LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO

 

Į S A K Y M A S

DĖL AMPROLIUMO, DIKLAZURILIO IR KARBADOKSO KIEKIO PAŠARUOSE NUSTATYMO TECHNINIO REGLAMENTO PATVIRTINIMO

 

2001 m. gruodžio 28 d. Nr. 467

Vilnius

 

Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos pašarų įstatymu (Žin., 2000, Nr. 34-952) ir atsižvelgdamas į Europos Sąjungos direktyvą 1999/27/EB, nustatančią analizės metodus, taikomus oficialiai kokybės kontrolei:

1. Tvirtinu Amproliumo, diklazurilio ir karbadokso kiekio pašaruose nustatymo techninį reglamentą (pridedama).

2. Nustatau, kad techninis reglamentas įsigalioja 2002 m. kovo 1 d.

 

 

ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS                                                                   JERONIMAS KRAUJELIS

______________

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro

2001 m. gruodžio 28 d. įsakymu Nr. 467

 

amproliumo, diklazurilio ir karbadokso kiekio pašaruose nustatymo

techninis reglamentas

 

Parengtas pagal 1999 m. balandžio 20 d. Europos Komisijos direktyvą 1999/27/EB „Dėl Bendrijos cheminės analizės metodų, kuriuos valstybės institucijos taiko amproliumo, diklazurilio ir karbadokso nustatymui pašaruose“.

 

I. Bendrosios nuostatos

 

1. Šis techninis reglamentas nustato į rinką tiekiamų pašarinių žaliavų, kombinuotųjų pašarų cheminės analizės metodus pašarų kokybės valstybinei kontrolei vykdyti. (Kai kuriems pašarams dėl jiems būdingų sudėties savybių reikia taikyti atskirus, tik jiems tinkamus cheminės analizės metodus. Šie atvejai nurodyti metodų aprašymuose su nuoroda „Pastabos“.)

2. Jei pašarų analitei nustatyti taikomi du ar daugiau metodų, taikomą metodą, jei nenurodyta kitaip, pasirenka cheminę analizę atliekanti laboratorija, tačiau šis metodas turi būti nurodomas analizės sertifikate.

3. Šio techninio reglamento reikalavimų privalo laikytis visi prekinius pašarus gaminantys, laikantys, gabenantys, naudojantys, tarpininkaujantys juos parduodant ir jais prekiaujantys ūkio subjektai ir pašarų kokybės valstybinė kontrolės institucija.

4. Šio techninio reglamento reikalavimai netaikomi pašarams:

4.1. skirtiems eksportuoti ne į Europos Sąjungos valstybes nares;

4.2. gabenamiems uždarose transporto priemonėse arba uždarose pakuotėse tranzitu per Lietuvos Respublikos teritoriją.

 

II. Sąvokos ir sutrumpinimai

 

5. Šiame techniniame reglamente vartojamos sąvokos:

Drėgnis – laisvo vandens procentinis kiekis medžiagoje.

Radimo riba – kokybiškai nustatomo komponento mažiausias kiekis arba koncentracija, dar duodantys analizinį signalą.

Nustatymo riba – kiekybinės analizės metodu ieškomo komponento mažiausias kiekis arba koncentracija, dar duodantys išmatuojamą signalą.

„Tuščiasis“ pašaras – pašaras be analitės ir kitų medžiagų, duodančių panašų į analitės analizinį signalą.

Kitos šiame reglamente vartojamos sąvokos turi tą pačią reikšmę kaip Lietuvos Respublikos pašarų įstatyme (Žin., 2000, Nr. 34-952) ir žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 205 (Žin., 2000, Nr. 69-2064) patvirtintame Pašarų klasifikatoriuje.

6. Metodų aprašymuose vartojami cheminių junginių trivialieji pavadinimai ir juos atitinkantys IUPAC terminai:

acetonitrilas – etannitrilas, CH3CN;

acto rūgštis – etano rūgštis, CH3COOH;

aliuminio oksidas – dialiuminio trioksidas, Al2O3;

amproliumas – 1-[(4-amino-2-propil-5-pyrimidinil)metil]–2metil-piridino chlorido vandenilio chloridas, C14H19N4Cl x HCl;

-metilbenzenacetonitrilas; α-(4-chlorofenil)-4-(4,5-dihidro-3,5-diokso-1,2,4-2(3H)-triazinil)-αdichlor-

diklazurilis – (+)-4-chlorfenil[2,6-dichlor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-diokso-1,2,4-triazin-2-il) fenil]acetonitrilas, C17H9Cl3N4O2;

karbadoksas –3-(2-chinoksalinilmetilen)hidrazinkarboksi rūgšties metilo esterio N1, N4-dioksidas, C11H10N4O4;

metanolis – CH3OH;

N, N-dimetilformamidas – dimetilmetanamidas, (CH3)2NCHO;

natrio acetatas – natrio etanoatas, CH3COONa;

natrio perchloratas monohidratas – natrio tetraoksochloratas monohidratas, NaClO4×H2O;

natrio-divandenilio fosfatas monohidratas – natrio-divandenilio tetraoksofosfatas monohidratas, NaH2PO4×H2O;

tetrabutilamonio-vandenilio sulfatas – [CH3(CH2)3]4N(HSO4).

7. Metodų aprašymuose vartojamos santrumpos:

HPLC – efektyvioji skysčių chromatografija;

c – koncentracija;

m/v – masės ir tūrio santykis;

v/v – tūrių santykis.

 

III. Mėginių paruošimas cheminei analizei

 

8. Pašarų cheminių analizių metodų bendrosios nuostatos:

8.1. Mėginių paruošimas cheminėms analizėms:

8.1.1. aprašyti veiksmai toliau taikomi galutiniams mėginiams (toliau – mėginiai), atsiųstiems į kontrolės laboratorijas po mėginių paėmimo pagal žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 208 (Žin., 2000, Nr. 60-1786) patvirtintą Pašarų mėginių paėmimo ir paruošimo techninį reglamentą;

8.1.2. galutiniai mėginiai turi būti paruošti tokiu būdu, kad pasverti kiekiai, numatyti analizių metoduose, būtų homogeniniai ir atitiktų galutinį mėginį.

8.2. Būtinos atsargumo priemonės mėginių paruošimo metu:

8.2.1. visi būtini veiksmai turi būti atliekami išvengiant mėginio užteršimo ir jo sudėties pokyčio. Malimas, maišymas ir sijojimas turi būti atliekami kaip galima greičiau, kuo trumpiau mėginį veikiant oru ir šviesa. Neturi būti naudojami malūnai ir smulkintuvai, pastebimai įšildantys mėginį. Pašarus, kurie yra ypač jautrūs šilumai, rekomenduojama smulkinti rankomis. Reikėtų įsitikinti, kad patys prietaisai nėra mikroelementų taršos šaltinis;

8.2.2. jei mėginys negali būti paruoštas be ryškaus mėginio drėgnio pokyčio, prieš paruošimą ir po jo nustatomas drėgnis pagal žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 206 patvirtintą Drėgnio, lakiųjų azoto bazių, suminio fosforo, žalio aliejaus ir riebalų kiekio nustatymo pašaruose techninį reglamentą.

8.3. Galutinio mėginio paruošimo eiga:

8.3.1. galutinis mėginys kruopščiai sumaišomas maišytuvu arba rankomis. Mėginys padalijamas į dvi lygias dalis (jei tinka, turi būti naudojamas ketvirčiavimo metodas). Viena dalis saugoma tinkamoje švarioje, sausoje talpykloje, su oro nepraleidžiančiu kamščiu, antroji dalis (arba jai būdinga mažiausiai 100 g dalis) paruošiama, kaip nurodyta toliau:

8.3.1.1. pašarai gali būti malami iš karto, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip.

Visas sumaltas mėginys persijojamas per sietą su kvadratinėmis akutėmis, kurios kraštinės ilgis 1 mm (pagal rekomendaciją ISO R565). Vengiama per smulkaus sumalimo. Persijotas mėginys išmaišomas ir surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys vėl išmaišomas;

8.3.1.2. pašarai gali būti sumalami juos išdžiovinus, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip; mėginys džiovinamas siekiant sumažinti drėgnį iki 8 %-12 % pagal parengtinio džiovinimo procedūrą, nurodytą drėgnio nustatymo metodo 4.3 punkte. Toliau dirbama, kaip nurodyta šio techninio reglamento 8.3.1.1 punkte;

8.3.1.3. skysto ir pusiau skysto pašaro mėginys surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys kruopščiai išmaišomas;

8.3.1.4. kitų pašarų mėginiai, kurie negali būti paruošti vienu iš nurodytų būdų, turi būti paruošiami bet kokiu kitu būdu, garantuojančiu, kad cheminei analizei pasvertas mėginys yra homogeninis ir būdingas galutiniam mėginiui.

8.4. Mėginiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Mėginiai, kuriuose numatyta analizuoti vitaminus ar kitas iš dalies šviesai jautrias medžiagas, turi būti laikomi rudo stiklo induose.

8.5. Reikalavimai reagentams ir prietaisams, naudojamiems cheminės analizės metoduose:

8.5.1. visi analiziniai reagentai turi būti analiziškai gryni (a. p.), jei cheminės analizės metoduose nenurodyta kitaip. Nustatant mikroelementus, reagentų grynumas turi būti tikrinamas „tuščiuoju“ bandymu. Atsižvelgiant į gautą rezultatą, gali būti reikalingas tolesnis reagentų gryninimas;

8.5.2. jei analizės metodų veiksmuose, susietuose su tirpalų ruošimu, skiedimu, skalavimu ar plovimu, nenurodoma naudojamo tirpiklio ar skiediklio prigimtis, suprantama, kad turi būti naudojamas vanduo. Vanduo turi būti tik demineralizuotas ar distiliuotas. Kai kuriais analizių metoduose nurodytais atvejais jis turi būti gryninamas specialiomis priemonėmis;

8.5.3. atsižvelgiant į kontrolės laboratorijose esančią įrangą, cheminės analizės metoduose leidžiama naudoti tik specialius ar specifinio naudojimo reikalaujančius instrumentus ir prietaisus. Jie turi būti ypač švarūs, nustatant labai mažus medžiagų kiekius.

8.6. Cheminės analizės metodų taikymas ir rezultatų išraiška:

8.6.1. kiekviena medžiaga pašaruose paprastai nustatoma atskiru metodu. Jei yra pateikta keletas metodų, kontrolės laboratorijoje naudotas metodas turi būti nurodomas analizės ataskaitoje;

8.6.2. analizės ataskaitoje pateikiamas rezultatas išreiškiamas mažiausiai dviejų matavimų, atliktų su atskiromis mėginio dalimis, vidurkiu, esant patenkinamam šių matavimų pakartojamumui. Šis rezultatas išreiškiamas reikšmingų skaitmenų skaičiumi analizės metoduose nurodytu būdu ir, jei reikia, koreguojamas pagal drėgnio kiekį, esantį galutiniame mėginyje prieš jo paruošimą.

 

IV. Mėginių cheminė analizė

 

9. Amproliumo kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento 1 priede nurodytą metodą.

10. Diklazurilio kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento 2 priede nurodytą metodą.

11. Karbadokso kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento 3 priede nurodytą metodą.

 

SUDERINTA                                        SUDERINTA

Nacionalinės veterinarijos                      Lietuvos gyvulininkystės

laboratorijos direktorius                         instituto direktorė

Jonas Milius                                            Violeta Juškienė

2001 m. gruodžio 21 d.                          2001 m. gruodžio 20 d.

______________

Amproliumo, diklazurilio ir karbadokso

kiekio pašaruose nustatymo techninio

reglamento

1 priedas

 

amproliumo nustatymas

 

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatomo amproliumo kiekio pašaruose ir premiksuose radimo riba yra 1 mg/kg, nustatymo riba – 25 mg/kg.

 

2. Metodo esmė

Mėginys ekstrahuojamas metanolio ir vandens mišiniu. Po praskiedimo judančiąja faze ir filtravimo per membraną, amproliumo kiekis nustatomas katijonų mainų efektyviąja skysčių chromatografija (HPLC) su UV detektoriumi.

 

3. Reagentai:

3.1. metanolis;

3.2. acetonitrilas, grynas HPLC;

3.3. vanduo, grynas HPLC;

3.4. natrio-divandenilio fosfato tirpalas, c = 0,1 mol/l: 1000 ml matavimo kolboje vandenyje (3.3) ištirpinama 13,80 g natrio-divandenilio fosfato monohidrato, skiedžiama vandeniu (3.3) iki žymės ir išmaišoma;

3.5. natrio perchlorato tirpalas, c = 1,6 mol/l: 1000 ml matavimo kolboje vandenyje (3.3) ištirpinama 224,74 g natrio perchlorato monohidrato, skiedžiama vandeniu (3.3) iki žymės ir išmaišoma;

3.6. judančioji fazė efektyviajai skysčių chromatografijai (žr. 1 pastabą): acetonitrilo (3.2) natrio-divandenilio fosfato tirpalo (3.4) ir natrio perchlorato tirpalo (3.5) mišinys, 450:450:100 (v/v/v). Prieš naudojimą tirpalas filtruojamas per 0,22 µm membraninį filtrą (4.3) ir degazuojamas (pvz., ultragarso vonioje (4.4) ne trumpiau kaip 15 min.);

3.7. standartinė medžiaga: grynas amproliumas, 1-[(4-amino-2-propil-5-pyrimidinil)metil]–2metil-piridino chlorido vandenilio chloridas, E 750 (žr. 2 pastabą):

3.7.1. amproliumo pradinis standartinis tirpalas, 500 µg/ml: į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 50 mg amproliumo (3.7), ištirpinama 80 ml metanolio (3.1). Kolba 10 min. įdedama į ultragarso vonią (4.4). Po apdorojimo ultragarsu tirpalas atvėsinamas iki kambario temperatūros, iki žymės skiedžiamas vandeniu ir išmaišomas. Tirpalas būna stabilus mėnesį žemesnėje nei 4 oC temperatūroje;

3.7.2. amproliumo tarpinis standartinis tirpalas, 50 µg/ml: 5 ml pradinio standartinio tirpalo (3.7.1) praskiedžiama 50 ml matavimo kolboje iki žymės ekstrahavimo tirpalu (3.8) ir išmaišoma. Tirpalas būna stabilus mėnesį žemesnėje nei 4 oC temperatūroje;

3.7.3. kalibraciniai tirpalai: į 50 ml matavimo kolbutes įpilama 0,5 ml, 1,0 ml ir 2,0 ml tarpinio standartinio tirpalo (3.7.2). Praskiedžiama iki žymės judančiąja faze (3.6) ir išmaišoma. Šiuose tirpaluose yra atitinkamai 0,5 µg/ml, 1 µg/ml ir 2 µg/ml amproliumo. Šie tirpalai turi būti ruošiami iš naujo prieš kiekvieną matavimą.

3.8. Ekstrahavimo tirpiklis: metanolio (3.1) ir vandens mišinys, 2:1 (v/v).

 

4. Prietaisai:

4.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos įrenginys su įleidimo sistema, tinkama įleisti 100 µl tirpalo:

4.1.1. skysčių chromatografinė kolonėlė 125 mm x 4 mm, katijonitas – Nukleosilas 10 SA, 10 µm įkrova ar panaši;

4.1.2. kintamo bangos ilgio UV detektorius arba diodinė matrica.

4.2. Membraninis filtras iš politetrafluoretileno, 0,45 µm.

4.3. Membraninis filtras, 0,22 µm.

4.4. Ultragarso vonia.

4.5. Mechaninė purtyklė ar magnetinis maišiklis.

 

5. Matavimas

5.1. Bendrosios nuostatos:

5.1.1. „Tuščiasis“ pašaras

„Tuščiasis“ pašaras ištiriamas siekiant patikrinti, ar jame nėra nei amproliumo, nei trukdančių medžiagų. „Tuščiasis“ pašaras turi būti panašios rūšies kaip tiriamasis ir jame neturi būti nei amproliumo, nei trukdančių medžiagų. „Tuščiasis“ pašaras naudojamas išgavos testui (5.1.2).

5.1.2. Išgavos testas

Išgavos testą reikėtų atlikti pridėjus į „tuščiąjį“ pašarą amproliumo kiekį, panašų į esantį mėginyje. Siekiant gauti koncentraciją 100 mg/kg, į 250 ml konusinę kolbą įpilama 10,0 ml pradinio standartinio tirpalo (3.7.1) ir tirpalas nugarinamas iki maždaug 0,5 ml. Pridedama 50 g „tuščiojo“ pašaro, gerai išmaišoma ir paliekama 10 min. Prieš ekstrahavimą (5.2) dar keletą kartų pamaišoma. Jei neįmanoma gauti „tuščiojo“ pašaro, panašaus į tiriamąjį, atgavimo testas gali būti atliekamas standartinio priedo metodu. Šiuo atveju į tiriamąjį mėginį pridedama panašus amproliumo kiekis, koks jau yra mėginyje. Mėginys su amproliumo priedu ir nepakeistas mėginys ištiriami ir atgavimas gali būti apskaičiuojamas atimties būdu.

5.2. Ekstrahavimas:

5.2.1. Premiksai (su mažesniu nei 1 % amproliumo) ir pašarai

Atsižvelgiant į amproliumo kiekį, 0,01 g tikslumu pasveriama 5 g–40 g mėginio. Supilama į 500 ml konusinę kolbą, įpilama 200 ml ekstrahavimo tirpiklio (3.8). Kolba 15 min. įdedama į ultragarso vonią (4.4). Iš ultragarso vonios išimta kolba 1 val. purtoma purtykle ar maišoma magnetiniu maišikliu (4.5). Alikvotinė ekstrakto dalis skiedžiama judančiąja faze (3.6), kad amproliumo koncentracija būtų nuo 0,5 µg/ml iki 2 µg/ml. Tirpalas išmaišomas (žr. 3 pastabą). 5 ml–10 ml praskiesto tirpalo filtruojama per membraninį filtrą (4.2) ir chromatografuojama (5.3).

5.2.2. Premiksai (amproliumo 1 % ar daugiau)

Atsižvelgiant į amproliumo kiekį, 0,001 g tikslumu pasveriama 1 g–4 g mėginio. Supilama į 500 ml konusinę kolbą, įpilama 200 ml ekstrahavimo tirpiklio (3.8). Kolba 15 min. įdedama į ultragarso vonią (4.4). Iš ultragarso vonios išimta kolba 1 val. purtoma purtykle ar maišoma magnetiniu maišikliu (4.5). Alikvotinė ekstrakto dalis skiedžiama judančiąja faze (3.6), kad amproliumo koncentracija būtų nuo 0,5 µg/ml iki 2 µg/ml. Tirpalas išmaišomas. 5 ml–10 ml praskiesto tirpalo filtruojama per membraninį filtrą (4.2) ir chromatografuojama (5.3).

5.3. HPLC matavimas:

5.3.1. Parametrai

Siūloma taikyti šias arba kitas sąlygas, jei jos duoda panašius rezultatus:

skysčių chromatografijos kolonėlė (4.1.1):

125 mm x 4 mm katijonitas Nucleosil 10 SA, 10 µm įkrova;

judančioji fazė (3.4):

acetonitrilo (3.2) ir natrio-divandenilio fosfato (3.4) ir natrio perchlorato (3.5) mišinys 450:450:100 (v/v/v);

debitas:

0,7 ml/min.–1 ml/min.;

matavimo bangos ilgis:

264 nm;

įleidimo tūris:

100 µl.

Chromatografinės sistemos stabilumas patikrinamas keletą kartų įleidžiant 1,0 µg/ml kalibravimo tirpalą (3.5.3), kol smailės aukštis ir sulaikymo trukmė nesikeis.

5.3.2. Kalibracinė kreivė

Įleidžiamas po keletą kartų kiekvienas kalibracinis tirpalas (3.5.3) ir išmatuojami kiekvienos koncentracijos smailių aukščių (plotų) vidurkiai. Ant ordinačių ašies nubraižoma kalibracinė kreivė, atidedant kalibracinių tirpalų smailių aukščių (plotų) vidurkius, ant abscisių – atitinkamas koncentracijas µg/ml.

5.3.3. Mėginio tirpalas

Keletą kartų įleidžiamas tokio pat tūrio mėginio ekstraktas (5.2) kaip ir kalibravimo tirpalų ir išmatuojamas amproliumo smailių aukščių (plotų) vidurkis.

 

6. Rezultatų apskaičiavimas

Pagal mėginio tirpalo amproliumo smailių aukščių (plotų) vidurkį, remiantis kalibracine kreive (5.3.2), nustatoma mėginio tirpalo koncentracija mikromoliais mililitre. Amproliumo kiekis w miligramais kilograme mėginio apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

Vxbxf

w = ––––––––, [mg/kg],

m

kurioje:

V – ekstrahavimo tirpiklio (3.8) tūris mililitrais (5.2) (t. y. 200 ml);

b – amproliumo koncentracija mėginio tirpale (5.2) mikrogramais mililitre;

f – praskiedimo faktorius (5.2);

m – matavimui paimto mėginio dalies svoris gramais.

 

7. Rezultatų patvirtinimas

7.1. Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtintas kochromatografijos ar diodinės matricos pagalba, lyginant mėginio ekstrakto (5.2) ir 2,0 µg/ml kalibracinio tirpalo (3.7.3) spektrus.

7.1.1. Kochromatografija

Mėginio ekstraktas (5.2) papildomas pridedant į jį tinkamą kalibravimo tirpalo (3.7.3) kiekį. Pridedamo amproliumo kiekis turėtų būti panašus į išmatuotą amproliumo kiekį mėginio ekstrakte.

Atsižvelgiant tiek į pridėtą kiekį, tiek į ekstrakto praskiedimą, padidėti turėtų tik amproliumo smailės aukštis. Smailės plotis pusėje jos aukščio turėtų būti ± 10 % nepapildyto mėginio ekstrakto amproliumo smailės pločio.

7.1.2. Detekcija diodine matrica

Rezultatai vertinami remiantis šiais kriterijais:

7.1.2.1. Mėginio ir standarto spektrų absorbcijos maksimumų bangų ilgiai, užregistruoti chromatogramų smailės viršūnėje, turi būti vienodi ir paklaida neturi viršyti detekcinės sistemos skiriamosios gebos sąlygojamų ribų. Šios ribos detekcijai diodine matrica paprastai yra ± 2 nm.

7.1.2.2. Tarp 210 nm ir 320 nm užregistruoti mėginio ir standarto chromatogramų smailių viršūnių spektrai neturi skirtis, kai santykinė absorbcija yra nuo 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai esant tam pačiam absorbcijos maksimumui, nėra nei vieno taško, kuriame nuokrypis tarp dviejų spektrų viršytų 15 % standarto analitės absorbcijos.

7.1.2.3. Tarp 210 nm ir 320 nm mėginio ekstrakto chromatogramos smailės pakilimo, viršūnės ir nusileidimo spektrai neturi skirtis vienas nuo kito, kai santykinė absorbcija yra nuo 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai esant tam pačiam absorbcijos maksimumui, visuose stebimuose taškuose nuokrypis tarp spektrų neviršija 15 % smailės viršūnės spektro absorbcijos.

Jei nors vienas iš šių kriterijų nepatenkinamas, analitės buvimas nėra patvirtintas.

7.2. Pakartojamumas

Skirtumas tarp dviejų lygiagrečiai atliktų to paties mėginio matavimų rezultatų neturi viršyti:

15 % santykinai didesnės vertės, kai amproliumo koncentracija yra nuo 25 mg/kg iki 500 mg/kg,

75 mg/kg, kai amproliumo yra nuo 500 mg/kg iki 1000 mg/kg,

5 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai kiekiai yra nuo 25 mg/kg iki 50 mg/kg,

7,5 % santykinai didesnės vertės, kai amproliumo koncentracija yra per 1000 mg/kg.

7.3. Išgava

Išgava su tuščiuoju papildytu mėginiu turi būti ne mažesnė kaip 90 %.

 

8. Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai

Tarplaboratorinių tyrimų metu išanalizuoti trys paukščių pašarai (1–3 mėginiai) ir vienas premiksas. Rezultatai pateikiami lentelėje.

 

 

1 mėginys („tuščiasis“ pašaras)

2 mėginys

3 mėginys

4 mėginys

5 mėginys

L

14

14

14

14

15

n

56

56

56

56

60

Vidurkis (mg/kg)

–

45,5

188

5129

25140

Sr (mg/kg)

–

2,26

3,57

178

550

CVr (%)

–

4,95

1,90

3,46

2,2

SR (mg/kg)

–

2,95

11,8

266

760

CVR (%)

–

6,47

6,27

5,19

3,00

 

Nominalus kiekis (mg/kg) – 50 200 5000 25000

 

L – laboratorijų skaičius;

n – vienetinių verčių skaičius;

Sr – pakartojamumo standartinis nuokrypis;

CVr – pakartojamumo variacijos koeficientas;

SR – atkartojamumo standartinis nuokrypis;

CVR – atkartojamumo variacijos koeficientas.

PASTABOS:

1. Jei mėginyje yra tiamino, jo smailė chromatogramoje pasirodo per arti amproliumo smailės. Amproliumas nuo tiamino turi būti atskirtas. Jei šiame metode naudojama kolonėle (4.1.1) amproliumas ir tiaminas neatskiriami, judančiojoje fazėje (3.6) iki 50 % acetonitrilo pakeičiama metanoliu.

2. Pagal „British Pharmacopoeia“ amproliumo tirpalo spektras (c = 0,02 mol/l) druskos rūgštyje (c = 0,1 mol/l) turi maksimumą 246 nm ir 262 nm srityje. Esant 246 nm bangos ilgiui, absorbcija turi būti 0,84 ir 262 nm – 0,80.

3. Ekstraktas visuomet turi būti skiedžiamas judančiąja faze, kitaip dėl pakitusios joninės jėgos žymiai pasikeis amproliumo smailės sulaikymo trukmė.

______________

Amproliumo, diklazurilio ir karbadokso

kiekio pašaruose nustatymo techninio

reglamento

2 priedas

 

Diklazurilio nustatymas

 

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatomo diklazurilio kiekio pašaruose ir premiksuose radimo riba yra 0,1 mg/kg, nustatymo riba – 0,5 mg/kg.

 

2. Metodo esmė

Pridėjus vidinio standarto, mėginys ekstrahuojamas su parūgštintu metanoliu. Pašarų mėginio ekstrakto alikvotinė dalis išvaloma ekstrahavimo kasetėje su C18 kietąja faze. Diklazurilis iš kasetės eliuojamas su parūgštintu metanolio ir vandens mišiniu. Išgarinus liekana ištirpinama DMF ir vandens mišinyje. Premiksų ekstraktas išgarinamas ir liekana ištirpinama DMF ir vandens mišinyje. Diklazurilio kiekis nustatomas trigubo gradiento atvirkštinių fazių efektyviąja skysčių chromatografija (HPLC) su UV detektoriumi.

 

3. Reagentai:

3.1. Vanduo, grynas HPLC.

3.2. Amonio acetatas.

3.3. Tetrabutilamonio-vandenilio sulfatas (TBHS).

3.4. Acetonitrilas, grynas HPLC.

3.5. Metanolis, grynas HPLC.

3.6. N, N-dimetilformamidas (DMF).

3.7. Druskos rūgštis, ρ20 = 1,19.

3.8. Standartinė medžiaga: grynas diklazurilis II-24, (+)-4-chlorfenil[2,6-dichlor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-diokso-1,2,4-triazin-2-il) fenil]acetonitrilas, C17H9Cl3N4O2, E771:

3.8.1. Diklazurilio pradinis standartinis tirpalas – 500 µg/ml: į 50 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 25 mg diklazurilio (3.8) ir ištirpinama DMF (3.6). Skiedžiama DMF (3.6) iki žymės ir išmaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija arba tirpalas perpilamas į rudo stiklo indą ir saugomas šaldytuve. Tirpalas yra stabilus vieną mėnesį žemesnėje nei 4 oC temperatūroje.

3.8.2. Diklazurilio standartinis tirpalas – 50 µg/ml: į 50 ml matavimo kolbą įpilama 5,00 ml pradinio standartinio tirpalo (3.8.1), skiedžiama iki žymės DMF, išmaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija arba tirpalas perpilamas į rudo stiklo indą ir saugomas šaldytuve. Tirpalas yra stabilus vieną mėnesį žemesnėje nei 4 oC temperatūroje.

3.9. Vidinis standartas: 2,6 dichlor-:α-(4-chlorofenil)-4-(4,5-dihidro-3,5-diokso-1,2,4-2(3H)-triazinil)-α-metilbenzenacetonitrilas

3.9.1. Pradinis vidinio standarto tirpalas – 500 µg/ml: į 50 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 25 mg vidinio standarto (3.9) ir ištirpinama DMF (3.6). Skiedžiama DMF (3.6) iki žymės ir išmaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija arba tirpalas perpilamas į rudo stiklo indą ir saugomas šaldytuve. Tirpalas yra stabilus vieną mėnesį žemesnėje nei 4 oC temperatūroje.

3.9.2. Vidinio standarto tirpalas – 50 µg/ml: į 50 ml matavimo kolbą įpilama 5,00 ml pradinio vidinio standarto tirpalo (3.9.1), skiedžiama iki žymės DMF, išmaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija arba tirpalas perpilamas į rudo stiklo indą ir saugomas šaldytuve. Tirpalas yra stabilus vieną mėnesį žemesnėje nei 4 oC temperatūroje.

3.9.3. Vidinio standarto tirpalas premiksams – p/1000 mg/ml (p – nominalus diklazurilio kiekis premikse mg/kg): į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama p/10 mg vidinio standarto (3.9) ir ištirpinama DMF (3.6) ultragarso vonioje. Skiedžiama DMF (3.6) iki žymės ir išmaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija arba tirpalas perpilamas į rudo stiklo indą ir saugomas šaldytuve. Tirpalas yra stabilus vieną mėnesį žemesnėje nei 4 oC temperatūroje.

3.10. Kalibracinis tirpalas – 2 µg/ml: į 50 ml matavimo kolbą įpilama 2,00 ml diklazurilio standartinio tirpalo (3.8.2), 2,00 ml vidinio standarto tirpalo (3.9.2) ir 16 ml DMF. Skiedžiama vandeniu iki žymės ir išmaišoma. Tirpalas ruošiamas prieš pat matavimą.

3.11. C18 kietos fazės ekstrahavimo kasetė, pvz., Bond Elut, dydis – 1 cm3, sorbento masė – 100 mg.

3.12. Ekstrahavimo tirpiklis: parūgštintas metanolis. Į 1000 ml metanolio (3.5) pridedama 5,0 ml druskos rūgšties ir išmaišoma.

3.13. HPLC judančiosios fazės:

3.13.1. Eliuentas A: amonio acetato ir tetrabutilamonio-vandenilio sulfato tirpalas. 1000 ml vandens ištirpinama 5 g amonio acetato (3.2) ir 3,4 g TBHS (3.3), išmaišoma.

3.13.2. Eliuentas B: acetonitrilas (3.4).

3.13.3. Eliuentas C: metanolis (3.5).

 

4. Prietaisai:

4.1. Mechaninė purtyklė.

4.2. Trigubo gradiento HPLC prietaisas:

4.2.1. Skysčių chromatografijos kolonėlė, Hypersil ODS, 3 µm įkrova, 100 mm x 4,6 mm ar panaši.

4.2.2. Kintamo bangos ilgio UV detektorius arba diodinė matrica.

4.3. Sukamasis vakuuminis garintuvas.

4.4. Membraninis filtras, 0,45 µm.

4.5. Vakuuminis kolektorius.

4.6. Ultragarso vonia.

 

5. Matavimas:

5.1. Bendrosios nuostatos:

5.1.1. „Tuščiasis pašaras“ ištiriamas siekiant patikrinti, ar jame nėra nei amproliumo, nei trukdančių medžiagų. „Tuščiasis“ pašaras turi būti panašios rūšies kaip tiriamasis ir jame neturi būti nei amproliumo nei trukdančių medžiagų.

5.1.2. Atgavimo testą reikėtų atlikti pridėjus į „tuščiąjį“ pašarą diklazurilio kiekį, panašų į esantį mėginyje. Siekiant gauti koncentraciją 1 mg/kg, į 50 g tuščiojo pašaro pridedama 0,1 ml pradinio standartinio tirpalo (3.8.1), gerai išmaišoma ir paliekama 10 min. Prieš ekstrahavimą (5.2) dar keletą kartų pamaišoma. Jei neįmanoma gauti „tuščiojo“ pašaro (5.1.1), panašaus į tiriamąjį, atgavimo testas gali būti atliekamas standartinio priedo metodu. Šiuo atveju į tiriamąjį mėginį pridedama panašus diklazurilio kiekis, koks jau yra mėginyje. Mėginys su diklazurilio priedu ir nepakeistas mėginys ištiriami ir išgava gali būti apskaičiuojama aritmetinės atimties būdu.

5.2. Ekstrahavimas:

5.2.1. Pašarai

Į 500 ml konusinę kolbą 0,01 g tikslumu pasveriama apie 50 g mėginio. Pridedama 1,00 ml vidinio standarto tirpalo (3.9.2) ir 200 ml ekstrahavimo tirpiklio (3.12). Kolba užkemšama. Mišinys purtomas mechaninėje purtyklėje (4.1) per naktį. Paliekamas 10 min. nusistovėti. 20 ml paviršinio tirpalo įpilama į tinkamą stiklinį indą ir skiedžiama 20 ml vandens. Gautas tirpalas vakuumo pagalba (4.5) praleidžiamas per ekstrahavimo kasetę (3.11). Kasetė plaunama 25 ml ekstrahavimo tirpalo (3.12) ir vandens mišinio, 65:35 (v/v). Surinkta tirpalo frakcija išmetama. Junginiai išplaunami 25 ml ekstrahavimo tirpiklio (3.12) ir vandens mišinio, 80:20 (v/v). Ši frakcija garinama sukamajame vakuuminiame garintuve (4.3) 60 oC temperatūroje iki sausos liekanos. Liekana ištirpinama 1,0 ml DMF (3.6), pridedama 1,5 ml vandens (3.1) ir išmaišoma. Filtruojama per membraninį filtrą (4.4) ir chromatografuojama (5.3).

5.2.2. Premiksai

Į 500 ml konusinę kolbą 0,001 g tikslumu pasveriama apie 1 g mėginio. Pridedama 1,00 ml vidinio standarto tirpalo (3.9.3) ir 200 ml ekstrahavimo tirpiklio (3.12). Kolba užkemšama. Mišinys purtomas mechaninėje purtyklėje (4.1) per naktį. Paliekamas 10 min. nusistovėti. Alikvotinė paviršinio skysčio dalis 10000/p ml (p – nominalus diklazurilio kiekis premikse) įpilama į tinkamo dydžio apvaliadugnę kolbą. Garinama sukamajame vakuuminiame garintuve (4.3) 60 oC temperatūroje iki sausos liekanos. Liekana ištirpinama 10 ml DMF (3.6), pridedama 15 ml vandens (3.1), išmaišoma ir chromatografuojama (5.3).

5.3. HPLC matavimas:

5.3.1. Parametrai

Siūloma taikyti šias arba kitas sąlygas, jei jos duoda panašius rezultatus:

skysčių chromatografijos kolonėlė (4.2.1):

 

100 mm x 4,6 mm, Hyprsil ODS, 3 µm įkrova ar panaši;

judančioji fazė (3.4):

eliuentas A (3.13.1):

vandeninis amonio acetato ir tetrabutilamonio-vandenilio sulfato tirpalas;

 

eliuentas B (3.13.2):

acetonitrilas;

 

eliuentas C (3.13.3):

metanolis;

eliuavimo būdas:

 

linijinis gradientas:

 

 

pradinės sąlygos: A:B:C = 60:20:20 (v/v/v);

 

 

po 10 min. pradedama eliuoti iki A:B:C = 45:20:35 (v/v/v)

 

 

per 30 min.;

 

 

plaunama 10 min. su B;

debitas:

 

1,5 ml/min. – 2,0 ml/min.;

įleidimo tūris:

 

100 µl;

matavimo bangos ilgis:

 

280 nm.

Chromatografinės sistemos stabilumas patikrinamas keletą kartų įleidžiant 2,0 µg/ml kalibravimo tirpalą (3.10), kol smailės aukštis ir sulaikymo trukmė nesikeis.

5.3.2. Kalibracinis tirpalas

Įleidžiama keletą kartų 20 µl kalibracinio tirpalo (3.10) ir išmatuojamas diklazurilio ir vidinio standarto smailių aukščių (plotų) vidurkiai.

5.3.3. Mėginio tirpalas

Įleidžiama keletą kartų 20 µl mėginio tirpalo (5.2.1 ar 5.2.2) ir išmatuojamas diklazurilio ir vidinio standarto smailių aukščių (plotų) vidurkiai.

 

6. Rezultatų apskaičiavimas:

6.1. Pašarai:

Diklazurilio kiekis mėginyje w (mg/kg) apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

h d, s x h i, c           C d, c x 10 x V

w = ––––––––––x–––––––––––––, [mg/kg],

h i, s x h d, c                          m

kurioje:

hd, s – mėginio tirpalo (5.2.1) diklazurilio smailės aukštis (plotas);

hi, s – mėginio tirpalo (5.2.1) vidinio standarto smailės aukštis (plotas);

hd, c – kalibracinio tirpalo (3.10) diklazurilio smailės aukštis (plotas);

hi, s – kalibracinio tirpalo (3.10) vidinio standarto smailės aukštis (plotas);

cd, c – diklazurilio koncentracija kalibraciniame tirpale (3.10) mikrogramais mililitre;

m – mėginio, paimto tyrimui, masė gramais;

V- mėginio ekstrakto tūris (5.2.1) mililitrais (t. y. 2,5 ml).

6.2. Premiksai

Diklazurilio kiekis mėginyje w (mg/kg) apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

h d, s x h i, c              C d, c x 0,02 x V x p

w = ––––––––––– x –––––––––––––––––, [mg/kg],

h i, s x h d, c                                 m

kurioje:

hd, c – kalibracinio tirpalo (3.10) diklazurilio smailės aukštis (plotas);

hi, c – kalibracinio tirpalo (3.10) vidinio standarto smailės aukštis (plotas);

hd, s – mėginio tirpalo (5.2.2) diklazurilio smailės aukštis (plotas);

hi, s – mėginio tirpalo (5.2.2) vidinio standarto smailės aukštis (plotas);

cd, c – diklazurilio koncentracija kalibraciniame tirpale (3.10) mikrogramais mililitre;

m – mėginio, paimto tyrimui, masė gramais;

V- mėginio ekstrakto tūris (5.2.1) mililitrais (t. y. 2,5 ml);

p – nominalus diklazurilio kiekis premikse miligramais kilograme.

 

7. Rezultatų patvirtinimas

7.1. Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtintas kochromatografijos ar diodinės matricos pagalba, lyginant mėginio ekstrakto (5.2.1 ar 5.2.2) ir kalibracinio tirpalo (3.10) spektrus.

7.1.1. Kochromatografija

Mėginio ekstraktas (5.2.1 ar 5.2.2) papildomas pridedant į jį tinkamą kalibracinio tirpalo (3.10) kiekį. Pridedamo diklazurilio kiekis turėtų būti panašus į išmatuotą diklazurilio kiekį mėginio ekstrakte.

Atsižvelgiant tiek į pridėtą kiekį, tiek į ekstrakto praskiedimą, padidėti turėtų tik diklazurilio smailės aukštis. Smailės plotis pusėje jos aukščio turėtų būti ± 10 % nepapildyto mėginio ekstrakto diklazurilio ar vidinio standarto smailės pločio.

7.1.2. Detekcija diodine matrica

Rezultatai vertinami remiantis šiais kriterijais:

7.1.2.1. mėginio ir standarto spektrų absorbcijos maksimumų bangų ilgiai, užregistruoti chromatogramų smailės viršūnėje, turi būti vienodi ir paklaida neturi viršyti detekcinės sistemos skiriamosios gebos sąlygojamų ribų. Šios ribos detekcijai diodine matrica paprastai yra ± 2 nm;

7.1.2.2. tarp 230 nm ir 320 nm užregistruoti mėginio ir standarto chromatogramų smailių viršūnių spektrai neturi skirtis, kai santykinė absorbcija yra nuo 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai, esant tam pačiam absorbcijos maksimumui, nėra nei vieno taško, kuriame nuokrypis tarp dviejų spektrų viršytų 15 % standarto analitės absorbcijos;

7.1.2.3. tarp 230 nm ir 320 nm mėginio ekstrakto chromatogramos smailės pakilimo, viršūnės ir nusileidimo spektrai neturi skirtis vienas nuo kito, kai santykinė absorbcija yra nuo 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai, esant tam pačiam absorbcijos maksimumui, visuose stebimuose taškuose nuokrypis tarp spektrų neviršija 15 % smailės viršūnės spektro absorbcijos.

Jei nors vienas iš šių kriterijų nepatenkinamas, analitės buvimas nėra patvirtintas.

7.2. Pakartojamumas

Skirtumas tarp dviejų lygiagrečiai atliktų to paties mėginio matavimų rezultatų neturi viršyti:

30 % santykinai didesnės vertės, kai amproliumo koncentracija yra nuo 0,5 mg/kg iki 2,5 mg/kg,

0,75 mg/kg, kai amproliumo yra nuo 2,5 mg/kg iki 5 mg/kg,

15 % santykinai didesnės vertės, kai amproliumo koncentracija yra per 5 mg/kg.

7.3. Išgava

Išgava su tuščiuoju papildytu mėginiu turi būti ne mažesnė kaip 80 %.

 

8. Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai

Tarplaboratorinių tyrimų metu 11 laboratorijų išanalizavo penkis mėginius. Du mėginiai buvo premiksai: vienas iš jų buvo su organiniu (O 100), kitas su neorganiniu (A 100) užpildu. Teorinis diklazurilio kiekis – 100 mg/kg. Trys mėginiai buvo paukščių pašarų mišiniai, pagaminti įvairių gamintojų (NL) (L1, Z1, K1). Teorinis diklazurilio kiekis – 1 mg/kg. Laboratorijoms buvo nurodyta kiekvieną mėginį išanalizuoti vieną ar du kartus. (Detalesnę informaciją apie tarplaboratorinius tyrimus galima rasti spaudoje: Journal of AOAC International, v. 77, No 6, 1994, p. 1359-1361.) Rezultatai pateikiami lentelėje.

 

 

1 mėginys

2 mėginys

3 mėginys

4 mėginys

5 mėginys

A 100

O 100

L 1

Z 1

K 1

L

11

11

11

11

6

n

19

18

19

19

12

Vidurkis (mg/kg)

100,8

103,5

0,89

1,15

0,89

Sr (mg/kg)

5,88

7,64

0,15

0,02

0,03

CVr (%)

5,83

7,38

17,32

1,92

3,34

SR (mg/kg)

7,59

7,64

0,17

0,11

0,12

CVR (%)

7,53

7,38

18,61

9,67

13,65

Nominalus kiekis (mg/kg)

100

100

1

1

1

 

L – laboratorijų skaičius;

n – vienetinių verčių skaičius;

Sr – pakartojamumo standartinis nuokrypis;

CVr – pakartojamumo variacijos koeficientas;

SR – atkartojamumo standartinis nuokrypis;

CVR – atkartojamumo variacijos koeficientas.

 

PASTABA.

Turi būti įrodyta, kad diklazurilio analizinio signalo priklausomybė nuo diklazurilio koncentracijos yra tiesinė visame matuojamų koncentracijų intervale.

______________

Amproliumo, diklazurilio ir karbadokso

kiekio pašaruose nustatymo techninio

reglamento

3 priedas

 

Karbadokso nustatymas

 

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatomas karbadokso kiekis pašaruose, premiksuose ir preparatuose. Mažiausia radimo riba yra 1 mg/kg. Mažiausia nustatymo riba yra 10 mg/kg.

 

2. Metodo esmė

Mėginys apdorojamas vandeniu ir ekstrahuojamas metanolio-acetonitrilo mišiniu. Pašarams alikvotinė filtruoto ekstrakto dalis išvaloma aliuminio oksido kolonėlėje. Premiksams ir preparatams alikvotinė filtruoto ekstrakto dalis skiedžiama vandeniu, metanoliu ir acetonitrilu iki tinkamos koncentracijos. Karbadokso kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviąja skysčių chromatografija (HPLC) su UV detektorium.

 

3. Reagentai:

3.1. Metanolis.

3.2. Acetonitrilas, tinkantis chromatografijai.

3.3. Acto rūgštis, c = 100 %, tinkantis chromatografijai.

3.4. Aliuminio oksidas, neutralus, aktyvumo laipsnis I.

3.5. Metanolio-acetonitrilo mišinys 1: 1 (v/v):

500 ml metanolio (3.1) sumaišoma su 500 ml acetonitrilo (3.2).

3.6. Acto rūgštis, c =10 %:

10 ml acto rūgšties (3.3) skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.7. Natrio acetatas.

3.8. Vanduo, tinkantis chromatografijai.

3.9. Acetatinis buferinis tirpalas, c = 0,01 mol/l, pH = 6,0:

0,82 g natrio acetato (3.7) ištirpinami 700 ml vandens (3.8). Acto rūgštimi (3.6) pH sureguliuojamas iki 6,0. Perpilama į 1000 ml matavimo kolbą, iki žymės skiedžiama vandeniu (3.8) ir išmaišoma.

3.10. HPLC judančioji fazė:

825 ml acetatinio buferinio tirpalo (3.9) sumaišomi su 175 ml acetonitrilo (3.2). Filtruojama per 0,22 µm poringumo filtrą (4.5), tirpalas degazuojamas (iš tirpalo pašalinamos dujos) (pvz.: 10 min. veikiant ultragarso vonioje).

3.11. Standartinė medžiaga: grynas karbadoksas, 3-(2-chinoksalinilmetilen)hidrazinkarboksi rūgšties metilo esterio N1, N4-dioksidas, E 850.

3.11.1. Karbadokso pradinis standartinis tirpalas, 100 µg/ml (žr.5 punktą „Matavimas“):

Į 250 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 25 mg karbadokso standartinės medžiagos (3.11) ir ištirpinama metanolio-acetonitrilo mišinyje (3.5). Kolba įdedama į ultragarso vonią (4.7). Po apdorojimo ultragarsu tirpalas atvėsinamas iki kambario temperatūros, iki žymės skiedžiamas metanolio-acetonitrilo mišiniu (3.5) ir išmaišomas. Kolba apvyniojama aliuminio folija (galima naudoti rudo stiklo indus) ir laikoma šaldytuve. Šis tirpalas oC temperatūroje yra stabilus vieną mėnesį.

3.11.2. Kalibraciniai tirpalai:

Į 100 ml matavimo kolbutes įpilama 2,0 ml, 5,0 ml, 10,0 ml ir 20,0 ml pradinio standartinio tirpalo (3.11.1). Pripilama 30 ml vandens, iki žymės praskiedžiama metanolio-acetonitrilo mišiniu (3.5) ir išmaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija. Šiuose tirpaluose yra atitinkamai 2,0 µg/ml, 5,0 µg/ml, 10,0 µg/ml ir 20,0 µg/ml karbadokso (žr.1 pastabą).

Kalibraciniai tirpalai gaminami prieš matavimą.

3.12. Vandens-[metanolio-acetonitrilo] (3.5) mišinys, 300: 700 (v/v):

300 ml vandens sumaišoma su 700 ml metanolio-acetonitrilo (3.5) mišinio.

 

4. Prietaisai:

4.1. Laboratorinė purtyklė arba magnetinė maišyklė.

4.2. Stiklo pluošto filtrinis popierius (Whatman GF/A ar panašus).

4.3. Stiklo kolonėlė (ilgis 300-400 mm, vidinis skersmuo apytiksliai 10 mm) su sukepintu fritu ir išleidimo kraneliu (žr. 2 pastabą).

4.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos įranga su įleidimo sistema, tinkama įleisti 20 µl:

4.4.1. Skysčių chromatografinė kolonėlė: 300 mm x 4 mm, C18, 10 µm įkrova, ar panaši.

4.4.2. Kintamo bangos ilgio UV detektorius arba diodinės matricos detektorius, kurio darbinis intervalas yra 225 nm – 400 nm ribose.

4.5. Membraniniai filtrai, 0,22 µm.

4.6. Membraniniai filtrai, 0,45 µm.

4.7. Ultragarso vonia.

 

5. Matavimas:

5.1. Bendrosios nuostatos (žr. 3 pastabą)

5.1.1. „Tuščiasis pašaras“

Siekiant atlikti atkartojimo testą (5.1.2), reikėtų išanalizuoti „tuščiąjį“ pašarą, patikrinant, ar jame nėra karbadokso ar trukdančių medžiagų. Testui naudojamas tuščiasis pašaras turi būti to paties tipo kaip mėginyje, be karbadokso ar trukdančių medžiagų.

5.1.2. Išgavos testas

Išgavos testą reikėtų atlikti analizuojant „tuščiąjį“ pašarą (5.1.1) ir pridedant į jį karbadokso kiekį, panašų į esantį mėginyje. Norint koncentraciją papildyti iki 50 mg/kg, į 200 ml konusinę kolbą įpilama 5,0 ml pradinio standartinio tirpalo (3.11.1). Tirpalas nugarinamas iki maždaug 0,5 ml, prapučiant pro jį azoto srautą. Pridedama 10 g tuščiojo pašaro, gerai išmaišoma, paliekama 10 min. ir ekstrahuojama (5.2).

5.2. Ekstrahavimas

5.2.1. Pašarai

Pasveriama 0,01 g tikslumu maždaug 10 g mėginio. Supilama į 200 ml konusinę kolbą. Įpilama 15,0 ml vandens, sumaišoma ir laikoma 5 min. Įpilama 35,0 ml metanolio-acetonitrilo mišinio (3.5), užkemšama ir 30 min. purtoma purtykle ar maišoma magnetine maišykle (4.1). Tirpalas filtruojamas per stiklo pluošto filtrinį popierių (4.2). Po to šis tirpalas gryninamas (5.3).

5.2.2. Premiksai (karbadokso nuo 0,1 % iki 2,0 %).

Pasveriama 0,01 g tikslumu maždaug 1g nesusmulkinto mėginio. Supilama į 200 ml konusinę kolbą. Įpilama 15,0 ml vandens, sumaišoma ir 5 min. brinkinama. Įpilama 35,0 ml metanolio-acetonitrilo mišinio (3.5), užkemšama ir 30 min. purtoma purtykle ar maišoma magnetine maišykle (4.1). Tirpalas filtruojamas per stiklo pluošto filtrinį popierių (4.2). Dalis filtrato pipete įlašinama į kalibruotą 50 ml kolbą. Įpilama 15,0 ml vandens, iki žymės praskiedžiama metanolio-acetonitrilo mišiniu (3.5) ir išmaišoma. Karbadokso koncentracija galutiniame tirpale turėtų būti apytikriai 10 µg/ml. Dalis tirpalo filtruojama per 0,45 µm filtrą (4.6). Tokiau dirbama pagal 5.4.

5.2.3. Preparatai (karbadokso per 2 %)

Pasveriama 0,001 g tikslumu maždaug 0,2 g nesumalto (nesusmulkinto) mėginio. Supilama į 250 ml konusinę kolbą. Įpilama 45,0 ml vandens, sumaišoma ir 5 min. brinkinama. Įpilama 105,0 ml metanolio-acetonitrilo mišinio (3.5), užkemšama ir maišoma. Po 15 min. purtoma purtykle ar maišoma magnetine maišykle (4.1), mėginys 15 min. veikiamas ultragarsu (4.7). Tirpalas filtruojamas per stiklo pluošto filtrinį popierių (4.2). Dalis filtrato skiedžiama vandens-metanolio-acetonitrilo mišiniu (3.12) iki galutinės 10 µg/ml – 15 µg/ml karbadokso koncentracijos (preparatams su 10 % skiedimo faktorius yra 10). Dalis tirpalo filtruojama per 0,45 µm filtrą (4.6). Toliau dirbama pagal 5.4.

5.3. Gryninimas:

5.3.1. Aliuminio oksido kolonėlės paruošimas

Pasveriami 4 g aliuminio oksido (3.4) ir supilami į stiklinę kolonėlę (4.3).

5.3.2. Mėginių gryninimas

15 ml filtruoto ekstrakto (5.2.1) supilami į aliuminio oksido kolonėlę. Pirmieji 2 ml eliuato išpilami. Kiti 5 ml surenkami ir filtruojami per 0,45 µm filtrą (4.6). Toliau dirbama pagal 5.4.

5.4. HPLC matavimas:

5.4.1. Parametrai

Siūloma taikyti šias arba kitas sąlygas, jei jos duoda panašius rezultatus:

skysčių chromatografijos kolonėlė (4.1.1): 300 mm x 4 mm, C18, 10 µm įkrova ar panaši;

judančioji fazė (3.10): acetatinio buferinio tirpalo (3.9) ir acetonitrilo (3.2) mišinys,

825: 175 (v/v);

debitas: 1,5 ml/min. – 2,0 ml/min.;

matavimo bangos ilgis: 365 nm;

įleidimo tūris: 20 µl.

Chromatografinės sistemos stabilumas patikrinamas keletą kartų įleidžiant 5,0 µg/ml kalibracinį tirpalą (3.11.2), kol karbadokso smailių aukščiai ir sulaikymo trukmės chromatogramose bus vienodi.

5.4.2. Kalibracinė kreivė

Po keletą kartų įleidžiamas kiekvienas kalibracinis tirpalas (3.11.2) ir išmatuojami kiekvienos koncentracijos smailės aukščiai (plotai). Nubraižoma kalibracinė kreivė, ant ordinačių ašies atidedant kalibracinių tirpalų smailių aukščių (plotų) vidurkius, ant abscisių – atitinkamas koncentracijas µg/ml.

5.4.3. Mėginio tirpalas

Keletą kartų įleidžiamas mėginio ekstraktas [(5.3.2) koncentratams, (5.2.2) premiksams ir (5.2.3) preparatams] ir išmatuojamas karbadokso smailių aukščių (plotų) vidurkis.

 

6. Rezultatų apskaičiavimas

Pagal mėginio tirpalo karbadokso smailių aukščių (plotų) vidurkį, remiantis kalibracine kreive (5.4.2), nustatoma mėginio tirpalo koncentracija µg/ml.

6.1. Pašarai:

Karbadokso kiekis w (mg/kg) mėginyje apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

b x V1

w =–––––––––––– , [mg/kg],

m

kurioje:

b – karbadokso koncentracija mėginio ekstrakte (5.3.2) µg/ml,

V1- ekstrakto tūris ml (t. y. 50),

m – matavimui paimto mėginio dalies svoris gramais.

6.2. Premiksai ir preparatai:

Karbadokso kiekis w (mg/kg) mėginyje apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

b x V2 F

w = –––––––––––––, [mg/kg],

m

kurioje:

b – karbadokso koncentracija mėginio ekstrakte (5.2.2 arba 5.2.3) µg/ml,

V2- ekstrakto tūris ml (t. y. 50 premiksams ir 150 preparatams),

f – skiedimo faktorius (5.2.2 premiksams arba 5.2.3 preparatams),

m – matavimui paimto mėginio dalies svoris gramais.

 

7. Rezultatų patvirtinimas:

7.1. Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtintas kochromatografijos ar diodinės matricos detektoriumi, lyginant mėginio ekstrakto ir 10,0 µg/ml kalibracinio tirpalo (3.11.2) spektrus.

7.1.1. Kochromatografija

Mėginio ekstraktas papildomas pridedant į jį tinkamą kalibracinio tirpalo (3.11.2) kiekį. Pridedamo karbadokso kiekis turėtų būti panašus į išmatuotą karbadokso kiekį mėginio ekstrakte.

Atsižvelgiant tiek į pridėtą kiekį, tiek į ekstrakto praskiedimą, padidėti turėtų tik karbadokso smailės aukštis. Smailės plotis pusėje jos aukščio turėtų būti ± 10 % nepapildyto mėginio ekstrakto karbadokso smailės pločio.

7.1.2. Nustatymas diodine matrica

Rezultatai vertinami remiantis šiais kriterijais:

7.1.2.1. mėginio ir standarto spektrų absorbcijos maksimumų bangų ilgiai, užregistruoti chromatogramų smailės viršūnėje, turi būti vienodi ir paklaida neturi viršyti detekcinės sistemos skiriamosios gebos sąlygojamų ribų. Šios ribos detekcijai diodine matrica paprastai yra ± 2 nm;

7.1.2.2. tarp 230 nm ir 320 nm užregistruoti mėginio ir standarto chromatogramų smailių viršūnių spektrai neturi skirtis, kai santykinė absorbcija yra nuo 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai, esant tam pačiam absorbcijos maksimumui, nėra nei vieno taško, kuriame nuokrypis tarp dviejų spektrų viršytų 15 % standarto analitės absorbcijos;

7.1.2.3. tarp 230 nm ir 320 nm mėginio ekstrakto chromatogramos smailės pakilimo, viršūnės ir nusileidimo spektrai neturi skirtis vienas nuo kito, kai santykinė absorbcija yra nuo 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai, esant tam pačiam absorbcijos maksimumui, visuose stebimuose taškuose nuokrypis tarp spektrų neviršija 15 % smailės viršūnės spektro absorbcijos.

Jei nors vienas iš šių kriterijų nepatenkinamas, analitės buvimas nėra patvirtintas.

7.2. Pakartojamumas

Skirtumas tarp dviejų lygiagrečiai atliktų to paties mėginio matavimų verčių neturi būti didesnis nei 15 % nuo santykinai didesnės vertės, kai karbadokso kiekis yra 10 mg/kg ir daugiau.

7.3. Išgava

Išgava su papildytu tuščiuoju mėginiu turi būti ne mažesnė kaip 90 %.

 

8. Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai

Buvo organizuoti tarplaboratoriniai tyrimai, kurių metu aštuoniose laboratorijose išanalizuoti šeši koncentratai, keturi premiksai ir trys preparatai. Kiekvienas mėginys buvo analizuotas du kartus. (Išsamesnę informaciją apie šiuos tarplaboratorinius tyrimus galima rasti Journal of the AOAC, Volume 71, 1988, p. 484-490.) Rezultatai pateikiami 1 ir 2 lentelėse:

 

1 lentelė. Koncentratų tarplaboratorinių tyrimų rezultatai.

 

 

1 mėginys

2 mėginys

3 mėginys

4 mėginys

5 mėginys

6 mėginys

L

8

8

8

8

8

8

n

15

14

15

15

15

15

Vidurkis (mg/kg)

50,0

47,6

48,2

49,7

46,9

49,7

Sr (mg/kg)

2,90

2,69

1,38

1,55

1,52

2,12

CVr (%)

5,8

5,6

2,9

3,1

3,2

4,3

SR (mg/kg)

3,92

4,13

2,23

2,58

2,26

2,44

CVR (%)

7,8

8,7

4,6

5,2

4,8

4,9

Nominalus kiekis (mg/kg)

50,0

50,0

50,0

50,0

50,0

50,0

 

2 lentelė. Premiksų ir preparatų tarplaboratorinių tyrimų rezultatai.

 

 

Premiksai

Preparatai

 

 

A

B

C

D

A

B

C

 

L

7

7

7

7

8

8

8

n

14

14

14

14

16

16

16

Vidurkis (mg/kg)

8,89

9,29

9,21

8,76

94,6

98,1

104

Sr (mg/kg)

0,37

0,28

0,28

0,44

4,1

5,1

7,7

CVr (%)

4,2

3,0

3,0

5,0

4,3

5,2

7,4

SR (mg/kg)

0,37

0,28

0,40

0,55

5,4

6,4

7,4

CVR (%)

4,2

3,0

4,3

6,3

5,7

6,5

7,4

Nominalus kiekis (mg/kg)

10,0

10,0

10,0

10,0

100

100

100

 

L – laboratorijų skaičius;

n – vienetinių verčių skaičius;

Sr – pakartojamumo standartinis nuokrypis;

CVr – pakartojamumo variacijos koeficientas;

SR – atkartojamumo standartinis nuokrypis;

CVR – atkartojamumo variacijos koeficientas.

PASTABOS:

1. Tiriant pašarus, kuriuose karbadokso yra mažiau nei 10 mg/kg, turi būti ruošiami mažesnės nei 2,0 µg/ml koncentracijos kalibraciniai tirpalai.

Taip pat gali būti naudojama stiklo kolonėlė su čiaupu ar nusmailintu (susiaurintu) galu; šiuo atveju mažas stiklo vatos kamštelis stiklinės lazdelės pagalba įkišamas į apatinį galą.

2. Karbadoksas jautrus šviesai, todėl visi matavimai turi būti atlikti blankioje šviesoje, naudojant rudo stiklo indus arba stiklo indus, apvyniotus aliuminio folija.

______________