LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS
Į S A K Y M A S
DĖL ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO 2006 M. LIEPOS 25 D. ĮSAKYMO NR. 3D-303 „DĖL ŽALIO PIENO PIRMINIŲ KOKYBĖS RODIKLIŲ ĮVERTINIMO INSTRUKCIJOS PATVIRTINIMO“ PAPILDYMO
2006 m. gruodžio 4 d. Nr. 3D-472
Vilnius
Papildau Žalio pieno pirminių kokybės rodiklių įvertinimo instrukciją, patvirtintą Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2006 m. liepos 25 d. įsakymu Nr. 3D-303 „Dėl Žalio pieno pirminių kokybės rodiklių įvertinimo instrukcijos patvirtinimo“ (Žin., 2006, Nr. 85-3337) šiuo 79 punktu:
„79. Antibiotikų, turinčių beta-laktaminį žiedą, nustatymas Delvo-X-PRESS βL-II metodu (spartusis metodas).
79.1. Metodo esmė. Metodas pagrįstas tuo, kad naudojama atsekamoji medžiaga (angl. tracer), sudaryta iš receptorinių baltymų, išskirtų iš Bacillius stearothermophilus rūšies bakterijų, ir iš fermento – krienų peroksidazės. Tam tikras atsekamosios medžiagos kiekis sumaišomas su pieno mėginio kiekiu beta-laktamais padengtuose mėgintuvėliuose. Atsekamoji medžiaga reaguoja su beta-laktamais, jeigu jų yra mėginyje, o likusi laisva atsekamoji medžiaga reaguoja su beta-laktamais, kuriais padengti mėgintuvėliai. Pašalinus atsekamosios medžiagos ir beta-laktamų kompleksą plaunant, įpilamas spalvos ryškalas atsekamosios medžiagos likučiams, prisirišusiems prie beta-laktamų, kuriais padengti mėgintuvėliai, aptikti. Taip pat daroma ir su beta-laktamų etaloniniu mėginiu. Susidariusios spalvos intensyvumas atvirkščiai proporcingas beta-laktamų koncentracijai mėginyje. Automatiškai palyginamas pieno mėginių ir etaloninio mėginio spalvų intensyvumas ir nustatoma, rasta ar nerasta beta-laktamų likučių pieno mėginyje.
Šiuo metodu galima aptikti piene 0,002–0,004 µg/ml penicilino, 0,004–0,008 µg/ml ampicilino, amoksicilino ar ceftiofuro, 0,025–0,050 µg/ml oksacilino bei 0,030–0,060 µg/ml kloksacilino.
PASTABA Delvo-X-PRESS βL-II yra testas, skirtas tik antibiotikams, turintiems beta-laktaminį žiedą, karvių piene nustatyti.
79.2. Naudojama įranga ir priemonės:
79.2.1. ISRP darbo stotis (DSM, Nyderlandai), kurią sudaro:
79.2.1.2. automatinės temperatūros kontrolės mėgintuvėlių stovas A 7 mėginiams (etaloniniam mėginiui ir 6 pieno mėginiams) inkubuoti (64±0,2) °C temperatūroje;
79.2.1.4. automatinės greičio kontrolės (700 min-1) kratytuvas mėginiams A ir B stovuose sukratyti inkubavimo metu;
79.2.1.6. 7 kanalų skaitytuvas spalvai atpažinti esant 660 nm bangos ilgiui ir rezultatams palyginti su etaloninio mėginio rodikliais;
79.3. Naudojami reagentai ir medžiagos:
79.3.1. Delvo-X-PRESS βL-II rinkinys (DSM, Nyderlandai), kuriame yra:
79.3.1.1. mėgintuvėliai, padengti specialiais beta-laktamais – du maišeliai, pažymėti „T“, po 50 mėgintuvėlių;
79.3.1.2. atsekamoji medžiaga (angl. tracer) – buteliukas, pažymėtas „1“, (22,0±0,5) ml (buferinis fiziologinis ožkų serumo ir 4-amino-antipirino tirpalas, konservuotas timerozaliu, naudojamas kaip fermentus surišantis receptorinis baltymas);
79.3.1.3. etalonas – buteliukas, pažymėtas „S“ (cefalosporinas, 100 ppb buferiniame fiziologiniame tirpale, liofilizuotas);
79.3.1.4. etalono skiediklis – buteliukas, pažymėtas „D“, ((15,0±1,5) ml vandeninio tirpalo, konservuoto timerozaliu). Visas tūris skirtas liofilizuotam etalonui buteliuke „S“ praskiesti;
79.3.1.5. spalvos ryškalas – buteliukas, pažymėtas „2“, ((120,0± 1,0) ml vandeninio fermento tirpalo). PASTABA. Spalvos ryškalas turi būti laikomas tamsoje.
79.3.1.6. valiklis – buteliukas, pažymėtas „W“, 60 ml (koncentruotas buferinis tirpalas su gliceroliu, konservuotas benzalkonio chloridu);
79.4. Pasiruošimas tyrimui:
79.4.1. pieno mėginiai laikomi nuo 2 °C iki 8 °C temperatūroje ir ištiriami per 48 val. Gali būti laikomi ir sušaldyti, bet neturėtų būti atšildomi daugiau kaip vieną kartą;
79.4.2. Delvo-X-PRESS rinkinys laikomas nuo 2 °C iki 8 °C temperatūroje, nes aukštesnėje temperatūroje laikomi reagentai praranda savo aktyvumą (25 °C temperatūroje – po 2 savaičių, 40 °C temperatūroje – po 2 dienų). Kai rinkinys sunaudojamas per savaitę, nebūtina jį laikyti šaldytuve, tada prieš tyrimą reagentų pašildyti nereikia. Reikia vengti reagentų sušaldymo, nes gali padidėti stiklinių buteliukų dūžtamumas ir drėgmės koncentracija mėgintuvėliuose. Svarbu, kad mėgintuvėliai išliktų sausi;
79.4.3. rinkinys išimamas iš šaldytuvo valandą prieš tyrimą, kad reagentai ir beta-laktamais dengti mėgintuvėliai pasiektų kambario (15–25) °C temperatūrą. ISRP darbo stotis įjungiama 15 min. prieš darbo pradžią, kad kaitinimo blokas įšiltų iki reikiamos inkubacijai (64,0±0,2) °C temperatūros;
79.4.4. etalono tirpalas ruošiamas iš liofilizuoto etalono (buteliukas „S“) ir etalono skiediklio (buteliukas „D“). Plovimo skystis ruošiamas iš koncentruoto valiklio (buteliukas „W“), atskiedžiant jį dejonizuoto vandeniu santykiu 1: 49;
79.4.5. padengtų beta-laktamais mėgintuvėlių tyrimui reikia tiek, kiek tiriama pieno mėginių, ir vienas papildomas – etaloniniam mėginiui. Mėgintuvėliai sustatomi į stovą iš kairės į dešinę;
79.4.6. pieno mėginiai turi būti gerai sumaišyti, vengti putų ir oro burbuliukų susidarymo, nes nuo to priklauso mėginio kiekio įtraukimo į pipetę tikslumas. Tiriamieji mėginiai ir etaloninis mėginys turi būti panašios temperatūros. Todėl, tiriant šaltus pieno mėginius, geriau naudoti ir šaltą etalono tirpalą.
79.5. Tyrimo eiga:
79.5.1. į pirmą mėgintuvėlį, pažymėtą „S“, įpilama 200 µl etaloninio tirpalo. Į kitus mėgintuvėlius, pažymėtus pieno mėginių numeriais, įpilama po 200 µl kiekvieno pieno mėginio. Į visus mėgintuvėlius iš buteliuko, pažymėto „1“, įpilama po 200 µl atsekamosios medžiagos tirpalo. Patartina etalono ir atsekamosios medžiagos tirpalus pilti į mėgintuvėlius prieš pat tyrimą;
79.5.2. mėgintuvėliai 3 min. inkubuojami (64±0,2) °C temperatūroje darbo stoties A (viršutinėje) eilėje. Šio inkubavimo metu mėgintuvėlių turinys sukratomas kratymo įtaisu;
79.5.3. po inkubavimo pieno ir atsekamosios medžiagos mišinys iš mėgintuvėlių išpilamas. Mėgintuvėliai išplaunami valikliu, pripilant valiklio iki mėgintuvėlio viršaus, o po to jį išpilant. Plovimo procedūra pakartojama dar du kartus;
79.5.4. į kiekvieną mėgintuvėlį įpilama po 1 ml spalvos ryškalo iš buteliuko, pažymėto „2“. Laiko trukmė tarp tirpalo įpylimo į pirmą ir paskutinį mėgintuvėlį negali viršyti 10 s. Įpylus spalvos ryškalą, mėgintuvėliai įstatomi į darbo stoties B (apatinę) eilę ir kambario temperatūroje kratomi 3 min.;
79.6. Rezultatų vertinimas:
79.6.1. po 3 min. ISRP darbo stotis automatiškai interpretuoja rezultatus. Stotis pateikia atsakymą skaičiais arba žinute:
79.6.1.1. skaičiai 00 ir didesni (+01, +02 ir t. t.) arba žinutės +, + + ir + + + reiškia, kad pieno mėginyje yra beta-laktaminį žiedą turinčių antibiotikų likučių;
79.6.2. darbo stotis papildomai atspausdina rezultatus su išsamia ataskaita apie pieno mėginį. Rezultatai negali būti naudojami beta-laktamų kiekiui nustatyti, nes tai priklauso nuo antibiotikų tipo ir tyrimo sąlygų. Todėl vieno ir to paties mėginio, tirto su kitais mėginiais ar pakartotinai, tyrimo rezultatai, išreikšti skaičiais, skiriasi. Nors pakartotinių tyrimų rezultatai būna skirtingi, jie atitinka vertinimo „yra antibiotikų likučių“ arba „nėra antibiotikų likučių“ ribas.
PASTABA. Testas labai jautrus beta-laktaminį žiedą turintiems antibiotikams, todėl reikia vengti bet kokio užkrėtimo šiomis medžiagomis. Prieš tyrimą būtina plauti rankas ir stalo paviršių muilu ir vandeniu bei nusausinti švariu medžiaginiu ar popieriniu rankšluosčiu.
Turi būti vengiama reagentų (atsekamosios medžiagos, spalvos ryškalo) užkrėtimo pieno mėginiais per pipetę.
Testo rinkinys neturi būti naudojamas pasibaigus galiojimo terminui, nurodytam ant pakuotės.
Reagentai ar mėgintuvėliai negali būti sukeisti tarp skirtingų testo rinkinių komplektų. Likusios rinkinio medžiagos turi būti išmestos.“