LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO

 

Į S A K Y M A S

DĖL ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO 2002 M. RUGSĖJO 20 D. ĮSAKYMO NR. 356 „DĖL SAUSUMOS GYVŪNŲ, ŽUVŲ IR KITŲ JŪROS GYVŪNŲ PRODUKTŲ NUSTATYMO BEI ĮVERTINIMO PAŠARUOSE MIKROSKOPINĖS ANALIZĖS METODO TECHNINIO REGLAMENTO PATVIRTINIMO“ PAKEITIMO

 

2004 m. birželio 23 d. Nr. 3D-370

Vilnius

 

 

Atsižvelgdamas į 2003 m. gruodžio 23 d. Komisijos direktyvos 2003/126/EB dėl gyvūninės kilmės sudedamųjų dalių nustatymo analizės metodo, taikomo valstybinei pašarų kontrolei, nuostatas:

1. Pakeičiu Sausumos gyvūnų, žuvų ir kitų jūros gyvūnų produktų nustatymo bei įvertinimo pašaruose mikroskopinės analizės metodu techninį reglamentą, patvirtintą Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2002 m. rugsėjo 20 d. įsakymu Nr. 356 „Dėl Sausumos gyvūnų, žuvų ir kitų jūros gyvūnų produktų nustatymo bei įvertinimo pašaruose mikroskopinės analizės metodu techninio reglamento patvirtinimo“ (Žin., 2002, Nr. 94-4062) ir išdėstau jį nauja redakcija (pridedama).

2. Šis įsakymas įsigalioja nuo 2004 m. liepos 1 d.

 

 

 

ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS                                                                   JERONIMAS KRAUJELIS

 

SUDERINTA

SUDERINTA

Nacionalinės veterinarijos laboratorijos

Lietuvos veterinarijos akademijos

direktorius

rektorius

Jonas Milius

Henrikas Žukauskas

2004 m. birželio 15 d.

2004 m. birželio 21 d.

 

 

PATVIrtinta

Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro

2002 m. rugsėjo 20 d. įsakymu Nr. 356

(Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro

2004 m. birželio 23 d įsakymo Nr. 3D-370

redakcija)

 

Sausumos gyvūnų, žuvų ir kitų jūros gyvūnų produktų sudedamųjų dalių pašaruose nustatymo ir įvertinimo mikroskopinės analizės metodu techninis reglamentas

 

Parengtas pagal 2003 m. gruodžio 23 d. Komisijos direktyvą 2003/126/EB dėl gyvūninės kilmės sudedamųjų dalių nustatymo analizės metodu, taikomo valstybinei pašarų kontrolei.

 

I. Bendrosios nuostatos

 

1. Sausumos gyvūnų, žuvų ir kitų jūros gyvūnų produktų nustatymo bei įvertinimo pašaruose mikroskopinės analizės metodu techninis reglamentas (toliau – techninis reglamentas) apibrėžia sausumos gyvūnų, žuvų ir kitų jūros gyvūnų produktų sudedamųjų dalių (toliau – gyvūnų sudedamosios dalys) pašaruose nustatymą ir įvertinimą mikroskopinės analizės metodu.

2. Jei gyvūnų sudedamosioms dalims pašaruose įvertinti ir nustatyti taikomi kiti metodai negu nurodyta šio techninio reglamento 1 punkte, tai nurodoma atitikties deklaracijoje.

3. Šio techninio reglamento nuostatos privalomos pašarų kokybės valstybinės kontrolės institucijai ir pašarų tyrimo laboratorijoms, nustatančioms ir įvertinančioms gyvūnų sudedamąsias dalis oficialiuose pašarų mėginiuose.

4. Pašarų tyrimo laboratorijų, nustatančių ir įvertinančių gyvūnų sudedamąsias dalis oficialiuose pašarų mėginiuose, darbuotojai privalo periodiškai tobulinti savo kvalifikaciją, dalyvauti tikrinant analizės metodų atlikimą tikrinime.

 

II. Sąvokos, terminai ir sutrumpinimai

 

5. Šiame techniniame reglamente vartojamos sąvokos:

Sedimentacija – sunkesnių pašaro dalelių nusodinimas reagentais (ar kitomis specialiomis medžiagomis).

Koncentruotas sedimentas – sunkesnių pašaro dalelių nuosėdos.

Gyvūnai – sausumos šiltakraujai gyvūnai (galvijai, kiaulės, avys, arkliai, ožkos ir kiti žinduoliai), visų rūšių paukščiai, sausumos bei vandenų šaltakraujai gyvūnai žuvys, kiti jūros bei kitų vandenų ir sausumos gyvūnai.

Gyvūnų sudedamosios dalys – kaulai, mėsa, oda, kraujas, žvynai, plaukai ir kt.

Gyvūniniai produktai – mėsos ir kaulų, kaulų, žuvų, kraujo, plunksnų ir kiti iš gyvūnų pagaminti produktai.

Kitos šiame techniniame reglamente vartojamos sąvokos turi tą pačią reikšmę kaip Lietuvos Respublikos pašarų įstatyme (Žin., 2000, Nr. 34-952; 2004, Nr. 73-2541) ir Pašarų klasifikatoriuje, patvirtintame Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 205 (Žin., 2000, Nr. 69-2064).

6. Mikroskopinės analizės metodo aprašymuose vartojami cheminių junginių trivialieji pavadinimai ir juos atitinkantys IUPAC terminai:

6.1. chloralio hidratas – 2,2,2-trichloretan-1,1-diolis (CCl3CH(OH)2);

6.2. reagento tirpalas cistino turinčioms dalelėms nustatyti – švino acetato (CH3(COOH)2Pb) ir natrio hidroksido (NaOH) mišinys;

6.3. jodo arba kalio jodido tirpalas – J2 arba KJ;

6.4. parafino aliejus (C18-C35);

6.5. tetrachloretilenas – perchloretilenas (Cl2C=CCl2).

Mikroskopinės analizės metodo aprašymuose vartojama santrumpa:

m/v – masės ir tūrio santykis.

 

III. MėginiO paruošimas mikroskopinei analizei

 

7. Mikroskopinei analizei skirto pašaro mėginio, paimto vadovaujantis Pašarų mėginių paėmimo ir paruošimo techninio reglamento, patvirtinto Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 208 (Žin., 2000, Nr. 60-1786) nuostatomis, kiekis turi būti:

7.1. homogeniškas, neužterštas, o jo kokybės rodikliai turi atitikti tiriamąjį pašarą;

7.2. tiriamas naudojant analitiškai grynus reagentus, jei analizės metode nenurodyta kitaip;

7.3. tiriamas nurodytais tirpalo skiedikliais. Analizės metode nenurodžius tirpalo skiediklio, suprantama, kad tai – vanduo. Vanduo gali būti demineralizuotas ar išgrynintas;

7.4. tiriamas (sveriamas) kalibruotais prietaisais.

 

IV. Mikroskopinė mėginio analizė

 

8. Gyvūnų sudedamosios dalys pašaruose įvertinamos bei nustatomos taikant šio techninio reglamento priede nurodytą mikroskopinės analizės metodą.

______________

 

Sausumos gyvūnų, žuvų ir kitų jūros gyvūnų produktų sudedamųjų dalių pašaruose nustatymo ir įvertinimo mikroskopinės analizės metodu techninio reglamento

priedas

 

mikroskopinės analizės metodAS

 

Tikslas bei taikymo sritis

1. Šiuo metodu yra aptinkami, identifikuojami bei įvertinami gyvūnų arba atskirų jų kūno dalių perdirbti produktai pašaruose. Gyvūnų sudedamosioms dalims pašaruose nustatyti ir įvertinti gali būti taikomi ir kiti pripažinti ar mikroskopinį tyrimą papildantys metodai. Norint identifikuoti gyvūninių sudedamųjų dalių turinį, gali būti atliekami riebalų ar lajaus tyrimai (9 punktas)

Tikslumas

2. Atsižvelgiant į gyvūnų sudedamųjų dalių struktūrą, gali būti nustatomi labai maži jų kiekiai pašaruose (<0,1 %).

Metodo esmė

3.tyrimui naudojamas pašaro mėginys turi atitikti techninio reglamento 7 punkto reikalavimus. Jame turi būti ne daugiau kaip 14 % drėgnio. Esant didesniam drėgnio kiekiui, mėginys turi būti atitinkamai paruošiamas: džiovinamas ar kietinamas (sutirštinamas). Riebalams ar lajui tirti – taikomas apdorojimas, nurodytas šio metodo 9 punkte. Gyvūnų sudedamosios dalys nustatomos pagal tipinius, mikroskopu atpažįstamus požymius: raumenų skaidulos ir kitas mėsos dalelės, taip pat kremzlių, kaulų, ragų, plaukų, šerių, pleiskanų, kraujo, plunksnų, kiaušinių lukštų, žuvų kaulų, žvynų dalelės. Tiriama išsijota frakcija (6.1 p.) Bei koncentruotas sedimentas (6.2 p.).

Reagentai

4. Naudojami tokie reagentai:

4.1. Ryškinamieji reagentai:

4.1.1.   Chloralio hidratas, (vandeninis 60 % (m/v);

4.1.2.   Šarmas (naoh 2,5 % m/v arba koh 2,5 % m/v) sieto frakcijai;

4.1.3.   Parafino aliejus ar glicerolis (klampumas 68-81) sedimentams stebėti mikroskopu;.

4.2.    plovimo medžiagos:

4.2.1.   96 % alkoholis;

4.2.2.   Acetonas.

4.3.    Koncentravimo medžiaga - tetrachloretilenas, (q=1,62 ).

4.4.    dažomieji reagentai:

4.4.1.   Jodo arba kalio jodido tirpalas (2 g kalio jodido ištirpinami 100 ml vandens nuolat purtant pridedama 1 g jodo);

4.4.2.   Raudonasis alizarinas (2,5 ml 1 m vandenilio chlorido atskiedžiama 100 ml vandens ir į šį tirpalą įdedama 200 mg raudonojo alizarino);

4.4.3.   cistino reagentas (švino acetato 2 g, natrio hidroksidas 10 g/100 ml vandens);

4.4.4.   Jodas ir kalio jodo tirpalas (ištirpinamas 70 % etanolio);

4.5       Balinamasis reagentas komercinis natrio hipochlorido tirpalas (9,6 % aktyviojo chloro).

Prietaisai ir priemonės

5. Naudojami tokie prietaisai ir priemonės:

5.1. Analitinės svarstyklės (0,01 g tikslumo, o koncentruotiems sedimentams 0,001 g);

5.2. Smulkinimo priemonės (grūstuvė, malūnėlis, ypač pašarams, turintiems > 15 % riebalų, tirti);

5.3. Sietai su kvadratinėmis 0,5 mm dydžio akutėmis;

 

5.4. Dalijamasis piltuvas ar sedimentams nusodinti menzūra kūginiu dugnu;

5.5. Stereomikroskopas (didinamoji geba iki 40 kartų);

5.6. Standartiniai laboratoriniai stiklo indai.

Visa įranga kruopščiai išvaloma. Dalijimo piltuvėliai ir stikliniai indai plaunami plovimo mašinoje. Sietai valomi kietų šerių šepečiu.

Darbo eiga

6. Granuliuoto pašaro mėginys išsijojamas, kai abi frakcijos tiriamos atskirai. Pasveriama ne mažiau kaip 50 g tiriamojo pašaro mėginio. Jei būtina, mėginys, priklausomai nuo jo struktūros, atitinkamomis priemonėmis, susmulkinamas (sumalamas arba sutrinamas) (5.2 punktas). Po to paruoštas jis skiriamas į dvi ne mažesnes kaip 5 g dalis. Viena mėginio dalis sijojama (6.1 punktas), kita dalis naudojama koncentruotai sedimentacijai gauti (6.2 punktas). Gyvūnų sudedamosioms dalims nustatyti tiriamojo pašaro mėginys spalvinamas dažais (6.3 punktas). Gyvūninių baltymų prigimčiai ir dalelių kilmei nustatyti naudojama sprendimų paramos sistema, pvz. ARIES, ir dokumentais patvirtinti reprezentaciniai mėginiai. 6.1. Gyvūnų sudedamųjų dalių nustatymas tiriant išsijotas frakcijas 5 g mėginio sijojama sietais (5.3 punktas) į ne mažiau kaip 2 frakcijas. Nusijota tiriamojo pašaro mėginio frakcija, kurios dalelės yra didesnės kaip 0,5 mm (arba atitinkama šios frakcijos dalis) yra paskleidžiama ant objektinio stiklelio ir tiriama stereomikroskopu (5.6 punktas), naudojant įvairų objektyvo didinimą gyvūnų sudedamosioms dalims nustatyti.

6.2. Gyvūnų sudedamųjų dalių nustatymas tiriant koncentruotą sedimentą

Į nusodinamąjį piltuvėlį ar menzūrą pripilama ne mažiau kaip 5 g (0,01 g tikslumu) tiriamojo pašaro ir ne mažiau kaip 50 ml tetrachloretileno tirpalo (4.3 punktas). Gautas turinys kelis kartus sumaišomas arba suplakamas:

jei naudojamas uždaras dalijamasis piltuvas, sedimentams atskirti mėginys paliekamas ne mažiau 3 min. nusistovėti. Pakartotinai papurtomas ir vėl ne mažiau kaip 3 min. paliekamas nusistovėti;

jei naudojama atvira menzūra, sedimentams atskirti mėginys paliekamas nusistovėti ne mažiau kaip 5 min.

Koncentruoto sedimento frakcija išdžiovinama, pasveriama (0,001 g tikslumu). Visa išdžiovinta koncentruoto sedimento frakcija arba jos dalis tiriama stereomikroskopu (5.4 punktas) bei praleidžiančiu arba poliarizuotos šviesos mikroskopu (5.5 punktas) kaulų sudedamosioms dalims nustatyti.

6.3. Ryškinamųjų medžiagų bei dažomųjų reagentų naudojimas

Gyvūnų sudedamosioms dalims nustatyti naudojamos specialios ryškinamosios medžiagos bei dažomieji reagentai.

 

Chloralio hidratas (4.1.1 punktas)

Atsargiai kaitinant, ląstelių struktūros aiškiai matomos, nes krakmolo grūdeliai yra želatinizuojami ir pašalinamas nepageidaujamas ląstelių turinys

Šarmas (4.1.2 punktas)

Raumenų skaiduloms, plaukams ir kitoms keratino struktūroms aptikti naudojamas natrio ir kalio hidroksidas

Parafino aliejus ir glicerolis (4.1.3 punktas)

Kaulų sudedamosios dalelės geriau atpažįstamos, nes kaulinio audinio ertmėse būna likę oro ir dėl to išryškėja nuo 5 iki 15 µm dydžio juodos dėmelės

Jodo arba kalio jodido tirpalas (4.4.1 punktas)

Naudojamas krakmolui (atsiranda mėlynai violetinė spalva) bei baltymams (atsiranda geltonai oranžinė spalva) nustatyti. Jei būtina, šis reagentas gali būti skiedžiamas

Raudonojo alizarino tirpalas (4.4.2 punktas)

Sedimentai (6.2 punktas) supilami į stiklinį sūkurinį vamzdelį ir du kartus praplaunami 5 ml alkoholiu (4.2.1 punktas), minutę paliekama nusistovėti, nupilama ir išdžiovinama. Išdžiovintas sedimentas balinamas 1 ml kalio hidrochloridu (4.5 punktas) (reakcija - ne trumpesnė kaip 10 min.), daugiau kaip du kartus sukūriniu būdu perplaunamas vandeniu, 2-3 minutes paliekama nusistovėti, vanduo ir jame plaukiojančios dalelės nupilamos. Priklausomai nuo vamzdelyje esančio sedimento kiekio, įlašinama nuo 2 iki 10 daugiau lašų raudonojo alizarino tirpalo, gautas mišinys supurtomas ir kelias sekundes paliekama vykti reakcijai. Nudažyti sedimentai du kartus sukūriniu būdu 5 ml alkoholiu (4.2.1 punktas) ir kartą acetonu (4.2.2 punktas) praplaunami, minutę paliekami nusistovėti, nupilami ir likęs sedimentų kiekis išdžiovinamas. Raudonojo alizarino tirpalas sedimente kaulus, žuvų kaulus ir žvynus nudažo raudona ir rožine spalva

Reagentas cistinui nustatyti (4.4.3 punktas)

Atsargiai kaitinant, cistino turinčios dalelės (plaukai, plunksnos ir kt.) tampa juodai rudos spalvos

 

6.4. Žuvų miltų pašaruose aptikimo tyrimas

Tiriama ne mažiau kaip po vieną objektinį stiklelį su smulkiąja sieto ir sedimento frakcija praleidžiančios arba poliarizuotos šviesos mikroskopu pagal šio metodo 6.1 ir 6.2 punktus.

7. Skaičiavimas ir vertinimas

Gyvūninių produktų kiekis skaičiuojamas tuo atveju, kai tiriamajame pašare randama kaulų fragmentų. Mikroskopu sausumos šiltakraujų gyvūnų kaulų fragmentai atskiriami nuo įvairių tipų žuvies kaulų, remiantis tipine kaulų porų struktūra bei išsidėstymu. Gyvūnų sudedamųjų dalių kiekis tiriamajame mėginyje nustatomas atsižvelgus į:

nustatytą kaulų dalelių kiekį (svorį proc.) koncentruoto sedimento frakcijoje;

kaulų kiekį (svorį proc.) gyvūniniuose produktuose.

Vieno pašaro mėginio tyrimas turi būti kartojamas ne mažiau kaip 3 kartus, kiekvieną kartą tiriant ne mažiau kaip 5 objektinio stiklelio laukelius. Pašaro mėginio koncentruoto sedimento frakcijoje be gyvūnų bei žuvų kaulų fragmentų paprastai nustatomos ir kitos didelę molekulinę masę turinčios dalelės, pvz., mineralinių medžiagų, smėlio, sumedėjusių augalų dalys ir pan.

7.1. Kaulų dalelių kiekio apskaičiavimas koncentruoto sedimento frakcijoje:

sausumos gyvūnų kaulų kiekis proc.=   ;

žuvų kaulų ir žvynų kiekis proc.=  .

Čia S - koncentruoto sedimento svoris mg;

c - koncentruotame sedimente nustatytas gyvūnų kaulų kiekis proc.;

d - koncentruotame sedimente nustatytas žuvų kaulų bei žvynų kiekis proc.;

W - tiriamojo mėginio paimto sedimentacijai svorį mg.

7.2.  Gyvūninio produkto kiekio apskaičiavimas, kai žinoma šio produkto rūšis, pagal nustatytą ir apskaičiuotą kaulų kiekį tiriamojo pašaro mėginio koncentruotame sedimente:

 

gyvūninio produkto kiekis proc. =;

 

žuvų miltų kiekis  proc.   = .

 

Čia S - koncentruoto sedimento svorį mg;

c - koncentruotame sedimente nustatytas gyvūnų kaulų kiekis proc.;

d - koncentruotame sedimente nustatytas žuvų kaulų bei žvynų kiekis proc.;

W - tiriamojo mėginio paimto sedimentacijai svorį mg;

f- kaulų kiekis rastas gyvūninių produktų arba žuvų miltų tiriamajame mėginyje.

Kaulų kiekis gyvūniniuose produktuose gali būti labai įvairus: pvz., mėsos ir kaulų miltuose - 50-60 proc., mėsos miltuose - 20-30 proc. Žuvų miltuose, pagal jų kilmę bei kategoriją, kaulų ir žvynų kiekis gali būti nuo 10 iki 20 proc.

Tyrimo rezultatų pateikimas

8. Mėginio stebėjimo mikroskopu rezultatai apie gyvūnų sudedamąsias dalis ataskaitoje pateikiami formuluojant taip:

8.1. apie sausumos gyvūnų sudedamąsias dalis:

8.1.1. gyvūnų sudedamųjų dalių nerasta arba gyvūnų sudedamųjų dalių rasta;

8.2. apie žuvų miltų sudedamąsias dalis:

8.2.1. žuvų sudedamųjų dalių nerasta arba žuvų sudedamųjų dalių rasta.

Gyvūninių sudedamųjų dalių apskaičiuotas kiekis tyrimo rezultatų ataskaitoje pateikiamas pagal sausumos gyvūnų tipus ir sudedamąsias dalis (raumenų skaidulos, kremzlės, kaulai, ragai, plaukai, šeriai, plunksnos, kraujas, kiaušinių lukštai, žuvų kaulai, žvynai). Nurodomas skaičiuojant naudotas pataisos koeficientas (f).

Nenustačius sausumos gyvūnų kaulų frakcijų, ataskaitoje užrašoma pastaba „Galima įtarti, kad rastos kaulų frakcijos gali būti žinduolių".

9. Laisvai pasirenkamos sąlygos riebalams ir lajui tirti. Taikomos tokios sąlygos:

9.1. kieti riebalai ar lajus mikrobangų krosnelėje kaitinami kol suskystės;

9.2. pipete iš mėginio dugno paimama 40 ml riebalų ar lajaus ir perdedama į vamzdelį;

9.3. riebalai ar lajus 10 minučių 4000 aps./min. greičiu išcentrifuguodami;

9.4. po centrifugavimo kieti riebalai ar lajus pakaitinami iki suskystėjimo ir dar kartą centrifuguojant 4000 aps./min. greičiu;

9.5. pusė filtruotų riebalų ar lajaus šaukšteliu ar mentele perdedama į petri lėkštelę ar ant mikroskopinio stiklelio ir nustatoma gyvūninių sudedamųjų dalelių struktūra (raumens skaidulos, plunksnos, kaulų dalelės). Mikroskopiniam tyrimui rekomenduojama naudoti parafino alyvą ar glicerolį.

9.6. Likusioms priemaišoms nustatyti taikomas šio metodo 6.2 punkte nurodytas tyrimas.

______________