LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO
Į S A K Y M A S
DĖL CINKO BACITRACINO, FLAVOFOSFOLIPOLIO, MIKROELEMENTŲ – GELEŽIES, VARIO, MANGANO IR CINKO KIEKIO PAŠARUOSE NUSTATYMO TECHNINIO REGLAMENTO PATVIRTINIMO
2001 m. rugsėjo 27 d. Nr. 337
Vilnius
Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos pašarų įstatymu (Žin., 2000, Nr. 34-952) ir siekdamas tikslaus pašarų kokybės įvertinimo:
1. Tvirtinu Cinko bacitracino, flavofosfolipolio, mikroelementų – geležies, vario, mangano ir cinko kiekio pašaruose nustatymo techninį reglamentą (pridedama).
Patvirtinta
Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro
2001 m. rugsėjo 27 d. įsakymu Nr. 337
cinko bacitracino, flavofosfolipolio, mikroelementų – geležies, vario, mangano ir cinko kiekio pašaruose nustatymo techninis reglamentas
Parengtas pagal 1978 m. birželio 15 d. aštuntąją Europos Komisijos direktyvą 78/633/EEB „Dėl Bendrijos analizės metodų, kuriuos valstybės institucijos taiko pašarams kontroliuoti“ ir 1981 m. liepos 30 d. direktyvą 81/680/EEB, 1984 m. gruodžio 20 d. direktyvą 84/4/EEB.
I. Bendrosios nuostatos
1. Šis techninis reglamentas nustato į rinką tiekiamų prekinių pašarų cheminės analizės metodus pašarų kokybės valstybinei kontrolei vykdyti. (Tačiau kai kuriems pašarams dėl jiems būdingų sudėties savybių reikia taikyti atskirus, tik jiems tinkamus cheminės analizės metodus. Šie atvejai nurodyti metodų aprašymuose su nuoroda „Pastabos“).
2. Jei pašarų analitei nustatyti taikomi du ar daugiau metodų, taikomą metodą, jei nenurodyta kitaip, pasirenka cheminę analizę atliekanti laboratorija, tačiau šis metodas turi būti nurodomas analizės sertifikate.
3. Šio techninio reglamento reikalavimų privalo laikytis visi prekinius pašarus gaminantys, laikantys, gabenantys, naudojantys, tarpininkaujantys juos parduodant ir jais prekiaujantys ūkio subjektai ir pašarų kokybės valstybinė kontrolės institucija.
II. Sąvokos, terminai ir sutrumpinimai
5. Šiame techniniame reglamente vartojamos sąvokos:
Drėgnis – laisvo vandens procentinis kiekis medžiagoje.
Tuščiasis bandymas – bandymas su tiriamąja medžiaga be analitės.
Flavofosfolipolis – mažiausiai keturių antibiotikų (moenomicinų A, B1, B2 ir C) kompleksas, kuriame pagrindinis komponentas yra moenomicinas A.
6. Metodų aprašymuose vartojami cheminių junginių trivialieji pavadinimai ir juos atitinkantys IUPAC terminai:
agar-agaras – agaras, (C12H18O9)n;
askorbo rūgštis – C6H8O6;
bromkrezolo violetinis – 5,5 -dibromo-o-krezolsulfoftaleinas, C21H16Br2O5S;
cinko bacitracinas – C66H101N17O16SZn;
kalio-vandenilio fosfatas – dikalio-vandenilio tetraoksofosfatas, K2HPO4;
druskos rūgštis – vandenilio chloridas, HCl;
gliukozė – C6H12O6;
kalio chloridas – KCl;
kalio-divandenilio fosfatas – kalio-divandenilio tetraoksofosfatas, KH2PO4;
lantano chloridas – lantano trichloridas, LaCl3;
lantano oksidas – dilantano trioksidas, La2O3;
metanolis – CH3OH;
natrio chloridas – NaCl;
natrio hidroksidas – NaOH;
natrio sulfidas – dinatrio sulfidas, Na2S;
sieros rūgštis – divandenilio tetraoksosulfatas, H2SO4;
tris(hidroksimetil)aminometanas – C4H11NO3;
Tween 80 – polioksietileno [(-OCH2CH2-)n] ir gliucitolio monooleato (C24H49O7) mišinio prekinis pavadinimas;
vandenilio fluoridas – HF;
vandenilio peroksidas – divandenilio dioksidas, H2O2.
III. Mėginių paruošimas cheminei analizei
8. Pašarų cheminių analizių metodų bendrosios nuostatos:
8.1. Mėginių paruošimas cheminėms analizėms:
8.1.1. aprašyti veiksmai toliau taikomi galutiniams mėginiams (toliau – mėginiai), atsiųstiems į kontrolės laboratorijas po mėginių paėmimo pagal Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 208 (Žin., 2000, Nr. 60-1786) patvirtintą Pašarų mėginių paėmimo ir paruošimo techninį reglamentą;
8.2. Būtinos atsargumo priemonės mėginių paruošimo metu:
8.2.1. visi būtini veiksmai turi būti atliekami išvengiant mėginio užteršimo ir jo sudėties pokyčio. Malimas, maišymas ir sijojimas turi būti atliekami kaip galima greičiau, kuo trumpiau mėginį veikiant oru ir šviesa. Neturi būti naudojami malūnai ir smulkintuvai, pastebimai įšildantys mėginį. Pašarus, kurie yra ypač jautrūs šilumai, rekomenduojama smulkinti rankomis. Reikėtų įsitikinti, kad patys prietaisai nėra mikroelementų taršos šaltinis;
8.2.2. jei mėginys negali būti paruoštas be ženklaus mėginio drėgnio pokyčio, prieš paruošimą ir po jo nustatomas drėgnis pagal Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 206 (Žin., 2000, Nr. 60-1784) patvirtintą Drėgnio, lakiųjų azoto bazių, suminio fosforo, žalio aliejaus ir riebalų kiekio nustatymo pašaruose techninį reglamentą.
8.3. Galutinio mėginio paruošimo eiga:
8.3.1. galutinis mėginys kruopščiai sumaišomas maišytuvu arba rankomis. Mėginys padalijamas į dvi lygias dalis (jei tinka, turi būti naudojamas ketvirčiavimo metodas). Viena dalis saugoma tinkamoje švarioje, sausoje talpykloje, su oro nepraleidžiančiu kamščiu, antroji dalis (arba jai būdinga mažiausiai 100 g dalis) paruošiama, kaip nurodyta toliau:
8.3.1.1. pašarai gali būti malami iš karto, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip.
Visas sumaltas mėginys persijojamas per sietą su kvadratinėmis akutėmis, kurios kraštinės ilgis 1 mm (pagal rekomendaciją ISO R565). Vengiama per smulkaus sumalimo. Persijotas mėginys išmaišomas ir surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys vėl išmaišomas;
8.3.1.2. pašarai gali būti sumalami juos išdžiovinus, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip, mėginys džiovinamas, siekiant sumažinti drėgnį iki 8 %-12 % pagal parengtinio džiovinimo procedūrą, nurodytą Drėgnio, lakiųjų azoto bazių, suminio fosforo, žalio aliejaus ir riebalų kiekio nustatymo pašaruose techninio reglamento 1 priedo 4.3 punkte. Toliau dirbama, kaip nurodyta šio techninio reglamento 8.3.1.1 punkte;
8.3.1.3. skysto ir pusiau skysto pašaro mėginys surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys kruopščiai išmaišomas;
8.4. Mėginiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Mėginiai, kuriuose numatyta analizuoti vitaminus ar kitas iš dalies šviesai jautrias medžiagas, turi būti laikomi rudo stiklo induose.
8.5. Reikalavimai reagentams ir prietaisams, naudojamiems cheminės analizės metoduose:
8.5.1. visi analitiniai reagentai turi būti analiziškai gryni (a. p.), jei cheminės analizės metoduose nenurodyta kitaip. Nustatant mikroelementus, reagentų grynumas turi būti tikrinamas tuščiuoju bandymu. Atsižvelgiant į gautą rezultatą, gali būti reikalingas tolesnis reagentų gryninimas;
8.5.2. jei analizės metodų veiksmuose, susietuose su tirpalų ruošimu, skiedimu, skalavimu ar plovimu, nenurodoma naudojamo tirpiklio ar skiediklio prigimtis, suprantama, kad turi būti naudojamas vanduo. Vanduo turi būti tik demineralizuotas ar distiliuotas. Kai kuriais analizių metoduose nurodytais atvejais jis turi būti gryninamas specialiomis priemonėmis;
8.6. Cheminės analizės metodų taikymas ir rezultatų išraiška:
8.6.1. kiekviena medžiaga pašaruose paprastai nustatoma atskiru metodu. Jei yra pateikta keletas metodų, kontrolės laboratorijoje naudotas metodas turi būti nurodomas analizės ataskaitoje;
8.6.2. analizės ataskaitoje pateikiamas rezultatas išreiškiamas mažiausiai dviejų matavimų, atliktų su atskiromis mėginio dalimis, vidurkiu, esant patenkinamam šių matavimų pakartojamumui. Šis rezultatas išreiškiamas reikšmingų skaitmenų skaičiumi analizės metoduose nurodytu būdu ir, jei reikia, koreguojamas pagal drėgnio kiekį, esantį galutiniame mėginyje prieš jo paruošimą.
IV. Mėginių cheminė analizė
9. Cinko bacitracino kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento 1 priede nurodytą metodą.
10. Flavofosfolipolio kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento 2 priede nurodytą metodą.
1 priedas
CINKO BACITRACINO NUSTATYMAS MATUOJANT DIFUZIJĄ AGARE
1. Tikslas ir taikymo sritis
Šiuo metodu nustatomas cinko bacitracino kiekis prekiniuose pašaruose. Radimo riba yra 5 mg/kg.1
2. Metodo esmė
Mėginys ekstrahuojamas metanolio, vandens ir druskos rūgšties mišiniu esant pH 2, pridedant natrio sulfido tirpalo. Natrio sulfidas dedamas siekiant nusodinti esamas tirpias vario druskas, kurios trukdytų matavimui. Ekstrakto pH pakeliamas iki 6,5, esant reikalui, mišinys koncentruojamas ir skiedžiamas. Antibiotinis aktyvumas nustatomas matuojant cinko bacitracino difuziją agaro terpėje, kurioje pasėta Micrococcus luteus (flavus). Difuzija matoma pagal inhibavimo zonų susidarymą terpėje su pasėtu mikroorganizmu. Šių zonų skersmuo yra proporcingas antibiotiko koncentracijos logaritmui.
3. Mikroorganizmas: Micrococcus luteus (flavus) ATCC 10240:
3.1. Pradinės bakterijų kultūros laikymas
Mėgintuvėlyje su gulsčiąja mitybine terpe (4.1) pasėjama Micrococcus luteus (flavus). Inkubuojama 24 val. 30 oC temperatūroje. Kultūra laikoma šaldytuve 4 oC temperatūroje. Persėjama kas dvi savaites.
3.2. Bakterijų suspensijos ruošimas 2
Bakterijos iš mėgintuvėlio su neseniai paruoštu gulsčiuoju agaru (3.1) surenkamos naudojant 2 ml-3 ml natrio chlorido tirpalo (4.3). Šia suspensija sėjama Roux kolboje su 250 ml mitybinės terpės (4.1) ir inkubuojama 18–20 valandų 30 oC temperatūroje. Bakterijos surenkamos su 25 ml natrio chlorido tirpalo (4.3) ir sumaišoma. Ši suspensija praskiedžiama 1:10 natrio chlorido tirpalu (4.3). Suspensijos šviesos pralaidumo koeficientas, matuojant 650 nm srityje 1 cm storio kiuvete ir lyginant su natrio chlorido tirpalu (4.3), turi būti apie 75 %. Ši suspensija, laikoma 4 oC temperatūroje, gali būti naudojama savaitę.
4. Mitybinės terpės ir reagentai:
4.1. Mitybinė terpė3:
mėsos peptonas 6,0 g
tripsino peptonas 4,0 g
mielių ekstraktas 3,0 g
mėsos ekstraktas 1,5 g
gliukozė 1,0 g
agaras 10 g-20 g
vanduo 1000 ml
pH (po sterilizavimo) 6,5-6,6.
4.2. Nustatymo terpė:
tripsino peptonas 10,0 g
mielių ekstraktas 3,0 g
mėsos ekstraktas 1,5 g
gliukozė 1,0 g
agaras 10 g-20 g
tween 80 1 ml
vanduo 1000 ml
pH (po sterilizavimo) 6,5.
4.3. Natrio chlorido tirpalas, 0,8 % (m/v): vandenyje ištirpinama 8 g natrio chlorido, skiedžiama vandeniu iki 1000 ml; sterilizuojama.
4.5. Fosfatinis buferinis tirpalas, pH 6,5:
kalio-vandenilio fosfatas, K2HPO4 22,15 g
kalio-divandenilio fosfatas, KH2PO4 27,85 g
vanduo iki 1000 ml.
4.10. Dromkrezolio violetinis, 0,04% (m/v) tirpalas: 0,1 g bromkrezolio violetinio ištirpinama 18,5 ml 0,01 mol/l natrio hidroksido tirpalo. Praskiedžiama iki 250 ml vandeniu ir išmaišoma.
5. Standartiniai tirpalai
Tiksliai pasveriamas standartinio cinko bacitracino (4.11) kiekis, atitinkantis 1050 T. V. (pagal nurodytą aktyvumą). Užpilama 5 ml 0,1 mol/l druskos rūgšties (4.7) ir paliekama 15 minučių. Įpilama 30 ml vandens, fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5) (apie 4 ml) sureguliuojamas pH iki 4,5. Iki 50 ml praskiedžiama vandeniu ir gerai išmaišoma (1 ml = 21 T. V.). Iš šio tirpalo nuosekliai praskiedžiant fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5) ruošiami šie tirpalai:
S8 0,42 T. V./ml,
S4 0,21 T. V./ml,
S2 0,105 T. V./ml,
S1 0,0525 T. V./ml.
6. Ekstrakto ir bandymo tirpalų paruošimas:
6.1. Ekstrahavimas:
6.1.1. Premiksai ir mineraliniai pašarai
Pasveriama 2,0 g-5,0 g mėginio, įpilama 29,0 ml mišinio (4.4) ir 1,0 ml natrio sulfido tirpalo (4.9), trumpai supurtoma. Mišinio pH turėtų būti apie 2. Purtoma 10 min., įpilama 30 ml fosfatinio buferinio tirpalo (4.5), purtoma dar 15 min. ir centrifuguojama. Paimamas tinkamas centrifugato kiekis, pH sureguliuojamas iki 6,5 pridedant 1 mol/l natrio hidroksido tirpalo (4.8). pH matuojamas pH-metru arba indikatoriaus bromkrezolio violetinio (4.10) pagalba. Skiedžiama fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5) siekiant gauti numatomą 0,42 T. V./ml koncentracijos cinko bacitracino tirpalą (U8).
6.1.2. Baltymingi koncentratai
Pasveriama 10,0 g mėginio, įpilama 49,0 ml mišinio (4.4) ir 1,0 ml natrio sulfido tirpalo (4.9), trumpai supurtoma. Mišinio pH turėtų būti apie 2. Purtoma 10 min., įpilama 50 ml fosfatinio buferinio tirpalo (4.5), purtoma dar 15 min. ir centrifuguojama. Paimamas tinkamas centrifugato kiekis, pH sureguliuojamas iki 6,5 pridedant 1 mol/l natrio hidroksido tirpalo (4.8). pH matuojamas pH-metru arba indikatoriaus bromkrezolio violetinio (4.10) pagalba. Sukamajame garintuve temperatūroje, neviršijančioje 35 oC, nugarinama apytikriai iki pusės tūrio. Skiedžiama fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5), siekiant gauti numatomą 0,42 T. V./ml koncentracijos cinko bacitracino tirpalą (U8).
6.1.3. Kiti pašarai
Pasveriama 10,0 g mėginio (20,0 g, jei numatomas cinko bacitracino kiekis yra 5 g/kg), įpilama 24,0 ml mišinio (4.4) ir 1,0 ml natrio sulfido tirpalo (4.9), maišoma 10 min. Įpilama 25 ml fosfatinio buferinio tirpalo (4.5), purtoma 15 min. ir centrifuguojama. Paimama 20 ml centrifugato, pH sureguliuojamas iki 6,5, pridedant 1 mol/l natrio hidroksido tirpalo (4.8). pH matuojamas pH-metru arba indikatoriaus bromkrezolio violetinio (4.10) pagalba. Sukamajame garintuve temperatūroje, neviršijančioje 35 oC, nugarinama apytikriai iki 4 ml tūrio. Likutis skiedžiamas fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5), siekiant gauti numatomą 0,42 T. V./ml koncentracijos cinko bacitracino tirpalą (U8).
7. Matavimas:
7.1. Sėjimas į mitybinę terpę
Į nustatymo mitybinę terpę (4.2) apytikriai 50 oC temperatūroje pasėjama bakterijų suspensija (3.2). Pradiniuose terpės (4.2) bandymuose ant lėkštelių nustatomas bakterinės suspensijos kiekis, reikalingas siekiant gauti didžiausias ir aiškiausias inhibavimo zonas su įvairiomis cinko bacitracino koncentracijomis.
7.2. Lėkštelių paruošimas
Difuzija agare atliekama lėkštelėse, naudojant keturių koncentracijų standartinius tirpalus (S8, S4, S2 ir S1) ir keturių koncentracijų bandymo tirpalus: U8, U4, U2 ir U1. Kiekvienoje lėkštelėje turi būti keturių koncentracijų ekstrakto ir standartininiai tirpalai. Kad agaro terpėje būtų galima padaryti bent aštuonias 10 mm-13 mm skersmens skyles, kurių centrai nutolę mažiausiai per 30 mm, parenkamos pakankamai didelės lėkštelės. Bandymai gali būti atlikti lėkštelėse, padarytose iš stiklo plokštelės, iš viršaus padengtos 200 mm skersmens ir 20 mm aukščio aliuminio ar plastiko žiedu.
Į lėkšteles įpilama toks kiekis pagal 7.1 apsėtos terpės (4.2), kad susidarytų maždaug 2 mm storio sluoksnis (60 ml-200 mm skersmens lėkštelei). Paliekama sutirštėti horizontalioje padėtyje, išgręžiamos skylės ir į jas įlašinami tiksliai išmatuoti bandymo ir standartinių tirpalų kiekiai (nuo 0,10 ml iki 0,15 ml priklausomai nuo skylės skersmens). Kiekviena koncentracija panaudojama mažiausiai 4 kartus, taigi kiekviename nustatyme atliekamas 32 inhibavimo zonų įvertinimas.
8. Rezultatų įvertinimas
0,1 mm tikslumu išmatuojamas inhibavimo zonų skersmuo. Kiekvienos koncentracijos matavimų vidurkis užrašomas pusiau logaritminiame milimetriniame popieriuje, parodant koncentracijų logaritmo priklausomybę nuo ihibavimo zonų skersmens. Brėžiamos standartinį tirpalą ir ekstraktą atitinkančios tiesės, kaip parodyta žemiau esančiame pavyzdyje. Taikant formulę, nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis mažiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SL):
(a) SL =(7S1+4S2+S4-2S8) / 10
Nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis didžiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SH) pasinaudojant formule:
(b) SH =(7S8+4S4+S2-2S1) / 10
Panašiai apskaičiuojami taškai, geriausiai atitinkantys mažiausią UL ir didžiausią UH koncentraciją ekstrakte, pakeičiant aukščiau pateiktose formulėse S1, S2, S4 ir S8 į U1, U2, U4 ir U8.
Pažymimos apskaičiuotos SL ir SH vertės tame pačiame grafike ir sujungus jas, gaunama geriausiai standartinį tirpalą atitinkanti tiesė. Panašiai pažymėjus ir sujungus UL ir UH vertes gaunama geriausiai ekstraktą atitinkanti tiesė.
Nesant trukdžių, šios dvi tiesės turėtų būti lygiagrečios. Praktiškai tieses galima laikyti lygiagrečiomis, jei SH – SL ir UH – UL vertės nuo jų vidurkio nesiskiria daugiau kaip 10 %. Jei tiesės nėra lygiagrečios, U1 ir S1 ar U8 ir S8 gali būti atmesti, o SL, SH, UL ir UH apskaičiuojami pagal alternatyvias formules, gaunant alternatyvias geriausiai atitinkančias tieses:
(a`) SL = (5S1+2S2-S4) / 6 arba (5S2+2S4-S8) / 6,
(b`) SH = (5S4+2S2-S1) / 6 arba (5S8+2S4-S2) / 6.
Panašiai apskaičiuojamos UL ir UH. Turi būti patenkinami tie patys lygiagretumo kriterijai. Faktas, kad rezultatas buvo skaičiuotas pagal tris vertes, turi būti pažymėtas galutinėje ataskaitoje.
Kai tiesės laikomos lygiagrečiomis, santykinio aktyvumo logaritmas (log A) skaičiuojamas pagal vieną iš formulių priklausomai nuo to, trys ar keturios vertės buvo naudojamos įvertinant lygiagretumą.
Keturioms vertėms:
(c) log A = .
Trims vertėms:
(d) log A =
arba
(d`) log A =.
Mėginio ekstrakto aktyvumas lygus atitinkamo standarto aktyvumui, padaugintam iš A
(U8 = S8 × A).
Jei apskaičiuojama, kad santykinis aktyvumas patenka už diapazono nuo 0,5 iki 2,0 ribų, bandymas kartojamas tinkamai sureguliavus ekstrakto, o jei tai neįmanoma, standartinio tirpalo koncentracijas. Kai santykinis aktyvumas negali būti gaunamas tarp reikalaujamų ribų, bet koks gautas rezultatas laikomas apytiksliu ir turi būti nurodytas galutinėje ataskaitoje.
Jei tiesės laikomos ne lygiagrečiomis, matavimas kartojamas. Jei lygiagretumas vis dar nepasiektas, matavimas laikomas nepatenkinamu.
Rezultatas išreiškiamas miligramais cinko bacitracino kilograme pašaro.
9. Pakartojamumas
Rezultatų skirtumas tarp dviejų lygiagrečių to paties mėginio matavimų, atliktų to paties tyrėjo, neturi viršyti:
2 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai cinko bacitracino kiekis siekia iki 10 mg/kg,
20 % didžiausios vertės, kai kiekiai yra nuo 10 mg/kg iki 25 mg/kg,
5 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai kiekiai yra nuo 25 mg/kg iki 50 mg/kg,
10 % didžiausios vertės, kai kiekiai yra virš 50 mg/kg.
_____________
2 priedas
FLAVOFOSFOLIPOLIO NUSTATYMAS MATUOJANT DIFUZIJĄ AGARE
1. Tikslas ir taikymo sritis
Šiuo metodu nustatomas flavofosfolipolio kiekis prekiniuose pašaruose. Radimo riba yra 1 mg/kg (1 ppm).
2. Metodo esmė
Mėginys ekstrahuojamas praskiestu metanoliu kaitinant su grįžtamuoju kondensatoriumi. Po centrifugavimo ekstraktas gryninamas (jei reikia) apdorojant jonitinėmis dervomis ir praskiedžiamas. Jo antibiotinis aktyvumas nustatomas matuojant flavofosfolipolio difuziją agaro terpėje, kurioje pasėta Staphylococcus aureus. Difuzija matoma pagal inhibavimo zonų susidarymą terpėje su pasėtu mikroorganizmu. Šių zonų skersmuo yra proporcingas antibiotiko koncentracijos logaritmui.
3. Mikroorganizmas: Staphylococcus aureus ATCC Nr. 6538 P
3.1. Pradinės bakterijų kultūros laikymas
Mėgintuvėlyje su gulsčiąja mitybine terpe (4.1) pasėjama Staphylococcus aureus. Inkubuojama 24 val. 37 oC temperatūroje. Kultūra laikoma šaldytuve 4 oC temperatūroje. Persėjama kas mėnesį.
3.2. Bakterijų suspensijos ruošimas 1
Atidedami du mėgintuvėliai su pradine bakterijų kultūra (3.1), kuri kas savaitę persėjama. Inkubuojama 24 valandas 37 oC temperatūroje ir laikoma šaldytuve 4 oC temperatūroje. Likus 24 val. iki matavimo, šia kultūra užsėjami 2-4 mėgintuvėliai su gulsčiąja mitybine terpe (4.1). Inkubuojama 16-18 val. 37 oC temperatūroje. Bakterijų suspensija surenkama natrio chlorido tirpalu (4.3). Suspensijos šviesos pralaidumo koeficientas, matuojant 578 nm srityje 1 cm storio kiuvetėje, lyginant su natrio chlorido tirpalu (4.3), turi būti apie 40 %.
4. Mitybinės terpės ir reagentai:
4.1. Mitybinė terpė2:
mėsos peptonas 6,0 g
tripsino peptonas 4,0 g
mėsos ekstraktas 1,5 g
mielių ekstraktas 3,0 g
gliukozė 1,0 g
agaras 15 g
distiliuotas vanduo iki 1000 ml
pH (po sterilizavimo) 6,5.
4.2. Bandomoji terpė:
4.2.1. Pagrindinis sluoksnis1:
mėsos peptonas 6,0 g
mėsos ekstraktas 1,5 g
mielių ekstraktas 3,0 g
agaras 10 g
distiliuotas vanduo iki 1000 ml
pH (po sterilizavimo) 6,5.
4.3. 0,4 % (m/v) natrio chlorido tirpalas: 4 g natrio chlorido ištirpinami vandenyje, praskiedžiama iki 1 litro ir sterilizuojama.
4.8. 1,5 % (m/v) kalio chlorido tirpalas metanolyje: 1,5 g kalio chlorido ištirpinama 20 ml vandens, iki 100 ml praskiedžiama metanoliu (4.4).
4.10. Anijonitas: Dowex 1X2, 50-100 mešas, Cl-forma („Serva“ katalogo Nr. 41010) ar panašus. Prieš naudojimą 12-14 val. laikomas 80 % metanolyje (4.6).
5. Prietaisai:
5.1. Stiklinė chromatografinė kolonėlė, vidinis skersmuo 9 mm, ilgis 150 mm-200 mm, su įrengtu čiaupu siaurajame gale ir šlifine jungtimi (jungimui su lašinamuoju piltuvu (5.2)) viršutiniame gale.
6. Standartiniai tirpalai
Tiksliai pasveriama standartinė medžiaga (4.14), ištirpinama 50 % metanolyje (4.5) ir praskiedžiama tiek, kad flavofosfolipolio koncentracija tirpale būtų 100 mg/ml. Šis tirpalas šaldytuve 4 oC temperatūroje uždarame inde gali būti laikomas 2 mėnesius.
Iš šio tirpalo, nuosekliai praskiedžiant 50 % metanoliu (4.5), ruošiami šie tirpalai:
S8 0,20 mg/ ml,
S4 0,10 mg/ ml,
S2 0, 05 mg/ ml,
S1 0,025 mg/ ml.
7. Ekstrakto paruošimas:
7.1. Ekstrahavimas:
7.1.1. Koncentratai, premiksai ir mineraliniai pašarai
Pasveriama 2,0 g-5,0 g mėginio, pridedama apie 150 mg askorbo rūgšties (4.13) ir konusinėje kolboje (5.3) sumaišoma su 150 ml 50 % metanolio (4.5). Pridedant apie 400 mg tris(hidroksimetil)aminometano (4.7), mišinio pH sureguliuojamas iki 8,1-8,2 ir kontroliuojamas indikatoriniu popieriumi (4.12). Paliekama stovėti 15 min., pH tris(hidroksimetil)aminometano (4.7) pagalba vėl sureguliuojamas iki 8,1-8,2. Virinama 10 min. su grįžtamuoju kondensatoriumi (5.4) pastoviai maišant. Paliekama atvėsti, mišinys centrifuguojamas, o ekstraktas nupilamas.
7.1.2. Kiti pašarai
Pasveriama 5,0 g-30,0 g mėginio, kuriame yra mažiausiai 30 mg flavofosfolipolio. Konusinėje kolboje (5.3) sumaišoma su 150 ml 50 % metanolio (4.5). Pridedant apie 400 mg tris(hidroksimetil)aminometano (4.7), mišinio pH sureguliuojamas iki 8,1-8,2 ir kontroliuojamas indikatoriniu popieriumi (4.12). Paliekama stovėti 15 min., pH tris(hidroksimetil)aminometano (4.7) pagalba vėl sureguliuojamas iki 8,1-8,2. Virinama 10 min. su grįžtamuoju kondensatoriumi (5.4) pastoviai maišant. Paliekama atvėsti, mišinys centrifuguojamas, o ekstraktas nupilamas.
7.2. Gryninimas (kombinuotieji pašarai, premiksai ir mineraliniai pašarai gali būti negryninami)
Į 110 ml ekstrakto supilama 11 g katijonito (4.9), virinama 1 min. su grįžtamuoju kondensatoriumi (5.4) pastoviai maišant. Katijonitas atskiriamas centrifuguojant arba filtruojant. 100 ml ekstrakto sumaišoma su 150 ml metanolio (4.4). Tirpalas 12 val.-15 val. laikomas 4 oC temperatūroje. Nuosėdos pašalinamos filtruojant šaltą tirpalą.
Stiklo vatos gumulėliu (4.11) užkemšamas apatinis stiklinio vamzdelio (5.1) galas. Įpilami 5 ml anijonito (4.10). Kolonėlė plaunama 100 ml 80 % metanoliu (4.6). Piltuvėlio (5.2) pagalba į kolonėlę įpilama mažiausiai 100 ml filtrato, kuriame būtų 16 mg flavofosfolipolio (200 ml 30-čiai g mėginio, turinčio 1 mg/kg flavofosfolipolio). Esant reikalui, prieš supilant į kolonėlę, filtratas skiedžiamas 80 % metanoliu (4.6). Tokiu būdu gaunama numatoma 16 mg/100 ml flavofosfolipolio koncentracija. Tekėjimo greitis iš kolonėlės turėtų būti apie 2 ml/min. Ištekėjęs skystis išpilamas. Kolonėlė plaunama 50 ml 80 % metanoliu (4.6). Ištekėjęs skystis išpilamas. Flavofosfolipolis išplaunamas metanoliniu kalio chlorido tirpalu (4.8) išlaikant 2 ml/min. tekėjimo greitį. Į graduotą kolbutę surenkama 50 ml eliuato, pripilama 30 ml vandens ir išmaišoma. Šiame tirpale turėtų būti 0,2 mg/ml (U8) flavofosfolipolio.
7.3. Bandymo tirpalai
Jei reikia (t. y. jei gryninimas buvo praleistas), 7.1.1 punkte gautas ekstraktas skiedžiamas 50 % metanoliu (4.5) siekiant gauti numatomą 0,2 mg/ml (U8) flavofosfolipolio koncentraciją. Iš U8 tirpalo nuosekliai skiedžiant per pusę (1+1) 50 % metanoliu (4.5) paruošiami tirpalai U4 (numatoma koncentracija: 0,1 mg/ml), U2 (numatoma koncentracija: 0,05 mg/ml), U1 (numatoma koncentracija: 0,025 mg/ml).
8. Matavimas:
8.1. Sėjimas į mitybinę terpę
Į nustatymo mitybinę terpę (4.2.2) apytikriai 50 oC temperatūroje pasėjama bakterijų suspensija (3.2). Pradiniuose terpės (4.2.2) bandymuose ant lėkštelių nustatomas bakterinės suspensijos kiekis, reikalingas siekiant gauti didžiausias ir aiškiausias inhibavimo zonas su įvairiomis flavofosfolipolio koncentracijomis (apie 30 ml/l).
8.2. Lėkštelių paruošimas
Difuzija agare atliekama lėkštelėse, naudojant keturių koncentracijų standartinius tirpalus (S8, S4, S2 ir S1) ir keturių koncentracijų bandymo tirpalus (U8, U4, U2 ir U1). Kiekvienoje lėkštelėje turi būti keturių koncentracijų ekstrakto ir standartininiai tirpalai. Kad agaro terpėje būtų galima padaryti bent aštuonias 10 mm-13 mm skersmens skyles, kurių centrai nutolę mažiausiai per 30 mm, parenkamos pakankamai didelės lėkštelės. Bandymai gali būti atlikti stiklinėse lėkštelėse, kurios iš viršaus padengtos 200 mm skersmens ir 20 mm aukščio aliuminio ar plastiko žiedu.
Į lėkšteles įpilamas toks kiekis terpės (4.2.1), kad susidarytų maždaug 1,5 mm storio sluoksnis (45 ml-200 mm skersmens lėkštelei). Paliekama sutirštėti horizantalioje padėtyje ir ant viršaus užpilama, kaip nurodyta 8.1, apsėta terpė (4.2.2), kad gautas sluoksnis būtų 1 mm storio (30 ml-200 mm skersmens lėkštelei). Vėl paliekama sutirštėti horizontalioje padėtyje, išgręžiamos skylės ir į jas įlašinami tiksliai išmatuoti bandymo ir standartinio tirpalų kiekiai (nuo 0,10 ml iki 0,15 ml priklausomai nuo skylės skersmens). Kiekviena koncentracija panaudojama mažiausiai 4 kartus, taigi kiekviename nustatyme atliekamas 32 inhibavimo zonų įvertinimas.
9. Rezultatų įvertinimas:
0,1 mm tikslumu išmatuojamas inhibavimo zonų skersmuo. Kiekvienos koncentracijos matavimų vidurkis užrašomas pusiau logaritminiame milimetriniame popieriuje, parodant koncentracijų logaritmo priklausomybę nuo inhibavimo zonų skersmens. Brėžiamos standartinį tirpalą ir ekstraktą atitinkančios tiesės, kaip parodyta žemiau esančiame pavyzdyje: taikant formulę nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis mažiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SL):
(a) SL = (7S1+4S2+S4-2S8) / 10
Nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis didžiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SH), taikant formulę:
(b) SH = (7S8+4S4+S2-2S1) / 10
Panašiai apskaičiuojami taškai, geriausiai atitinkantys mažiausią (UL) ir didžiausią (UH) koncentraciją ekstrakte, pakeičiant nurodytose formulėse S1, S2, S4 ir S8 į U1, U2, U4 ir U8.
Tame pačiame grafike pažymimos apskaičiuotos SL ir SH vertės ir jas sujungus gaunama geriausiai standartinį tirpalą atitinkanti tiesė. Panašiai pažymimos ir sujungiamos UL ir UH vertės, gaunant geriausiai ekstraktą atitinkančių tiesę.
Nesant trukdžių, šios dvi tiesės yra lygiagrečios. Praktiškai tieses galima laikyti lygiagrečiomis, jei SH – SL ir UH – UL vertės nuo jų vidurkio nesiskiria daugiau kaip 10 %. Jei tiesės nėra lygiagrečios, U1 ir S1 ar U8 ir S8 gali būti atmesti, o SL, SH, UL ir UH apskaičiuojami pagal alternatyvias formules, gaunant alternatyvias geriausiai atitinkančias tieses:
(a`) SL = (5S1+2S2-S4) / 6 arba (5S2+2S4-S8) / 6,
(b`) SH = (5S4+2S2-S1) / 6 arba (5S8+2S4-S2) / 6.
Panašiai apskaičiuojamos UL ir UH. Turi būti patenkinami tie patys lygiagretumo kriterijai. Faktas, kad rezultatas buvo skaičiuotas pagal tris vertes, turi būti pažymėtas galutinėje ataskaitoje.
Kai tiesės laikomos lygiagrečiomis, santykinio aktyvumo logaritmas (log A) skaičiuojamas pagal vieną iš formulių priklausomai nuo to, trys ar keturios vertės buvo taikomos įvertinant lygiagretumą.
Keturioms vertėms:
(c) log A = .
Trims vertėms:
(d) log A =,
arba
(d`) log A =.
Tikrasis aktyvumas = numatomas aktyvumas × santykinis aktyvumas.
Jei tiesės laikomos ne lygiagrečiomis, matavimas kartojamas. Jei lygiagretumas vis dar nepasiektas, santykinio aktyvumo logaritmas (log A) skaičiuojamas pagal formulę (c). Toks rezultatas laikomas apytiksliu ir turi būti nurodytas galutinėje ataskaitoje.
10. Pakartojamumas
Rezultatų skirtumas tarp dviejų lygiagrečių to paties mėginio matavimų, atliktų to paties analitiko, neturi viršyti:
0,5 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai flavofosfolipolio kiekis siekia nuo 1 iki 2 mg/kg,
25 % didžiausios vertės, kai kiekiai yra nuo 2 mg/kg iki 10 mg/kg,
20 % didžiausios vertės, kai kiekiai yra nuo 10 mg/kg iki 25 mg/kg,
5 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai kiekiai yra nuo 25 mg/kg iki 50 mg/kg,
10 % didžiausios vertės, kai kiekiai yra per 50 mg/kg.
______________
3 priedas
Mikroelementų – geležies, vario, mangano ir cinko nustatymas
1. Tikslas ir taikymo sritis
Šiuo metodu prekiniuose pašaruose nustatomi mikroelementai – geležis, varis, manganas ir cinkas. Mažiausia geležies nustatoma koncentracija yra 20 mg/kg, vario – 10 mg/kg, mangano – 20 mg/kg, cinko – 20 mg/kg.
2. Metodo esmė
Mėginio organinė medžiaga suardoma. Mėginys ištirpinamas druskos rūgštyje ir praskiedžiamas. Geležis, varis, manganas ir cinkas nustatomi atominės absorbcijos spektrometru.
3. Reagentai:
3.1. Reagentų ir tirpalų paruošimui naudojamas vanduo be nustatomų katijonų. Vanduo gaunamas du kartus distiliuojant borosilikatinio ar kvarcinio stiklo distiliatoriuje arba du kartus apdorojant jonitine derva.
3.2. Reagentai turi būti analiziškai gryni (a. p.) arba grynesni. Tuščiuoju bandymu reagentai turi būti patikrinami, ar juose nėra nustatomų elementų. Jei reikia, reagentai turi būti išgryninami. Vietoj aprašytų standartinių tirpalų gali būti naudojami komerciniai standartiniai tirpalai, jei jie turi garantiją ir prieš naudojimą buvo patikrinti:
3.2.4. 38 %-40 % (v/v) koncentracijos vandenilio fluoridas, turintis mažiau nei 1 mg/l geležies ir likutis po išgarinimo mažesnis nei 10 mg/l (skaičiuojant sulfatų kiekiu);
3.2.7. Standartinis geležies tirpalas (1000 mg /ml) ruošiamas taip: ištirpinama 1 g geležies vielos (a. p.) 200 ml 6 mol/l druskos rūgšties (3.2.2), pridedama 16 ml vandenilio peroksido (3.2.6) ir skiedžiama vandeniu iki 1 l:
3.2.8. standartinis vario tirpalas (1000 mg /ml) ruošiamas taip: 1 g vario miltelių (a. p.) ištirpinama 25 ml 6 mol/l druskos rūgšties (3.2.2), pridedama 5 ml vandenilio peroksido (3.2.6) ir praskiedžiama vandeniu iki 1 l:
3.2.9. standartinis mangano tirpalas (1000 mg/ml) ruošiamas taip: 1 g mangano miltelių (a. p.) ištirpinama 25 ml 6 mol/l druskos rūgšties (3.2.2) ir praskiedžiama vandeniu iki 1 l;
3.2.10. standartinis cinko tirpalas (1000 mg/ml) ruošiamas taip: 1 g cinko drožlių ar lapelių (a. p.) ištirpinama 25 ml 6 mol/l druskos rūgšties (3.2.2) ir praskiedžiama vandeniu iki 1 l;
4. Prietaisai:
4.2. Stikliniai indai iš atsparaus borosilikatinio stiklo, naudojami išimtinai mikroelementų nustatymui.
5. Matavimas:
5.1. Organinės medžiagos mėginiai:
5.1.1. Sudeginimas ir tirpalų paruošimas analizei[1]:
5.1.1.1. Į platininį ar kvarcinį tiglį (4.3) 0,2 mg tikslumu pasveriama 5 g-10 g mėginio (žr. 2 pastabą). Mėginys išdžiovinamas krosnyje 105 oC temperatūroje ir įdedamas į šaltą mufelinę krosnį (4.1). Krosnis uždaroma (žr. 3 pastabą) ir per 90 min. palaipsniui įkaitinama iki 450 oC-475 oC (žr. 4 pastabą). Siekiant pašalinti anglies junginius, tokia temperatūra palaikoma 4-16 val (galima per naktį). Krosnis atidaroma ir atvėsinama.
Pelenai atsargiai ir kruopščiai iš tiglio nuplaunami su 5 ml druskos rūgšties (3.2.1) į stiklinę (galima energinga CO2 išsiskyrimo reakcija). Maišant lašinama druskos rūgštis (3.2.1), kol nustoja išsiskirti burbuliukai. Sausai išgarinama retkarčiais pamaišant stikline lazdele.
Po to į likutį pridedama 15 ml 6 mol/l druskos rūgšties (3.2.2) ir apie 120 ml vandens. Išmaišoma stikline lazdele, kuri paliekama stiklinėje. Stiklinė uždengiama laikrodžio stiklu. Silpnai virinama, kol pelenai baigia tirpti. Filtruojama per bepelenį filtrinį popierių į 250 ml matavimo kolbą. Stiklinė ir filtrinis popierius perplaunami su 5 ml 6 mol/l druskos rūgšties (3.2.2) ir du kartus su verdančiu vandeniu. Pripilama vandens iki žymės. Tirpale yra apie 0,5 mol/l druskos rūgšties.
5.1.1.2. Jei ant filtrinio popieriaus lieka juodos nuosėdos (anglies dalelės), jos kartu su filtru dedamos į mufelinę krosnį ir vėl deginamos apie 3 val.-5 val. 450 oC-475 oC. Jei gaunami balti ar beveik balti pelenai, mėginys yra visiškai sudegęs. Liekana po sudeginimo ištirpinama 2 ml druskos rūgšties (3.2.1), sausai išgarinama, pridedama 5 ml 6 mol/l druskos rūgšties (3.2.2), pakaitinus filtruojama į matavimo kolbą, skiedžiama vandeniu iki žymės. Gautame tirpale yra apie 0,5 mol/l HCl.
5.1.2. Spektrometrinis nustatymas:
5.1.2.1. Kalibracinių tirpalų paruošimas
Kiekvienam nustatomam mikroelementui iš darbinių standartinių tirpalų (3.2.7.1, 3.2.8.1, 3.2.9.1 ir 3.2.10.1) paruošiama keletą kalibracinių tirpalų. Visuose tirpaluose HCl koncentracija yra apie 0,5 mol/l (geležies, mangano ir cinko tirpaluose) ir lantano chlorido koncentracija ekvivalentiška 0,1 % La (m/v). Mikroelementų kiekis tirpaluose turi neviršyti naudojamo spektrofotometro jautrumo ribų. Lentelėse pateikiami kalibracinių tirpalų sudėties pavyzdžiai. Atsižvelgiant į naudojamo spektrofotometro tipą ir jautrumą, galima paruošti kalibracinius tirpalus su kitokiomis mikroelementų koncentracijomis.
Geležies kalibracinių tirpalų sudėtis
Fe koncentracija mg /ml |
0 |
0,5 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
Darbinio standartinio tirpalo (3.2.7.1) kiekis ml |
0 |
0,5 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 mol/l HCl (3.2.2) kiekis ml |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
Lantano chlorido tirpalo kiekis (3.2.11) ml |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
Visi tirpalai skiedžiami vandeniu iki 100 ml.
Vario kalibracinių tirpalų sudėtis
Cu koncentracija mg /ml |
0 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
1,0 |
Darbinio standartinio tirpalo (3.2.8.1) kiekis ml |
0 |
1 |
2 |
4 |
6 |
8 |
10 |
6 mol/l HCl (3.2.2) kiekis ml |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
Visi tirpalai skiedžiami vandeniu iki 100 ml.
Mangano kalibracinių tirpalų sudėtis
Mn koncentracija mg /ml |
0 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
1,0 |
Darbinio standartinio tirpalo (3.2.9.1) kiekis ml |
0 |
1 |
2 |
4 |
6 |
8 |
10 |
6 mol/l HCl (3.2.2) kiekis ml |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
Lantano chlorido tirpalo kiekis (3.2.11) ml |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
Visi tirpalai skiedžiami vandeniu iki 100 ml.
Cinko kalibracinių tirpalų sudėtis
Zn koncentracija mg /ml |
0 |
0,05 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
Darbinio standartinio tirpalo (3.2.10.1) kiekis ml |
0 |
0,5 |
1 |
2 |
4 |
6 |
8 |
6 mol/l HCl (3.2.2) kiekis ml |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
Lantano chlorido tirpalo kiekis (3.2.11) ml |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
Visi tirpalai skiedžiami vandeniu iki 100 ml.
5.1.2.2. Tirpalų paruošimas analizei
Vario nustatymui naudojamas tirpalas paruoštas pagal 5.1.1 punktą. Siekiant tirpalo vario koncentracijos neviršijant kalibracinių tirpalų koncentracijų ribų, alikvotinė tirpalo dalis matavimo kolboje skiedžiama iki 100 ml su 0,5 mol/l HCl (3.2.3).
Geležies, mangano ir cinko nustatymui alikvotinė tirpalo, paruošto pagal 5.1.1 punktą, dalis paimama į 100 ml matavimo kolbą, pridedama 10 ml lantano chlorido tirpalo (3.2.11) ir skiedžiama iki žymės su 0,5 mol/l HCl (3.2.3) (žr. 5 pastabą).
5.1.2.3. Tuščiasis bandymas
Tuščiajame bandyme turi būti atliekami visi 5 punkte aprašyti veiksmai nenaudojant mėginio. Matavimas, atliktas su kalibraciniu tirpalu „0“, negali būti vertinamas kaip tuščiasis bandymas.
5.1.2.4. Atominės absorbcijos matavimas
Kalibracinių ir tiriamųjų tirpalų atominės absorbcijos matavimai atliekami naudojant oksiduojančiąją acetileno ir deguonies liepsną esant tokiems bangų ilgiams: geležies nustatymui – 248,3 nm, vario – 324,8 nm, mangano – 279,5 nm, cinko – 213,8 nm. Matavimai kartojami keturis kartus.
6. Rezultatų apskaičiavimas
Naudojantis kalibracine kreive apskaičiuojamos mikroelementų koncentracijos tiriamajame tirpale. Rezultatas išreiškiamas mikroelemento kiekio miligramais kilograme mėginio.
7. Pakartojamumas
Skirtumas tarp dviejų lygiagrečių to paties mėginio matavimų, atliktų to paties analitiko, neturi viršyti:
10 % didesnio rezultato vertės, kai mikroelemento koncentracija yra 50 mg/kg – 100 mg/kg;
10 mg/kg absoliučia verte, kai mikroelemento koncentracija yra 100 mg/kg – 200 mg/kg;
5 % didesnio rezultato vertės, kai mikroelemento koncentracija yra per 200 mg/kg;
5 mg/kg absoliučia verte, kai mikroelemento koncentracija yra iki 50 mg/kg.
PASTABOS:
1. Nustatant mikroelementus svarbus yra užteršimo pavojus, ypač cinku, variu ir geležimi, todėl prietaisai, naudojami mėginiams paruošti, turi būti be šių metalų. Siekiant sumažinti užteršimo pavojų dirbama nedulkėtoje patalpoje su kruopščiai išvalytais prietaisais ir išplautais indais. Cinko nustatymas ypač jautrus daugeliui užteršimo tipų, tokių kaip stiklai, reagentai, dulkės ir t. t.
2. Mėginio, kuris turi būti sudeginamas, masė apskaičiuojama atsižvelgiant į apytikrį mikroelemento kiekį pašare ir naudojamo spektrofotometro jautrumą. Tam tikrų pašarų su mažu mikroelementų kiekiu gali tekti imti 10 g-20 g ir pagaminti tik 100 ml pelenų tirpalo.
5. Didelis fosforo kiekis gali trukdyti geležies, mangano ir cinko nustatymui. Trukdžiai pašalinami pridėjus lantano chlorido tirpalo (3.2.11). Jei mėginyje esančių kalcio (Ca), magnio (Mg) ir fosforo (P) kiekių (procentais) santykis (Ca+Mg)/P didesnis už 2, lantano chlorido tirpalo (3.2.11) į tiriamus ir kalibracinius tirpalus galima nedėti.
______________
1 1 mg cinko bacitracino atitinka 42 tarptautinius vienetus (T.V.).
2 Kiti metodai taip pat gali būti naudojami su sąlyga, jei yra nustatyta, jog tie metodai duoda panašias bakterijų suspensijas.
3 Gali būti naudojama bet kuri prekyboje esanti panašios sudėties mitybinė terpė, su kuria gaunami tokie patys rezultatai.
1 Kiti metodai taip pat gali būti naudojami su sąlyga, jei yra nustatyta, jog tie metodai duoda panašias bakterijų suspensijas.
2 Gali būti naudojama bet kuri prekyboje esanti mitybinė terpė, kuri būtų panašios sudėties ir duotų tokius pačius rezultatus.
1 Gali būti naudojama bet kuri prekyboje esanti mitybinė terpė, kuri būtų panašios sudėties ir duotų tokius pačius rezultatus.
[1] Žoliniuose pašaruose (šviežiuose ir džiovintuose) gali būti didelis kiekis silicio junginių, kurie gali surišti mikroelementus. Šie silicio junginiai turi būti pašalinti. Todėl mėginiai iš tokių pašarų apdorojami kitaip. Dirbama pagal 5.1.1.1 punktą iki filtravimo imtinai. Filtrinis popierius su netirpiais likučiais du kartus perplaunamas verdančiu vandeniu, sudedamas į platininį tiglį (4.3) ir deginamas mufelinėje krosnyje žemesnėje nei 550 oC temperatūros, kol visiškai nelieka anglies. Atšaldoma, pridedama keletą lašų vandens, 10 ml-15 ml vandenilio fluorido (3.2.4) ir sausai išgarinama maždaug 150 oC temperatūroje. Jei lieka bent koks silicio junginių likutis, dar kartą tirpinama keliuose mililitruose vandenilio fluorido (3.2.4) ir sausai išgarinama. Pridedama penki lašai sieros rūgšties (3.2.5) ir kaitinama, kol nustoja išsiskirti balti dūmai. Pridedama 5 ml 6 mol/l druskos rūgšties (3.2.2) ir apie 30 ml vandens, kaitinama, filtruojama į 250 ml matavimo kolbą ir skiedžiama su vandeniu iki žymės. Tirpale yra apie 0,5 mol/l druskos rūgšties. Toliau dirbama pagal 5.1.2 punktą.