LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS
Į S A K Y M A S
DĖL BULVIŲ RUDOJO PUVINIO FITOSANITARINĖS KONTROLĖS IR FITOSANITARIJOS PRIEMONIŲ TAIKYMO TVARKOS PATVIRTINIMO
2002 m. birželio 27 d. Nr. 242
Vilnius
Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos fitosanitarijos įstatymo (Žin., 1999, Nr. 113-3285) 4 straipsnio 3 ir 6 dalimis, remdamasis 2000 m. lapkričio 20 d. įsakymu Nr. 315 „Dėl karantininių organizmų, augalų, augalinių produktų ir kitų objektų sąrašų patvirtinimo ir 1998 m. gruodžio 28 d. įsakymo Nr. 321 pripažinimo netekusiu galios“ (Žin., 2000, Nr. 102-3244) bei vykdydamas Lietuvos Respublikos Vyriausybės 2002 m. vasario 27 d. nutarimu Nr. 300 (Žin., 2002, Nr. 25-910) patvirtintus Lietuvos pasirengimo narystei Europos Sąjungoje programos (Nacionalinė Acquis priėmimo programa) teisės derinimo priemonių ir Acquis įgyvendinimo priemonių 2002 metų planus (priemonės kodas 3.7.4.2.2-T1),
tvirtinu Bulvių rudojo puvinio fitosanitarinės kontrolės ir fitosanitarijos priemonių taikymo tvarką (pridedama).
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro
2002 m. birželio 27 d. įsakymu Nr. 242
BULVIŲ RUDOJO PUVINIO FITOSANITARINĖS KONTROLĖS IR FITOSANITARIJOS PRIEMONIŲ TAIKYMO TVARKA
Ši tvarka parengta remiantis Tarybos 1998 m. liepos 20 d. direktyva 98/57/EB dėl bulvių rudojo puvinio kontrolės.
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Šios tvarkos tikslas – užtikrinti sistemingą Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. – bulvių rudojo puvinio sukėlėjo (toliau – bakterija) fitosanitarinę kontrolę (toliau – kontrolę), siekiant bakteriją aptikti, užkirsti kelią jai atsirasti ir išplisti, o aptikus bakteriją, nustatyti jos išplitimą bei užkirsti kelią jai toliau plisti ir kontroliuoti, stengiantis išnaikinti.
II. FITOSANITARINIAI TYRIMAI
3. Tarnyba atlieka sistemingus oficialius tyrimus, ieškant bakterijos bulvių (Solanum tuberosum L.) stiebagumbiuose ir augaluose bei pomidorų (Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw) augaluose, išskyrus vaisius ir sėklas.
4. Bulvės tikrinamos imant stiebagumbių mėginius pagal III skyriuje pateikiamus bakterijai aptikti ir diagnozuoti metodus. Tuo pačiu metu atliekamas vizualinis mėginių patikrinimas perpjaunant stiebagumbius.
5. Bet koks objektas laikomas užkrėstu, jei jame randamas nors vienas užkrėstas bakterija augalas ar stiebagumbis.
6. Oficialius tyrimus, pagrįstus organizmo biologija ir konkrečiomis auginimo sistemomis, sudaro:
6.1. tiriant bulves:
6.1.1. stebėjimas augimo metu ir/arba sėklinių ir kitų bulvių pavyzdžių paėmimas augimo arba sandėliavimo metu. Šie pavyzdžiai yra tikrinami vizualiai perpjaunat gumbus;
7. Tyrimų aprašyme turi būti nurodyta:
7.1. atliekant tyrimus su bulvėmis:
7.2. atliekant tyrimus su augančiais pomidorais:
7.3. atliekant tyrimus su kitais augalais-šeimininkais, išskyrus bulves ir pomidorus, įskaitant laukinius bulvinių šeimos augalus-šeimininkus:
8. Šioje tvarkoje apibūdintos įvairios procedūros atliekamos:
III. BAKTERIJOS NUSTATYMO IR DIAGNOZAVIMO METODIKA
Bulvių gumbų rudojo puvinio ir bulvių bei pomidorų augalų bakterinio vytulio diagnozavimas
10. Šis tyrimas yra taikomas bulvių gumbams su tipiškais arba įtariamais rudojo puvinio požymiais ir bulvių bei pomidorų augalams su tipiškais arba įtariamais bakterinio vytulio požymiais. Jį sudaro greito nustatymo bandymas, patogeno išskyrimas iš užkrėsto apytakinio audinio naudojant diagnostinę terpę ir, gavus teigiamą rezultatą, bakterijos identifikavimas (žr. priedo 1 schema).
11. Požymiai:
11.1. požymiai bulvėse:
11.1.1. bulvės augale pirmoji infekcijos stadija – viršutinių augalo lapų vytimas esant aukštai dienos temperatūrai ir atsigavimas naktį. Tačiau labai greitai lapai nuvysta negrįžtamai ir augalas žūsta. Skersai nupjautų nuvytusių augalų stiebų apytakinis audinys gali paruduoti ir iš nupjauto paviršiaus išsiskiria arba lengvai gali būti išspaudžiamos į pieną panašios išskyros. Nupjautą stiebą vertikaliai panardinus į vandenį, iš apytakinių pluoštų nusidriekia gleivių siūlai;
11.1.2. bulvės gumbas, nustatant požymius, turi būti perpjaunamas skersai arti stolonų prisisegimo vietos. Ankstyvajai infekcijos stadijai būdingas apytakinio žiedo išblukimas, spalvai keičiantis nuo vaiskiai geltonos iki šviesiai rudos spalvos. Iš apytakinio žiedo po kelių minučių spontaniškai išsiveržia šviesiai kreminės spalvos išskyros. Vėliau apytakinis išblukimas paruduoja, ir nekrozė gali išsiplėsti iki parenchimatinio audinio. Išsivysčiusios ligos stadijose infekcija išsiveržia iš stolonų prisisegimo vietų ir akučių, ir dėl to žievėje gali susidaryti truputį rusvai rudos pažeistos duobelės, iš kurių gali sunktis bakterijos, prie kurių prilimpa dirvos dalelės;
11.2. požymiai pomidoruose: pomidoro augale pirmasis pastebimas požymis – labai silpni jauniausi augalo lapeliai. Palankiomis patogenui aplinkos sąlygomis (dirvos temperatūra apie 250C, dirva prisotinta drėgmės), po keleto dienų vyksta epinastija ir pasireiškia vienos augalo pusės arba viso augalo vytimas, ir galiausiai augalas žūsta. Mažiau palankiomis sąlygomis (dirvos temperatūra mažesnė nei 250C) ant kamieno gali išsivystyti daug papildomų šaknų. Tuomet ant kamieno atsiranda pastebima gliti juosta, kuri įrodo apytakinės sistemos nekrozę. Perpjovus kamieną, iš išblukusių rudų apytakinių stiebo audinių išsiskiria balti arba gelsvi bakterinio skysčio lašeliai.
12. Greito nustatymo bandymai (palengvina spėjamosios diagnozės nustatymą). Taikomas vienas iš šių bandymų:
12.1. stiebo gleivių siūlų susidarymo bandymas. Bakterijos buvimas nustatomas vystančiuose bulvių ir pomidorų stiebuose. Stiebas nupjaunamas truputį virš dirvos paviršiaus. Nupjautas stiebas įmerkiamas į menzūrą su vandeniu. Netrukus bakterijų gleivių siūlai pradeda tekėti iš apytakinių pluoštų. Visoms kitoms bulvių apytakinę infekciją sukeliančioms bakterijoms šis reiškinys nebūdingas;
12.2. poli-beta hidroksibutirato (toliau – PBH) granulių nustatymas. PBH granulės bakterijų ląstelėse tampa regimos dažant Nilo mėlynuoju A arba Sudano juoduoju B. Dažymas atliekamas taip: ant mikroskopo objektinio stiklelio paruošiamas išskyrų arba suspenduoto audinio tepinėlis, arba kultūros, 48 valandas augintos ant MPGA ar SPA maitinamosios terpės, tepinėlis (žr. priede Maitinamoji terpė, naudojama Ralstonia solanacearum išskyrimui ir auginimui). Paruošiama 2 biotipo /3 rasės štamo teigiamos kontrolės tepinėliai ir, jei manoma, kad tai naudinga, heterologiško štamo neigiamos kontrolės tepinėlis. Leidžiama išdžiūti. Keletą kartų apatinis stiklelio paviršius greitai leidžiamas per liepsną, kol tepinėlis užsifiksuos;
12.3. Nilo mėlynojo bandymas. Bandymas atliekamas taip: užpilamas fiksuotas tepinėlis 1% vandeniniu Nilo mėlynojo A tirpalu; 10 min. laikoma 55°C temperatūroje; nupilamas dažantis tirpalas; nuplaunama, trumpai palaikant po silpna vandens srovele; filtriniu popieriumi pašalinamas vandens perteklius; tepinėlis užpilamas 8% acto rūgštimi; palaikoma vieną minutę kambario temperatūroje; nuplaunama po silpna vandens srovele; tepinėlis nusausinamas filtriniu popieriumi; užlašinamas lašas vandens; uždeniama dengiamuoju stikleliu; nudažytas tepinėlis ištiriamas epifluorescenciniu mikroskopu, kurio bangos ilgis – 450 nm, didinamoji galia – 1 000 kartų, naudojant imersinį aliejų; stebimas ryškiai oranžinis PHB granulių švytėjimas, o stebint dienos šviesoje, įsitikinama, kad nuosėdos yra ląstelės viduje ir ląstelių morfologija yra būdinga bakterijai;
12.4. Sudano juodojo bandymas. Bandymas atliekamas taip: fiksuotas tepinėlis užpilamas 0,3% Sudano juodojo B tirpalu 70% etanolyje; palaikoma 10 min. kambario temperatūroje; nupilamas dažantis tirpalas; trumpai nuplaunama po vandens srove; filtriniu popieriumi pašalinamas vandens perteklius; tepinėlis trumpam panardinamas į ksilolą; nusausinama filtriniu popieriumi (atliekama traukos spintoje); tepinėlis užpilamas 0,5 % vandeniniu safranino tirpalu ir 10 min. paliekamas kambario temperatūroje (operacija atliekama traukos spintoje); nuplaunama silpna vandens srovele; tepinėlis nusausinamas filtriniu popieriumi, uždengiamas dengiamuoju stikleliu ir tiriamas šviesos mikroskopu, naudojant išsklaidytą šviesą, imersinį aliejų ir 1 000 x. PHB granulės bakterijos ląstelėje nusidažo mėlynai juoda spalva, o ląstelės sienelė nusidažo rožine spalva;
13. Išskyrimo procedūra:
13.1. iš gumbo apytakinio žiedo arba stiebo apytakinio audinio pašalinamos išskyros arba pašviesėjęs audinys. Suspenduojama nedideliame sterilaus distiliuoto vandens kiekyje arba 50 mM fosfatiniame buferyje. Paliekama 5–10 minučių ant stalo;
13.3. standartinis suspensijos ir jos tirpalų kiekis perkeliamas ant pagrindinės maitinamosios terpės (NA, MPGA ir SPA) ir/arba ant Kelmano tetrazolio terpės (žr. priede Maitinamoji terpė, naudojama Ralstonia solanacearum išskyrimui ir auginimui) ir/arba ant SMSA selektyviosios terpės (žr. priede Medžiagos, naudojamos selektyviam auginimui ir praturtinimo bandymuose). Paskleidžiama arba įbrėžiama, naudojant atitinkamą sėjimo techniką. Kaip teigiama kontrolė naudojama virulentiško 2 biotipo 3 rasės štamo atskiesta bakterijos suspensija;
13.4. lėkštelės tris dienas laikomos 28°C temperatūroje. Jei augimas vyksta lėtai, auginimo periodas pratęsiamas iki šešių dienų, atsižvelgiant į tai, kad kolonijos, esančios ant SMSA lėkštelių, dažnai pasidaro netipiškos ir žūsta;
13.5. ant pagrindinės maitinamosios terpės virulentiškos bakterijos sudaro perlų baltumo, plokščias, netaisyklingas ir takias kolonijas, dažnai su būdingais menturiais;
13.6. Kelmano tetrazolio terpėje virulentiškos bakterijos tipiškos kolonijos yra kreminės spalvos, plokščios, netaisyklingos ir takios su kraujo spalvos menturiais viduryje. Nevirulentinės bakterijos formos sudaro riebias tamsiai raudonas kolonijas;
13.7. SMSA terpėje virulentiškos bakterijos tipiškos kolonijos yra pieno baltumo, plokščios, netaisyklingos ir takios, o vidurys – kraujo raudonumo spalvos;
13.8. bakterijos nevirulentinės formos sudaro mažiau takias kolonijas, kurios visos (ne tik centras) yra nuo rožinės iki raudonos spalvos SMSA terpėje;
14. Patvirtinimo bandymai:
14.1. bakterijos identifikuojamos naudojant vieną iš žemiau pateiktų būdų:
14.1.1. maitinamieji ir fermentiniai bandymai. Išvardytos bakterijos fenotipinės savybės paprastai arba pasireiškia arba nepasireiškia (žr. priedo 4 lentelę);
14.1.2. IF bandymas. Iš kultūros ir kontrolinio štamo (štamų) paruošiama 106 ląstelių viename mililitre suspensija ir keletas dvigubai praskiestų antiserumo tirpalų. Taikoma IF procedūra. IF bandyme naudojamos kultūros titras privalo atitikti teigiamos kontrolės titrą;
14.1.3. ELISA bandymas. Iš kultūros ir kontrolinio štamo (štamų) paruošiama 106 ląstelių viename mililitre suspensija. Taikoma ELISA procedūra. ELISA bandyme naudojamos kultūros koncentracija privalo atitikti teigiamos kontrolės koncentraciją;
14.1.4. PGR bandymas. Iš kultūros ir kontrolinio štamo (štamų) paruošiama 106 ląstelių viename mililitre suspensija. Taikoma PGR procedūra. PGR bandyme naudojamos kultūros produktas turi būti to paties dydžio ir sukarpytas tuo pačiu restrikcijos fermentu kaip ir teigiamos kontrolės;
14.1.5. fluorescencinis in-situ hibridizavimas (toliau – FISH). Iš kultūros ir kontrolinio štamo (štamų) paruošiama 106 ląstelių viename mililitre suspensija. Taikoma FISH procedūra (van Beuningen et al, 1995) su OLI-1 PGR pradmeniu (Seal et al, 1993). Kultūros reakcija turi būti tokia pati kaip ir teigiamos kontrolės;
14.1.6. baltymo atskyrimas. Denatūruoti nepažeistų ląstelių baltymai atskiriami poliakrilamido gelio elektroforeze – Page (Stead, 1992);
14.1.7. sočiųjų rūgščių profiliavimas (toliau – SRP). Kultūra ir teigiamos kontrolės štamas 48 valandas auginami 28°C temperatūroje ant triptikazės sojos agaro ir taikoma SRP procedūra (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, 1992). Kultūros profilis turi atitikti teigiamos kontrolės profilį. Esant apibrėžtoms sąlygoms, būdingos sočiosios rūgštys yra: 14:0 3OH; 16:0 2OH; 16:1 2OH ir 18:1 2OH;
14.2. štamo charakteristika. Štamo charakteristika nėra privaloma, tačiau rekomenduojama kiekvienu nauju atveju, naudojant bent vieną iš šių bandymų:
14.2.1. biotipo nustatymas. Bakterija yra skirstoma į biotipus pagal sugebėjimą gaminti rūgštį iš trijų skirtingų heksozės alkoholių ir trijų cukrų (Hayward, 1964 ir 1994) (žr. priede 1 lentelę). Pagal papildomus bandymus 2 biotipą galima skirstyti į subfenotipus (Hayward, 1994) (žr. priede 2 lentelę);
14.2.2. rasės nustatymas. Rasė (Buddenhagen et al., 1962) nustatoma remiantis patogeniškumo bandymu, atliekamu su pomidorų, baklažanų ar tabako augalais ir padidinto jautrumo reakcijos (toliau – PJR) bandymu, atliekamu su tabako lapais (Lozano ir Sequeira, 1970) (žr. priede 3 lentelę). Rasės nustatymas, atliekant patogeniškumo arba tabako padidėjusio jautrumo reakciją, nėra visiškai patikimas ir vietoj to gali būti nustatomas pagal tai, koks biotipas užkrečia natūralų augalą-šeimininką;
14.2.3. kultūra gali būti charakterizuojama Genomo atspaudais. Bakterijos komplekso štamo molekulinis suskirstymas gali būti atliekamas:
14.2.3.1. RFLP analizės būdu (restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo nustatymas su DNR pradmenimis) (Cook et al, 1989);
14.3. patogeniškumo bandymas. Šis bandymas skirtas bakterijos nustatymo patvirtinimui ir kultūrų, identifikuotų kaip bakterija, virulentiškumo įvertinimui:
14.3.1. iš kultūros ir teigiamos kontrolės štamo paruošiamas 106 ląstelių 1 mililitre inokuliantas. Paskiepijama 5–10 pomidorų arba baklažanų augalų, trečiojoje arba vėlesnėje tikrųjų lapų stadijoje (žr. 22 punktą, Biobandymas pagal Janse). Auginama iki dviejų savaičių 22–28°C temperatūroje ir kasdien laistoma, palaikant aukštą santykinį drėgnumą. Stebimas vytimas ir/arba epinastija, chlorozė, nykimas;
14.3.2. bakterija iš augalų su pažeidimų požymiais išskiriama paimant dalį stiebo audinio nuo kamieno 2 cm atstumu virš paskiepijimo vietos. Susmulkinama ir suspenduojama nedideliame sterilaus vandens kiekyje arba 50 mM fosfatiniame buferyje. Tada auginama lėkštelėje tikrinant, ar yra tipiškų bakterijos kolonijų.
Bakterijos nustatymas ir identifikavimas bulvių gumbų pavyzdžiuose
15. Ši procedūra skirta latentiniam užkratui bulvių gumbuose nustatyti vieno arba, pageidautina, keleto nustatymo bandymų pagalba, ir jeigu jie teigiami, papildomi patogeno išskyrimo bandymu; t. y. tuo atveju, kai išskiriamos tipiškos kolonijos, identifikuojama grynoji bakterijos kultūra (žr. priedo 2 schema).
17. Bandinio paruošimas tyrimui:
17.1. jei manoma, kad tai naudinga, prieš bandymą atliekamos šios procedūros:
17.1.1. iki dviejų savaičių bandinys laikomas 25–30°C temperatūroje, siekiant paskatinti mažos bakterijos populiacijos dauginimąsi;
17.2. su švariu ir dezinfekuotu skalpeliu arba peiliu, skirtu daržovėms pjaustyti, nulupama odelė ties gumbo stolono prisijungimo vieta taip, kad pirmiausia būtų matomi apytakiniai audiniai. Iš apytakinio audinio, esančio ties stolono prisitvirtinimo vieta, atsargiai išpjaunama kūgio formos šerdis (3–5 mm diametro). Paliekama kuo mažiau neapytakinio audinio. Šitaip paruošiami visi pavyzdžio gumbai. Šiame etape atliekama vizualinė gumbų apžiūra (žr. 11 punktą). Atidėkite ir atskirai ištirkite visus gumbus, kurie turi požymių arba yra labai supuvę (žr. 10–14 punktus);
17.3. bulvių gumbų šerdys sudedamos į indą. Pageidautina juos nedelsiant paruošti. Jei tai neįmanoma, jie ten laikomi ne ilgiau kaip 24 valandas, o 4°C temperatūroje – ne ilgiau kaip 72 valandas;
17.4. šerdys paruošiamos atliekant vieną iš šių procedūrų:
17.4.1. šerdys perkeliamos į tinkamą indą. Pripilama pakankamai mirkymo buferio (žr. priede Medžiagos, naudojamos pavyzdžiui paruošti), kad jis apsemtų šerdis. Šerdys smulkinamos Waring Blender arba Ultra Thurrax maišikliuose iki vientisos masės. Reikia vengti per didelės homogenizacijos. 15–30 min. mirkymo buferiui leidžiama įsigerti;
17.4.2. šerdys perkeliamos į tinkamą kolbą. Pripildoma pakankamai mirkymo buferio, kad jis apsemtų šerdis. Kolba patalpinama į purtyklę. 4 valandas laikoma 20°C–22°C temperatūroje purtant 50–100 apsisukimų per min. greičiu arba 16–24 valandas 4°C temperatūroje;
17.4.3. šerdys perkeliamos į stiprų vienkartinį mirkymo maišelį (pvz., į sterilų Stomacherio maišelį, kurio matmenys 105 mm × 150 mm). Šerdys atsargiai sutraiškomos tinkamu įrankiu, pvz., plaktuku, iki vientisos masės. Pripilama pakankamai mirkymo buferio, kad jis apsemtų šerdis. 15–30 min. mirkymo buferiui leidžiama pastovėti;
17.5. bakterijos iš paruoštų šerdžių išskiriamos atliekant vieną iš šių procedūrų:
17.5.1. maceratas atsargiai supilamas į centrifuginį mėgintuvėlį, šerdžių liekanas paliekant kolboje arba maišelyje. Jei perpiltas pavyzdys yra drumstas, žemesnėje kaip 10°C temperatūroje 10 min. sukama centrifugoje ne daugiau kaip 180 g. Žemesnėje kaip 10°C temperatūroje 15 min. centrifuguojamas perpiltas pavyzdys arba pirmojo centrifugavimo etapo supernatantas, esant 7 000 g, arba 10 min. – ties 10 000 g. Nesuardant nuosėdų, išpilamas supernatantas;
17.5.2. pavyzdys nufiltruojamas, naudojant filtrą su 40–100 µm skylutėmis. Filtravimas paspartinamas naudojant vakuuminį siurblį. Filtratas supilamas į centrifuginį mėgintuvėlį. Filtras išplaunamas mirkymo buferiu. Žemesnėje kaip 10°C temperatūroje filtratas centrifuguojamas 15 min. 7 000 g arba 10 min. 10 000 g. Nedrumsčiant nuosėdų, išpilamas supernatantas;
17.6. nuosėdos užpilamos 1 ml buferiu (žr. priede Medžiagos, naudojamos pavyzdžiui paruošti). Padalijamos į dvi lygias dalis ir kiekviena perkeliama į mikromėgintuvėlį. Bandymui naudojamas vienas mėgintuvėlis. Mikromėgintuvėlis tyrimo metu laikomas 4°C temperatūroje. Įdedama 10–25 proc. (ml/ml) sterilaus glicerino į kitą mikromėgintuvėlį. Sumaišoma. Saugoma -18°C temperatūroje (savaites) arba -70°C temperatūroje (mėnesius).
18. IF bandymas. Naudojamas bakterijos serumas, pageidautina 3 rasei/2 biotipui. Pagal gamintojo rekomendaciją nustatoma 106 ląstelių 1 ml suspensijos titras iš homogeniško bakterijos štamo su atitinkamo praskiedimo fluorescencinio izotiocijanato (FITC) konjugato tirpalu. IF teste naudojamas žalias antiserumas turėtų būti bent 1:2 000 titro. Naudojami mikroskopiniai stikleliai su daugybe langelių, pageidautina su 10 langelių bent 6 mm skersmens. Į kiekvieną bandymo stiklelį įtraukiama konjugato kontrolė. Jei FITC kontrolėje pastebima bent viena teigiama ląstelė, bandymas turėtų būti kartojamas naudojant ir FDB kontrolę. Paruošiami atskiri teigiamos kontrolės stikleliai su atitinkamo bakterijos rasės/biotipo štamo 106 ląstelių į ml suspensija. Kiekvienam bandymui naudojamas vienas stiklelis;
18.1. bandymo stikleliai paruošiami tokiu būdu:
18.1.1. resuspenduotoms nuosėdoms, kuriose yra sąlyginai mažai krakmolo: ant langelių eilės pipete užlašinamas išmatuotas standartinis resuspenduotų nuosėdų tūris (15 µl pakanka 6 mm skersmens langeliui, didesniems langeliams kiekis padidinamas). Likusioji eilė gali būti panaudota kaip dublikatas arba pakartojimui (žr. priede 1 diagramoje);
18.1.2. kitoms nuosėdoms: paruošiami dešimtainiai resuspenduotų nuosėdų buferyje praskiedimai, būtent 1/10, 1/100 ir 1/1000. Ant langelių eilės pipete užlašinamas išmatuotas standartinis tūris (15 µl pakanka 6 mm skersmens langeliui, didesniems langeliams tūris padidinamas). Likusioji eilė gali būti panaudota kaip dublikatas arba pakartojimui (žr. priede 2 diagramoje);
18.2. lašeliams leidžiama išdžiūti. Bakterijų ląstelės ant stiklelio užfiksuojamos kaitinant liepsnoje arba 95 proc. etanoliu;
18.3. IF procedūra: atsižvelgiant į 18.1.1 papunktyje nurodytą bandymo stiklelio paruošimą, paruošiama dukart skiedžiamo antiserumo IF buferyje praskiedimų seka (žr. priede IF bandymo metu naudojamos medžiagos): 1/4 titro (T/4), 1/2 titro (T/2), titras (T) ir dvigubas (2T) titras. Atsižvelgiant į 18.1.2 papunktyje nurodytą bandymo stiklelio paruošimą, paruošiamas darbinis antiserumo tirpalas IF buferyje. Darbinis tirpalas yra optimalaus specifiškumo antiserumo tirpalas ir paprastai sudaro pusę titro;
18.3.1. bandymo stikleliai išdėliojami ant drėgno filtrinio popieriaus. Bandymo langeliai padengiami antiserumo tirpalu (tirpalais). FDB buferis užpilamas ant FITC langelių. Ant langelių užpilto antiserumo tūris turi atitikti ekstrakto tūrį;
18.3.3. antiserumo lašeliai nuo stiklelio nukratomi ir IF buferiu kruopščiai nuskalaujamas stiklelis. 5 minutes plaunama IF buferiu-Tween, o po to 5 minutes – IF buferiu (žr. priede IF bandymo metu naudojamos medžiagos). Rūpestingai pašalinamas drėgmės perteklius;
18.3.4. stikleliai išdėliojami ant drėgno filtrinio popieriaus. Bandymo langeliai ir FITC langelis padengiami FITC konjugato tirpalu, naudojamu titrui nustatyti. Ant langelių užpilto konjugato tūris turi atitikti naudojamo antiserumo tūrį;
18.3.6. nuo stiklelio konjugato nukratomi lašeliai. Nuskalaujama ir praplaunama, kaip nurodyta anksčiau (18.3.3). Rūpestingai pašalinamas drėgmės perteklius;
18.4. IF bandymo analizavimas. Bandymo stikleliai tiriami epifluorescenciniu mikroskopu su filtrais, jautriais FITC, naudojant imersinį aliejų ir 500–1 000 x. Langeliai peržiūrimi skersai ir išilgai bei pagal perimetrą. Pirmiausia patikrinamas teigiamos kontrolės stiklelis. Ląstelės turi ryškiai švytėti ir būti visiškai nusidažiusios. Jei nusidažymas nukrypęs nuo normos, testą reikia pakartoti. Peržiūrimi bandymo stikleliai. Pirmiausia stebima, ar FITC kontrolės langeliuose nėra švytinčių ląstelių. Švytinčios ląstelės FITC kontrolėje nurodo nespecifinį konjugato jungimąsi, autofluorescenciją arba užteršimą. Pastebėjus šį dalyką, testas kartojamas. Bandymo langeliuose stebimos bakterijai charakteringos morfologijos švytinčios ląstelės. Švytėjimo intensyvumas turi atitikti teigiamos kontrolės štamo švytėjimo intensyvumą esant tokiam pačiam antiserumo praskiedimui. Į ląsteles, kurios nevisiškai nusidažiusios arba silpnai fluorescuoja (švyti), neturi būti kreipiamas dėmesys, jei tokių ląstelių nėra daug (žr. priede IF bandymo rezultatų aiškinimas);
18.5. IF bandymo rezultatų aiškinimas:
18.5.1. jei nerandama ryškiai švytinčių tipiškos morfologijos ląstelių, laikoma, kad IF bandymas yra neigiamas;
18.5.2. jei randama ryškiai švytinčių tipiškos morfologijos ląstelių, tai nustatomas vidutinis ląstelių skaičius mikroskopo lauke ir apskaičiuojamas ląstelių skaičius (N) 1 mililitre resuspenduotų nuosėdų (žr. priede Užkrėtimo lygio nustatymas IF bandymu). IF bandyme nustatymo riba laikoma 103 ląstelių populiacija 1 mililitre resuspenduotų nuosėdų:
18.5.2.1. bandiniuose, kuriuose N > 103 ląstelių 1 ml resuspenduotų nuosėdų, IF bandymas laikomas teigiamu;
18.5.2.2. bandiniuose, kuriuose N 103 ląstelių 1 ml resuspenduotų nuosėdų, IF bandymas gali būti laikomas teigiamu;
18.5.2.3. jei didelis skaičius (>105 ląstelių 1 mililitre) nevisiškai pilnai arba silpnai švytinčių ląstelių yra matomas antiserumo titre, turi būti atliekamas antras testas, pagrįstas skirtingu biologiniu principu arba kartojamas IF bandymas arba su antruoju antiserumu, arba dešimt kartų praskiestomis nuosėdomis.
19. ELISA bandymas pagal Robinson-Smith et al., 1995. Naudojamas bakterijos antiserumas, pageidautina 3 rasei/2 biotipui. Nustatomas 106 ląstelių 1 mililitre suspensijos titras iš bakterijai homogeniško štamo. Rekomenduojama naudoti NUNC- Polysorb mikroplokštelės. Naudojama neigiama bulvių ekstrakto kontrolė ir fosfato druskų buferio (FDB) kontrolė. Kaip teigiama kontrolė naudojama bakterijos atitinkamos rasės/tipo štamo 106 ląstelių 1 mililitre suspensija. Tiriama tokiu pačiu būdu, kaip ir bandinys (bandiniai), tačiau gerai atskiriama nuo bandinių, esančių ant mikroplokštelės;
19.1. į mikromėgintuvėlį pipete įlašinama 100–200 µl resuspenduotų nuosėdų. 4 minutes kaitinama 100°C temperatūroje. Mikromėgintuvėlis padedamas ant ledo;
19.2. pridedamas toks pats tūris dvigubo stiprumo karbonatinio padengimo buferio (žr. priede ELISA bandyme naudojamos medžiagos). Maišoma;
19.3. įdedama 100 µl mėginio bent į du mikroplokštelės šulinėlius. Vieną valandą laikoma 37°C temperatūroje arba visą naktį + 4°C temperatūroje;
19.4. staigiu judesiu išpilama iš akučių. Akutės tris kartus išplaunamos FDB-Tween buferiu (žr. priede ELISA bandyme naudojamos medžiagos), bent 5 min. paliekant paskutinį plovimo buferį akutėse;
19.5. paruošiamas tinkamas bakterijos antiserumo tirpalas blokavimo buferyje (žr. priede ELISA bandyme naudojamos medžiagos). Į akutes įpilama 100 µl praskiesto antiserumo. Valandą laikoma 37°C temperatūroje;
19.6. staigiu judesiu antiserumas išpilamas iš šulinėlių. Šulinėliai išplaunami, kaip nurodyta aukščiau (19.4);
19.7. paruošiamas tinkamas šarminės fosfatazės konjugatas blokavimo buferyje. Į akutes įpilama 100 µl konjugato tirpalo. Valandą laikoma 37°C temperatūroje;
19.8. konjugatas greitai išgriebiamas iš akučių. Išplaunami šulinėliai, kaip nurodyta anksčiau (19.4 ir 19.6);
19.9. paruošiamas šarminės fosfatazės substrato tirpalas (žr. priede ELISA bandyme naudojamos medžiagos). 100 µl įpilama į šulinėlius. Nuo 30 min. iki 1 val. laikoma tamsoje, kambario temperatūroje;
20. PGR testas pagal Seal et al., 1993. Pipetės antgaliai su filtrais turi būti naudojami visuose bandinio paruošimo etapuose ir atliekant kitas PGR bandymo procedūras. Kaip teigiama kontrolė, iš bakterijos 3 rasės/ 2 biotipo paruošiama 106 ląstelių 1 ml suspensija. Tiriama tuo pačiu būdu, kaip ir pavyzdys (pavyzdžiai):
20.1. į mikromėgintuvėlį pipete įlašinama 100 µl resuspenduotų nuosėdų. Kaip alternatyvą galima įpilti 90 µl resuspenduotų nuosėdų į mikromėgintuvėlį su 10 µl 0,5 M NaOH. Sumaišoma vartant mikromėgintuvėlį;
20.3. steriliame distiliuotame arba ypač švariame vandenyje (YŠV) paruošiami bent du dešimtainio praskiedimo tirpalai, pvz., 1/10 ir 1/100, o jei reikia, ir daugiau;
20.4. steriliame mėgintuvėlyje paruošiamas PGR reakcijos mišinys (žr. priede Medžiagos PGR bandymui), pridedant nurodytų komponentų (žr. priede 5 lentelę);
20.5. PGR amplifikacija:
20.5.1. neprivaloma: mėgintuvėliai centrifuguojami su virintu bandiniu ir teigiama kontrole. Į mėgintuvėlius su PGR reakcijos mišiniu nurodyta tvarka pridedama 2–5µl bandinio (bandinių), vandens kontrolės ir teigiamos kontrolės. Mėgintuvėliai patalpinami į DNR ciklinio termostato kaitinimo bloką;
20.5.2. vykdoma tokia programa: ciklo, susidedančio iš 2 minučių 96°C temperatūroje, vyksta matricos denatūracija; 50 ciklų, susidedančių iš 20 sekundžių 94°C temperatūroje vykstančios denatūracijos; 20 sekundžių 68°C temperatūroje vykstančio pradmenų jungimosi; 30 sekundžių 72°C temperatūroje vykstančio kopijos padauginimo; vieno ciklo, susidedančio iš 10 minučių 72°C temperatūroje, kurio metu vyksta tolesnis pagausinimas; vieno ciklo laikant 4°C temperatūroje. Šie parametrai yra Perkin Elmer 9600 markės. Kitiems cikliniams termostatams gali reikėti padengti mineraliniu aliejumi PGR reakcijos mėgintuvėliuose ir/arba amplifikacijos procedūros trukmės tarpsnių modifikavimo;
20.6. PGR produkto analizė. PGR fragmentai nustatomi agarozės gelio elektroforeze bei dažant etidžio bromidu;
20.6.1. atsargiai paruošiamas tinkamas agarozės gelis, pridedant karštą agarozę į triacetato elektroforezės (TAE) buferį;
20.6.2. išsilydžiusi agarozė atvėsinama iki 50–60C° temperatūros, supilama į elektroforezės bloką ir įterpiamos šukutės. Tirpalui leidžiama sukietėti;
20.6.3. išimamos šukutės. Gelis panardinamas į TAE taip, kad buferis jį tik truputį (2–3 mm) apsemtų;
20.6.4. ant parafilmo užlašinama 3 µl lašeliai buferio. Pridedama 12 µl PGR produkto iš bet kurio pavyzdžio, teigiamos kontrolės arba vandens kontrolės ir prieš lašinant atsargiai sumaišoma sutraukiant į pipetės antgalį. Nurodytus kiekius galima pakeisti, kad jie atitiktų agarozės gelio skylučių tūrį;
20.6.6. sujungiama elektros šaltinio laidai ir elektroforezės įrenginys. 5–8 V/cm, kol judėjimo indikatoriaus priekinė dalis pasieks 1 cm iki gelio pabaigos;
20.6.7. išjungiamas elektros šaltinis. Laidai atjungiami nuo elektroforezės bloko. Atsargiai išimamas gelis. Jis pamerkiamas 30–45 min. etidžio bromido tirpale. Dirbant su etidžio bromidu, naudojamos vienkartinės pirštinės, nes jis yra stiprus mutagenas;
20.6.9. ultravioletinėje šviesoje stebimas amplifikuotas DNR fragmentas (fragmentai). Bakterijos PGR produktas su pradmenimis OLI-1 ir Y-2 yra 288 bp ilgio. Pavyzdys tikrinamas su DNR žymeniu ir teigiama kontrole. Vandens kontrolė visais atvejais turi būti neigiama. Jei ji teigiama, testas kartojamas;
20.7. restrikcijos fermentų analizė: 8,5 µl PGR produkto perkeliama į naują mikromėgintuvėlį. Įdedama 1 µl 10 x fermentinio buferio ir 0, 5 µl restrikcijos fermento Ava II; atsargiai sumaišoma sutraukiant į pipetę. Jei lašai pasilieka ant mėgintuvėlio sienelių, pasukama mikrocentrifuga. Valandą laikoma 37°C temperatūroje; sukarpytas PGR fragmentas ištiriamas agarozės gelio elektroforeze, kaip nurodyta anksčiau;
20.8. PGR bandymo rezultatų aiškinimas:
20.8.1. PGR bandymas yra neigiamas, jei nerandama charakteringo 288 bp fragmento, ir fragmentas yra nustatomas bakterijos štamo teigiamoje kontrolėje;
21. Selektyvaus auginimo bandymas pagal Elphinstone et al., 1996:
21.1. bandymas atliekamas naudojant tinkamą tirpalo auginimo lėkštelėse techniką, pavyzdžiui:
21.1.1. paruošiami bent du dešimtainiai tirpalai, būtent 1/10 ir 1/100 ar daugiau, jei manoma, kad reikia, nuosėdų buferyje resuspenduotų nuosėdų. Pipete užlašinamas išmatuotas standartinis kiekis (50–100 µl) resuspenduotų nuosėdų ir jų kiekvieno atskiesto tirpalo ant modifikuotos SMSA selektyvios terpės (žr. priede Medžiagos, naudojamos selektyviam auginimui ir praturtinimo bandymuose) ir paskleidžiama su stikline mentele ant viso terpės paviršiaus. Jei naudinga, 10 µl resuspenduotų nuosėdų su kilpele paskleidžiama (štrichais) ant viso terpės paviršiaus. Kilpelė nudeginama prieš kiekvieną štrichavimą;
21.2. naudojant tą pačią auginimo lėkštelėse techniką, 106 ląstelių 1 ml suspensija iš bakterijos 3 rasės/ 2 tipo virulentiško štamo kaip pozityvi kontrolė panaudojama ant atskirų modifikuotų SMSA lėkštelių;
21.3. lėkštelės laikomos 28°C temperatūroje. Lėkštelių duomenys pradedami analizuoti po trijų dienų. Jeigu jie neigiami, laikoma iki šešių dienų. Virulentiškos bakterijos kolonijos yra pieno spalvos baltumo, plokščios, netaisyklingos ir takios, vidurys kraujo raudonumo ir su vidiniais ruoželiais ar menturiais;
21.4. tipiškos morfologijos kolonijos išgryninamos persėjant ant pagrindinės maitinamosios terpės (žr. priede Maitinamoji terpė, naudojama Ralstonia solanacearum išskyrimui ir auginimui);
21.6. selektyvaus auginimo bandymo aiškinimas:
21.6.1. selektyvaus auginimo bandymas yra neigiamas, jei po šešių dienų neišskirta bakterijų kolonijų arba bakterijų kolonijos yra netipiškos bakterijai, su sąlyga, kad nėra kitų bakterijų kolonijų slopinimo ir kad bakterijai būdingos kolonijos rastos teigiamose kontrolėse;
22. Biobandymas pagal Janse, 1988:
22.1. kiekvienam bandymo pavyzdžiui imama po 10 pomidorų ir baklažanų augalų sodinukų trečiojoje tikrųjų lapų stadijoje. 24 valandas prieš inokuliaciją bandymui skirti augalai nelaistomi;
22.2. 100 µl resuspenduotų nuosėdų paskiriama inkubuoti augalus. Skiepijama į stiebą tarp skilčialapių ir dar vienoje ar keliose vietose;
22.3. tuo pačiu būdu paskiepijama 10 daigų 106 ląstelių viename mililitre tirpalu iš bakterijai virulentiškos 2 biotipo/3 rasės štamo teigiamai kontrolei ir nuosėdų buferiu, neigiamai kontrolei. Teigiamos kontrolės augalai atskiriami nuo kitų augalų, kad būtų išvengta kryžminio užsikrėtimo;
22.4. bandymo augalai toliau auginami iki 4 savaičių 22–28°C temperatūroje ir aukštoje santykinėje drėgmėje, kasdien laistant. Stebimas vytimas, epinastija, chlorozė ir/arba nykimas;
22.5. išskiriama iš užkrėstų augalų (žr. Bulvių gumbų rudojo puvinio ir bulvių bei pomidorų augalų bakterinio vytulio diagnozavimas). Identifikuojamos tipiškos morfologijos grynos kultūros (14.1) ir patvirtinamos bakterijos kultūros patogeniškumo testu;
22.6. jei manoma, kad tai naudinga, patikrinama, ar nėra infekcijos bandymo augaluose be infekcijos požymių. 2 cm atstumu virš inokuliacijos taško išpjaunama iš kiekvieno tiriamo augalo stiebo 1 cm dalis. Audiniai homogenizuojami mirkymo buferyje. Atliekamas auginimo lėkštelėse testas. Tirpalas išpilstomas į lėkšteles. Jei rezultatas teigiamas, identifikuojamos tipiškos morfologijos grynos kultūros ir patogeniškumo testu patvirtinamos bakterijos kultūros;
23. Praturtinimo bandymas pagal Elphinstone et al, 1996;
23.1. 100 µl resuspenduotų nuosėdų įpilama į tris ml modifikuoto SMSA sultinio (žr. priede Medžiagos, naudojamos selektyviam auginimui ir praturtinimo bandymuose);
23.2. laikoma 48 valandas, bet kuriuo atveju ne ilgiau kaip 72 valandas 28°C temperatūroje, mėgintuvėlį laisvai užkimšus, kad vyktų aeracija;
IV. FITOSANITARINĖS PRIEMONĖS
25. Kiekvienu įtariamo paplitimo atveju tarnyba turi užtikrinti laboratorinį tyrimą, taikant III skyriuje aprašytus metodus, siekiant patvirtinti arba paneigti įtariamą paplitimą.
26. Belaukiant, kol bus patvirtintas arba paneigtas 25 punkte minimas įtariamas paplitimas, kiekvienu įtariamo paplitimo atveju, jeigu buvo pastebėti organizmo sukelti ligos diagnostiniai simptomai arba atliekant greito nustatymo bandymą (bandymus) buvo gautas teigiamas rezultatas, arba atliekant nustatymo bandymą (bandymus) buvo gautas teigiamas rezultatas, tarnyba produkcijos atžvilgiu:
26.1. uždraudžia augalų arba jų gumbų judėjimą iš visų partijų ar siuntų, iš kurių buvo imami bandiniai, išskyrus tarnybos kontroliuojamus, ir su sąlyga, kad buvo nustatyta, jog nekyla pastebimo organizmo išplitimo pavojaus;
26.3. remdamasi įvertintos rizikos laipsniu, įveda atitinkamas papildomas apsaugos priemones, ypač dėl augalinės medžiagos auginimo ir dėl sėklinių bulvių siuntų judėjimo, išskyrus bulves, minimas šiame punkte, išaugintas toje vietoje, iš kurios buvo paimti šiame punkte minimi bandiniai, kad būtų išvengta organizmo plitimo.
27. Tais įtariamo paplitimo atvejais, kai kitai valstybei kyla augalinės medžiagos arba paviršinių vandenų užkrėtimo pavojus, tarnyba privalo nedelsdama pranešti apie minėto įtariamo paplitimo detales minėtai valstybei. Gavusi tokį pranešimą iš kitos valstybės, tarnyba imasi apsaugos priemonių.
28. Jeigu patikrinimo metu bakterijos buvimas patvirtinamas, tarnyba, atsižvelgdama į pagrįstus mokslinius principus, organizmo biologiją ir konkrečias gamybos, pateikimo į rinką ir organizmo augalų-šeimininkų apdorojimo sistemas, turi:
28.1. augalinės medžiagos atveju:
28.1.2. pripažinti užkrėstais augalinę medžiagą, siuntą ir/arba partiją iš kurios buvo paimti bandiniai, bei mechanizmus, transporto priemones, talpas, sandėlius ar jų dalis, visus kitus objektus, įskaitant ir pakavimo medžiagą, kuri lietėsi su augaline medžiaga, iš kurios buvo paimti bandiniai; taip pat pripažinti užkrėstais lauką (laukus), saugomų pasėlių plotą (plotus) ir auginimo vietas, kuriose buvo nuimtas sąraše pateiktos augalinės medžiagos derlius ir iš kurių buvo paimti bandiniai;
28.1.3. nustatyti galimo užkrėtimo laipsnį prieš derliaus nuėmimą ir po jo, auginimo metu, drėkinimo ir purškimo metu arba klonavimo metu dėl sąlyčio su nustatyto užkrėtimo židiniu;
28.2. dėl kitų augalų-šeimininkų kultūrų, išskyrus paminėtus 28.1 papunktyje, kai yra nustatyta, jog augalinei medžiagai kyla pavojus:
28.3. dėl paviršiaus vandenų (įskaitant skystas atliekas iš pramoninio perdirbimo ir pakavimo patalpų, kuriose yra dirbama su sąraše pateiktomis augalinėmis medžiagomis) ir šalia augančiais laukiniais bulvinių šeimos augalais-šeimininkais, jei sąraše pateiktų augalinių medžiagų produkcijai kyla užkrėtimo pavojus per drėkinimą, purškimą arba paviršinių vandenų užtvindymą:
28.3.1. atlikti paviršinių vandenų ir laukinių bulvinių šeimos augalų-šeimininkų, jei tokių yra, bandinių tyrimus, įskaitant tyrimus, atliekamus tam tikru nustatytu metu, siekiant nustatyti užkrėtimo laipsnį;
28.3.2. pripažinti užkrėstais paviršiaus vandenis, iš kurių buvo paimtas bandinys (bandiniai) tyrimui, remiantis šiame punkte minimu tyrimu;
29. Kiekvienu įtariamu užkrėtimo atveju, kurį patvirtino teigiamas atrankos bandymo (bandymų) atsakymas, arba visais kitais atvejais, pritaikius bet kurį kitą oficialiai patvirtintą metodą ir, kol yra laukiama to metodo patvirtinimo arba paneigimo, turėtų būti sulaikyta ir atitinkamai saugoma, kol bus užbaigti darbai pagal minėtą metodą:
29.1. jeigu įmanoma, siunta arba jos dalis (iš kurios buvo paimtas pavyzdys) originalioje pakuotėje su etikete;
29.3. bet koks likęs ekstraktas ir atrankos bandymui paruoštos papildomos medžiagos, pavyzdžiui, imunofluorescenciniai bandymo stikleliai;
30. Jei organizmo buvimas buvo patvirtintas, turėtų būti sulaikyta ir atitinkamai nors vieną mėnesį po pranešimo saugoma:
30.2. jei įmanoma, ir užkrėsto pomidoro arba baklažano bandinys, paskiepytas gumbo ar augalo ekstraktu;
31. Tyrimai, skirti nustatyti užkrėtimo laipsnį ir pirminį šaltinį, susideda iš:
31.1. auginimo vietų:
31.1.1. kuriose yra arba buvo auginamos bulvės, klonavimo požiūriu susijusios su organizmo užkrėstomis bulvėmis;
31.1.2. kuriose yra arba buvo auginami pomidorai, kilę iš tų pačių šaltinių, kaip ir organizmu užkrėsti pomidorai;
31.1.3. kuriose yra arba buvo auginamos bulvės ir pomidorai, specialiai prižiūrimos dėl įtariamos organizmo infekcijos;
31.1.4. kuriose yra arba buvo auginamos bulvės, klonavimo požiūriu susijusios su bulvėmis, augusiomis organizmu užkrėstose auginimo vietose;
31.1.5. kuriose yra auginamos bulvės ir pomidorai, esantys užkrėstų auginimo vietų kaimynystėje, įskaitant ir tokias šių produktų auginimo vietas, kurios tiesiogiai ar per bendrą tiekėją tarpusavyje dalijasi gamybos įranga ir priemonėmis;
31.1.6. kuriose laistymui ir purškimui naudojami paviršiniai vandenys, gaunami iš tokių šaltinių, kurie buvo patvirtinti arba yra įtariami esantys užkrėsti organizmu;
31.1.7. kuriose laistymui ir purškimui naudojami paviršiniai vandenys yra imami iš šaltinio, kuriuo taip pat naudojasi ir kitos gamybos vietos, patvirtintos arba įtariamos organizmo užkrėtimu;
32. Galimo užkrėtimo laipsnis prieš derliaus nuėmimą ir po jo, auginimo metu, drėkinimo ir purškimo metu arba klonavimo metu dėl sąlyčio su nustatyto užkrėtimo židiniu nustatomas, jei reikalinga, tiriant:
32.2. augalinės medžiagos gamybos vietą (vietas), kuri pripažinta užkrėsta, įskaitant ir tas gamybos vietas, kurios tiesiogiai ar per bendrą tiekėją dalijasi gamybos įrenginiais ir priemonėmis;
32.3. 32.2 punkte nurodytose gamybos vietose išaugintą sąraše pateiktą augalinę medžiagą arba buvusią tokioje gamybos vietoje (vietose) tuo metu, kai augalinė medžiaga pripažinta užkrėsta;
32.5. mechanizmus, transporto priemones, talpas ar jų dalis ir visus kitus objektus, įskaitant įpakavimo medžiagą, kurie galėjo liestis su augaline medžiaga, pripažinta užkrėsta;
32.6. bet kurią augalinę medžiagą, kuri yra laikoma arba lietėsi su bet kuriais įrenginiais arba objektais, išvardytais 32.5 papunktyje, prieš juos išvalant ir dezinfekuojant;
32.7. atlikus tyrimus, skirtus nustatyti užkrėtimo laipsnį ir pirminį šaltinį ir bandymus, tiriant tuos bulvių gumbus ar augalus, kurie yra susiję seserinio ar tėvinio klonavimo požiūriu, ir tiriant tuos pomidorų augalus, kurie kilę iš tų pačių šaltinių, kaip ir augalinė medžiaga, pripažinta užkrėsta, kuri galėjo būti užkrėsta per kloninį ryšį, nors bandymų atsakymai ieškant organizmo buvo neigiami;
32.9. sąraše pateiktos augalinės medžiagos gamybos vietas, kurios laistomos ir purškiamos vandeniu, pripažintu užkrėstu;
33. Teritorija paženklinama, remiantis nustatytu užkrėtimu, galimu užkrėtimo laipsniu bei galimu organizmo išplitimu, atsižvelgiant į:
33.3. gamybos vietas, kuriose sąraše pateikta augalinė medžiaga laistoma arba purškiama paviršiniais vandenimis tada, kai gresia ar grėsė pavojus, kad paviršiniai vandenys gali nutekėti arba užtvindyti gamybos vietas, kurios yra pripažintos užkrėstomis;
33.4. gamybos vietą (vietas), kurioje auginama augalinė medžiaga yra užkrėstų paviršinių vandenų kaimynystėje ar kuriai gresia pavojus būti užtvindytai tuo vandeniu;
34. Sėklinės bulvės turi būti neužkrėstos jokiais kenksmingais augalams ir augaliniams produktams organizmais ir būtų tiesiogiai išaugintos iš dauginamosios medžiagos, kurią ištyrus bakterija nebuvo rasta.
35. Minėtas tyrimas atliekamas:
35.1. tais atvejais, kai organizmas (organizmai) buvo aptiktas šalyje auginamose sėklinėse bulvėse:
35.1.1. tiriant pradines stadijas, įskaitant pradinę klonų atranką, ir sistemiškai tiriant pagrindinius sėklinių bulvių klonus;
IV. SUNAIKINIMO TVARKA
36. Tarnyba užtikrina, kad augalinės medžiagos, pripažintos užkrėsta, negalima sodinti ir kad, tarnybai patikrinus ir patvirtinus, jai bus taikomos sunaikinimo priemonės.
37. Tarnyba užtikrina, kad augalinės medžiagos, kuri gali būti užkrėsta, įskaitant augalinę medžiagą, kuriai gresia pavojus auginimo vietose, kurios apibūdinamos kaip galbūt užkrėstos, negalima sodinti. Tarnybai kontroliuojant, ji atitinkamai panaudojama arba pašalinama, kad būtų nustatyta, jog nėra pastebimo organizmo išplitimo pavojaus.
38. Tarnyba užtikrina, kad visi mechanizmai, transporto priemonės, talpos, sandėliai arba jų dalys ir visi kiti objektai, įskaitant pakavimo medžiagas, pripažinti užkrėstais arba kuriuos galima laikyti užkrėstais, turi būti sunaikinami arba išvalomi, taikant atitinkamus metodus. Po išvalymo visi šie objektai nebelaikomi užkrėstais.
39. Pripažintai užkrėsta augalinei medžiagai taikomos priemonės:
39.3. augalinė medžiaga giliai užkasama šiukšlių duobėje, iš kurios organizmas negalės patekti į dirbamus žemės plotus arba vandenį, kuris gali būti naudojamas kultivuojamos žemės laistymui;
39.4. augalinė medžiaga perdirbama pramoniniu būdu, pristatant atliekas tiesiogiai ir nedelsiant į perdirbimo gamyklą, kurioje įrengti oficialiai patvirtinti perdirbimo įrenginiai, atitinkantys šios tvarkos nuostatas;
40. Tinkamas augalinės medžiagos panaudojimas arba pašalinimas kontroliuojant tarnybai, jei bulvės pakuojamos arba apdorojamos naudojant atliekų sunaikinimo įrenginius, yra toks:
40.1. bulvių gumbų atveju:
40.1.1. naudoti kaip maistines bulves, skirtas vartojimui ir supakuotas įmonėse, turinčiose atitinkamą atliekų šalinimo įrangą, bei skirtas ir paruoštas tiesioginiam išvežimui ir naudojimui jų neperpakuojant;
40.1.2. naudoti kaip maistines bulves, skirtas pramoniniam perdirbimui ir tiesioginiam bei neatidėliotinam pristatymui į perdirbimo gamyklą, turinčią atitinkamus atliekų pašalinimo įrengimus;
41. Šioje tvarkoje minimi užkrėstų objektų užkrato išaiškinimo būdai yra jų išvalymas, jei reikia, dezinfekavimas, kad neliktų realaus organizmo plitimo pavojaus. Jie yra taikomi prižiūrint tarnybai.
42. Priemonės, kurias tarnyba turi įgyvendinti paženklintoje teritorijoje (teritorijose), yra tokios:
42.1. tais atvejais, kai gamybos vietos buvo pripažintos užkrėstomis:
42.1.1. saugomuose pasėlių plotuose, pripažintuose užkrėstais:
42.1.1.1. mažiausiai per 4 auginimo metus po užkrėtimo pripažinimo:
42.1.1.1.1. imasi priemonių išnaikinti savaime išaugusius bulvių ir pomidorų augalus, taip pat ir kitus organizmo augalus-šeimininkus, įskaitant ir bulvinių šeimos piktžoles;
42.1.1.1.2. išvardyti augalai nėra sodinami: bulvių gumbai ir augalai, pomidorų augalai ir sėklos, atsižvelgiant į organizmo biologiją nebus sodinami kiti augalai-šeimininkai, Brassica rūšies augalai, kuriuose organizmas gali išlikti, kultūros, kurios kelia realų organizmo plitimo pavojų;
42.1.1.1.3. pirmo bulvių ir pomidorų derliaus sezono metu po laikotarpio, apibūdinto 42.1.1.1.2 papunktyje, ir su sąlyga, kad per paskutinius dvejus auginimo metus prieš sodinant tame lauke nebuvo aptikta savaime augančių bulvių ir pomidorų augalų ir kitų augalų-šeimininkų, įskaitant ir bulvinių šeimos piktžoles, bulvių atveju oficialiai patvirtintos sėklinės bulvės yra sodinamos tik perdirbimui (maistui) ir yra atliekamas oficialus tyrimas, įskaitant ir bandymus;
42.1.1.1.4. bulvių ir pomidorų derliaus metu, einančiu po 42.1.1.1.3 papunktyje paminėto sezono ir laikantis atitinkamo sėjomainos ciklo, bulvių atveju oficialiai patvirtintos sėklinės bulvės yra sodinamos sėklai arba perdirbimui maistui ir bulvių bei pomidorų atveju yra atliekamas oficialus tyrimas;
42.1.1.2. per 5 auginimo metus po užkrėtimo pripažinimo:
42.1.1.2.1. imamasi priemonių išnaikinti savaime augančius bulvių ir pomidorų augalus, kaip ir kitus organizmo augalus-šeimininkus, įskaitant ir bulvinių šeimos piktžoles;
42.1.1.2.2. pirmuosius trejus metus laukas yra ruošiamas ir paliekamas dirvonuoti arba priklausomai nuo nustatyto pavojaus laipsnio yra apsėjamas javais arba paverčiamas ilgalaike ganykla joje intensyviai ganant arba dažnai ir trumpai ją šienaujant, arba užleidžiamas žole sėklų gamybai, po to dvejus metus apsodinant jį augalais, kurie nėra organizmo augalai-šeimininkai ir kurie nekelia organizmo išlikimo ir išplitimo pavojaus;
42.1.2. kituose laukuose:
42.1.2.1. pirmaisiais auginimo metais po užkrėtimo pripažinimo:
42.1.2.1.1. nesodinami jokie bulvių augalai arba gumbai, ar kiti organizmo augalai-šeimininkai, ir imamasi priemonių, kad būtų išnaikinti savaime augantys bulvių ir pomidorų augalai bei kiti augalai-šeimininkai, įskaitant ir bulvinių šeimos piktžoles;
42.1.2.1.2. bulvių gumbų atveju oficialiai patvirtintos sėklinės bulvės gali būti sodinamos tik perdirbimui (maistui) su sąlyga, kad tarnyba įsitikina, jog savaime augančių bulvių ir pomidorų augalų ir kitų organizmo augalų-šeimininkų, įskaitant ir bulvinių šeimos piktžoles, pavojus pašalintas. Augantis derlius yra tikrinamas atitinkamu laiku ir savaime augantys bulvių augalai yra tikrinami dėl organizmo buvimo; be to, nuėmus bulvių derlių, tikrinami gumbai;
42.1.2.2. pirmais auginimo metais po 42.1.2.1.2 papunktyje nurodyto laikotarpio bulvių atveju tik oficialiai patvirtintos sėklinės bulvės yra sodinamos sėklai arba perdirbimui (maistui);
42.1.2.3. bent antraisiais auginimo metais po pirmoje pastraipoje nurodyto laikotarpio bulvių atveju tik oficialiai patvirtintos sėklinės bulvės arba sėklinės bulvės, išaugintos iš oficialiai patvirtintų sėklinių bulvių, oficialiai kontroliuojant jų augimą, yra sodinamos sėklai arba perdirbimui (maistui);
42.1.2.4. kiekvienais auginimo metais, minėtais 42.1.2.3 papunktyje, imamasi priemonių išnaikinti savaime augančius bulvių ir pomidorų augalus ir kitus organizmo augalus-šeimininkus, įskaitant ir bulvinių šeimos piktžoles, ir atliekamas oficialus tyrimas, o tais atvejais, kai sėklinės bulvės yra sodinamos sėklai, atliekamas gumbų tyrimas;
42.1.3. iškart po užkrėtimo nustatymo ir kiekvienais metais, įskaitant ir pirmąjį leistiną bulvių ir pomidorų derlių iš užkrėstais pripažintų laukų:
42.1.3.1. visi gamybos vietoje esantys mechanizmai ir bulvių laikymo įrenginiai, naudojami bulvių gamyboje, yra išvalomi ir, jei reikalinga, dezinfekuojami, taikant atitinkamus metodus;
42.1.4. saugomo derliaus pasėlio plote, pripažintame užkrėstu, kuriame įmanoma visiškai pakeisti augimo terpę:
42.1.4.1. nėra sodinami bulvių gumbai ar augalai arba kiti organizmo augalai-šeimininkai, įskaitant pomidorų augalus ir sėklas, jei minėtame pasėlio plote nebuvo taikomos oficialiai prižiūrimos priemonės, kuriomis buvo siekiama išnaikinti organizmą ir pašalinti visą augalų-šeimininkų medžiagą, įskaitant bent visišką augimo terpės pakeitimą ir išvalymą ir, jei reikia, minėto pasėlio ploto ir visos įrangos dezinfekavimą, ir po viso to tarnybai nepritariant bulvių ir pomidorų gamybai;
42.1.4.2. auginant bulves, jų sėkla yra pasirenkama iš oficialiai patvirtintų sėklinių bulvių arba jos auginamos iš mini-gumbų arba mikroaugalų, išvestų iš patikrintų šaltinių;
42.2. nepažeisdama 42.1 papunktyje smulkiai aprašytų priemonių, paženklintoje teritorijoje tarnyba:
42.2.1. nedelsdama ir bent trejus metus po užkrėtimo paskelbimo:
42.2.1.1. kai paženklinta teritorija buvo nustatyta pagal 28.1.4 papunktį:
42.2.1.1.1. užtikrina įmonių, auginančių, sandėliuojančių ir prižiūrinčių bulvių gumbus ir pomidorus, taip pat ir įmonių, naudojančių bulvių ir pomidorų gamybos mechanizmus pagal kontraktą, kontroliavimą, vykdomą tos šalies atsakingų valstybinių institucijų;
42.2.1.1.2. reikalauja išvalyti mechanizmus ir sandėlius, o jei reikia, ir dezinfekuoti, taikant atitinkamus metodus tokiose įmonėse;
42.2.1.1.3. reikalauja sėti tik patvirtintą sėklą arba sėklą, išaugintą oficialiai prižiūrint visą bulvių derlių toje teritorijoje, ir, nuėmus derlių, bandymais patikrinti tas sėklines bulves, kurios buvo užaugintos gamybos vietose, pripažintose galimai užkrėstomis;
42.2.1.1.4. visose šioje zonoje esančiose įmonėse nuimtą sėklinių bulvių derlių reikalauja laikyti atskirai nuo perdirbimui (maistui) skirtų bulvių;
42.2.1.2. tais atvejais, kai paviršiniai vandenys buvo pripažinti užkrėstais arba laikomi vienu iš galimų organizmo plitimo šaltinių:
42.2.1.2.1. atlieka kasmetinį tyrimą atitinkamu laiku, įskaitant paviršinių vandenų ir atitinkamų bulvinių šeimos augalų-šeimininkų bandinių ėmimą susijusiuose vandens šaltiniuose ir tokius bandymus:
42.2.1.2.2. įveda oficialų laistymo ir purškimo programų tikrinimą, įskaitant uždraudimą naudoti užterštu pripažintą vandenį, kuriuo laistoma ir purškiama augalinė medžiaga ir, jei reikia, kiti augalai-šeimininkai, kad būtų sustabdytas organizmo plitimas. Šis draudimas gali būti pakoreguotas, remiantis kasmetinio tyrimo rezultatais;
43. Šioje tvarkoje minimi oficialiai patvirtinti atliekų apdorojimo įrenginiai turi atitikti žemiau pateiktas nuostatas taip, kad būtų išvengta organizmo plitimo pavojaus:
43.1. bulvių ir pomidorų gamybos atliekos (įskaitant atmestas bulves bei jų nuolupas ir pomidorus) ir bet kokios kitos kietos bulvių ir pomidorų atliekos yra sunaikinamos šiais būdais:
43.1.1. giliai užkasant šiukšlių duobėje, iš kurios jos negalės patekti į kultivuojamas žemes arba į vandens šaltinius, kurie gali būti naudojami dirbamos žemės laistymui. Atliekos nuvežamos tiesiai į vietą prižiūrint, kad nebūtų pamestos;
43.2. skystos perdirbimo atliekos: prieš išmetant skystas atliekas, savo sudėtyje turinčias kietų dalelių, jos turi būti filtruojamos, kad būtų pašalintos nuosėdos. Nuosėdos yra sunaikinamos 43.1 punkte paminėtais būdais. Po to skystos atliekos:
V. INFORMACIJOS PERDAVIMAS UŽSIENIO VALSTYBĖMS IR TARPTAUTINĖMS ORGANIZACIJOMS
45. Tarnyba privalo kaupti informaciją apie diagnozuotus bakterijos židinius, taikyti fitosanitarines priemones, kol bus nustatyta, kad bakterijos židinys visiškai sunaikintas.
46. Tarnyba kasmet privalo pranešti Europos ir Viduržemio jūros augalų apsaugos organizacijai, ES šalims narėms ir Komisijai apie oficialius tyrimus ir priemones, taikytas aptikus bakteriją, taip pat fitosanitarinio registro objektų, kuriems šios priemonės taikytos, registracijos numerius.
47. Atsiradus bakterinio užkrėtimo pavojui, tarnyba privalo nedelsdama pranešti Europos ir Viduržemio jūros augalų apsaugos organizacijai, ES šalims narėms ir Komisijai apie bet kokį užkrėtimą ir zonos paženklinimo detales.
48. Apie atliktų tyrimų rezultatus tarnyba kartą per metus praneša Europos ir Viduržemio jūros regiono augalų apsaugos organizacijai, ES šalims narėms ir Komisijai.
49. Tarnyba informuoja suinteresuotas užsienio valstybes, tarptautines organizacijas ir Europos Komisiją apie nustatytus bulvių rudojo puvinio židinius.
50. Pranešime apie bet kokį užkrėtimą bakterija tarnyba nurodo:
50.1. pranešimo apie įtariamą užkrėtimą datą, bandinių ėmimo ir organizmo buvimo patvirtinimo datas;
51. Kartu Komisijai gali būti pateiktas papildomas pranešimas, kuriame nurodomi:
51.1. bet kokios bulvių siuntos arba partijos, pripažintos užkrėsta, fitosanitarinių sertifikatų ir prireikus fizinių ir juridinių asmenų, auginančių, dauginančių, įvežančių, sandėliuojančių, gabenančių, realizuojančių, superkančių augalus, taip pat gaminančių, įvežančių, sandėliuojančių, gabenančių, realizuojančių, superkančių augalinius produktus ir kitus objektus, kurių fitosanitarinė kontrolė būtina, registracijos arba augalo paso numeriai;
51.2. bet kokios pomidorų siuntos arba partijos, pripažintos užkrėsta, fitosanitarinių sertifikatų ir prireikus fizinių ir juridinių asmenų, auginančių, dauginančių, įvežančių, sandėliuojančių, gabenančių, realizuojančių, superkančių augalus, taip pat gaminančių, įvežančių, sandėliuojančių, gabenančių, realizuojančių, superkančių augalinius produktus ir kitus objektus, kurių fitosanitarinė kontrolė būtina, registracijos arba augalo paso numeriai;
Bulvių rudojo puvinio
fitosanitarinės kontrolės ir
fitosanitarijos priemonių taikymo
tvarkos priedas
RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. LABORATORINĖS EKSPERTIZĖS SCHEMOS, REAGENTŲ, MAITINAMŲJŲ TERPIŲ SUDĖTIS, LĄSTELIŲ POPULIACIJOS NUSTATYMO METODAI, TESTAI
1 lentelė. Bakterijos skirstymas į biotipus pagal sugebėjimą gaminti rūgštį iš trijų skirtingų heksozės alkoholių ir trijų cukrų.
|
|
Biotipai |
||||
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
| Panaudojimas: -maltozės -laktozės -celobiozės -manitolio -sorbitolio -dulcitolio |
- - - - - - |
+ + + - - - |
+ + + + + + |
- - - + + + |
+ + + + - - |
2 lentelė. 2 biotipo skirstymas į subfenotipus pagal papildomus bandymus.
|
|
2 biotipas |
2-A biotipas |
2-T biotipas |
| Trehalozės panaudojimas Inozitolio panaudojimas D-ribozės panaudojimas Pektolitinis aktyvumas |
- + - žemas |
+ - - žemas |
+ +
aukštas |
3 lentelė. Rasės nustatymas remiantis patogeniškumo bandymu, atliekamu su pomidorų, baklažanų ar tabako augalais, ir padidinto jautrumo reakcijos bandymu, atliekamu su tabako lapais.
|
|
|
Rasė (*) |
|
|
|
1 |
2 |
3 |
| Reakcija: -pomidorų/baklažanų augaluose -tabako augaluose -tabako lapuose |
vytimas vytimas nekrozė (48 val.) ir vytimas (7-8 dienos) |
nėra reakcijos nėra reakcijos PJR (12-24 val.) |
vytimas nėra reakcijos chlorozė (2-8 dienos) |
| (*) 4 rasė (patogeniška ant imbiero ir kitų augalų-šeimininkų) ir 5 rasė (patogeniška tik ant šilkmedžio) neįtrauktos. |
|||
4 lentelė. Pasireiškiančios arba nepasireiškiančios bakterijų fenotipinės savybės.
| Fluorescentinis pigmentas |
- |
| PHB intarpai ląstelėje |
+ |
| Oksidacijos/fermentacijos (O/F) bandymas |
O+/F- |
| Katalazė |
+ |
| Kovačo oksidazė |
+ |
| Nitrato redukcija |
+ |
| Citrato panaudojimas |
+ |
| Augimas 400 C temperatūroje |
|
| Augimas 1 proc. NaCl tirpale |
+ |
| Augimas 2 proc. NaCl tirpale |
- |
| Arginino dihidrolazė |
- |
| Želatinos suskystinimas |
- |
| Krakmolo hidrolizė |
- |
| Aesulino hidrolizė |
- |
| Levano susidarymas |
- |
Terpės ir metodai yra pateikti Lelliott & Stead (1987)
5 lentelė. Į PGR reakcijos mišinį pridedami komponentai.
50 µl tūrio reakcijai:
| Komponentas |
Tūris |
Galutinė koncentracija |
| Sterilus distiliuotas vanduo arba ypač švarus vanduo |
30, 8 µl–33, 8 µl |
1 x |
| 10 x PGR buferis |
5,0 µl |
0,2 mM |
| d-ATP |
1,0 µl |
0,2 mM |
| d-CTP |
1,0 µl |
0,2 mM |
| d-GTP |
1,0 µl |
0,2 mM |
| d-TTP |
1,0 µl |
0,2 mM |
| Pradmuo OLI-1 (20 µM) |
2,5 µl |
1 µM |
| Pradmuo Y-2 (20 µM) |
2,5 µl |
1,0 µM |
| Taq polimerazė (5U/µl) |
0,2 µl |
1,0 U |
Bendras kiekis 45 µl – 48 µl
Didesniam reakcijų skaičiui:
Apskaičiuokite kiekvieno komponento kiekį reikalaujamam reakcijų skaičiui.
Sumaišykite komponentus ir perkelkite 45 µl–48 µl mišinio į sterilius PGR mėgintuvėlius.
Laikykite mėgintuvėlius su PGR reakcijos mišiniu ant ledo.
25 µl tūrio reakcijai:
Atitinkamai sumažinkite komponentus.
1 diagrama. Bandymo stiklelio paruošimas pagal 18.1.1 ir 18.3 papunkčius.
Resuspenduotų nuosėdų vienas standartinis praskiedimas
T = titras
FITC T/4 T/2 T 2T Dvigubai skiedžiant antiserumą
1 pavyzdys +1 +2 +3 +4 +5
1 pavyzdžio pakartojimas
arba 2 pavyzdys +6 +7 +8 +9 +10
2 diagrama. Bandymo stiklelio paruošimas pagal 18.1.2 ir 18.3 papunkčius.
FITC Standartinis antiserumo praskiedimas
|
|
Neatskiestas |
Neatsk. |
1/10 |
1/100 |
1/1000 |
Naudojant dešimtainį nuosėdų praskiedimą |
1 pavyzdys +1 +2 +3 +4 +5
1 pakartojimas arba 2
pavyzdys +6 +7 +8 +9 +10
1 schema. Tyrimo, taikomo bulvių gumbams su tipiškais arba įtariamais rudojo puvinio požymiais ir bulvių bei pomidorų augalams su tipiškais arba įtariamais bakterinio vytulio požymiais, struktūrinė diagrama:
Nuorodos į struktūrinę diagramą:
(1) Požymių apibūdinimas yra pateiktas tvarkoje.
(2) Greito nustatymo bandymai palengvina spėjamąją diagnozę.
Atliekami bandymai:
5. PGR bandymas.
(3) Nors patogeno išskyrimas iš tipiškus požymius turinčios augalinės medžiagos persėjimo būdu yra tiesioginis, vėlesnėje infekcijos stadijoje gali nepasisekti išauginti bakterijas. Saprofitinės bakterijos, augančios ant sergančio audinio, gali užgožti arba slopinti patogeną išskyrimo terpėje. Jei išskyrimo bandymas yra neigiamas, bet ligos požymiai yra tipiški, išskyrimo bandymą privalu pakartoti, pageidautina naudojant selektyvią terpę.
(4) Patikimai identifikuoti Ralstonia solanacearum grynąją kultūrą galima atliekant bent vieną iš tvarkoje išvardytų bandymų, derinant jį su patogeniškumo bandymu. Štamo charakteristika nėra privaloma, tačiau rekomenduojama kiekvienu nauju atveju.
2 schema. Procedūra skirta latentiniam užkratui bulvių gumbuose nustatyti vieno arba, pageidautina, keleto nustatymo bandymų pagalba ir, jeigu jie teigiami, papildomi patogeno išskyrimo bandymu. Struktūrinė diagrama:
Nuorodos į struktūrinę diagramą:
(1) Pavyzdžio dydis
Standartinis bandinio dydis yra 200 gumbų. Tačiau bandymas taip pat gali būti atliekamas ir su mažesniu gumbų skaičiumi.
(2) Nustatymo bandymas (bandymai)
Vienintelis atliktas bandymas gali būti nepakankamai tikslus ar patikimas Ralstonia solanacearum bakterijai nustatyti bandinyje, todėl rekomenduojama atlikti daugiau nei vieną bandymą, kuris būtų pagrįstas skirtingais biologiniais principais.
(3) Imunofluorescentinis bandymas (IF)
IF bandymas yra gerai pasiteisinęs nustatymo bandymas. Jis yra pranašesnis už kitus bandymus, kurie dar nėra pakankamai ištobulinti arba oficialiai patvirtinti. Šis bandymas yra taikomas nustatyti daugelį kitų karantininių bakterijų, pvz., Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Pagal šio metodo parametrus tai yra tikslus bandymas (tikslumo riba 103–104 ląstelių viename mililitre bulvių resuspenduotų nuosėdų).
Pagrindinis šio bandymo rezultatų patikimumo faktorius yra antiserumo kokybė. Tinkamas yra tik aukšto titro antiserumas (mažiausiai 2000 vienetų žaliame antiserume), ir visus bandymus privalu atlikti naudojant antiseruminį titrą arba vienu praskiedimu mažiau negu titras. Pageidautina taikyti netiesioginį būdą. Tiesioginis būdas gali būti taikomas tuo atveju, jei bandymo tikslumo ir specifiškumo lygis atitinka netiesioginio būdo lygį.
IF bandymas yra pranašus specifiniu ląstelių dažymosi ir švytėjimo intensyvumu, kurie ir suteikia informacijos apie reakcijos specifiškumą. Ralstonia solanacearum ląstelių morfologiją turinčių serologiškai giminingų dirvos ir bulvių audinių bakterijų kryžminės reakcijos yra tos pačios. IF bandymas gali būti taikomas kaip vienintelis nustatymo bandymas, nors tais atvejais, kai įtariamos kryžminės reakcijos, turi būti atliekamas papildomas nustatymo bandymas, grindžiamas skirtingais biologiniais principais. Tokiais atvejais labiausiai tinka selektyvaus auginimo bandymas.
(4) Selektyvaus auginimo bandymas
Naudojant modifikuotą SMSA terpę ir specifinę tyrimo metodiką – tai tikslus ir selektyvus Ralstonia solanacearum bandymas. Rezultatai gaunami praėjus 3–6 dienoms nuo bandinių paruošimo. Patogenas randamas tiesiogiai kultūroje ir gali būti lengvai nustatomas. Kad būtų išnaudotos visos bandymo galimybės, reikia kruopščiai paruošti mėginuką, paimtą iš stolono prisisegimo vietos gumbe, kad nepatektų kitos bulvių gumbų bakterijos, kurios konkuruoja su Ralstonia solanacearum toje pačioje terpėje ir gali turėti įtakos patogeno vystymuisi. Kai kurios bakterijų atmainos gali prastai augti, kadangi terpės komponentai gali paveikti pagrindinį organizmą. Taip pat reikalaujama rūpestingai atskirti Ralstonia solanacearum nuo kitų bakterijų, kurios gali išsivystyti terpėje. Selektyvus auginimas gali būti naudojamas kaip vienintelis nustatymo bandymas su sąlyga, kad tais atvejais, kai įtariama, jog kitos bakterijos slopina Ralstonia solanacearum augimą ir gaunamas neigiamas tyrimo rezultatas, mėginys tiriamas dar kartą, naudojant skirtingą bandymą, kad būtų galima patvirtinti arba paneigti diagnozę. Tokiais atvejais labiausiai tinka IF bandymas.
(5) ELISA bandymas
ELISA bandymas paprastai pasižymi mažesniu tikslumu nei IF bandymas (tikslumo riba 104–105 ląstelių viename mililitre bulvių resuspenduotų nuosėdų). Bandymas yra pigus ir greitas, tačiau dažniau pasitaiko klaidingų teigiamų (kryžminės reakcijos) ir klaidingų neigiamų rezultatų (slopinimas – inhibicija – fenolio molekulėmis, esančiomis bulvių ekstrakte). Keliami labai dideli reikalavimai antiserumui. ELISA bandymas negali būti naudojamas kaip vienintelis nustatymo bandymas.
(6) PGR bandymas
PGR bandymas pasižymi labai dideliu tikslumu, nors jį lengvai slopina augalų ar gumbų ekstrakto komponentai, sąlygojantys klaidingus neigiamus rezultatus. Kai kurios bulvių veislės turi daugiau procesą stabdančių medžiagų nei kitos, todėl yra būtina šiuos inhibitorius pašalinti. Slopinimą galima sumažinti skiedžiant, tačiau Ralstonia solanacearum populiacija taip pat atsiskies. Kiekviena bandinio ir bandymo paruošimo pakopa reikalauja didelio kruopštumo, norint išvengti užkrėtimo, kuris sąlygotų klaidingus teigiamus tyrimo rezultatus. Klaidingi teigiami rezultatai taip pat gali kilti dėl kitų organizmų homologinio atitikimo. Dėl šių priežasčių tiesioginis PGR negali būti taikomas kaip vienintelis nustatymo bandymas.
(7) Praturtinimo bandymas
Auginant bulvių ekstrakto suspenduotų nuosėdų pavyzdžius pusiau selektyviame buljone, pvz., modifikuotame SMSA sultinyje, yra galimybė padauginti Ralstonia solanacearum bakterijas. Dar svarbiau yra tai, kad jis praskiedžia ELISA ir PGR bandymų inhibitorius. Tokiu būdu IF, ELISA ir PGR bandymais galima nustatyti Ralstonia solanacearum, išaugintą praturtintame buljone. Šie praturtinimo bandymai dar nėra kruopščiai išbandyti ir ištyrinėti. Jie įtraukti čia, nes turi geras galimybes. Tačiau dėl praktinės patirties stokos jie negali būti taikomi kaip vieninteliai nustatymo metodai.
(8) Biobandymas
Biobandymas yra naudojamas išskirti Ralstonia solanacearum bakterijai iš bulvių ekstrakto suspenduotų nuosėdų naudojant selektyvinio praturtinimo metodui augalą-šeimininką, t. y. užkrečiant pomidorų ar baklažanų augalus. Kaip nurodo šis metodas, bandymas reikalauja optimalių auginimo sąlygų. Bakterijos, slopinančios Ralstonia solanacearum augimą SMSA terpėje, greičiausiai neturės šiam bandymui įtakos.
(9) Patvirtinimo bandymas (bandymai)
Gryna Ralstonia solanacearum kultūra gali būti identifikuota atlikus bent vieną iš bandymų, derinant jį su patogeniškumo testu. Štamo charakteristika nėra privaloma, tačiau rekomenduotina kiekvienu nauju atveju.
Maitinamoji terpė, naudojama Ralstonia solanacearum išskyrimui ir auginimui
Mielių–peptono–gliukozės agaras (M P G A)
| Mielių ekstraktas (Difco) |
5 g |
| Baktopeptonas (Difco) |
5 g |
| D (+) Gliukozė (monohidratas) |
10 g |
| Baktoagaras (Difco) |
15 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 litras |
Sacharozės peptono agaras (S P A)
| Sacharozė |
20 g |
| Peptonas |
5 g |
| K2HPO4 |
0,5 g |
| MgSO4 x 7H2O |
0,25 g |
| Baktoagaras (Difco) |
15 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 litras |
Kelmanotetrazolio terpė
| Kazamino rūgštys (Difco) |
1 g |
| Baktopeptonas (Difco) |
10 g |
| Dekstrozė |
5 g |
| Baktoagaras (Difco) |
15 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 litras |
Pripilkite filtru sterilizuoto trifenilo tetrazolio chlorido (Sigma) vandeninio tirpalo tiek, kad galutinė koncentracija būtų 50 mg viename litre.
Medžiagos, naudojamos pavyzdžiui paruošti
Mirkymo buferinis tirpalas: 50 m M fosfatinis buferis, pH 7,0
Šis buferinis tirpalas yra naudojamas audiniui mirkyti.
| Na2HPO4 |
4,26 g |
| KH2PO4 |
2,72g |
| Distiliuotas vanduo |
1 litras |
Sudedamąsias dalis ištirpinkite ir patikrinkite pH.
15 min. sterilizuokite autoklave 121°C temperatūroje.
Atliekant tiesioginį PGR testą, rekomenduojama pridėti 5 proc. polivinilpirolidono-
40 000 MWT (PVP-40), tokiu būdu sumažinant amplifikacijos slopinimą ekstrakte esančiomis aromatinėmis medžiagomis.
Atliekant Waring Blender arba Ultra Thurex homogenizavimo procedūrą, mirkant bulvių audinių šerdis, rekomenduojama pridėti deflokulianto, antiputokšlio arba antioksidanto.
| Lubrolio dribsniai |
0,5 g/1 l |
| DC silikono antiputokšlis |
1,0 ml/1 l |
| Natrio tetrapirofosfatas |
1,0 g/ 1 l |
Autoklavuokite atskirai. Dėkite tiek, kad pasiektumėte pageidaujamą koncentraciją.
Nuosėdų buferinis tirpalas: 10 mM fosfatinis buferis, pH 7,2
Šis buferinis tirpalas yra naudojamas resuspenduoti ir atskiesti bulvių šerdis ir nuosėdas.
| Na2HPO4 x 12H2O |
2,7 g |
| NaH2PO4 x 2H2O |
0,4 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 litras |
Sudedamąsias dalis ištirpinkite ir patikrinkite pH. Nustatykite tinkamą rūgštingumą.
15 min. sterilizuokite autoklave 121°C temperatūroje.
IF bandymo metu naudojamos medžiagos
IF bandyme naudojamas buferinis tirpalas: 10 mM
fosfato druskų buferis (F D B) pH 7,2
Šis buferis naudojamas antiserumams praskiesti.
| Na2HPO4 x 12H2O |
2,7 g |
| NaH2PO4 x 2H2O |
0,4 g |
| NaCl |
8,0 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 litras |
Sudedamąsias dalis ištirpinkite ir patikrinkite pH. Nustatykite tinkamą rūgštingumą.
15 min. sterilizuokite autoklave 121°C temperatūroje.
IF bandyme naudojamas buferis Tween
Šis buferis naudojamas stikleliams plauti. Į IF teste naudojamą buferį FDB pridėkite 0,1 proc. Tween 20.
0,1 M Fosfato glicerino buferis pH 7,6
Šis buferis naudojamas kaip skystis IF bandymų stiklelio langelių švytėjimui sustiprinti.
| Na2HPO4 x 12H2O |
3,2 g |
| NaH2PO4 x 2H2O |
0,15 g |
| Glicerinas |
50 ml |
| Distiliuotas vanduo |
100 ml |
Užkrėtimo lygio nustatymas IF bandymu
Daugiaskylio bandymų stiklelio langelio paviršiaus plotas (S)
, (1)
kai D=langelio skersmuo.
Matymo lauko paviršiaus plotas (plotai)
, (2)
kai d=lauko skersmuo.
Apskaičiuokite d tiesiogiai išmatuodami arba pagal šią formulę:
, (3)
kai i=lauko koeficientas (priklauso nuo okuliaro tipo nuo 8 iki 24 ribose),
K= tubuso koeficientas (1 arba 1,25),
G=objektyvo didinamoji galia: 100x, 40x ir t. t.
iš (2)
(4)
iš (3)
Suskaičiuokite, kiek yra tipiškų švytinčių ląstelių lauke (c).
Apskaičiuokite tipiškų švytinčių ląstelių skaičių lange (C).
Apskaičiuokite tipiškų švytinčių ląstelių skaičių viename nuosėdų mililitre (N),
,
kai y=nuosėdų tūris langelyje,
F=nuosėdų praskiedimo koeficientas.
ELISA bandyme naudojamos medžiagos
Dukart koncentruotas karbonatinis padengimo buferis, pH 9,6
| Na2CO3 |
6,36 g |
| NaHCO3 |
11,72 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 litras |
Sudedamąsias dalis ištirpinkite ir patikrinkite pH. Nustatykite tinkamą rūgštingumą.
15 min. sterilizuokite autoklave 121°C temperatūroje.
Jei ekstrakte yra didelis kiekis aromatinių molekulių, kaip antioksidantą galima naudoti natrio sulfitą iki 0,2 proc. galutinės koncentracijos.
10 x Fosfato druskų buferis (F D B), pH 7,4
| NaCl |
80 g |
| KH2PO4 |
2 g |
| Na2HPO4 x 12 H2O |
29 g |
| KCl |
2 g |
| Distiliuotas vanduo |
1 litras |
Sudedamąsias dalis ištirpinkite ir patikrinkite pH. Nustatykite tinkamą rūgštingumą.
15 min. sterilizuokite autoklave 121°C temperatūroje.
Fosfato druskų buferis–Tween (FDB – T)
| 10 x FDB |
100 ml |
| 10 proc. Tween 20 |
5 ml |
| Distiliuotas vanduo |
895 ml |
Blokuojantis (antikūnio) buferis (turi būti ruošiamas prieš darbą)
| 10 x FDB |
10 ml |
| Polivinilpirolidonas-44 000 MWT (PPV-44) |
2,0 g |
| 10 proc. Tween 20 |
0,5 g |
| Pieno milteliai |
0,5 g |
| Distiliuotas vanduo |
iki 100 ml |
Šarminės fosfatazės substrato tirpalas pH 9,8
| Dietanolaminas |
97 ml |
| Distiliuotas vanduo |
800 ml |
Išmaišykite ir nustatykite pH 9,8 pridedami koncentruoto HCl tirpalo.
Pripilkite distiliuoto vandens, kad susidarytų 1 litras.
Įdėkite 0,2 g MgCl2.
Ištirpinkite dvi fosfatazės substrato 5 mg tabletes (Sigma) į 15 ml tirpalo.
Medžiagos PGR bandymui
Oligonukleotido pradmenų seka
| Pradmuo OLI-I |
5' – GGGGGTAGCTACCTGCC – 3' |
| Pradmuo Y-2 |
5' – CCCACTGCTGCCTCCCGTSGGAGT – 3' |
Medžiagas žiūrėkite Seal et al (1993).
Medžiagos, naudojamos selektyviam auginimui ir praturtinimo bandymuose
SMSA selektyvi terpė (Engelbrecht, 1994, modifikuota Elphistone et al, 1996).
| Bazinė terpė |
|
| Kazamino rūgštys (Difco) |
1 g |
| Baktopeptonas (Difco) |
10 g |
| Glicerolis |
5 ml |
| Agaras (Difco) |
15 mg |
| Distiliuotas vanduo |
1 litras |
Gaminkite 0,5 l terpės vieno litro talpos buteliuose.
Ištirpinkite sudedamąsias dalis ir patikrinkite pH. Prieš autoklavuodami, nustatykite pH, jei reikia iki 6,5. Ralstonia solanacearum neaugs gerai terpėje, kurios pH> 7,0.
15 min. sterilizuokite autoklave 121°C temperatūroje.
Atvėsinkite iki 50°C.
Pridėkite šių sudedamųjų dalių (visos iš Sigma), kad gautumėte nurodytas galutines koncentracijas:
| Kristalo violetinis |
5mg/l |
|
|
| Polimiksino B sulfatas |
100 mg/l |
(apie 600 000 vienetų) |
Sigma P-1004 |
| Bacitracinas(*) |
25 mg/l |
(apie 1 250 vienetų) |
Sigma B-0125 |
| Chloramfenikolis |
5 mg/l |
Sigma C-3175 |
|
| Penicilinas-G |
0, 5 mg/l |
(apie 825 vienetus) |
Sigma P-3032 |
| Tetrazolio druskos |
50 mg/l |
|
|
Ištirpinkite sudedamąsias dalis 70 proc. etanolyje iki nurodytų paruoštos terpės koncentracijų.
Kai kurias sudedamąsias dalis, būtent polimiksiną B ir chloramfenikolį, reikia truputį pašildyti ir suplakti.
SMSA sultinys (Elphinstone et al., 1996)
Paruoškite kaip ir SMSA selektyviai terpei, tačiau nedėkite agaro.
Į 30 ml universalius mėgintuvėlius paskirstykite pavyzdį po 3 ml.
(*) Jei reikia, padidinus bacitracino koncentraciją iki 300 ppm, galima sumažinti užsikrėtimą saprofitinėmis bakterijomis, nesumažinant Ralstonia solanacearum dauginimosi.
______________