LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO
Į S A K Y M A S
DĖL BULVIŲ ŽIEDINIO PUVINIO FITOSANITARINĖS KONTROLĖS IR FITOSANITARIJOS PRIEMONIŲ TAIKYMO TVARKOS PATVIRTINIMO
2001 m. rugpjūčio 31 d. Nr. 306
Vilnius
Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos fitosanitarijos įstatymo (Žin., 1999, Nr. 113-3285) 4 straipsnio 3 ir 6 dalimis, remdamasis 2000 m. lapkričio 20 d. įsakymu Nr. 315 „Dėl karantininių organizmų, augalų, augalinių produktų ir kitų objektų sąrašų patvirtinimo ir 1998 m. gruodžio 28 d. įsakymo Nr. 321 pripažinimo netekusiu galios“ (Žin., 2000, Nr. 102-3244) bei vykdydamas Lietuvos Respublikos Vyriausybės 2001 m. vasario 22 d. nutarimu Nr. 192 (Žin., 2001, Nr. 18-554) patvirtintus Lietuvos pasirengimo narystei Europos Sąjungoje programos (Nacionalinė Acquis priėmimo programa) teisės derinimo priemonių ir Acquis įgyvendinimo priemonių 2001 metų planus (priemonės kodas 3.4.2.7-T-B7),
tvirtinu Bulvių žiedinio puvinio fitosanitarinės kontrolės ir fitosanitarijos priemonių taikymo tvarką (pridedama).
ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS KĘSTUTIS KRISTINAITIS
______________
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro
2001 m. rugpjūčio 31 d. įsakymu Nr. 306
BULVIŲ ŽIEDINIO PUVINIO FITOSANITARINĖS KONTROLĖS IR FITOSANITARIJOS PRIEMONIŲ TAIKYMO TVARKA
Ši tvarka parengta remiantis Tarybos 1993 m. spalio 4 d. direktyva 93/85/EEB dėl bulvių žiedinio puvinio kontrolės.
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Šios tvarkos tikslas – užtikrinti sistemingą oficialią Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff 1914) Davis, Gillaspie, Vidaver et Harris 1984 – bulvių žiedinio puvinio sukėlėjo (toliau – bakterija) fitosanitarinę kontrolę, siekiant bakteriją aptikti ir nustatyti jos išplitimą bei užkirsti kelią jai atsirasti ir išplisti, o aptikus bakteriją, užkirsti kelią jai plisti ir kontroliuoti, stengiantis išnaikinti.
II. FITOSANITARINIAI TYRIMAI
3. Tarnyba atlieka sistemingus oficialius tyrimus, ieškant bakterijos bulvių (Solanum tuberosum L.) stiebagumbiuose ir augaluose.
4. Bulvės tikrinamos imant stiebagumbių mėginius pagal III skyriuje pateikiamą bakterijai aptikti ir diagnozuoti metodą. Tuo pačiu metu atliekamas vizualinis mėginių patikrinimas perpjaunant stiebagumbius.
III. BAKTERIJOS NUSTATYMO IR DIAGNOZAVIMO METODIKA
Kūgiškų audinių gabaliukų išėmimas
6. Mėginį sudaro 200 stiebagumbių. Stiebagumbiai nuplaunami tekančiu vandeniu arba aplink kiekvieno stiebagumbio viršūnę esantis epidermis pašalinamas naudojant nuolat dezinfekuojamą skalpelį ar bulvių skutimo peilį. Peilis dezinfekuojamas pamerkus jį į 70% etanolį ir uždegus.
7. Skalpeliu arba bulvių skutimo peiliu kūgio pavidalo audinio gabaliukai atsargiai išimamai iš stiebagumbio viršūnės. Nevaskuliarinio audinio turi būti kiek galima mažiau. Atskirti mėginiai turi būti paruošti dažyti Gramo būdu, imunofluorescenciniam dažymui ir baklažano testui per 24 valandas arba laikomi - 20°C temperatūroje ne ilgiau kaip dvi savaites.
Vizualinis bulvių žiedinio puvinio simptomų ieškojimas
8. Atskyrus mėginius, kiekvienas stiebagumbis skersai perpjaunamas ir stebima, ar nėra bakterijos simptomų. Suspaudus stiebagumbį, apžiūrima, kaip atrodo išsiskiriančios iš vaskuliarinio audinio sultys.
9. Pirminiai simptomai yra audinio skaidrumas arba peršviečiamumas, neminkštėjimas aplink vaskuliarinę sistemą, ypač prie viršūnės. Vaskuliarinis žiedas prie viršūnės gali būti šiek tiek tamsesnės spalvos negu paprastai. Pirmasis lengvai nustatomas simptomas yra tas, kad vaskuliarinis žiedas yra gelsvas ir, švelniai paspaudus stiebagumbį, iš indų pradeda sunktis į sūrį panašios konsistencijos medžiaga. Šioje stadijoje vaskuliarinis audinys gali paruduoti. Pradžioje simptomai gali būti matomi tik vienoje žiedo dalyje, nebūtinai prie viršūnės, ir palaipsniui gali išsiplėsti po visą žiedą. Infekcijai plečiantis, žūva vaskuliarinis audinys. Išorinė žievės dalis gali atsiskirti nuo vidinės žievės. Vėlesnėse infekcijos stadijose stiebagumbio paviršiuje atsiranda įtrūkimų, kurių pakraščiai dažnai būna raudonai rudi. Antrinė grybinė arba bakterinė invazija gali užmaskuoti simptomus, todėl gali būti sunku, netgi neįmanoma atskirti vėlyvuosius bakterijos simptomus nuo kitų stiebagumbio puvinių.
Mėginių paruošimas dažyti Gramo būdu imunofluorescenciniam dažymui ir baklažano testui
10. Mėginiai homogenizuojami iki visiško maceravimo tirpiklyje, kuris nebūtų toksiškas (pavyzdžiui, 0,05 M fosfatiniame buferiniame valgomosios druskos tirpale pH 7,0) mažesnėje negu 30°C temperatūroje. Rekomenduojama įpilti netoksiško deflokulianto, taip pat gali prireikti netoksiško priešpučio (žr. priedą, Maceravimo skysčio sudėtis, rekomenduojama pagal Lelliottą ir Sellarą). Bakterijos išskiriamos iš homogenizuoto tirpalo vienu iš nurodytų būdų:
10.1.2. gautas centrifugatas 10 min. centrifuguojamas 4000xg. Centrifugatas nufiltruojamas ir išpilamas;
10.2.1. maceratui leidžiama pastovėti 30 min., kol audinių dalelės nusėda. Skystis filtruojamas nesudrumsčiant nuosėdų;
10.2.2. skystis perliejamas per filtravimo popierių (Vatmanas Nr. 1), įdėtą į stiklo filtrą (Nr. 2; 40-100m), naudojant vakuuminį vandens siurblį. Filtratas surenkamas į centrifugos vamzdį. Filtras išplaunamas steriliu 0,05 M fosfatiniu buferiniu valgomosios druskos pH 7,0 tirpalu, kol susidaro ne daugiau kaip 35 ml filtrato;
10.3.1. mėginys kratytuvu kratomas 100-110 aps./min. greičiu keturias valandas arba laikoma +4°C temperatūroje ne daugiau kaip 12 valandų;
11. Granulė suspenduojama steriliame 0,01 M fosfatiniame buferiniame valgomosios druskos tirpale pH 7,2 (žr. priedą, Buferiai), kad visas kiekis sudarytų maždaug 1 ml. Padalijama į dvi lygias dalis: viena atidedama pasitikrinti – užšaldoma iki -20°C temperatūros arba jai taikoma liofilizacija, likusioji dalis padalijama pusiau – viena pusė sunaudojama imunofluorescenciniam testui ir Gramo dažymui, o kita – baklažano testui.
Dažymas pagal Gramą
13. Mėginiai iš stiebagumbių, kuriuose pastebimas skaidrumas, puvimas ar kitokie įtartini simptomai, ir jų skiediniai paruošiami dažyti pagal Gramą. Mėginius reikia paimti nuo apkrėstų audinių pakraščių. Tepinėliai iš žinomos bakterijos kultūros ir, jeigu įmanoma, natūraliai apkrėsto audinio paruošiami dažyti pagal Gramą. Nustatoma, kuriuose mėginiuose yra būdingų Gramteigiamų coryneform ląstelių. Paprastai bakterijos ląstelės būna 0,8-1,2 µm ilgio ir 0,4-0,60 µm pločio. Teisinga spalvinimo tvarka yra pateikiama priede.
14. Natūralios infekcijos arba neseniai izoliuotų kultūrų preparatuose dažnai vyrauja kokinės ląstelių grandinėlės, kurios paprastai yra šiek tiek mažesnės nei iš senesnių agaro kultūrų. Daugumoje kultūrų terpių bakterijos ląstelės būna pleomorfinės coryneform lazdelės ir gali nulemti skirtingą Gramo reakciją. Ląstelės yra pavienės, poromis su būdingomis alkūnėmis, tipiškomis lenkiamajam dalijimuisi, o kartais netaisyklingomis grupėmis, dažnai vadinamomis tvorelėmis arba kinų hieroglifais.
Imunofluorescencinio tyrimo schema
15. Bakterijos štamui ATCC 33113 (NCPPB 2137) arba NCPPB 2140 naudojamas antiserumas, turintis imunofluorescencinį titrą, didesnį kaip 1:600. Atliekama viena tyrimo skaidrės 0,05 M fosfatinio buferinio valgomosios druskos pH 7,0 tirpalo kontrolė nustatyti, ar fluoresceino izotiocianato anti-rabbit imunoglobulininis junginys (FITC) nesijungia su bakterijų ląstelėmis. Bakteriją (ATCC 33113 (NCPPB 2137), NCPPB 2140) reikia panaudoti kaip homologinę antigeno kontrolę ant atskiros skaidrės. Jei įmanoma, turi būti naudojamas natūraliai užkrėstas audinys (palaikomas liofilizacijos būdu arba užšaldytas iki -20°C) kaip panaši kontrolė tai pačiai skaidrei (žr. priedo 2 pav.)
16. Galutinė granulė nuosekliai 3 kartus dešimteriopai (101, 102, 103) praskiedžiama distiliuotame vandenyje (žr. priedo 1 pav.). Išmatuotas standartinis kiekvienos granulės tirpalo arba bakterijos suspensijos (maždaug 106 ląstelių/ml) kiekis, kurio užtenka uždengti langeliui (maždaug 25 µl) užlašinamas pipete į daugiataškės skaidrės langelius, kaip parodyta priedo 1 paveiksle.
17. Atitinkami langeliai padengiami bakterijos antiserumu rekomenduojamais skiediniais 0,01 M fosfatiniame buferiniame valgomosios druskos pH 7,2 tirpale (žr. priedą, Buferiai), kaip parodyta priedo 1 paveiksle. 0,01 M fosfatinis buferinis valgomosios druskos pH 7,2 tirpalas naudojamas FITC kontrolei. Darbinis serumo skiedinys turi sudaryti maždaug pusę imunofluorescencinio titro. Jei norima naudoti kitus antiserumo skiedinius, reikia paruošti atskiras skaidres kiekvienam naudojamam skiediniui. Tada inkubuoti drėgnoje kameroje aplinkos temperatūroje 30 minučių. Gerai praskalaujama su 0,01 M fosfatiniu buferiniu valgomosios druskos pH 7,2 tirpalu ir plaunama penkias minutes tris kartus vis nauju buferio kiekiu. Drėgmės perteklius kruopščiai pašalinamas.
18. Tokiu pačiu koncentratu, kuris buvo panaudotas nustatyti titrą, kiekvienas langelis padengiamas FITC konjugatu ir inkubuojama 30 minučių tamsioje drėgnoje kameroje aplinkos temperatūroje. Praskalaujama ir išplaunama kaip ir anksčiau. Ant kiekvieno langelio užlašinama maždaug 5-10 µl 0,1 M fosfatų buferuoto glicerino pH 7,6 (arba panašaus tirpalo, kurio pH ne mažesnis kaip 7,6) (žr. priedą, Buferiai), uždengiama dengiamuoju stiklu. Gautas rezultatas apžiūrimas mikroskopu su epifluorescenciniu šviesos šaltiniu ir filtrais, tinkamais darbui su FITC. Tinkamas didinimas yra 400 – 1000 kartų. Replikuoti langeliai nuskaitomi dviem diametrais stačiais kampais ir aplink langelio perimetrus. Ieškoma fluorescuojančių ląstelių teigiamuose kontroliniuose mėginiuose ir nustatomas titras. Ieškoma fluorescuojančių ląstelių FITC/fosfatinio buferinio valgomosios druskos tirpalo kontroliniame langelyje ir, jeigu jų ten neaptinkama, pereinama prie tiriamųjų langelių. Mažiausiai dešimtyje mikroskopo laukų nustatomas vidutinis morfologiškai tipiškų fluorescuojančių ląstelių skaičius viename lauke ir apskaičiuojamas jų skaičius vienam mililitrui nepraskiestos granulės (žr. priedą, Imunofluorescencinių-teigiamų ląstelių populiacijos nustatymas).
19. Yra keletas problemų, būdingų imunofluorescenciniam tyrimui:
19.1. bulvių granulėse gali atsirasti foninės fluorescuojančių ląstelių populiacijos, turinčios netipišką morfologiją, ir susikryžminančios saprofitinės bakterijos, kurių dydis ir morfologija yra panašūs į bakterijos. Dėmesį reikia atkreipti tik į tipiško dydžio ir morfologijos fluorescuojančias ląsteles;
19.2. dėl sukryžminimo reakcijos galimybės mėginius, kurių imunofluorescencinis tyrimas yra teigiamas, reikia dar kartą ištirti, naudojant kitą antiserumą;
20. Neigiamas imunofluorescencinis tyrimas yra nustatomas bet kuriam mėginiui, kuriame neaptiktos morfologiškai tipiškos fluorescuojančios ląstelės. Mėginiai laikomi neužkrėstais bakterija. Baklažano testo atlikti nereikia.
21. Teigiamas imunofluorescencinis tyrimas yra nustatomas bet kuriam mėginiui, kuriame aptiktos morfologiškai tipiškos fluorescuojančios ląstelės. Mėginiai, kuriems nustatomas teigiamas imunofluorescencinis tyrimas, naudojant abu antiserumus, laikomi potencialiai užkrėstais bakterija. Baklažano testą reikia atlikti visiems mėginiams, kurie laikomi potencialiai užkrėstais.
Baklažano testas
22. Baklažano kultūra:
22.1. baklažano (Solanum melongena cv. Black Beauty) sėklos pasodinamos į pasterizuotą sėklų kompostą. Daigai persodinami su visiškai išsiskleidusiomis sėklaskiltėmis (nuo 10 iki 14 dienų) į vazonėlį su pasterizuotu kompostu;
22.2. baklažanai naudojami, kai yra 3 lapelių fazėje, kai du, bet ne daugiau kaip trys lapeliai yra visiškai išsiskleidę. Baklažanai turi būti auginami šiltnamyje, prie išvardytų aplinkos sąlygų:
22.2.1. apšvietimas: 14 valandų dirbtinis prie 8-10 tūkst. liuksų arba natūralus, jei diena ilgesnė nei 14 valandų;
22.3. bakterija neauga temperatūroje, aukštesnėje nei 30°C. Jei temperatūra naktį nenukrenta iki 15°C, gali atsirasti chlorofilo trūkumas (sidabriška nekrozė);
Inokuliavimas į įpjovą (I metodas)
24. Kiekvienas vazonėlis paguldomas horizontaliai (išplėsto polistirolo blokas, iš kurio vieno paviršiaus pašalintas 5 cm gylio, 10 cm pločio, 15 cm ilgio gabalas atitinka 10 cm vazonėlį) (žr. priedo 3 pav.). Kiekvienam tiriamam mėginiui tarp stiebo ir bloko turi būti įstatyta sterilaus aliuminio folijos juostelė. Augalą galima prilaikyti gumine juosta apjuosus bloką.
25. Skalpeliu padaroma išilginė arba šiek tiek įstriža 0,5-1,0 cm ilgio ir maždaug trijų ketvirčių stiebo diametro gylio įpjova tarp sėklaskilčių ir pirmojo lapelio. Praplėtus įpjovą skalpelio geležtės smaigaliu, teptuku akims apvesti arba plonu dailininko teptuku, patepama inokuliantu nuo granulės. Likusi granulė paskirstoma ant visų baklažanų. Naudojant 2 ml švirkštą, įpjova užtepama steriliu vazelinu.
Inokuliavimas į įpjovą (II metodas)
26. Laikant augalą tarp dviejų pirštų, pipete užlašinamas lašas (maždaug 5 – 10 l) granulės suspensijos ant stiebo tarp sėklaskilčių ir pirmojo lapelio. Steriliu skalpeliu, pradedant nuo granulės suspensijos lašo, padaroma išilginė (maždaug 5° kampu) 1,0 cm ilgio ir maždaug 2/3 stiebo storio gylio įpjova. Naudojant švirkštą, įpjova užtepama steriliu vazelinu.
Inokuliavimas švirkštu
27. Tam kad būtų sumažintas turgoro spaudimas, vieną dieną prieš inokuliaciją baklažanų laistyti negalima. Baklažanų augalai inokuliuojami tiesiai virš sėklaskilčių švirkštu su poodine adata (ne mažesne kaip 23G). Granulė paskirstoma baklažanams. 25 augalai inokuliuojami žinoma bakterijos kultūra ir, kur įmanoma, natūraliai užkrėstu stiebagumbių audiniu, taikant tą patį inokuliavimo metodą. 25 augalai inokuliuojami steriliu 0,05 M fosfatiniu buferiniu valgomosios druskos pH 7,0 tirpalu, taikant tą patį inokuliacijos metodą. Tada 40 dienų augalai tinkamomis sąlygomis inkubuojami. Kas aštuonias dienas reguliariai tikrinama, ar nepasirodys simptomai. Suskaičiuojamas augalų, kuriuose pasirodė bakterijos sukeltas lapų vytimas, kuris gali prasidėti kaip vytimas kraštuose ir tarp gyslų simptomai, skaičius. Suvytęs audinys iš pradžių gali būti tamsiai žalias arba margas, tačiau prieš nekrozuojant pašviesėja. Vytimai tarp gyslų dažnai atrodo kaip sušlapinti riebiu skysčiu. Nekrotinis audinys dažnai turi ryškų geltoną pakraštį. Augalai nebūtinai žūva – kuo ilgesnis laikotarpis iki pasirodant pirmiesiems simptomams, tuo didesnė galimybė, kad augalas išgyvens. Augalai gali nugalėti infekciją. Jauni baklažanų augalai daug jautresni mažų bakterijų populiacijoms negu vyresni augalai, todėl augalus reikia naudoti 3 lapelio stadijoje arba prieš pat ją.
28. Vytimą taip pat gali sukelti kitų bakterijų arba grybų populiacijos, esančios stiebagumbio audinio granulėje. Tai gali būti Erwinia carotovora subsp. carotovora ir E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata, taip pat ir didelės saprofitinių bakterijų populiacijos. Tokį apvytimą galima atskirti nuo bakterijos sukelto vytimo, kadangi visi lapai arba visi augalai greitai vysta.
29. Gramo mėginiai paruošiami visoms baklažano augalo dalims, kuriose pastebėti simptomai, panaudojant suvytusių lapų audinių ir stiebų audinių dalis ir izoliuojami tinkamoje maistinių medžiagų terpėje. Baklažanų lapai ir stiebų paviršius dezinfekuojami nušluostant 70% etanoliu. Esant tam tikroms aplinkybėms, ypač kai augimo sąlygos nėra pačios geriausios, gali būti, kad bakterija įgis latentinės infekcijos formą baklažanuose net po 40 dienų inkubacijos. Dėl tokios infekcijos inokuliuoti augalai gali nustoti augti ir prarasti energiją. Jeigu imunofluorescencinis testas laikomas teigiamu, galima nuspręsti tirti toliau. Todėl labai svarbu palyginti visų tiriamų baklažanų augalų augimo tempus sterilaus 0,05 M fosfatinio buferinio valgomosios druskos pH 7,0 tirpalo kontroline inokuliacija ir stebėti šiltnamio aplinkos sąlygas.
30. Tolesniam tyrimui reikia nupjauti stiebus virš inokuliuotos vietos ir pašalinti lapus. Tada stiebai maceruojami 0,05 M fosfatiniu buferiniu valgomosios druskos pH 7,0 tirpalu. Sunaudojama pusė granulės dažyti Gramo būdu ir imunofluorescenciniam testui, likusi pusė panaudojama kitam baklažano testui, atliekamam tuo atveju, jei dažymas Gramo būdu ir (arba) imunofluorescenciniai testai teigiami. Naudojama žinoma bakterijos kultūra ir sterili 0,05 M fosfatinio buferinio valgomosios druskos pH 7,0 tirpalo kontrolė. Jeigu kitame teste simptomai nepastebimi, mėginys turi būti laikomas neigiamu.
Bakterijos izoliavimas
31. Diagnozę galima patvirtinti tiktai tada, jeigu bakterija yra izoliuojama ir nustatoma. Nors tai sudėtinga bakterija, ją galima izoliuoti iš simptominio audinio. Nepaisant to, šią bakteriją gali užgožti greitai augančios saprofitinės bakterijos ir todėl izoliavimas tiesiai nuo stiebagumbio audinio granulės nerekomenduojamas. Baklažanai yra puiki selektyvi mitybinė terpė bakterijai augti ir su jais galima taip pat puikiai atlikti patvirtinamąjį šeimininko testą.
32. Izoliavimą reikia atlikti iš visų simptominių bulvių stiebagumbių ir baklažanų. Kai reikia, atliekama baklažanų stiebų maceracija.
33. Suspensija sėjama ant vienos iš išvardytų terpių:
35. Bakterija auga lėtai, paprastai per 10 dienų išauga į segtuko smaigalio, kremines, skliautines kolonijas. Sėjama dar kartą, stengiantis gauti gryną kultūrą.
Bakterijos nustatymas
37. Iš sveikų arba užkrėstų bulvių ir baklažanų galima išskirti daugelį Gramteigiamų coryneform bakterijų, kurių kolonijiniai tipai panašūs į bakterijos. Bakterija nustatoma tokiais testais:
38. Visuose testuose reikia panaudoti žinomos bakterijos kontrolę. Maistinių medžiagų ir fiziologinius testus reikia atlikti naudojant inokuliantus iš maistinių agaro subkultūrų. Morfologinius palyginimus reikia atlikti iš maistinių dekstrozės agaro kultūrų.
39. Imunofluorescenciniam testui ląstelių populiacijos turi būti sureguliuotos iki 106 ląstelių mililitre. Imunofluorescencinis titras turi būti panašus į žinomos bakterijos kultūrą.
40. Baklažano testui ląstelių populiacijos turi būti sureguliuotos iki 107 ląstelių mililitre. Baklažano testus reikia atlikti su 10 augalų kiekvienam naudojant bakterijos kultūrą ir sterilaus vandens kontrolę. Su grynomis kultūromis paprastai nuvysta per 20 dienų, tačiau augalai, kuriuose simptomai neatsiranda praėjus šiam laikui, turi būti inkubuojami iš viso 30 dienų temperatūroje, sudarančioje sąlygas baklažanams augti, tačiau neviršijančioje 30°C. Jeigu praėjus 30 dienų simptomai nepastebimi, negali būti patvirtinta, kad kultūra yra patogeninė bakterijos forma.
Tyrimui panaudotos medžiagos laikymas
41. Kiekvienu atveju, kai buvo užfiksuotas teigiamas imunofluorescencinis testas, taikomas metodas, nurodytas šios tvarkos III skyriuje, ir laukiama patvirtinimo arba paneigimo; užbaigus minėtą tyrimą, reikia atskirti ir užkonservuoti:
42. Jeigu bakterijos buvimas patvirtinamas, reikia atskirti ir užkonservuoti trumpiausiai vieną mėnesį po pranešimo:
Galimo bulvių užkrėtimo masto nustatymas
43. Nustatant galimo užkrėtimo mastą, reikia atsižvelgti į:
43.2. auginimo vietą arba patalpas, kuriose yra gamybinė grandis, susijusi su stiebagumbiais ir augalais, kurios yra užkrėstos, įskaitant tas, kur dalijamasi gamybine įranga ir priemonėmis tiesiogiai ar per tą patį rangovą;
43.3. stiebagumbius arba augalus, auginamus auginimo vietoje, kuri minima 43.2 papunktyje, arba esančius tokioje auginimo vietoje laikotarpiu, kai stiebagumbiai ir augalai, nustatyti užkrėstais, buvo auginimo vietose arba gamybiniuose pastatuose;
43.5. bet kokią techniką, transporto priemonę, konteinerį, saugyklą arba jų dalis ir kitus objektus, įskaitant pakuotę, kurie galėjo turėti sąlytį su stiebagumbiais arba augalais, nustatytais užkrėstais per praėjusį 12 mėnesių laikotarpį;
43.6. bet kokius stiebagumbius arba augalus, laikomus arba turėjusius sąlytį su bet kokiomis struktūromis ar objektais, minėtais 43.5 papunktyje, prieš tokių struktūrų ar objektų išvalymą ir dezinfekavimą;
IV. FITOSANITARIJOS PRIEMONĖS
45. Norint patvirtinti arba paneigti bakterijos buvimą, tarnyba privalo atlikti laboratorinį patikrinimą pagal šios tvarkos III skyriuje aprašytus metodus bei tinkamai užkonservuoti panaudotą medžiagą.
46. Kol bus patvirtintas arba paneigtas įtariamas užkrėtimas bakterija, tarnyba turi:
46.1. uždrausti visų partijų ir/arba siuntų, iš kurių buvo paimti mėginiai, judėjimą, išskyrus atvejus, kai tai yra jos kontroliuojama ir su sąlyga, kad bus taikomos priemonės bakterijos išplitimui išvengti;
47. Jeigu patikrinimo metu stiebagumbių, augalų ar augalų dalių mėginiuose bakterijos buvimas patvirtinamas (nustatomas), tarnyba, atsižvelgdama į mokslinius principus, bakterijos biologiją ir konkrečias gamybos, rinkodaros ir perdirbimo sistemas:
47.1. nustato užkrėstais stiebagumbius ir augalus, siuntą ir/arba partiją, įrenginius, transporto priemonę, konteinerius, saugyklą ar jų dalis ir bet kokius kitus objektus, įskaitant pakuotę, iš kur buvo paimtas mėginys, bei auginimo vietą (-as) ir lauką (-us), kur stiebagumbiai ar augalai buvo auginami ir nukasti;
47.2. nustato galimo bakterinio užkrėtimo mastą per produkcijos (iki derliaus nuėmimo ir po jo) sąlytį su nustatytu užkrėtimu;
47.3. paženklina teritorijos ribas, remdamasi nustatytu bakteriniu užkrėtimu, galimu užkrėtimo mastu ir galimu bakterijos išplitimu;
48. Tarnyba užtikrina, jog nustačius, kad stiebagumbiai arba augalai yra užkrėsti, bulvių atsargos, kurios klonavimu susijusios su užkrėstomis, būtų patikrintos pagal šios tvarkos III skyriuje pateikiamus metodus. Jei šiuo patikrinimu nustatomas užkrėtimas, turi būti įvertintas jo mastas, išplitimas, paženklinama užkrėsta teritorija.
49. Nustačius bakterinį užkrėtimą, gali būti naudojamos tokios priemonės:
49.1. užkrėstų bulvių stiebagumbių panaudojimas pramoniniam perdirbimui, jas be perkrovimo pristatant į perdirbimo įmonę, kurioje yra atliekų šalinimo įrenginiai, užtikrinus, kad per šalinimo įrenginius neišplis bakterija, bei saugyklų ir transporto priemonių, išvažiuojančių iš įmonės teritorijos, dezinfekcijos sistema;
50. Tinkamas bulvių stiebagumbių arba augalų, kurie įtariami bakterijos užkrėtimu, panaudojimas arba šalinimas yra:
50.2. pramoninis perdirbimas, jas pristatant be perkrovimo į perdirbimo cechą, kuriame yra tinkami atliekų šalinimo ir dezinfekavimo įrenginiai;
52. Paženklintoje teritorijoje įgyvendinamos priemonės:
52.1. auginimo vietose, kurios laikomos užkrėstomis:
52.1.1. lauke, kuris laikomas užkrėstu arba mažiausiai trejus auginimo metus skaičiuojant nuo kitų metų, kai nustatytas užkrėtimas bakterija:
52.1.1.1. naikinami savaime augantys augalai bei stiebagumbiai ar kiti natūraliai aptikti bakterijos augalai šeimininkai;
52.1.1.2. jokie stiebagumbiai, augalai, sėklos ar kiti natūraliai aptikti bakterijos augalai šeimininkai, ar kiti augalai, keliantys bakterijos išlikimo ar paplitimo pavojų, negali būti sodinami, kol lauke bus aptinkami savaime augantys bulvių augalai ar stiebagumbiai mažiausiai dvejus auginimo metus paeiliui;
52.1.1.3. pirmąjį bulvių auginimo sezoną, praėjus 52.1.1 papunktyje apibūdintam laikotarpiui, sodinamos oficialiai sertifikuotos sėklinės bulvės, skirtos maistui ar pašarui, atliekant oficialius tyrimus;
52.1.2. lauke, kuris laikomas užkrėstu, ketverius auginimo metus praėjus tiems metams, kuriais buvo nustatytas užkrėtimas:
52.1.2.1. taikomos priemonės naikinant savaime sudygstančius bulvių augalus ir stiebagumbius bei kitus natūraliai aptiktus bakterijos augalus šeimininkus;
52.1.2.2. laukas paliekamas pūdymuoti arba paverčiamas nuolatine ganykla, kuri dažnai visiškai nupjaunama arba intensyviai ganoma;
52.1.3. laukuose, kurie ribojasi su užkrėsta teritorija:
52.1.3.1. auginimo metais, einančiais po tų metų, kuriais buvo nustatytas užkrėtimas:
52.1.3.1.1. negali būti sodinami ar sėjami jokie augalai, sėklos ar bakterijos augalai šeimininkai. Priemonės turi būti taikomos naikinant savaime augančius bulvių augalus bei bakterijos augalus šeimininkus;
52.1.3.1.2. gali būti sodinamos tik oficialiai sertifikuotos sėklinės bulvės, skirtos maistui ar pašarui, su sąlyga, jog savaime sudygstančių bulvių augalų ir kitų natūraliai aptiktų bakterijos augalų šeimininkų nėra;
52.1.3.1.3. mažiausiai dvejus auginimo metus po metų, nurodytų 52.1.3.1 papunktyje, sodinamos tiktai oficialiai sertifikuotos sėklinės bulvės sėklai, maistui ar pašarui;
52.1.3.1.4. kiekvienais auginimo metais, minėtais 52.1.3.1 ir 52.1.3.1.3 papunkčiuose, taikomos priemonės naikinant savaime sudygstančius bulvių augalus ir kitus natūraliai aptiktus bakterijos augalus šeimininkus, atliekant oficialius tyrimus;
52.1.4. nustačius užkrėtimą, kiekvienais auginimo metais, iki pirmojo leistino bulvių derliaus sezono imtinai, lauke, kuriame buvo nustatytas užkrėtimas, naudota technika ir sandėliavimo įranga turi būti valoma ir dezinfekuojama;
52.1.5. tose gamybos sistemose, kur galima visiškai pakeisti auginimo terpę:
52.1.5.1. jokie augalai ar sėklos nesodinami ir nesėjami, kol gamybos įmonėje nebus taikytos priemonės išnaikinti bakteriją bei pašalinti visą bulvių ar kitą Solanaceae medžiagą, visų pirma pakeičiant auginimo terpę ir valant bei dezinfekuojant gamybos įmonę bei visą įrangą;
52.2. paženklintoje teritorijoje tarnyba:
52.2.1. kontroliuoja:
52.2.1.1. mažiausiai tris auginimo sezonus po nustatyto užkrėtimo:
52.2.1.1.1. vietas ir patalpas, kur auginami, laikomi ir apdorojami bulvių stiebagumbiai, taip pat patalpas, kur dirbama pagal sutartį samdytomis bulvių apdorojimo mašinomis;
54. Draudžiamas bakterijos laikymas, išskyrus žemės ūkio ministro nustatytus atvejus mokslo, tyrimų ir selekcijos tikslais, jeigu tai netrukdys bakterijos kontrolei ir nesukels jos išplitimo pavojaus.
V. INFORMACIJOS PERDAVIMAS UŽSIENIO VALSTYBĖMS IR TARPTAUTINĖMS ORGANIZACIJOMS
56. Tarnyba privalo kaupti informaciją apie diagnozuotus bakterijos židinius, taikyti fitosanitarijos priemones, kol nebus nustatyta, kad bakterijos židinys visiškai sunaikintas.
57. Tarnyba kasmet privalo pranešti Europos ir Viduržemio jūros augalų apsaugos organizacijai, ES šalims narėms ir Europos Komisijai apie oficialias priemones, taikytas aptikus bakteriją, taip pat fitosanitarinio registro objektų, kuriems šios priemonės taikytos, registracijos numerius.
58. Atsiradus bakterinio užkrėtimo pavojui, tarnyba privalo nedelsdama pranešti Europos ir Viduržemio jūros augalų apsaugos organizacijai, ES šalims narėms ir Europos Komisijai apie bet kokį užkrėtimą bakterija ir zonos paženklinimo detales.
59. Apie atliktų tyrimų rezultatus tarnyba kartą per metus praneša Europos ir Viduržemio jūros regiono augalų apsaugos organizacijai, ES šalims narėms ir Europos Komisijai.
VI. SUNAIKINIMO TVARKA
61. Nustačius bakterijos buvimą bulvių produkcijoje, sėklinėms ir maistinėms bulvėms taikomas:
62. Saugyklų, kur laikomos užkrėstos bakterija bulvės, įrenginių, transporto priemonių dezinfekavimui turi būti naudojamos medžiagos, turinčios savo sudėtyje amonio, chloro, dioksido, jodo ir fenolio grupes, galima panaudoti 2-4 proc. vario sulfato ar formalino tirpalus.
Bulvių žiedinio puvinio fitosanitarinės kontrolės ir fitosanitarijos priemonių taikymo tvarkos priedas
CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. SEPEDONICUS (SPIECKERMANN ET KOTTHOFF, 1914) DAVIS, GILLASPIE, VIDAVER ET HARRIS, 1984 LABORATORINĖS EKSPERTIZĖS SCHEMOS, REAGENTŲ, MITYBINIŲ TERPIŲ SUDĖTIS, DAŽYMAS, LĄSTELIŲ POPULIACIJOS
NUSTATYMO METODAI, TESTAI
1 pav. Mėginio ir fosfatinio valgomosios druskos buferinio tirpalo kontrolinė skaidrė
2 pav. Teigiama kontrolinė skaidrė
3 pav. Paguldytas vazonėlis
1 schema. Tyrimų rezultatas
| Bandymas |
Bakterija |
| O/F |
inertiškas arba silpnai oksiduotas |
| Oksidazė |
– |
| Katalazė |
+ |
| Nitratų redukcija |
– |
| Ureazės veikla |
– |
| H2S produkavimas |
– |
| Indolo produkavimas |
– |
| Citrato panaudojimas |
– |
| Krakmolo hidrolizė |
– arba silpna |
| Augimas esant 37°C |
– |
| Augimas 7% NaCl |
– |
| Želatinos hidrolizė |
– |
| Eskulino hidrolizė |
+ |
| Rūgštis iš: |
|
| - glicerolio |
– |
| - laktozės |
– arba silpna |
| - ramnozės |
– |
| - salicino |
– |
MACERAVIMO SKYSČIO SUDĖTIS, REKOMENDUOJAMA PAGAL LELLIOTTĄ IR SELLARĄ (1976 m.)
| D C silikoninis priešputis MS A mišinys (Hopkins et. ir Williams Ltd, Kat. Nr. 9964-25, Chadwell Heath, Eseksas, Anglija) |
10 ml |
| Lubrol W drožlės (ICI Ltd) |
0,5 g |
| Tetranatrio pirofosfatas |
1 g |
| 0,05 M fosfatinis buferinis druskos tirpalas pH 7,0 |
1 l |
0,05 M fosfatinis buferinis druskos tirpalas pH 7,0
Šį buferį galima naudoti gumbų audiniams maceruoti
| Na2HPO4 |
4,26 g |
| KH2PO4 |
2,72 g |
| NaCl |
8,0 g |
| Distiliuotas vanduo, iki |
1 l |
0,01 M fosfatinis buferinis druskos tirpalas pH 7,2
Šis buferis naudojamas antiserumams atskiesti ir plauti IF skaidres
| Na2HPO4 12H2O |
2,7 g |
| Na2HPO4 2H2O |
0,4 g |
| NaCl |
8,0 g |
| Distiliuotas vanduo, iki |
1 l |
0,1 M fosfatinis buferinis glicerolis pH 7,6
Šis buferis naudojamas kaip pagrindas sustiprinti fluorescenciją IF teste
| Na2HPO4 12H2O |
3,2 g |
| Na2HPO4 2H2O |
0,15 g |
| Glicerinas |
50 ml |
| Distiliuotas vanduo |
100 ml |
Kristalvioletino tirpalas
2 g kristalvioletino ištirpinama 20 ml 95% etanolio. 0,8 g amonio oksalato ištirpinama 80 ml distiliuoto vandens. Šie du tirpalai sumaišomi.
Liugolio jodas
| Jodas |
1 g |
| Kalio jodidas |
2 g |
| Distiliuotas vanduo |
300 ml |
Kietosios medžiagos grūstuvu sutrinamos kartu. Supilama į vandenį ir uždarame inde išmaišoma, kad ištirptų.
Safranino kontradažymo tirpalas
Pradinis tirpalas:
| Safraninas O |
2,5 g |
| 95 % etanolis |
100 ml |
Sumaišyti ir laikyti.
Praskiesti: 1:10 darbiniam tirpalui gauti.
Dažymo procedūra
Paruošti tepinėliai išdžiovinami ore, tuomet pakaitinti fiksuojami. Skaidrė vienai minutei pamerkiama į kristalvioletino tirpalą, greitai perliejama vandeniu iš čiaupo, po to minutei pamerkiama į Liugolio jodą. Vėl perliejama vandeniu iš čiaupo ir sausai išdžiovinama. Tada išblukinama 95 % etanoliu, lašinant jį, iki spalva nustos blukti, arba atsargiai maišant pamerkiama 30 s. Vėl nuplaunama vandeniu iš čiaupo ir sausai išdžiovinama. Pamerkiama į safranino tirpalą 10 s. Paskutinį kartą nuplaunama vandeniu iš čiaupo ir sausai išdžiovinama.
Gramteigiamos bakterijos nusidažo rausvai mėlyna spalva, gramneigiamos bakterijos nusidažo rausvai raudona spalva.
IMUNOFLUORESCENCINIŲ-TEIGIAMŲ LĄSTELIŲ POPULIACIJOS NUSTATYMAS
Daugiataškės skaidrės langelio paviršiaus plotas (S)
Objektyvo lauko paviršiaus plotas(-ai)
d apskaičiuojamas tiesiogiai išmatuojant arba pagal pateiktą formulę:
|
|
, i = lauko koeficientas (priklauso nuo okuliaro tipo ir kinta nuo 8 iki 24, K = |
| okuliaro koeficientas (1 arba 1,25), G = objektyvo didinimas (100x, 40x ir t. t.). |
|
Suskaičiuojamas tipiškų fluorescuojančių ląstelių skaičius lauke (c).
Apskaičiuojamas tipiškų fluorescuojančių ląstelių skaičius langelyje (C).
Apskaičiuojamas tipiškų fluorescuojančių ląstelių skaičius ml granulėje (N).
|
|
, y = granulės tūris langelyje, F = granulės skiedimo koeficientas.
|
Mitybinis agaras
Difco bacto arba jam analogiškas mitybinis agaras sterilizuojamas pagal rekomenduojamas gamintojo koncentracijas distiliuotame vandenyje autoklave 121°C 15 min.
Mitybinis gliukozės agaras
Difco bacto arba jam analogiškas mitybinis agaras, kurio sudėtyje yra 1% D(+) gliukozės (monohidrato), sterilizuojamas autoklave 20 min. 115°C temperatūroje.
Mielių-peptono-gliukozės agaras
| Difco bacto arba jam analogiškas mielių ekstraktas (Nr. 0127) |
5 g |
| Difco bacto arba jam analogiškas peptonas (Nr. 0118) |
5 g |
| D (+) gliukozė (monohidratas) |
10 g |
| Difto bacto arba jam analogiškas išgrynintas agaras (Nr. 0560) |
15 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 l |
Sterilizuojama 0,5 litro tūrio terpes autoklave 20 min. 115°C temperatūroje.
Mielių ekstrakto mineralinių druskų terpė
| Difco bacto arba jam analogiškas mielių ekstraktas |
2,0 g |
| D (+) gliukozė (monohidratas) |
2,0 g |
| K2HPO4 |
0,25 g |
| KH2PO4 |
0,25 g |
| MgSO4.7H2O |
0,1 g |
| MgSO4.H2O |
0,015 g |
| NaCl |
0,05 g |
| FeSO4.7H2O |
0,005 g |
| Difto bacto arba jam analogiškas išgrynintas agaras |
18 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 l |
Sterilizuojama 0,5 l tūrio terpes autoklave 20 min. 115°C.
MAISTO MEDŽIAGŲ IR FIZIOLOGINIAI TESTAI BAKTERIJOMS NUSTATYTI
Visos terpės turi būti inkubuojamos 21°C temperatūroje ir tikrinamos po šešių dienų. Jeigu augimas nepastebimas, inkubuojama iki 20 d.
Oksidacijos ir fermentacijos testas (Hugh et. ir Leifson), 1953) – O/F-testas
Pagrindinė terpė:
| KCl |
0,2 g |
| MgSO4. 7H2O |
0,2 g |
| NH4H2PO4 |
1,0 g |
| Difco bacto arba jam analogiškas peptonas |
1,0 g |
| Difco bacto arba jam analogiškas išgrynintas agaras |
3,0 g |
| D (+) gliukozė (monohidratas) |
10,0 g |
| Bromtimolo mėlis |
0,03 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 l |
Terpė sumaišoma su 1N KOH ir nustatoma, kad pH būtų nuo 7,0 iki 7,2. Padalijama į Pyrex kultūrų auginimo mėgintuvėlius 16 mm x 100 mm (12 ml talpos) po 5 ml ir 10 ml. Sterilizuojama autoklave 10 min. 115°C temperatūroje. Kiekvienai kultūrai užsėjami 5 ml ir 10 ml mėgintuvėliai. Aseptiškai įdedama 1 – 2 ml sterilaus skysto parafino į 10 ml mėgintuvėlį. Inkubuojama.
Teigiama reakcija:
| Mėgintuvėlis |
Spalva |
Aiškinimas |
|
|
Geltona |
Fermentacija |
| Uždaras |
Geltona |
|
| Atviras |
|
Oksidacija |
| Uždaras |
Mėlynai-žalia |
|
| Atviras |
|
Oksidacija arba inertiška |
| Uždaras |
Mėlynai-žalia |
|
Oksidazės testas (Kovacsas, 1956 m.)
Kovacso oksidazės reagentas – 1% vandeninis tetrametil-parafenilendiamino-dihidrochlorido (BDH Nr. 30386) tirpalas distiliuotame vandenyje. Šį reagentą reikia pasigaminti šviežiai po 1 ml arba galima laikyti rudo stiklo butelyje 5°C temperatūroje nuo 1 iki 4 savaičių.
Reagento lašas užlašinamas ant filtrinio popieriaus, esančio švarioje Petri lėkštelėje. Naudojant platininę kilpelę, nedelsiant nutrinama šiek tiek tiriamosios kultūros nuo mitybinio agaro.
Teigiama reakcija: nusidažo purpurine spalva per 10 s. Kultūros, nusidažančios per 10 – 30 s, yra silpnai teigiamos.
Ypač svarbu naudoti platininę kilpelę ir mitybinio agaro kultūras, kadangi geležies pėdsakai arba didelis cukraus kiekis auginimo terpėje gali parodyti neteisingus teigiamus rezultatus.
Rūgšties gamyba iš laktozės, ramnozės, salicino, glicerolio
Paruošiama Hugh ir Leifson’o oksidacinė-fermentinė terpė be gliukozės. Padalijama į 5 ml tūrius mėgintuvėliuose. Sterilizuojama autoklave 10 min. 115°C temperatūroje. Į išlydytą 45°C bazę aseptiškai įdedama 0,5 ml filtru sterilizuoto 10% vandeninio glicerolio, laktozės, ramnozės arba salicino tirpalų. Gerai išmaišoma.
Teigiama reakcija: spalvos pasikeitimas iš mėlynai žalios į geltoną rodo, kad gaminasi rūgštis.
Katalazės testas
Vandenilio peroksido lašas (30 %) užlašinamas ant švarios skaidrės. Padaroma emulsija, maišant kultūrą, sudėtą į platininę kilpelę.
Teigiama reakcija: deguonies burbuliukų susidarymas laše rodo katalazės buvimą.
Nitratų reduktazės veikla ir denitrifikacija (Bradbury, 1970 m.)
Kultūrinė terpė:
| KNO3 (be nitritų) |
1 g |
| Difco bacto arba jam analogiškas mielių ekstraktas |
1 g |
| K2HPO4 |
5 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 l |
Padalijama po 10 ml į 20 ml buteliukus. Sterilizuojama autoklave 15 min. 121°C temperatūroje.
Reagentas A:
| H2SO4 |
8 g |
| 5N acto rūgštis |
1 l |
Reagentas B:
| naftilaminas |
5 g |
| 5N acto rūgštis |
1 l |
Nitrato terpė užsėjama du kartus. Patikrinama po 10 ar 20 d., įlašinant vieną lašą Liugolio jodo, 0,5 ml reagento A ir 0,5 ml reagento B. Jeigu terpė neparausta, papildomai panaudojama 50 mg cinko miltelių. Stebima spalvos reakcija.
| Teigiama reakcija: |
Spalvos reakcija |
|
| 1 stadija |
2 stadija |
|
| Nitratas nesiredukuoja |
bespalvė |
raudona |
| Nitratas redukuojasi iki nitrito |
raudona |
- |
| (tik nitrato reduktazė) |
|
|
| Nitrato redukavimas labiau nei iki nitrito |
bespalvė |
bespalvė |
| (denitrifikacija – nitrato ir nitrito reduktazė) |
|
|
Ureazės gamyba (Lelliottas, 1966 m.)
Pagrindinė terpė:
| Oksoidinė karbamido agaro bazė (CM53) |
2,4 g |
| Distiliuotas vanduo |
95 ml |
Terpė sterilizuojama autoklave 20 min. 115°C temperatūroje. Išsilydžiusi bazė atvėsinama iki 50°C temperatūros ir aseptiškai pridedama 5ml filtru sterilizuoto 40% vandeninio karbamido tirpalo (oksoidas SR20). Gerai išmaišoma. Padalinama po 6 ml į sterilius mėgintuvėlius (16 x 100 mm) ir paguldoma nuožulniai, kad dugnas būtų užpildytas.
Teigiama reakcija: jeigu pasireiškia ureazės aktyvumas, geltonai oranžinė terpė įgauna vyšnios raudonumo arba fuksino rausvumo spalvą.
Citrato pasisavinimas (Christensen) (Skerman, 1967 m.)
Terpė:
| Citrato agaro bazė (Merck 2503) |
23 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 l |
Terpė sumaišoma ir ištirpinama kaitinant. Padalijama po 6 ml, kaip ir karbamido terpė. Sterilizuojama autoklave 15 min. 121°C temperatūroje ir paguldoma.
Teigiama reakcija: citrato pasisavinimą parodo terpės spalvos pasikeitimas iš oranžinės į raudoną.
Vandenilio sulfido gamyba (Ramamurthi, 1959 m.)
Terpė:
| Difco bacto arba jam analogiškas triptonas (Nr. 0123) |
10 g |
| K2HPO4 |
1 g |
| NaCl |
5 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 l |
Terpė ištirpinama ir padalijama po 6 ml į 16 x 100 mm mėgintuvėlius. Sterilizuojama autoklave 10 min. 115°C temperatūroje.
Švino acetato popierius (Merck 9511) užsėjamas ir steriliai pakabinamas nuo vamzdelio krašto. Pritvirtinama dangteliu. Inkubuojama iki 20 d.
Teigiama reakcija: H2S gamybą iš triptono parodo indikatorinio popieriaus nusidažymas juosvai ruda spalva.
Indolo gamyba (Ramamurthi, 1959 m.)
Terpė – kaip ir H2S testui.
Švino acetato popierius išimamas, įpilama 1 – 2 ml dietil-eterio ir švelniai pakratoma. Palaukiama (penkias minutes), iki atsiskirs sluoksniai. Į nuožulniai paverstą mėgintuvėlį atsargiai įdedama 0,5 ml Kovačo reagento (Merck 9293).
Teigiama reakcija: indolo buvimą parodo geltonojo sluoksnio tarp eterio ir vandeninių frakcijų nusidažymas raudona spalva.
Auginimas 37°C temperatūroje (Ramamurthi, 1959 m.)
Terpė:
| Difco bacto arba jam analogiška mitybinė terpė (Nr. 0003) |
8 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 l |
Terpė sumaišoma, ištirpinama ir padalijama po 6 ml į mėgintuvėlius. Sterilizuojama autoklave 15 min. 121°C temperatūroje. Užsėjama ir inkubuojama 37°C.
Teigiama reakcija: ieškoma augimo.
Auginimas 7% natrio chloride (Ramamurthi, 1959 m.)
Terpė:
| Difco bacto arba jam analogiškas mitybinis tirpalas |
8 g |
| NaCl |
70 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 l |
Terpė sumaišoma, ištirpinama ir padalijama po 6 ml į mėgintuvėlius. Sterilizuojama autoklave 15 min. 121°C temperatūroje.
Teigiama reakcija: ieškoma augimo.
Želatinos hidrolizė (Lelliottas, Billingas ir Haywardas, 1966 m.)
Terpė:
| Difco bacto arba jam analogiška želatina (Nr. 0143) |
120 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 l |
Terpė sumaišoma, ištirpinama kaitinant ir padalijama po 6 ml į mėgintuvėlius. Sterilizuojama autoklave 121°C temperatūroje 15 min.
Teigiama reakcija: želatinos suskystėjimas, netgi 30 min. laikant 5°C temperatūroje.
Krakmolo hidrolizė
Terpė:
| Difco bacto arba jam analogiškas mitybinis agaras (išlydytas) |
1 l |
| Difco bacto arba jam analogiškas tirpus krakmolas (Nr. 0178) |
2 g |
Terpė sumaišoma ir sterilizuojama autoklave 10 min. 115°C temperatūroje. Pripildomos lėkštelės. Užsėjama taškiniu būdu. Kai gerai paauga (nuo 10 iki 20 dienų), dalis augimo pašalinama ir praplaunama Liugolio jodu.
Teigiama reakcija: krakmolo hidrolizę parodo skaidrios zonos po arba aplink bakterijų augimą; likusi terpės dalis nusidažo purpurine spalva.
Eskulino hidrolizė (Sneathas ir Collinsas, 1974 m.)
Terpė:
| Difco bacto arba jam analogiškas peptonas |
10 g |
| Eskulinas |
1 g |
| Geležies III citratas (Merck 3862) |
0,05 g |
| Natrio citratas |
1 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 l |
Terpė išmaišoma, kad ištirptų, ir padalijama po 6 ml į mėgintuvėlius. Sterilizuojama autoklave 10 min. 115°C temperatūroje. Terpė yra skaidri, bet melsvai fluorescuojanti.
Teigiama reakcija: eskulino hidrolizę parodo nusidažymas ruda spalva ir fluorescencijos išnykimas. Tai galima patikrinti ultravioletine lempa.
______________