LIETUVOS RESPUBLIKOS APLINKOS MINISTRO

 

Į S A K Y M A S

DĖL APLINKOS APSAUGOS NORMATYVINIO DOKUMENTO LAND 45-2003 PATVIRTINIMO

 

2004 m. balandžio 19 d. Nr. D1-193

Vilnius

 

Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų įstatymo (Žin.,2000, Nr. 36-987) 6 straipsniu, Cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų aplinkai, savybių tyrimo tvarka, patvirtinta aplinkos ministro 2000 m. gruodžio 29 d. įsakymu Nr. 762/556 (Žin., 2001, Nr. 3-60),

1. Tvirtinu Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos normatyvinio dokumento LAND 45-2001 „Cheminių medžiagų ir preparatų ekotoksiškumo tyrimo metodai“ papildymą, LAND 45-2003 (pridedama).

2. Nustatau, kad aplinkos apsaugos normatyvinis dokumentas LAND 45-2003:

2.1. įsigalioja nuo 2004 m. gegužės 1 d.;

2.2. yra privalomas juridiniams ir fiziniams asmenims, nustatyta tvarka atliekantiems cheminių medžiagų ir preparatų tyrimus.

 

 

APLINKOS MINISTRAS                                                                          ARŪNAS KUNDROTAS

 

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos aplinkos ministro

2004 m. balandžio 19 d. įsakymu Nr. D1-193

 

CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ IR PREPARATŲ EKOTOKSIŠKUMO TYRIMO METODAI

LAND45-2003

(LAND 45 – 2001 papildymas)

 

 

BIOLOGINIS KONCENTRAVIMAS: BANDYMAS SU ŽUVIMIS,

ESANT PRATEKĖJIMO SĄLYGOMS (C 13 )

 

1 METODAS

Šis biologinio koncentravimo metodas yra OECD TG 305 (1996) kopija.

 

1.1 ĮVADAS

Šis metodas aprašo pratekėjimo sąlygomis vykstančio medžiagų biologinio koncentravimo gebos žuvyse apibūdinimo procedūrą. Nors tyrimams, atliekamiems pratekėjimo režimu, pabrėžtinai teikiama pirmenybė, leidžiama naudoti ir pusiau stacionarius režimus, jei jie atitinka patikimumo kriterijus.

Metodas pateikia pakankamai išsamių bandymą atlikti reikalingų detalių, palikdamas atitinkamą laisvę eksperimento schemą pritaikyti konkrečių laboratorijų esamoms sąlygoms ir skirtingoms bandomųjų medžiagų savybėms. Jis tinkamiausias patvarioms organinėms medžiagoms, kurių log Pow vertės yra nuo 1,5 iki 6,0 (1), tačiau gali būti taikomas ir ypač lipofilinėms medžiagoms (kurių log Pow > 6,0). Tokių ypač lipofilinių medžiagų biokoncentravimo faktoriaus (BKF), kartais žymimo KB, išankstinis įvertis greičiausiai būtų didesnis, nei nuostoviosios būsenos biokoncentravimo faktoriaus (BKFnb) vertė, kurios reikėtų laukti iš laboratorinių bandymų. Medžiagų, kurių log Pow vertės yra iki 9,0, išankstiniai biokoncentravimo faktoriaus įverčiai gali būti gauti, naudojant Bintein ir kt. lygtį (2). Parametrams, kurie apibūdina biokoncentravimo gebą, priklauso sugerties greičio konstanta (k1), apsivalymo greičio konstanta (k2) ir BKFmb.

Radioaktyvias žymenas turinčios bandomosios medžiagos gali palengvinti vandens ir žuvų bandinių analizę ir gali būti naudojamos, siekiant nustatyti, ar reikia atlikti irimo produktų identifikavimą ir kiekybinį nustatymą. Jei matuojamas bendras radioaktyviųjų likučių kiekis (pvz., deginant arba soliubilizuojant audinius), BKF turi būti pagrįstas duomenimis apie pradinio junginio, visų sulaikytų metabolitų, taip pat įsisavintos anglies kiekiu. Taigi BKF vertės, pagrįstos bendruoju radioaktyviųjų likučių kiekiu, negali būti tiesiogiai lyginamos su BKF vertėmis, gautomis atliekant tik pradinio junginio selektyviąją analizę.

Norint nustatyti BKF, pagrįstą tik pradinio junginio kiekiu, tyrimuose su radioaktyviomis žymenomis gali būti naudojami gryninimo būdai, ir gali būti apibūdinti pagrindiniai medžiagų apykaitos produktai, jei laikoma, kad tai yra būtina. Analizuojant ir identifikuojant likučius audiniuose, galima sujungti medžiagų apykaitos tyrimus žuvyse su biokoncentravimo tyrimais.

 

1.2 APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI

Biokoncentravimas ir bioakumuliacija – bandomosios medžiagos koncentracijos didėjimas organizme (tam tikruose audiniuose) arba organizmo paviršiuje, lyginant su bandomosios medžiagos koncentracija supančioje terpėje.

Biokoncentravimo faktorius (BKF arba Kb) – bandomosios medžiagos koncentracijos žuvies viduje ir paviršiuje arba jos apibrėžtuose audiniuose (Cf, μg/g (ppm)) ir cheminės medžiagos koncentracijos supančioje terpėje (Cw, μg/ml (ppm)) santykis per bet kurį šio koncentravimo bandymo sugerties etapą.

Nuostoviosios būsenos biokoncentravimo faktorius (BKFmb arba Kb) ilgesnį laiko tarpą daug nekinta, jei bandomosios medžiagos koncentracija supančioje terpėje nekinta.

Horizontalioji dalis arba nuostovioji būsena pasiekiama tuomet, kai bandomosios medžiagos koncentracijos žuvyje (Cf) priklausomybės nuo laiko kreivė tampa lygiagreti laiko ašiai, o trys Cf vertės, gautos analizuojant mažiausiai kas dvi paras paeiliui paimtus bandinius, viena nuo kitos nesiskiria daugiau kaip ± 20 %, ir nėra didelių skirtumų tarp trijų bandinių ėmimo periodų. Kai analizuojami sujungti bandiniai, reikia ne mažiau kaip keturių paeiliui atliktų analizių. Lėtai sugeriamoms bandomosioms medžiagoms tinkamesni būtų septynių parų tarpai.

Kinetinis biokoncentravimo faktorius (BKFk) – biologinio koncentravimo faktorius, apskaičiuotas tiesiog iš kinetinių greičio konstantų (k1 ir k2).

Pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas (Pow) – cheminės medžiagos tirpumo n-oktanolyje ir vandenyje santykis, esant pusiausvirai (A. 8 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais), taip pat išreiškiamas kaip K“w. Cheminės medžiagos biokoncentravimo vandens organizmuose gebos rodikliu taikomas Pow logaritmas.

Poveikio arba sugerties etapas – laiko tarpas, per kurį žuvis yra veikiama bandoma chemine medžiaga.

Sugerties greičio konstanta (k1) – skaitinė vertė, apibūdinanti bandymo medžiagos koncentracijos žuvyje arba jos paviršiuje (arba apibrėžtuose jos audiniuose) didėjimo greitį, kai žuvis veikiama chemine medžiaga (k1 išreiškiama (para)-1).

Etapas po veikimo, arba apsivalymo (išnykimo) etapas – laikas, kai bandymo žuvis perkelta iš terpės su bandomąja medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos nėra, ir per kurį tiriamas bandomosios medžiagos išsivalymas (arba tiesiog išnykimas) iš bandymo žuvies arba tam tikrų jos audinių.

Apsivalymo (išnykimo) greičio konstanta (k2) – skaitinė vertė, apibūdinanti bandomosios medžiagos koncentracijos bandymo žuvyje (arba apibrėžtuose jos audiniuose) mažėjimo greitį po to, kai bandymo žuvis buvo pernešta iš terpės su bandomąja medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos nėra (k2 išreiškiama (para)-1).

 

1.3 BANDYMŲ METODO ESMĖ

Bandymą sudaro du etapai: poveikio (sugerties) etapas ir etapas po poveikio (apsivalymo). Per sugerties etapą vienos rūšies žuvų grupės veikiamos mažiausiai bent dviejų koncentracijų bandomąja medžiaga. Išsivalyti jos pernešamos į terpę be bandomosios medžiagos. Išsivalymo etapas yra būtinas, išskyrus tuos atvejus, kai medžiagos sugertis (pereiga) buvo nedidelė (pvz., BKF yra mažesnis kaip 10). Bandomosios medžiagos koncentracija žuvyje arba jos paviršiuje (arba apibrėžtuose jos audiniuose) nustatoma per abu bandymo etapus. Kontrolinė žuvų grupė laikoma tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir bandomųjų koncentracijų, bet be bandomosios medžiagos, kad biokoncentravimo bandyme galimas neigiamas pasekmes būtų galima palyginti su kontroline grupe ir gauti bandomosios medžiagos foninių koncentracijų.

Sugerties etapas tęsiamas 28 paras, jei neįrodoma, kad pusiausvyra yra pasiekta anksčiau. Sugerties etapo trukmės ir laiko, kai bus pasiekta nuostovioji būsena, laiko prognozė gali būti padaryta pagal 3 priedo lygtį. Pernešus žuvis į kitą švarų indą su ta pačia terpe, bet be bandomosios medžiagos, pradedamas apsivalymo periodas. Pageidautina, jei įmanoma, biologinio koncentravimo fektorių apskaičiuoti ir kaip santykį koncentracijos žuvyje (Cf) su koncentracija vandenyje (Cw) tariamosios nuostoviosios būsenos sąlygomis (BKFmb), ir kaip kinetinį biologinio koncentravimo fektorių (BKFk), išreiškiamą sugerties (k1) ir taikomi sudėtingesni modeliai (5 priedas).

Jei nuostovioji būsena per 28 paras nepasiekiama, sugerties etapas turi būti pratęstas, kol ji bus pasiekta, arba iki 60 parų priklausomai nuo to, kas anksčiau; tuomet pradedamas apsivalymo etapas.

Sugerties greičio konstanta, apsivalymo (išnykimo) greičio konstanta (ar konstantos, jei naudojami sudėtingesni modeliai), biologinio koncentravimo faktorius, ir, jei įmanoma, kiekvieno šių parametrų pasikliovimo ribos apskaičiuojamos pagal modelį, kuris geriausiai aprašo žuvyse ir vandenyje išmatuotas bandymo medžiagos koncentracijas.

BKF yra išreiškiamas kaip žuvies bendrosios drėgnos masės funkcija. Specialiems tikslams, jei žuvis yra pakankamai didelė, gali būti naudojami atitinkami audiniai arba organai (pvz., raumuo, kepenys), arba žuvis gali būti padalinta į valgomą (filė) ir nevalgomą (viduriai) dalis. Yra aiški daugelio organinių medžiagų biologinio koncentravimo gebos ir lipofiliškumo priklausomybė, atitinkama priklausomybė yra ir tarp riebalų kiekio bandymų žuvyse ir stebimo tokių medžiagų biologinio koncentravimo. Tokiu būdu, norint sumažinti šį bandymo rezultatų kintamumo šaltinį, lipofilinių (t.y. kurių log Pow > 3) medžiagų biologinis koncentravimas turi būti apskaičiuojamas ne tik viso kūno masei, bet ir riebalų kiekiui.

Kai tai įmanoma atlikti, riebalų kiekis turi būti nustatomas toje pačioje biologinėje medžiagoje, kurioje nustatoma bandomoji medžiaga.

 

1.4 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ

Prieš atliekant biologinio koncentravimo bandymą, apie bandomąją medžiagą turi būti žinoma tokia informacija:

a) tirpumas vandenyje;

b) pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas Pow (taip pat išreikštas kaip Kow nustatomas HPLC metodu – A. 8 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais);

c) hidrolizė;

d) fotocheminiai virsmai vandenyje, nustatyti saulės arba dirbtinės spinduliuotės sąlygomis ir biologinio koncentravimo bandyme naudotos spinduliuotės sąlygomis (3);

e) paviršiaus įtemptis (t. y. medžiagoms, kurioms log Pow negali būti nustatytas);

f) garų slėgis;

g) biologinio skaidomumo lengvumas (jei reikia).

Kita reikalinga informacija yra toksiškumas bandyme naudojamoms žuvų rūšims, geriausiai – asimptotiška (t.y. nuo laiko nepriklausanti) LC50 vertė. Reikia turėti tinkamą žinomo tikslumo ir jautrumo analizinį metodą bandomajai medžiagai bandymo tirpaluose ir biologinėje medžiagoje kiekybiškai nustatyti, kartu su bandinių ruošimo ir laikymo detalėmis. Tai pat turi būti žinoma bandymo medžiagos analizinio nustatymo vandenyje ir žuvies audiniuose riba. Kai naudojama 14C žymėta bandymo medžiaga, turi būti žinoma radioaktyvumo dėl priemaišų buvimo procentinė dalis.

 

1.5 BANDYMŲ PAGRĮSTUMAS (patikimumas)

Bandymai laikomi pagrįstais, jeigu laikomasi šių sąlygų:

- temperatūros svyravimas ne didesnis kaip ± 2 °C;

- ištirpusio deguonies koncentracija ne mažiau 60 % oro soties verties;

- per sugerties etapą bandymo medžiagos koncentracija bandymo induose palaikoma vidutinių išmatuotų verčių ribose, su ne didesniu kaip ± 20 % nuokrypiu;

- bandymo pabaigoje tiek kontrolinių, tiek ir veikiamų žuvų mirtingumas arba kiti neigiami veiksniai arba liga yra mažesni kaip 10 %; jei bandymas vyksta kelias savaites arba mėnesius, mirtingumas arba kiti neigiami veiksniai abiejose žuvų grupėse turi būti mažesnis kaip 5 %, o bendras mirtingumas ne didesnis kaip 30 %.

 

1.6 ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Tikrinant tyrimo metodiką, galima naudoti etalonines medžiagas su žinoma biokoncentravimo geba. Etaloninės medžiagos iki šiol nėra apibrėžtos.

 

1.7 BANDYMŲ METODO APRAŠAS

 

1.7.1 Aparatūra

Reikia žiūrėti, kad visų įrangos dalių gamybai nebūtų naudojamos medžiagos, kurios gali tirpti, sugerti arba išsiplauti ir turėti neigiamą poveikį žuvims. Gali būti naudojami stačiakampio arba ritinio formos standartiniai indai, kurie būtų pagaminti iš chemiškai inertiškų medžiagų ir kurių tūris atitiktų įkrovos dydį. Minkštų plastikinių vamzdžių turi būti naudojama kuo mažiau. Geriausiai naudoti vamzdžius iš teflono (R), nerūdijančio plieno arba stiklo. Patirtis parodė, kad medžiagoms su dideliu sugerties koeficientu, pvz., sintetiniams piretroidams, gali būti reikalingas silanizuotas stiklas. Tokiais atvejais įranga po naudojimo turėtų būti išmesta.

 

1.7.2 Vanduo

Bandymuose dažniausiai naudojamas gamtinis vanduo, jis turi būti imamas iš neužterštos ir vienodos kokybės gavimo vietos. Skiedimo vandens kokybė turi būti tokia, kad pasirinktų rūšių žuvys išgyventų per aklimatizavimo ir bandymo laiką ir jų išvaizdoje arba elgesyje neatsirastų ko nors neįprasto. Geriausiu atveju reikėtų parodyti, kad bandomosios rūšys skiedimo vandenyje gali išlikti, augti ir daugintis (pvz., laboratoriniame veisimo bandyme arba gyvenimo ciklo toksikologiniame bandyme). Apibūdinant vandenį, turi būti nurodyta pH vertė, kietumas, bendrasis kietųjų dalelių kiekis, bendroji organinė anglis, taip pat pageidautina nurodyti amonio ir nitritų jonų kiekį bei šarmingumą, o jūrinėms žuvų rūšims – druskingumą. Parametrai, kurie atitiktų optimalias žuvų gyvavimo sąlygas, yra žinomi, tačiau 1 priede pateiktos rekomenduojamos bandymuose naudojamų gėlo ir jūros vandens komponentų didžiausios koncentracijos.

Vandens kokybė visą bandymo laiką turi būti pastovi. Vandens pH turi būti nuo 6,0 iki 8,5, tačiau konkrečiame bandyme pH reikšmė turi būti ± 0,5 pH vieneto ribose. Norint užtikrinti, kad skiedimo vanduo neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pavyzdžiui, sudarydamas kompleksus su bandomąja medžiaga) arba neigiamai veiktų žuvų būrio elgesį, per tam tikrus laiko tarpus turi būti imami bandiniai analizei. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb. Zn, Hg. Cd. Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca, Mg, Na, K, Ci SO4), pesticidų (pvz., bendrojo fosforoorganinių ir chlororganinių pesticidų kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti atliekama, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė yra gana pastovi. Jei būtų parodyta, kad vandens kokybė yra pastovi bent metus, analizė gali būti atliekama ne taip dažnai, o tarpai tarp jų didesni (pvz., kas šešis mėnesius).

Natūralus kietųjų dalelių kiekis, taip pat bendrosios organinės anglies (BOA) kiekis skiedimo vandenyje turi būti kuo mažesnis, kad būtų išvengta bandomosios medžiagos absorbcijos organinėse medžiagose, nes gali sumažėti bandomosios medžiagos biologinis prieinamumas (4). Didžiausias leistinas kietųjų dalelių kiekis yra 5 mg/l (skaičiuojant pagal medžiagas, sulaikomas 0,45 μm filtru), o bendrosios organinės anglies – 2 mg/l (žr. 1 priedą). Prireikus prieš naudojimą vanduo turi būti filtruojamas. Bandymų žuvų (ekskrementų) ir maisto likučių indėlis į bendrosios organinės anglies kiekį turi būti kiek įmanoma mažesnis. Organinės anglies koncentracija bandymo inde visą bandymo laiką neturi viršyti su bandomąja medžiaga patekusios organinės anglies koncentracijos ir, jei naudojama, soliubilizuojančioje medžiagoje, esančios organinės anglies koncentracijos daugiau kaip 10 mg/l (± 20 %).

 

1.7.3 Bandymų tirpalai

Ruošiamas reikiamos koncentracijos bandomosios medžiagos pradinis tirpalas. Pradinį tirpalą geriausiai būtų ruošti bandomąją medžiagą tiesiog maišant arba plakant skiedimo vandenyje. Naudoti tirpiklius arba disperguojančias (solubilizuojančias) medžiagas nerekomenduojama; tačiau kai kuriais atvejais, norint pagaminti pakankamai koncentruotą pradinį tirpalą, jų gali prireikti. Tirpikliai, kuriuos būtų galima naudoti, yra etanolis, metanolis, etilenglikolio monometilo eteris (etandiolio monometilo eteris), etilenglikolio dimetilo eteris (etandiolio dimetilo eteris), dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Disperguojančios medžiagos, kurias galima naudoti, yra Cremophor RH40, Tween 80, metilceliuliozės 0,01 % tirpalas ir HCO-40. Naudojant biologiškai lengvai suardomas medžiagas, reikia žiūrėti, kad neatsirastų problemų dėl bakterijų augimo bandymų pratekančiame vandenyje. Bandomoji medžiaga gali turėti radioaktyvius žymenis ir turi būti aukščiausio grynumo (pvz., geriausiai > 98 %).

Bandymuose su pratekančiu vandeniu bandomosioms koncentracijoms bandymų induose užtikrinti reikalinga sistema, kuri nuolat dozuotų ir skiestų bandomosios medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozuojantis siurblys, proporcinis skiestuvas, prisotinimo sistema). Geriausiai būtų daryti bent penkis vandens tūrio keitimus per dieną kiekvienoje bandymų talpoje. Geriau naudoti pratekėjimo režimą, tačiau, jei jis netinka (pvz., kai tai kenkia bandomiesiems organizmams), galima taikyti pusiau statinį metodą, jei jis atitinka pagrįstumo kriterijus. Pradinio tirpalo ir skiedimo vandens srautas turi būti tikrinamas 48 valandas prieš bandymą ir vėliau visą bandymo laiką, bent kasdieną. Šį kartą tikrinant nustatomas pratekėjimo srautas ir užtikrinama, kad jis inde arba tarp indų nesikeistų daugiau kaip 20 %.

 

1.7.4 Žuvų rūšies parinkimas

Pasirenkant žuvų rūšis, svarbu, ar lengva jas gauti, ar galima gauti tinkamų dydžių ir ar yra sąlygos jų priežiūrai laboratorijoje. Kiti žuvų rūšies pasirinkimo kriterijai apima rekreacinę, komercinę, ekologinę svarbą, taip pat palyginamąjį jautrumą, sėkmingą naudojimą praeityje ir t.t.

Rekomenduotos bandomosios rūšys pateiktos 2 priede. Galima naudoti kitas rūšis, tačiau tinkamoms bandymo sąlygoms užtikrinti gali tekti keisti bandymo sąlygas. Šiuo atveju ataskaitoje turi būti pateikta rūšies pasirinkimo priežastis ir bandymų metodas.

 

1.7.5 Žuvų laikymas

Žuvų populiacija bent dvi savaites aklimatizuojama vandenyje bandymo temperatūroje ir pakankamai šeriama tos pačios rūšies pašaru, kuris bus naudojamas atliekant bandymą.

Po 48 valandų stabilizacijos periodo registruojamas mirtingumas ir taikomi tokie kriterijai:

- jei populiacijos mirtingumas per septynias paras didesnis kaip 10%, visa partija atmetama;

- jei populiacijos mirtingumas per septynias paras 5-10%, aklimatizuojama dar septynias papildomas paras;

- jei populiacijos mirtingumas per septynias paras mažesnis kaip 5 %, partija priimama, jei mirtingumas per kitas septynias paras didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama.

Reikia žiūrėti, kad bandymams naudojamos žuvys neturėtų pastebimų ligų ir apsigimimų. Pašalinamos visos ligotos žuvys. Žuvys dvi savaites prieš pradedant bandymą arba atliekant bandymą neturi būti gydomos.

 

1.8 Bandymo atlikimas

 

1.8.1 Išankstinis bandymas

Gali praversti atlikti išankstinį bandymą, norint optimizuoti galutinio bandymo sąlygas, pvz., bandymo medžiagos koncentraciją (-as), sugerties ir apsivalymo etapų trukmę.

 

1.8.2 Veikimo sąlygos

1.8.2.1 Sugerties etapo trukmė

Sugerties etapo trukmės prognozavimas gali būti atliekamas remiantis praktiniu patyrimu (pvz., ankstesniu panašios cheminės medžiagos sugerties tyrimu) arba pagal tam tikras empirines priklausomybes, naudojant tirpumo vandenyje duomenis arba bandymo medžiagos pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą (žr. 3 priedą).

Sugerties etapas turi trukti 28 paras, jei negalima įrodyti, kad pusiausvyra pasiekta anksčiau. Jei nuostovioji būsena nepasiekiama per 28 paras, sugerties etapas turi būti pratęstas, atliekant tolesnius matavimus, kol pasiekiama nuostovioji būsena arba iki 60 parų, atsižvelgiant į tai, kas trumpiau.

1.8.2.2. Apsivalymo etapo trukmė

Pusės sugerties etapo laiko dažniausiai pakanka, kad į organizmą patekusios medžiagos kiekis sumažėtų iki atitinkamos vertės (pvz., 95 %) (dėl šio įverčio paaiškinimo žr. 3 priedą). Jei laikas, reikalingas 95 % išnykimo vertei pasiekti, yra neįvykdomai ilgas, pavyzdžiui, du kartus ilgesnis už normalią sugerties etapo trukmę (t.y. daugiau kaip 56 paros), galima naudoti trumpesnį periodą (pvz., kol bandomosios medžiagos koncentracija pasiekia mažiau nei 10 % nuostoviosios būsenos koncentracijos). Tačiau medžiagų, kurių sugerties ir apsivalymo modelis yra sudėtingesnis už tą, kurį vaizduoja žuvų vienoje talpoje modelis, atitinkantis pirmojo laipsnio kinetiką, išnykimo greičio konstantoms nustatyti naudojami ilgesni apsivalymo etapai. Tačiau šio periodo trukmę gali nusakyti laikas, kai bandymo medžiagos koncentracija žuvyje vis dar yra didesnė už analizinio aptikimo ribą.

1.8.2.3. Bandomųjų žuvų skaičius

Bandomajai medžiagos koncentracijai nustatyti parenkamas toks žuvų skaičius, kad per kiekvieną bandinio ėmimą kiekvienam bandiniui tektų ne mažiau kaip keturios žuvys. Jei reikia didesnio statistinio reikšmingumo, vienam bandiniui žuvų reikės daugiau.

Jei naudojamos suaugusios žuvys, reikia nurodyti, kurios vienos lyties ar abiejų lyčių žuvys buvo naudojamos bandyme. Jei naudojamos abiejų lyčių žuvys, prieš veikimo pradžią turi būti dokumentuota, kad lyčių riebalų kiekio skirtumas yra nereikšmingas; gali būti būtina suleisti visas vyriškosios ir moteriškosios lyties žuvis į vieną grupę.

Kiekvienam atskiram bandymui parenkamos panašios masės žuvys, kad mažiausių žuvų masė nebūtų mažesnė kaip du trečdaliai didžiausios žuvies masės. Visos žuvys turi būti to paties amžiaus ir iš to paties gavimo šaltinio. Kartais paaiškėja, kad žuvų masė ir amžius turi didelę įtaką BKF vertėms (1), todėl šios detalės turi būti tiksliai registruojamos. Norint įvertinti vidutinę masę, rekomenduojama iš turimų žuvų atsargų prieš bandymą pasverti po bandinį.

1.8.2.4. Įkrova

Norint mažinti Cw sumažėjimą dėl žuvų pridėjimo bandymo pradžioje ir išvengti ištirpusio deguonies koncentracijos mažėjimo, naudojami dideli vandens ir žuvų kiekio santykiai. Svarbu, kad įkrovos dydis atitiktų naudojamą bandymų rūšį. Bet kuriuo atveju dažniausiai rekomenduojamas įkrovos dydis yra 0,1 – 1,0 g žuvies (šlapios masės) litrui vandens parai. Dideles įkrovas galima taikyti, jei įrodoma, kad reikiamą bandymo medžiagos koncentraciją įmanoma palaikyti ± 20 % ribose ir kad ištirpusio deguonies koncentracija nesumažėja daugiau kaip iki 60 % soties koncentracijos.

Pasirenkant tinkamus įkrovos režimus, atsižvelgiama į žuvų rūšies įprastąsias gyvenimo aplinkos sąlygas. Pavyzdžiui, dugne gyvenančioms žuvims tam pačiam vandens tūriui gali būti reikalingas didesnis akvariumo dugno plotas nei jūros žuvų rūšims.

1.8.2.5. Šėrimas

Aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu žuvys maitinamos tinkamu pašaru, kurio yra žinomas riebalų ir baltymų bendrasis kiekis ir kurio pakanka, kad žuvys būtų sveikos ir būtų palaikoma jų kūno masė. Žuvys aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu maitinamos kiekvieną dieną, pašaro kiekis sudaro maždaug 1 – 2 % kūno masės per parą; taip per bandymą riebalų koncentracija daugumoje žuvų rūšių palaikoma santykinai pastovi. Norint palaikyti kūno masės ir riebalų kiekio atitikimą, pašaro kiekis turi būti perskaičiuojamas, pvz., kartą per savaitę. Šiam apskaičiavimui atlikti žuvų masė kiekviename inde gali būti įvertinta pagal neseniai iš šio indo bandiniui paimtų žuvų masę. Nesveriamos žuvys, liekančios bandymų inde.

Nesuėstas pašaras ir išmatos išsiurbiami iš indo kasdien netrukus po šėrimo (nuo 30 minučių iki vienos valandos). Indai visą bandymo laiką turi būti palaikomi kuo švaresni, kad būtų kuo mažesnė organinių medžiagų koncentracija, nes organinė anglis gali riboti bandomosios medžiagos biologinį prieinamumą (1).

Kadangi daugelis pašarų gaminami iš žuvų miltų, pašaras turi būti analizuojamas, norint aptikti bandomosios medžiagos. Taip pat pageidautina pašaro pesticidų ir sunkiųjų metalų analizė.

1.8.2.6. Šviesa ir temperatūra

Apšvietimo periodo trukmė dažniausiai būna 12-16 valandų, o temperatūra (± 2 °C) turi būti tinkama žuvų rūšims (žr. 2 priedą). Turi būti žinomas apšvietimo tipas ir jo ypatybės. Būtina imtis atsargumo priemonių dėl galimų bandomosios medžiagos fotocheminių virsmų tiriant, naudojant apšvietimą. Kai kuriais atvejais tikslinga naudoti filtrą, kuris nepraleistų trumpesnių nei 290 nm bangos ilgio UV spindulių.

1.8.2.7. Bandymuose naudojamos koncentracijos

Žuvys pratekėjimo sąlygomis veikiamos vandenyje bent dviejų koncentracijų bandomąja medžiaga. Dažniausiai didesnė (arba didžiausia) bandomosios medžiagos koncentracija parenkama taip, kad ji būtų lygi maždaug 1 % jos ūmios asimptotinės LC50 ir būtų bent dešimt kartų didesnė už jos aptikimo ribą vandenyje naudojamu analizės metodu.

Didžiausią bandymo medžiagos koncentraciją taip pat galima nustatyti, padalinant ūmios 96 h LC5o vertę iš atitinkamo ūmaus ir chroniško koncentracijų santykio (kai kurių cheminių medžiagų atitinkamas santykis gali kisti maždaug nuo 3 iki 100). Jei įmanoma, parenkama kitokia arba kitokios koncentracijos, kuri (arba kurios) būtų didesnė už nurodytąją 10 kartų. Jei tai neįmanoma dėl 1 % LC50 sąlygos ir analizinio nustatymo ribos, galima taikyti mažesnį nei 10 daugiklį arba turi būti atsižvelgta į galimybę naudoti 14C žymėtą bandomąją medžiagą. Neturi būti naudojama koncentracija, kuri būtų didesnė už bandomosios medžiagos tirpumą.

Jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, jos koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1ml/l ir ji turi būti vienoda visuose bandymo induose. Turi būti žinoma, kokią bendrosios organinės anglies kiekio dalį bandymo vandenyje sudaro ši medžiaga ir bandomoji medžiaga kartu. Tačiau reikia stengtis, kad tokių medžiagų naudoti nereikėtų.

1.8.2.8. Kontroliniai bandymai

Papildomai turi būti tikrinamas skiedimo vanduo arba, jei tinka, vanduo su soliubilizuojančia medžiaga, jei buvo nustatyta, kad soliubilizuojanti medžiaga neveikia žuvų. Jei taip nėra, turi būti atliekami abu tikrinimai.

 

1.8.3 Vandens kokybės matavimų dažnis

Atliekant bandymą, visuose induose būtina matuoti ištirpusį deguonį, BOA, pH ir temperatūrą. Bendrasis kietumas ir druskingumas, jei reikia, turi būti nustatyti kontroliniuose bandymuose ir viename inde su didesne (arba didžiausia) koncentracija. Ištirpęs deguonis ir druskingumas, jei reikia, turi būti nustatomi mažiausiai tris kartus – sugerties etapo pradžioje, maždaug viduryje ir pabaigoje, o per apsivalymo etapą- kartą per savaitę. BOA turi būti nustatyta bandymo pradžioje (24 valandos ir 48 valandos prieš pradedant sugerties etapą) prieš žuvis suleidžiant ir bent kartą per savaitę sugerties ir apsivalymo etapų metu. Temperatūra turi būti matuojama kasdien, pH kiekvieno laikotarpio pradžioje ir pabaigoje, o kietumas – kartą, atliekant kiekvieną bandymą. Temperatūra bent viename inde turi būti stebima nuolat.

 

1.8.4 Bandinių ėmimas ir žuvų bei vandens analizė

1.8.4.1 Žuvų ir vandens bandinių ėmimo grafikas

Vanduo iš bandymo indų nustatyti bandomosios medžiagos koncentraciją imamas prieš suleidžiant žuvis ir sugerties bei išsivalymo etapų metu. Minimalus vandens bandinių skaičius imamas tuomet, kai imami žuvų bandiniai ir prieš šeriant. Sugerties laiką bandomosios medžiagos koncentracija nustatoma, norint kad būtų laikomasi pagrįstumo kriterijų.

Žuvų bandiniai imami bent penkis kartus per sugerties etapą ir bent keturis kartus per išsivalymo etapą. Remiantis tokiu bandinių skaičiumi, kai kuriais atvejais būna sunku gauti pakankamai tikslų BKF vertės įvertį, ypač kai pasirodo, kad išsivalymo kinetika yra kitokia nei pirmojo laipsnio, galima būtų patarti bandinius imti dažniau (žr. 4 priedą). Papildomi bandiniai saugomi ir analizuojami tik tuo atveju, jei pasirodo, kad pirmosios eilės analizės duomenų nepakanka BKF apskaičiuoti norimu tikslumu.

Tinkamo bandinių ėmimo grafiko pavyzdys pateiktas 4 priede. Naudojant kitas Pow numanomas vertes poveikio trukmei, per kurią būtų pasiekta 95% sugertis, apskaičiuoti, gali būti lengvai sudaryti kiti grafikai.

Bandiniai imami per sugertį tol, kol pasiekiama nuostovioji būsena arba 28 paras priklausomai nuo to, kas trumpiau. Jei nuostovioji būsena nebuvo pasiekta per 28 paras, bandiniai imami tol, kol pasiekiama nuostovioji būsena, arba iki 60 parų priklausomai nuo to, kas trumpiau. Prieš pradedant išsivalymo etapą, žuvys perkeliamos į švarius indus.

1.8.4.2. Bandinių ėmimas ir bandinio ruošimas

Vandens bandiniai analizei gaunami, pvz., siurbiant (sifonuojant) juos iš inertiškos medžiagos pagamintais vamzdžiais, įstatytais į bandymo indo vidurį. Atrodo, jog nei filtravimu, nei centrifugavimu neįmanoma atskirti biologiškai neįsisavinamos bandomosios medžiagos dalies nuo tos dalies, kuri yra biologiškai prieinama (ypač labai lipofilinių cheminių medžiagų, t.y. tokių medžiagų, kurių log Pow > 5) (1) (5), todėl bandinių tokiais būdais apdoroti nereikia.

Todėl reikia imtis priemonių, kad rezervuarai būtų kuo švaresni, o bendrosios organinės anglies kiekis per sugerties ir apsivalymo etapus turi būti nuolat kontroliuojamas.

Kiekvieną kartą imant bandinį iš bandymo indų paimamas atitinkamas žuvų skaičius (dažniausiai ne mažiau kaip keturios žuvys). Bandinio žuvys iš karto nuplaunamos vandeniu, „sausai“ nušluostomos, tuojau pat užmušamos pačiu tinkamiausiu būdu ir sveriamos.

Vanduo ir žuvys turi būti analizuojami iš karto po bandinio ėmimo, kad būtų išvengta irimo arba kitų nuostolių, ir apskaičiuojami apytikriai sugerties bei apsivalymo greičiai per bandymą. Iš karto atlikta analizė leidžia negaištant nustatyti, kada pasiekiama horizontalioji sugerties kreivės dalis.

Jei iš karto analizė neatliekama, bandiniai turi būti laikomi tinkamai. Prieš pradedant tyrimą, gaunama informacija apie tinkamą konkrečios bandymo medžiagos laikymo metodą, pvz., šaldymą, laikymą, esant 4 °C temperatūrai, laikymo trukmę, ekstrahavimą ir 1.1.

1.8.4.3. Analizės metodo kokybė

Kadangi visas bandymas iš esmės priklauso nuo bandomajai medžiagai nustatyti taikomo analizės metodo tikslumo, tikslumo ir jautrumo, reikia eksperimentiškai patikrinti, ar konkretaus metodo cheminės analizės tikslumas ir atkuriamumas, taip pat bandomosios medžiagos išgavimas iš vandens ir žuvies yra patenkinami. Taip pat reikia patikrinti, ar bandomoji medžiaga neaptinkama naudojamame skiedimo vandenyje.

Jei būtina, daromos Cw ir Cf gautų verčių pataisos, atsižvelgiant į išgavimo ir fono kontroliniuose bandiniuose gautas vertes. Su žuvies ir vandens bandiniais visą laiką elgiamasi taip, kad užteršimas ir nuostoliai (pvz., dėl bandinio ėmimo įtaiso sugerties) būtų kuo mažesni.

1.8.4.4. Žuvies bandinio analizė

Jei bandyme naudojama radioaktyvius žymenis turinčių medžiagų, galima nustatyti bendrą jų kiekį (t.y. pradinę medžiagą ir metabolitus) arba bandiniai gali būti gryninami, kad pradinę medžiagą galima būtų analizuoti atskirai. Taip pat, pasiekus nuostoviąją būseną arba sugerties etapo pabaigą, priklausomai nuo to kas anksčiau, galima apibūdinti pagrindinius metabolitus.

Jei BKF, apskaičiuotas pagal bendrąjį radioaktyvius žymenis turinčių likučių kiekį, yra didesnis ar lygus 100 %, būtų patartina, o radus kai kurių cheminių medžiagų rūšių, pvz., pesticidų, labai rekomenduotina, identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus, kurie sudaro daugiau kaip 10 % bendrojo likučių kiekio žuvies audiniuose nuostoviosios būsenos sąlygomis.

Jei yra identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktai, kurie sudaro daugiau kaip 10 % bendrojo žymėtuosius atomus turinčių likučių kiekio, taip pat rekomenduojama identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus bandymo vandenyje.

Bandomosios medžiagos koncentracija dažniausiai turi būti nustatoma kiekvienoje pasvertoje žuvyje. Jei tai neįmanoma, kiekvieno ėmimo bandinius galima sudėti, tačiau bandinių sudėtis riboja statistinio apdorojimo metodikas, kurios galėtų būti taikomos duomenims apdoroti, galimybes. Jei yra svarbi specifinė statistinė procedūra ir jos reikšmingumas, tuomet bandyme turi būti naudojamas pakankamas žuvų skaičius, kuris atitiktų norimą jungimo procedūrą ir statistinį reikšmingumą (6) (7).

BKF turi būti išreikštas kaip visos šlapios masės funkcija, o labai lipofiliškoms medžiagoms – kaip riebalų kiekio funkcija. Riebalų kiekis žuvyje nustatomas kiekvieno bandinio ėmimo atveju, jei tai įmanoma. Riebalų kiekiui nustatyti turi būti taikomi atitinkami metodai (3 priedo 8 ir 2 nuorodos). Geriausias metodas, jei gali būti rekomenduota ekstrahavimo chloroformo ir metanolio mišiniu metodika (9). Įvairūs metodai neleidžia gauti vienodų verčių (10), todėl svarbu pateikti taikyto metodo detales. Kai tai įmanoma, riebalų analizė turi būti atliekama tame pačiame ekstrakte, kuris buvo gautas bandomajai medžiagai analizuoti, kadangi riebalus dažnai reikia pašalinti iš ekstrakto prieš tai, kai jį galima analizuoti chromatografiškai. Riebalų kiekis žuvyje (mg/kg šlapios masės) bandymo pabaigoje turi nesiskirti nuo bandymo pradžioje nustatyto kiekio daugiau kaip ± 25 %. Taip pat reikia pateikti procentais apskaičiuotą audinio sausų medžiagų kiekį, kad būtų galima apskaičiuoti sausų medžiagų riebalų koncentraciją.

 

2 REZULTATAI

2.1 REZULTATŲ APDOROJIMAS

Bandomosios medžiagos sugerties kreivė gaunama aritmetinėje skalėje žymint per sugerties bandymą gautos koncentracijos kaitą žuvyje arba jos paviršiuje (arba tam tikruose audiniuose) per tam tikrą laiką. Jei kreivė pasiekė horizontaliąją dalį, t.y. pasidaro beveik asimptotiška laiko ašiai, nuostoviosios būsenos BKFmb apskaičiuojamas taip:

Kai nuostovioji būsena nepasiekiama, BKFmb bali būti įmanoma apskaičiuoti pagal 80 % (l,6/k2) arba 95% (3,0/k2) „nuostoviosios būsenos“ pusiausvyros, tai bus pakankamas tikslumas, reikalingas įvertinant pavojingumą.

Taip pat nustatomas biokoncentravimo faktorius (BKFk) kaip dviejų pirmojo laipsnio kinetinių konstantų k1/k2 santykis. Apsivalymo greičio konstanta (k2) dažniausiai nustatoma pagal apsivalymo kreivę (t.y., bandymo medžiagos žuvyje koncentracijos mažėjimo per tam tikrą laiką grafiką). Tuomet, turint k2 vertę ir Cf, kuri gaunama pagal sugerties kreivę, apskaičiuojama sugerties greičio konstanta (k1) (žr. 5 priedą). Tinkamiausias metodas BKFk ir greičio konstantoms k1 ir k2 apskaičiuoti yra netiesinių parametrų kompiuterinio vertinimo metodų taikymas (11). Kitaip k1 ir k2 apskaičiuoti gali būti naudojami grafiniai metodai. Jei apsivalymo kreivė akivaizdžiai yra ne pirmojo laipsnio, turi būti taikomi sudėtingesni modeliai (žr. 3 priedo nuorodas) ir prašoma biologo-statistiko patarimo.

 

2.2 REZULTATŲ INTERPRETAVIMAS

Rezultatai turi būti interpretuojami atsargiai, jei išmatuotos bandymo tirpalų koncentracijos yra arti analizinio metodo aptikimo ribos.

Aiškiai apibrėžtos sugerties ir išsivalymo kreivės yra biologinio koncentravimo duomenų geros kokybės ženklas. Dviem koncentracijoms nustatytų sugerties ir apsivalymo konstantų kitimas turi būti mažesnis kaip 20 %. Dviem bandymų koncentracijoms stebėti dideli sugerties ir apsivalymo greičių skirtumai turi būti registruojami ir pateikti galimi aiškinimai. Dažniausiai, atliekant gerai planuotus tyrimus, BKF verčių pasikliovimo riba artėja prie ± 20 %.

 

3 ATASKAITOS PATEIKIMAS

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija:

 

3.1 BANDOMOJI MEDŽIAGA

- fizinė prigimtis ir, jei reikia, fizinės ir cheminės savybės,

- cheminio identifikavimo duomenys (įskaitant organinės anglies kiekį jei reikia),

- jei turi radioaktyvius žymenis, tiksli žymėtojo atomo (-ų) padėtis ir su priemaišomis susijusio radioaktyvumo procentinė dalis.

 

3.2 BANDYMŲ RŪŠYS

- mokslinis pavadinimas, rūšis, šaltinis, bet koks išankstinis apdorojimas, aklimatizavimas, amžius, dydžio intervalas ir t.t.

 

3.3 BANDYMŲ SĄLYGOS

- taikyta bandymų metodika (pvz., pratekėjimo arba pusiau stacionariomis sąlygomis),

- naudoto apšvietimo tipas ir ypatybės bei apšvietimo periodas (-ai),

- bandymų schema (pvz., bandymo indų (talpų) skaičius ir dydis, vandens tūrinės apykaitos greitis, lygiagrečių bandymų skaičius, žuvų skaičius tuo pat metu atliktame bandyme, atliekant bandymus taikytų koncentracijų skaičius, sugerties ir išsivalymo etapų trukmė, žuvų ir vandens bandinių ėmimo dažnis),

- pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų keitimo dažnis (jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija ir indėlis į organinės anglies kiekį bandymo vandenyje),

- vardinės bandymų koncentracijos, bandymų induose nustatytų koncentracijų vidutinės vertės ir jų standartiniai nuokrypiai bei metodas, kuriuo jie buvo nustatyti,

- skiedimo vandens šaltinis, bet kokio jo apdorojimo aprašymas, bandomųjų žuvų sugebėjimo gyventi vandenyje rodymo rezultatai ir vandens ypatybės: pH, kietumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės, bandymo terpės druskingumas (jei reikia) ir visi kiti daryti matavimai,

- vandens kokybė bandymų talpose, pH, kietumas, BOA, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija,

- išsami informacija apie šėrimą (pvz., pašaro tipas, šaltinis, sudėtis, jei įmanoma bent riebalų ir baltymų kiekis, duodamas kiekis ir šėrimo dažnis), -informacija apie žuvų ir vandens bandinių apdorojimą, įskaitant ruošimo, laikymo, ekstrahavimo detales ir bandomosios medžiagos bei riebalų (jei nustatomi) analizės metodikas (ir tikslumą).

 

3.4 REZULTATAI

- bet kokių atliktų išankstinių tyrimų rezultatai,

- kontrolinių žuvų ir žuvų kiekviename bandymų inde mirtingumas bei bet koks jų neįprastas elgesys,

- riebalų kiekis žuvyje (jei nustatoma),

- kreivės (įskaitant visus gautų matavimų duomenis), rodančios bandomosios medžiagos žuvų sugertį ir jų apsivalymą, laikas iki nuostoviosios būsenos,

- Cf ir Cw (ir jų standartinis nuokrypis bei intervalas, jei tinka) visiems bandinio ėmimo atvejams (Cf išreikšta μg/g viso kūno arba tam tikrų jo audinių, pvz., riebalų, šlapios masės (ppm), o Cw- μg/ml (ppm)). Cw vertės kontrolinėse serijose (taip pat turi būti nurodytas fonas),

- nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius (BKFmb) ir (arba) kinetinis biokoncentravimo faktorius (BKFk) ir, jei taikytina, 95 % pasikliovimo ribos sugerties ir apsivalymo (išnykimo) greičio konstantoms (viskas apskaičiuota viso gyvūno kūno ir bendro riebalų kiekio, jei nustatytas, arba apibrėžtų jo audinių atžvilgiu), pasikliovimo ribos ir standartinis nuokrypis (kai yra) bei apskaičiavimų (duomenų analizės) metodai kiekvienai naudotos bandomosios medžiagos koncentracijai,

- jei naudojamos radioaktyvius žymenis turinčios medžiagos, ir jei to reikalaujama, gali būti pateikti bet kokių aptiktų metabolitų kaupimosi rezultatai,

- visa, kas bandyme buvo neįprasto, bet koks numatytų veiksmų nukrypimas ir bet kuri kita tinkama informacija.

Reikia mažinti rezultatų, kurie būtų „nenustatyti aptikimo riboje“, kiekį, paruošiant parengiamąjį bandymą ir planuojant bandymus, kadangi tokie rezultatai negali būti panaudoti apskaičiuojant greičio konstantas.

 

4 NUORODOS

(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, 117 -156 p.

(2) Birsein S, Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR ir QSAR in Environmental Research, 1, 29 – 390 p.

(3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformatkm of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing ir Assessment of Chemicals. No 3.

(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailabilily of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.

(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document (or the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.

(6) US PDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1,5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.

(7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human arba animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Evironmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.

(8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aąuatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Ch. 2.3. Part H. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.

(9) Gardner et al. (199.5). Limn. & Oceanogr. 30, 1099 – 1105 p.

(10) Randall R. C, Lee H., Ozretich R.J., Lake J. L. and Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, 1431 – 1436 p.

(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method, Ring Test Programme. 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholni.

(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.

 

1 priedas

Skiedimui tinkamo vandens cheminės savybės

 

 

Medžiaga

Didžiausia leistina koncentracija

1

Kietosios dalelės

5 mg/l

2

Bendroji organinė anglis

2 mg/l

3

Nejonizuotas amoniakas

1 μg/l

4

Liekamasis chloras

1 μg/l

5

Bendras fosforoorganinių pesticidų kiekis

50 ng/1

6

Bendras chlororganinių pesticidų ir polichlorintų difenilų kiekis

50 ng/l

7

Bendras organinis chloras

25 ng/l

8

Aliuminis

1 μg/l

9

Arsenas

1 μg/l

10

Chromas

1 μg/l

11

Kobaltas

1 μg/l

12

Varis

1 μg/l

13

Geležis

1 μg/l

14

Švinas

1 μg/l

15

Nikelis

1 μg/l

16

Cinkas

1 μg/l

17

Kadmis

100 ng/l

18

Gyvsidabris

100 ng/l

19

Sidabras

100 ng/l

 

2 priedas

Bandyti rekomenduotos žuvų rūšys

 

 

Rekomenduojamos rūšys

Rekomenduojamas bandymų temperatūros intervalas, °C

Rekomenduojamas bandymų gyvūno bendrasis kūno ilgis, cm

1

Zebrinė danija (Danio rerio (')) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan)

20-25

3,0 ± 0,5

2

Rainė (Pimephales promelas) (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesąue) (Phoxinus phoxinus)

20-25

5,0 ±2,0

3

Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus) Paprastasis karpis

20-25

5,0 ± 3,0

4

Japoninė medaka (Oryzias latipes) (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck ir Schlegel)

20-25

4,0 ±1,0

5

Vaivorykštinis gupis (Poecilia reticulata) (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Gupi

20-25

3,0 ±1,0

6

Melsvažiaunis saulešeris (Lepomis macrochirus) (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesąue)

20-25

5,0 ±2,0

7

Margasis upėtakis (Onchorhynchus mykiss) (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum)

13-17

8.0 ± 4,0

8

Trispyglė dyglė (Gasterosteus aculeatus) (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus)

18-20

3,0 ±1,0

(')Me

yer A, Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B, Vol. 252, p. 231.

 

 

 

Skirtingose šalyse buvo naudojamos įvairios upių žiočių ir jūros žuvų rūšys, pvz.,

 

Spotas (Leiostomus xanthuru); Margoji lėlžuvė (Cyprinodon variegatus);

Priekrančių menidija (Menidia beryllind); Gyvavedis šaineris (Cymatogaster aggregata);

Plekšnė (Parophrys vertulus); Siauragalvė plernė (Leptocottus armatus);

Trispyglė dyglė (Gasterosteus aculeatus); Jūros ešerys (Dicentracus labrax);

Aukšlė (Albumus albumus).

 

Parinkimas

Lentelėje nurodytas gėlųjų vandenų žuvis lengva auginti ir (arba) jų galima gauti ištisus metus, tuo tarpu galimybė gauti jūros ir upių žiočių žuvų iš dalies ribota atitinkamoms šalimis. Žuvis galima auginti ir veisti žuvų fermose arba laboratorijose, ligų ir parazitų kontrolės sąlygomis, kad bandomieji gyvūnai būtų sveiki, ir būtų žinoma jų kilmė. Šių žuvų yra daugelyje pasaulio kraštų.

 

3 priedas

Sugerties ir apsivalymo etapų trukmės prognozavimas

 

1 Sugerties etapo trukmės prognozavimas

Prieš atliekant bandymą, k2 įvertis, taigi nuostoviajai būsenai pasiekti reikalingo laiko tam tikra procentinė dalis, gali būti gauta iš empirinių k2 ir n-oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficiento (Pow) arba k2 priklausomybių ir tirpumo vandenyje (s).

Įvertis k2 (para-1) gali būti gautas, pvz., pagal tokią empirinę priklausomybę (1):

logk2 = -0,414 log10(P“w) + 1,47 (r2 = 0,95) (1 lygtis)

Kitos priklausomybės pateiktos 2 nuorodoje.

Jei pasiskirstymo koeficientas (Pow) nežinomas, įvertis gali būti atliktas (3), jei žinomas medžiagos tirpumas vandenyje (s), taikant lygtį:

log10(Pow) = 0,862 logl0(s) + 0,710 (r2 = 0,994) (2 lygtis)

kurioje s = tirpumas (mol/l): (n – 36).

Šios priklausomybės tinka tik toms cheminėms medžiagoms, kurių log (Pow) vertės yra nuo 2 iki 6,5 (4).

Nuostoviajai būsenai pasiekti reikalingo laiko tam tikra procentinė dalis, taikant k2 įvertį, gali būti nustatyta iš bendrosios kinetinės lygties, aprašančios sugertį ir apsivalymą (pirmojo laipsnio kinetika):

arba jei Cw yra pastovus dydis:

Artėjant prie nuostoviosios būsenos (t →∞), 3 lygtis gali būti supaprastinta (5) (6) iki:

 

Tokiu atveju, k1/k2 x Cw yra arti koncentracijos žuvyje „nuostoviosios būsenos“ sąlygomis (Cf,s). 3 lygtis gali būti pertvarkyta į:

arba                                                               (4 lygtis)

Taikant 4 lygtį, galima prognozuoti laiką, reikalingą pasiekti tam tikrą nuostoviosios būsenos procentinę dalį, kai pagal 1 arba 2 lygtį iš anksto yra įvertinta k2.

Statistiškai priimtiniems duomenims (BKFk) gauti, statistiškai optimalios sugerties etapo trukmės atskaitos tašku laikomas laikas, per kurį kreivė, vaizduojanti priklausomybę tarp bandymų medžiagos žuvyje koncentracijos logaritmo ir tiesinėje skalėje atidėto laiko, pasiektų jos vidurio tašką arba l,6/k2, arba 80 % nuostoviosios būsenos, tačiau ne didesnis kaip 3,0/k2, arba 95 % nuostoviosios būsenos (7).

Laikas 80% nuostoviosios būsenos pasiekti (4 lygtis)yra lygus:

arba                                                                             (5 lygtis)

k2 Panašiu būdu laikas, reikalingas pasiekti 95 % nuostoviosios būsenos, yra lygus:

                         (6 lygtis)

Pvz., sugerties etapo trukmė (sug) bandymų medžiagai, kurios log10(Pow) = 4, būtų (taikant lygtis 1, 5 ir 6):

log10k2 = -0,414 x (4) + 1,47                                                   k2 = 0,652 paros-1

sug (80%) = 1,6/0,652, t.y. 2,45 paros (59 valandos)

arba sug (95%) = 3,0/0,652, t.y. 4,60 paros (110 valandų)

 

Panašiai, jei bandymų medžiagos s= 10-5 mol/l (log(s) =-5,0), sug trukmė būtų (taikant lygtis 1,2, 5 ir 6):

log10 (Pow) = 0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02

log10k2 =-0,414 (5,02)+ 1,47

k2 = 0,246 paros-1

sug (80%) = 1.6/0,246, t.y. 6,5 paros (156 valandos)

arba sug (95 %) = 3.0/0,246, t.y. 12,2 paros (293 valandos)

 

Kaip alternatyva, lygtis:

Teq = 6,54 x 10-3 Pow + 55,31 (valandos) gali būti taikoma apskaičiuoti laiką, reikalingą pasiekti tikrąją nuostoviąją būseną (4).

 

2 APSIVALYMO ETAPO TRUKMĖS PROGNOZAVIMAS

Laikas, per kurį organizme sulaikytos medžiagos kiekis sumažėja iki tam tikros pradinės koncentracijos procentinės dalies, taip pat gali būti prognozuojamas, taikant bendrąja lygtį kuri aprašo sugertį ir apsivalymą (pirmojo laipsnio kinetika) (1) (8).

Apsivalymo etapo atveju daroma prielaida, kad Cw lygi nuliui. Lygtis gali būti redukuota į lygtį:

 arba,

kurioje Cf,o yra koncentracija apsivalymo etapo pradžioje. Tuomet 50 % apsivalymas bus pasiektas per laiką (t50):

Panašiai 95 % apsivalymas bus pasiektas per laiką:

Jei pirmajam periodui taikoma sugerties trukmė sudaro 80 % (l,6/k2), o per apsivalymo etapą sumažėjimas sudaro 95 % (3,0/k2), tuomet apsivalymo etapas trunka maždaug du kartus ilgiau už sugerties etapą.

Svarbu pažymėti, kad įverčiai remiasi prielaida, jog sugerties ir apsivalymo modeliai atitinka pirmojo laipsnio kinetiką. Jei pirmojo laipsnio kinetikos akivaizdžiai nepaisoma, turi būti naudojami sudėtingesni modeliai (pvz., (1) nuoroda).

 

Nuorodos (3 priedo)

(1) Spacie A. and Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, 309-320 p.

(2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.

(3) ChiouC.T. and Schmedding D.W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16(1), 4- 10 p.

(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentralion kinetics withfish. Wat. Res. 22(6), 701-707 p.

(5) Branson D. R, Blau G. E, Alexander H.C. and Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), 785 – 792 p.

(6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aąuatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte P., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4,243 – 255 p. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons LtdN.Y.

(7) Reilly P.M, Bajraniovic R., Blau G. E., Branson D. R. and Sauerhotf M.W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55. 614 – 622 p.

(8) Konemann H. and .Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemnsinherp 9 3 – 19 p.

 

4 priedas

Bandinių ėmimo teorinis grafiko pavyzdys, tiriant medžiagų, kurių log (Pow) = 4, biologini koncentravimą

 

 

Bandinių ėmimo tvarkaraštis

 

 

Žuvų bandinių ėmimas

Mažiausias reikalingas dažnis (paros)

Papildomas bandinių ėmimas

Vandens bandinių skaičius

Žuvų skaičius bandinyje

Sugerties etapas

-1 0

 

2(*) 2

45-80 žuvų

1-asis

0,3

0,4

2

(2)

4

(4)

2-asis

0,6

0,9

2

(2)

4

(4)

3-iasis

1,2

1,7

2

(2)

4

(4)

4-asis

2,4

3,3

2

(2)

4

(4)

5-asis Apsivalymo etapas

4,7

 

2

6 Žuvų pernešimas į vandenį be bandymo medžiagos

6-asis

5,0

5,3

 

4

(4)

7-asis

5,9

7,0

 

4

(4)

8-asis

9,3

11,2

 

4

(4)

9-asis

14,0

17,5

 

6

(4)

 

(*) Vandens bandinys imamas po to, kai buvo pateikti mažiausiai trys „indo tūriai“.

Vertės skliausteliuose rodo bandinių (vandens, žuvų) skaičių, kurį reikia paimti, jei bandiniai papildomai imami.

NB: Prieš bandymą darytas k2 įvertis, kai log (Pow) = 4,0, yra 0,652 paros-1. Bendra bandymo trukmė nustatyta 3 x sug = 3 x 4,6 paros, t.y. 14 parų. Kaip vertinti „sug“, žr. 3 priedą.

 

5 priedas

Modelio pasirinkimas

 

Buvo padaryta prielaida, kad biologinio koncentravimo duomenys „pakankamai“ gerai aprašomi paprasto dviejų indų ir dviejų parametrų modelio (tai matyti ištiesintoje kreivėje, kuri priartina žuvies apsivalymo etapo koncentracijos taškus, kai jie vaizduojami pusiau logaritminiame popieriuje. (Jei šie taškai negali būti aprašyti ištiesinta kreive, tuomet reikia naudoti sudėtingesnius modelius, žr., pvz., Spacie and Hanwhnk, 3 priedo 1 nuoroda).

Grafinis metodas apsivalymo (išnykimo) greičio konstantai k2 nustatyti

Pusiau logaritminiame popieriuje nubraižomas kiekviename žuvies bandinyje rastos bandymo medžiagos koncentracijos kitimo ir laiko grafikas. Šios tiesės krypties koeficientas yra k2.

 

 

Atkreipkite dėmesį, kad nukrypimai nuo tiesės gali reikšti, kad apsivalymo modelis yra sudėtingesnis už pirmojo laipsnio kinetiką. Norint spręsti apie tai, ar apsivalymo tipas nukrypsta nuo pirmojo laipsnio kinetikos, galima taikyti grafinį metodą.

Grafinis metodas, nustatant sugerties greičio konstantą k.

Duotai k2 vertei k1 apskaičiuojamas taip:

 (1 lygtis)

Cf vertė yra gautosios sugerties glaudžiusios kreivės duomenų vidurio taškas. Kreivė vaizduoja koncentracijos logaritmo kitimą per tam tikrą laiką (aritmetinėje skalėje).

Kompiuteriniai metodai sugerties ir apsivalymo (išnykimo) greičio konstantoms apskaičiuoti

Geriausias būdas yra taikyti kompiuterinius netiesinių parametrų vertinimo metodus biologinio koncentravimo faktorių ir kj bei k2 greičio konstantoms apskaičiuoti. Jei duota koncentracijos kitimo laike duomenų aibė ir modelis, šios programos apskaičiuoja k] ir k2 vertes:

  (2lygtis)

 

 (3 lygtis)

čia: tc = sugerties etapo pabaigos laikas.

Šis metodas duoda k1 ir k2 standartinio nuokrypio įverčius.

Didesnė dalis k2 atvejų pagal išsivalymo kreivę gali būti įvertinta pakankamai tiksliai. Tarp dviejų parametrų, k1 ir k2, jei juos vertintume kartu, yra stipri koreliacija. Galima būtų patarti iš pradžių tik pagal išsivalymo duomenis apskaičiuoti k2, o vėliau pagal sugerties duomenis ir taikant netiesinę regresiją apskaičiuoti k1.

 

ŽUVŲ MAILIAUS AUGIMO BANDYMAS (C.14.)

 

1. METODAS

Šis toksiškumo augimui bandymo metodas yra OECD TG 215 (2000) kopija.

 

1.1 ĮVADAS

Sis bandymas skirtas įvertinti cheminių medžiagų ilgo veikimo įtaką žuvų mailiaus augimui. Jis pagrįstas Europos Sąjungoje sukurtu ir tarplaboratoriniais bandymais patikrintu (1) (3) dinaminiu metodu, taikytu įvertinti cheminių medžiagų poveikius vaivorykštinio upėtakio (Oncorynchus mykiss) mailiaus augimui. Galima naudoti kitas dokumentais tinkamai patvirtintas rūšis. Pvz., įgyta patyrimo, atliekant zebrinės danijos (Danio rerio) (2) (4) (5) ir japoninės medakos (Oryzias latipes) (6) (7) (8) augimo bandymus.

 

1.2 APIBRĖŽIMAI

Mažiausioji pastebimo poveikio koncentracija, LOEC: mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis yra statistiškai reikšmingas lyginant su kontroliniais bandiniais (p<0,05). Tačiau visų didesnių kaip LOEC bandomųjų koncentracijų kenksmingas poveikis turi būti lygus ar didesnis už LOEC poveikį.

Nepastebimo poveikio koncentracija, NOEC: bent kiek už LOEC mažesnė bandomoji koncentracija.

EC,: šiam bandymo metodui tai yra bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant žuvų augimo greičio pokytis lyginant su kontroliniais bandiniais yra x %.

Įkrova: gyvų žuvų masė, tenkanti vandens tūrio vienetui.

Žuvų tankis: žuvų skaičius, tenkantis vandens tūrio vienetui.

Atskiros žuvies savitasis augimo greitis: išreiškia atskiros žuvies augimo greitį pagal jos pradinę masę.

Vidutinis savitasis augimo greitis bandymo indui: išreiškia bandymo indo populiacijos vidutinį augimo greitį vienai koncentracijai.

Tariamai („Pseudo“) savitasis augimo greitis: išreiškia atskirų žuvų augimo greitį lyginant su bandymo indo populiacijos vidutine pradine mase.

 

1.3 BANDYMO METODO ESMĖ

Eksponentinio augimo etapo žuvų mailius pasveriamas, įleidžiamas į bandymo indus, kur jis geriau dinaminio bandymo sąlygomis ar, jei neįmanoma, atitinkamomis pusiau statinio bandymo (periodinio atnaujinimo) sąlygomis yra veikiamas bandomosios medžiagos subletalios koncentracijos diapazono vandeniniais tirpalais. Bandymo trukmė 28 paros. Žuvys šeriamos kasdien. Pašaro davinys nustatomas pagal pradinę žuvų masę ir po 14 parų gali būti perskaičiuojamas iš naujo. Bandymo pabaigoje žuvys vėl sveriamos. Taikant regresijos modelį, analizuojamas poveikis augimo greičiui, norint nustatyti koncentraciją, sukeliančią x % augimo greičio pokytį, t. y. ECx (pvz., EC10, EC20 ar EC30). Be to, norint nustatyti mažiausią pastebimo poveikio koncentraciją (LOEC), taigi ir nepastebimo poveikio koncentraciją (NOEC), duomenis galima lyginti su kontrolinių bandinių vertėmis.

 

1.4 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ

Reikėtų turėti atlikto ūmaus toksiškumo bandymo (žr. „Ūminis toksinis poveikis žuvims“, Žin., 2002, Nr. 81-3493), daryto su šiam bandymui pasirinkta rūšimi, rezultatus. Tai reikštų, kad bandomosios medžiagos tirpumas vandenyje ir garų slėgis yra žinomi ir kad ataskaitoje yra pateiktas patikimas metodas nustatyti ištirpintos bandomosios medžiagos kiekį žinomu tikslumu bei aptikimo riba.

Naudingą informaciją apie bandomąją medžiagą apima struktūrinė formulė, medžiagos grynumas, stabilumas vandenyje ir veikiant šviesai, pKa, Pow ir lengvo biologinio skaidomumo bandymo rezultatai (žr. „Lengvo“ biologinio skaidomumo nustatymas“, Žin., 2002, Nr. 81-3493).

 

1.5 BANDYMO PAGRĮSTUMAS (PATIKIMUMAS)

Bandymas yra pagrįstas, jei išlaikytos šios sąlygos:

- baigiant bandymą kontrolinio (-ių) bandymo (-ų) žuvų gaištamumas turi būti ne didesnis kaip 10%,

- kontrolinio (-ių) bandymo (-ų) vidutinė žuvų masė turi būti pakankamai padidėjusi, kad būtų galima aptikti mažiausią augimo greičio kitimą, kuris dar laikomas reikšmingu. Tarplaboratorinių bandymų palyginimas (3) parodė, kad kontroliniuose bandymuose vaivorykštinio upėtakio vidutinė masė per 28 paras turi padidėti bent per pusę jo pradinės vidutinės masės (t. y. 50 %); pvz., pradinė masė: 1g/žuviai (= 100 %), galutinė masė po 28 parų: daugiau arba lygu 1,5 g/žuviai (> 150 %),

- ištirpusio deguonies koncentracija per visą bandymą turi sudaryti bent 60 % oro soties vertės (OSV),

- kiekvieną bandymo momentą bandymo indų vandens temperatūra neturi tarpusavyje skirtis daugiau kaip ±1°C ir būti palaikoma 2°C intervale bandymo rūšims nurodytame diapazone (1 priedas).

 

1.6 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

 

1.6.1 Aparatūra

Be įprastos laboratorinės įrangos, reikalinga ši speciali įranga:

a) deguonies ir pH matuokliai;

b) įranga, nustatanti vandens kietumą ir šarmingumą;

c) darbo reikalavimus atitinkantys aparatai, kontroliuojantys temperatūrą, pirmenybę teikiant nuolatinės kontrolės aparatūrai;

d) indai, pagaminti iš chemiškai inertiškos medžiagos ir atitinkantys rekomenduotą įkrovą bei žuvų tankį (žr. 1.8.5 skirsnį ir 1 priedą);

e) reikiamo tikslumo svarstyklės (t. y. ± 0,5 % tikslumo).

 

1.6.2 Vanduo

Galima naudoti bet kokį vandenį, kuriame žuvys gali ilgai gyventi ir augti. Vandens kokybė turi nekisti visą bandymo laiką. pH vertė turi būti 6,5 -8,5, tačiau atliekant konkretų bandymą jo reikšmė neturi kisti daugiau kaip ± 0,5 pH vieneto. Rekomenduojamas didesnis kaip 140 mg/l (skaičiuojant CaCOs) kietumas. Norint užtikrinti, kad skiedimo vanduo per daug neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pvz., nesudarytų kompleksinių junginių su bandomąja medžiaga), bandiniai tam tikrais laiko tarpais turi būti analizuojami. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidų (pvz., fosforo organinių ir chloro organinių pesticidų bendro kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti atliekama, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė santykinai nekinta. Jei buvo įrodyta, kad vandens kokybė nekinta bent metus, analizė gali būti atliekama ne taip dažnai, o intervalai padidinti (pvz., kas šešis mėnesius). Kai kurios skiedimui tinkamo vandens savybės yra pateiktos 2 priede.

 

1.6.3 Bandomieji tirpalai

Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą.

Pradinį tirpalą geriau ruošti bandomąją medžiagą maišant ar plakant skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ar ultragarsu). Koncentruotam pradiniam tirpalui ruošti galima naudoti prisotinimo kolonėles (tirpumo kolonėles).

Kartais norint gauti tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą, gali tekti naudoti organinius tirpiklius ar dispergatorius. Tinkami tirpikliai yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilsulfoksidas, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Tinkami dispergatoriai yra Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% metilceliuliozė ir HCO-40. Reikėtų atsargiai naudoti lengvai biologiškai suardomas medžiagas (pvz., acetoną) ir (ar) labai lakius junginius, nes, atliekant dinaminius bandymus, jie gali kelti problemų dėl bakterijų kaupimosi. Naudojama soliubilizuojanti medžiaga neturi daryti reikšmingo poveikio žuvų augimui ir neigiamo poveikio mailiui, kaip tai nustatoma atliekant kontrolinį bandymą vien tik su tirpikliu.

Bandomosios koncentracijos tirpalams į bandymo indus tiekti dinaminių bandymų metu reikalinga sistema, kuri nepertraukiamai dozuotų ir skiestų bandomosios medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozavimo siurblys, proporcingasis skiestuvas, prisotinimo sistema). Pradinių tirpalų ir skiedimo vandens srautai turi būti kartais, geriau kasdien, tikrinami ir per visą bandymą neturėtų kisti daugiau kaip 10 %. Tarplaboratorinio palyginimo bandymas (3) parodė, kad, atliekant bandymą su vaivorykštiniu upėtakiu, yra priimtinas 6 litrų/g žuvies ir parai vandens keitimo dažnis (žr. 1.8.2.2 skirsnį).

Pusiau statiniams (atnaujinimo) bandymams terpės atnaujinimo dažnis priklauso nuo bandomosios medžiagos stabilumo, tačiau vandenį atnaujinti rekomenduojama kasdien. Jei pradiniai stabilumo bandymai (žr. 1.4 poskyrį) rodo, kad bandomosios medžiagos koncentracija laikotarpiu tarp atnaujinimų yra nestabili (t. y. yra už 80 – 120 % vardinės koncentracijos ribų ar mažesnė kaip 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), reikėtų numatyti dinaminį bandymą.

 

1.6.4 Rūšių parinkimas

Šiam bandymui rekomenduojama rūšis yra vaivorykštinis upėtakis (Oncorhynchus mykiss), nes naudojant šią rūšį buvo sukauptas didžiausias tarplaboratorinio palyginimo bandymų patyrimas (1) (3). Galima naudoti ir kitas dokumentais tinkamai patvirtintas rūšis, bet tinkamoms bandymo sąlygoms gauti gali tekti pritaikyti bandymo metodiką. Pvz., įgyta patyrimo su zebrine danija (Danio rerio) (4) (5) ir japonine medaka (Oryzias latipes) (6) (7) (8). Taigi ataskaitoje reikia pateikti rūšies pasirinkimo priežastį ir bandymų metodą.

 

1.6.5 Žuvų laikymas

Bandymui pasirenkamos vieno kamieno populiacijos ir geriau to paties neršto bandymo žuvys, kurios prieš bandymą bent dvi savaites buvo laikomos tokios kokybės vandenyje ir tokiomis apšvietimo sąlygomis, kurios panašios į bandymo sąlygas. Jų dienos pašaro davinys laikymo ir bandymo laikotarpiu turi sudaryti ne mažiau kaip 2 % kūno masės, bet geriau 4 % kūno masės.

Po 48 valandų stabilizavimo laikotarpio užrašomi mirtingumo duomenys ir taikomi šie kriterijai:

- jei populiacijos mirtingumas per septynias paras yra didesnis kaip 10 %, visa partija atmetama;

- jei populiacijos mirtingumas 5-10%: žuvys papildomai aklimatizuojamos dar septynias paras; jei per kitas septynias paras mirtingumas yra didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama;

- jei populiacijos mirtingumas per septyniais paras yra mažesnis kaip 5 %, partija priimama. Dvi savaites prieš bandymą ir visą bandymo laiką žuvys neturėtų būti gydomos vaistais.

 

1.7 BANDYMO PLANAS

Bandymo planą sudaro – bandomosios koncentracijos verčių ir tarpo tarp jų parinkimas, indų kiekvienai koncentracijai ir žuvų skaičiaus viename inde parinkimas. Geriausia būtų, kad bandymo planas būtų pasirinktas atsižvelgiant į:

a) tyrimo tikslą;

b) taikomą statistinės analizės metodą;

c) bandymų priemonių buvimą ir kainą.

Jei įmanoma, aptariant tikslą reikėtų nurodyti statistinę galimybę duoto dydžio (pvz., augimo greičio) skirtumui aptikti, arba kitaip, koks turi būti EC“ (pvz., kai x = 10,20 ar 30 ir geriau ne mažesnis kaip 10) įvertinimo tikslumas. Be šito negalima tiksliai apibrėžti tyrimo apimties.

Svarbu pripažinti, kad vienam statistinės analizės metodui taikytas optimalus (geriausiai panaudoja išteklius) planas nebūtinai yra optimalus kitam metodui. Taigi rekomenduotas planas LOEC ir NOEC įvertinti nebus toks pat kaip regresinei analizei rekomenduotas planas.

Dėl Stephan ir Rogers (9) svarstytų priežasčių regresinė analizė dažniausiai tinka geriau nei dispersinė analizė. Tačiau nerandant tinkamo regresijos modelio (r2 < 0,9), reikia taikyti NOEC ir LOEC įvertinimą.

 

1.7.1. Regresinės analizės planas

Svarbūs regresijos metodu analizuojamo bandymo plano nagrinėtini klausimai yra šie:

a) bandymui naudotos koncentracijos būtinai turi aprėpti poveikio koncentraciją (pvz., EC10, 20, 30 ir dominančio medžiagos poveikio koncentracijos verčių diapazoną. Poveikio koncentracijos įverčiai bus tiksliausi, kai poveikio koncentracijos bus ties bandomųjų koncentracijos verčių diapazono viduriu. Tinkamai parinkti bandomąsiams koncentracijas gali padėti iš anksto atliktas diapazono nustatymo bandymas;

b) norint turėti patenkinamą statistinį modelį bandymui turi būti naudojamas vienas kontrolinis rezervuaras ir penki papildomi rezervuarai, skirti skirtingoms koncentracijų vertėms. Jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, be bandomosios serijos, turi būti dar vienas kontrolinis bandinys su didžiausios bandomosios koncentracijos soliubilizavimo medžiaga (žr. 1.8.3 ir 1.8.4 skirsnius);

c) galima naudoti tinkamą geometrinės progresijos ar logaritminę eilutę (10) (žr. 3 priedą). Geriau naudoti logaritminę bandomųjų koncentracijų eilutę;

d) jei yra daugiau kaip šeši indai, papildomi indai turi būti panaudoti lygiagretiems bandymams arba paskirstyti visam koncentracijų verčių diapazonui, tarpams tarp jų sumažinti. Abi šios priemonės vienodai tinka.

 

1.7.2. NOEC ir LOEC įvertinimo planas taikant dispersinę analizę

Kiekvienai koncentracijos vertei gerai būtų turėti dar po vieną indą, ir statistinė analizė turėtų būti daroma atsižvelgiant į kiekvieno indo duomenis (11). Jei nėra indų lygiagrečiam bandymui, neįmanoma atsižvelgti į kintamumą tarp indų be to kintamumo, kuris atsiranda dėl atskirų žuvų. Tačiau patyrimas parodė (12), kad tiriamu atveju kintamumas tarp bandymo indų buvo labai mažas, lyginant su kintamumu viename inde (t. y. tarp žuvų). Taigi santykinai priimtina alternatyva yra statistinę analizę atlikti atsižvelgiant į kiekvienos žuvies tyrimus.

Dažniausiai naudojamos bent penkios koncentracijų vertės, sudarančios eilutę pagal geometrinę progresiją, kurios koeficientas turėtų būti ne didesnis kaip 3,2.

Kai bandymai daromi turint bandymų indus lygiagretiems bandymams, lygiagrečių kontrolinių indų skaičius, taigi ir žuvų skaičius, turi būti dvigubai didesnis negu kiekvienai bandomajai koncentracijai pasirinktas skaičius, kuris turi būti vienodas (13) (14) (15). Priešingu atveju, jei indų lygiagretiems bandymams nėra, kontrolinės grupės žuvų skaičius turi būti lygus kiekvienai bandomajai koncentracijai naudojamam žuvų skaičiui.

Jei dispersinė analizė (ANOVA) turi būti atliekama atsižvelgiant į bandymų indų duomenis, o ne į kiekvienos žuvies tyrimus (tam reikėtų kiekvieną žuvį paženklinti ar naudoti tariamai („pseudo“) savituosius augimo greičius (žr.2.1.2 skirsnį)), reikia turėti pakankamą indų skaičių lygiagretiems bandymams, kad būtų galima nustatyti standartinį,vienos koncentracijos bandymų indų“ nuokrypį. Vadinasi, dispersinės analizės paklaidai reikėtų turėti bent 5 laisvės laipsnius (11). Jei daromi tik lygiagretūs kontroliniai bandymai, esama pavojaus, kad paklaidos kintamumas bus pasislinkęs, nes paklaida gali didėti didėjant tiriamo augimo greičio vidutinei vertei. Reikia tikėtis, jog augimo greitis mažėja, koncentracijai didėjant, todėl atsiranda tendencija per daug sureikšminti kintamumą.

 

1.8 DARBO EIGA

1.8.1 Bandymų žuvų atranka ir svėrimas

Svarbu, kad žuvų masės skirtumas bandymo pradžioje būtų kuo mažesnis. Bandymams rekomenduotų skirtingų rūšių žuvų masės tinkami diapazonai yra pateikti 1 priedėlyje. Būtų geriausia, kad bandymo pradžioje visos partijos žuvų masės kitimo diapazonas būtų lygus žuvų masės aritmetiniam vidurkiui ± 10 % ir jokiu atveju nebūtų didesnis kaip 25 %. Vidutinei masei nustatyti rekomenduojama prieš bandymą pasverti žuvų ėminio dalį.

Žuvys turi būti nustojamos maitinti 24 h iki bandymo pradžios. Toliau jos turi būti atsitiktinai atrenkamos. Vartojant bendrąjį anestetiką, pvz., [neutralizuotą vandeninį 100 mg/l (3 – aminobenzenkarboninės rūgšties etilesterio metansulfonato (MS 222) tirpalą, sumaišant dvi dalis natrio hidrokarbonato ir vieną dalį MS 222], žuvys turi būti atskirai pasveriamos (sausai nušluostytos) gyvų žuvų masei nustatyti 1 priede nurodytu tikslumu. Tos žuvys, kurių masė atitinka numatytą diapazoną, paliekamos ir vėliau paskirstomos į bandymų indus. Turi būti registruojama bendra kiekvieno bandymų indo gyvų žuvų masė. Anestetiko vartojimas, taip pat apdorojimas (įskaitant šluostymą ir svėrimą) žuvų mailiui gali sukelti įtampą ir jį galima sužeisti, ypač jei tai mažų žuvų rūšys. Taigi apdoroti mailių reikia ypač atsargiai ir vengti bandymų gyvūnų įtampos ir sužeidimų.

Žuvys vėl sveriamos 28 bandymo parą (žr. 1.8.6 skirsnį). Tačiau, jei manoma, kad būtina perskaičiuoti pašaro davinį žuvys gali būti sveriamos 14 bandymo parą (žr. 1.8.2.3 skirsnį). Galima taikyti kitus metodus, pvz., fotografavimą, norint nustatyti žuvų dydžio pokytį pagal kurį būtų galima reguliuoti pašaro davinį.

 

1.8.2. Poveikio sąlygos

1.8.2.1. Trukmė

Bandymo trukmė ≥ 28 paros.

1.8.2.2. Įkrova ir žuvų tankis

Svarbu, kad įkrova ir žuvų tankis būtų tinkamas tiriamai žuvų rūšiai (žr. 1 priedą). Jei žuvų tankis per didelis, dėl perpildymo sukeltos įtampos mažėja augimo greitis ir žuvys gali susirgti. Jei žuvų tankis per mažas, gali atsirasti teritorinis elgesys, kuris irgi gali veikti augimą. Bet kuriuo atveju įkrova turi būti pakankamai maža, kad be aeravimo būtų palaikoma bent 60 % OSV ištirpusio deguonies koncentracija. Tarplaboratorinis bandymas (3) parodė, kad vaivorykštiniam upėtakiui priimtina įkrova, jei 40 l vandens tūrio būtų 16 upėtakių po 3 – 5 g masės. Rekomenduojamas vandens keitimo dažnis bandymo metu yra 6 litrai/g žuvies per parą.

1.8.2.3. Šėrimas

Žuvys turi būti šeriamos atitinkamu pašaru (1 priedas) ir pakankamai dažnai, kad būtų garantuotas priimtinas augimo greitis. Reikėtų stengtis išvengti mikroorganizmų dauginimosi ir vandens drumstumo. Vaivorykštiniam upėtakiui 4 % kūno masės davinys per parą turėtų atitikti šias sąlygas (3) (16) (17) (18). Paros davinys turi būti padalytas į dvi lygias dalis ir sušeriamas žuvims per du kartus darant bent penkių valandų pertrauką. Davinys nustatomas pagal kiekvieno bandymų indo bendrą pradinę žuvų masę. Jei žuvys 14 parą sveriamos papildomai, davinys perskaičiuojamas. Prieš sveriant, žuvys turi būti nemaitintos 24 h.

Nesuėstas pašaras ir išmatos iš bandymų indų turi būti pašalinami kasdien, rūpestingai išsiurbiant kiekvieno indo dugną.

1.8.2.4. Šviesa ir temperatūra

Apšvietimo laikotarpis ir vandens temperatūra turi atitikti žuvų rūšį (1 priedas).

 

1.8.3. Bandomosios medžiagos koncentracijos

Dažniausiai reikia naudoti penkias bandomosios medžiagos koncentracijas, neatsižvelgiant į bandymo planą (žr. 1.7.2 skirsnį). Ankstesnės žinios apie bandomosios medžiagos toksiškumą (pvz., ūmaus toksiškumo bandymo ir (ar) koncentracijų diapazono nustatymo tyrimo duomenys) turėtų padėti renkantis tinkamas bandomąsias koncentracijas. Sprendimą naudoti mažiau kaip penkias koncentracijas reikia pagrįsti. Didžiausia bandoma koncentracija turi būti ne didesnė už medžiagos tirpumo vandenyje ribinę koncentraciją.

Kad pradinį tirpalą būtų lengviau paruošti, gali būti naudojama soliubilizuojanti medžiaga, o jos galutinė koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1 ml/l. Geriau būtų, jei ji visuose bandymų induose būtų vienoda (žr. 1.6.3 skirsnį). Reikėtų kiek įmanoma stengtis vengti naudoti šias medžiagas.

 

1.8.4. Kontroliniai bandymai

Skiedimo vandens kontrolinių bandinių skaičius priklauso nuo bandymo plano (žr. 1.7 – 1.7.2). Jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, į bandymo planą turi būti įtrauktas toks soliubilizavimo medžiagos kontrolinių bandinių skaičius, kiek yra skiedimo vandens kontrolinių bandinių.

 

1.8.5. Kiekybės analizių ir matavimų dažnis

Atliekant bandymą bandomosios medžiagos koncentracijų vertės nustatomos reguliariais tarpais (žr. toliau).

Atliekant dinaminius bandymus, skiediklio ir toksiškos medžiagos pradinio tirpalo srautai turi būti tikrinami tam tikrais laiko tarpais, geriau kasdien, ir visą bandymą neturi kisti daugiau kaip 10 %. Jei tikimasi, kad bandomosios medžiagos koncentracijos vertės bus lygios vardinei koncentracijai ± 20 % (t. y. 80 -120 %; žr. 1.6.2 ir 1.6.3 skirsnius), rekomenduojama atlikti bent didžiausios ir mažiausios bandomosios koncentracijos analizę bandymo pradžioje, o vėliau kas savaitę. Jei atliekant bandymus nesitikima, kad bandomosios medžiagos koncentracija gali likti vardinės koncentracijos ± 20 % vertės (pagal bandomosios medžiagos stabilumo duomenis), būtina atlikti visų bandomųjų koncentracijų analizę, bet pagal tą patį grafiką.

Jei tikimasi, kad, atliekant pusiau statinius (atnaujinimo) bandymus, bandomosios medžiagos koncentracija liks vardinės koncentracijos ± 20 % vertės, rekomenduojama atlikti bent didžiausios ir mažiausios bandomosios koncentracijos analizę iš karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jo atnaujinimą tyrimo pradžioje ir kas savaitę vėliau. Jei tai bandymai, kuriuos atliekant nemanoma, kad koncentracija liks vardinės koncentracijos ± 20 % vertės, turi būti išmatuotos visos koncentracijos vertės laikantis to paties kaip ir stabilioms medžiagoms analizės režimo.

Rekomenduojama rezultatus pateikti remiantis išmatuotomis koncentracijos vertėmis. Jei yra įrodymų, leidžiančių parodyti, kad bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką buvo patenkinamai palaikoma vardinės koncentracijos ± 20 % vertės ar išmatuotos pradinės koncentracijos vertės, rezultatai gali būti pateikiami remiantis vardine ar išmatuota vertėmis.

Bandinius gali tekti filtruoti (pvz., pro 0,45 μm akytumo filtrą) ar centrifuguoti. Rekomenduojamas metodas – centrifugavimas. Tačiau, jei filtras bandomosios medžiagos neabsorbuoja, tinkamas būtų ir filtravimas.

Atliekant bandymą visuose bandymų induose turi būti matuojama ištirpusio deguonies koncentracija, pH ir temperatūra. Turi būti matuojamas kontrolinių bandymų ir indo su didžiausios koncentracijos bandymu bendras kietumas, šarmingumas ir druskingumas (jei reikia). Ištirpusio deguonies koncentracija ir druskingumas (jei reikia) turi būti matuojami mažiausiai tris kartus (bandymo pradžioje, viduryje ir pabaigoje). Darant pusiau statinius bandymus, ištirpusio deguonies koncentraciją rekomenduojama matuoti dažniau, geriau prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, ar bent kartą per savaitę. Atliekant statinius bandymus su atnaujinimu, pH vertė turi būti matuojama prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, o atliekant dinaminius bandymus – bent kartą per savaitę. Vandens kietumas ir šarmingumas atliekant kiekvieną bandymą matuojami vieną kartą. Temperatūrą bent viename bandymų inde reikėtų kontroliuoti nuolat.

 

1.8.6. Stebėjimai

Masė. Baigiant bandymą visos gyvos žuvys turi būti pasvertos, norint nustatyti gyvų žuvų grupių (sausai nušluostytų filtro popieriumi) masę, imant duomenis pagal bandymų indus ar atskirai kiekvienos žuvies. Geriau yra sverti bendrai bandymų indus, nes, sveriant kiekvieną žuvį, jas reikėtų atskirai ženklinti. Nustatant atskirų žuvų masę kiekvienos žuvies savitajam augimo greičiui nustatyti, pasirinktoji ženklinimo metodika gyvūnams neturi kelti įtampos (gali tikti žuvų ženklinimo užsaldant alternatyvos, pvz., plonas spalvotas valas).

Žuvys visą bandymo laiką turi būti kasdien apžiūrimos ir turi būti pažymimos bet kokios išorės anomalijos (pvz., kraujavimas, spalvos pakeitimas) bei neįprastas elgesys. Visi gaištamumo atvejai turi būti registruojami, o negyvos žuvys kuo greičiau pašalinamos. Jei įkrova ir žuvų tankis yra pakankami, negyvos žuvys kitomis nekeičiamos, kad būtų išvengta poveikio augimui dėl vienam bandymų indui tenkančio žuvų skaičiaus kitimo. Tačiau šėrimo davinį reikia koreguoti.

 

2 DUOMENYS IR ATASKAITA

2.1 REZULTATŲ APDOROJIMAS

Rekomenduojama, kad, planuojant ir analizuojant bandymo planą, dalyvautų statistikas, nes šis bandymo metodas leidžia keisti eksperimento planą, pvz., bandymo indų skaičių, bandomųjų koncentracijų skaičių, žuvų skaičių ir t. t. Atsižvelgiant į bandymo plano variantų įvairovę, jokių specialių nurodymų dėl statistinės tyrimo eigos čia nepateikiama.

Augimo greitis neturėtų būti apskaičiuojamas bandymų indams, jei gaištamumas juose didesnis kaip 10 %. Tačiau gaištamumas turi būti nurodytas visoms bandomosioms koncentracijoms.

Koks metodas bebūtų taikomas duomenims analizuoti, pagrindinė sąvoka yra savitasis augimo greitis r tarp laiko ti ir t2. Jis gali būti nustatytas keliais būdais pagal tai, ar žuvys yra ženklinamos atskirai ar ne, arba pagal tai, ar reikia nustatyti bandymo indui vidutinį greitį.

čia:

r1 = atskiros žuvies savitasis augimo greitis,

r2 = vidutinis savitasis augimo greitis rezervuare,

r3 = tariamai „pseudo“ savitasis augimo greitis,

w1, w2 = konkrečios žuvies masė, atitinkamai, laiku t1 ir t2,

loge w1 = atskiros žuvies masės tyrimo pradžioje logaritmas,

loge w2 = atskiros žuvies masės tyrimo pabaigoje logaritmas,

logew, = tyrimo pradžioje nustatytos rezervuaro žuvų masės w1 logaritmų verčių vidurkis,

loge w2 = tyrimo pabaigoje nustatytos rezervuaro žuvų masės w2 logaritmų verčių vidurkis,

t1, t2 = tyrimo laikotarpio pradžios ir pabaigos laikas (paros),

r1, r2, r3 gali būti apskaičiuoti 0-28 parų laikotarpiui ir, jei tinka (t. y. kai buvo matuojama 14 parą), 0-14 ir 14-28 parų laikotarpiams.

 

2.1.1 Rezultatų analizė, taikant regresiją (koncentracijos ir atsako santykio modeliavimas)

Šis analizės metodas nustato atitinkamą savitojo augimo greičio ir koncentracijos matematiškai išreiškiamą santykį taigi leidžia įvertinti EC“, t. y. kiekvieną reikiamą EC vertę. Taikant šį metodą, r vertės (n) atskirai žuviai apskaičiuoti nebūtina, ir analizė gali būti pagrįsta vidutine bandymo indo (r2) r verte. Šiam metodui taikoma pirmenybė. Jis taip pat tinkamesnis naudojant mažiausių žuvų rūšis.

Norint ištirti koncentracijos ir atsako santykį, vidutiniai savitieji augimo greičiai bandymo indui (r2) turi būti išreiškiami grafiškai, kaip koncentracijos funkcija.

Santykiui tarp r2 ir koncentracijos išreikšti turi būti pasirinktas atitinkamas modelis ir jo pasirinkimas turi būti atitinkamai pagrįstas.

Jei kiekviename bandymo inde likusių gyvų žuvų skaičius yra nevienodas, modelio pritaikymo procese, paprastame ar netiesiniame, reikėtų naudoti svorinius koeficientus, taip atsižvelgiant į nevienodą grupių dydį.

Modelio pritaikymo metodas turi leisti įvertinti, pvz., EC20 ir nustatyti jos sklaidą (standartinę paklaidą ar pasikliovimo intervalą). Pritaikyto modelio grafikas turėtų būti parodytas lyginant su duomenimis, kad būtų galima įvertinti pritaikyto modelio atitikimą (9) (19) (20) (21).

 

2.1.2 Rezultatų analizė LOEC įvertinti

Jei atliekant bandymą kiekvienai iš visų koncentracijų verčių yra po keletą indų lygiagretiems pakartojimams, LOEC įvertinimas gali būti grindžiamas vidutinio savitojo augimo greičio bandymo indui dispersine analize (ANOVA) (žr. 2.1 poskyrį). Vėliau taikomas tinkamas metodas (pvz., Dunnett ar Williams kriterijus (13) (14) (15) (22), kuriuo kiekvienos koncentracijos vidutinė r vertė lyginama su kontrolinių bandinių vidutine r verte. Tai daroma, norint nustatyti mažiausią koncentraciją, kuriai šis skirtumas yra reikšmingas, esant 0,05 kriterijaus reikšmingumo lygmeniui. Jei parametriniams metodams reikiamos hipotezės (nenormalus pasiskirstymas (pvz., Shapiro-Wilk kriterijus) ar heterogeninė sklaida (Bartlett kriterijus)) nepasitvirtina, reikėtų numatyti duomenų pertvarkymą sklaidoms homogenizuoti prieš atliekant dispersine analizę ar atlikti svorinę dispersine analizę.

Jei, atliekant bandymą, lygiagretiems pakartojimams atlikti reikalingų indų yra ne visoms koncentracijos vertėms, bandymo indais pagrįsta dispersine analizė bus netiksli ar neįmanoma. Šiuo atveju yra priimtinas kompromisas dispersinei analizei panaudoti kiekvienos žuvies „pseudo“ savitąjį augimo greitį r3.

Toliau vidutinė r3 vertė kiekvienai koncentracijai gali būti lyginama su vidutine r3 verte kontroliniams bandymams. Tuomet LOEC gali būti nustatytas taip, kaip buvo daryta pirmiau. Būtina pripažinti, kad šis metodas neatsižvelgia į kintamumą tarp bandymo indų, išskyrus kintamumą tarp atskirų žuvų, ir šiuo požiūriu nesuteikia jokios apsaugos. Tačiau patyrimas parodė (9), kad kintamumas tarp bandymo indų buvo labai mažas lyginant su kintamumu konkrečiame inde (t.y. tarp žuvų). Jei į analizę neįtraukiami kiekvienos žuvies duomenys, būtina numatyti išskirčių identifikavimo metodą ir pagrįsti jo taikymą.

 

2.2 REZULTATŲ AIŠKINIMAS

Rezultatai turi būti aiškinami atsargiai, jei išmatuotos bandomųjų tirpalų toksiškų medžiagų koncentracijos vertės yra arti analizės metodo aptikimo ribos arba, jei atliekant pusiau statinius bandymus, bandomosios medžiagos tirpalo prieš atnaujinimą koncentracija yra mažesnė kaip šviežiai paruošto tirpalo koncentracija.

 

2.3 BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:

 

2.3.1 Bandomoji medžiaga:

- fizinė būsena ir atitinkamos fizinės ir cheminės savybės,

- cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynumą, ir, jei reikia, analizės metodas bandomajai medžiagai kiekybiškai nustatyti.

 

2.3.2 Bandomieji gyvūnai

- mokslinis pavadinimas, gali būti,

- veislė, dydis, tiekėjas, bet kokie prieš tai buvę poveikiai, priežiūra ir 1.1.

 

2.3.3 Bandymo sąlygos:

- taikytas bandymo metodas (pvz., pusiau statinis ar su atnaujinimu, dinaminis, įkrova, žuvų tankis ir 1.1,

- bandymo planas (pvz., bandymų indų skaičius, bandomosios koncentracijos ir lygiagrečių bandymų skaičius, žuvų skaičius viename inde),

- pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų atnaujinimo dažnis (jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija),

- vardinės bandymo koncentracijos, bandymų induose nustatytų analizės būdu koncentracijų vidutinės vertės ir jų standartiniai nuokrypiai bei nustatymo metodas ir įrodymai, kad buvo atliekami tikrųjų bandomosios medžiagos tirpalų koncentracijų matavimai,

- skiedimo vandens savybės: pH, kietumas, šarmingumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės, bandymo terpės druskingumas (jei matuota) ir visi kiti atlikti matavimai,

- vandens kokybė bandymų induose: pH, kietumas, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija,

- išsami informacija apie šėrimą (pvz., davinio rūšis (-ys), šaltinis, duodamas kiekis ir šėrimo dažnumas).

 

2.3.4 Rezultatai:

- kontrolinių bandymų atitikimo pagrįstumo kriterijams duomenys ir duomenys apie gaištamumą visose bandomosiose koncentracijose,

- taikytos statistinės analizės metodikos, statistika, pagrįsta lygiagrečiais bandymų indais ar žuvimis, duomenų apdorojimas ir naudotų metodikų pagrindimas,

- lentelėse pateikti 0,14 (jei matuota) ir 28 parų atskirų žuvų ir vidutinės žuvų masės duomenys bandymo indui ar tariamai „pseudo“ savitojo augimo greičio (jei reikia) vertės 0-28 parų laikotarpiu ar galbūt 0 – 14 ir 14 – 28 parų laikotarpiu,

- statistinės analizės (t. y. regresinės analizės ar dispersinės analizės) rezultatai, geriau , kad tai būtų lentelės ir grafikai, LOEC (p = 0,05) bei NOEC ar ECX vertės, nurodant, kai įmanoma, atitinkamas standartines paklaidas,

- visi pasitaikantys žuvų neįprasto elgesio atvejai ir visos matomos bandomosios medžiagos poveikio pasekmės.

 

3 NUORODOS

1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UKRing Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2.

2) Meyer, A., Bierman, C. H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231 – 236 p.

3) Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.

4) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, 1855 – 1870 p.

5) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N. and Hofte B. B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, 157 – 164 p.

6) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.

7) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28,287 – 297 p.

8) Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.

9) Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia,328-338p.

10) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 p.

11) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.

12) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10—12 December 1991.

13) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control J. Amer. Statist. Assoc, 50, 1096 – 1121 p.

14) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20,482 — 491 p.

15) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103 – 117 p.

16) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, 123 – 133 p.

17) Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, 33 – 41 p.

18) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 p.

19) Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485 – 1494

P-

20) De Graeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.

21) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assessment Center. Sept. 1988.12 p.

22) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28,510 —531 p.

 

1 priedas

BANDYMAMS REKOMENDUOJAMOS ŽUVŲ RŪŠYS IR TINKAMOS BANDYMO SĄLYGOS

 

Rūšys

Rekomenduojamas bandymo temperatūros diapazonas (°C)

Apšvietimo trukmė (valandos)

Rekomenduojamas žuvų pradinės masės diapazonas (g)

Būtinas matavimo tikslumas

Įkrova

(g/l)

Gyvūnų tankis (litrui)

Maistas

Bandymo trukmė (paros)

Rekomenduojamos rūšys:

 

 

 

 

 

 

 

 

Oncorhynchus mykiss Vaivorykštinis upėtakis

12,5-16,0

12-16

1-5

100 mg tikslumu

1,2-2,0

4

Sausas firminis lašišinių mailių maistas

≥28

Kitos dokumentais tinkamai patvirtintos rūšys:

 

 

 

 

 

 

 

 

Danio rerio Zebrinė danija

21-25

12-16

0,050-0,100

1 mg tikslumu

0,2-1,0

5-10

Gyvas maistas {Brachionus Artemid)

≥28

Oryzias latipes Japoninė medaka

21-25

12-16

0,050-0,100

1 mg tikslumu

0,2-1,0

5-20

Gyvas maistas (Brachionus Artemid)

≥28

 

2 Priedas

KAI KURIOS SKIEDIMO VANDENS CHEMINĖS SAVYBĖS

 

Medžiaga

Koncentracija

Kietosios dalelės

< 20 mg/l

Bendra organinė anglis

< 2 mg/l

Nejonizuotas amoniakas

<1 μg/l

Liekamasis chloras

< 10 μg/l

Bendras fosforo organinių pesticidų kiekis

< 50 ng/l

Bendras chloro organinių pesticidų ir polichlorintų difenilų kiekis

< 50 ng/l

Bendras organinis chloras

< 25 ng/l

 

3 Priedas

TOKSIŠKUMO BANDYMUI TINKAMŲ KONCENTRACIJŲ LOGARITMINĖ EILUTĖ (9)

 

Stulpelis (koncentracijų tarp 100 ir 10 ar tarp 10 ir 1 skaičius)1

1

2

3

4

5

6

7

100

100

100

100

100

100

100

32

46

56

63

68

72

75

10

22

32

40

46

52

56

3,2

10

18

25

32

37

42

1,0

4,6

10

16

22

27

32

 

2,2

5,6

10

15

19

24

 

1,0

3,2

6,3

10

14

18

 

 

1,8

4,0

6,8

10

13

 

 

1,0

2,5

4,6

7,2

10

 

 

 

1,6

3,2

5,2

7,5

 

 

 

1,0

2,2

3,7

5,6

 

 

 

 

1,5

2,7

4,2

 

 

 

 

1,0

1,9

3,2

 

 

 

 

 

1,4

2,4

 

 

 

 

 

1,0

1,8

 

 

 

 

 

 

1,3

 

 

 

 

 

 

1,0

 

1 Stulpelyje galima pasirinkti penkių (ar daugiau) viena po kitos einančių koncentracijų eilutę. Stulpelio (x) koncentracijų vidurio taškai randami stulpelyje (2x +1). Sąraše nurodytos vertės gali būti išreikštos procentine tūrio dalimi ar masės koncentracija (mg/l ar μg/1). Vertės gali būti padaugintos ar padalytos iš 10, pakelto bet kuriuo tinkamu laipsniu. 1 stulpelį galima būtų naudoti, jei toksiškumo lygio neapibrėžtis yra didelė.

ŽUVYS, TRUMPALAIKIS TOKSIŠKUMO EMBRIONUI IR MAILIUI SU TRYNIO MAIŠELIU BANDYMAS (C.15.)

 

1 METODAS

Šis trumpalaikio toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 212 (1998) kopija.

 

1.1 ĮVADAS

Šis trumpalaikio toksiškumo žuvų embrionams ir mailiui su trynio maišeliu bandymas yra trumpalaikis. Ką tik apvaisinti žuvų ikrai yra veikiami nuo jų apvaisinimo iki mailiaus su trynio maišeliu stadijos pabaigos. Toksiškumo bandymas embrionui ir mailiui su trynio maišeliu atliekamas be šėrimo, bandymas turi būti baigtas, kol mailius dar maitinamas iš trynio maišelio.

Bandymo tikslas – nustatyti cheminių medžiagų letalaus ir mažesnio subletalaus poveikio specifinėms vystymosi stadijoms ir bandytai rūšiai pasekmes. Šis bandymas turėtų suteikti vertingos informacijos, nes jis a) galėtų būti letalumo ir subletalumo bandymų jungtimi, b) galėtų būti taikomas kaip atrankos bandymas, numatant visą pradinės gyvenimo stadijos bandymą ar chroniško toksiškumo bandymus ir c) galėtų būti taikomas bandyti rūšis, kurių auginimo metodai dar nėra taip gerai parengti, kad aprėptų perėjimo etapą iš endogeninio į egzogeninį maitinimą.

Žinotina, kad tik visas žuvies gyvenimo ciklo stadijas apimantys bandymai gali duoti tikslų chroniško toksiškumo žuvims įvertį ir kad bent kiek sutrumpinus veikimą, neįtraukiant kurios nors gyvenimo stadijos, gali sumažėti jautrumas, taigi gali būti nepakankamai įvertintas chroniškas toksiškumas. Todėl manoma, kad embriono ir mailiaus su trynio maišeliu bandymas turėtų būti ne toks jautrus kaip visas pradinio gyvenimo stadijų bandymas, ypač labai lipofiliškų cheminių medžiagų (log Pow > 4) ir specifinio toksiško veikimo cheminių medžiagų atvejais. Tačiau mažesnių jautrumo skirtumų tarp šių dviejų bandymų reikėtų tikėtis bandant nespecifinio, narkotinio veikimo tipo chemines medžiagas (1).

Dar prieš šio bandymo paskelbimą daugiausia patyrimo, atliekant embriono ir mailiaus su trynio maišeliu bandymą, buvo sukaupta su gėlavandenėmis žuvimis – zebrinėmis danijomis (Danio rerio) Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – įprastas pavadinimas danija). Todėl smulkesnių nurodymų, kaip atlikti bandymą, naudojant šią žuvų rūšį, pateikta 1 priede. Tačiau tai netrukdo naudoti kitas rūšis, su kuriomis taip pat yra sukaupta patyrimo (IA ir IB lentelės).

 

1.2 APIBRĖŽIMAI

Mažiausia pastebimo poveikio koncentracija LOEC. Mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis yra statistiškai reikšmingas lyginant su kontroliniais bandiniais (kai p<0,05). Tačiau visų didesnių kaip LOEC bandomųjų koncentracijų kenksmingas poveikis turi būti lygus ar didesnis kaip LOEC poveikis.

Nepastebimo poveikio koncentracija NOEC. Bent kiek už LOEC mažesnė bandomosios medžiagos koncentracija.

 

1.3 BANDYMO ESMĖ

Embrionų ir mailiaus su trynio maišeliu augimo stadijų žuvys veikiamos vandeniniais įvairių koncentracijų bandomosios medžiagos tirpalais. Bandymo protokolas leidžia pasirinkti pusiau statinį ar dinaminį bandymą. Pasirinkimas priklauso nuo bandomosios medžiagos prigimties. Bandymas pradedamas sudėjus apvaisintus ikrus į bandymo indus ir baigiamas prieš pat tą momentą, kai kuriame nors inde lervos trynio maišelis yra visiškai absorbuotas ar kai iš bado pradeda gaišti kontrolinių bandymų lervos. Įvertinamos letalios ir subletalios poveikio pasekmės. Jos lyginamos su kontrolinėmis vertėmis mažiausiai pastebimo poveikio koncentracijai, taigi ir nestebimo poveikio koncentracijai nustatyti. Kitaip poveikiai gali būti analizuojami, taikant regresijos modelį ir siekiant nustatyti koncentraciją, kuri sukeltų x % pokytį (t. y., LC/ECX, čia x yra tam tikras % išreikštas poveikis).

 

1.4 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ

Reikėtų turėti ūmaus toksiškumo bandymo (žr. „Ūminis toksinis poveikis žuvims“, Žin., 2002, Nr. 81-3493), geriau atlikto su šiam bandymui pasirinkta rūšimi, rezultatus. Rezultatai gali būti naudingi, tiriant ankstyvuosius gyvenimo etapus, pasirenkant atitinkamą bandomųjų koncentracijų diapazoną. Turi būti žinomas medžiagos tirpumas vandenyje (įskaitant tirpumą bandymo vandenyje) ir bandomosios medžiagos garų slėgis. Turi būti patikimas metodas nustatyti ištirpintos bandomosios medžiagos kiekį žinomu tikslumu ir aptikimo riba, kurie nurodomi ataskaitoje.

Informacija apie bandomąją medžiagą, vertinga bandymo sąlygoms nustatyti, yra struktūrinė formulė, medžiagos grynumas, stabilumas veikiant šviesai, stabilumas bandymo sąlygomis, pKa, Pow ir lengvo biologinio skaidomumo bandymo rezultatai (žr. „„Lengvo“ biologinio skaidomumo nustatymas“, Žin., 2002, Nr. 81-3493).

 

1.5 BANDYMO PAGRĮSTUMAS (PATIKIMUMAS)

Bandymo pagrįstumui (patikimumui), turi būti įvykdytos šios sąlygos:

- bendras apvaisintų ikrų išgyvenamumas kontroliniuose bandiniuose ir, jei reikia, induose vien tik su tirpikliu turi būti didesnis arba lygus ribinėms vertėms, apibrėžtoms 2 ir 3 prieduose,

- ištirpusio deguonies koncentracija visą bandymą turi sudaryti 60 % – 100 % oro soties vertės (OSV),

- kiekvieną bandymo momentą temperatūros verčių (ir bandymo induose, ir skirtingomis bandymo dienomis) skirtumas neturi būti didesnis kaip ±1,5 °C, o temperatūra turėtų būti palaikoma bandymo rūšims nurodyto diapazono (2 ir 3 priedai) ribose.

 

1.6 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.6.1. Bandymų indai

Galima naudoti bet kokius stiklinius ar chemiškai inertiškos medžiagos indus. Indų matmenys turi būti pakankamai dideli, kad atitiktų įkrovos sąlygas (žr. 1.7.1.2). Bandymų indus bandymų atlikimo plote rekomenduojama išdėstyti atsitiktinai. Jei laboratorijoje yra sistemingi poveikiai, kuriuos būtų galima kontroliuoti suskirstant į blokus, indus geriau išdėstyti nevisiškai atsitiktinai, bet pagal atsitiktinę blokų schemą, kiekvieną bloką kontroliuojant. Jei taikoma blokų schema, į tai būtina atsižvelgti vėliau analizuojant duomenis. Bandymų indai turi būti apsaugoti nuo nepageidautinų trikdžių.

 

1.6.2 Žuvų rūšių parinkimas

Rekomenduotos žuvų rūšys nurodytos 1A lentelėje. Tai netrukdo naudoti kitas rūšis (pavyzdžiai pateikti 1B lentelėje), bet, norint sudaryti tinkamas bandymų sąlygas, gali tekti pritaikyti bandymų metodiką. Šiuo atveju ataskaitoje turi būti pagrįsti rūšies pasirinkimas ir tyrimo metodas.

 

1.6.3 Veislinių žuvų laikymas

Duomenų apie veislinių žuvų laikymą patenkinamomis sąlygomis galima rasti OECD TG 210[1] ir nuorodose (2) (3) (4) (5) (6).

 

1.6.4 Embrionų ir lervų priežiūra (apdorojimas)

Embrionai ir lervos gali būti veisiami mažesniuose į pagrindinį indą įstatomuose induose, jų šonines ar galines sieneles pakeičiant tinklu, kad tirpalas galėtų tekėti per indą. Galima padaryti taip, kad per mažus indus tekėtų neturbulentinis srautas, tik reikia pakabinti juos ant svirties, kuri indus keltų ir nuleistų, bet visą laiką organizmai turi būti panardinti; taip pat galima naudoti sifoninę tekėjimo sistemą. Apvaisinti lašišinių žuvų ikrai gali būti laikomi dėžėse ar tinkluose su pakankamai didelėmis akutėmis, kad išsiritusios lervos galėtų pro jas iškristi. Lervoms pernešti, atliekant pusiau statinius bandymus su visišku kasdieniu atnaujinimu, tinka Pastero pipetės (žr. 1.6.6).

Jei ikrų talpyklos, grotelės ar tinkleliai buvo naudojami ikrams pagrindiniame inde laikyti, šitos apribojimo priemonės turėtų būti pašalintos išsiritus lervoms1, tačiau reikia palikti tinklelius, kurie neleistų ištrūkti žuvims. Jei lervas reikia pernešti, jų neturi veikti oras, o žuvims iš ikrų talpyklų pernešti neturi būti naudojami tinklai (tokia atsargumo priemonė gal ir nebūtina kai kurioms ne tokioms gležnoms rūšims, pvz., karpiui). Šio pernešimo laikas įvairioms rūšims skirtingas ir pernešti nėra visuomet būtina. Taikant pusiau statinį metodą galima naudoti chemines stiklines ar negilias talpyklas ir, jei būtina, turinčias tinklo ekraną, truputį pakeltą virš stiklinės dugno. Jei šių talpyklų tūris yra pakankamas, kad atitiktų įkrovos reikalavimus (žr. 1.7.1.2), embrionų ar lervų pernešti nebūtina.

 

1.6.5 Vanduo

Bandymams galima naudoti bet kokį vandenį, kuris atitinka priimtino skiedimo vandens chemines ypatybes, nurodytas 4 priede, ir kuriame bandymo rūšis rodo kontrolinį išgyvenamumą, bent tokį, koks aprašytas 2 ir 3 prieduose. Vandens kokybė turėtų būti vienoda visą bandymo laiką. pH reikšmė neturėtų kisti daugiau kaip ± 0,5 pH vieneto. Norint garantuoti, kad skiedimo vanduo neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pvz., nesudarytų kompleksinių junginių su bandomąja medžiaga) ar nedarytų neigiamo poveikio neršiančių žuvų elgesiui, vandens bandiniai kartkartėmis turi būti analizuojami. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ir Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cf ir SO), pesticidų (pvz., bendro

fosforo organinių ir chloro organinių pesticidų kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti daroma, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė pakankamai ilgai nekinta. Jei būtų parodyta, kad vandens kokybė nekinta bent metus, analizė gali būti daroma ne taip dažnai, o intervalai padidinti (pvz., kas šešis mėnesius).

 

1.6.6 Bandomieji tirpalai

Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą.

Pradinį tirpalą geriau ruošti bandomąją medžiagą tiesiog maišant ar plakant skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ar ultragarsu). Pakankamai koncentruotą pradinį tirpalą ruošiant galima naudoti prisotinimo kolonėles (tirpumo kolonėles). Kiek įmanoma, reikia vengti naudoti tirpiklius ar dispergatorius (soliubilizuojančias medžiagas); tačiau kartais, norint gauti tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą, tokias medžiagas gali tekti panaudoti. Tinkami tirpikliai yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilsulfoksidas, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Tinkami dispergatoriai yra Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metilceliuliozė ir HCO-40. Reikėtų atsargiai naudoti lengvai biologiškai irstančias medžiagas (pvz., acetoną) ir (ar) labai lakius junginius, nes, darant dinaminius bandymus, jie gali kelti problemų dėl bakterijų kaupimosi. Naudojama soliubilizavimo medžiaga neturi daryti reikšmingo poveikio išgyvenamumui ir neigiamo poveikio ankstyvosioms stadijoms, kaip kad nustatoma atliekant kontrolinį bandymą vien tik su tirpikliu. Tačiau reikia kiek įmanoma stengtis tokių medžiagų nenaudoti.

Pusiau statiniam metodui galima taikyti dvi atnaujinimo metodikas: 1) nauji bandomosios medžiagos tirpalai paruošiami švariuose induose ir gyvi likę ikrai bei lervos su mažu seno tirpalo kiekiu pernešami į naujus indus, vengiant sąlyčio su oru, ar 2) bandymų organizmai paliekami senuose induose, tačiau pakeičiama dalis (bent trys ketvirčiai) jų vandens. Terpės atnaujinimo dažnis dažniausiai priklauso nuo bandomosios medžiagos stabilumo, tačiau vandenį atnaujinti rekomenduojama kasdien. Jei pradiniai stabilumo bandymai (žr. 1.4) rodo, kad bandomosios medžiagos koncentracija tarp atnaujinimų yra nestabili (t. y. yra už 80 – 120 % vardinės koncentracijos ribų ar yra mažesnė kaip 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), reikėtų numatyti dinaminio bandymo taikymą. Bet kuriuo atveju reikėtų pasirūpinti, kad atnaujinant vandenį lervos nepatirtų įtampos.

Bandomosios koncentracijos tirpalams į bandymo kameras tiekti atliekant dinaminius bandymus reikalinga sistema, kuri nepertraukiamai dozuotų ir skiestų bandomosios medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozavimo siurblys, proporcingasis skiestuvas, prisotinimo sistema). Pradinių tirpalų ir skiedimo vandens srautai turi būti kartais, geriau kasdien, tikrinami ir visą bandymą turi nekisti daugiau kaip 10 %. Tinkamas pasirodė esąs srautas, atitinkantis bent penkis bandymo indo tūrius per 24 h (2).

 

1.7 BANDYMO EIGA

Vertingos informacijos, kaip atlikti žuvų embrionų ir mailiaus su trynio maišeliu toksiškumo bandymus, yra literatūroje, kurios keli pavyzdžiai įtraukti į šio teksto nuorodų dalį (7) (8) (9).

 

1.7.1 Veikimo sąlygos

1.7.1.1. Trukmė

Bandymą geriau pradėti per 30 min. nuo ikrų apvaisinimo. Embrionai į bandomąjį tirpalą dedami prieš prasidedant blastodisko segmentacijos stadijai ar tik jai prasidėjus, bet būtinai prieš gastrolės stadijos pradžią. Jei ikrus tiekia prekybininkas, pradėti bandymą iš karto po apvaisinimo gali būti neįmanoma. Kadangi bandymo pradžios vėlavimas gali labai paveikti bandymo jautrumą, bandymas turėtų būti pradėtas per aštuonias valandas po apvaisinimo. Dėl tos priežasties, kad lervos veikimo laikotarpiu nemaitinamos, bandymas turėtų būti baigtas prieš pat tą momentą, kai kurioje nors bandymo kameroje kurios nors lervos trynio maišelis bus visiškai absorbuotas ar kai iš bado pradės žūti kontrolinių bandymų gyvūnai. Trukmė priklauso nuo naudotos rūšies. Kai kurios rekomenduojamos trukmės yra nurodytos 2 ir 3 priedėliuose.

1.7.1.2. Įkrova

Bandymo pradžioje turimų apvaisintų ikrų skaičiaus turi pakakti vykdant statistikos reikalavimus. Ikrai turi būti paskirstyti atsitiktinai ir kiekvienai koncentracijai turi būti naudojama bent po 30 apvaisintų ikrų, vienodai (ar kuo panašiau, nes naudojant kai kurias rūšis gali būti sunku gauti vienodas įkrovas) paskirstytų bent į tris tos pačios koncentracijos bandymų indus. Įkrova (biomasė bandomojo tirpalo tūrio vienetui) turi būti pakankamai maža, kad be aeracijos ištirpusio deguonies koncentraciją būtų galima palaikyti ne mažiau kaip 60 % oro soties vertės. Dinaminiams bandymams yra rekomenduota (2) ne didesnė kaip 0,5 g/l per 24 h ir bet kuriuo momentu ne didesnė kaip 5 g/l tirpalo įkrova.

1.7.1.3. Šviesa ir temperatūra

Apšvietimo laikotarpis ir vandens temperatūra turi atitikti žuvų rūšį (2 ir 3 priedai). Nuolatinei temperatūros kontrolei pravartu būtų turėti papildomą bandymų indą.

 

1.7.2 Bandomosios medžiagos koncentracijos

Dažniausiai reikia naudoti penkias bandomosios medžiagos koncentracijas, kurios skiriasi vienodu santykiu, geriausiai ne didesniu kaip 3,2. Renkantis koncentracijų verčių diapazoną, turi būti išnagrinėta ūmaus toksiškumo tyrimų kreivė, siejanti LC50 ir veikimo trukmę. Tam tikromis aplinkybėmis gali pasiteisinti mažiau kaip penkių koncentracijų verčių naudojimas, pvz., atliekant ribinės koncentracijos vertės nustatymo bandymus, ar siauresnio koncentracijos verčių diapazono. Naudojant mažiau kaip penkias koncentracijų vertes, reikia tai pagrįsti. Medžiagos koncentracijos verčių, didesnių kaip 96 h LC5o ar 100 mg/l, priklauso nuo to, kuri mažesnė, bandyti nebūtina. Neturėtų būti atliekami bandymai su koncentracijos vertėmis, didesnėmis kaip medžiagos tirpumo ribinė koncentracija.

Jei pradinio tirpalo ruošimui naudojama soliubilizuojanti medžiaga, jos galutinė koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1 ml/l ir geriau, kad ji visuose bandymo induose būtų vienoda (žr. 1.6.6).

 

1.7.3 Kontroliniai bandymai

Be bandomosios serijos turi būti atliktas vienas skiedimo vandens kontrolinis bandymas (su lygiagrečiais bandymais, kai reikia) ir, jei tinka, vienas kontrolinis bandymas su soliubilizavimo medžiaga (su lygiagrečiais bandymais, kai reikia).

 

1.7.4 Kiekybinių analizių ir matavimų dažnis

Atliekant bandymą reguliariais tarpais, nustatomos bandomosios medžiagos koncentracijų vertės.

Jei manoma, kad atliekant pusiau statinius bandymus bandomosios medžiagos koncentracija lieka vardinės koncentracijos ± 20 % vertės (t. y. 80 -120 % diapazono; žr. 1.4 ir 1.6.6), rekomenduojama mažiausiai tris kartus lygiais bandymo laiko tarpais nustatyti bent didžiausią ir mažiausią bandomąją koncentraciją iš karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jo atnaujinimą (t. y. reikia analizuoti tą patį tirpalą, imant bandinius iš šviežio tirpalo ir prieš pat jo atnaujinimą).

Jei bandymai tokie, kuriuos atliekant nesitikima, kad koncentracija lieka lygi vardinei vertei ± 20 % (pagal medžiagos stabilumo duomenis), turi būti nustatomos visos naujai paruoštų tirpalų ir atnaujintinų tirpalų koncentracijos vertės, laikantis to paties analizės režimo (t. y. bent tris kartus lygiais bandymo laiko tarpais). Bandomosios medžiagos koncentraciją prieš atnaujinimą reikia nustatyti tik viename tos pačios koncentracijos inde. Tarp nustatymų turi būti ne ilgesnis kaip septynių parų tarpas. Rekomenduojama pateikiant rezultatus remtis išmatuotomis koncentracijos vertėmis. Tačiau jei yra įrodymų, leidžiančių parodyti, kad bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką buvo patenkinamai palaikoma kaip vardinė koncentracijos ± 20 % vertė ar išmatuotoji pradinė koncentracijos vertė, rezultatai gali būti pateikiami remiantis vardine ar išmatuotąja vertėmis.

Atliekant dinaminius bandymus, tinka bandinių ėmimo režimas, panašus į aprašytąjį ir taikomas atliekant pusiau statinius bandymus (bet „senų“ tirpalų koncentracijų matavimas šiuo atveju netaikomas). Tačiau jei šis bandymas trunka ilgiau kaip septynias paras, būtų pageidautina pirmą savaitę padidinti bandinių ėmimo dažnį (pvz., trys matavimų serijos), norint įsitikinti, kad bandomosios koncentracijų vertės nesikeičia.

Bandinius gali tekti filtruoti (pvz., per 0,45 μm akytumo filtrą) ar centrifuguoti. Nei centrifugavimu, nei filtravimu dažniausiai negalima atskirti biologiškai neprieinamos bandomosios medžiagos dalies nuo biologiškai prieinamos dalies, todėl bandinių apdorojimas šiais būdais gali būti netaikomas.

Atliekant bandymą, visuose bandymų induose turi būti matuojama ištirpusio deguonies koncentracija, pH ir temperatūra. Turi būti matuojamas kontrolinių bandinių ir vieno indo su didžiausios koncentracijos bandiniu bendras kietumas ir druskingumas (jei reikia). Ištirpusio deguonies koncentracija ir druskingumas (jei reikia) turi būti matuojami mažiausiai tris kartus (bandymo pradžioje, viduryje ir pabaigoje). Atliekant pusiau statinius bandymus ištirpusio deguonies koncentraciją rekomenduojama matuoti dažniau, geriau prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, ar bent kartą per savaitę. Atliekant pusiau statinius bandymus pH vertė turi būti matuojama prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, atliekant dinaminius bandymus -bent kartą per savaitę. Vandens kietumas kiekvieną bandymą matuojamas vieną kartą. Temperatūrą būtina matuoti kasdien, o bent viename inde būtų gerai ją stebėti visą laiką, nepertraukiamai.

 

1.7.5 Stebėjimai

1.7.5.1. Embrioninio vystymosi stadija

Embrioninė stadija (t. y. gastrolės stadija) veikimo bandomąja medžiaga pradžioje turi būti kiek įmanoma tiksliau patikrinta (verifikuota). Tai galima padaryti naudojant tinkamai išlaikytų ir nuvalytų ikrų pavyzdinį bandinį. Embrioninių stadijų aprašymo ir iliustravimo pavyzdžių galima rasti literatūroje (2) (5) (10) (11).

1.7.5.2. Išsiritimas ir išlikimas

Išsiritimo ir išlikimo stebėjimai turi būti daromi bent kasdien, o gauti skaičiai registruojami. Pageidautina bandymo pradžioje stebėti dažniau (pvz., pirmąsias tris valandas kas 30 minučių), nes kartais išlikimo laikas gali būti svarbesnis už vien tik žūčių skaičių (pvz., dėl ūmaus toksiškumo poveikio). Negyvi embrionai ir lervos turi būti pašalinti iš karto, kai tik bus pastebėti, nes jie greitai suyra. Šalinti reikėtų labai atsargiai, kad nebūtų užgauti ar fiziškai sužaloti šalia esantys ikrai arba lervos, kadangi jie yra labai gležni ir jautrūs. Žūties kriterijai kinta, atsižvelgiant į gyvenimo etapą:

- ikrams, ypač ankstyvosiomis stadijomis, pastebimas skaidrumo sumažėjimas ir spalvos pokytis dėl baltymo koaguliacijos ir (ar) nusėdimo, dėl to atsiranda baltas matinis atspalvis,

- embrionams pastebimas kūno judėjimo ir (ar) širdies plakimo nebuvimas, matinio atspalvio atsiradimas rūšims, kurių embrionai yra permatomi, esant normalioms sąlygoms,

- lervoms pastebimas nejudamumas ir (ar) kvėpavimo judėjimo, ir (ar) širdies plakimo nebuvimas, ir (ar) balta matinė centrinės nervų sistemos spalva, ir (ar) reakcijos į mechaninius dirgiklius nebuvimas.

1.7.5.3. Išvaizdos anomalijos

Kūno ir (ar) pigmentacijos anomalijų turinčių lervų skaičius ir trynio maišelio absorbcijos stadija turi būti registruojami atitinkamais laiko tarpais, atsižvelgiant į bandymo trukmę ir į aprašytos anomalijos prigimtį. Pastebėtina, kad nenormalūs embrionai ir lervos pasitaiko natūraliai ir kai kurių rūšių gali sudaryti net kelis kontrolinio (-ių) bandinio (-ių) procentus. Iš bandymo indų turi būti pašalinami išvaizdos anomalijų turintys ką tik žuvę gyvūnai.

1.7.5.4. Elgesio anomalijos

Anomalijos, pvz., hipervėdinimas, nekoordinuotas plaukimas ir netipiškas nejudrumas, turi būti registruojamos atitinkamais laiko tarpais, atsižvelgiant į bandymo trukmę. Šie pastebėti pokyčiai, nors juos sunku įvertinti kiekybiškai, gali padėti interpretuojant gaištamumo duomenis, t. y. suteikti informacijos apie medžiagos toksiško veikimo būdą.

1.7.5.5. Ilgis

Baigiant bandymą, rekomenduojama išmatuoti atskirų gyvūnų ilgį galima matuoti standartinį ilgį iki uodegos peleko išsišakojimo arba bendrą ilgį. Jei supuvo uodegos pelekas ar jis yra išėstas, turi būti imamas standartinis ilgis. Dažniausiai, jei bandymas vykdomas tiksliai, ilgio variacijos koeficientas lygiagretiems kontroliniams bandiniams turi būti < 20 %.

1.7.5.6. Masė

Baigiant bandymą, galima išmatuoti atskirų gyvūnų masę; geriau nustatyti sausų gyvūnų masę (po 24 h esant 60 °C temperatūrai), o ne gyvų (sausai nušluostytų filtro popieriumi). Dažniausiai, jei bandymas atliekamas tiksliai, masės variacijos koeficientas lygiagretiems kontroliniams bandiniams turi būti < 20 %.

Atliekant stebėjimus, dažniausiai gaunama dalis nurodytų duomenų ar visi duomenys, kuriems taikytina statistinė analizė:

- bendras gaištamumas,

- sveikų lervų skaičius baigiant bandymą,

- išsiritimo pradžia ir jo pabaiga (t. y. 90 % išsiritusių ikrų kiekviename vienodos koncentracijos inde),

- kiekvieną parą išsiritančių lervų skaičius,

- iki bandymo pabaigos išgyvenusių gyvūnų ilgis (ir masė),

- deformuotų ar anomalios išvaizdos lervų skaičius,

- anomalaus elgesio lervų skaičius.

 

2. DUOMENYS IR ATASKAITA

2.1. REZULTATŲ APDOROJIMAS

Rekomenduojama, kad tiek rengiant bandymo planą, tiek ir analizuojant bandymą dalyvautų statistikas, nes šis bandymų metodas leidžia labai keisti eksperimento planą, pvz., bandymo indų skaičių, bandomųjų koncentracijų skaičių, pradinį apvaisintų ikrų skaičių, matuojamų parametrų skaičių. Atsižvelgiant į bandymo plano variantų įvairovę, jokių specialių statistinės metodikos nurodymų čia nepateikiama.

Jei reikia įvertinti LOEC ir NOEC vertes, būtina analizuoti kiekvieno vienodos koncentracijos pakartojimų duomenų sklaidą, taikant dispersinę analizę (ANOVA) ar atsitiktinių veiksnių analizę. Norint atlikti atskiros koncentracijos ir kontrolinių bandinių gautų rezultatų bendrą palyginimą, gali būti naudingas Dunnetto metodas (12) (13). Yra ir kitų naudingų metodų pavyzdžių (14) (15). Taikant dispersinę analizę (ANOVA) ar kitas procedūras, nustatomo poveikio dydis (t. y. metodo galimybės) turi būti apskaičiuotas ir pateiktas ataskaitoje. Žinotina, kad ne visus 1.7.5.6 skirsnyje išvardytus stebėjimus galima statistiškai apdoroti, taikant dispersinę analizę. Pvz., bendras gaištamumas ir gyvų lervų skaičius baigiant bandymą galėtų būti analizuojami, taikant probito modelio metodus.

Jei reikia įvertinti LC ar EC“ vertes, tyrimo rezultatams taikant statistinį metodą, pvz., mažiausių kvadratų ar netiesinių mažiausių kvadratų metodą, turi būti pritaikyta tinkama (-os) kreivė (-ės), pvz., logistinė kreivė. Kreivė (-ės) turi būti sudalyta (-os) taip, kad nustatomos LC ar EC“ vertės ir jų standartinė paklaida galėtų būti įvertintos tiesiogiai. Tai tikrai lengviau apskaičiuoti pasikliovimo rėžius LC ar ECX. Jei nėra svarbių priežasčių pirmenybę teikti kitiems pasikliovimo lygmenims, turi būti nurodomas dvipusis 95 % pasikliovimo intervalas. Pageidautina, kad pritaikymo metodika turėtų priemonių įvertinti atitikimo stokos reikšmę. Galima taikyti grafinius kreivių pritaikymo metodus. Regresinė analizė tinka visiems 1.7.5.6 skirsnyje išvardytiems stebėjimams.

 

2.2 REZULTATŲ INTERPRETAVIMAS

Rezultatai turi būti interpretuojami atsargiai, jei matuojamos bandomųjų tirpalų toksiškų medžiagų koncentracijos vertės yra arti analizės metodo aptikimo ribos. Taip pat labai atsargiai reikėtų interpretuoti gautus koncentracijos verčių rezultatus, didesnius už medžiagos tirpumo vandenyje vertes.

 

2.3 BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:

 

2.3.1. Bandomoji medžiaga:

- fizinė būsena ir atitinkamos fizinės bei cheminės savybės,

- cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynumą ir, jei reikia, analizės metodas, norint nustatyti bandomosios medžiagos kiekį.

 

2.3.2 Bandymų gyvūnai:

- mokslinis pavadinimas, veislė, motininių žuvų skaičius (t. y. kiek moteriškosios lyties žuvų buvo naudojama bandymui reikalingų ikrų skaičiui gauti), apvaisintų ikrų surinkimo šaltinis bei metodas ir vėlesnė priežiūra.

 

2.3.3 Bandymo sąlygos:

- taikytas bandymo metodas (pvz., pusiau statinis ar dinaminis, laikas nuo apvaisinimo iki bandymo pradžios, įkrova ir 1.1);

- apšvietimo laikotarpio (-ių) trukmė,

- bandymo planas (pvz., bandymų indų skaičius ir lygiagrečių bandymų skaičius, embrionų skaičius vienam lygiagrečiam bandiniui),

- pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų atnaujinimo dažnis (jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija),

- vardinės bandomosios koncentracijos, išmatuotos tirpalų koncentracijos vertės bandymų induose, jų vidutinės vertės, standartiniai nuokrypiai ir nustatymo metodas; jei bandomosios medžiagos tirpumas yra mažesnis už bandomosios koncentracijos, įrodymai, kad buvo matuojama bandomosios medžiagos koncentracija tirpale,

- skiedimo vandens savybės: pH, kietumas, šarmingumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės, bandymo terpės druskingumas (jei matuotas) ir visi kiti atlikti matavimai,

- vandens kokybė bandymų induose: pH, kietumas, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija.

 

2.3.4 Rezultatai:

- visų parengiamųjų bandomosios medžiagos stabilumo tyrimų rezultatai;

- įrodymai, kad kontroliniai bandiniai atitinka priimtą bendro bandymų rūšies išgyvenamumo standartą (2 ir 3 priedai);

- embriono ir lervos stadijos žuvų gaištamumo ir išgyvenamumo bei bendro gaištamumo ir išgyvenamumo duomenys;

- ikrų inkubacijos parų skaičius ir išsiritusių lervų skaičius;

- ilgio (ir masės) duomenys;

- morfologinių anomalijų, jei yra, dažnis ir aprašymas;

- poveikių elgesiui, jei yra, dažnis ir aprašymas;

- duomenų statistinė analizė ir apdorojimas;

- jei bandymų duomenims buvo taikoma dispersinė analizė, kiekvieno įvertinto atsako mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC), kai p = 0,05, ir nestebimo poveikio koncentracija (NOEC), įskaitant taikytų statistinių procedūrų aprašymą ir nuorodą, kokio dydžio poveikis gali būti aptiktas,

- jei bandymo duomenims buvo taikomas regresinės analizės metodas, LC ir ECx jų pasikliovimo intervalai ir šioms vertėms apskaičiuoti naudoto pritaikyto modelio grafikas,

- visų nukrypimų nuo bandymo metodo paaiškinimai.

 

3. NUORODOS

1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 p. June 1990.

2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241 – 88. 26

P-

3) Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.

4) Brungs W. A. and Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.

5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, 121 – 173 p.

6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of Daily Spavming and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, 328 – 330 p.

7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chenristry, 6,61 — 71 p.

8) Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chenristry 4, 807 – 821 p.

9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986). Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. m. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, 129 – 145 p.

10) Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1 – 4. Carolina Biological Supply Company.

11) Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 p.

12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50,1096 – 1121 p.

13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20,482 – 491 p.

14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity TestData. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.

15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, 321 – 334 p.

16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological TestMethod Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, 81 p.

17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Niekei, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 21, 126 – 134 p.

18) Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 231 – 236 p.

19) Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F. and Roubaud P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Environmental Safety 32, 19 – 28 p.

20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.

21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.

22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth tęst: an intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, 1189-1203 p.

23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spavming, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.

24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ, Dordrecht, 280 p.

25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, 1 – 58 p.

 

1A LENTELĖ. Bandymui rekomenduojamos žuvų rūšys

 

Gėlavandenės

Oncorhynchus mykiss —

Vaivorykštinis upėtakis (9) (16)

 

Danio rerio —

Zebrinė danija (7)(17)(18)

 

Cyprinus carpio —

Paprastasis karpis (8) (19)

 

Oryzias latipes —

Japoninė medaka (20) (21)

 

Pimephales promelas – (8) (22)

 

 

1B LENTELĖ. Kitų, dokumentais patvirtintų, naudotų rūšių pavyzdžiai

 

Gėlavandenės

Sūriavandenės (jūrų)

Carassius amatus –

Sidabrinis karosas (8)

Menidia peninsula –

Tidewater silverside (23) (24) (25)

Lepomis macrochirus —

Melsvažiaunis saulešeris (8)

Clupea harengus —

Strimelė (24) (25)

 

Godus morhua –

Menkė (24) (25)

 

Cyprinodon variegatus

Margoji lėlžuvė (23) (24) (25)

 

 

1 priedas

TOKSIŠKUMO DANIJOS (BRACHYDANIO RERIO) EMBRIONAMS IR MAILIUI SU TRYNIO MAIŠELIU BANDYMO REKOMENDACIJOS

 

ĮVADAS

Danijos yra Indijos Koromandelio (Coromandel) pakrančių žuvis, gyvenanti srauniose upėse. Tai yra paplitusi karpinių šeimos akvariumų žuvis. Informacijos apie jos priežiūros ir auginimo būdus galima rasti tropinių žuvų auginimo standartų kataloguose. Žuvies biologija ir naudojimas žuvininkystės tyrimams buvo apžvelgti Laale'so veikale (1).

Žuvis retai yra ilgesnė kaip 45 mm. Kūnas cilindriškas su 7 — 9 tamsiai mėlynomis horizontaliomis juostomis sidabriniame fone. Šios juostos eina iki kaudalinio ir analinio pelekų. Nugara yra alyvuogių žalumo. Patinėliai yra liaunesni už pateles. Patelės yra labiau sidabriškos, o jų pilvai yra daugiau išspūtę, ypač prieš nerštą.

Suaugusios žuvys gali išverti didelius temperatūros, pH ir vandens kietumo svyravimus. Tačiau norint gauti sveikų žuvų, kurios nerštų geros kokybės ikrus, reikia sudaryti optimalias sąlygas.

Neršiant patinas persekioja patelę ir bado ją galva, ir kai tik ikrai yra išneršiami, jie iš karto apvaisinami. Ikrai, permatomi ir nelipnūs, krenta į dugną, kur juos gali suryti suaugusios žuvys. Nerštui įtakos turi ir apšvietimas. Jei rytą pakanka šviesos, žuvis dažniausiai neršia anksti, kai tik išaušta.

Patelė gali neršti po kelis šimtus ikrų kas savaitę.

 

MOTININIŲ ŽUVŲ BŪSENA, REPRODUKCIJA IR ANKSTYVOSIOS GYVENIMO STADIJOS

Parenkamas atitinkamas skaičius sveikų žuvų ir prieš numatytą neršto laiką bent dvi savaites laikomas tinkamame vandenyje (pvz., 4 priedas). Žuvų grupei turi būti leista bent kartą neršti prieš tai, kaip bus ruošiama bandymui skirtų ikrų partija. Žuvų tankis šiuo laikotarpiu turi būti ne didesnis kaip 1 gramas žuvų litrui vandens. Tankis gali būti didesnis, jei vanduo keičiamas reguliariai ar naudojamos valymo sistemos. Temperatūra talpyklose turi būti (25 ± 2)°C. Žuvys turėtų būti šeriamos įvairiu maistu, kurį gali sudaryti, pvz., atitinkamas parduodamas sausas maistas, gyvos ką tik išsiritusios artemijos, chironomidai, dafnijos, baltosios kirmėlės (Enchytraeids).

Toliau pateikti dviejų metodikų aprašai. Jas taikant galima gauti pakankamą skaičių sveikų apvaisintų ikrų:

i) Į 50 l skiedimo vandens pilną akvariumą, apsaugotą nuo tiesioginės šviesos, įleidžiamos aštuonios patelės ir 16 patinų, kurie

48 valandas kuo mažiau arba visiškai netrikdomi. Prieš bandymo pradžią vidurdienį akvariumo dugne padedamas padėklas. Padėklą sudaro

5-7 cm aukščio rėmas (iš organinio stiklo ar kitos tinkamos medžiagos), jo viršuje tvirtintas stambių 2-5 mm akučių tinklas, apačioje – smulkių 10 – 30 μm akučių tinklas. Prie stambaus tinklo rėmo pritvirtinami keli „medžiai“ nerštui, padaryti iš nesusuktos nailono virvutės. 12 valandų pabuvus tamsoje, įjungiama silpna šviesa, kad žuvys pradėtų neršti. Po neršto praėjus dviem ar keturioms valandoms, padėklas išimamas ir surenkami ikrai. Padėklas apsaugo ikrus nuo suaugusių žuvų (neleidžia suryti ikrų), be to, lengviau juos surinkti. Žuvų grupei turi būti leista bent kartą neršti prieš tai, kaip bus ruošiama bandymui skirtų ikrų partija.

ii) Nuo penkių iki dešimties patinų ir patelių bent dvi savaites prieš numatytą nerštą laikoma atskirai. Po 5 – 10 parų patelių pilvai bus išsipūtę ir matyti jų genitaliniai speneliai. Patinai spenelių neturi. Žuvys naršinamos tam skirtose talpyklose, turinčiose netikrą tinklinį dugną (kaip pirmiau). Talpykla pripilama skiedimo vandens taip, kad vandens virš tinklo būtų 5-10 cm. Parą prieš numatytą nerštą į rezervuarą įleidžiama viena patelė ir du patinai. Vandens temperatūra palaipsniui didinama kol pasiekiama vienu laipsniu didesnė už aklimatizacijos temperatūrą. Šviesa išjungiama ir stengiamasi netrikdyti talpykloje esančių žuvų. Rytą, nerštui pradėti, įjungiama silpna šviesa. Po 2 – 4 valandų žuvys išimamos ir surenkami ikrai. Jei ikrų reikia daugiau nei gali išneršti viena patelė, galima įrengti pakankamą skaičių talpyklų. Jei prieš bandymą buvo registruota kiekvienos patelės reprodukcijos geba (partijos dydis ir kokybė), nerštui galima atrinkti geriausios reprodukcijos pateles.

Ikrai turi būti pernešti į bandymo indus naudojant stiklinius vamzdelius (vidinis skersmuo ne mažesnis kaip 4 mm), turinčius lanksčias siurbimo kriaušes. Su ikrais pernešamo vandens turi būti kuo mažiau. Ikrai yra sunkesni kaip vanduo ir iškrenta iš vamzdelio. Reikia žiūrėti, kad ikrams (ir lervoms) nepatektų oro. Siekiant užtikrinti, kad pradinėse vystymosi stadijose nebūtų nukrypimų nuo normos, ikrų partijų ėminiai turi būti ištirti mikroskopu. Ikrų dezinfekuoti negalima.

Ikrų daugiausia žūva per pirmąsias 24 h po apvaisinimo. Šiuo laikotarpiu dažnai jų žūva nuo 5% iki 40 %. Ikrai išsigimsta dėl nesėkmingo apvaisinimo ar dėl nenormalaus vystymosi. Atrodo, kad ikrų partijos kokybė priklauso nuo patelių, nes kai kurios patelės visą laiką neršia geros kokybės ikrus, o kitoms tai niekuomet nepavyksta. Skiriasi ikrų partijų vystymosi greitis ir išsiritimo trukmė. Sėkmingai apvaisintų ikrų ir lervų su trynio maišeliu išliekamumas yra geras, dažniausiai didesnis kaip 90 %. Esant 25 °C temperatūrai, lervos išsirita per 3-5 paras po apvaisinimo, o trynio maišelis absorbuojamas maždaug per 13 parupo apvaisinimo.

Embrioninį vystymąsi gerai aprašė Hisaoka and Battle (2). Ikrai ir išsiritusios lervos yra permatomi, todėl galima sekti žuvies vystymąsi ir pastebėti išsigimimus. Praėjus maždaug keturioms valandoms po neršto, neapvaisintus ikrus galima atskirti nuo apvaisintų (3). Šiam tyrimui ikrai ir lervos dedami į mažo tūrio bandymo indus ir tiriami mikroskopu.

Ankstyvosioms gyvenimo stadijoms taikomos bandymo sąlygos yra išvardytos 2 priede. Optimalios praskiedimo vandens pH ir kietumo vertės yra lygios 7,8 ir 250 mg CaCO3/l.

 

APSKAIČIAVIMAI IR STATISTIKA

Siūlomas dviejų stadijų metodas. Iš pradžių statistiškai analizuojami gaištamumo, nenormalaus vystymosi ir išsiritimo trukmės duomenys. Vėliau pagal tas koncentracijas, kurioms esant neigiamo poveikio šiems parametrams nebuvo aptikta, statistiškai įvertinamas kūno ilgis. Siūloma taikyti šį metodą, nes nuo toksiškos medžiagos gali selektyviai žūti kai kurios mažesnės žuvys, vėluoti išsiritimo laikas ir atsirasti akivaizdžių išsigimimų, taigi dėl to gali būti gauti netikslūs ilgio matavimai. Be to, kiekvienam veikimui reikės išmatuoti maždaug tokį pat žuvų skaičių, o taip bus garantuotas bandymo statistikos pagrįstumas (patikimumas).

 

LC50 IR EC50 NUSTATYMAS

Išgyvenusių ikrų ir lervų procentinė dalis, darant pataisą dėl gaištamumo kontroliniuose bandymuose, apskaičiuojama pagal Abbotto formulę (4):

čia:

P = pataisyta išgyvenamumo vertė %;

P' = stebėta išgyvenamumo vertė %, esant bandomajai koncentracijai;

C = stebėta išgyvenamumo vertė kontroliniuose bandymuose.

Jei įmanoma, bandymo pabaigoje tinkamu metodu nustatoma LC50.

Jei vertinant EC50 į statistiką norima įtraukti morfologines anomalijas, rekomendacijų galima rasti Stephan darbe (5).

 

LOEC IRNOEC ĮVERTINIMAS

Ikrų ir mailiaus su trynio maišeliu bandymo tikslas – nenulines koncentracijos vertes palyginti su kontroliniais bandymais, t. y. nustatyti LOEC. Taigi turi būti taikomos bendro palyginimo {multiple comparison) metodikos (6) (7) (8) (9) (10).

 

NUORODOS

1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 121-173 p.

2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311p.

3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabarbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 2, 173-181 p.

4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, 1 – 333 p.

5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, 69 – 81 p.

6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, 1096-1121 p.

7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20,482 – 491 p.

8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, 103 – 117 p.

9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. Biometrics 28, 519 – 531 p.

10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.

 

2 priedas

REKOMENDUOJAMŲ RŪŠIŲ BANDYMŲ SĄLYGOS, TRUKMĖ IR IŠGYVENAMUMO KRITERIJAI

 

Rūšis

Temperatūra, °C

Druskin-gumas, 0/00

Apšvietimo trukmė, valandos

Stadijų trukmė (paros)

 

Tipiška bandymo trukmė

Išgyvenamumas kontroliniuose bandymuose (ne mažesnis kaip, %)

 

embrionas

mailius su trynio maišeliu

išsiritimo sėkmė

 

po išsiritimo

GĖLAVANDENĖS Brachydanio rerio Zebrinė danija

25±1

 

12-16

3-5

8-10

Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 5 parų po išsiritimo (8-10 parų)

80

90

Oncorhynchus mykiss Vaivorykštinis upėtakis

1O±11

12±12

 

03

30-35

25-30

Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 20 parų po išsiritimo (50-55 paros)

66

70

Cyprinus carpio Paprastasis karpis

21-25

 

12-16

5

>4

Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 parų po išsiritimo (8-9 paros)

80

75

Oryzias latipes Japoninė medaka

24±11

23±12

 

12-16

8-11

4-8

Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 5 parų po išsiritimo (13-16 parų)

80

80

Pimephales promelas

25±2

 

16

4-5

5

Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 parų po išsiritimo (8-9 paros)

60

70

 

1 Embrionų.

2 Lervų.

3 Embrionas ir lerva vieną savaitę po išsiritimo laikomi tamsoje, išskyrus kai jie yra tikrinami. Toliau visą bandymo laiką palaikomas silpnesnis apšvietimas.

 

3 priedas

KITŲ DOKUMENTAIS TINKAMAI PATVIRTINTŲ RŪŠIŲ BANDYMŲ SĄLYGOS, TRUKMĖ IR IŠGYVENAMUMO KRITERIJAI

 

Rūšis

Temperatūra

°'c

Druskin-gumas, 0/00

Apšvietimo trukmė, valandos

Stadijų trukmė (paros)

 

Tipiška embriono ir mailiaus su trynio maišeliu bandymo trukmė

Išgyvenamumas kontroliniuose bandymuose (ne mažesnis kaip, %)

embrionas

mailius su trynio maišeliu

išsiritimo sėkmė

 

išsiritimo sėkmė

 

GĖLAVANDENĖS Carassius auratus Sidabrinis karosas

24±1

-

-

3^

>4

Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 parų po išsiritimo (7 paros)

 

80

Leopomis macrochirus Melsvažiaunis saulešeris

21±1

 

16

3

>4

Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 parų po išsiritimo (7 paros)

 

75

JUROS Menidia peninsulae Tidevvater silverside

22-25

15-22

12

1,5

10

Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 5 parų po išsiritimo (6-7 paros)

80

60

Clupea harengus Strimelė

10±1

8-15

12

20-25

3-5

Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 3 parų po išsiritimo (23- 27 paros)

60

80

Gadus morhua Menkė

5±1

5-30

12

14-16

3-5

Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 3 parų po išsiritimo (18 parų)

60

80

Cyprinodon variegatus Margoji lėlžuvė

25±1

15-30

12

 

 

Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 ar 7 parų po išsiritimo (28 paros)

>75

80

 

4 priedas

KAI KŪMOS SKIEDIMO VANDENS CHEMINĖS SAVYBĖS

 

Medžiaga

Koncentracija

Kietosios dalelės

< 20 mg/l

Bendra organinė anglis

< 2 mg/l

Nejonizuotas amoniakas

< 1 μg/l

Liekamasis chloras

< 10 μg/1

Bendras fosforo organinių pesticidų kiekis

< 50 ng/l

Bendras chloro organinių pesticidų ir polichlorintų difenilų kiekis

< 50 ng/l

Bendras organinis chloras

< 25 ng/l

 

NAMINĖS BITĖS. ŪMAUS ORALINIO TOKSIŠKUMO BANDYMAS (C.16.)

 

1 METODAS

Šis ūmaus toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 213 (1998) kopija.

 

1.1 ĮVADAS

Šis toksiškumo bandymas yra laboratorinis metodas, skirtas įvertinti augalų apsaugai skirtų produktų ir kitų cheminių medžiagų ūmų oralinį toksiškumą suaugusioms naminėms bitėms darbininkėms.

Vertinant ir nustatant cheminių medžiagų toksiškumo savybes, gali prireikti nustatyti jų ūmų oralinį toksiškumą naminėms bitėms, pvz., kai naminės bitės gali būti veikiamos chemine medžiaga. Ūmaus oralinio toksiškumo bandymas atliekamas, siekiant nustatyti pesticidų ir kitų cheminių medžiagų būdingą toksiškumą bitėms. Šio bandymo rezultatai turėtų būti taikomi vertinant pesticidų pavojų bitėms. Tokios programos turi būti pradedamos vykdyti nuo laboratorinių toksiškumo bandymų, o baigiamos atliekant bandymus pusiau lauko ir lauko sąlygomis (1). Pesticidai gali būti bandomi kaip aktyviosios medžiagos (a. m.) ir kaip preparatai.

Turi būti vartojamas toksiškumo etalonas, tikrinant bičių jautrumą ir bandymo metodo tikslumą.

 

1.2 APIBRĖŽIMAI

Ūmus oralinis toksiškumas. Žalingo poveikio pasekmės, kurios pasireiškia per 96 valandas (h), davus oralinę vienkartinę bandomosios medžiagos dozę.

Dozė. Suvartotos medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama kaip bandomosios medžiagos masė (μg) vienam bandymo gyvūnui (μg/bitei). Tikroji dozė kiekvienai bitei negali būti apskaičiuota, nes bitės maitinamos kartu, tačiau galima įvertinti vidutinę dozę (bendras suvartotas bandomosios medžiagos kiekis padalintas iš bandomųjų bičių skaičiaus viename narvelyje).

Oralinė LD50 (medianinė letali dozė). Tai yra statistiškai apskaičiuota vienkartinė medžiagos dozė, kurią duodant oraliniu būdu, gali žūti 50 % gyvūnų. LD50 vertė yra išreiškiama (μg) bandomosios medžiagos kiekiu vienai bitei. Jei tai pesticidai, bandomoji medžiaga gali būti aktyvioji medžiaga (a. m.) arba apibrėžtos sudėties produktas, kuriame yra viena ar daugiau kaip viena aktyvioji medžiaga.

Mirštamumas. Bitė registruojama kaip mirusi, kai ji visiškai nejuda.

 

1.3 BANDYMO METODO ESMĖ

Suaugusios naminės bitės darbininkės (Apis meili/era) yra paveikiamos sacharozės tirpale ištirpyta bandomąja medžiaga, skiriant tam tikrą kiekį dozių. Toliau bitės maitinamos tuo pačiu maistu, bet be bandomosios medžiagos. Mirštamumas registruojamas kasdien, bent 48 h, jis lyginamas su mirštamumo kontroliniuose bandymuose vertėmis. Jei mirštamumas didėja per 24h – 48 h, o mirštamumas kontroliniuose bandymuose lieka priimtinas, t. y. < 10 %, bandymą reikia tęsti iki 96 h. Rezultatai analizuojami, kad būtų galima apskaičiuoti LD50 po 24 h ir 48 h, o į ei bandymas tęsiamas, tai ir po 72 h bei 96 h.

 

1.4 BANDYMO PAGRĮSTUMAS

Bandymas yra pagrįstas, jei galioja šios sąlygos:

- baigiant bandymą vidutinis mirštamumas visuose kontroliniuose bandiniuose turi būti ne didesnis kaip 10 %,

- toksiškumo etalono LD50 atitinka apibrėžtą diapazoną.

 

1.5 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.5.1 Bičių rinkimas

Turi būti pasirinktos jaunos, suaugusios ir tos pačios kilmės bitės darbininkės, t. y. to paties amžiaus, vienodai maitinamos ir t. t. Bitės turi būti gaunamos iš tinkamai maitinamų, sveikų, kuo sveikesnės ir geresnės motinėlės šeimų, kurių istorija ir fiziologinė būklė yra žinoma. Jos gali būti renkamos tą rytą, kai numatoma tirti, arba vakare prieš bandymą, ir laikomos bandymo sąlygomis iki kitos dienos. Tinka bitės, surinktos nuo rėmelių, kuriuose nėra perų. Reikia vengti rinkti bites ankstyvą pavasarį ar vėlyvą rudenį, nes tuomet keičiasi bičių fiziologija. Jei bandymai turi būti atliekami anksti pavasarį ar vėlai rudenį, bitės gali būti užaugintos inkubatoriuje ir vieną savaitę maitinamos bičių duonele (iš korių surinkta žiedadulkių masė) ir sacharozės tirpalu. Bitės, apdorotos cheminėmis medžiagomis, pvz., antibiotikais, preparatais nuo varoatozės (ektoparazitinė bičių liga) ir 1.1, toksiškumo bandymams neturi būti imamos, jei po paskutinio apdorojimo dar nėra praėjusios keturios savaitės.

 

1.5.2 Laikymo ir maitinimo sąlygos

Naudojami lengvai plaunami ir gerai vėdinami narveliai. Galima naudoti bet kurios tinkamos medžiagos, pvz., nerūdijančio plieno, vielos tinklelio, plastiko, vienkartinius medinius narvelius ir t.t. Siūloma pasirinkti 10-ies bičių grupes viename narvelyje. Narvelių dydis turi atitikti bičių skaičių, t. y. joms turi būti pakankamai erdvės.

Bitės bandymų patalpoje turi būti laikomos tamsoje, esant 25 ± 2 °C temperatūrai. Santykinė drėgmė, dažniausiai apie 50 – 70 %, turi būti registruojama visą bandymą. Bičių tvarkymo procedūras, įskaitant apdorojimą ir stebėjimus, galima atlikti esant (dienos) šviesai. Maistas yra sacharozės vandeninis tirpalas, kurio galutinė koncentracija yra 500 g/l (50 % w/v). Paveikus bandomąja medžiaga, bitės toliau maitinamos pasirinktiną laiką. Maitinimo sistema turi leisti registruoti maisto suvartojimą kiekviename narvelyje. Galima naudoti stiklinį vamzdelį (maždaug 50 mm ilgio ir 10 mm vidinio skersmens, kurio atvirasis galas susiaurintas maždaug iki 2 mm skersmens).

 

1.5.3 Bičių ruošimas

Surinktos bitės atsitiktiniu būdu paskirstomos į bandymo narvelius, kurie atsitiktiniu būdu išdėstomi bandymų patalpoje.

Prieš bandymo pradžią bites galima laikyti nemaitintas ne daugiau kaip 2 h. Rekomenduojama, prieš veikiant bandomąja medžiaga, bičių nemaitinti, kad bandymo pradžioje visų bičių virškinimo trakto turinys būtų vienodas. Prieš pradedant bandymą mirštančios bitės turi būti pašalintos ir pakeistos sveikomis.

 

1.5.4 Dozių ruošimas

Jei bandomoji medžiaga yra su vandeniu susimaišantis junginys, jį galima tiesiogiai disperguoti 50 % sacharozės tirpale. Vandenyje blogai tirpius techninės paskirties produktus ir medžiagas galima naudoti kartu su bitėms mažai toksiškais tirpikliais, pvz., organiniu tirpikliu, emulsikliu ar dispergatoriumi (pvz., acetonu, dimetilformamidu, dimetilsulfoksidu). Tirpiklio koncentracija priklauso nuo bandomosios medžiagos tirpumo ir turi būti vienoda visoms bandomoms koncentracijoms. Dažniausiai paskiriama 1 % nešiklio koncentracija neturi būti viršijama.

Turi būti paruošti atitinkami kontroliniai tirpalai, t. y., jei bandomajai medžiagai soliubilizuoti naudojamas tirpiklis ar dispergatorius, turi būti naudojamos dvi atskiros kontrolinių bandymų grupės: sacharozės tirpalas vandenyje ir sacharozės tirpalas su tirpikliu ar nešikliu tokios pat koncentracijos, kokia naudojama bandomajame tirpale.

 

1.6 BANDYMO EIGA

1.6.1 Bandymų ir kontrolinės grupės

Dozių ir lygiagrečių bandymų skaičius turi atitikti statistinius LD50 nustatymo reikalavimus, esant 95 % pasikliovimo ribai. Dažniausiai bandymui atlikti reikia penkių dozių, išdėstytų geometrine progresija, kurių daugiklis būtų ne didesnis kaip 2,2 ir galima būtų nustatyti LD50. Skiedimo veiksnys ir dozavimui naudojamų koncentracijų skaičius turi būti nustatyti pagal toksiškumo kreivės (mirštamumas, kaip dozės funkcija) krypties koeficientą ir atsižvelgiant į pasirinktą statistinį metodą, skirtą analizuoti rezultatus. Dozavimui tinkamas koncentracijas galima pasirinkti pagal diapazono nustatymo bandymo rezultatus.

Kiekvienos koncentracijos doze turi būti paveiktos ne mažiau kaip trys bandymų grupės po 10 bičių. Turi būti ne mažiau kaip trys kontrolinės bandymų grupės po 10 bičių, neskaičiuojant bandomosios serijos. Kontrolinės grupės taip pat turi būti įtrauktos ir naudojamiems tirpikliams ar nešikliams (žr. 1.5.4).

 

1.6.2 Toksiškumo etalonas

Į bandymų seriją turi būti įtrauktas toksiškumo etalonas. Kiekvienai bandomajai dozei turėtų būti bent trys narveliai su 10 bičių kiekviename narvelyje. Toksiškumo etalonu geriau naudoti dimetoksatą (dimethoate), kuriam oralinės 24 h LD50 vertės diapazonas yra 0,10 – 0,35 μg aktyviosios medžiagos vienai bitei (2). Tačiau būtų priimtini ir kiti toksiškumo etalonai, jei būtų pateikta pakankamai duomenų tikrinant laukiamą atsaką į dozės poveikį (pvz., tiofosas).

 

1.6.3 Poveikis

1.6.3.1. Dozių davimas

Kiekvienai bičių bandymo grupei turi būti duodama 100 – 200 ui 50 % sacharozės vandeninio tirpalo, kuriame būtų reikiamos koncentracijos bandomoji medžiaga. Blogai tirpiems, mažo toksiškumo produktams ar mažos koncentracijos preparatams reikalingas didesnis tūris, nes turi būti sunaudota didesnė sacharozės tirpalo dalis. Turi būti kontroliuojamas grupės suvartotas bandomojo maisto kiekis. Maistą suvartojus (dažniausiai per 3-4 h), maitinimo įtaisas (penėtuvė) turi būti pašalintas iš narvelio ir pakeistas maitinimo įtaisu vien tik su sacharozės tirpalu. Toliau sacharozės tirpalai duodami pasirinktinam vartojimui. Esant kai kurių junginių didesnei koncentracijai, bandomosios dozės gali būti atmetamos, nes maisto suvartota mažai arba bitės gali jo visiškai nevartoti. Ne vėliau kaip po 6 h nesuvartotas bandomasis maistas turi būti pakeistas vien tik sacharozės tirpalu. Turi būti įvertintas nesuvartoto bandomojo maisto kiekis (pvz., matuojant nesuvartoto maisto tūrį arba masę).

1.6.3.2. Trukmė

Pirmenybė teikiama 48 h bandymo trukmei, po kurios bandomasis tirpalas pakeičiamas vien tik sacharozės tirpalu. Jei mirštamumas po pirmųjų 24 h didėja daugiau kaip 10 %, bandymo trukmė turi būti ilgesnė, bet ne daugiau kaip 96 h, jei mirštamumas kontroliniuose bandymuose yra ne didesnis kaip 10 %.

 

1.6.4 Stebėjimai

Mirštamumas registruojamas praėjus 4 h nuo bandymo pradžios, o vėliau 24 h ir 48 h (t. y. po dozės davimo). Jei reikalingas ilgas stebėjimo laikotarpis, tolesni vertinimai turi būti daromi kas 24 h, bet ne ilgiau kaip 96 h, jei mirštamumas kontroliniuose bandymuose yra ne didesnis kaip 10 %.

Turi būti įvertintas grupės suvartoto maisto kiekis. Apdoroto (bandomojo) ir neapdoroto maisto suvartojimo greičio per 6 h lyginimas gali suteikti informacijos apie apdoroto maisto priimtinumą.

Turi būti registruojami visi bandymą atliekant pastebėti neįprasto elgesio reiškiniai.

 

1.6.5 Ribinis bandymas

Kartais (pvz., kai manoma, kad bandomosios medžiagos toksiškumas turėtų būti mažas) galima atlikti ribinį bandymą, naudojant 100 μg aktyviosios medžiagos vienai bitei, taip norint parodyti, kad LD50 yra didesnė už šią vertę. Turi būti naudojama ta pati procedūra, įskaitant tris lygiagrečias bandymų grupes bandomajai dozei, atitinkamus kontrolinius bandymus ir toksiškumo etaloną. Jei pasitaiko mirštamumo atvejų, turi būti atliekamas visas tyrimas. Jei pastebimi subletalūs poveikiai (žr. 1.6.4), jie turi būti užregistruoti.

 

2 DUOMENYS IR ATASKAITA

2.1 DUOMENYS

Kiekvienos dozės grupės, kontrolinių bandinių ir toksiškumo etalono grupių duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, nurodant bičių skaičių, mirštamumą kiekvieną stebėjimo momentą ir bičių, kurios neįprastai elgiasi, skaičių. Mirštamumo duomenys analizuojami atitinkamais analizės metodais (pvz., probito funkcijos analizė, slenkamasis vidurkis, binominio skirstinio tikimybė) (3) (4). Nubraižomos kiekvieno rekomenduoto stebėjimo momento (t. y. 24 h, 48 h ir, jei reikia, 72 h, 96 h) dozės funkcijos kreivės ir apskaičiuojami kreivių krypties koeficientai bei medianinės letaliosios dozės (LD50) su 95 % pasikliovimo riba. Galima padaryti pataisas dėl mirštamumo kontroliniuose bandymuose, naudojant Abbotto pataisą (4) (5). Jei apdorotas maistas suvartojamas ne visiškai, turi būti nustatyta grupės suvartota bandomosios medžiagos dozė. LD50 turi būti išreikšta bandomosios medžiagos μg vienai bitei.

 

2.2 BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje turi būti ši informacija:

 

2.2.1 Bandomoji medžiaga:

- fizinė būklė ir atitinkamos fizinės ir cheminės savybės (pvz., stabilumas vandenyje, garų slėgis),

- cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant struktūrinę formulę, grynumą (t. y., pesticidams – identiškumas ir aktyviosios (-ųjų) medžiagos (-ų) koncentracija).

 

2.2.2 Bandymų gyvūnai:

- mokslinis pavadinimas, rasė, apytikris amžius (savaitės), rinkimo būdas, rinkimo data,

- informacija apie bičių rinkimui naudotas šeimas, įskaitant sveikatą, visas suaugusių bičių ligas, prieš tai taikytą apdorojimą ir 1.1.

 

2.2.3 Bandymo sąlygos:

- bandymo patalpos temperatūra ir santykinė drėgmė,

- laikymo sąlygos, įskaitant narvelių tipą, dydį ir medžiagą,

- pradinių ir bandomųjų tirpalų ruošimo būdai (turi būti nurodytas tirpiklis, jei naudojamas, ir jo koncentracija),

- pradinių tirpalų ruošimo būdas ir atnaujinimo dažnumas (turi būti nurodyta soliubilizavimo medžiaga, jei naudojama, ir jos koncentracija),

- bandymo atlikimas, pvz., naudotos bandomosios koncentracijos ir jų skaičius, kontrolinių bandymų skaičius; kiekvienai bandomajai koncentracijai ir kontroliniam bandymui naudotų narvelių skaičius ir bičių skaičius viename narvelyje,

- bandymo data.

 

2.2.4 Rezultatai:

- parengiamojo tyrimo diapazono nustatymo, jei atliktas, rezultatai,

- neapdoroti duomenys: mirštamumas po kiekvienos bandytos dozės ir kiekvienu stebėjimo momentu,

- dozės ir atsako kreivės, baigiant bandymą,

- bandomosios medžiagos ir toksiškumo etalono LD50 vertės su 95 % pasikliovimo riba, nustatytos kiekvieną rekomenduotą stebėjimo laiką,

- LD50 nustatymui taikyti statistiniai metodai,

- mirštamumas kontroliniuose bandymuose,

- kiti stebėti ar išmatuoti biologiniai poveikiai, pvz., neįprastas bičių elgesys (įskaitant bandomosios dozės atmetimą), maisto vartojimo greitis apdorotų ir neapdorotų bičių grupėse,

- visi nukrypimai nuo čia aprašytų bandymo metodikų ir visa kita reikalinga informacija.

 

3. NUORODOS

1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products — Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, 151 – 165 p. March 1993.

2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L) 1981 – 1992. Journal of Apicultural Research, 22, 119 – 125 p.

3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simpliSed method of evaluating dose – effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96,99 – 113 p.

4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol, 18, 265-267 p.

 

NAMINĖS BITĖS. ŪMAUS TOKSIŠKUMO BANDYMAS SĄLYČIO BŪDU (C.17.)

 

1. METODAS

Šis ūmaus toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 214 (1998) kopija.

 

1.1 ĮVADAS

Šis toksiškumo bandymas yra laboratorinis metodas, skirtas įvertinti augalų apsaugai skirtų produktų ir kitų cheminių medžiagų ūmų toksiškumą, dėl sąlyčio, suaugusioms naminėms bitėms darbininkėms.

Vertinant ir nustatant cheminių medžiagų toksiškumo savybes, gali prireikti nustatyti ūmų toksiškumą naminėms bitėms sąlyčio būdu, pvz., kai naminės bitės gali būti veikiamos chemine medžiaga. Ūmaus toksiškumo bandymas sąlyčio būdu atliekamas, siekiant nustatyti pesticidų ir kitų cheminių medžiagų būdingą toksiškumą bitėms. Šio bandymo rezultatai turėtų būti naudojami pesticidų pavojaus bitėms vertinimo programose, vykdomose kaip laboratoriniai toksiškumo bandymai ir net kaip bandymai pusiau lauko ir lauko sąlygomis (1). Pesticidai gali būti bandomi kaip aktyviosios medžiagos (a. m.) ar kaip preparatai.

Turi būti vartojamas toksiškumo etalonas bičių jautrumui ir bandymo metodo tikslumui tikrinti.

 

1.2 APIBRĖŽIMAI

Ūmus toksiškumas sąlyčio būdu. Žalingos pasekmės, kurios pasireiškia ne vėliau kaip per 96 h po vienkartinės bandomosios medžiagos dozės vietinio užtepimo.

Dozė. Užteptos medžiagos kiekis. Dozė yra išreiškiama kaip bandomosios medžiagos masė μg vienam bandymų gyvūnui (μg/bitei).

Sąlyčio LD50 (medianinė letali dozė). Yra statistiškai apskaičiuota vienkartinė medžiagos dozė, kurią naudojant gali žūti 50 % gyvūnų. LD50 vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos μg vienai bitei. Jei tai pesticidai, bandomoji medžiaga gali būti aktyvioji medžiaga (a. m.) ar apibrėžtos sudėties produktas, kuriame yra viena ar daugiau kaip viena aktyvioji medžiaga.

Mirštamumas. Bitė registruojama kaip mirusi, kai ji visiškai nejuda.

 

1.3 BANDYMO METODO ESMĖ

Suaugusios naminės bitės darbininkės (Apis mellifera) tam tikrais laiko tarpais yra veikiamos tinkamame nešiklyje ištirpinta bandomąja medžiaga, ją tiesiogiai užlašinant ant torakso (lašeliais). Bandymo trukmė yra 48 h. Jei mirštamumas per 24 h – 48 h didėja, o mirštamumas kontroliniuose bandymuose lieka priimtino lygio, t. y. ≤10 %, bandymą reikia tęsti 96 h. Mirštamumas registruojamas kasdien ir lyginamas su mirštamumo kontroliniuose bandymuose vertėmis. Rezultatai yra analizuojami, kad būtų galima apskaičiuoti LD50 po 24 h ir 48 h, o jei bandymas yra tęsiamas, po 72 h ir 96 h.

 

1.4 BANDYMO PAGRĮSTUMAS (PATIKIMUMAS)

Bandymas yra pagrįstas (patikimas), jei galioja šios sąlygos:

- baigiant bandymą vidutinis mirštamumas visuose kontroliniuose bandiniuose turi būti ne didesnis kaip 10 %,

- toksiškumo etalono LD50 atitinka apibrėžtą diapazoną.

 

1.5 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.5.1 Bičių rinkimas

Turi būti tiriamos jaunos suaugusios bitės darbininkės, t. y. to paties amžiaus, vienodai maitinamos, tos pačios rasės ir t. t. Bitės turi būti gaunamos iš tinkamai maitinamų, sveikų ir vienos motinėlės šeimų, kurių istorija ir fiziologinė būklė yra žinoma. Jos gali būti renkamos tą rytą, kai numatomos tirti, ar vakare prieš bandymą ir laikomos esant bandymo sąlygoms iki kitos dienos. Tinka bitės, surinktos nuo rėmelių, kuriuose nėra perų. Reikia vengti rinkti bites ankstyvą pavasarį ar vėlyvą rudenį, nes tuomet keičiasi bičių fiziologija. Jei bandymai turi būti atliekami anksti pavasarį ar vėlai rudenį, bitės gali būti užaugintos inkubatoriuje ir vieną savaitę maitinamos bičių duonele (iš korių surinkta žiedadulkių mase) ir sacharozės tirpalu. Bitės, apdorotos cheminėmis medžiagomis, pvz., antibiotikais, preparatais varoatozės ir t. t, toksiškumo bandymams neturi būti naudojamos, jei po apdorojimo paskutinį kartą dar nėra praėjusios keturios savaitės.

 

1.5.2 Laikymo ir maitinimo sąlygos

Naudojami lengvai plaunami ir gerai vėdinami narveliai. Galima naudoti bet kurios tinkamos medžiagos, pvz., nerūdijančio plieno, vielos tinklelio, plastiko, vienkartinius medinius narvelius ir t.t. Narvelių dydis turi atitikti bičių skaičių, t. y. joms turi būti pakankamai erdvės. Siūloma naudoti dešimties bičių grupes viename narvelyje.

Bitės bandymų patalpoje turi būti laikomos tamsoje, esant 25 ± 2 °C temperatūrai. Santykinė drėgmė, dažniausiai apie 50 – 70 %, turi būti registruojama per visą bandymą. Bičių tvarkymo procedūras, įskaitant apdorojimą ir stebėjimus, galima atlikti (dienos) šviesoje. Maistas, sacharozės vandeninis tirpalas, kurio galutinė koncentracija yra 500 g/l (50 % w/v), duodamas ed libidum (pasirinktu laiku) per visą bandymą, naudojant bičių maitinimo įtaisą. Tai gali būti stiklinis vamzdelis (maždaug 50 mm ilgio ir 10 mm vidinio skersmens, kurio atvirasis galas susiaurintas maždaug iki 2 mm skersmens).

 

1.5.3 Bičių ruošimas

Surinktos bitės gali būti anestezuotos anglies dioksidu ar azotu, kad būtų galima užtepti bandomąją medžiagą. Anestezuojančios medžiagos kiekis ir veikimo trukmė turi būti kiek įmanoma mažesni. Prieš pradedant bandymą, mirštančios bitės turi būti pašalintos ir pakeistos sveikomis.

 

1.5.4 Dozių ruošimas

Bandomoji medžiaga, o tai yra tirpalas su nešikliu, t.y. ji ištirpinama organiniame tirpiklyje ar vandenyje, turinčiame drėkiklio, užtepama ant bitės. Kaip organinį tirpiklį geriau būtų naudoti acetoną, tačiau galima naudoti ir kitus bitėms mažai toksiškus tirpiklius (pvz., dimetilformamidą, dimetilsulfoksidą). Jei tai vandenyje disperguoti cheminiai preparatai ir organiniuose tirpikliuose netirpios labai polinės organinės medžiagos, lengviau juos užtepti, paruošus nedidelės koncentracijos kurio nors prekybinio drėkiklio (pvz., Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tweeri) tirpalą.

Turi būti paruošti atitinkami kontroliniai tirpalai, t. y., jei bandomajai medžiagai soliubilizuoti naudojamas tirpiklis ar dispergatorius, turi būti naudojamos dvi atskiros kontrolinių bandymų grupės: vienos grupės bitės apdorojamos vandeniu, kitos grupės bitės tirpikliu ir nešikliu.

 

1.6 BANDYMO EIGA

1.6.1 Bandymų ir kontrolinės grupės

Dozių ir lygiagrečių bandymų skaičius turi atitikti statistinius LD50 nustatymo reikalavimus, esant 95 % pasikliovimo ribai. Dažniausiai bandymui reikia penkių LD50 diapazono dozių, išdėstytų geometrine progresija, tarp kurių daugiklis būtų ne didesnis kaip 2,2. Skiedimo veiksnys ir dozavimui naudojamų koncentracijų skaičius turi būti nustatyti pagal toksiškumo kreivės (mirštamumas kaip dozės funkcija) krypties koeficientą ir atsižvelgiant į rezultatams analizuoti parinktą statistinį metodą. Dozavimui tinkamas koncentracijas galima pasirinkti pagal diapazono nustatymo rezultatus.

Kiekvieną bandymo koncentraciją reikia tepti ne mažiau kaip trims bandymų grupėms po 10 bičių.

Be bandomosios serijos, turi būti bandomos trys kontrolinės grupės po 10 bičių. Jei naudojamas organinis tirpiklis ar drėkiklis, tirpikliui ar drėkikliui turi būti naudojamos papildomos trys kontrolinės grupės, kurių kiekvienoje būtų po 10 bičių.

 

1.6.2 Toksiškumo etalonas

Į bandymų seriją turi būti įtrauktas toksiškumo etalonas. Laukiamai LD50 dozei turi būti pasirenkamos bent trys dozės. Kiekvienai bandomajai dozei turi būti bent trys narveliai su 10 bičių kiekviename narvelyje. Kaip toksiškumo etalonui pirmenybė teikiama dimetoksatui (dimethoate), kuriam sąlyčio 24 h LD50 vertės diapazonas yra (0,10 – 0,30) μg aktyviosios medžiagos vienai bitei (2). Tačiau būtų priimtini ir kiti toksiškumo etalonai, jei būtų pateikta pakankamai duomenų laukiamam dozės poveikio atsakui patikrinti (pvz., tiofosas).

 

1.6.3 Veikimas

1.6.3.1. Dozių davimas

Anestezuotos (apmarintos) bitės apdorojamos kiekviena atskirai, darant vietinį užtepimą (užlašinimą). Bitės skirtingoms bandomosioms dozėms ir kontroliniams bandiniams paskirstomos atsitiktinai. Ant kiekvienos bitės torakso dorsalinės pusės mikropipete užtepamas 1 μl tinkamos koncentracijos bandomosios medžiagos tirpalo. Galima naudoti kitokius tūrius, jei tai yra pagrįsta. Užlašinus bitės paskirstomos į narvelius ir joms duodama sacharozės tirpalo.

1.6.3.2. Trukmė

Pirmenybė teikiama 48 h bandymo trukmei, jei mirštamumas 24 h — 48 h laikotarpiu didėja daugiau kaip 10 %. Bandymo trukmė turi būti ilginama ne daugiau kaip iki 96 h, jei mirštamumas kontroliniuose bandymuose yra ne didesnis kaip10 %.

 

1.6.4 Stebėjimai

Mirštamumas registruojamas po 4 h nuo dozės davimo, o vėliau 24 h ir 48 h. Jei reikalingas ilgesnis stebėjimo laikotarpis, tolesni vertinimai turi būti daromi kas 24 h ne ilgiau kaip iki 96 h, jei mirtingumas kontroliniuose bandiniuose yra ne didesnis kaip 10 %. Turėtų būti registruojami visi bandymo metu pastebėti neįprasto elgesio reiškiniai.

 

1.6.5 Ribinis bandymas

Kartais (pvz., kai manoma, kad bandomosios medžiagos toksiškumas turėtų būti mažas) galima atlikti ribinį bandymą, naudojant 100 μg aktyviosios medžiagos vienai bitei, taip norint parodyti, kad LD50 yra didesnė už šią vertę. Turėtų būti naudojama ta pati procedūra, įskaitant tris lygiagrečias bandymų grupes bandomajai dozei, atitinkamus kontrolinius bandymus ir toksiškumo etalono naudojimą. Jei pasitaiko mirštamumo atvejų, turi būti atliekamas visas tyrimas. Jei pastebimi subletalūs poveikiai (žr. 1.6.4 skirsnį), jie turi būti užregistruoti.

 

2 DUOMENYS IR ATASKAITA

2.1 DUOMENYS

Kiekvienos dozės grupės duomenys turi būti apibendrinti ir pateikti lentelėse, kontrolinių bandymų ir toksiškumo etalono grupėms nurodant tirtų bičių skaičių, mirštamumą kiekvieną stebėjimo momentą ir neįprastai besielgiančių bičių skaičių. Mirštamumo duomenys analizuojami atitinkamais analizės metodais (pvz., probito funkcijos analizė, slenkamasis vidurkis, binominio skirstinio tikimybė) (3) (4). Nubraižomos kiekvieno rekomenduoto stebėjimo momento (t. y. 24 h, 48 h ir, jei reikia, 72 h, 96 h) atsako, kaip dozės funkcijos, kreivės ir apskaičiuojami kreivių krypties koeficientai bei medianinės letalios dozės (LD50) su 95 % pasikliovimo ribomis. Galima padaryti kontrolinių bandymų pataisas dėl mirštamumo, naudojant Abbotto pataisą (4) (5). LD50 turi būti išreikšta μg bandomosios medžiagos vienai bitei.

 

2.2 BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje turi būti ši informacija:

 

2.2.1 Bandomoji medžiaga:

- fizinė būsena ir atitinkamos fizinės ir cheminės savybės (pvz., stabilumas vandenyje, garų slėgis),

- cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant struktūrinę formulę, grynumą (t. y., pesticidams – identiškumas ir aktyviosios (-ųjų) medžiagos (-ų) koncentracija).

 

2.2.2 Bandymų gyvūnai:

- mokslinis pavadinimas, rasė, apytikris amžius (savaitėmis), rinkimo būdas, rinkimo data,

- informacija apie bandymų bičių rinkimui naudotas kolonijas, įskaitant sveikatą, visas suaugusių bičių ligas, prieš tai taikytą apdorojimą ir 1.1.

 

2.2.3 Bandymo sąlygos:

- bandymo patalpos temperatūra ir santykinė drėgmė, – laikymo sąlygos, įskaitant narvelių tipą, dydį ir medžiagą,

- bandomosios medžiagos davimo būdai, pvz., naudojamas tirpiklis, užtepamo bandomojo tirpalo tūris, naudotos anestezuojančios medžiagos,

- bandymo atlikimas, pvz., naudotos bandomosios dozės ir jų skaičius, kontrolinių bandinių skaičius; kiekvienai bandomajai koncentracijai ir kontroliniam bandiniui naudotų narvelių skaičius ir bičių skaičius viename narvelyje,

- bandymo data.

 

2.2.4 Rezultatai:

- parengiamojo tyrimo diapazono nustatymo, jei atliktas, rezultatai,

- neapdoroti duomenys: mirštamumas po kiekvienos bandytos dozės ir kiekvieną stebėjimo momentą,

- dozės ir atsako kreivės bandymo pabaigoje,

- bandomosios medžiagos ir toksiškumo etalono LD50 vertės su 95 % pasikliovimo riba, nustatytos kiekvieną rekomenduotą stebėjimo etapą,

- LD50 nustatymui taikyti statistiniai metodai,

- mirštamumas kontroliniuose bandymuose,

- kiti pastebėti ar išmatuoti biologiniai efektai ir bet koks neįprastas bičių elgesys,

- visi nukrypimai nuo čia aprašytų bandymo metodikų ir visa kita reikalinga informacija.

 

3 NUORODOS

1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N. 1,151 – 165 p. March 1993.

2) Gough, H. J., McIndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 – 1992. Journal of Apicultural Research 22, 119 – 125 p.

3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose – effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96,99 – 113 p.

4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18,265-267 p.

 

ADSORBCIJA IR DESORBCIJA TAIKANT ĮKROVOS PUSIAUSVYROS METODĄ (C.18.)

 

1 METODAS

Šis metodas yra OECD (Organization for Economic Cooperation and Development – Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos) TG (Test Guidlines – Bandymų rekomendacijų) 106 dėl dirvožemio adsorbcijos ir desorbcijos, taikant įkrovos pusiausvyros metodą, kopija (2000).

 

1.1 ĮVADAS

Metodas atsižvelgia į tarplaboratorinio palyginimo bandymą ir į seminaro apie dirvožemio atranką, tobulinant adsorbcijos metodą, medžiagą (1) (2) (3) (4), taip pat į nacionaliniu lygiu taikomas rekomendacijas (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).

Adsorbcijos ir desorbcijos tyrimai yra naudingi kaupiant svarbią informaciją apie cheminių medžiagų judrumą ir jų pasiskirstymą biosferos dirvožemio, vandens ir oro sudedamosiose dalyse (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Informacija gali būti naudojama numatant ar įvertinant, pvz., kaip cheminės medžiagos gali būti skaidomos (22) (23), kaip jas keičia ir įsisavina organizmai (24); kaip jos išplaunamos per dirvos sluoksnius (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28); koks jų lakumas nuo dirvožemio paviršiaus (21) (29) (30); koks nuotėkis nuo žemės paviršiaus į natūraliuosius vandenis (18) (31) (32). Adsorbcijos duomenys gali būti naudojami palyginant ir modeliuojant (19) (33) (34) (35).

Cheminės medžiagos pasiskirstymas dirvožemyje ir vandeninėse fazėse yra sudėtingas procesas, kuris priklauso nuo daugelio skirtingų veiksnių: medžiagos cheminės prigimties (12) (36) (37) (38) (39) (40), dirvožemio savybių (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) ir klimato veiksnių, pvz., lietaus, temperatūros, saulės šviesos ir vėjo. Taigi daugybės reiškinių ir mechanizmų, kurie dirvožemyje dalyvauja cheminių medžiagų adsorbcijos procese, negali visiškai išaiškinti toks supaprastintas laboratorinis modelis, kaip čia pateiktas metodas. Tačiau, nors šis bandymas negali apimti visų galimų aplinkoje atvejų, jis suteikia vertingos informacijos apie cheminės medžiagos adsorbcijos svarbą aplinkai.

 

1.2 TAIKYMO SRITIS

Metodu siekiama įvertinti, kaip medžiagos dirvožemiuose adsorbuojamos ir desorbuojamos. Tikslas yra gauti sorbcijos vertę, kuri galėtų būti naudojama prognozuojant pasiskirstymą, esant įvairioms aplinkos sąlygoms; cheminių medžiagų adsorbcijos pusiausvyros koeficientai nustatomi kaip dirvožemio savybių (pvz., organinės anglies kiekio, molio kiekio, dirvožemio tekstūros bei pH) funkcija. Turi būti naudojami įvairūs dirvožemio tipai, kad būtų galima kiek įmanoma plačiau aptarti konkrečios medžiagos sąveiką su natūraliai esančiais dirvožemiais.

Šiame metode adsorbcija yra cheminės medžiagos susijungimo su dirvožemio paviršiumi procesas; metodas neskiria skirtingų adsorbcijos procesų (fizinės ir cheminės adsorbcijos) ir kitų procesų, pvz., paviršiaus katalizuojamo skaidymo, tūrio adsorbcijos ar cheminės reakcijos. Neatsižvelgiama į adsorbciją, kuri vyksta ant dirvožemyje susidarančių koloidinių dalelių (skersmuo < 0,2 μm).

Adsorbcijai svarbiausi dirvožemio parametrai yra: organinės anglies kiekis (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) (45) (46) (47) (48), molio kiekis, dirvožemio tekstūra (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) ir, jei tai jonizuojami junginiai, pH vertė (3) (4) (42). Kiti dirvožemio parametrai, kurie galėtų veikti konkrečios medžiagos adsorbciją ir desorbciją, yra efektyvioji katijonų mainų talpa (EKMT), amorfinių geležies ir aliuminio oksidų kiekis, ypač vulkaninės kilmės ir tropikų dirvožemių atvejais (4), taip pat savitasis paviršius (49).

Bandymas skirtas įvertinti cheminės medžiagos adsorbciją į skirtingus dirvožemio tipus su kintamu organinės anglies kiekiu, molio kiekiu ir dirvožemio struktūra bei įvertinti pH. Jį sudaro trys etapai:

1 etapas: Parengiamasis tyrimas, siekiant nustatyti:

- dirvožemio ir tirpalo santykį,

- adsorbcijos pusiausvyros nusistovėjimo trukmę ir pusiausvyros sąlygomis adsorbuotos medžiagos kiekį,

- medžiagos adsorbciją ant bandymų indų paviršių ir bandomosios medžiagos stabilumą bandymo laikotarpiu.

2 etapas: Atrankos bandymas – tiriama penkių skirtingų tipų dirvožemio adsorbcija, matuojant adsorbcijos kinetiką, esant vienai koncentracijai ir nustatant pasiskirstymo koeficientus Kd ir Koc.

3 etapas: Freundlicho adsorbcijos izotermių apskaičiavimas, norint nustatyti koncentracijos įtaką adsorbcijos dirvožemiu laipsniui. Desorbcijos tyrimas, taikant desorbcijos kinetiką ir Freundlicho desorbcijos izotermes (1 priedas).

 

1.3 APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI

 

Simbolis

Apibrėžimas

Vienetai

Ati

adsorbcijos procentinė dalis laiko momentu t

%

Aeq

adsorbcijos procentinė dalis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis

%

msads (ti)

bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu laiko momentu ti, masė

μg

msads (Δti)

bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu per laiką Ati, masė

μg

msads (eq)

bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis, masė

μg

m0

adsorbcijos bandymo pradžioje mėgintuvėlyje esančios bandomosios medžiagos masė

μg

mmads (ti)

bandomosios medžiagos masė, išmatuota tirpalo alikvotinėje dalyje (VAa ) laiku ti

μg

maqads (eq)

medžiagos tirpale masė adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis

μg

msoil

dirvožemio fazės kiekis, išreikštas sauso dirvožemio mase

g

cst

medžiagos pradinio tirpalo masės koncentracija

μg x cm-3

c0

sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomojo tirpalo pradinė masės koncentracija

μg x cm-3

Caqads (ti)

medžiagos vandeninės fazės masės koncentracija laiko momentu t, kai buvo daroma analizė

μg x cm-3

Csads (eq)

dirvožemiu adsorbuotos medžiagos kiekis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis

μg x g-1

Caqads (eq)

medžiagos vandeninės fazės masės koncentracija adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis

μg x cm-3

v0

sąlytyje su dirvožemiu esančios vandeninės fazės pradinis tūris atliekant adsorbcijos bandymą

cm3

VAa

alikvotinės tirpalo dalies, kurioje išmatuota bandomoji medžiaga, tūris

cm3

Kd

adsorbcijos pasiskirstymo koeficientas

cm3 x g-1

Koc

adsorbcijos koeficientas normalizuotas pagal organinę anglį

cm3 x g-1

Kom

pasiskirstymo koeficientas normalizuotas pagal organinę medžiagą

cm3 x g-1

KFads

Freundlicho adsorbcijos koeficientas

μg1-1/n x (cm3)1/n x g-1

1/n

Freundlicho lygties laipsnio rodiklis

 

Dti

desorbcijos procentinė dalis laiku t

%

DΔti

desorbcijos procentinė dalis, atitinkanti laiko intervalą Ati

%

Kdes

tariamasis desorbcijos koeficientas

cm3 x g-1

KFdes

Freundlicho desorbcijos koeficientas

μg1-1/n x (cm3)1/n x g-1

maqdes (ti)

bandomosios medžiagos, desorbuotos nuo dirvožemio laiku t, masė

μg

maqdes (Δti)

bandomosios medžiagos, desorbuotos nuo dirvožemio per laiko tarpą Ati, masė

μg

mmdes (eq)

medžiagos, analiziškai nustatytos vandeninėje fazėje desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, masė

μg

maqdes (eq)

bandomosios medžiagos, desorbuotos desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, bendroji masė

μg

msdes (Δti)

medžiagos, kuri liko adsorbuota dirvožemiu praėjus laiko tarpui Ati, masė

μg

mAaq

medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl ne visiško tūrio pakeitimo, masė

μg

Csdes (eq)

bandomosios medžiagos, kuri liko adsorbuota dirvožemiu desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, kiekis

μg x g-1

Caqdes (eq)

bandomosios medžiagos vandeninėje fazėje masės koncentracija desorbcijos pusiausvyros sąlygomis

μg x cm-3

VT

vandeninės fazės, esančios sąlytyje su dirvožemiu, atliekant desorbcijos kinetikos bandymą nuosekliuoju metodu, bendras tūris

cm3

VR

tirpalo virš nuosėdų, pašalinto iš mėgintuvėlio pasiekus adsorbcij os pusiausvyrą ir pakeisto tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo, tūris

cm3

VDa

tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti atliekant desorbcijos kinetikos bandymą nuosekliuoju metodu, alikvotinės dalies tūris

cm3

Vir

tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti atliekant desorbcijos kinetikos bandymą (lygiagretusis metodas), tūris

cm3

VFr

tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, tūris

cm3

MB

masių balansas

%

mE

bandomosios medžiagos, dviem etapais ekstrahuotos iš dirvožemio ir nuo sienelių, bendroji masė

μg

Vrec

adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis regeneruoto tirpalo virš nuosėdų tūris

cm3

Pow

pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas

 

pKa

disociacijos konstanta

 

Sw

tirpumas vandenyje

g x 1-1

 

1.4 BANDYMŲ METODO ESMĖ

Žinomi bandomosios medžiagos, neturinčios ar turinčios žymėtųjų atomų, tirpalo 0,01 M CaCl2 tūriai yra sumaišomi su žinomos sauso dirvožemio masės bandiniais, prieš tai laikytais 0,01 M CaCl2, kad nusistovėtų pusiausvyra. Mišinys tam tikrą laiką maišomas. Paskui dirvožemio suspensija atskiriama centrifugavimu ir, jei to pageidaujama, filtravimu, o vandeninė fazė analizuojama. Dirvožemio bandiniu adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis apskaičiuojamas kaip skirtumas tarp pradinio bandomosios medžiagos kiekio tirpale ir jos kiekio bandymo pabaigoje (netiesioginis metodas).

Pagal kitą metodą atliekama dirvožemio analizė ir tiesiogiai nustatomas adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis (tiesioginis metodas). Šis metodas, kurį sudaro dirvožemio ekstrahavimas tam tikrais etapais atitinkamu tirpikliu, rekomenduojamas tais atvejais, kai negalima tiksliai nustatyti bandomosios medžiagos tirpalo koncentracijos skirtumo. Tokių atvejų pavyzdžiai yra: bandomosios medžiagos adsorbcija ant bandymų indų paviršiaus; bandomosios medžiagos nestabilumas atliekant bandymą; silpna adsorbcija, todėl tirpalo koncentracijos pokytis yra labai mažas; stipri adsorbcija, todėl tirpalo koncentracija labai sumažėja ir negali būti tiksliai nustatyta. Naudojant medžiagą su radioaktyviąja žymena, dirvožemio galima ir neekstrahuoti, jei dirvožemio fazės analizei taikomas sudeginimo ir skysčių scintiliacijos skaičiavimo metodas. Skysčių scintiliacijos skaičiavimas yra ne specifinis metodas ir juo negalima atskirti pradinių produktų nuo jų kitimo produktų; taigi jis turi būti taikomas tik tokiu atveju, jei cheminė medžiaga yra stabili atliekant tyrimą.

 

1.5 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ

Cheminiai reagentai turi būti analiziškai gryni. Rekomenduojama naudoti bent 95 % grynumo žinomos sudėties radioaktyviųjų žymenų neturinčias bandomąsias medžiagas ar žinomos sudėties radioaktyviai grynas medžiagas su radioaktyviąja žymena. Jei radioaktyviųjų izotopų pusamžis yra trumpas, turi būti taikomos skilimo pataisos.

Prieš atliekant adsorbcijos ir desorbcijos bandymą, apie bandomąją medžiagą turi būti žinoma ši informacija:

a) tirpumas vandenyje (A.6 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais);

b) garų slėgis (A.4 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais) ir (ar) Henry'o dėsnio konstanta;

c) abiotinis skaidymas: hidrolizė, kaip pH funkcija (Žin., 2002, Nr. 81 – 3493, „Skaidymas – abiotinio hidrolizinio skaidymo kaip pH funkcijos nustatymas“);

d) pasiskirstymo koeficientas (A.8 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais);

e) lengvas biologinis skaidomumas (Žin., 2002, Nr. 81 – 3493, „Lengvo biologinio skaidomumo nustatymas“) ar aerobinis ir anaerobinis kitimas dirvožemyje;

f) jonizuojamų medžiagų pKa,

g) tiesioginė fotolizė vandenyje (t.y. vandeninio tirpalo UV-VIS absorbcijos spektras, kvantinė išeiga) ir fotocheminis skaidymas ant dirvožemio.

 

1.6 BANDYMO TAIKOMUMAS

Bandymas tinka cheminėms medžiagoms, kurioms nustatyti yra turimas pakankamo tikslumo analizės metodas. Svarbus parametras yra bandomosios medžiagos stabilumas atliekant bandymą, kuris gali turėti įtakos rezultatų patikimumui, ypač taikant netiesioginį metodą. Taigi atliekant parengiamąjį tyrimą, būtina tikrinti stabilumą; jei atliekant bandymą stebimas medžiagos kitimas, atliekant pagrindinį tyrimą – rekomenduojama analizuoti dirvožemio ir vandeninę fazes.

Gali kilti sunkumų, atliekant bandymą su bandomosiomis medžiagomis, kurių tirpumas vandenyje yra mažas (Sw < 10-4 g x1-1), taip pat esant dideliam bandomųjų medžiagų kiekiui, nes medžiagos koncentracija vandeninėje fazėje negali būti analiziškai nustatyta pakankamai tiksliai. Šiais atvejais būtina imtis papildomų priemonių. Nurodymai, kaip spręsti šias problemas, pateikti atitinkamuose šio metodo aprašymo poskyriuose.

Bandant lakiąsias medžiagas, reikia imtis atsargumo priemonių per bandymą išvengti nuostolių.

 

1.7 METODO APRAŠYMAS

1.7.1 Aparatūra ir cheminiai reagentai

Reikalinga ši standartinė laboratorinė įranga:

a) mėgintuvėliai ar indai bandymams atlikti. Svarbu, kad šie mėgintuvėliai ar indai:

- būtų pritaikyti centrifugavimo aparatui, norint sumažinti manipuliavimo ir pernešimo paklaidas,

- būtų pagaminti iš inertinės medžiagos, kurios paviršiuje bandomosios medžiagos adsorbcija būtų kuo mažesnė.

b) maišymo įtaisas: vartomoji maišyklė ar lygiavertė įranga; maišant maišymo įtaisu dirvožemis turi būti palaikomas suspensijos būsenoje,

c) centrifuga: pirmenybė teikiama didelio apsukų dažnio centrifugoms, pvz., centrifugavimo jėga > 3000 g, termostatuojama, iš vandeninio tirpalo galinti pašalinti daleles, kurių skersmuo didesnis kaip 0,2 μm. Maišant ir centrifuguojant mėgintuvėliai turi būti uždaryti dangteliais, kad būtų išvengta nuostolių dėl medžiagų lakumo ir vandens nugaravimo; adsorbcijai ant dangtelių sumažinti turi būti naudojami dezaktyvuoti dangčiai, pvz., užsukami, politetrafluoretileno plėvele iškloti dangteliai,

d) neprivalomas: filtravimo įtaisas; filtrų poringumas – 0,2 μm, sterilūs, vienkartiniai. Ypatingą dėmesį reikia kreipti parenkant filtro medžiagą, kad būtų išvengta bet kokių bandomosios medžiagos nuostolių ant filtro; mažai tirpioms medžiagoms nerekomenduojama naudoti filtrų iš organinės medžiagos,

e) analizės aparatūra, tinkama bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai nustatyti,

f) laboratorinė krosnis, palaikyti 103 °C – 110 °C temperatūrą.

 

1.7.2 Dirvožemio tipo apibūdinimas ir parinkimas

Dirvožemio tipą turėtų apibūdinti trys parametrai, kurie daro didžiausią įtaką adsorbcijos gebai: organinė anglis, molio kiekis ir dirvožemio tekstūra bei pH. Kaip minėta (žr. poskyrį „Taikymo sritis“), konkrečios medžiagos adsorbcijai ir desorbcijai gali turėti įtakos kitos fizinės ir cheminės dirvožemio savybės, o tokiais atvejais į jas turi būti atsižvelgta.

Metodai, taikyti dirvožemiui apibūdinti, yra labai svarbūs ir gali turėti didelės įtakos rezultatams. Taigi atitinkamu ISO metodu (ISO-10390-1) rekomenduojama išmatuoti dirvožemio 0,01 M CaCl2 tirpale (t. y. tirpale, naudojamame adsorbcijos ir desorbcijos bandymuose) pH vertę. Taip pat rekomenduojama, kad standartiniais metodais (pvz., ISO, „Handbook of Soil Analysis“) būtų nustatytos kitos reikalingos dirvožemio savybės; tai leidžia sorbcijos duomenis analizuoti pagal visam pasauliui standartizuotus dirvožemio parametrus. Kai kurie duomenys apie esamus standartinius dirvožemio analizės ir apibūdinimo metodus pateikti nuorodose (50 – 52). Dirvožemio bandymų metodams kalibruoti rekomenduojama naudoti etaloninius dirvožemius.

Nurodymai, kaip parinkti dirvožemius adsorbcijos ir desorbcijos bandymams, pateikti 1 lentelėje. Parinkti septyni dirvožemio tipai apima vidutinėse geografinėse zonose pasitaikančius dirvožemio tipus. Jei bandomosios medžiagos yra joninės, parinkti dirvožemio tipai turi apimti platų pH verčių diapazoną, kad būtų galima įvertinti jonizuotos ir nejonizuotos medžiagos adsorbciją. Nurodymai, kiek skirtingų dirvožemio tipų naudoti įvairiuose bandymo etapuose, pateikti 1.9 poskyryje „Bandymo eiga“.

Jei tinkamesnis kitų tipų dirvožemis, jis turi būti apibūdintas tais pačiais parametrais ir jo savybės turi įvairuoti panašiai kaip 1 lentelėje aprašytos savybės, net jei tiksliai kriterijų ir neatitinka.

 

1 lentelė. Nurodymai, kaip parinkti dirvožemio bandinius adsorbcijos ir desorbcijos bandymams

Dirvožemio tipas

pH diapazonas (0,01 M CaCl2)

Organinės anglies kiekis, %

Molio kiekis, %

Dirvožemio tekstūra1

1

4,5-5,5

1,0-2,0

65-80

Molis

2

>7,5

3,5 – 5,0

20-40

sunkus priemolis

3

5,5 – 7,0

1,5-3,0

15-25

rudasis priemolis

4

4,0-5,5

3,0-4,0

15-30

priemolis

5

<4,0-6,02

<0,5-l,52'3

<10-152

priemolio smėlis

6

>7,0

< 0,5-1,02'3

40-65

sunkus priemolis ar molis

7

<4,5

>10

<10

smėlis ar priemolio smėlis

 

1 Pagal FAO (Food and Agricultural Organisation – Maisto ir žemės ūkio organizacija) ir JAV sistemą (85).

2 Būtų geriau, jei atitinkamų kintamųjų vertės būtų nurodytame diapazone. Tačiau, jei kyla sunkumų rasti tinkamą dirvožemį, priimtinos mažesnės negu nurodytos mažiausios vertės.

3 Dirvožemis, kuriame organinės anglies yra mažiau kaip 0,3 %, gali sugriauti naudoti dirvožemį kuriame organinės anglies būtų ne mažiau kaip 0,3 %.

 

1.7.3 Dirvožemio bandinių rinkimas ir laikymas

1.7.3.1. Rinkimas

Nėra rekomenduojami kokie nors specifiniai bandinių ėmimo metodai ar priemonės; bandinių ėmimo metodas priklauso nuo tyrimo tikslo (53) (54) (55) (56) (57) (58).

Reikia atsižvelgti į šiuos dalykus:

a) būtina turėti išsamią informaciją apie lauko sklypą; reikia atsižvelgti į vietą, augmenijos dangą, apdorojimą pesticidais ir (ar) trąšomis, biologinius priedus ar atsitiktinį užteršimą. Reikia laikytis dirvožemio bandinių ėmimo ISO standarto (ISO 10381-6) rekomendacijų, atsižvelgiant į bandinio ėmimo vietos aprašymą;

b) bandinių ėmimo vieta turi būti apibrėžta UTM (Universal Transversal Mercator-Projection/European Horizontal Datum — Universalioji skersinė Merkatoriaus projekcija arba Europos horizontalusis atskaitos lygis) ar geografinių koordinačių; tai leistų ateityje vėl paimti konkretaus dirvožemio ar padėtų apibūdinti dirvožemį pagal įvairias klasifikavimo sistemas, taikomas skirtingose šalyse. Be to, reikia rinkti tik A horizonte, ne giliau kaip 20 cm. Jei konkrečiai 7 tipo dirvožemio dalį sudaro Oh horizontas, jis turi būti įtrauktas į bandinį.

Dirvožemio bandiniai turi būti gabenami konteineriuose, esant tokiai temperatūrai, kuri garantuotų pradines dirvožemio savybes ir jų labai nepakeistų.

1.7.3.2. Laikymas

Geriau naudoti ką tik iš lauko paimtą dirvožemį. Jei tai neįmanoma, išdžiovintas ore dirvožemis gali būti laikomas kambario temperatūros sąlygomis. Rekomendacijų apie laikymo trukmės ribas nepateikiama, tačiau daugiau kaip trejus metus laikytas dirvožemis prieš naudojant turi būti vėl analizuojamas, kad būtų nustatytas organinės anglies kiekis, pH ir katijonų mainų talpa (KMT).

1.7.3.3. Dirvožemio bandinių apdorojimas ir paruošimas bandymui

Dirvožemis džiovinamas ore kambario temperatūros sąlygomis, geriau 20 — 25 °C. Smulkinti reikia kuo mažesne jėga, kad pradinė dirvožemio sandara pasikeistų kuo mažiau. Dirvožemis sijojamas, kol lieka 2 mm dydžio ir smulkesnės dalelės; sijoj ant reikėtų laikytis ISO standarto dirvožemio bandinių ėmimo rekomendacijų (ISO 10381-6). Rekomenduojama dirvožemį kruopščiai homogenizuoti, nes tai pagerina rezultatų atkuriamumą. Kiekvieno dirvožemio bandinio drėgmės kiekis nustatomas tris alikvotines dalis kaitinant 105 °C temperatūroje tol, kol masė daugiau nesikeičia (maždaug 12 h). Visiems skaičiavimams nurodoma krosnyje išdžiovinto dirvožemio masė, t. y. dirvožemio, atėmus drėgmės kiekį, masė.

 

1.7.4 Bandomosios medžiagos paruošimas maišymui su dirvožemiu

Bandomoji medžiaga ištirpinama 0,01 M CaCl2 tirpale, kuriam paruošti naudojamas distiliuotas ar dejonizuotas vanduo; CaCl2 tirpalas yra naudojamas kaip vandeninis tirpiklis centrifugavimui palengvinti ir katijonų mainams, kiek įmanoma, sumažinti. Pradinio tirpalo koncentracija turėtų būti trimis dydžio eilėmis didesnė už analizės metodo aptikimo ribą. Ši riba garantuoja tikslius matavimus, taikant šį metodą; be to, pradinio tirpalo koncentracija turėtų būti mažesnė už bandomosios medžiagos tirpumo vandenyje vertę.

Pradinį tirpalą geriau ruošti prieš pat maišymą su dirvožemio bandiniais. Paruoštas tirpalas turi būti uždengtas ir laikomas tamsoje, esant 4 °C temperatūrai. Laikymo trukmė priklauso nuo bandomosios medžiagos stabilumo ir nuo tirpalo koncentracijos.

Mažai tirpioms medžiagoms (Sw < 10-4 g x 1-1), kai bandomąją medžiagą sunku ištirpinti, gali būti reikalingas atitinkamas soliubilizavimo agentas. Šis soliubilizavimo agentas: a) turi maišytis su vandeniu, pvz., metanolis ar acetonitrilas; b) jo koncentracija neturi būti didesnė kaip 1 % bendrojo pradinio tirpalo tūrio ir turi būti mažesnė nei sąlytyje su dirvožemiu esančios bandomosios medžiagos koncentracija (geriau, jei mažesnė kaip 0,1 %); c) neturi būti paviršiaus aktyvioji medžiaga arba dalyvauti solvolizės reakcijoje su bandomąja medžiaga. Duomenų ataskaitoje turi būti nurodytas ir pagrįstas tokio soliubilizavimo agento naudojimas.

Kitas mažai tirpioms medžiagoms taikomas būdas yra pridėti bandomosios medžiagos į bandymo sistemą, naudojant pagalbinį tirpiklį: bandomoji medžiaga ištirpinama organiniame tirpiklyje, alikvotinė šio tirpalo dalis pridedama į dirvožemio ir 0,01 M CaCl2 tirpalo distiliuotame ar dejonizuotame vandenyje sistemą. Organinio tirpiklio kiekis vandeninėje fazėje turi būti kuo mažesnis, dažniausiai ne didesnis kaip 0,1 %. Medžiagos pridėjimas, naudojant tirpalą organiniame tirpiklyje, gali pabloginti tūrio atkuriamumą. Taigi gali atsirasti papildoma paklaida, nes bandomosios medžiagos ir pagalbinio tirpiklio koncentracija visuose bandymuose gali būti nevienoda.

 

1.8 ADSORBCIJOS IR DESORBCIJOS BANDYMO BŪTINOSIOS SĄLYGOS

1.8.1 Analizės metodas

Pagrindiniai parametrai, galintys turėti įtakos sorbcijos matavimams, yra tirpalui ir adsorbuotoms fezėms analizuoti taikomo analizės metodo tikslumas, bandomosios medžiagos stabilumas ir grynumas, sorbcijos pusiausvyros pasiekimas, tirpalo koncentracijos pokyčio dydis, dirvožemio ir tirpalo santykis, dirvožemio struktūros pokyčiai, nusistovint pusiausvyrai (35) (59 – 62). Keletas pavyzdžių, susijusių su tikslumo problemomis, pateikta 2 priede.

Taikomo analizės metodo patikimumas turi būti patikrintas pagal koncentracijų diapazoną, kuris greičiausiai bus taikomas atliekant bandymą. Bandytojas gali laisvai tobulinti atitinkamą metodą, turintį reikiamą tikslumą, atkuriamumą, aptikimo ribas ir atgavimo lygį. Toliau pateikti nurodymai, kaip tokį bandymą atlikti.

Atitinkamas 0,01 M CaCl2 tirpalo tūris, pvz., 100 cm3, 4 h maišomas su tam tikra labai adsorbuojančio, t. y. turinčio didelį organinės anglies ir molio kiekį, dirvožemio mase, pvz., 20 g; ši masė ir tūris gali skirtis priklausomai nuo analizės poreikių, tačiau dirvožemio ir tirpalo santykis – 1:5 yra patogus pradžios taškas. Mišinys centrifuguojamas ir vandeninė jo fazė gali būti filtruojama. Į vandeninę fazę įpilamas tam tikras tūris bandomosios medžiagos pradinio tirpalo, kad būtų pasiekta vardinė koncentracija koncentracijų diapazone, kuris bus numatomas atliekant bandymą. Šis tūris turi sudaryti ne daugiau kaip 10 % galutinio vandeninės fazės tūrio, kad kuo mažiau pasikeistų pradiniam pusiausvyros nusistovėjimui paimto tirpalo savybės. Tirpalas analizuojamas.

Norint patikrinti analizės metodo artefaktus ir dėl dirvožemio atsiradusius matricos efektus, turi būti įtrauktas vienas tuščias bandymas, kurį sudaro sistema iš dirvožemio + CaCl2 tirpalo (be bandomosios medžiagos).

Analizės metodus, kurie gali būti taikomi sorbcijai matuoti, sudaro dujų ir skysčių chromatografija (Gas-Liquid Chromatography, GLC), didelio efektyvumo skysčių chromatografija (high-performance liąuid chromatography, HPLC), spektrometrija (pvz., GC/masių spektrometrija, HPLC/masių spektrometrija) ir skysčių scintiliacijos skaičiavimas (medžiagų su radioaktyviąja žymena). Nepriklausomai nuo analizės metodo, patenkinamu laikomas aptikimo lygis, kuris sudaro 90 % — 110 % vardinės vertės. Norint medžiagą aptikti ir įvertinti po įvykdyto atskyrimo, analizės metodo aptikimo riba turi būti bent dviem dydžio eilėmis mažesnė už vardinę koncentraciją.

Adsorbcijos tyrimams taikomo analizės metodo savybės ir aptikimo riba yra labai svarbios, apibrėžiant bandymo sąlygas ir bendrą bandymo veiksmingumą. Šis metodas pateikia bendrąją bandymo eigą ir numato rekomendacijas alternatyviems sprendimams ten, kur galimybes gali riboti analizės metodas ir laboratorijos įranga.

 

1.8.2 Optimalaus dirvožemio ir tirpalo santykio parinkimas

Tinkamo dirvožemio ir tirpalo santykio parinkimas sorbcijos tyrimams priklauso nuo pasiskirstymo koeficiento Kd ir nuo pageidaujamo santykinio adsorbcijos laipsnio. Matavimo, pagrįsto adsorbcijos lygties forma ir analizės metodo riba, statistinį tikslumą, nustatant medžiagos tirpalo koncentraciją, lemia šios koncentracijos pokytis. Taigi naudinga pasirinkti kelias pastovias santykio vertes, kurioms adsorbuotos medžiagos procentinė dalis yra didesnė negu 20 %, geriau didesnė negu 50 % (62), ir pasirūpinti, kad bandomosios medžiagos tirpalo koncentracija būtų palaikoma tokia, kad ją būtų galima tiksliai nustatyti. Tai ypač svarbu, kai yra didelė adsorbcijos procentinė dalis.

Patogus būdas parinkti tinkamą dirvožemio ir vandens santykį, pagrįstą Kd vertės įverčiu, atliekant išankstinius tyrimus arba taikant sukurtus vertinimo metodus (3 priedas). Tinkamą santykį galima pasirinkti pagal dirvožemio ir tirpalo santykio bei nustatytos adsorbcijos procentinės dalies Kd grafiką (1 pav.). Šiam grafikui nubrėžti daroma prielaida, kad adsorbcijos lygtis yra tiesiška (3)13. Tinkamas sąryšis gaunamas Kd 4 lygtį pertvarkant į 1 lygtį:

ar į jos logaritminę išraišką, darant prielaidą, kad,

Pasiskirstymo koeficientas Kd (cm3 x g-1)

 

1 pav. Dirvos ir tirpalo santykio, ir Kd sąryšis, esant įvairioms adsorbuotos medžiagos procentinėms dalims

1 pav. Reikiamas dirvožemio ir tirpalo santykis pateiktas kaip Kd funkcija esant įvairiems adsorbcijos lygiams. Pvz., jei dirvožemio ir tirpalo santykis yra 1:5, ir Kd 20, adsorbcijos laipsnis maždaug 80 %. 50% adsorbcijai gauti, esant tam pačiam Kd, turi būti taikomas santykis 1:25. Šis tinkamo dirvožemio ir tirpalo santykio pasirinkimo būdas leidžia bandytojui lanksčiai prisitaikyti prie bandymo sąlygų.

Sunkiau yra panaudoti tas sritis, kuriose medžiaga adsorbuojama labai stipriai arba labai silpnai. Jei adsorbcija vyksta silpnai, rekomenduojamas 1:1 dirvožemio ir tirpalo santykis, nors kai kuriems dirvožemiams su dideliu organinės medžiagos kiekiu šį santykį būtina padidinti norint gauti suspensiją. Reikia pasirūpinti analizės metodu mažiems tirpalo koncentracijos pokyčiams matuoti, kitaip adsorbcijos matavimas bus netikslus. Kita vertus, esant labai dideliems pasiskirstymo koeficientams Kd, dirvožemio ir tirpalo santykį galima mažinti iki 1:100, kad cheminės medžiagos tirpale liktų daug. Reikia užtikrinti gerą sumaišymą ir būtina duoti pakankamai laiko sistemai pasiekti pusiausvyrą. Alternatyvus šių ribinių atvejų naudojimo būdas, kai nėra tinkamo analizės metodo, yra Kd vertės prognozė, taikant vertinimo metodikas, pagrįstas, pvz., Pow vertėmis (3priedas). Tai gali būti naudinga ypač silpnai adsorbuojamoms ar polinėms medžiagoms, kurių Pow < 20, ir lipofilinėms ar stipriai sorbuojamoms cheminėms medžiagoms, kurių Pow > 104.

 

1.9 BANDYMŲ EIGA

1.9.1 Bandymų sąlygos

Visi bandymai atliekami aplinkos temperatūros ir, jei įmanoma, pastovios temperatūros nuo 20 °C iki 25 °C sąlygomis.

Centrifugavimo sąlygos turi būti tokios, kad būtų galima pašalinti iš tirpalo didesnes kaip 0,2 μm daleles. Ši vertė atitinka mažiausią dydį iki kurio dalelė dar laikoma kietąja dalele, ir tai yra riba tarp kietųjų ir koloidinių dalelių. Kaip nustatyti centrifugavimo sąlygas, nurodyta 4 priede.

Jei negalima garantuoti, kad centrifugavimo priemonės pašalins didesnes kaip 0,2 μm daleles, būtų galima taikyti centrifugavimo ir filtravimo pro 0,2 μm filtrus derinį. Norint išvengti ant filtrų bet kokių bandomosios medžiagos nuostolių, indai turi būti pagaminti iš tinkamos inertinės medžiagos. Bet kuriuo atveju turi būti įrodyta, kad filtruojant nepatiriama jokių bandomosios medžiagos nuostolių.

 

1.9.2.1 etapas. Parengiamasis tyrimas

Pradinio tyrimo vykdymo tikslas jau buvo nurodytas poskyryje „Taikymo sritis“. Toliau pateikiamos rekomendacijos, kaip atlikti tokį bandymą.

1.9.2.1. Optimalaus dirvožemio ir tirpalo santykio verčių parinkimas

Naudojami du dirvožemio tipai ir trys dirvožemio ir tirpalo santykio vertės (šeši bandymai). Vieno tipo dirvožemyje yra didelis organinės anglies ir mažas molio kiekis, kito tipo dirvožemyje — mažas organinės anglies ir didelis molio kiekis. Siūloma naudoti tokius dirvožemio ir tirpalo santykius:

- 50 g dirvožemio ir 50 cm3 bandomosios medžiagos vandeninio tirpalo (santykis 1/1),

- 10 g dirvožemio ir 50 cm3 bandomosios medžiagos vandeninio tirpalo (santykis 1/5),

- 2 g dirvožemio ir 50 cm3 bandomosios medžiagos vandeninio tirpalo (santykis 1/25).

Mažiausias dirvožemio kiekis, su kuriuo gali būti atliekamas bandymas, priklauso nuo laboratorijos įrangos ir taikomų analizės metodų. Tačiau, norint gauti patikimus bandymo rezultatus, rekomenduojama naudoti nemažiau kaip 1 g, o geriau 2 g dirvožemio.

Bandomosios medžiagos stabilumui CaCl2 tirpale ir jos galimai adsorbcijai ant bandymų indų paviršių patikrinti – vienas kontrolinis bandinys, kurį sudaro 0,01 M CaCl2 tirpale ištirpinta bandomoji medžiaga (be dirvožemio), pereina tiksliai tuos pačius etapus kaip ir bandomosios sistemos.

Tuščiasis bandymas kiekvienam dirvožemiui su tuo pačiu dirvožemio kiekiu ir bendru 50 cm3 0,01 M CaCl2 tirpalo tūriu (be bandomosios medžiagos) atliekamas pagal tą pačią bandymo metodiką. Atliekant analizę, šis bandymas yra fono kontrolės priemonė, norint aptikti trukdančių medžiagų ar užterštų dirvožemių.

Visi bandymai, įskaitant kontrolinius ir tuščiuosius, turi būti atliekami mažiausiai po du kartus. Bendras tyrimui paruoštų bandinių skaičius gali būti apskaičiuotas atsižvelgiant į taikomą metodą.

Parengiamojo tyrimo ir pagrindinio tyrimo metodai dažniausiai yra tie patys, būtinos išimtys yra nurodomos.

Norint pasiekti pusiausvyrą ore, išdžiovinti dirvožemio bandiniai sumaišomi su ne mažesnio kaip 45 cm3 tūrio 0,01 M CaCl2 tirpalu ir mišinys maišomas per naktį (12 h) prieš bandymo atlikimo dieną. Vėliau įpilamas tam tikras tūris bandomosios medžiagos pradinio tirpalo taip, kad būtų gautas galutinis 50 cm3 tūris. Šis įpilamo pradinio tirpalo tūris: a) neturi sudaryti daugiau kaip 10 % galutinio 50 cm3 vandeninės fazės tūrio, kad kuo mažiau pasikeistų pradinei pusiausvyrai nusistovėti naudoto tirpalo savybės; b) būtų toks, kad sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomosios medžiagos pradinio tirpalo koncentracija (C0>) būtų bent dviem dydžio eilėmis didesnė negu analizės metodo aptikimo ribos vertė; šis ribinis dydis leidžia daryti tikslius matavimus, esant didelio laipsnio adsorbcijai (> 90%) ir vėliau apskaičiuoti adsorbcijos izotermes. Be to, rekomenduojama, kad pradinė medžiagos koncentracija (C0>), jei tai įmanoma, būtų ne didesnė kaip pusė tirpumo vertės.

Toliau pateikiamas pavyzdys, kaip apskaičiuoti pradinio tirpalo koncentraciją (Cst). Tarkime, kad aptikimo riba yra 0,01 μg x cm-3 ir adsorbcijos laipsnis 90 %; taigi sąlytyje su dirvožemiu esančios bandomosios medžiagos pradinė koncentracija turi būti 1 μg x cm-3 (dviem dydžio eilėmis didesnė kaip aptikimo ribos vertė). Darant prielaidą, kad įpilamo pradinio tirpalo tūris yra didžiausias, koks buvo rekomenduotas, t. y. 5 cm3 į 45 cm3 0,01 M CaCl2 pusiausvyros nusistovėjimo tirpalo (pradinis tirpalas sudaro 10 % 50 cm3 bendrojo vandeninės fazės tūrio), pradinio tirpalo koncentracija turi būti 10 μg x cm-3; ji yra trimis dydžio eilėmis didesnė už analizės metodo aptikimo ribinę vertę.

Vandeninės fazės pH vertė turi būti matuojama prieš sąlytį su dirvožemiu ir po jo, kadangi ji visą adsorbcijos procesą yra svarbi, ypač jei tai jonizuojamosios medžiagos.

Mišinys maišomas tol, kol pasiekiama adsorbcijos pusiausvyra. Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė dirvožemiams yra labai nevienoda, atsižvelgiant į cheminę medžiagą ir dirvožemį; dažniausiai pakanka 24 h (77). Atliekant parengiamąjį tyrimą, bandinius per visą 48 h maišymo laikotarpį galima imti nuosekliai (pvz., 4, 8, 24,48 h). Tačiau rinktis analizės laiką reikėtų lanksčiai ir atsižvelgiant į laboratorijos darbo grafiką.

Yra du galimi būdai bandomosios medžiagos vandeniniam tirpalui analizuoti: a) lygiagretusis metodas ir b) nuoseklusis metodas. Pabrėžtina, kad, nors eksperimentinio darbo lygiagrečiuoju metodu yra daugiau, matematinis rezultatų apdorojimas yra paprastesnis (5 priedas). Tačiau metodą pasirinkti leidžiama pačiam bandytojui, kuris turės atsižvelgti į laboratorijos įrangą ir lėšas.

a) Lygiagretusis metodas: paruošiami bandiniai su vienodu dirvožemio ir tirpalo santykiu, bandinių reikia tiek, kiek laiko tarpų pasirinkta adsorbcijos kinetikai tirti. Po centrifugavimo ir, jei pageidaujama, filtravimo vandeninė fazė, jei įmanoma, išgaunama visa ir analizuojama, pvz., pirmojo mėgintuvėlio po 4 h, antrojo mėgintuvėlio – po 8 h, trečiojo mėgintuvėlio – po 24, ir 1.1.

b) Nuoseklusis[2]metodas: kiekvienam dirvožemio ir tirpalo santykiui paruošiama tik po du bandinius. Nustatytais laiko tarpais mišinys centrifuguojamas fazėms atskirti. Maža alikvotinė tirpalo dalis tuojau pat analizuojama bandomajai medžiagai nustatyti; bandymas tęsiamas su pradiniu mišiniu. Jei po centrifugavimo taikomas filtravimas, laboratorijoje turi būti priemonių mažiems alikvotinių dalių tūriams filtruoti. Rekomenduojama bendrą alikvotinių dalių tūrį imti ne didesnį kaip 1 % bendrojo tirpalo tūrio, kad atliekant bandymą labai nepakistų dirvožemio, ir tirpalo santykis ir nesumažėtų adsorbuojamos medžiagos masė.

Pagal vardinę pradinę koncentraciją ir koncentraciją, išmatuotą bandinio ėmimo momentui (t), pataisytą pagal tuščiojo bandymo vertę, kiekvienam laiko momentui (ti) apskaičiuojama adsorbcijos Ati procentinė dalis. Braižomi Ati kitimo laike grafikai (5 priedas, 1 pav.), kad būtų galima nustatyti, ar jau pasiekta pusiausvyros horizontalioji kreivės dalis (1). Taip pat apskaičiuojama Kd vertė pusiausvyros sąlygomis. Pagal šią Kd vertę (1 pav.) pasirenkamas tinkamas dirvožemio ir tirpalo santykis, kad adsorbcijos procentinė dalis būtų didesnė kaip 20 %, o geriau, jei > 50 % (61). Visos taikomos lygtys ir grafikų sudarymo principai pateikti poskyryje „Duomenys ir ataskaita“ ir 5 priede.

1.9.2.2. Adsorbcijos pusiausvyros nusistovėjimo, trukmės ir pusiausvyros sąlygomis adsorbuotos medžiagos kiekio nustatymas

Kaip jau sakyta, Ati ar Cadsaq kitimo per tam tikrą laiką grafikai leidžia įvertinti, ar pasiekta adsorbcijos pusiausvyra ir koks yra pusiausvyros sąlygomis adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis. Tokių grafikų pavyzdžiai pateikti 5 priede. Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė – tai laikas, per kurį sistema pasiekia kreivės horizontaliąją dalį.

Jei konkrečiai medžiagai kreivės lygiagrečioji dalis nepasiekiama, bet adsorbcija visą laiką didėja, gali būti sunkinančių veiksnių, pvz., biologinis skaidymas ar lėta difuzija. Biologinį skaidymą galima įrodyti, pakartojant bandymą su steriliu dirvožemio bandiniu. Jei ir dabar lygiagrečioji kreivės dalis nepasiekiama, bandytojas turi ieškoti kitų reiškinių, trukdančių vykdyti specifinį tyrimą; tai galima padaryti atitinkamai pakeitus bandymo sąlygas (temperatūrą, maišymo trukmę, dirvožemio ir tirpalo santykį). Bandytojas pats turi spręsti, ar tęsti bandymą, nepaisant to, kad gali ir nepavykti pasiekti pusiausvyrą.

1.9.2.3. Adsorbcija ant bandymų indų paviršiaus ir bandomosios medžiagos stabilumas

Tam tikros informacijos apie bandomosios medžiagos adsorbciją ant bandymų indų paviršiaus, taip pat apie jos stabilumą, galima gauti analizuojant kontrolinius bandinius. Jei pastebimas medžiagos išeikvojimas yra didesnis už analizės metodo standartinę paklaidą, gali vykti abiotinis skaidymas ir (ar) adsorbcija ant bandymų indų paviršiaus. Šiuos du reiškinius galima atskirti, jei indų sienelės gerai nuplaunamos žinomu kiekiu atitinkamo tirpiklio ir plovimui naudotas tirpalas analizuojamas, norint nustatyti bandomąją medžiagą. Jei adsorbcija ant indų paviršiaus nevyksta, medžiagos išeikvojimas rodo abiotinį bandomosios medžiagos nestabilumą. Jei adsorbcija įrodoma, būtina keisti medžiagas, iš kurių pagaminti bandymų indai. Tačiau duomenys, gauti atliekant šį bandymą, negali būti tiesiogiai ekstrapoliuoti dirvožemio ir tirpalo bandymui. Šiai adsorbcijai įtakos gali turėti dirvožemis.

Papildomos informacijos apie bandomosios medžiagos stabilumą galima gauti, nustatant pradinės medžiagos masės balansą per tam tikrą laiką. Tokiu atveju vandeninė fazė, dirvožemio ekstraktai ir bandymų indų sienelės analizuojamos, norint nustatyti bandomąją medžiagą. Pridėtos bandomosios medžiagos masės ir bandomosios medžiagos vandeninėje fazėje, ekstraktuose ir ant bandymų indų sienelių masių sumos skirtumas yra lygus masei medžiagos, kuri buvo suardyta ir (ar) išgaravo, ir (ar) nebuvo ekstrahuota. Norint nustatyti masių balansą, atliekant bandymą turi būti pasiekta adsorbcijos pusiausvyra.

Masių balansas sudaromas dviem dirvožemiams ir kiekvieno dirvožemio vienam dirvožemio ir tirpalo santykiui, kuriam pusiausvyros sąlygomis gaunamas didesnis negu 20 %, o geriau didesnis negu 50 % išeikvojimas. Baigus santykio nustatymo bandymą, kai po 48 h padaroma paskutinė vandeninės fazės bandinio analizė, fazės yra atskiriamos centrifugavimu ir, jei pageidaujama, filtravimu. Iš dirvožemio išgaunama kuo didesnio laipsnio vandeninė fazė, vėliau, norint ekstrahuoti bandomąją medžiagą, į jį įpilama tinkamo ekstrahavimo tirpiklio (ekstrahavimo veiksnys bent 95%). Rekomenduojama nuosekliai ekstrahuoti bent du kartus. Nustatomas medžiagos kiekis dirvožemio ir bandymų indų ekstraktuose ir apskaičiuojamas masių balansas (10 lygtis, „Duomenys ir ataskaita“). Jei jis yra mažesnis negu 90 %, laikoma, kad bandomoji medžiaga, atliekant bandymą, yra nestabili. Tyrimus galima tęsti toliau, atsižvelgiant į bandomosios medžiagos nestabilumą; rekomenduojama, atliekant pagrindinį tyrimą, analizuoti abi fazes.

 

1.9.3 2 etapas. Adsorbcijos kinetika, esant vienai bandomosios medžiagos koncentracijai

Naudojami iš 1 lentelės pasirinkti penki dirvožemio tipai. Jei tinka, tarp šių penkių tipų naudinga turėti kai kuriuos dirvožemio tipus, naudotus atliekant parengiamąjį tyrimą. Tuomet parengiamajam tyrimui naudotiems dirvožemio tipams 2 etapo bandymų daryti nereikia.

Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė, dirvožemio ir tirpalo santykis, dirvožemio bandinio masė, susijęs su dirvožemiu vandeninės fazės tūris ir bandomosios medžiagos tirpalo koncentracija pasirenkami pagal parengiamojo tyrimo rezultatus. Analizę būtų geriau atlikti maždaug po 2, 4, 6, 8 (galbūt dar po 10 h) ir po nusistovėjimo trukmė. Analizės laiką reikėtų rinktis lanksčiai.

Kiekvienas bandymas (vienas dirvožemis ir vienas tirpalas) atliekamas bent du kartus, kad būtų galima įvertinti rezultatų sklaidą. Atliekant kiekvieną bandymą, lygiagrečiai atliekamas tuščiasis bandymas. Jį sudaro dirvožemis ir 0,01 M CaCl2 tirpalas be bandomosios medžiagos, kurių tūris yra atitinkamai toks pat kaip ir bandymo su bandomąja medžiaga masė. Norint išvengti netikėtumų, pagal tą pačią bandymo metodiką atliekamas kontrolinis bandymas tik su bandomąja medžiaga, ištirpinta 0,01 M CaCl2 tirpale (be dirvožemio).

A A

Apskaičiuojama kiekvieno laiko momento Ati ir (ar) laiko tarpo AΔti (pagal poreikį) adsorbcijos procentinė dalis ir pateikiamas adsorbcijos kitimo tam tikrą laiką grafikas. Apskaičiuojamas pasiskirstymo koeficientas Kd pusiausvyros sąlygomis, taip pat pagal organinę anglį normalizuotas adsorbcijos koeficientas Koc (nepolinių organinių medžiagų).

Adsorbcijos kinetikos bandymo rezultatai

Tiesinė Kd vertė dažniausiai tiksliai aprašo dirvožemio sorbcinį elgesį (35) (78) ir yra cheminių medžiagų būdingo judrumo dirvožemyje išraiška. Pvz., cheminės medžiagos, kurių Kd < 1 cm3 x g-1, kokybiškai laikomos judriomis. Panašiai MacCall et ai. (16) buvo sukurta judrumo klasifikavimo schema, pagrįsta Koc vertėmis. Be to, yra išplovimo klasifikavimo schemos, pagrįstos Kd ir DT-50[3] santykiu (32) (79).

Pagal paklaidų analizės tyrimus (61) mažesnės kaip 0,3 cm3 x g-1 Kd vertės negali būti tiksliai įvertintos pagal vandeninės fazės koncentracijos mažėjimą, netgi taikant palankiausią (tikslumo požiūriu) dirvožemio ir tirpalo santykį, t. y. 1:1. Šiuo atveju rekomenduojama analizuoti abi fazes, dirvožemį ir tirpalą.

Atsižvelgiant į šias pastabas, rekomenduojama tęsti adsorbcinį cheminės medžiagos dirvoje elgesio ir jos potencialaus judrumo tyrimą, nustatant Freundlicho adsorbcijos izotermes tų sistemų, kurių Kd vertes galima tiksliai nustatyti pagal šio metodo aprašymą. Tiksliai nustatyti galima, jei Kd ir dirvožemio ir tirpalo santykio sandaugos vertė yra > 0,3, matuojant vandeninės fazės koncentracijos mažėjimą (netiesioginis metodas) ar > 0,1, kai analizuojamos abi fazės (tiesioginis metodas) (61).

 

1.9.4 3 etapas. Adsorbcijos izotermes ir desorbcijos kinetika bei desorbcijos izotermes

1.9.4.1. Adsorbcijos izotermes

Naudojamos penkios bandomosios medžiagos koncentracijos ir rekomenduojama, kad jų vertės apimtų dvi dydžio eiles; pasirenkant šias koncentracijas, reikia atsižvelgti į tirpumą vandenyje ir gaunamą vandeninės fazės pusiausvyros koncentraciją. Tas pats dirvožemio ir tirpalo santykis turi būti taikomas visą tyrimą. Adsorbcijos bandymas atliekamas taip, kaip aprašyta pirmiau, skirtumas tik toks, kad vandeninė fazė analizuojama vieną kartą pusiausvyros nusistovėjimo momentu, nustatytu pagal 2 etapo rezultatus. Nustatoma tirpalų pusiausvyros koncentracija ir pagal medžiagos kiekio tirpale sumažėjimą arba tiesioginiu metodu apskaičiuojamas adsorbuotos medžiagos kiekis. Adsorbuotos medžiagos masė, tenkanti dirvožemio masės vienetui, grafiškai pateikiama kaip bandomosios medžiagos pusiausvyros koncentracijos funkcija (žr. „Duomenys ir ataskaita“).

Bandymo rezultatai, norint gauti adsorbcijos izotermę

Apibūdinant adsorbcijos procesus iš ligi šiol pasiūlytų matematinių adsorbcijos modelių dažniausiai taikoma Freundlicho izotermė. Smulkesnė informacija, interpretuojant adsorbcijos modelius ir jų svarbą, pateikta nuorodose (41), (45), (80), (81), (82).

PASTABA. Reikėtų paminėti, kad skirtingų medžiagų KF (Freundlicho adsorbcijos koeficiento) vertes galima palyginti, jei šios KF vertės yra išreikštos tais pačiais vienetais (83).

1.9.4.2. Desorbcijos kinetika

Šio bandymo tikslas yra ištirti, ar cheminę medžiagą dirvožemis adsorbuoja grįžtamai ar negrįžtamai. Ši informacija yra svarbi, kadangi cheminės medžiagos elgesiui dirvožemyje lauko sąlygomis desorbcijos procesas taip pat turi svarbią įtaką. Be to, desorbcijos duomenys yra naudingi kaip įvesties duomenys kompiuteriu modeliuojant išplovimą ir ištirpusių medžiagų nuotėkį. Jei norima vykdyti desorbcijos tyrimą, rekomenduojama, kad su kiekviena sistema, kurios Kd buvo galima tiksliai nustatyti, atliekant ankstesnį adsorbcijos kinetikos bandymą, būtų atliekamas toliau aprašytas tyrimas.

Panašiai kaip atliekant adsorbcijos kinetikos tyrimą, yra du desorbcijos kinetikos bandymo metodai: a) lygiagretusis metodas ir b) nuoseklusis metodas. Pasirinkti metodą patikima bandytojui, kuris turi atsižvelgti į laboratorijos įrangą ir lėšas.

a) Lygiagretusis metodas: kiekvienam desorbciją tirti pasirinktam dirvožemio tipui paruošiama bandinių, kurių dirvožemio ir tirpalo santykis būtų vienodas ir kurių būtų tiek, kiek yra desorbcijos kinetiką tiriant pasirinktų laiko tarpų. Geriau naudoti laiko tarpus, pasirinktus tiriant adsorbcijos kinetiką; tačiau bendras laikas gali būti atitinkamai padidintas, kad sistema galėtų pasiekti desorbcijos pusiausvyrą. Atliekant kiekvieną bandymą (vienas dirvožemis, vienas tirpalas), šalia atliekamas vienas tuščiasis bandymas. Jį sudaro dirvožemis ir 0,01 M CaCl2 tirpalas be bandomosios medžiagos, kurių masė ir tūris atitinkamai yra tokie pat kaip ir bandinio su bandomąja medžiaga. Pagal tą pačią bandymo metodiką tiriamas kontrolinis bandinys tik su bandomąja medžiaga, ištirpinta 0,01 M CaCl2 tirpale (be dirvožemio). Visi dirvožemio ir tirpalo mišiniai maišomi, kol pasiekiama adsorbcijos pusiausvyra (kaip nustatyta pirmiau pagal 2 etapą). Toliau fazės atskiriamos centrifugavimu ir pašalinama kuo daugiau vandeninių fazių. Pašalinti tirpalai pakeičiami tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo be bandomosios medžiagos ir nauji mišiniai vėl maišomi. Pirmojo mėgintuvėlio vandeninė fezė kuo geriau išgaunama ir analizuojama, pvz., po 2 h, antrojo mėgintuvėlio – po 4 h, trečiojo mėgintuvėlio – po 6 h ir 1.1, kol pasiekiama desorbcijos pusiausvyra.

b) Nuoseklusis metodas: baigus adsorbcijos kinetikos bandymą, mišinys centrifuguojamas ir vandeninė fazė kiek įmanoma daugiau pašalinama. Pašalintas tirpalas pakeičiamas tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo be bandomosios medžiagos. Naujas mišinys maišomas tol, kol pasiekiama desorbcijos pusiausvyra. Per tą laiką tam tikrais laiko tarpais mišinys yra centrifuguodamas, kad fazės būtų atskirtos. Maža alikvotinė tirpalo dalis tuojau pat analizuojama, nustatant bandomąją medžiagą; vėliau bandymas tęsiamas su pradiniu mišiniu. Kiekvienos atskiros alikvotinės dalies tūris turi sudaryti mažiau negu 1 % bendro tūrio. Dirvožemio ir tirpalo santykį išlaikant tokį pat, įpilamas toks pat kiekis šviežio 0,01 M CaCl2 tirpalo. Maišoma, kol ateina kitas laiko tarpas.

Apskaičiuojama kiekvieno laiko momento (Dti) ir (ar) laiko tarpo (DΔti) (pagal tyrimo poreikius) desorbcijos procentinė dalis ir braižomas kitimo tam tikrą laiką grafikas. Taip pat apskaičiuojamas desorbcijos koeficientas Kdes pusiausvyros sąlygomis. Visos taikomos lygtys pateiktos poskyryje „Duomenys ir ataskaita“ ir 5 priedėlyje.

Desorbcijos kinetikos bandymo rezultatai

Bendri desorbcijos procentinės dalies Dti ir adsorbcijos Ati kitimo tam tikrą laiką grafikai leidžia įvertinti adsorbcijos proceso grįžtamumą. Adsorbcija laikoma grįžtamąja, jei laikas, skirtas pasiekti desorbcijos pusiausvyrą, yra trumpesnis už dvigubą laiką, reikalingą pasiekti adsorbcijos pusiausvyrai, o bendroji desorbciją sudaro daugiau negu 75 % adsorbuoto kiekio.

1.9.4.3. Desorbcijos izotermės

Apskaičiuojamos dirvožemių, kuriems buvo apskaičiuojamos adsorbcijos izotermės, Freundlicho desorbcijos izotermės. Desorbcijos bandymas daromas, kaip aprašyta skirsnyje „Desorbcijos kinetika“, išskyrus tai, kad vandeninė fazė analizuojama tik vieną kartą, kai nusistovi desorbcijos pusiausvyra. Apskaičiuojamas desorbuotos bandomosios medžiagos kiekis. Desorbcijos pusiausvyros sąlygomis likęs dirvožemio adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis grafiškai pateikiamas kaip bandomosios medžiagos tirpalo pusiausvyros koncentracijos funkcija (žr. „Duomenys ir ataskaita“ ir 5 priedą).

 

2 DUOMENYS IR ATASKAITA

Analizės duomenys pateikiami lentelėse (žr. 6 priedą). Pateikiami atskiri matmenys ir apskaičiuotos vidutinės vertės. Adsorbcijos izotermės pateikiamos grafiškai. Apskaičiuojama taip, kaip nurodyta toliau.

Atliekant šį bandymą laikoma, kad 1 cm3 vandeninio tirpalo masė yra 1 g. Dirvožemio ir tirpalo santykis gali būti išreikštas m/m ar m/V, skaitmeninė šių dydžių vertė yra vienoda.

 

2.1 ADSORBCIJA

Adsorbcija (Ati) yra išreiškiama bandymo sąlygomis dirvožemio adsorbuotos medžiagos procentine dalimi nuo jos kiekio bandymo pradžioje. Jei

Ą bandomoji medžiaga yra stabili ir indo sienelės jos labai neadsorbuoja, Ati kiekvienu laiko momentu Ati apskaičiuojama pagal lygtį:

čia:

Ati = adsorbcijos procentinė dalis laiko momentu į (%),

msads (ti) = laiku ti dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg),

mo= bandymo pradžioje mėgintuvėlyje esančios bandomosios medžiagos masė (μg).

Informacija, kaip apskaičiuoti adsorbciją Ati lygiagrečiuoju ir nuosekliuoju metodu, išsamiai aprašyta 5 priede.

Pasiskirstymo koeficientas Kd yra medžiagos kiekio dirvožemio fazėje ir vandeninio tirpalo masės koncentracijos santykis bandymo sąlygomis, pasiekus adsorbcijos pusiausvyrą.

čia:

Csads (eq) = dirvožemiu adsorbuotos medžiagos kiekis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg x g-1),

Caqads (eq) = medžiagos vandeninės fazės masės koncentracija adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg x cm-3). Ši koncentracija nustatoma analizės būdu, atsižvelgiant į vertes, gautas atlikus tuščiuosius bandymus,

msads (eq) = dirvožemiu adsorbuotos medžiagos masė adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg),

maqads (eq) = medžiagos masė tirpale adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg),

msoil = dirvožemio fazės kiekis, išreikštas sauso dirvožemio mase (g),

Vo = su dirvožemiu susijusios vandeninės fazės pradinis tūris (cm3).

Aeq, ir Kd santykis aprašomas lygtimi:

čia:

Aeq = adsorbcijos procentinė dalis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis %.

Pagal organinę anglį normalizuotas adsorbcijos koeficientas Koc susieja pasiskirstymo koeficientą Kd ir dirvožemio bandinio organinės anglies kiekį:

čia:

%oc = organinės anglies dirvožemio bandinyje procentinė dalis (g x g-1).

Koc koeficientas rodo vienintelę vertę, kuri dažniausiai apibūdina neporinių organinių cheminių medžiagų pasiskirstymą tarp dirvožemio organinės anglies ar nuosėdų ir vandens. Šių cheminių medžiagų adsorbcija susiejama su organinės medžiagos kiekiu adsorbuojančioje kietojoje medžiagoje (7); taigi Koc vertės priklauso nuo humusinių dalių, kurių sorbcijos galia labai skiriasi dėl kilmės, genezės ir kt. specifinių savybių.

 

2.1.1. Adsorbcijos izotermės

Freundlicho adsorbcijos izotermių lygtis susieja adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekį ir bandomosios medžiagos tirpalo koncentraciją pusiausvyros sąlygomis (8 lygtis).

Duomenys apdorojami, kaip nurodyta „Adsorbcijos“ poskyrio bendrojoje dalyje, ir kiekvienam mėgintuvėliui po adsorbcijos bandymo apskaičiuojamas dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis (Csads (eq), kitur žymimas x/m). Daroma prielaida, kad pusiausvyra yra pasiekta ir kad Csads (eq) rodo pusiausvyros vertę:

Freundlicho adsorbcijos lygtis pateikta (8):

ar kaip tiesė:

čia:

KFads = Freundlicho adsorbcijos koeficientas; jo dimensija yra cm3 x g-1, tik jei l/n= 1; visais kitais atvejais į KFads dimensiją įvedamas krypties koeficientas 1/n [μg1-1/n x (cm3)1/n x g-1],

n = regresijos konstanta; 1/n dažniausiai kinta 0,7 – 1,0 ribose. Tai rodo, kad sorbcijos duomenys dažnai yra šiek tiek netiesiški.

Gali būti nubrėžti 8 ir 9 lygčių grafikai ir, taikant 9 lygtį, regresijos analizės metodu apskaičiuojami KFads ir 1/n. Taip pat apskaičiuojamas logaritminės lygties koreliacijos koeficientas r2. Tokių grafikų pavyzdys pateiktas 2 pav.

2 pav. Freundlicho adsorbcijos įprastas ir ištiesintas grafikas.

 

2.1.2 Masių balansas

Masių balansas (MB) apibrėžiamas kaip medžiagos, galinčios būti analiziškai išgautos po adsorbcijos bandymo, procentinė dalis nuo medžiagos vardinio kiekio bandymo pradžioje.

Duomenų apdorojimas skirsis, jei tirpiklis visiškai maišosi su vandeniu. Jei tirpiklis maišosi su vandeniu, ekstrahuojant tirpikliu nustatyti atgaunamos medžiagos kiekį galima taikyti duomenų apdorojimo būdą, aprašytą „Desorbcijos“ poskyryje. Jei tirpiklis su vandeniu maišosi blogiau, reikia nustatyti atgautos medžiagos kiekį.

Adsorbcijos atveju masių balansas MB apskaičiuojamas, kaip nurodyta toliau. Daroma prielaida, kad narys (mB) atitinka bandomosios cheminės medžiagos, organiniu tirpikliu ekstrahuojamos iš dirvožemio ir nuo bandymų indo sienelių, masių sumą:

čia:

MB= masių balansas (%)

mE bandomosios medžiagos, dviem etapais ekstrahuotos iš dirvožemio ir nuo sienelių, bendroji masė (μg),

Co= sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomojo tirpalo pradinė masės koncentracija (μg x cm-3)

Vrec= adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis išgauto virš nuosėdų tirpalo tūris (cm3).

 

2.2 DESORBCIJA

Desorbcija (D) apibrėžiama kaip desorbuotos bandomosios medžiagos procentinė dalis nuo medžiagos kiekio, prieš tai adsorbuotos bandymo sąlygomis:

čia:

Dti = desorbcijos procentinė dalis laiko momentu į (%)

maqdes (ti) = laiko momentu ti nuo dirvožemio desorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg)

msads (eq) = adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg).

Informacija, kaip apskaičiuoti desorbcijos procentinę dalį Dti lygiagrečiuoju ir nuosekliuoju metodu, išsamiai aprašyta 5 priede. Tariamasis desorbcijos koeficientas (Kdes) bandymo sąlygomis yra dirvožemio fazėje likusios medžiagos kiekio ir desorbuotos medžiagos vandeninio tirpalo masės koncentracijos santykis pasiekus desorbcijos pusiausvyrą:

čia:

Kdes = desorbcijos koeficientas (cm3 x g“1)

maqads (eq) = nuo dirvožemio desorbuotos bandomosios medžiagos bendroji masė desorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg)

Vt= atliekant desorbcijos kinetikos bandymą sąlytyje su dirvožemiu esančios vandeninės fazės bendrasis tūris (cm3).

Kaip apskaičiuoti maqdes (eq), nurodyta 5 priedo poskyryje „Desorbcija“.

PASTABA. Jei prieš tai atliekant adsorbcijos bandymą buvo taikomas lygiagretusis metodas, laikoma, kad tūris VT 12 lygtyje yra lygus Vo.

 

2.2.1 Desorbcijos izotermės

Freundlicho desorbcijos izotermių lygtis susieja desorbcijos pusiausvyros sąlygomis likusios dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekį ir bandomosios medžiagos tirpalo koncentraciją (16 lygtis).

Desorbcijos pusiausvyros sąlygomis likusios dirvožemio adsorbuotos medžiagos kiekis kiekvienam mėgintuvėliui apskaičiuojamas taip:

maqdes (eq) yra apibrėžiama taip:

čia:

Csdes (eq) = bandomosios medžiagos, kuri liko adsorbuota dirvožemiu desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, kiekis (μg x g ),

mmdes (eq) = medžiagos, analiziškai nustatytos vandeninėje terpėje desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, masė (μg),

mAaq = bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl ne visiško tūrio pakeitimo, masė (μg),

maqdes (eq) = medžiagos, esančios tirpale adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis, masė (μg)

VFr = tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio, norint nustatyti bandomosios medžiagos kiekį desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, tūris (cm3),

VR= virš nuosėdų esančio tirpalo, pašalinto iš mėgintuvėlio, kai pasiekta adsorbcijos pusiausvyra ir pakeista tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo, tūris (cm3).

Freundlicho desorbcijos lygtis pateikta (16):

ar kaip tiesė:

čia:

KFdes = Freundlicho desorbcijos koeficientas

n = regresijos konstanta,

Caqdes (eq) = medžiagos vandeninėje fazėje masės koncentracija desorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg x cm-3).

Gali būti nubrėžti 16 ir 17 lygčių grafikai ir taikant 17 lygtį regresijos analizės metodu apskaičiuojami KdesF ir 1/n.

PASTABA. Jei Freundlicho adsorbcijos ar desorbcijos laipsnio rodiklis 1/n yra lygus 1, Freundlicho lygčių adsorbcijos ar desorbcijos konstantos (KFads ir KFdes) bus lygios atitinkamai adsorbcijos ar desorbcijos pusiausvyros konstantoms (Kd ir Kdes), ir Cs priklausomybės nuo Caq grafikas dažniausiai būna tiesė. Jei laipsnių rodikliai nėra lygūs 1, Cs priklausomybės nuo Caq grafikai nebūna tiesės ir adsorbcijos bei desorbcijos konstantos dažniausiai keičiasi išilgai izotermių.

 

2.2.2 Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti ši informacija:

- išsamus naudotų dirvožemio bandinių identifikavimas, įskaitant:

- geografinį vietos nurodymą (platuma, ilguma),

- bandinio ėmimo datą,

- kilmę (pvz., žemės ūkio paskirties dirvožemis, miškas ir 1.1),

- bandinio ėmimo gylį,

- smėlio, dumblo, molio kiekį, -pH vertes (0,01 M CaCl2),

- organinės anglies kiekį,

- organinės medžiagos kiekį,

- azoto kiekį,

- C/N santykį,

- katijonų mainų talpą (mmol/kg),

- visą informaciją apie dirvožemio bandinių rinkimą ir laikymą,

-jei reikia, visą informaciją, reikalingą interpretuoti bandomosios medžiagos adsorbciją ir desorbciją,

- metodus, taikomus nustatant kiekvieną parametrą,

- atitinkama informacija apie bandomąją medžiagą,

- bandymų temperatūra,

- centrifugavimo sąlygos,

- analizės procedūra, taikyta analizuojant bandomąją medžiagą,

- priežastys, kurios pagrįstų soliubilizavimo agento naudojimą ruošiant pradinį bandomosios medžiagos tirpalą,

- skaičiavimuose darytų pataisų aiškinimai, jei reikia,

- duomenys pagal formą (6 priedas) ir grafikai,

- visa informacija ir pastabos, padedančios interpretuoti bandymų rezultatus.

 

3. NUORODOS

1) Kukowski H. and Brummer G., (1987). Investigations on the Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02 045, Part H.

2) Franzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02 045, Part I.

3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, Collection, Treatment, Characterisatioa Special Publication No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.

4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995 (June 1995).

5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, Series 163 – 1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.

6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 835-Fate, Transport and Transformation TestGuidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.

7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Determining a Sorption Constant (Koc) for an Organic Chemical in Soil and Sediments.

8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.

9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Application for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.

10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment.

11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany.

12) Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and the prediction of the mobilities of pesticides in soils“, in Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).

13) Calvet R., (1980), „Adsorption-Desorption Phenomena“ in Interactions between herbicides and the soil. (R. J. Hance ed.), Academic Press, London, 83 – 122 p.

14) Hasset J. J., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of nonpolar organics by soils and sediments“ in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, 31 – 44 p.

15) van Genuchten M. Th., Davidson J. M., and Wierenga P. J., (1974), „An evaluation of kinetic and eąuilibrium eąuations for the prediction of pesticide movement through porous media“. Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), 29 – 35 p.

16) McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., and Dishburger H. J., (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis“, in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.

17) Lambert S. M., Porter P. E., and Schieferrstein R. H., (1965), „Movement and sorption of chemicals applied to the soil“. Weeds, 13,185 – 190 p.

18) Rhodes R. C, Belasco I. J., and Pease H. L., (1970) „Determination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils“. J.Agric.Food Chem., 18, 524-528 p.

19) Russell M. H., (1995), „Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil“ in Environmental Behaviour of Agrochemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley & Sons Ltd.

20) Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. W. and Holland P. T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides“, IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 901 – 932 p.

21) Guth J. A., Burkhard N., and D. O. Eberle, (1976), „Experimental models for studying the persistence of pesticides in soils“. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 137 – 157 p., BCPC, Surrey, UK.

22) Furminge C. G. L., and Osgerby J. M., (1967), „Persistence of herbicides in soil“. J. Sci. Fd Agric, 18, 269 – 273 p.

23) Burkhard N., and Guth J. A., (1981), „Chemical hydrolysis of 2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption“. Pestic. Sci. 12, 45 – 52 p.

24) Guth J. A., Gerber H. R., and Schlaepfer T., (1977), „Effect of adsorption, movement and persistence on the biological availability of soil-applied pesticides“. Proc. Br. Crop Prot. Conf, 3,961 – 971 p.

25) Osgerby J. M., (1973), „Process affecting herbicide action in soil“. Pestic. Sci., 4,247 – 258 p.

26) Guth J. A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von Pflanzenschutzmitteln in Boden“. Schr. Reihe Ver. Wass. -Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, 143 – 154 p.

27) Hamaker J. W., (1975), „The interpretation of soil leaching experiments“, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), 135 – 172 p., Plenum Press, NY.

28) Helling C. S., (1971), „Pesticide mobility in soils“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc, 35, 732 – 210 p.

29) Hamaker J. W., (1972), „Diffusion and volatilization“ in Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J. W. Hamaker eds), Vol. I, 49-143 p.

30) Burkhard N. and Guth J. A., (1981), „Rate of volatilisation of pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results with those determined in a laboratory model system“. Pestic. Sci. 12, 37 – 44 p.

31) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F., and Enfield C.G., (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, 297 – 325 p., Acs Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.

32) Gustafson D. L, (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple method for assessing pesticide leachability“. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), 339 – 357 p.

33) Leistra M., and Dekkers W. A., (1976). „Computed effects of adsorption kinetics on pesticide movement in soils“. J. of Soil Sci., 28, 340 – 350 p.

34) Bromilov R. H., and Leistra M., (1980), „Measured and simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fellow soils“. Pest. Sci., 11,389 – 395 p.

35) Green R. E., and Karickoff S. W., (1990), „Sorption estimates for modeling“, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., Book Series no. 2, 80-101 p.

36) Lambert S. M., (1967), „Functional relationship between sorption in soil and chemical structure“. J. Agri. Food Chem., 15,572 – 576 p.

37) Hance R. J., (1969), „An empirical relationship between chemical structure and the sorption of some herbicides by soils“. J. Agri. Food Chem., 17, 667-668 p.

38) Briggs G. G. (1969), „Molecular structure of herbicides and their sorption by soils“. Nature, 223, 1288.

39) Briggs G. G. (1981). „Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor“. J. Agric. Food Chem., 29, 1050 – 1059 p.

40) Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of soil sorption of organic polutance by molecular topology“. J. Agric. Food Chem., 32, 243-246 p.

41) Bailey G. W., and White J. L., (1970), „Factors influencing the adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil“. Residue Rev., 32,29 – 92 p.

42) Bailey G. W., J. L. White and Y. Rothberg., (1968), „Adsorption of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 32:222 – 234 p.

43) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natūrai sediments and soils“. Chemosphere 10, 833-846 p.

44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners“. Environ. Toxicol. Safety 21,1 – 17 p.

45) Hamaker J. W., and Thompson J. M., (1972), „Adsorption in organic chemicals“ in Organic Chemicals in the Soil Environment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and n, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972,49 – 143 p.

46) Deli J., and Warren G. F., 1971, „Adsorption, desorption and leaching of diphenamid in soils“. Weed Sci. 19: 67 – 69 p.

47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, (1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils“. Weed Science, Vol. 23,454 – 457 p.

48) Haues M. H. B., Stacey M., and Thompson J. M., (1968), „Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations“ in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.

49) Pionke H. B., and Deangelis R. J., (1980), „Methods for distributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase“, CREAMS, in A Field Scale Model for Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.

50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition (1994).

51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 1 1th edition.

52) Black, Evans D. D., White J. L.,EnsmingerL. E., and Clark F. E., eds. „Methods of Soil Analysis“, Vol 1 and 2, American Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.

53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality-Sampling-Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.

54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance on sampling techniques.

55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality- Sampling -Part 3: Guidance on safety of sampling.

56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality -Sampling – Part 4: Guidance on the investigation of natūrai and cultivated soils.

57) ISO/DIS 103 81 -5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.

58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

59) Green R. E., and Yamane V. K., (1970), „Precision in pesticide adsorption measurements“. Soil Sci. Am. Proc, 34, 353 – 354 p.

60) Grover R., and Hance R. J. (1970), „Effect of ratio of soil to water on adsorption of linuron and atrazine“. Soil Sci., 109 – 138 p.

61) Boesten, J. J. T. I, „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients inpesticide/soil system“. Pest. Sci. 1990,30,31 – 41 p.

62) Boesten, J. J. T. I. „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106“. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26 – 29 April 1994.

63) Bastide J., Cantier J. M., et Coste C, (1980), „Comportement de substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimiąue“. Weed Res. 21,227-231 p.

64) Brown D. S., and Flagg E. W., (1981), „Empirical prediction of organic pollutants sorption in natūrai sediments“. J. Environ.Qual., 10(3), 382 – 386 p.

65) Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W., (1983), „Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water“. Environ. Sci. Technol, 17(4), 227 – 231 p.

66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic substances by soils and sediments“. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), 297 — 312 p.

67) Vowles P. D., and Mantoura R. F. C, (1987), „Sediment-water partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons“. Chemosphere, 16(1), 109- 116 p.

68) Lyman W. J., Reehl W. F.and Rosenblatt D. H. (1990). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.

69) Keniga E. E., and Goring, C. A. I. (1980). „Relationship between water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota“ in Aquatic Toxicology (eds J.G. Eaton, et ai), 78 – 115 p., ASTM STP 707, Philadelphia.

70) Chiou C. T., Peters L. J., and Freed V. H., (1979), „A physical concept of soil-water eąuilibria for non-ionic organic compounds“. Science, Vol. 206, 831-832 p.

71) Hassett J. J., Banwart W. L, Wood S. G., and Means J. C, (1981), „Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption“. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, 38 – 42 p.

72) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natūrai sediments and soils“. Chemosphere, Vol. 10(8), 833-846 p.

73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilitė-reactivitė“. Revue de l'Agric, 34 (4), 319-322 p.

74) Mūller M., Kordel W. (1996), „Comparison of screening methods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil“. Chemosphere, 32(12), 2493 – 2504 p.

75) Kordel W., Kotthoff G., Mūller M. (1995), „HPLC – screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil – results of a ring test“. Chemosphere 30 (7), 1373 – 1384 p.

76) Kordel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC – screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil – comparison of different stationary phases“. Chemosphere 27 (12), 2341 – 2352 p.

77) Hance, R. J., (1967), „The Speed of Attainment of Sorption Eąuilibria in Some Systems Involving Herbicides“. Weed Research, Vol. 7,29 – 36 p.

78) Koskinen W. C, and Harper S. S., (1990), „The retention processes: mechanisms“ in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.

79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield C. G. (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, 297 – 325 p, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.

80) Giles C. H., (1970), „Interpretation and use of sorption isotherms“ in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37,14 – 32 p.

81) Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, (1960), „Studies in adsorption: XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils“. J. Chem. Soc, 3973 – 93 p.

82) Calvet R., Tercė M., and Arvien J. C, (1980), „Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caracteristiąues generales de l'adsorption“. Ann. Agron. 31: 239 — 251 p.

83) Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich eąuation“, Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environment, 13 – 15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.

84) Guth, J. A., (1985), „Adsorption/desorption“, in Joint International Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.

85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).

 

1 priedas

BANDYMO PLANAS

 

 

2 priedas

 

ANALIZĖS METODO TIKSLUMO IR KONCENTRACIJOS POKYČIO ĮTAKA ADSORBCIJOS REZULTATŲ TIKSLUMUI

 

Iš toliau pateikiamos lentelės (84) matyti, kad jei tirpale esančios bandomosios medžiagos pradinės masės (m0 =110 μg) ir pusiausvyros masės maqads (eq) = 100 μg) skirtumas labai mažas (nes yra 5 % paklaida), tai matuojant pusiausvyros koncentraciją susidaro 50 % paklaida, kai apskaičiuojamas dirvožemiu adsorbuotos medžiagos masė msads (eq), ir 52,4 % paklaida, apskaičiuojant Kd.

 

Dirvožemio kiekis                         msoil = 10 g        Tirpalo tūris       V0=100cm3

 

maqads (eq)

Caqads (eq)

R

msads (eq)*

Csads (eq)*

R*

Kd*

R*

 

(μg x cm-3)

 

(μg)

(μg x g-1)

 

 

 

(μg)

 

 

 

 

 

 

 

 

mo=110 μg ar

 

 

 

A = 9 %

 

 

 

 

100

1,000

Tikroji

vertė

10

1,00

Tikroji

vertė

1

 

Co= 1,100

μg /cm3

 

 

 

 

 

 

 

 

101

1,010

1%

9

0,90

10%

0,891

10,9 %

 

105

1,050

5%

5

0,50

50%

0,476

52,4 %

 

109

1,090

9%

1

0,10

90%

0,092

90,8 %

mo=110 μg ar

 

 

 

A = 55 %

 

 

 

 

50,0

0,500

Tikroji

vertė

60,0

6,00

tikroji vertė

12,0

 

Co= 1,100

μg /cm3

50,5

0,505

1%

59,5

5,95

0,8 %

11,78

1,8 %

 

52,5

0,525

5%

57,5

5,75

4,0 %

10,95

8,8 %

 

55,0

0,550

10%

55,0

5,50

8,3 %

10,00

16,7 %

mo=110 μg ar

 

 

 

A = 99 %

 

 

 

 

1,100

0,011

tikroji vertė

108,9

10,89

tikroji vertė

990

 

Co= 1,100

μg /cm3

1,111

0,01111

1%

108,889

10,8889

0,01 %

980

1,0 %

 

1,155

0,01155

5%

108,845

10,8845

0,05 %

942

4,8 %

 

1,21

0,0121

10%

108,790

10,8790

0,10%

899

9,2 %

 

Čia:

msads (eq) = bandomosios medžiagos dirvožemio fazėje masė pusiausvyros sąlygomis, μg,

maqads (eq) = bandomosios medžiagos vandeninėje fazėje masė pusiausvyros sąlygomis, μg,

Csads (eq) = bandomosios medžiagos dirvožemio fazėje kiekis pusiausvyros sąlygomis, μg x g-1,

Caqads (eq) = bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija pusiausvyros sąlygomis, μg x cm-3,

R = analizinė paklaida nustatant maqads (eq),

R*= apskaičiuota paklaida dėl analizinės paklaidos R.

 

3 priedas

 

Kd VERTINIMO METODAI

 

1. Vertinimo metodai leidžia daryti Kd vertės prognozę, pagrįstą koreliacija, su, pvz., Pow vertėmis (12) (39) (63 – 68), tirpumo vandenyje duomenimis (12) (19) (21) (39) (68 – 73) ar poliškumo duomenimis, gautais taikant atvirkštinių fazių HPLC metodą (74 – 76). Kaip parodyta 1 ir 2 lentelėse, pagal tas lygtis apskaičiuojamos Koc ar Kom vertės ir vėliau netiesiogiai pagal šias lygtis apskaičiuojama Kd:

2. Šių koreliacijų koncepcija pagrįsta dviem prielaidomis: 1) dirvožemio organinė medžiaga, kuri daro didžiausią įtaką medžiagos adsorbcijai; ir 2) vykstančios sąveikos dažniausiai yra nepolinės. Todėl šios koreliacijos: 1) netinka arba tik iš dalies tinka polinėms medžiagoms, ir 2) netinka tais atvejais, kai organinės medžiagos dirvožemyje kiekis yra labai mažas (12). Be to, nors tarp P“„ ir adsorbcijos buvo nustatytos patenkinamos koreliacijos (19), to negalima pasakyti apie tirpumo vandenyje ir adsorbcijos laipsnio priklausomybę (19) (21); taigi tyrimai yra labai prieštaringi.

3. Kai kurie adsorbcijos koeficiento ir oktanolio-vandens pasiskirstymo koeficiento bei tirpumo vandenyje koreliacijų pavyzdžiai pateikti atitinkamai 1 ir 2 lentelėje.

1 lentelė. Adsorbcijos pasiskirstymo koeficiento ir oktanolio-vandens pasiskirstymo koeficiento koreliacijos pavyzdžiai; kiti pavyzdžiai pateikti (12) (68)

Medžiagos

Koreliacijos lygtys

Autoriai

Karbamido pakaitalai

log Kom = 0,69 + 0,52 log Pow

Briggs(1981)(39)

Chlorinti aromatiniai junginiai

log Koc = – 0,779 + 0,904 log Pow

Chiouetal. (1983) (65)

Įvairūs pesticidai

log Kom = 4,4 + 0,72 log Pow

Gerstl and Mingelgrin (1984) (66)

Aromatiniai angliavandeniliai

log Koc =-2,53+ 1,15 log Pow

Vowles and Mantoura (1987) (67)

2 lentelė. Adsorbcijos pasiskirstymo koeficiento ir tirpumo vandenyje koreliacijos pavyzdžiai; kiti pavyzdžiai pateikti (68), (69)

Junginiai

Koreliacijos lygtys

Autoriai

Įvairūs pesticidai

log Kom = 3,8 -0,561 log Sw

Gerstl and Mingelgrin (1984) (66)

Alifatinės, aromatinės chlorintos medžiagos

log Kom = (4,040 ±0,038)-(0,557 ±0,012) log Sw

Chiouetal. (1979) (70)

a – naftolis

log Koc = 4,273-0,686 log Sw

Hassetetal.(1981)(71)

Ciklinės, alifatinės aromatinės medžiagos

log Koc = – 1,405 – 0,921 log Sw -0,00953 (mp-25)

Karickhoff (1981) (72)

Įvairūs junginiai

log Kom = 2,75-0,45 log Sw

Moreale van Blade (1982) (73)

 

4 priedas

 

SKAIČIAVIMAI CENTRIFUGAVIMO SĄLYGOMS APIBRĖŽTI

 

1. Centrifugavimo trukmė nustatoma pagal šią formulę, darant prielaidą, kad dalelės yra rutulio formos:

Siekiant supaprastinti, visi paramerai yra išreikšti ne SI vienetais (g, cm).

Čia:

ω= sukimosi greitis (=2П x rpm/60), rad x s-1;

rpm= apsukų dažnis, min-1;

η = tirpalo klampumas, g x s-1 x cm-1;

rp = dalelių spindulys, cm;

ρs = dirvožemio tankis, g x cm-3;

ρaq = tirpalo tankis, g x cm-3;

Rt = nuotolis nuo centrifugos rotoriaus centro iki tirpalo centrifugavimo mėgintuvėlyje viršaus, cm;

Rb = nuotolis nuo centrifugos rotoriaus centro iki tirpalo centrifugavimo mėgintuvėlyje apačios, cm;

Rb – Rt = dirvožemio ir tirpalo mišinio stulpelio centrifugavimo mėgintuvėlyje ilgis, cm.

Kad būtų garantuotas visiškas atskyrimas, praktikoje taikoma trukmė dažniausiai yra dvigubai ilgesnė už apskaičiuotąją.

2. Pirmoji lygtis gali būti dar supaprastinta, darant prielaidą, kad tirpalo klampumas (η) ir tankis (ρaq) yra lygūs vandens klampumui ir tankiui 25 °C temperatūroje; taigi η = 8,95 x 10-3 g x s-1 x cm-1 ir ρa, = 1,0 g x cm-3.

Tuomet centrifugavimo trukmė išreiškiama 2 lygtimi:

3. Iš 2 lygties aišku, kad norint pasiekti tam tikro dydžio dalelių atsiskyrimą (mūsų atveju 0,1 μm spindulio) centrifugavimo sąlygoms, t. y. laikui (t) ir apsukų dažniui (min-1), apibrėžti yra svarbūs du parametrai: 1) dirvožemio tankis ir 2) mišinio stulpelio centrifugavimo mėgintuvėlyje ilgis (Rb – Rt), t. y. nuotolis, kurį dirvožemio dalelė įveikia nuo tirpalo viršaus iki mėgintuvėlio dugno; akivaizdu, kad tam tikro tūrio mišinio stulpelio mėgintuvėlyje ilgis priklauso nuo mėgintuvėlio spindulio, pakelto kvadratu.

4. 1 pav. pavaizduota centrifugavimo trukmės (t) priklausomybė nuo centrifugos apsukų dažnio (r.p.m, min-1), esant skirtingiems dirvožemių tankiams (ρs) (1a pav.) ir skirtingiems mišinio stulpelio centrifugavimo mėgintuvėlyje ilgiams (1b pav.). Iš 1a pav. matyti, kad dirvožemio tankio įtaka yra akivaizdi; pvz., tradicinis centrifugavimas 3000 min-1 dažniu trunka maždaug 240 min, kai dirvožemio tankis 1,2 g x cm-3, tuo tarpu ši trukmė yra tik 50 min, jei tankis 2,0 g x cm-3. Panašiai, pagal 1b pav., centrifuguojant tradiciniu 3000 min-1 dažniu, centrifugavimo trukmė yra maždaug 50 min, jei mišinio stulpelio ilgis lygus 10 cm, ir tik 7 min, jei ilgis lygus 1 cm. Tačiau svarbu rasti optimalų centrifugavimo sąlygų, kai turi būti kuo mažesnis stulpelio ilgis, ir galimybės bandymą atliekančiajam lengvai atskirti fazes po centrifugavimo santykį.

5. Be to, apibrėžiant bandymų sąlygas dirvožemio ir tirpalo fazėms atskirti, svarbu atsižvelgti į galimą trečios „pseudofazės“ koloidinių dalelių buvimą. Šios dalelės, kurios yra mažesnės negu 0,2 μm, gali daryti reikšmingą įtaką visam medžiagos adsorbcijos dirvožemio suspensija mechanizmui. Centrifuguojant taip, kaip aprašyta pirmiau, koloidinės dalelės lieka vandeninėje fazėje ir analizuojamos kartu su ja. Taigi prarandama informacija apie jų poveikį.

Jei bandymus atliekanti laboratorija turi ultracentrifugavimo ar ultrafiltravimo priemonių, medžiagos adsorbcija ir desorbcija dirvožemiu galėtų būti ištirta išsamiau, įskaitant informaciją apie medžiagos adsorbciją koloidinėmis dalelėmis. Šiuo atveju norint atskirti tris fazes: dirvožemį, koloidines daleles ir tirpalą, turi būti taikomas ultracentrifugavimas 60000 min-1 apsukų dažniu ar ultrafiltravimas pro filtrą, kurio akytumas 100 000 Daltonų. Atitinkamai turi būti pakeistas bandymų protokolas, kad visos trys fazės būtų išanalizuotos.

 

Centrifugos apsukų dažnis (min-1)

1a pav. Centrifugavimo trukmės (t) priklausomybė nuo centrifugos apsukų dažnio (min-1), esant skirtingam dirvožemio tankiui (ρs). Rt = 10 cm, Rb – Rt = 10 cm, η = 8,95 x 10-3 g x s-1 x cm-1 ir ρad = 1,0 g x cm-3 25 °C temperatūroje

Centrifugos apsukų dažnis (min-1)

1b pav. Centrifugavimo trukmės (t) priklausomybė nuo centrifugos apsukų dažnio (min-1), esant skirtingam mišinio stulpelio centrifugavimo mėgintuvėlyje ilgiui (Rb – Rt) = L; Rt = 10 cm, η = 8,95 x 10-3 g x s-1 x cm-1, ρaq = 1,0 g x cm-3 25 °C temperatūrai ir ρs = 2,0 g x cm-3

 

5 priedas

 

ADSORBCIJOS A (%) IR DESORBCIJOS D (%) APSKAIČIAVIMAS

 

Metodikai taikyta laiko schema:

Darant visus skaičiavimus taikoma prielaida, kad bandomoji medžiaga yra stabili, ir jos labai neadsorbuoja indo sienelės.

ADSORBCIJA A (A%)

a) Lygiagretusis metodas

Kiekvienam mėgintuvėliui (i) kiekvienu laiko momentu (ti) adsorbcijos procentinė dalis apskaičiuojama pagal lygtį:

[4]

Šios lygties nariai gali būti apskaičiuoti taip:

čia:

Ati = adsorbcijos procentinė dalis (%) laiko momentu t,

msads (ti) = dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė laiko momentu ti, kai buvo atliekama analizė (μg),

mo = bandymo pradžioje mėgintuvėlyje buvusios bandomosios medžiagos masė (μg),

Co= sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomojo tirpalo pradinė masės koncentracija (μg x cm-3),

Caqads (ti)= medžiagos vandeninės fazės masės koncentracija laiko momentu t, kai atliekama analizė (μg x cm-3); ši koncentracija nustatoma analizės būdu, atsižvelgiant į tuščiuosiuose bandymuose gautas vertes,

Vo= sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomojo tirpalo pradinis tūris (cm3).

Adsorbcijos procentinės dalies Ati ar Caqads (ti) vertės pažymimos grafike pagal laiką ir nustatomas sorbcijos pusiausvyros pasiekimo laikas. Tokių grafikų pavyzdžiai pateikti atitinkamai 1 pav. ir 2 pav.

1 pav. Adsorbcijos pusiausvyros grafikas

2 pav. Bandomosios medžiagos masės koncentracijos vandeninėje fazėje (Cm) kaita tam tikrą laiką

b) Nuoseklusis metodas

Toliau pateiktose lygtyse atsižvelgiama į tai, kad pagal adsorbcijos matavimo metodiką bandomosios medžiagos kiekis tam tikrais laiko tarpais nustatomas mažose vandeninės fazės alikvotinėse dalyse.

- Kiekvienam laiko tarpui dirvožemiu adsorbuotos medžiagos kiekis apskaičiuojamas taip:

- pirmajam laiko tarpui Δt1 = t1- to

- antrajam laiko tarpui Δt2 = t2 – t1

 

- trečiajam laiko tarpui Δt2 t3 = t3 – t2

- n-tajam laiko tarpui Δtn = tn – tn-1

 

- Kiekvienam laiko tarpui procentinė adsorbcijos dalis, AΔti apskaičiuojama pagal šią lygtį:

[5]

tuo tarpu procentinė adsorbcijos dalis (Ati) laiko momentu t apskaičiuojama pagal lygtį:

[6]

Adsorbcijos vertės Ati (arba atsižvelgiant į tai, kuri reikalinga tyrimui) pažymimos grafike pagal laiką ir nustatomas sorbcijos pusiausvyros

pasiekimo laikas.

Pusiausvyros pasiekimo laiku ti:

- dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė lygi:

[7]

- bandomosios medžiagos tirpale masė yra lygi:

[8]

- ir adsorbcijos procentinė dalis pusiausvyros sąlygomis yra lygi:

[9]

Pirmiau naudoti parametrai apibrėžiami kaip:

msads (t1), msads (t2),..., msads (tn)= bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu atitinkamai per laiko tarpus Δt1, Δt2,..., Δtn masė (μg),

mmads (t1), mmads (t2),..., mmads (tn)= alikvotinėje tirpalo dalyje VAa, atitinkamai laiko momentu t1, t2,..., tn nustatyta bandomosios medžiagos masė (μg),

msads (eq)= adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis dirvožemiu adsorbuotos medžiagos masė (μg),

maqads (eq)= adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis tirpale esančios medžiagos masė (μg),

VAa = alikvotinės dalies, kurioje nustatoma bandomoji medžiaga, turis (cm ),

AΔti = adsorbcijos, atitinkančios laiko tarpą Δti, procentinė dalis (%),

Aeq = adsorbcijos procentinė dalis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (%).

DESORBCIJA D (%)

Laikas to, kuris laikomas desorbcijos kinetikos bandymo pradžia, yra tas momentas, kai kuo didesnis išgauto bandomosios medžiagos tirpalo tūris (po to, kai pasiekiama adsorbcijos pusiausvyra) yra pakeičiamas tokiu pat 0,01 M CaCl2 tirpalo tūriu.

a) Lygiagretusis metodas

Laiko momentu ti matuojama masė bandomosios medžiagos, esančios iš mėgintuvėlio i paimtame vandeninės terpės tūryje (Vir), ir desorbuotos medžiagos masė apskaičiuojama pagal lygtį:

Desorbcijos pusiausvyros sąlygomis ti = teq, todėl per laiko tarpą (Δti) desorbuotos medžiagos masė nustatoma pagal lygtį:

Desorbcijos procentinė dalis apskaičiuojama:

- laiko momentu ti pagal lygtį:

- ir per laiko tarpą (Δti) pagal lygtį:

čia:

Dti = desorbcijos procentinė dalis laiko momentu ti (%),

DΔti = desorbcijos procentinė dalis, atitinkanti laiko tarpą Δti (%),

maqdes (ti)= laiko momentu ti desorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg),

maqdes (Δti) = per laiko tarpą Δti desorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg),

mmdes (ti) = bandomosios medžiagos, analizės būdu nustatytos laiko momentu ti analizei paimtame tirpalo tūryje Vir, masė (μg),

mAaq = bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl nevisiško tūrio pakeitimo, masė (μg):

maqads (eq)= tirpale esančios bandomosios medžiagos masė adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg),

VR= tirpalo virš nuosėdų, pašalinto iš mėgintuvėlio pasiekus adsorbcijos pusiausvyrą ir pakeisto tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo, tūris (cm3),

Vri = tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti atliekant desorbcijos kinetikos bandymą, tūris (cm3).

Desorbcijos vertės Dti arba DΔti (žiūrint, kuri reikalinga tyrimui) pažymimos pagal laiką grafike ir nustatomas desorbcijos pusiausvyros pasiekimo laikas.

b) Nuoseklusis metodas

Šiose lygtyse atsižvelgta į tai, kad anksčiau taikytoje adsorbcijos metodikoje bandomoji medžiaga buvo nustatinėjama nedidelėse vandeninės fazės alikvotinėse dalyse (VAa) (lygiagretusis metodas pagal 1.9 poskyrį „Bandymo eiga“). Daroma prielaida, kad: a) po adsorbcijos kinetikos bandymo iš mėgintuvėlio pašalintas tirpalas virš nuosėdų buvo pakeistas tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo (VR) ir b) sąlytyje su dirvožemiu esančios vandeninės fazės bendras tūris (VT) atliekant desorbcijos kinetikos bandymą yra pastovus ir apibrėžiamas lygtimi:

Laiko momentu į:

- bandomosios medžiagos masė matuojama mažame alikvotinės dalies tūryje VaD ir desorbuotos medžiagos masė apskaičiuojama pagal lygtį:

- desorbcijos pusiausvyros sąlygomis ti = teq, todėl maqdes (ti)= maqdes (eq),

- desorbcijos procentinė dalis Dti apskaičiuojama pagal šią lygtį:

Per laiko tarpą (Δti):

Per kiekvieną laiko tarpą desorbuotos medžiagos kiekis apskaičiuojamas taip:

- pirmajam laiko tarpui Δt1= t1-to

- antrajam laiko tarpui Δt2= t2-t1

- n-tajam laiko tarpui Δtn= tn-tn-1

Galiausiai desorbcijos procentinė dalis kiekvienam laiko tarpui DΔti apskaičiuojama pagal šią lygtį:

tuo tarpu desorbcijos procentinė dalis Dti laiko momentu ti nustatoma pagal lygtį:

Šiose lygtyse naudoti parametrai apibrėžiami kaip:

msdes (t1), msdes (t2),..., msdes (tn)=

medžiagos, kuri dar liko adsorbuota dirvožemiu pasibaigus atitinkamai laiko tarpams Δt1, Δt2,..., Δtn, masė (μg),

maqdes (t1), maqdes (t2),..., maqdes (tn)=

bandomosios medžiagos, desorbuotos atititinkamai per laiko tarpus Δt1, Δt2,..., Δtn, masė (μg),

 

mmdes (t1), mmdes (t2),.., mmdes (tn)=

medžiagos masė, nustatyta alikvotinės dalies tūryje VDa atitinkamai laiko momentais t1, t2,..., tn, (μg),

VT

=

vandeninės fazės, esančios sąlytyje su dirvožemiu atliekant desorbcijos kinetikos bandymą pagal nuoseklųjį metodą, bendras tūris (cm3),

mAaq

=

bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl ne visiško tūrio pakeitimo, masė (μg),

mAaq

=

VR

=

tirpalo virš nuosėdų, pašalinto iš mėgintuvėlio pasiekus adsorbcijos pusiausvyrą ir pakeisto tokiu pat tūriu 0,01 M CaCb tirpalo, tūris (cm3),

VDa

=

tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti, atliekant desorbcijos kinetikos bandymą, alikvotinės dalies tūris (cm3):

 

6 priedas

 

DIRVOŽEMIŲ ADSORBCIJA IR DESORBCIJA: DUOMENŲ PATEIKIMO LENTELĖS

 

Bandyta medžiaga:

Bandytas dirvožemis:

Sauso dirvožemio masės dalis (105 °C, 12 h):                                                                   %

Temperatūra:                                                                                                                      °C

 

 

Analizės metodo tinkamumas

Pasverta dirvožemio

g

 

Sauso dirvožemio masė

g

 

CaCl2 tirpalo tūris

cm3

 

Galutinio tirpalo vardinė koncentracija

μg x cm-3

 

Galutinio tirpalo analizinė koncentracija

μg x cm-3

 

 

Taikyto analizės metodo esmė:

Analizės metodo kalibravimas:

Bandyta medžiaga:

Bandytas dirvožemis:

Sauso dirvožemio masės dalis (105 °C, 12 h):                                                                   %

Temperatūra:                                                                                                                      °C

Taikytas analizės metodas:

Netiesioginis  Tiesioginis 

Lygiagretusis 

Nuoseklusis 

Adsorbcijos bandymas: bandiniai

 

Simbolis

Vienetai

Pusiausvyros nusistovėjimo laikas

Pusiausvyros nusistovėjimo laikas

Pusiausvyros nusistovėjimo laikas

Pusiausvyros nusistovėjimo laikas

Mėgintuvėlio Nr.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Pasverta dirvožemio

-

g

 

 

 

 

 

 

 

 

Sauso dirvožemio masė

msoil

g

 

 

 

 

 

 

 

 

Vandens tūris pasvertame dirvožemyje (apskaičiuotas)

VWS

cm3

 

 

 

 

 

 

 

 

0,01 M CaCl2 tirpalo tūris pusiausvyrai su dirvožemiu pasiekti Pradinio tirpalo tūris

 

cm3

 

 

 

 

 

 

 

 

Su dirvožemiu sąlytyje esančios vandeninės fazės bendras tūris

Vo

cm3

 

 

 

 

 

 

 

 

Bandomosios medžiagos tirpalo pradinė koncentracija

Co

μg x cm-3

 

 

 

 

 

 

 

 

Bandomosios medžiagos masė bandymo pradžioje

mo

μg

 

 

 

 

 

 

 

 

Po sumaišymo ir centrifugavimo

 

Netiesioginis metodas

 

Lygiagretusis metodas

Bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija, įskaitant tuščiojo bandymo pataisą

Caqads (ti)

μg x cm-3

 

 

 

 

 

 

 

 

Nuoseklusis metodas

VAa Alikvotinės tirpalo dalies tūryje išmatuota medžiagos masė

maqads (ti)

μg

 

 

 

 

 

 

 

 

Tiesioginis metodas

Dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė

msads (ti)

μg

 

 

 

 

 

 

 

 

Adsorbcijos apskaičiavimas

Adsorbcija

Ati

%

 

 

 

 

 

 

 

 

AΔti

%

 

 

 

 

 

 

 

 

Vidutinės vertės

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Adsorbcijos koeficientas

Kd

cm3 x g-1

 

 

 

 

 

 

 

 

Vidutinės vertės

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Adsorbcijos koeficientas

Koc

cm3 x g-1

 

 

 

 

 

 

 

 

Vidutinės vertės

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Bandyta medžiaga:

Bandytas dirvožemis:

Sauso dirvožemio masės dalis (105 °C, 12 h):                                                                   %

Temperatūra:                                                                                                                      °C

Adsorbcijos bandymas: tuštieji ir kontroliniai bandymai

 

Simbolis

Vienetai

Tuščiasis

bandymas

Tuščiasis

bandymas

Kontrolinis

bandymas

Mėgintuvėlio Nr.

 

 

 

 

 

 

 

 

Pasverta dirvožemio

 

g

 

 

 

 

0

0

Vandens tūris pasvertame dirvožemyje (apskaičiuotas)

 

cm3

 

 

 

 

 

 

Įpilto 0,01 M CaCl2 tirpalo tūris

 

cm3

 

 

 

 

 

 

Įpiltas bandomosios medžiagos pradinio tirpalo tūris

 

cm3

0

0

0

 

 

 

Bendras vandeninės fazės tūris (apskaičiuotas)

 

cm3

 

 

 

 

 

 

Pradinė bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija

 

μg x cm-3

 

 

 

 

 

 

Po sumaišymo ir centrifugavimo

Vandeninės fazės koncentracija

 

μg x cm-3

 

 

 

 

 

 

PASTABA. Prireikus stulpelių gali būti ir daugiau

 

Bandyta medžiaga:

Bandytas dirvožemis:

Sauso dirvožemio masės dalis (105 °C, 12 h):                                                                   %

Temperatūra:                                                                                                                      °C

Masių balansas

 

Simbolis

Vienetai

 

 

 

 

Mėgintuvėlio Nr.

 

 

 

 

 

 

Pasverta dirvožemio

-

g

 

 

 

 

Sauso dirvožemio masė

msoil

g

 

 

 

 

Vandens tūris pasvertame dirvožemyje (apskaičiuotas)

VWS

ml

 

 

 

 

0,01 M CaCk tirpalo tūris pusiausvyrai su dirvožemiu pasiekti

 

ml

 

 

 

 

Pradinio tirpalo tūris

 

cm3

 

 

 

 

Su dirvožemiu sąlytyje esančios vandeninės fazės bendras tūris

Vo

cm3

 

 

 

 

Bandomosios medžiagos tirpalo pradinė koncentracija

Co

μg x cm-3

 

 

 

 

Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė

-

h

 

 

 

 

Po sumaišymo ir centrifugavimo

bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija, skaitant tuščiojo bandymo pataisą

Caqads (eq)

μg x cm-3

 

 

 

 

'usiausvyros nusistovėjimo trukmė

taq

h

 

 

 

 

1-asis praskiedimas tirpikliu

Nupiltos vandeninės fazės tūris

Vrec

cm3

 

 

 

 

Įpilto tirpiklio tūris

ΔV

cm3

 

 

 

 

1-asis ekstraliavimas tirpikliu

Tirpiklio fazėje analizuojamos medžiagos signalas

Sb1

įv.

 

 

 

 

Tirpiklyje ištirpusios bandomosios medžiagos koncentracija

Cb1

μg x cm-3

 

 

 

 

Medžiagos, ekstrahuotos iš dirvožemio ir nuo indo sienelių, masė

mB1

μg

 

 

 

 

2-asis praskiedimas tirpikliu

Nupilto tirpiklio tūris

ΔVs

cm3

 

 

 

 

Įpilto tirpiklio tūris

ΔV‘

cm3

 

 

 

 

2-asis ekstraliavimas tirpikliu

Tirpiklio fazėje analizuojamos medžiagos signalas

Sb2

įv.

 

 

 

 

Tirpiklyje ištirpusios bandomosios medžiagos koncentracija

Cb2

μg x cm-3

 

 

 

 

Medžiagos, ekstrahuotos iš dirvožemio ir nuo indo sienelių, masė

mB2

μg

 

 

 

 

Dviejų etapų ekstrahuotos bandomosios medžiagos bendroji masė

mE

μg

 

 

 

 

Masių balansas

MB

%

 

 

 

 

 

Bandyta medžiaga:

Bandytas dirvožemis:

Sauso dirvožemio masės dalis (105 °C, 12 h):                                                                   %

Temperatūra:                                                                                                                      °C

Adsorbcijos izotermės

 

Simbolis

Vienetai

 

 

 

 

 

 

 

 

Mėgintuvėlio Nr.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Pasverta dirvožemio

-

g

 

 

 

 

 

 

 

 

Sauso dirvožemio masė

E

g

 

 

 

 

 

 

 

 

Vandens tūris pasvertame dirvožemyje (apskaičiuotas)

VWS

ml

 

 

 

 

 

 

 

 

0,01 M CaCk tirpalo tūris pusiausvyrai su dirvožemiu pasiekti

 

ml

 

 

 

 

 

 

 

 

Įpilto pradinio tirpalo tūris

 

cm3

 

 

 

 

 

 

 

 

Su dirvožemiu sąlytyje esančios vandeninės fazės bendras tūris (apskaičiuotas)

Vo

cm3

 

 

 

 

 

 

 

 

Tirpalo koncentracija Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė

Co

μg x cm-3

 

 

 

 

 

 

 

 

Po sumaišymo ir centrifugavimo

Bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija, įskaitant tuščiojo bandymo pataisą

Caqdes (eq)

μg x cm-3

 

 

 

 

 

 

 

 

Temperatūra

 

°C

 

 

 

 

 

 

 

 

Adsorbuotos medžiagos masė, tenkanti dirvožemio masės vienetui

Caqdes (eq)

μg x g-1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Regresijos analizė:

KFads vertė:

l/n vertė:

regresijos koeficientas r2:

Bandyta medžiaga: Bandytas dirvožemis:

Sauso dirvožemio masės dalis (105 °C, 12 h):                                                                   %

Temperatūra:                                                                                                                      °C

Taikytas analizės metodas:

Netiesioginis  Tiesioginis 

Lygiagretusis 

Nuoseklusis 

Desorbcijos bandymas

 

 

Simbolis

Vienetai

Laiko tarpas

Laiko tarpas

Laiko tarpas

Laiko tarpas

Mėgintuvėlio, gauto iš adsorbcijos etapo, Nr.

 

 

 

 

 

 

Adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis dirvožemio adsorbuotos medžiagos masė

msads (eq)

„g

 

 

 

 

Pašalintos vandeninės fazės tūris, pakeistas 0,01 M CaCl2

Vr

cm3

 

 

 

 

Su dirvožemiu sąlytyje esančios vandeninės fazės bendras tūris (apskaičiuotas)

LM

NM

Vo

VT

cm3

cm3

 

 

 

 

Bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl nevisiško tūrio pakeitimo, masė

mAaq

μg

 

 

 

 

Desorbcijos kinetika

Laiko momentu į nuo dirvožemio desorbuotos medžiagos išmatuota masė

 

mmdes (ti)

μg

 

 

 

 

Tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomajai medžiagai nustatyti, tūris

LM

Vir

cm3

 

 

 

 

NM

Vir

cm3

 

 

 

 

Laiko momentu ti nuo dirvožemio desorbuotos medžiagos masė (apskaičiuota)

maqdes (ti)

μg

 

 

 

 

Per laiko tarpą Δti nuo dirvožemio desorbuotos medžiagos masė (apskaičiuota)

maqdes (Δti)

μg

 

 

 

 

Desorbcijos procentinė dalis

Desorbcija laiko momentu ti

Dti

%

 

 

 

 

Desorbcija per laiko tarpą Δti

DΔti

%

 

 

 

 

Tariamas desorbcijos koeficientas

 

 

 

 

 

 

LM: lygiagretusis metodas

NM: nuoseklusis metodas

 

DIRVOŽEMIO IR NUOTEKŲ DUMBLO ADSORBCIJOS KOEFICIENTO (K“c) VERTINIMAS, TAIKANT DIDELIO EFEKTYVUMO SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJĄ (HPLC) (C.19.)

 

1 METODAS

Šis metodas yra OECD TG121 (2000) kopija.

 

1.1 ĮVADAS

Dirvožemio ar nuotekų dumblo medžiagų gebėjimą sorbuoti tam tikras medžiagas gali apibūdinti parametrai, nustatyti taikant C. 18 bandymų metodą. Svarbus parametras yra adsorbcijos koeficientas, kuris apibrėžiamas kaip medžiagos dirvožemyje ir dumble koncentracijos ir medžiagos vandeninės fazės koncentracijos santykis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis. Adsorbcijos koeficientas, normuotas pagal dirvožemio organinės anglies kiekį, Koc yra naudingas cheminės medžiagos ir dirvožemio bei nuotekų dumblo organinės medžiagos surišimo gebos rodiklis ir leidžia lyginti įvairias chemines medžiagas. Šis parametras gali būti įvertintas taikant koreliacijas su tirpumu vandenyje ir n-oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficientu (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).

Pagal aprašytą šio bandymo metodą, adsorbcijos dirvožemiu ir nuotekų dumblu koeficientui Koc nustatyti, naudojamas HPLC (8). Įverčiai yra patikimesni nei gauti pagal QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships – Kiekybinės struktūros ir aktyvumo sąsajos) apskaičiavimus (9). Kaip vertinimo metodas, jis negali visiškai pakeisti įkrovos pusiausvyros bandymų, atliekamų pagal C. 18 bandymų metodą. Tačiau įvertintas Koc gali būti naudingas tinkamiems bandymų parametrams pasirinkti adsorbcijai ir desorbcijai tirti pagal C. 18 bandymų metodą, apskaičiuojant Kd (pasiskirstymo koeficientą) ar Kf (Freundlicho adsorbcijos koeficientą) pagal 3 lygtį (žr. 1.2).

 

1.2 APIBRĖŽIMAI

Kd pasiskirstymo koeficientas apibrėžiamas kaip dviejų fazių sistemoje, sudarytoje iš sorbento (dirvožemio ar nuotekų dumblo) ir vandeninės fazės, ištirpintos bandomosios medžiagos pusiausvyros koncentracijos C santykis; jis yra bematis dydis, jei abiejų fazių koncentracija išreikšta masės ir masės koncentracija. Jei vandeninės fazės koncentracija išreikšta masės ir tūrio koncentracija, vienetas yra ml x g-1. Kį gali skirtis priklausomai nuo sorbento savybių ir gali priklausyti nuo koncentracijos.

čia:

Csoil = bandomosios medžiagos dirvožemyje koncentracija pusiausvyros sąlygomis (μg x g-1),

Csludge = bandomosios medžiagos dumble koncentracija pusiausvyros sąlygomis (μg x g-1),

Caq = bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija pusiausvyros sąlygomis (μg x g-1, μg x ml-1).

Kf: Freundlicho adsorbcijos koeficientas yra apibrėžiamas kaip bandomosios medžiagos dirvožemyje ar nuotekų dumble koncentracija (x/m), kai vandeninės fazės pusiausvyros koncentracija Caq lygi vienetui; vienetai yra μg x g-1 sorbento. Vertė gali skirtis priklausomai nuo sorbento savybių.

čia:

x/m = kiekis x (μg) bandomosios medžiagos, pusiausvyros sąlygomis adsorbuotos sorbentu, kurio kiekis m (g),

1/n = Freundlicho adsorbcijos izotermės lygties nuožulnumo koeficientas,

Caq, = bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija pusiausvyros sąlygomis (μg x ml-1).

Kai Caq= l;logKf=log x/m

Koc: pasiskirstymo koeficientas (Kd) arba Freundlicho adsorbcijos koeficientas (Kf), normalizuoti pagal sorbento organinės anglies kiekį (foc); ypač nejoninėms cheminėms medžiagoms jis yra apytikris medžiagos ir sorbento adsorbcijos laipsnio rodiklis ir leidžia lyginti skirtingas chemines medžiagas. Pagal tai, kokios yra Kd ir Kf dimensijos, Koc gali būti bematis arba jo vienetai yra ml x g-1 ar μg x g-1 organinės medžiagos.

Koc ir Kd santykis nėra visuomet tiesiškas, taigi įvairių dirvožemių Koc vertės gali būti skirtingos, tačiau jų kintamumas yra daug mažesnis, lyginant su Kd ar Kf verčių kintamumu.

Adsorbcijos koeficientas (Koc) nustatomas iš sulaikymo veiksnio (k1), naudojant pasirinktų etaloninių medžiagų log k1 pagal log Koc kalibracinį grafiką.

čia:

tR: bandomosios ir etaloninės medžiagos sulaikymo trukmė HPLC metodu (minutės)

to: eliuento sulaikymo trukmė (dead time) HPLC metodu (minutės) (žr. 1.8.2).

Pow: oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficientas apibrėžiamas kaip medžiagos n-oktanolio tirpalo ir vandens tirpalo koncentracijos santykis; jis yra bematis dydis.

 

1.3 ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Prieš taikant metodą, reikia žinoti struktūrinę formulę, grynumą ir disociacijos konstantą (jei reikia). Vertinga yra tirpumo vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, oktanolio ir vandens koeficiento pasiskirstymo, hidrolizės duomenų informacija.

Išmatuotiems bandomosios medžiagos HPLC sulaikymo duomenims ir jos adsorbcijos koeficientui Koc susieti turi būti gauta log Koc, pagal log k', kalibracinė kreivė. Turi būti panaudoti ne mažiau kaip šeši etaloniniai taškai, bent vienas jų – žemiau nuo laukiamos bandomosios medžiagos vertės ir vienas – aukščiau šios vertės. Metodo tikslumas labai padidėja, jei naudojamos etaloninės medžiagos struktūra yra panaši į bandomosios medžiagos. Jei tokių duomenų nėra, vartotojas gali pats pasirinkti atitinkamas kalibravimo medžiagas, todėl reikia turėti įvairios cheminės struktūros medžiagų rinkinį. Rekomenduojamos naudoti medžiagos ir nuotekų dumblo Koc vertės yra pateiktos 1 priedo 1 lentelėje, o dirvožemio – 3 lentelėje. Kitų kalibravimo medžiagų pasirinkimą reikia pagrįsti.

 

1.4 BANDYMO METODO ESMĖ

Tyrimas HPLC metodu atliekamas analizinėse kolonėlėse, užpildytose komerciniu būdu gaunamos cianpropilo kietosios fazės, su lipofilinėmis ir pūlinėmis grupėmis. Naudojama vidutinio poliškumo nejudančioji (stacionari) fazė, nešiklis – silicio dioksidas:

- O – Si

- CH2 – CH2 – CH2

- CN

silicio dioksidas

neopolinė tarpinė grupė

polinė grupė

 

Bandymo metodo esmė yra panaši į A.8 bandymo metodo (pasiskirstymo koeficientas, HPLC metodas; Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais) esmę. Bandomajai medžiagai einant per kolonėlę kartu su judamąja faze, vyksta medžiagos ir nejudamosios fazės sąveika. Dėl pasiskirstymo tarp judančiosios ir nejudančiosios fazių, sulėtinamas bandomosios medžiagos slinkimas. Nejudančioji (stacionari) fazė sudaryta iš polinių ir nepolinių grupių, vyksta jos sąveika su molekulės polinėmis ir nepolinėmis grupėmis, panašiai kaip ir bendrosios organinės medžiagos, kurios nešiklis yra dirvožemis ar nuotekų valymo dumblas. Taip galima nustatyti sąsają tarp kolonėlės sulaikymo trukmės ir adsorbcijos ant organinės medžiagos koeficiento.

Didelės įtakos sorbcijai turi pH, ypač polinių medžiagų. Žemės ūkio paskirties dirvožemio ar nuotekų valymo įrenginių talpyklų turinio pH dažniausiai yra 5,5-7,5. Jei medžiagos gali jonizuotis, tai naudojant tinkamus buferinius tirpalus turi būti atliekami du bandymai, medžiagai esant joninio ir nejoninio pavidalo, tačiau tik tais atvejais, jei bandomosios medžiagos disociacijos laipsnis yra bent 10 %, kai pH yra nuo 5,5 iki 7,5.

Kadangi vertinimui naudojama HPLC kolonėlės sulaikymo trukmės ir adsorbcijos koeficiento priklausomybė, nereikia jokio kiekybinio analizės metodo, būtina nustatyti tik sulaikymo trukmę. Jei yra tinkamas etaloninių medžiagų rinkinys ir galima naudoti standartines bandymo sąlygas, metodas leidžia greitai ir veiksmingai įvertinti adsorbcijos koeficientą Koc.

 

1.5 METODO TAIKYMAS

HPLC metodas taikomas cheminėms medžiagoms (nežymėtoms ar žymėtoms), kurioms galima pritaikyti tinkamą aptikimo sistemą (pvz., spektrofotometrą, radioaktyvumo detektorių) ir kurios yra gana stabilios vykdant bandymą. Jis gali būti ypač naudingas cheminėms medžiagoms, sunkiai tiriamoms kitomis bandymų sistemomis (t. y. lakioms medžiagoms; medžiagoms, kurių tirpumas yra mažesnis nei analiziškai nustatoma koncentracija; medžiagoms, kurių giminingumas inkubavimo sistemų paviršiams yra didelis). Metodas gali būti taikomas mišiniams, kurių išplovimo juostos neatsiskirta. Tokiu atveju turi būti nurodyta mišinio junginių viršutinė ir apatinė log Koc verčių riba.

Kartais priemaišos gali trukdyti interpretuojant HPLC rezultatus, tačiau jos nėra tokios svarbios, jei bandomoji medžiaga gali būti analiziškai aiškiai identifikuota ir atskirta nuo priemaišų.

Metodas patikrintas, naudojant priedo 1 lentelėje išvardytas medžiagas, taip pat juo buvo tiriamos įvairios šių klasių medžiagos:

- aromatiniai aminai (pvz., trifluralinas, 4-chloranilinas, 3,5-dinitroanilinas, 4-metilanilinas, N-metilanilinas, 1-naftilaminas),

- aromatinių karboninių rūgščių esteriai (pvz., benzenkarboksirūgšties metilesteris, 3,5-dinitrobenzenkarboksirūgšties etilesteris),

- aromatiniai angliavandeniliai (pvz., toluenas, ksilenas, etilbenzenas, nitrobenzenas),

- ariloksifenoksipropano rūgšties esteriai (pvz., diklofopmetilas, fenoksapropetilas, fenoksaprop-P-etilas),

- fungicidai benzimidazolo ir imidazolo pagrindu (pvz., karbendazimas, fuberidazolas, triazoksidas),

- karboksirūgščių amidai (pvz., 2-chlorbenzamidas, N,N-dimetilbenzamidas, 3,5-dinitrobenzamidas, N-metilbenzamidas, 2-nitrobenzamidas, 3 -nitrobenzamidas),

- chlorinti angliavandeniliai (pvz., endosulfanas, DDT, heksachlorbenzenas, kvintozenas, 1,2,3-trichlorbenzenas),

- fosforo organiniai insekticidai (pvz., azinfosmetilas, disulfotonas, fenamifosas, izofenfosas, pirazofosas, sulprofosas, triazofosas),

- fenoliai (pvz., fenolis, 2-nitrofenolis, 4-nitrofenolis, pentachlorfenolis, 2,4,6-trichlorfenolis, 1-naftolis),

- fenilkarbamido dariniai (pvz., izoproturonas, monolinuronas, pencikuronas),

- pigmentiniai dažai (pvz., rūgštusis geltonas 219, bazinis mėlynas 41, tiesioginis raudonas 81),

- poliaromatiniai angliavandeniliai (pvz., acenaftenas, naftalenas),

- herbicidai 1,3,5-triazino pagrindu (pvz., prometrinas, propazinas, simazinas, terbutrinas),

- triazolo dariniai (pvz., tebukonazolas, triadimefonas, tradimenolis, triapentenolis).

Metodas netinka medžiagoms, reaguojančioms su eliuentu ar su nejudančiąja faze. Jis taip pat netinka medžiagoms, kurios su neorganiniais komponentais reaguoja specifiniu būdu (pvz., su molio mineralais sudaro klasterinius kompleksinius junginius). Metodas gali netikti paviršiaus aktyviosioms medžiagoms, neorganiniams junginiams ir vidutinio stiprumo ar stiprioms organinėms rūgštims ir bazėms. Galima nustatyti log Koc vertes 1,5-5,0 diapazone. Jonizuojamos medžiagos turi būti matuojamos naudojant buferinę judančiąją fazę, tačiau reikia žiūrėti, kad nesusidarytų buferinio tirpalo komponentų ar bandomosios medžiagos nuosėdų.

 

1.6 KOKYBĖS KRITERIJAI

1.6.1. Tikslumas

Dažniausiai bandomosios medžiagos adsorbcijos koeficientas gali būti įvertintas ± 0,5 log vieneto tikslumu, lyginant su verte, nustatyta įkrovos pusiausvyros metodu (žr. 1 priedo lentelėj. Galima pasiekti didesnį tikslumą, jei naudota etaloninė medžiaga ir bandomoji medžiaga yra panašios cheminės struktūros.

 

1.6.2. Pakartojamumas

Nustatymas turi būti atliekamas bent du kartus. Atskirų matavimų log Koc turi skirtis mažiau kaip 0,25 log vieneto.

 

1.6.3. Atkuriamumas

Iki šiol sukauptas patyrimas taikant šį metodą, patvirtina jo pagrįstumą. Kai HPLC metodas buvo ištirtas panaudojus 48 medžiagas (daugiausia pesticidus), kurioms yra patikimi adsorbcijos dirvožemiu Koc duomenys, gautas koreliacijos koeficientas R = 0,95 (10) (11).

Metodui tobulinti ir jo pagrįstumui patvirtinti buvo atliktas tarplaboratorinio palyginimo bandymas, dalyvaujant 11 laboratorijų (12). Rezultatai pateikti priedo 2 lentelėje.

 

1.7 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.7.1. Pirminis adsorbcijos koeficiento {vertinimas

Kaip adsorbcijos laipsnį nusakantys rodikliai, ypač nejonizuotų medžiagų, gali būti naudojami oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficientas Pow (=Kow) ir tam tikras tirpumas vandenyje, taigi jie gali būti naudojami nuspėti pirminį etapą. Kelioms cheminių medžiagų grupėms buvo paskelbta nemažai naudingų koreliacijų (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).

 

1.7.2. Aparatūra

Būtina turėti skysčių chromatografą su nepulsuojančiu siurbliu ir atitinkamu detektavimo įtaisu (detektoriumi). Rekomenduojama naudoti injekcijos (mėginio įvedimo) vožtuvą ir injekcijos kilpą. Naudojamos komercinės cianpropilo dervos, chemiškai surištos su silicio dioksido nešikliu (pvz., Hypersil ir Zorbax CN). Tarp injekcijos sistemos ir analizės kolonėlės galima įtaisyti tos pačios medžiagos apsauginę kolonėlę. Skirtingų tiekėjų kolonėlių skiriamoji galia gali labai skirtis. Vadovautis reikėtų šiomis sulaikymo veiksnių k' vertėmis: log k' > 0,0, jei log Koc = 3,0, ir log k' > 0,4, jei log Koc = 2,0, jei judančiąją faze naudojamas metanolio ir vandens 55/45 % mišinys.

 

1.7.3. Judančiosios fazės

Buvo bandytos kelios judančiosios fazės, rekomenduoti galima šias dvi:

- metanolio ir vandens (55/45 % v/v) mišinį,

- metanolio ir 0,01 M citratinio buferio pH 6,0 (55/45 % v/v) mišinį.

Eliuavimo tirpikliui paruošti naudojamas HPLC grynumo metanolis ir distiliuotas vanduo ar citratinis buferinis tirpalas. Prieš naudojant, mišinys nudujinamas. Turi būti taikomas izokratinis eliuavimas. Jei metanolio ir vandens mišiniai netinka, galima išmėginti kitus organinio tirpiklio ir vandens mišinius, pvz., etanolio ir vandens ar acetonitrilo ir vandens mišinius. Tiriant jonizuojamas medžiagas, rekomenduojama pH vertei stabilizuoti naudoti buferinį tirpalą. Reikia stengtis nesudaryti sąlygų susidaryti druskų nuosėdoms ir nesugadinti kolonėlės, taip gali atsitikti su kai kuriais organinės fazės ir buferinio tirpalo mišiniais.

Negalima naudoti priedų, pvz., jonų porų reagentų, nes jie gali veikti nejudamosios fazės sorbcines savybes. Tokie nejudamosios fazės pokyčiai gali būti negrįžtami. Dėl šios priežasties privaloma, kad bandymai, naudojant priedus, būtų atliekami atskirose kolonėlėse.

 

1.7.4. Tirpiniai

Bandomoji ir etaloninės medžiagos turi būti ištirpintos judamojoje fazėje.

 

1.8 BANDYMO EIGA

1.8.1. Bandymo sąlygos

Matuojant turi būti registruojama temperatūra. Norint užtikrinti nekintamas sąlygas, kolonėlę rekomenduojama laikyti termostatuojamoje kameroje, kai atliekami kalibravimo, vertinimo ir bandomosios medžiagos matavimai.

 

1.8.2. Eliuento sulaikymo trukmės to nustatymas

Eliuento sulaikymo trukmei nustatyti galima taikyti du skirtingus metodus (žr. taip pat 1.2).

1.8.2.1. Eliuento sulaikymo trukmės nustatymas naudojant homologines serijas

Įrodyta, kad šiuo metodu gaunamos patikimos ir etaloninės to vertės. Detalės pateiktos A.8 bandymo metodo – „Pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolis ir vanduo), HPLC metodas“ – aprašyme (Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais).

1.8.2.2. Eliuento sulaikymo trukmė nustatoma naudojant inertiškas medžiagas, kurių nesulaiko kolonėlė

Metodas pagrįstas formamido, karbamido ar natrio nitrato tirpalų įvedimu. Matavimai turi būti atliekami mažiausiai du kartus.

 

1.8.3. Sulaikymo trukmės tR nustatymas

Etaloninės medžiagos turi būti parinktos taip, kaip aprašyta 1.3 poskyryje. Norint nustatyti jų sulaikymo trukmę, medžiagos gali būti įvestos kaip mišrusis etalonas, jei buvo patvirtinta, kad kiekvieno etaloninio standarto sulaikymo trukmei kiti esantys etaloniniai standartai įtakos neturi. Kalibruoti būtina nuolat, mažiausiai du kartus per dieną, kad būtų galima atsižvelgti į netikėtus kolonėlės veikimo pokyčius. Gera praktika reikalauja, kad kalibravimo tirpalų įvedimas būtų atliekamas prieš ir po bandomosios medžiagos įvedimo, siekiant patvirtinti, kad sulaikymo trukmės poslinkio neįvyko. Bandomosios medžiagos kaip galima mažesniais kiekiais (kad būtų išvengta kolonėlės perkrovos) įvedamos atskirai ir nustatoma jų sulaikymo trukmė.

Norint didinti matavimo patikimumą, turi būti atliekami mažiausiai du matavimai. Atskirų matavimų log Koc turi skirtis mažiau kaip 0,25 log vieneto.

 

1.8.4. Įvertinimas

Pagal eliuento sulaikymo trukmę to ir pasirinktų etaloninių medžiagų tR, taikant 4 lygtį, apskaičiuojami sulaikymo veiksniai k' (žr. 1.2). Etaloninių medžiagų log k' duomenys brėžiami grafike pagal jų log Koc vertes, gautas įkrovos pusiausvyros bandymuose ir pateiktas priedo 1 ir 3 lentelėse. Pagal šį grafiką gauta bandomosios medžiagos log k' vertė yra naudojama jos log Koc vertei nustatyti. Jei gauti rezultatai rodo, kad bandomosios medžiagos log Koc yra už kalibravimo intervalo ribų, bandymą reikia pakartoti, naudojant kitas, tinkamesnes etalonines medžiagas.

 

2. DUOMENYS IR ATASKAITA

Ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:

- bandomosios ir etaloninės medžiagos identifikavimas bei jų grynumas ir, jei reikia, pKa vertės,

- įrangos ir darbo sąlygų aprašymas, pvz., analizinės (ir apsauginės) kolonėlės tipas bei matmenys, detektavimo priemonės, judamoji fazė (komponentų santykis ir pH), bandymų temperatūros diapazonas atliekant matavimus,

- eliuento sulaikymo trukmė ir jo nustatymo metodas,

- į kolonėlę įvestų bandomosios ir etaloninių medžiagų kiekiai,

- kalibravimui naudotų etaloninių medžiagų slinkimo sulėtinimo trukmė,

- regresijos kreivės detalės (log k' pagal log Koc) ir šios kreivės grafikas,

- vidutiniai sulaikymo duomenys ir įvertinta bandomosios medžiagos log Koc vertė,

- chromatogramos.

 

3. NUORODOS

1) W. J. Lyman, W. F. Reehl D. H. Rosenblatt (ed). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, McGraw-Hill New York.

2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Koc) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67.

3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefScients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29,1050 – 1059 p.

4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol, 17, 227 – 231 p.

5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19,297 – 312 p.

6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, 831 – 832 p.

7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, 833 – 846 p.

8) W. Kordel D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121 – 128 p.

9) M. Mueller, W. Kordel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), 2493 -2504 p.

10) W. Kordel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), 2341 – 2352 p.

11) B. von Oepen, W. Kordel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22,285 – 304 p.

12) W. Kordel G. Kotthoff, J. Muller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373-1384 p.

 

Priedas

 

1 LENTELĖ

Dirvožemių ir nuotekų dumblų Koc verčių ir HPLC atrankos metodu apskaičiuotų verčių palyginimas1,2

Medžiaga

CAS Nr.

Nuotekų dumblų log Koc

log Koc HPLC

Δ

Dirvožemių log Koc

log Koc HPLC

Δ

Atrazinas

1912-24-9

1,66

2,14

0,48

1,81

2,20

0,39

Linuronas

330-55-2

2,43

2,96

0,53

2,59

2,89

0,30

Fentionas

55-38-9

3,75

3,58

0,17

3,31

3,40

0,09

Monuronas

150-68-5

1,46

2,21

0,75

1,99

2,26

0,27

Fenantrenas

85-01-8

4,35

3,72

0,63

4,09

3,52

0,57

Fenilbenzoatas

93-99-2

3,26

3,03

0,23

2,87

2,94

0,07

Benzamidas

55-21-0

1,60

1,00

0,60

1,26

1,25

0,01

4-nitrobenzamidas

619-80-7

1,52

1,49

0,03

1,93

1,66

0,27

Acetanilidas

103-84-4

1,52

1,53

0,01

1,26

1,69

0,08

Anilinas

62-53-3

1,74

1,47

0,27

2,07

1,64

0,43

2,5-dichloranilinas

95-82-9

2,45

2,59

0,14

2,55

2,58

0,03

1 W. Kordel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121 – 128 p.

2 W. Kordel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), 107 -119 p.

 

2 LENTELĖ

Tarplaboratorinio palyginamojo bandymo (11 dalyvaujančių laboratorijų), atlikto HPLC metodui patobulinti ir pagrįstumui patvirtinti, rezultatai1

Medžiaga

CAS Nr.

log Koc (OECD 106)

Koc

log Koc

[HPLC metodas]

Atrazinas

1912-24-9

1,81

78 ±16

1,89

Monuronas

150-68-5

1,99

100 ±8

2,00

Triapentenolis

77608 – 88 – 3

2,37

292 ± 58

2,47

Linuronas

330-55-2

2,59

465 ± 62

2,67

Fentionas

55-38-9

3,31

2062 ± 648

3,31

1 W. Kordel, G. Kotthoff, J. Muller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring tęst. Chemosphere, 30(7), 1373-1384 p.

 

3 LENTELĖ

Rekomenduojamos etaloninės medžiagos HPLC atrankos metodui, parinktos pagal jų adsorbcijos dirvožemiu duomenis

Etaloninė medžiaga

CAS Nr.

log Koc vidutinės vertės, gautos iš įkrovos pusiausvyros tyrimo duomenų

Koc duomenų skaičius

log S.D.

Šaltinis

Acetanilidas

103-84-4

1,25

4

0,48

a

Fenolis

108-95-2

1,32

4

0,70

a

2-Nitrobenzamidas

610-15-1

1,45

3

0,90

b

N,N-dimetilbenzamidas

611-74-5

1,52

2

0,45

a

4-Metilbenzamidas

619-55-6

1,78

3

1,76

a

Metilbenzoatas

93-58-3

1,80

4

1,08

a

Atrazinas

1912-24-9

1,81

3

1,08

c

Izoproturonas

34123-59-6

1,86

5

1,53

c

3-Nitrobenzamidas

645-09-0

1,95

3

1,31

b

Anilinas

62-53-3

2,07

4

1,73

a

3,5-dinitrobenzamidas

121-81-3

2,31

3

1,27

b

Karbendazimas

10605-21-7

2,35

3

1,37

c

Triadimenolis

55219-65-3

2,40

3

1,85

c

Triazoksidas

72459-58-6

2,44

3

1,66

c

Triazofosas

24017-47-8

2,55

3

1,78

c

Linuronas

330-55-2

2,59

3

1,97

c

Naftalenas

91-20-3

2,75

4

2,20

a

Endosulfandiolis

2157-19-9

3,02

5

2,29

c

Metiokarbas

2032-65-7

3,10

4

2,39

c

Rūgštusis geltonas 219

63405 – 85 – 6

3,16

4

2,83

a

1,2,3-trichlorobenzenas

87-61-6

3,16

4

1,40

a

Y-HCH

58-89-9

3,23

5

2,94

a

Fentionas

55-38-9

3,31

3

2,49

c

Tiesioginis raudonasis 81

2610-11-9

3,43

4

2,68

a

Pirazofosas

13457-18-6

3,65

3

2,70

c

a-Endosulfanas

959-98-8

4,09

5

3,74

c

Dichlofopmetilas

51338-27-3

4,20

3

3,77

c

Fenantrenas

85-01-8

4,09

4

3,83

a

Bazinis mėlynasis 41 (mišinys)

26850-47-5 12270-13-2

4,89

4

4,46

a

DDT

50-29-3

5,63

1

 

b

a W. Kordel, J. Muller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D Report No 106 01 044 (1994).

b B.V. Oepen, W. Kordel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22,285 – 304 p.

c Pramonės pateikti duomenys.

 

DAPHNIA MAGNA REPRODUKCIJOS BANDYMAS (C. 20.)

 

1. METODAS

Šis toksiškumo reprodukcijai bandymo metodas yra OECD TG 211 (1998) kopija.

 

1.1 ĮVADAS

Pagrindinis šio bandymo tikslas – įvertinti cheminių medžiagų poveikį Daphnia magna reprodukcijai.

 

1.2 APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI

Motininiai gyvūnai – nuo bandymo pradžios naudojamos moteriškosios lyties dafnijos (motininiai gyvūnai), kurių yra tiriamas reprodukcijos našumas.

Palikuonys – atliekant bandymą išsiritusios (produkuotos) dafnijos.

Mažiausia pastebimo poveikio koncentracija (LOEC) – mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis per nustatytą veikimo laikotarpį yra statistiškai reikšmingas reprodukcijai ir motininių gyvūnų gaištamumui (p<0,05), lyginant su kontroliniais bandymais. Tačiau visų didesnių LOEC bandomųjų koncentracijų poveikio kenksmingos pasekmės turi būti lygios ar didesnės negu bandomosios medžiagos LOEC poveikio pasekmės. Jei šios dvi sąlygos negali būti įvykdytos, turi būti pateiktas išsamus paaiškinimas, kodėl buvo pasirinkta LOEC (taigi ir NOEC).

Nepastebimo poveikio koncentracija (NOEC) – bandomoji koncentracija bent kiek mažesnė už LOEC, kurios poveikis per nustatytą veikimo laikotarpį nėra statistiškai reikšmingas (p < 0,05), lyginant su kontroliniais bandymais.

EC, – vandenyje ištirpintos bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant Daphnia magna reprodukcija per nustatytą veikimo laikotarpį sumažėja x %.

Būdingasis prieaugio greitis – yra populiacijos augimo matas, apimantis reprodukcijos našumą ir amžiui būdingą gaištamumą (20) (21) (22). Stacionarios būsenos populiacijų jis yra lygus nuliui. Augančių populiacijų yra teigiamas, o nykstančių populiacijų – neigiamas. Aišku, kad pastarosios yra neilgaamžės ir galiausiai išnyksta.

Aptikimo riba – mažiausia koncentracija, kai medžiagą galima aptikti, bet neįmanoma nustatyti kiekybiškai.

Nustatymo riba- mažiausia kiekybiškai nustatoma koncentracija.

Gaištamu mas – gyvūnas laikomas žuvusiu, kai jis nejuda, t.y. kai negali plaukti arba kai, 15 s lengvai papurčius bandymų indą, nepastebima judant galūnių ar pilvelio. (Jei taikomas kitas apibrėžimas, jis turi būti pateiktas kartu su jo nuoroda.)

 

1.3 BANDYMO METODO ESMĖ

Jaunos moteriškosios lyties dafnijos (motininiai gyvūnai), kurių amžius bandymo pradžioje mažesnis kaip 24 h, yra veikiamos bandomosios medžiagos tam tikrų koncentracijų tirpalais. Bandymo trukmė 21 para. Baigus bandymą įvertinamas vienam gyvam motininiam gyvūnui tenkančių gyvų palikuonių bendras skaičius. Jaunikliai, kurie žūva per bandymą, į skaičiavimus neįtraukiami. Motininių gyvūnų reprodukcijos našumą galima išreikšti kitais būdais (pvz., gyvų palikuonių, produkuotų vieno gyvūno per parą nuo pirmos palikuonių pastebėjimo dienos, skaičiumi), tačiau ataskaitoje šie skaičiai turi būti pateikiami papildomai prie bendro gyvų jauniklių skaičiaus, bandymo pabaigoje tenkančio vienam motininiam gyvūnui. Mažiausiai pastebimo poveikio koncentraciją (LOEC) ir nepastebimo poveikio koncentraciją (NOEC) norint nustatyti, bandomąja medžiaga veikiamų gyvūnų reprodukcijos našumas lyginamas su kontrolinio (-ių) bandinio (-ių) našumu. Be to, kiek įmanoma, duomenys analizuojami, naudojant regresijos modelį, kad būtų galima įvertinti koncentraciją, kuriai esant reprodukcijos našumas sumažėtų x % (t. y. EC50, EC20 ar EC10).

Ataskaitoje taip pat turi būti nurodytas motininių gyvūnų išlikimo laipsnis ir pirmosios vados atsiradimo laikas. Gali būti ištirti kiti bandomąja medžiaga veikiami parametrai, pvz., augimas (pvz., ilgis) ir galbūt būdingasis prieaugio greitis.

 

1.4 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ

Reikėtų turėti su Daphnia magna atlikto trumpalaikio toksiškumo bandymo (žr. „Ūminis toksinis poveikis dafnijoms“, Žin., 2002, Nr. 81-3493) rezultatus. Rezultatas gali būti naudingas, parenkant atitinkamą reprodukcijos bandymų bandomųjų koncentracijų diapazoną. Turėtų būti žinomas bandomosios medžiagos tirpumas vandenyje ir garų slėgis, be to, nustatant bandomosios medžiagos tirpalų koncentracijos kiekį, turi būti prieinamas patikimas analizės metodas, kurio tikslumas ir nustatymo riba yra žinomi.

Informacija apie bandomąją medžiagą galinti būti vertinga nustatant bandymo sąlygas, ji apima struktūrinę formulę, medžiagos grynumą, stabilumą šviesoje, stabilumą bandymo sąlygomis, pKa, Pow ir lengvo biolologinio skaidomumo bandymo rezultatus (žr. „Lengvo“ biologinio skaidomumo nustatymas“, Žin., 2002, Nr. 81-3493 ).

 

1.5 BANDYMO PAGRĮSTUMAS (PATIKIMUMAS)

Metodas yra pagrįstas, jei atliekant kontrolinį (-ius) bandymą (-us), įvykdomi šie veiksmingumo kriterijai:

- bandymo pabaigoje motininių gyvūnų gaištamumas (moteriškosios lyties dafnijų) yra ne didesnis kaip 20 %;

- iš vieno iki bandymo pabaigos išgyvenusio motininio gyvūno gautų gyvų palikuonių vidutinis skaičius yra > 60.

 

1.6 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.6.1. Aparatūra

Bandymų indai ir kita aparatūra, su kuria liečiasi bandomieji tirpalai, turi būti pagaminti vien tik iš stiklo ar kitos chemiškai inertinės medžiagos. Bandymams dažniausiai naudojamos laboratorinės stiklinės. Be to, yra reikalingi šie prietaisai arba jų dalys:

- deguonies matuoklis (su mikroelektrodu ar kitas tinkamas prietaisas, skirtas matuoti ištirpusį deguonį mažo tūrio bandiniuose),

- atitinkama aparatūra, skirta palaikyti pastovią temperatūrą,

- pH metras,

- įranga, skirta nustatyti vandens kietumą,

- įranga, skirta nustatyti bendrosios organinės anglies koncentraciją (BOA) ar įranga, skirta nustatyti cheminį deguonies suvartojimą (ChDS) vandenyje,

- tinkama aparatūra apšvietimo režimui kontroliuoti ir šviesos intensyvumui matuoti.

 

1.6.2 Bandymų organizmai

Dažniausiai rekomenduojama naudoti rūšis yra Daphnia magna Straus. Galima naudoti kitas dafnijų rūšis, jei jos atitinka nustatytus patikimumo kriterijus (dafnijų rūšiai turi būti taikomas su kontrolinių bandinių reprodukcijos našumu susijęs patikimumo kriterijus). Jei naudojamos kitos dafnijų rūšys, jos turi būti aiškiai apibrėžtos ir jų naudojimas turi būti įteisintas.

Kloną geriau būtų identifikuoti pagal genotipą. Tyrimas (1) parodė, kad A klono (jo kilmė – IRCHA (Institut de Recherche en Chimie Appliquee), Prancūzija) (3) reprodukcijos našumas visą laiką atitinka pagrįstumo kriterijų, pagal kurį vieno išlikusio gyvo motininio gyvūno ir auginamo šiame metode aprašytomis sąlygomis vidutinis palikuonių skaičius yra > 60. Tačiau priimtini ir kiti klonai, jei parodoma, kad dafnijų kultūra atitinka bandymo pagrįstumo kriterijus.

Bandymo pradžioje gyvūnai turi būti jaunesni kaip 24 h ir palikuonių karta neturi būti pirmoji. Jie turi būti gauti iš sveiko kamieno (t. y. be streso požymių, pvz., didelio mirtingumo, vyriškosios lyties atstovų ir ephippia buvimo, vėlavimo produkuoti pirmąją vadą, pasikeitusios gyvūnų spalvos ir t. t.). Kamieno gyvūnai turi būti laikomi tokiomis sąlygomis (šviesa, temperatūra, terpė, maitinimas ir gyvūnų skaičius tūrio vienetui), kurios būtų panašios į bandymo sąlygas. Jei bandymui naudota auginimo terpė skiriasi nuo įprastos dafnijų auginimo terpės, norint išvengti motininių gyvūnų streso, gera praktika reikalauja leisti dafnijoms, dažniausiai maždaug per tris savaites (t. y. vienos kartos laikotarpį), aklimatizuotis.

 

1.6.3 Bandymų terpė

Rekomenduojama šiems bandymams naudoti visiškai apibrėžtą terpę. Taip galima išvengti sunkiai apibūdinamų priedų (pvz., jūros dumblių, dirvožemio ekstrakto ir 1.1.) naudojimo, taigi pagerėja tarplaboratorinio standartizavimo galimybės. Buvo nustatyta, kad geriausiai tinka Elendt M4 (4) ir M7 terpės (žr. 1 priedą). Tačiau yra priimtinos ir kitos terpės (pvz., (5) (6)), jei jose išauginta dafnijų kultūra atitinka bandymui nustatytus pagrįstumo kriterijus.

Jei naudojamos tokios terpės, kuriose yra neapibrėžtų priedų, šie priedai turi būti aiškiai apibūdinti ir bandymų ataskaitoje turi būti informacija apie jų sudėtį, ypač apie organinės anglies kiekį, nes tai gali būti tiekiamo maisto dalis. Rekomenduojama nustatyti organinio priedo pradinio tirpalo bendrąją organinę anglį (BOA) ir (ar) cheminį deguonies suvartojimą (ChDS) ir įvertinti jų indėlį į paruoštos terpės BOA ir ChDS. Rekomenduojama, kad terpės (t.y. prieš pridedant dumblių) BOA lygis būtų mažesnis negu 2 mg/l (7).

Bandant metalų turinčias medžiagas, svarbu suprasti, kad bandomosios terpės savybės (pvz., kietumas, chelatų susidarymo geba) gali turėti įtakos bandomosios medžiagos toksiškumui. Dėl šios priežasties pageidautina turėti visiškai apibrėžtą terpę. Tačiau vienintelės, visiškai apibrėžtos terpės, kurios, kiek šiandien žinoma, tiktų ilgą laiką auginti Daphnia magna, yra Elendt M4 ir M7. Abiejose terpėse esama chelatų susidarymo agento EDTA.

Darbas (2) parodė, kad, reprodukcijos bandymą atliekant M4 ir M7 terpėje, kadmio „tariamasis toksiškumas“ dažniausiai yra mažesnis, lyginant su EDTA neturinčia terpe. Taigi M4 ir M7 terpių nerekomenduojama naudoti, bandant metalų turinčias medžiagas, taip pat reikėtų vengti naudoti terpes, turinčias žinomų chelatų susidarymo agentų. Metalų turinčioms medžiagoms patartina naudoti kitą terpę, pvz., ASTM (American Society for Testing and Materials) dirbtinį gėlą vandenį (7) be EDTA, į kurį pridėta jūros dumblių ekstrakto (8). Šis ASTM dirbtinio gėlo vandens ir jūros dumblių ekstrakto derinys taip pat tinka ilgą laiką auginti ir bandyti Daphnia magna (2), nors dėl jūros dumblių ekstrakto organinio komponento vis tiek pasireiškia nedidelis chelatuojantis veikimas.

Bandymo pradžioje ir visą bandymą ištirpusio deguonies koncentracija turi būti didesnė negu 3 mg/l. pH vertė turi būti 6 – 9 ir atliekant bet kurį bandymą, ji dažniausiai neturi kisti daugiau kaip 1,5 vieneto. Rekomenduojamas 140 mg/l (pagal CaCO3) vandens kietumas. Bandymai, atlikti esant šiam ar aukštesniam lygiui, parodė, kad reprodukcijos našumas atitinka pagrįstumo kriterijus (9) (10).

 

1.6.4. Bandomieji tirpalai

Parinktos koncentracijos bandomieji tirpalai dažniausiai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradinius tirpalus geriau ruošti tirpinant medžiagą bandymų terpėje.

Kartais, norint gauti tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą, gali tekti naudoti organinius tirpiklius ar disperguojančius priedus, tačiau reikia stengtis šių medžiagų nenaudoti, jei tik įmanoma. Tinkami tirpikliai yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Tinkamos disperguojančios medžiagos yra Cremophor RH40, 0,01 % metilceliuliozė ir HCO-40. Bet kuriuo atveju bandomosios medžiagos bandomojo tirpalo koncentracija neturi būti didesnė negu tirpumo bandymų terpėje riba.

Tirpikliai naudojami, ruošiant pradinį tirpalą, kuris gali būti tiksliai dozuojamas į vandenį. Jei pirmiau išvardyti tirpikliai galutinėje bandymų terpėje būna rekomenduojamos koncentracijos (t. Y.<0,1 ml/l), jie nebus toksiški ir dažniausiai nepadidins bandomosios medžiagos tirpumo vandenyje.

Disperguojančios medžiagos gali padėti tiksliai dozuoti ir disperguoti. Kai pirmiau išvardytos disperguojančios medžiagos galutinėje bandymų terpėje bus rekomenduojamos koncentracijos (< 0,1 ml/l), jos nebus toksiškos ir nepadidins medžiagos tirpumo vandenyje.

 

1.7 BANDYMO PLANAS

Bandymų indai paskirstomi pagal apdorojimo būdus, o toliau visi bandymų indai turi būti tvarkomi atsitiktiniu būdu. Taip nedarant, gali atsirasti nukrypimų, kurie galėtų būti aiškinami kaip koncentracijos poveikio pasekmė. Ypač, jei bandymo vienetai tvarkomi tokia seka, kokia jie buvo apdoroti, arba, atsižvelgiant į koncentraciją, kai kurie su laiku susiję veiksniai, pvz., operatoriaus nuovargis ar kita klaida, esant didesnėms koncentracijos vertėms, gali turėti rimtesnių pasekmių. Be to, jei bandymo rezultatus gali veikti bandymo pradinės ar aplinkos, pvz., padėties laboratorijoje, sąlygos, reikėtų svarstyti blokinį bandymo planą.

 

1.8 BANDYMO EIGA

1.8.1. Veikimo sąlygos

1.8.1.1. Trukmė

Bandymo trukmė — 21 para.

1.8.1.2. Įkrova

Motininiai gyvūnai laikomi atskirai po vieną bandymų inde su 50 — 100 ml terpės.

Kartais, atsižvelgiant į reikalavimus nustatant bandomąją medžiagą, gali būti reikalingas didesnis tūris, nors atliekant cheminę analizę leidžiama kartu supilti tos pačios koncentracijos bandinius. Jei naudojamas didesnis negu 100 ml tūris, gali tekti padidinti dafnijų pašaro davinį, kad turimo pašaro pakaktų ir būtų garantuota pagrįstumo kriterijų atitiktis. Dinaminiams bandymams dėl techninių priežasčių galima numatyti alternatyvius bandymo planus (pvz., keturias grupes po 10 gyvūnų didesniame bandymo tūryje), tačiau visi bandymo plano pakeitimai turi būti nurodyti ataskaitoje.

1.8.1.3. Gyvūnų skaičius

Atliekant pusiau statinius bandymams, kiekvienai koncentracijai imama bent 10 atskirai laikomų gyvūnų ir bent 10 atskirai laikomų gyvūnų kontrolinės serijos bandymams.

Buvo parodyta, kad dinaminiams bandymams kiekvienai koncentracijai tinka naudoti 40 gyvūnų, padalytų į keturias grupes po 10 gyvūnų (1). Galima naudoti mažiau bandomųjų organizmų, bet kiekvienai koncentracijai rekomenduojama naudoti ne mažiau kaip po 20 gyvūnų, padalytų į du ar daugiau indų su vienodu gyvūnų skaičiumi (pvz., į keturis indus po 5 dafnijas kiekviename). Jei atliekant bandymus su grupėmis laikomais gyvūnais, motininiai gyvūnai žūva, reprodukcijos našumo bus neįmanoma išreikšti kaip bendro gyvų palikuonių skaičiaus, tenkančio vienam bandymo pabaigoje gyvam motininiam gyvūnui. Tuomet reprodukcijos našumas išreiškiamas kaip „bendras skaičius gyvų palikuonių, tenkantis vienam bandymo pradžioje buvusiam gyvūnui“.

1.8.1.4. Maitinimas

Atliekant pusiau statinius bandymus gyvūnus geriau šerti kasdien, tačiau ne mažiau kaip tris kartus per savaitę (tai atitinka terpės keitimą). Nukrypimai nuo šių sąlygų (pvz., dinaminių bandymų) nurodomi ataskaitoje.

Atliekant bandymą motininių gyvūnų pašarą turėtų sudaryti šių gyvų dumblių ląstelės: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata (11)) ir Scenedesmus subspicatus. Tiekiamas pašaras turėtų būti apskaičiuotas pagal organinės anglies (C) kiekį, duodamą kiekvienam motininiam gyvūnui. Tyrimas (12) parodė, kad pvz., Daphnia magna pakanka gauti 0,1 – 0,2 mg C vienai dafnijai per parą, kad būtų pasiektas bandymo patikimumo kriterijus, atitinkantis palikuonių skaičių. Pašarą galima tiekti vienodai visą bandymo laiką ar, jei taip reikalaujama, mažiau bandymo pradžioje ir vis daugiau per bandymą, atsižvelgiant į motininių gyvūnų augimą. Šiuo atveju visą laiką davinys turi atitikti rekomenduotą 0,1 – 0,2 mg C kiekį vienai dafnijai per parą.

Jei šėrimo lygiui nustatyti naudojami pakeičiantys supaprastinti parametrai, pvz., dumblių ląstelių skaičius ar tariamasis suspensijos optinis tankis (t. y. kad būtų patogiau, nes anglies kiekiui nustatyti reikia daug laiko), kiekviena laboratorija turi sudaryti savo nomogramą, kuri tokį supaprastintą parametrą susietų su anglies kiekiu dumbliuose (nomogramos sudarymas, žr. 2 priedą). Nomogramas būtina tikrinti bent kartą per metus ir dažniau, jei kinta dumblių auginimo sąlygos. Buvo nustatyta, kad tariamasis suspensijos optinis tankis yra geresnis anglies kiekio nustatymą pakeičiantis parametras negu ląstelių skaičius (13).

Dafnijos šeriamos koncentruota dumblių suspensija, kad į bandymų indus pilamos kultūros tūris būtų kuo mažesnis. Dumbliams koncentruoti galima naudoti centrifugavimą ir pakartotinį suspendavimą distiliuotame, dejonizuotame vandenyje ar dafnijų kultūros terpėje.

1.8.1.5. Šviesa

16 h trukmės apšvietimas, kurio intensyvumas ne didesnis kaip 15 — 20 μE x m-2 x s-1.

1.8.1.6. Temperatūra

Bandymų terpės temperatūra turi būti 18-22 °C. Tačiau, jei įmanoma, atliekant visus bandymus tokia temperatūra neturėtų kisti daugiau kaip 2 °C (pvz., 18-20, 19-21 ar 20-22 °C). Temperatūros kontrolei galima skirti papildomą bandymų indą.

1.8.1.7. Aeravimas

Atliekant bandymą bandomieji tirpalai neaeruojami.

 

1.8.2. Bandomoji koncentracija

Dažniausiai naudojamos bent penkios bandomosios koncentracijų vertės, sudarančios geometrinę progresiją, kurios daugiklis būtų ne didesnis kaip 3,2. Kiekvienai bandomosios koncentracijos vertei daromas atitinkamas skaičius lygiagrečiųjų bandymų (žr. 1.8.1.3 skirsnį). Jei naudojamos mažiau kaip penkios koncentracijų vertės, tai reikia pagrįsti. Bandomosioms medžiagoms neturi būti parenkamos koncentracijos, didesnės už jų tirpumo bandymų terpėje ribą.

Nustatant koncentracijų diapazoną būtina žinoti:

i) jei tikslas – nustatyti LOEC ir NOEC, mažiausia bandomoji koncentracija turi būti pakankamai maža, kad ją naudojant vaisingumas, lyginant jį su kontroliniu bandymu nebūtų pastebimai mažesnis. Jei taip nėra, bandymą reikia pakartoti su dar mažesne mažiausia koncentracija,

ii) jei tikslas – nustatyti LOEC ir NOEC, didžiausia bandomoji koncentracija turi būti pakankamai didelė, kad ją naudojant vaisingumas, lyginant jį su kontroliniu bandymu būtų pastebimai mažesnis. Jei taip nėra, bandymą reikia pakartoti su dar didesne didžiausia koncentracija,

iii) jei vertinama reprodukciją veikianti ECX, jai apibrėžti atitinkamu pasikliovimo lygiu patartina naudoti pakankamą koncentracijos verčių skaičių. Jei vertinama reprodukciją veikianti EC50, patartina, kad didžiausia bandomoji koncentracija būtų didesnė už šią EC50. Priešingu atveju, nors EC50 vis dar galima įvertinti, EC50 pasikliovimo intervalas būtų labai platus, ir gali būti neįmanoma patenkinamai įvertinti parinkto modelio tinkamumo,

iv) reikėtų vengti į bandomosios koncentracijos verčių diapazoną įtraukti koncentracijos vertes, kurios būtų statistiškai reikšmingos suaugusių gyvūnų išlikimui, nes taip pasikeistų bandymo esmė, ir jis iš paprasto reprodukcijos bandymo taptų sudėtinio reprodukcijos ir gaištamumo bandymu, kuriam reikalinga daug sudėtingesnė statistinė analizė.

Tinkamas bandomąsias koncentracijas parinkti turėtų padėti anksčiau gautos žinios apie bandomąją medžiagą (pvz., trumpalaikio toksiškumo ir (ar) diapazono nustatymo tyrimų duomenys).

Jei bandomiesiems tirpalams ruošti naudojamas tirpiklis ar disperguojanti pagalbinė medžiaga (žr. 1.6.4 skirsnį), jų galutinė koncentracija visuose bandymų induose turi būti vienoda ir ne didesnė negu 0,1 ml/l.

 

1.8.3 Kontroliniai bandymai

Be bandomosios medžiagos bandymų serijos, atliekama viena bandymų terpės kontrolinių bandymų serija ir, jei reikia, viena tirpiklio ar disperguojančios medžiagos kontrolinių bandymų serija. Naudojamo tirpiklio ar disperguojančios medžiagos koncentracija turi būti tokia, kokia yra induose su bandomąja medžiaga. Turi būti atliekamas atitinkamas lygiagrečiųjų bandymų skaičius (žr. 1.8.1.3 skirsnį).

Jei bandymų serija atliekama tinkamai, kontrolinio (-ių) bandymo (-ų) variacijos ties vidutine motininio gyvūno produkuotų palikuonių verte koeficientas turi būti < 25 %, ir jis turi būti nurodomas bandymo planams su atskirai laikomais gyvūnais.

 

1.8.4 Bandymų terpės atnaujinimas

Bandymų terpės atnaujinimo dažnis priklauso nuo bandomosios medžiagos, tačiau ji turėtų būti atnaujinama ne mažiau kaip tris kartus per savaitę. Jei pagal išankstinius stabilumo bandymus (žr. 1.4) bandomosios medžiagos koncentracija per ilgiausią (t. y. trijų parų) atnaujinimo laikotarpį yra nestabili (t. y. yra už 80 – 120 % vardinės koncentracijos ribų ar yra mažesnė negu 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), reikėtų numatyti dažnesnį terpės atnaujinimą arba naudoti dinaminį bandymo metodą.

Kai reikia atnaujinti pusiau statinių bandymų terpę, paruošiama antra bandymų indų serija, ir įjuos perkeliami motininiai gyvūnai naudojant, pvz., tinkamo skersmens stiklinę pipetę. Su Daphnia pernešamos terpės tūris turi būti kuo mažesnis.

 

1.8.5 Matavimai

Stebėjimų rezultatai, gauti atliekant bandymą, registruojami duomenų lentelėse (žr. 3 ir 4 priedo pavyzdžius). Jei reikalingi kiti matavimai (žr. 1.3 ir 1.8.8), gali būti atitinkamai reikalingi papildomi stebėjimai.

 

1.8.6 Palikuonys

Kiekvieno motininio gyvūno palikuonis patartina atskirti ir skaičiuoti kasdien nuo pirmosios vados atsiradimo, kad jie nevartotų suaugusiems gyvūnams skirto maisto. Pagal šį metodą reikia skaičiuoti tik gyvus palikuonis, tačiau taip pat reikia registruoti neapvaisintų kiaušinių ar negyvų palikuonių skaičių.

 

1.8.7 Gaištamumas

Motininių gyvūnų gaištamumą patartina registruoti kasdien, bent jau tuomet, kai skaičiuojami palikuonys.

 

1.8.8. Kiti parametrai

Nors šis metodas iš esmės yra skirtas vertinti reprodukcijos rezultatus, galima kiekybiškai įvertinti ir kitus rezultatus, kad būtų įmanoma jų statistinė analizė. Pageidautina, kad būtų matuojamas augimas, nes jis suteikia informacijos apie galimus subletalius rezultatus, kurie gali būti naudingesni negu vien tik reprodukcijos matavimas; baigiant bandymą rekomenduojama išmatuoti motininių gyvūnų ilgį (t. y. kūno ilgį, išskyrus analinį dyglį). Kiti parametrai, kuriuos galima išmatuoti ar apskaičiuoti, yra pirmosios vados (ir vėlesnių vadų) atsiradimo laikas, vieno gyvūno vadų skaičius ir dydis, neapvaisintų kiaušinėlių skaičius, vyriškosios lyties atstovų ar ephippia buvimas ir populiacijos prieaugio būdingasis greitis.

 

1.8.9 Analizinių nustatymų ir kitų matavimų dažnis

Deguonies koncentracija, temperatūra, kietumas ir pH vertės turi būti matuojamos bent kartą per savaitę prieš ir po terpės atnaujinimo ir induose su didžiausia bandomosios medžiagos koncentracija ir atliekant kontrolinį (-ius) bandymą (-us).

Atliekant bandymą, bandomosios medžiagos koncentracijos vertės nustatomos reguliariais laiko tarpais.

Jei pusiau statiniuose bandymuose daroma prielaida, kad bandomosios medžiagos koncentracija lieka vardinės koncentracijos ± 20 % vertės (t. y. 80 -120 %, žr. 1.4 ir 1.8.4), rekomenduojama nustatyti bent didžiausią ir mažiausią bandomąją koncentraciją iš karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jį atnaujinant pirmąją bandymo savaitę (t. y. turi būti atliekama to paties tirpalo mėginių analizė iš karto po tirpalo paruošimo ir jį atnaujinant). Vėliau tokia analizė turi būti kartojama bent kas savaitę.

Jei yra tokių bandymų, kuriuos atliekant nesitikima, kad koncentracija liks vardinės koncentracijos ± 20 % vertės, būtina analizuoti visų koncentracijos verčių bandomuosius tirpalus iš karto po jų paruošimo ir prieš pat atnaujinant. Bandymuose, kur išmatuota pradinė bandomosios medžiagos koncentracija nepatenka į (± 20) % vardinės vertės diapazoną, bet galima gauti pakankamai įrodymų, kad pradinės koncentracijos vertės yra pakartojamos ir stabilios (t. y. 80 – 120 % pradinės koncentracijos verčių), antrą ar trečią bandymo savaitę cheminių analizių skaičių galima sumažinti ir apsiriboti didžiausios ir mažiausios bandomosios koncentracijos nustatymu. Visais atvejais prieš atnaujinimą turi būti daromas tik vieno lygiagretaus kiekvienos koncentracijos bandymo bandomosios koncentracijos nustatymas.

Jei atliekamas dinaminis bandymas, tinka pusiau statinių bandymų bandinių ėmimo režimas (bet „senų“ tirpalų analizės šiuo atveju nebėra). Tačiau, norint patikrinti bandomosios koncentracijos verčių stabilumą, patartina pirmąją savaitę bandinius imti dažniau (pvz., trims matavimų serijoms). Šio tipo bandymuose skiediklio srautas ir bandomoji medžiaga turi būti kontroliuojami kasdien.

Jei yra įrodymų, kad bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymą gali būti išlaikyta vardinės koncentracijos ar išmatuotos pradinės koncentracijos vertės ± 20%, rezultatai gali būti išreikšti, remiantis vardinėmis arba išmatuotomis pradinėmis vertėmis. Jei vardinės ar išmatuotos pradinės koncentracijos nuokrypis yra didesnis kaip ± 20 %, rezultatai turėtų būti išreiškiami kaip laiko svorinis vidurkis (žr. 5 priedą).

 

2. DUOMENYS IR ATASKAITA

2.1 REZULTATŲ APDOROJIMAS

Šio bandymo tikslas – nustatyti, kokį poveikį daro bandomoji medžiaga bendrajam palikuonių kiekiui, kuriuos produkuoja kiekvienas iki bandymo pabaigos išlikęs gyvas motininis gyvūnas. Bendras vieno motininio gyvūno palikuonių skaičius apskaičiuojamas pagal kiekvieno bandymų indo duomenis (t. y. lygiagrečiojo bandymo). Jei, atliekant bandymą, kuriame nors inde motininis gyvūnas nugaišta arba pasirodo, kad yra vyriškosios lyties, lygiagretusis bandymas iš analizės pašalinamas. Tuomet analizė bus atliekama remiantis mažesniu skaičiumi lygiagrečiųjų bandymų.

Norint įvertinti LOEC, taigi ir NOEC, susijusią su cheminės medžiagos poveikiu reprodukcijai, būtina apskaičiuoti visų kiekvienos koncentracijos lygiagrečiųjų bandymų vidutinį reprodukcijos našumą ir grupinį liekamąjį standartinį nuokrypį. Tai galima atlikti, taikant dispersinę analizę. Toliau kiekvienos koncentracijos vidutinė vertė turi būti palyginta su kontrolinio bandymo vidutine verte, taikant atitinkamą daugybinio lyginimo metodą. Gali būti naudingi Dunnetto ar Williamso kriterijai (14) (15) (16) (17). Būtina patikrinti, ar taikant dispersinę analizę galioja sklaidos homogeniškumo prielaida. Rekomenduojama tai daryti grafiškai, o ne taikant formalų reikšmingumo kriterijų (18); tinkama alternatyva būtų Bartletto kriterijus. Jei ši prielaida negalioja, reikėtų numatyti duomenų transformavimą, homogenizuojant sklaidas, ar atlikti svorinę dispersinę analizę. Tai daryti prieš atliekant dispersinę analizę. Taikant dispersinę analizę, aptinkamo poveikio dydis (t. y. mažiausias reikšmingas skirtumas) turi būti apskaičiuotas ir pateiktas ataskaitoje.

Koncentracijai, kuri sukeltų reprodukcijos našumo sumažėjimą 50 % (t. y. EC5o), įvertinant pagal duomenis, turi būti pritaikyta tinkama kreivė, pvz., logistinė kreivė, taikant statistinį, pvz., mažiausių kvadratų, metodą. Kreivė galėtų būti sudalyta taip, kad EC5o ir jos standartinė paklaida būtų įvertinta tiesiogiai. Taip būtų lengviau apskaičiuoti EC50 pasikliovimo rėžius. Jei nėra svarbių priežasčių, kodėl turėtų būti naudojami kiti pasikliovimo lygiai, turi būti nurodytos dvipusės 95 % pasikliovimo ribos. Pritaikymo metodika turėtų numatyti būdą, kaip įvertinti atitikties nebuvimo reikšmingumą. Tai galima padaryti grafiškai arba liekamąją kvadratų sumą padalijus į „atitikties nebuvimo“ dalį ir „grynos paklaidos komponentų“ dalį. Tuomet galima atlikti atitikties nebuvimo reikšmingumo tikrinimą. Esant apdorojimo atvejų, dėl kurių vaisingumas būna didelis, gali būti didesnė jauniklių skaičiaus sklaida negu tuomet, kai yra apdorojimo atvejų, dėl kurių vaisingumas būna mažas. Reikėtų atsižvelgti į galimybę taikyti svorinius koeficientus, kad būtų galima atspindėti skirtingų apdorojimo grupių skirtingą sklaidą (žr. (18) nuorodą, kurioje yra pateikti teoriniai pagrindai).

Analizuojant galutinio tarplaboratorinio bandymo duomenis (2), logistinė kreivė buvo pritaikyta imant šį modelį, nors galima taikyti ir kitus tinkamus modelius:

Čia:

Y – bendras jauniklių skaičius, tenkantis vienam gyvam motininiam gyvūnui bandymo pabaigoje (apskaičiuotas kiekvienam indui),

X – medžiagos koncentracija,

C – laukiamas jauniklių skaičius, kai x = 0,

X0 – populiacijos EC50,

b – krypties koeficiento parametras.

Šis modelis turėtų tikti daugeliui situacijų, tačiau pasitaiko bandymų, kuriems jis netinka. Reikėtų patikrinti modelio pagrįstumą, kaip užsiminta pirmiau. Kai kuriais atvejais gali tikti Hormesis modelis, kurį taikant būna didesnis mažų koncentracijos verčių poveikis (19).

Gali būti įvertintos kitos poveikio koncentracijos vertės, pvz., EC10 ar EC20, bet nustatant modelio parametrus geresnis gali pasirodyti kitas būdas, o ne tas, kuris buvo naudotas įvertinant EC5o.

 

2.2 BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje turi būti:

 

2.2.1. Bandomoji medžiaga

- fizinė būsena ir atitinkamos fizinės bei cheminės savybės;

- cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynumą.

 

2.2.2. Bandymo gyvūnai

- klonas (jei nustatytas jo genotipas), tiekėjas ar šaltinis (jei žinomas) ir taikytos auginimo sąlygos. Jei naudojama ne Daphnia magna rūšis, tai turi būti nurodyta ataskaitoje ir pagrįsta.

 

2.2.3. Bandymo sąlygos

- naudota bandymo metodika (pvz., pusiau statinis ar dinaminis bandymas, tūris, įkrova ir dafnijų skaičius litre);

- apšvietimo trukmė ir šviesos intensyvumas;

- bandymo planas (pvz., lygiagrečiųjų bandymų skaičius, vieno lygiagrečiojo bandymo motininių gyvūnų skaičius);

- naudotos auginimo terpės išsamus apibūdinimas;

- organinės medžiagos priedai, jei naudoti, įskaitant sudėtį, šaltinį, ruošimo metodą, pradinių tirpalų BOA ir ChDS, gautų bandymo terpės BOA ir ChDS verčių įvertinimas;

- išsami informacija apie šėrimą, įskaitant pašaro kiekį (mg C/Daphnia/parai) ir programa (pvz., pašaro (-ų) tipas, įskaitant, jei tai dumbliai, specialųjį pavadinimą (rūšį) ir, jei žinomas, kamieną, auginimo sąlygas);

- pradinių tirpalų paruošimo metodas ir atnaujinimo dažnumas (tirpiklis ar disperguojanti medžiaga, jei naudojami, ir jų koncentracija).

 

2.2.4. Rezultatai

- visų išankstinių bandomosios medžiagos stabilumo tyrimų rezultatai,

- bandomosios koncentracijos vardinės vertės ir analizių rezultatai, reikalingi bandymų induose nustatant medžiagos kiekį (žr. 4 priedo duomenų lentelių

pavyzdžius); taip pat ataskaitoje pateikiamas metodo tikslumas ir nustatymo riba,

- vandens kokybė bandymų induose (t. y. pH, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, BOA ir (ar) ChDS bei kietumas, jei reikia) (žr. 3 priedą,

duomenų lentelės pavyzdys),

- išsamus kiekvieno motininio gyvūno gyvų palikuonių registravimas (žr. 3 priedą, duomenų lentelės pavyzdys),

- nugaišusių motininių gyvūnų skaičius ir diena (žr. 3 priedą, duomenų lentelės pavyzdys),

- kontrolinių bandinių vaisingumo variacijos koeficientas (pagrįstas bendruoju gyvų palikuonių skaičiumi, tenkančiu vienam iki bandymo pabaigos

gyvam išlikusiam motininiam gyvūnui),

- vienam iki bandymo pabaigos gyvam išlikusiam motininiam gyvūnui tenkančio gyvų palikuonių bendro skaičiaus (kiekvienam tuo pat metu atliekamam

bandiniui) ir bandomosios medžiagos koncentracijos grafikas,

- mažiausia stebimo poveikio reprodukcijai koncentracija (LOEC), įskaitant taikytų statistinių metodikų aprašymą ir nurodymą, kokio dydžio poveikio

pasekmių gali būti aptikta, ir nepastebimo poveikio reprodukcijai koncentracija (NOEC); jei tinka, taip pat turi būti pateikta motininių gyvūnų gaištamumo LOEC ir NOEC,

- jei reikia, reprodukcijos ECX ir pasikliovimo intervalai bei ją apskaičiuoti taikyto modelio grafikas, dozės ir atsako kreivės krypties koeficientas, jos

standartinė paklaida,

- kiti stebėti biologiniai rezultatai ar matavimai: pateikiami visi kiti pastebėti ar matuoti biologiniai rezultatai (pvz., motininių gyvūnų augimas), įskaitant

kiekvieno iš jų pagrindimą,

- bet kokio nukrypimo nuo bandymo metodo pagrindimas.

 

3. NUORODOS

1)OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University,UK,20-21 March 1993.

2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.

3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C, Soares A. M. V. M. and Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicology and Environmental Safety, 21,257 – 265 p.

4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154,25-33 p.

5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4 – 90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.

6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol.,47, 775-782 p.

7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 p.

8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Lokke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), 144 – 148 p.

9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity Testwith Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol, 26, 1 – 8 p.

10) Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water ąuality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol, 120(2), 185-196 p.

11) Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F – 1990. Biologice Prace, 36,209.

12) Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a Standard Daphnia juvenile production tęst. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 2053-2058 p.

13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128,459 – 466 p.

14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc, 50,1096 – 1121 p. (15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20,482 — 491 p.

16) Williams D. A. (1971). A Test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103 – 117 p.

17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, 510 – 531 p.

18) Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.

19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96 p.

20) Wilson E. O. and Bossert, W. H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.

21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, 532 p.

22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L. and Boyce M. S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67,1156-1166 p.

 

1 priedas

VISIŠKAI APIBRĖŽTŲ ELENDT M7 IR M4 TERPIŲ RUOŠIMAS

 

Aklimatizavimas Elendt M7 ir M4 terpėje

 

Kai kurios laboratorijos turėjo sunkumų, perkeliant dafnijas tiesiai į M4 (1) ir M7 terpes. Tačiau šiek tiek pasisekė aklimatizuojant pamažu, t.y. perkeliant dafnijas iš jų terpės į 30 % ELENDT, vėliau į 60 % ELENDT ir pagaliau į 100 % ELENDT. Aklimatizavimas gali trukti visą mėnesį.

RUOŠIMAS

Mikroelementai

Atskirų mikroelementų pradiniai tirpalai (I) iš pradžių ruošiami, naudojant tinkamo grynumo vandenį pvz., dejonizuotą, distiliuotą arba atvirkščiosios osmozės būdu gautą vandenį. Iš šių skirtingų tirpalų (I) ruošiamas antras pradinis tirpalas (H), kuriame yra visų mikroelementų (bendras tirpalas), t.y.:

I Pradinis tirpalas (atskira medžiaga)

Į vandenį įdėtas kiekis (mg/l)

Koncentracija (lyginant su M4 terpe) (kartų)

Ruošiant bendrą II pradinį tirpalą, į vandenį įpilto I pradinio tirpalo tūris, ml/l

M4

M7

H3BO3

57 190

20 000

1,0

0,25

MnCl2 x 4H2O

7210

20 000

1,0

0,25

LiCl

6 120

20 000

1,0

0,25

RbCl

1420

20 000

1,0

0,25

SrCl2 x 6H2O

3 040

20 000

1,0

0,25

NaBr

320

20 000

1,0

0,25

Na2MoO4 x 2H2O

1260

20 000

1,0

0,25

CuCl2 x 2H2O

335

20 000

1,0

0,25

ZnCl2

260

20 000

1,0

1,0

CoCl2 x 6H2O

200

20 000

1,0

1,0

KI

65

20 000

1,0

1,0

Na2Se03

43,8

20 000

1,0

1,0

NH4VO3

11,5

20 000

1,0

1,0

Na2EDTA x 2H2O

5 000

2 000

-

-

FeSO4 7H2O

1991

2 000

_

_

Na2EDTA ir FeSO4 tirpalai ruošiami atskirai, vėliau supilami kartu ir iš karto apdorojami autoklave. Taip gaunamas:

2 1 Fe-EDTA tirpalas

 

1000

20,0

5,0

 

M4 ir M7 terpės

M4 ir M7 terpės, naudojant II pradinį tirpalą, makroelementus ir vitaminus, yra ruošiamos taip:

 

Į vandenį įdėtas kiekis, mg/l

Koncentracija (lyginant su M4 terpe) (kartų)

Terpei paruošti įpilto pradinio tirpalo tūris, ml/l

 

 

 

M4

M7

II pradinis visų mikroelementų tirpalas

 

20

50

50

Mitybinių makroelementų pradiniai tirpalai (atskira medžiaga)

CaCl2 x 2 H2O

293 800

1000

1,0

1,0

MgSO4 x 7H2O

246 600

2 000

0,5

0,5

KC1

58 000

10 000

0,1

0,1

NaHCO3

64 800

1000

1,0

1,0

Na2Si03x9H20

50 000

5 000

0,2

0,2

NaNO3

2 740

10 000

0,1

0,1

KH2PO4

1430

10 000

0,1

0,1

K2HPO4

1 840

10 000

0,1

0,1

Vitaminų mišinio pradinis tirpalas

-

10 000

0,1

0,1

 

Vitaminų mišinio pradinis tirpalas ruošiamas, į 1 litrą vandens dedant tokį šių vitaminų kiekį:

Tiamino hidrochloridas

750

10 000

-

-

Ciankobalaminas (B12)

10

10 000

-

-

Biotinas

7,5

10 000

-

-

 

Vitaminų mišinio pradinis tirpalas laikomas užšaldytas mažomis lygiomis dalimis. Į terpę vitaminų dedama prieš pat naudojimą.

Pastabos: Kad būtų išvengta druskų nuosėdų susidarymo galutinėje terpėje, lygios pradinio tirpalo dalys įpilamos į maždaug 500 — 800 ml dejonizuoto vandens ir praskiedžiamos taip, kad susidarytų 1 litras.

Pirmąją publikaciją apie M4 terpę galima rasti Elendt, B.P. (1990). Selenium dęficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154,25 — 33 p.

 

2 priedas

BENDROS ORGANINĖS ANGLIES (BOA) ANALIZĖ IR DUMBLIŲ MAISTO BOA KIEKIO NOMOGRAMŲ GAVIMAS

 

Pripažinta, kad dumblių pašaro anglies kiekis tiesioginiu metodu dažniausiai nematuojamas, bet taikoma jo koreliacija (t. y. nomogramos) su pakeičiamais paprastesniais parametrais, pvz., dumblių ląstelių skaičiumi ar tariamu suspensijos optiniu tankiu.

BOA reikėtų matuoti taikant oksidavimo, esant aukštai temperatūrai, metodą, bet ne UV ar persulfatinį metodą (žr. The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).

Nomogramai gauti dumbliai ir auginimo terpė atskiriami centrifuguojant, vėliau dumbliai vėl suspenduojami distiliuotame vandenyje. Kiekvieno bandinio supaprastintas dydis ir BOA koncentracija matuojami tris kartus. Analizuojami distiliuoto vandens tuštieji bandiniai ir jų BOA koncentracija atimama iš dumblių bandinio BOA koncentracijos.

Nomograma nustatytam anglies koncentracijų diapazonui turėtų būti tiesinė. Pavyzdžiai pateikti toliau.

NB. Jų negalima naudoti perskaičiuojant; svarbu, kad laboratorijos turėtų savo sudarytas nomogramas.

 

Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 211/12).

 

Sausos masės mg/l ir mg C/l regresija. Koncentruotų suspensijų, gautų iš pusiau nepertraukiamu būdu auginamų ląstelių partijų ir pakartotinai suspenduotų distiliuotame vandenyje, duomenys.

Sauso koncentruoto dumblių pašaro masė mg/l

 

Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 211/12).

Ląstelių skaičiaus ir mg C/l regresija.

Koncentruotų suspensijų, gautų iš pusiau nepertraukiamu būdu auginamų ląstelių partijų ir pakartotinai suspenduotų distiliuotame vandenyje, duomenys.

 

Koncentruoto dumblių pašaro ląstelių skaičius/ 1(x 108)

 

Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 112/12).

Šviesos absorbcijos faktoriaus ir mg C/l regresija. (1 cm kiuvetė)

Koncentruotų suspensijų, gautų iš pusiau nepertraukiamu būdu auginamų ląstelių partijų ir pakartotinai suspenduotų distiliuotame vandenyje, duomenys.

1/10 praskiesto koncentruoto dumblių maisto šviesos absorbcijos faktorius esant 440 nm bangos ilgiui

 

 

 

3 Priedas

 

TERPĖS ATNAUJINIMO, FIZINIO IR CHEMINIO MONITORINGO, MAITINIMO, DAFNIJŲ REPRODUKCIJOS IR SUAUGUSIŲ GYVŪNŲ GAIŠTAMUMO DUOMENŲ REGISTRACIJOS LENTELĖS PAVYZDYS

 

Bandymo Nr.

Pradžios data:

Klonas:

Terpė:

Maisto tipas:

Bandomoji medžiaga

Vardinė konc.

 

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

 

 

Terpės atnaujinimas (dėti varnelę)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

pH1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

naujos

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

senos

 

O2 mg/l1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

naujos

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

senos

 

Temperatūra oC1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

naujos

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

senos

 

Duota pašaro (dėti varnelę)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Nėra gyvulių palikuonių2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Bendras

1 indas

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

9

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

10

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Bendrasis suaugusių gyvūnų gaištamumas3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Bendras

 

1 Nurodomas bandymui naudotas indas

2 Registruojami neapvaisinti kiaušiniai, atitinkamame langelyje įrašant „AB“

3 Registruojamas visų suaugusių gyvūnų gaištamumas, atitinkamame langelyje įrašant „M”

 

 

4 Priedas

 

CHEMINĖS ANALIZĖS REZULTATŲ REGISTRAVIMO LENTELĖS PAVYZDYS

 

a) Išmatuotos koncentracijos vertės

 

1 savaitės bandinys

2 savaičių bandinys

3 savaičių bandinys

Vardinė konc.

Šviežias

Senas

Šviežias

Senas

Šviežias

Senas

 

 

 

 

 

 

 

 

b) Išmatuotos koncentracijos vertės, išreikštos vardinės koncentracijos procentine dalimi

 

1 savaitės bandinys

2 savaičių bandinys

3 savaičių bandinys

Vardinė konc.

Šviežias

Senas

Šviežias

Senas

Šviežias

Senas

 

 

 

 

 

 

 

 

5 Priedas

 

LAIKO SVORINIO VIDURKIO APSKAIČIAVIMAS

 

Laiko svorinis vidurkis

Darant prielaidą, kad bandomosios medžiagos koncentracija tarp terpės atnaujinimų gali mažėti, būtina nustatyti koncentracijos vertę, kuri atspindėtų motinines dafnijas veikiančios medžiagos koncentracijos verčių ribas. Pasirinkimas turi būti pagrįstas biologiniais ir statistiniais sumetimais. Pvz., jei manoma, kad reprodukciją labiausiai veikia didžiausia koncentracija, reikia naudoti didžiausios koncentracijos vertę. Jei svarbesniu laikomas kaupiamasis ar ilgalaikis toksiškas medžiagos poveikis, tinkamesnis yra koncentracijos vidurkis. Šiuo atveju tinkamas naudoti vidurkis yra laiko svorinė vidutinė koncentracijos vertė, nes ją nustatant atsižvelgiama į momentinį koncentracijos kitimą per tam tikrą laiką.

1 paveikslas. Laiko svorinio vidurkio pavyzdys

1 paveiksle pateiktas septynių parų trukmės (supaprastinto) bandymo pavyzdys, terpę atnaujinant 0,2 ir 4 parą.

- Zigzagas, nubrėžtas plona linija, rodo koncentracijos vertę bet kurį matavimo momentą. Daroma prielaida, kad koncentracijos mažėjimas atitinka irimo pagal eksponentę procesą.

- Šeši pažymėti taškai rodo stebimas koncentracijų vertes, išmatuotas kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje.

- Stora linija rodo laiko svorinio vidurkio vietą.

Laiko svorinis vidurkis apskaičiuojamas taip, kad plotas po laiko svorinio vidurkio tiese yra lygus plotui po koncentracijos kitimo kreive. Pirmame paveiksle pateikto pavyzdžio apskaičiavimas parodytas 1 lentelėje.

1 lentelė. Laiko svorinio vidurkio apskaičiavimas (LS)

Atnaujinimo Nr.

Paros

Conc0

Conc1

ln(Conc0)

ln(Conc1)

Plotas

1

2

10,000

4,493

2,303

1,503

13,767

2

2

11,000

6,037

2,398

1,798

16,544

3

3

10,000

4,066

2,303

1,403

19,781

Bendras parų skaičius: 7

Bendras plotas

50,091

LS vidurkis

7,156

„Paros“ – atnaujinimo laikotarpio parų skaičius,

„Conc0“ – kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje išmatuota koncentracija,

„Conc1“ – kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pabaigoje išmatuota koncentracija,

„ln(Conc0)“ – Conc0 natūralusis logaritmas,

„ln(Conc1)“ – Conc1 natūralusis logaritmas,

„Plotas“ – plotas po eksponentės kreive kiekvieną atnaujinimo laikotarpį. Jis apskaičiuojamas:

Laiko svorinis vidurkis („LS vidurkis“) yra „bendro ploto“ ir „bendro parų skaičiaus“ dalmuo.

Savaime aišku, kad atliekant dafnijų reprodukcijos bandymą, lentelė turėtų būti išplėsta iki 21 paros.

Aišku, kad matuojant tik kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje, neįmanoma patvirtinti, kad irimo procesas iš tikrųjų vyksta eksponentiškai. Esant kitokiai kreivei, būtų gautas kitas „ploto“ apskaičiavimo rezultatas. Irimo pagal eksponentinę kreivę procesas nėra nekeliantis pasitikėjimo ir, nesant kitos informacijos, tai yra tinkamiausia taikyti kreivė.

Jei atnaujinimo laikotarpio pabaigoje, atlikus cheminę analizę, visiškai nerandama bandomosios medžiagos, dėl atsargumo reikia atlikti visų ankstesnių duomenų peržiūrą. Jei negalima įvertinti, kaip greitai medžiaga išnyko iš tirpalo, neįmanoma gauti tikrojo ploto po kreive, taigi neįmanoma gauti priimtino laiko svorinio vidurkio.

______________

 

 


[1] OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, Fish, Early-life Stage Toxicity Test.

[2] Bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracijos (Cadsaq) kitimo laike grafikai taip pat gali būti panaudoti nustatant, ar pasiekta pusiausvyros horizontalioji kreivės dalis (žr. 5 priedo 2 pav.).

[3] DT-50: laikas, per kurį suskaidoma 50 % bandomosios medžiagos.

[4] Lygtis tinka tiesioginiam ir netiesioginiam metodui. Visos kitos lygtys tinka tik netiesioginiam metodui.

[5] Lygtis tinka tiesioginiam ir netiesioginiam metodui. Visos kitos lygtys tinka tik netiesioginiam metodui.

[6] Lygtis tinka tiesioginiam ir netiesioginiam metodui. Visos kitos lygtys tinka tik netiesioginiam metodui.

[7] Lygtis tinka tiesioginiam ir netiesioginiam metodui. Visos kitos lygtys tinka tik netiesioginiam metodui.

[8] Lygtis tinka tiesioginiam ir netiesioginiam metodui. Visos kitos lygtys tinka tik netiesioginiam metodui.

[9] Lygtis tinka tiesioginiam ir netiesioginiam metodui. Visos kitos lygtys tinka tik netiesioginiam metodui.