens tūris, nuosėdų masė, vandens ir nuosėdų sluoksnių storis, tyrimo indų matmenys ir t. t.);
- tiriamosios medžiagos dėjimas į tyrimo sistemą: naudota tyrimo koncentracija, kartotinių ir kontrolinių mėginių skaičius, tiriamosios medžiagos įdėjimo būdas (pvz., tirpiklis, jei naudojamas) ir t. t.;
- inkubavimo temperatūra;
- mėginių ėmimo laikas;
- ekstrahavimo metodai ir jų efektyvumas, be to, analizės metodai ir aptikimo ribos;
- transformavimo produktų apibūdinimo ir identifikavimo metodai;
- nukrypimai bandymo metu nuo tyrimo protokolo arba tyrimo sąlygų.
30.5. Rezultatai:
- standartinių analizių neapdorotų duomenų skaičiai (visi neapdoroti duomenys turi būti saugomi archyve);
- panaudotų analizės metodų pakartojamumas ir jautris;
- išgavimo laipsnio vertės (tinkamu patvirtinto tyrimo procentinės vertės yra pateiktos 1.7.1 punkte);
- tiriamosios medžiagos ir, jei reikia, transformavimo produktų ir nesiekstrahuojančio radioaktyvumo rezultatų, išreiškiamų kaip naudotos dozės % ir mg × kg-1, gautų vandenyje, nuosėdose ir visoje sistemoje (tik %), lentelės;
- masių balansas tyrimų eigoje ir juos užbaigus;
- transformavimo vandens bei nuosėdų dalyse ir visoje sistemoje (įskaitant mineralizaciją) grafinis vaizdas;
- mineralizacijos greičio vertės;
- tiriamosios medžiagos ir, jei reikia, pagrindinių transformavimo produktų transformavimo vandenyje, nuosėdose ir visoje sistemoje pusėjimo arba DT50, ir, jei tinka DT75 ir DT90 vertės, su pasikliovimo rėžiais;
- tiriamosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindinių transformavimo produktų transformavimo kinetikos įvertinimas;
- pasiūlytas transformavimo kelias, jei reikia;
- rezultatų aptarimas.
______________
LAND 77-2005 „Aerobinis ir anaerobinis
transformavimas vandens telkinių dugno
nuosėdų sistemose (C.24)“
1 priedas
NURODYMAI DĖL AEROBINIŲ IR ANAEROBINIŲ TYRIMO SISTEMŲ
Aerobinė tyrimo sistema
Šiame tyrimo metode aprašytą aerobinę tyrimo sistemą sudaro aerobinis vandens sluoksnis (standartinis deguonies koncentracijos verčių intervalas nuo 7 iki 10 mg× l-1) ir nuosėdų sluoksnis, aerobinis paviršiuje ir anaerobinis giliau po paviršiniu sluoksniu (standartinės vidutinės oksidacijos-redukcijos potencialo (Eh) vertės anaerobinėje nuosėdų zonoje yra nuo minus 80 iki minus 190 mV). Drėgnas oras leidžiamas virš vandens paviršiaus kiekviename inkubavimo įrenginyje pakankamam deguonies kiekiui erdvėje virš skysčio užtikrinti.
Anaerobinė tyrimo sistema
Tyrimo, naudojant anaerobinę tyrimo sistemą, procedūra iš esmės atitinka metodiką, aprašytą aerobinei sistemai, išskyrus tai, kad kiekviename inkubavimo įrenginyje virš vandens paviršiaus leidžiamas drėgnas azotas pakankamam azoto kiekiui erdvėje virš skysčio užtikrinti. Nuosėdos ir vanduo laikomi anaerobiniais, kai oksidacijos-redukcijos potencialas (Eh) yra mažesnis kaip minus 100 mV.
Atliekant anaerobinį tyrimą, mineralizacija įvertinima pagal išsiskyrusio anglies dioksido bei metano kiekio matavimus.
______________
LAND 77-2005 „Aerobinis ir anaerobinis
transformavimas vandens telkinių dugno
nuosėdų sistemose (C.24)“
2 priedas
DUJŲ PRATEKĖJIMO METODĄ TAIKANČIOS APARATŪROS PAVYZDYS
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Apsauginė gaudyklė, tuščia 1 gaudyklė: etilenglikolis lakiems organiniams produktams sugerti 2 gaudyklė: 0,1 mol/l sieros rūgštis šarminiams lakiems produktams sugerti 3 ir 4 gaudyklės: 2 mol/l natrio hidroksidas CO2 ir kitiems rūgštiniams lakiems produktams sugerti |
|
|
|
______________
LAND 77-2005 „Aerobinis ir anaerobinis
transformavimas vandens telkinių dugno
nuosėdų sistemose (C.24)“
3 priedas
BIOMETRINĖS APARATŪROS PAVYZDYS
|
|
CO2 ir lakiųjų organinių junginių sugėrimo sistema (pralaidi deguoniui) |
| CO2 ekstrahavimo įtaisas |
|
| Anga deguoniui vandenyje analizuoti |
|
| Anga dujoms analizuoti (uždaryta membrana) |
|
| Maišytuvas |
|
| Vanduo |
|
| Nuosėdos |
|
|
|
______________
LAND 77-2005 „Aerobinis ir anaerobinis
transformavimas vandens telkinių dugno
nuosėdų sistemose (C.24)“
4 priedas
Į TYRIMO INDUS DEDAMOS DOZĖS APSKAIČIAVIMO PAVYZDYS
| Cilindro vidinis skersmuo: |
= 8 cm |
| Vandens stulpelio gylis, išskyrus nuosėdas: |
= 12 cm |
| Paviršiaus plotas: 3,142 × 42 |
= 50,3 cm2 |
| Įterpimo norma: 500 g tiriamosios medžiagos/ha atitinka 5 µg/cm2 |
|
| Bendras kiekis, µg: 5 × 50,3 |
= 251,5 µg |
| Nustatykite kiekį pagal 100 cm stulpelio gylį: 12 × 251,5 : 100 |
= 30,18 µg |
| Vandens stulpelio tūris: 50,3 × 12 |
= 603 ml |
| Koncentracija vandenyje: 30,18 : 603 |
= 0,050 µg/ml arba |
______________
LAND 77-2005. „Aerobinis ir anaerobinis
transformavimas vandens telkinių dugno
nuosėdų sistemose (C.24)“
5 priedas
BIBLIOGRAFIJA
1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.
2) Commission for registration of pesticides: Application for registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.
3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United-Kingdom.
4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada. pp 35-37.
5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism.
6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.
7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality – Sampling – Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments.
9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080.
11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).
13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149-158.
15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.
16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on degradation of policyclic aromatic hidrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631-637.
17) Steber,J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol etoksilates. Studies with 14C-labelled model surfactants. Water Research 21, 661-667.
18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.
19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (17th edition). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chemistry 44, 1038- 1039.
22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests', 3-4 July 1991.
23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858-2868.
25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329-338.
26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203.
27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation- extraction method.
28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chlorform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hidrobiol. Bull. 24 (1), 13-21.
29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857.
30) Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U., Steber,J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550,
31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegradation tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499-1509.
32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597-3603.
33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090.
34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961-968.
35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, 187-203.
36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47-60,