LIETUVOS RESPUBLIKOS APLINKOS MINISTRAS

Į S A K Y M A S

DĖL LIETUVOS APLINKOS APSAUGOS NORMATYVINIO DOKUMENTO LAND 69-2005 PATVIRTINIMO

2005 m. gruodžio 28 d. Nr. D1-648

Vilnius

Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos aplinkos monitoringo įstatymo (Žin., 1997, Nr. 112-2824) 6 straipsniu, Lietuvos Respublikos aplinkos ministerijos nuostatų, patvirtintų Lietuvos Respublikos Vyriausybės 1998 m. rugsėjo 22 d. nutarimu Nr. 1138 (Žin., 1998, Nr. 84-2353; 2002, Nr. 20-766), 6.8 punktu,

1. Tvirtinu Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos normatyvinį dokumentą LAND 69-2005 „Vandens kokybė. Biocheminių parametrų matavimas. Spektrometrinis chlorofilo „a“ koncentracijos nustatymas“ (pridedama).

2. Pripažįstu netekusiu galios Lietuvos Respublikos aplinkos ministro 2003 m. gruodžio 24 d. įsakymo Nr. 708 „Dėl Lietuvos aplinkos apsaugos normatyvinių dokumentų LAND 53-2003, LAND 54-2003, LAND 55-2003, LAND56-2003, LAND 57-2003 patvirtinimo“ (Žin., 2004, Nr. 53-1827) 1.4 punktą.

3. Nustatau, kad šio įsakymo 1 punktu patvirtintas aplinkos apsaugos normatyvinis dokumentas privalomas juridiniams ir fiziniams asmenims, nustatyta tvarka atliekantiems aplinkos tyrimus.

APLINKOS MINISTRAS                                                                          ARŪNAS KUNDROTAS

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos aplinkos ministro

2005 m. gruodžio 28 d. įsakymu Nr. D1-648

LAND 69-2005 „VANDENS KOKYBĖ. BIOCHEMINIŲ PARAMETRŲ MATAVIMAS. SPEKTROMETRINIS CHLOROFILO „A“ KONCENTRACIJOS NUSTATYMAS“

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Šiame normatyviniame dokumente pateikiamas chlorofilo „a“ koncentracijos nustatymo metodas. Šis metodas gali būti taikomas nustatyti fitoplanktonui natūraliuose vandens telkiniuose ir dumblių augimui įvertinti eksperimentinėmis sąlygomis. Taikant atitinkamą mėginių paėmimą, šis metodas gali būti taikomas ir fitobentoso bendrijoms (1 priedas).

2. Kiti dumblių pigmentai, tokie kaip chlorofilas „b“ ir chlorofilas „c“, ir kai kurie chlorofilo metabolitai šiuo metodu nenustatomi. Feopigmentai gali būti nustatomi pusiau kiekybiškai, siekiant ištaisyti jų daromą įtaką chlorofilo „a“ nustatymui, ir leidžia įvertinti neaktyvių dumblių biomasės dalį.

3. Chlorofilas „a“ yra pagrindinis fotosintezės pigmentas, esantis visuose žaliuosiuose augaluose. Chlorofilo „a“ kiekis leidžia įvertinti paviršinio vandens telkinio trofiškumo lygį ir suteikia informaciją apie potencialų fotosintetinį dumblių aktyvumą. Svarbiausi chlorofilo metabolitai yra feofitinas ir feoforbidas. Chlorofilo ir šių feopigmentų kiekio santykis leidžia įvertinti dumblių fiziologinį būvį.

4. Chlorofilas yra jautrus šviesai ir deguoniui, ypač kai jis yra ekstrahuojamas. Norint išvengti deguonies ir fotocheminės destrukcijos, mėginių negalima laikyti aktyvioje šviesoje ir sandariai neuždarytų. Mėginių homogenizavimas kai kuriais atvejais gali padidinti ekstrakcijos efektyvumą.

5. Ekstrakcija etanoliu atliekama šildant 5 min. iki 75°C temperatūros, kad būtų inaktyvuota chlorofilazė ir pagreitinta pigmento hidrolizė. Ekstraktai (išskyrus filtrus su surinkta suspenduota medžiaga) prieš fotometrinį matavimą laikomi kuo trumpiau, nors esant reikalui galima laikyti iki 3 dienų šaldytuve 4°C temperatūroje arba iki 30 dienų – 25°C temperatūroje.

6. Ekstrakto nuskaidrinimui ekstraktas filtruojamas arba centrifuguojamas. Tačiau mažas drumstumas gali likti. Drumstumą gali sąlygoti ir parūgštinimas. Todėl mėginio absorbcijos vertė matuojama prie 665 nm bangos ilgio, o dėl drumstumo ji turi būti pakoreguojama matuojant absorbcijos vertę prie 750 nm bangos ilgio.

7. Chlorofilo „a“ koncentracijos nustatymui trukdo retai pasitaikančių fototrofinių bakterijų (t. y. Chlorobium) pigmentai [1]. Chlorofilo „b“ ir chlorofilo „c“ įtaka absorbcijai prie 665 nm bangos ilgio yra nedidelė [2].

II. NUORODOS

8. Šis aplinkos apsaugos normatyvinis dokumentas parengtas vadovaujantis standartu

ISO 10260:1992 „Vandens kokybė. Biocheminių parametrų matavimas. Spektrometrinis chlorofilo „a“ koncentracijos nustatymas“.

III. PRINCIPAS

9. Dumblių ir kitų skendinčių medžiagų sukoncentravimui atliekamas filtravimas. Dumblių pigmentai ekstrahuojami karštu etanoliu. Chlorofilo „a“ koncentracija nustatoma spektrometriniu metodu. Chlorofilo „a“ ir feopigmentų koncentracija įvertinama pagal absorbcinės vertės skirtumus prieš ir po ekstrakto parūgštinimo prie 665 nm bangos ilgio [3],[4].

IV. TYRIMO EIGA

10. Reagentai

Leidžiama vartoti tik pripažinto analizinio grynumo reagentus ir tik dejonizuotą arba tokio pat grynumo analizės vandenį.

10.1. Druskos rūgšties (HC1) 3mol/l tirpalas.

10.2. Etanolio (etilo alkoholio) 90% tūrinės dalies tirpalas vandenyje (V/V).

Pastaba. Denatūrantas etanolyje netrukdo, tačiau palyginamasis nustatymas su grynu etanoliu (90%) yra rekomenduotinas kiekvienai naujai partijai [4].

11. Naudojama įprastinė ir nurodyta žemiau laboratorinė įranga

11.1. Spektrofotometras – naudoti matomos šviesos ribose iki 750 nm; su 1 nm skiriamąja geba; absorbcijos juostos plotis – 2 nm arba mažesnis, jautrumas – mažesnis arba lygus 0,001 absorbcijos vienetų.

11.2. Vakuuminės filtracijos įrenginys, filtrų laikiklis su gnybtu (veržtuvu).

11.3. Stiklo pluošto filtrai be organinio rišiklio, sulaikantys daugiau kaip 99% dalelių, didesnių už 1 μm. Tinkamas apskritų filtrų skersmuo – nuo 25 iki 50 mm.

11.4. Filtrai, skirti ekstraktams filtruoti. Kaip aprašyta 11.3 punkte, tik mažesnio skersmens, pvz., 25 mm;

arba: centrifuga – ne mažesnio kaip 6000 aps./min. x g išcentrinio pagreičio ir su rotoriumi, tinkamu naudojamiems mėgintuvėliams.

11.5. Vandens vonelė su atitinkamomis grotelėmis ekstrakcijos indeliams ir temperatūra, reguliuojama iki 75°C ± 1°C.

11.6. Ekstrakciniai indeliai – tamsaus stiklo, plačiagurkliai, su užsukamais dangteliais, išklotais politetrafluoretilenu (PTFE), įprastinės talpos nuo 30 ml iki 50 ml, tinkami centrifugavimui 6000 aps./min. × g.

12. Mėginių atrinkimas ir saugojimas

Mėginiai imami pagal LST EN 25667-1 ir LST EN 25667-2 standartus. Šaldytuve tamsoje vandens mėginiai gali būti laikomi iki 8 val. Tačiau pageidautina, kad mėginys po paėmimo būtų nufiltruotas kiek galima greičiau, pagal punktuose 13.1–13.3 aprašytą metodiką. Jei būtina, pirminiai (žali) ekstraktai laikomi iki 30 dienų – 25°C temperatūroje deguoniui (orui) neprieinamuose tamsaus stiklo ekstrakcijos induose (11.6.). Negalima laikyti šaldytuve vandens mėginių ar filtrų kartu su kitomis medžiagomis.

13. Procedūra:

13.1. Mėginio filtravimas

Mėginys kruopščiai išmaišomas. Išmatuotas tikslus mėginio tūris V_s (priklausomai nuo dumblių koncentracijos nuo 0,1 l iki 2 l) nufiltruojamas per stiklo pluošto be organinio rišiklio filtrus, esančius specialiuose laikikliuose (11.3). Filtras išdžiovinamas vakuume ir kiek galima greičiau perkeliamas į ekstrakcijos indus. Jei filtras netelpa į ekstrakcijos indą, jį reikia sukarpyti į dalis.

Pastaba. Venkite kontakto su pirštais.

13.2. Chlorofilo „a“ ekstrakcija. Variantas A

13.2.1. Reikalingas etanolio (10.2.) kiekis pašildomas iki 75°C temperatūros. Nedidelis kiekis (30–40 ml) karšto etanolio supilamas į ekstrakcijos indą su filtru ar jo gabaliukais. Filtras (šiek tiek atšaldžius suspensiją) su stikline lazdele susmulkinamas siekiant palengvinti ekstrakciją. Pageidautina naudoti homogenizatorių. Po to stiklinė lazdelė nuplaunama nedideliu kiekiu etanolio (10.2.) į tą patį indą, kuriame yra filtras, norint nuplauti filtro prilipusias daleles. Ekstrakcija atliekama ne mažiau kaip 3 min.

Pastaba. Ekstrakcija dažniausiai atliekama kambario temperatūroje keletą valandų arba per naktį. Jei ekstrakcija yra ilga arba jei ekstraktus reikia laikyti keletą dienų (pvz., jei ekstraktą reikia palikti nakčiai ar savaitgaliui), tai ekstrakciniai indai su suspensija turi būti laikomi tamsoje šaldytuve.

13.2.2. Ekstrakto suspensija filtruojama per tankų filtrą (11.4.) į kalibruotą indą (50–100 ml talpos) arba centrifuguojama. Ekstrakcijos indai praskalaujami etanoliu (10.2.) ekstrakto suspensijai pašalinti nuo indo sienelių ir turinys supilamas į kalibruotą indą. Indas pripildomas iki žymės, užsukamas ir indo turinys gerai sumaišomas. Taip gaunamas ekstrakto kiekis – V_e.

13.3. Chlorofilo „a“ ekstrakcija. Variantas B

13.3.1. Tikslus etanolio (10.2.) kiekis V_e (paprastai 20–25 ml) paskirstomas į ekstrakcijos indus (11.6.) ir palaukiama, kol nusės ant indo dugno filtro gabaliukai. Ekstrakcijos indeliai rūpestingai užsukami, kad garuojant nebūtų prarandamas ekstrakcijos tirpalas. Ekstrakcijos indai su turiniu lengvai kratomi, siekiant gauti homogenišką chlorofilo pasiskirstymą ekstrakciniame tirpale. Po to jie sudedami į vandens vonelę (11.5.) taip, kad ekstrakto lygis susilygintų su vonelėje esančiu vandens lygiu. Kaitinama 5 min., jei reikia, atsargiai kratant. Po to ekstrakcijos indai išimami iš vandens vonelės ir atvėsinami per 15 min. iki kambario temperatūros.

Reikia siekti, kad laikas tarp ekstrakcijos ir optinio tankio matavimų būtų sumažinamas iki minimumo.

Pastaba. Taip paruošti ekstraktai gali būti saugomi tamsoje šaldytuve per naktį, kol bus atlikti optinio tankio matavimai (13.4.). Jei yra būtinybė, galima saugoti ir ilgiau, bet ne daugiau kaip 3 paras.

13.3.2. Ekstrakto suspensija perfiltruojama per tankų filtrą (11.4.) į švarų ekstrakcijos indelį (11.6.), bet ekstrakcijos indai neskalaujami šviežiu tirpikliu (4 pastaba).

Skaidrus ekstraktas (supernatantas) naudojamas matavimui.

Pastaba. Dirbant pagal šį aprašymą, užtenka susigrąžinti tik dalį ekstrakto kiekio, nes pradinis tūris V_e yra žinomas tiksliai ir nesumažėja dėl garavimo atliekant ekstrakciją, nes ekstrakcijos indai yra sandariai uždaryti dangteliais. Be to, likutinis vandens kiekis ant filtrų (žr. 13.1.) yra nedidelis, turi mažiau nei 5% ekstrakto kiekio.

13.4. Matavimas

13.4.1. Dalis ekstrakto turinio su pipete įpilama į spektrofotometro kiuvetę, paliekant pakankamą ekstrakto kiekį tolesniam parūgštinimui (žr. 13.4.3.).

13.4.2. Chlorofilo „a“ ekstrakto optinis tankis matuojamas prie 665 nm (A₆₆₅) ir 750 nm (A₇₅₀) bangų ilgių ir palyginamas su kontroline kiuvete, užpildyta etanoliu.

Pastaba. Absorbcijos vertė prie 665 nm bangos ilgio turi būti tarp 0,01 ir 0,8 vienetų. Tai pasiekiama atitinkamai parenkant filtravimui tiriamo vandens tūrį, skaidraus ekstrakto (supernatanto) tūrį, atskiedimą, optinį bangos ilgį ir t. t. Pradėdami imkite 0,5 1 mėginio, 50 mm diametro filtrą, 20 ml etanolio (10.2.) ir 5 cm kiuvetę (optinio sluoksnio storio).

13.4.3. Ekstrakto dalis (dažniausiai nuo 5 ml iki 10 ml) parūgštinama 0,01 ml druskos rūgšties tirpalu (10.1.) 10 ml ekstrakto kiekiui, išmaišoma ir palaikoma nuo 5 min. iki 30 min. ir po to išmatuojamos absorbcijos vertės prie 665 nm ir 750 nm bangų ilgių.

14. Chlorofilo „a“ koncentracijos apskaičiavimas

14.1. Chlorofilo „a“ koncentracija (p_c), išreikšta mikrogramais litre, skaičiuojama pagal lygtį:

                                                                  (1)

kur:

A = A₆₆₅ – A₇₅₀            ekstrakto absorbcija prieš parūgštinimą (žr. 13.4.1.);

A_a = A₆₆₅ – A₇₅₀           ekstrakto absorbcija po parūgštinimo;

V_e =     ekstrakto tūris mililitrais;

V_s =     filtruoto mėginio tūris litrais;

K_c = 82 l/μg·m             specifinis spektrinis absorbcijos koeficientas chlorofilui „a“ (dydis paimtas iš [2]);

R = 1,7            santykis A/A_a gryno chlorofilo „a“ tirpalui, kuris rūgštinant paverčiamas į feofitiną(žr. 13.4.3.), (dydis paimtas iš [2]);

d          kiuvetės optinio sluoksnio storis, cm;

10³         V_e dimensijos faktorius.

14.2. Feopigmento koncentracija (p_p) mikrogramais litre yra apskaičiuojama pagal lygtį:

                                                                    (2)

14.3. Kuomet dydis K_c = 82 l/μg·m yra imamas kaip specifinis spektrinis absorbcijos koeficientas chlorofilui „a“ 90% etanolyje ir 1,7 imamas maksimaliam parūgštinimo santykiui (R) grynam chlorofilui „a“, tuomet chlorofilo „a“ koncentracija p_c vandens mėginiui supaprastinama iki

                                                                      (3)

ir feopigmento koncentracija, 2 lygtis supaprastinama iki 4 lygties

                                                                      (4)

Pastabos:

Apskaičiuotos feopigmentų kiekio vertės yra mažiau patikimos nei chlorofilo „a“ koncentracijos. Tarplaboratoriniai bandymai parodė tarplaboratorinius nuokrypius nuo 5% iki 11% chlorofilo „a“ nustatymo atveju ir nuo 6% iki 46% feopigmentų atveju.

Santykis A/A_a yra 1,7, jei mėginyje yra tik nesuskilęs chlorofilas „a“. Jis yra lygus 1, jei mėginyje yra tik chlorofilo „a“ skilimo produktai. Specifinis spektrinis absorbcijos koeficientas (82) chlorofilui „a“ etanolyje (10.2.) yra gaunamas iš absorbcijos koeficiento, rekomenduojamo [5] prie 665 nm bangos ilgio. Čia duodamas dydis (84) leidžia atsižvelgti į chlorofilą „b“ ir chlorofilą „c“. Absorbcija chlorofilo „a“ vienodų koncentracijų acetono tirpale yra nuo 2% iki 3% didesnė nei etanolio tirpale prie 665 nm bangos ilgio [2] [4].

14.4. Rezultatai išreiškiami mikrogramais litre (arba miligramais kubiniame metre) daugiausia dviem arba vienu skaitmeniu po kablelio, pvz.:

chlorofilo „a“ koncentracija – 5,5 μg/l;

feopigmento koncentracija – ≤ 0,1 μg/l.

15. Tikslumas

Tarplaboratoriniuose bandymuose, atliktuose 1983 m., gauti rezultatai [6] pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė. Tikslumo duomenys:

Pavyzdys	l	n	na %	= x μg/l	σr μg/l	VCr %	σR μg/l	VCR %
A	18	71	0	126,5	5,46	4,3	6,36	5,0
B	18	70	2,8	20,3	3,67	18,1	2,90	11,3
C	17	67	5,6	24,6	2,21	9,0	2,8	11,4

l – laboratorijų skaičius;

n – reikšmių skaičius;

n_a – išskirčių procentas;

x – bendras vidurkis;

σ_r – pakartojamumo standartinis nuokrypis;

VC_r – pakartojamumo variacijos koeficientas;

σ_R – standartinis atkuriamumo nuokrypis;

VC_R – atkuriamumo variacijos koeficientas.

V. BAIGIAMOSIOS NUOSTATOS

16. Tyrimo ataskaita

Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikiama ši informacija:

a) nuoroda į šį normatyvinį dokumentą;

b) vandens mėginio identifikavimas;

c) rezultatų išraiška pagal 14.4 punkto reikalavimą;

d) vandens mėginių apdorojimas (jei tai būtina);

e) pateikti bet kokie nuokrypiai nuo metodo ir bet kokios kitos aplinkybės, kurios turi įtakos rezultatams.

______________

LAND 69-2005 „Vandens kokybė.

Biocheminių parametrų matavimas.

Spektrometrinis chlorofilo „a“ koncentracijos

nustatymas“

1 priedas

FITOBENTOSO KONCENTRACIJOS NUSTATYMAS

1. Fitobentoso nustatymas

Fitoplanktono atrinkimas yra atliekamas pagal ISO 5667-1 ir ISO 5667-2.

Fitobentosas. Tai ant dugno ar įvairių po vandeniu esančių daiktų augantys dumbliai. Vieni jų prisitvirtinę, kiti pasyviai prigludę prie substrato.

Dumbliai nuo akmenų ar kitų panirusių substratų nugramdomi peiliu ar skutimosi peiliuku. Ant mažų akmenų augantys dumbliai renkami su substratu ir patalpinami tiesiai į tirpiklį. Kiekybinių mėginių paėmimą palengvina dirbtinių substratų, tokių kaip stiklo plokštelių, eksponuotų vandenyje, panaudojimas. Apaugusi stiklo plokštelė arba surinkti dumbliai, transportuojant laikomi vandenyje. Suspenduoti fitobentosiniai dumbliai arba žinomo svorio nuosėdos yra apdorojami panašiai kaip fitoplanktonas pagal šiame normatyviniame dokumente aprašytą metodiką.

2. Ekstrahentas

Dumblių pigmentams išskirti nuo 1966 m. buvo naudojamas acetonas, rekomenduotas UNESCO-SCOR. Tačiau paaiškėjus, kad ekstrakcijos acetone efektyvumas kai kuriais atvejais buvo mažas, pradėti naudoti alkoholiai. Buvo įrodyta, kad karštas etanolis ir metanolis yra vienodai efektyvūs ir kartais efektyvesni negu acetonas [4]. Tačiau, naudojant metanolį, gali iškilti specifinės problemos tuo atveju, jei chlorofilo ekstraktas rūgštinamas koreguojant feopigmentų įtaką. Absorbcijos maksimumo pasislinkimas į trumpesniąsias bangas gali sukelti didelius santykio tarp neparūgštinto ir parūgštinto mėginių optinių tankių svyravimus. Tai priklauso nuo, pavyzdžiui: rūgšties koncentracijos, vandens kiekio tirpiklyje ir filtre, laiko trukmės nuo parūgštinimo iki matavimo.

Šių problemų galima išvengti, įtraukiant į procedūrą papildomus veiksmus, pavyzdžiui, neutralizaciją organinėmis bazėmis (dimetil anilinu ar difenil anilinu). Be to, metanolis yra nuodingas. Dėl šių priežasčių rekomenduojama naudoti etanolį kaip pagrindinį ekstrahentą chlorofilo „a“ koncentracijai nustatyti gėlo ir jūros vandens mėginiuose.

______________

LAND 69-2005 „Vandens kokybė.

Biocheminių parametrų matavimas.

Spektrometrinis chlorofilo „a“ koncentracijos

nustatymas“

2 priedas

BIBLIOGRAFIJA

1. TOLSTOY, A. and TOTH, I., Bacteriochlorophyll-d and its interference on determination of chlorophyll-a, Arch. Hydrobiol. 89 (1980), p. 160–170.

2. NUSCH, E. A., Comparison of different methods for chlorophyll and phaeopigment determination, Arch. Hydrobiol. Beih. Ergebn. Limnol. 14 (1980), p. 14–36.

3. LORENZEN, C. J., Determination of chlorophyll and phaeopigments; spectrophotometric equations, Limnol, Oceanogr. 12 (1967), p. 343–346.

4. MARKER, A. F. H., NUSCH, E. A., RAI, H. and RIEMANN, B., The measurement of photosynthetic pigments in freshwaters and standardization of methods: Conclusions and recommendations, Arch. Hydrobiol. Beih. Ergebn. Limnol. 14 (1980), p. 91–106.

5. VOLLENWEIDER, R. A., A manual on methods of measuring primary production in aquatic environments, IBP Handbook No 12, 2nd ed. (1971) Blackwell Scient. Publ. Oxford, Edinburgh.

6. NUSCH, E. A., Results from an interlaboratory ring test concerning the determination of chlorophyll a, Z. Wasser Abw. Forsch. 17 (1984), p. 189–194.

______________