LIETUVOS RESPUBLIKOS VALSTYBINĖS AUGALŲ APSAUGOS TARNYBOS VIRŠININKAS
Į S A K Y M A S
DĖL RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOZAVIMO, APTIKIMO IR IDENTIFIKAVIMO METODIKOS PATVIRTINIMO
2007 m. balandžio 3 d. Nr. A1-092
Vilnius
Vadovaudamasis Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kenksmingojo organizmo fitosanitarinės kontrolės ir fitosanitarijos priemonių taikymo taisyklių, patvirtintų Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2007 m. vasario 28 d. įsakymo Nr. 3D-98 (Žin., 2007, Nr. 29-1062), 2 punktu,
tvirtinu Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. diagnozavimo, aptikimo ir identifikavimo metodiką (pridedama).
PATVIRTINTA
Valstybinės augalų apsaugos tarnybos
viršininko 2007 m. balandžio 3 d.
įsakymu Nr. A1-092
RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOZAVIMO, APTIKIMO IR IDENTIFIKAVIMO METODIKA
Ši metodika parengta vadovaujantis ir įgyvendinant 2006 m. liepos 14 d. Komisijos direktyvą 2006/63/EB, iš dalies keičiančią Tarybos direktyvos 98/57/EB dėl Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kontrolės II-VII priedus (OL, 2006, L 206, p. 36). Šioje metodikoje pateikiami bakterijos Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al, sukeliančios rudąjį puvinį, nustatymo ir diagnozavimo metodai.
TYRIMŲ PLANO TAIKYMO SRITIS
Pateiktame plane apibūdinamos įvairios procedūros atliekamos:
i) diagnozuojant bulvių stiebagumbių rudąjį puvinį ir bulvių, pomidorų bei kitų augalų šeimininkų bakterinį vyrulį;
ii) aptinkant Ralstonia solanacearum bulvių stiebagumbių, bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų bandiniuose, vandenyje ir dirvožemyje;
BENDRIEJI PRINCIPAI
Įvairios optimizuotos metodikos, patvirtinti reagentai ir duomenys apie pasiruošimą testui bei kontrolines medžiagas pateikiami priedėliuose. Laboratorijų, dalyvavusių optimizuojant ir tvirtinant darbo taisykles, sąrašas pateikiamas 1 priedėlyje.
Kadangi metodikose numatytas karantininio organizmo nustatymas ir gyvybingos R. solanacearum kultūros bus naudojamos kaip kontrolinė medžiaga, procedūras reikės atlikti karantino sąlygomis, naudojantis atitinkamais atliekų pašalinimo įrenginiais ir sąlygomis, kurias licencijavo oficialios augalų karantino institucijos.
Testavimo parametrai privalo užtikrinti nuolatinį ir atkartojamą R. solanacearum nustatymo lygmenį esant nustatytoms pasirinktų metodų nustatymo jautrumo slenkstinėms riboms.
Privaloma tiksliai paruošti teigiamas kontrolines medžiagas.
Atliekant testą atsižvelgus į reikalaujamas metodo jautrumo slenkstines ribas taip pat padaroma prielaida, kad reikia pasirinkti teisingus nustatymus, atlikti įrangos kalibravimą ir techninę priežiūrą, rūpestingai tvarkyti ir saugoti reagentus ir imtis visų priemonių, kad būtų išvengta kryžminės taršos tarp bandinių, t. y. teigiamus kontrolinius bandinius atskiriant nuo tiriamųjų bandinių. Siekiant išvengti administracinių ir kitokių klaidų, ypač susijusių su ženklinimu etiketėmis ir dokumentų tvarkymu, privaloma taikyti kokybės kontrolės standartus.
Įtarus organizmo buvimą, kaip nurodyta Direktyvos 98/57/EB 4 straipsnio 2 dalyje, daroma prielaida, kad atliekant bandinio diagnostinį arba atrankos testą gaunamas teigiamas rezultatas, kaip nurodyta vaizduojamose diagramose. Jei pirmojo atrankos testo (IF arba PGR/FISH) rezultatas teigiamas, jį privaloma patikrinti atliekant antrąjį atrankos testą, pagrįstą kitokiu biologiniu principu.
Jei pirmojo atrankos testo rezultatas teigiamas, tai įtariamas užkrėtimas R. solanacearum ir privaloma atlikti antrąjį atrankos testą. Jei antrojo atrankos testo rezultatas teigiamas, tai įtarimas (įtariamas buvimas) patvirtinamas ir būtina toliau atlikti plane nurodytus testus. Jei antrojo atrankos testo rezultatas neigiamas, tada bandinys nėra laikomas užkrėstu R. solanacearum.
Patvirtinimo buvimas, kaip nurodyta Direktyvos 98/57/EB 5 straipsnio 1 dalyje, reiškia, kad buvo išskirta ir identifikuota grynoji R. solanacearum kultūra ir patvirtintas jos patogeniškumas.
I SKIRSNIS
TYRIMŲ PLANO TAIKYMAS
1. Nustatymo, kuriuo siekiama diagnozuoti ii. solanacearum sukeliamą bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų, turinčių rudojo puvinio ar bakterinio vytulio simptomų, rudąjį puvinį ar bakterinį vytulį, planas.
Šis tyrimas yra taikomas tiriant bulvių stiebagumbius ir bulvinių šeimos augalus, turinčius arba įtariamus turint tipinių rudojo puvinio ar vaskuliarinio vytimo simptomų. Jį sudaro greitos atrankos testas ir patogeno išskyrimas iš užkrėsto vaskuliarinio audinio, pasėjimas į (selektyvią) kultūrinę terpę ir, gavus teigiamą rezultatą, Ralstonia solanacearum kultūros identifikavimas.
(1) Simptomai aprašyti II skirsnio 1 dalyje.
(2) Greitieji diagnostiniai testai palengvina spėjamąją diagnozę, tačiau nėra privalomi. Neigiamas
rezultatas ne visada garantuoja patogeno nebuvimą.
(3) Stiebo apytakinio audinio gleivių siūlų susidarymo testas aprašytas VI skirsnio A dalies 1 punkte.
(4) Olibetahidroksibutirato granulių nustatymo bakterinėse ląstelėse testas aprašytas VI skirsnio A dalies 2 punkte.
(5) Bakterinių gleivių arba simptominio audinio ekstraktų serologinės agliutinacijos testai aprašyti VI skirsnio A dalies 3 punkte.
(6) Bakterinių gleivių vandeninės suspensijos arba simptominio audinio ekstraktų IF testas aprašytas VI skirsnio A dalies 5 punkte.
(7) Bakterinių gleivių vandeninės suspensijos arba simptominio audinio ekstraktų FISH testas aprašytas VI skirsnio A dalies 7 punkte.
(8) Bakterinių gleivių vandeninės suspensijos arba simptominio audinio ekstraktų imunofermentinės analizės testas (ELISA) aprašytas VI skirsnio A dalies 8 punkte.
(9) Bakterinių gleivių vandeninės suspensijos arba simptominio audinio ekstraktų PGR aprašyta VI skirsnio A dalies 6 punkte.
(10) Paprastai patogeninis organizmas išskiriamas iš simptomatinės augalinės medžiagos praskiedžiamuoju pasėjimu į terpę (II skirsnio 3 dalis).
(11) Tipiška kolonijų morfologija aprašyta II skirsnio 3 dalies d punkte.
(12) Paskesniuose užkrėtimo etapuose organizmo auginimas gali būti slopinamas dėl saprofitinių bakterijų konkurencijos arba peraugimo. Jei ligos simptomai tipiški, o išskyrimo testo rezultatai neigiami, tai išskyrimo testą reikia pakartoti, pirmiausia atliekant selektyvaus pasėjimo į terpę testą.
(13) Galimų R. solanacearum izoliatų grynas kultūras galima patikimai identifikuoti VI skirsnio B dalyje aprašytais testais. Kiekvienu nauju atveju rekomenduojama atlikti štamo apibūdinimą.
(14) Patogeniškumo testas aprašytas VI skirsnio C dalyje.
2. Ralstonia solanacearum nustatymo ir identifikavimo besimptominių bulvių stiebagumbių bandiniuose planas
Principas:
Tyrimo procedūra skirta bulvių stiebagumbių latentinėms infekcijoms nustatyti. Mažiausiai du atrankos testai, paremti skirtingais biologiniais principais, turi būti teigiami, kad papildomai būtų išskirtas patogenas ir tipiškų kolonijų išskyrimo atveju patvirtinta gryna kultūra kaip R. solanacearum štamas. Tik vieno atrankos testo teigiamo rezultato nepakanka bandiniui įtarti.
Atrankos testų ir išskyrimo testų nustatymo jautrumo slenkstinė riba turėtų siekti 103–104 ląstelių/ml pakartotinai suspenduotose nuosėdose, naudojamose kaip teigiama kontrolė atliekant kiekvieną testų seriją.
(1) Standartinį bandinį sudaro 200 stiebagumbių, tačiau galima naudoti mažesnius bandinius, jeigu negalima gauti 200 stiebagumbių.
(2) Patogeno ekstrakcijos ir koncentravimo metodai aprašyti III skirsnio 1 punkto 1 papunktyje.
(3) Jei mažiausiai dviejų testų, besiskiriančių pagal biologinius atlikimo principus, rezultatai teigiami, būtina atlikti išskyrimą ir patvirtinimą. Atliekamas bent vienas atrankos testas. Jei šio testo rezultatas neigiamas, bandinys laikomas neigiamu. Jei šio testo rezultatas teigiamas, reikalaujama atlikti du ar daugiau atrankos testų, besiskiriančių pagal biologinius principus, pirmajam teigiamam rezultatui patvirtinti. Jei antrasis ar kiti testai yra neigiami, bandinys laikomas neigiamu. Paskesnių testų nereikalaujama atlikti.
(4) IF testas aprašytas VI skirsnio A dalies 5 punkte.
(5) Selektyvaus išskyrimo testas aprašytas VI skirsnio A dalies 4 punkte.
(6) PGR testai aprašyti VI skirsnio A dalies 6 punkte.
(7) FISH testas aprašytas VI skirsnio A dalies 7 punkte.
(8) Imunofermentinės analizės (ELISA) testas aprašytas VI skirsnio A dalies 8 punkte.
(9) Biotestas aprašytas VI skirsnio A dalies 9 punkte.
(10) Tipiška kolonijų morfologija aprašyta II skirsnio 3 dalies d punkte.
(11) Auginimas terpėje arba biotestai gali nepavykti dėl saprofitinių bakterijų konkurencijos arba vykdomo slopinimo. Jei atrankos testų rezultatai teigiami, tačiau išskyrimo testų rezultatai neigiami, reikia pakartoti išskyrimo iš tų pačių nuosėdų testus arba, naudojant to paties bandinio papildomą vaskuliarinį audinį, paimtą šalia stiebagumbių viršūnės gabaliukų išpjovimo vietos, arba, jei būtina, ištirti papildomus bandinius.
(12) Galimų R. solanacearum izoliatų grynas kultūras galima patikimai identifikuoti atlikus VI
skirsnio B dalyje aprašytus testus.
(13) Patogeniškumo testas aprašytas VI skirsnio C dalyje.
3. Ralstonia solanacearum nustatymo ir identifikavimo bulvių, pomidorų ar kitų augalų šeimininkų besimptominiuose bandiniuose planas
(1) Žr. III skirsnio 2 dalies 1 punktą dėl rekomenduotinų bandinio dydžių.
(2) Patogeninio ekstrakcijos ir koncentravimo metodai aprašyti III skirsnio 2 dalies 1 punkte.
(3) Jei mažiausiai dviejų testų, besiskiriančių pagal biologinius atlikimo principus, rezultatai teigiami, būtina atlikti išskyrimą ir patvirtinimą. Atliekamas bent vienas atrankos testas. Jei šio testo rezultatas neigiamas, bandinys laikomas neigiamu. Jei šio testo rezultatas teigiamas, reikalaujama atlikti du ar daugiau atrankos testų, besiskiriančių pagal biologinius principus, pirmajam teigiamam rezultatui patvirtinti. Jei antrasis ar kiti testai yra neigiami, bandinys laikomas neigiamu. Paskesnių testų nereikalaujama atlikti.
(4) Selektyvus išskyrimas aprašytas VI skirsnio A dalies 4 punkte.
(5) IF testas aprašytas VI skirsnio A dalies 5 punkte.
(6) PGR testas aprašytas VI skirsnio A dalies 6 punkte.
(7) FISH testas aprašytas VI skirsnio A dalies 7 punkte.
(8) Imunofermentinė analizė (ELISA) aprašyta VI skirsnio A dalies 8 punkte.
(9) Biotestas aprašytas VI skirsnio A dalies 9 punkte.
(10) Tipiška kolonijų morfologija aprašyta II skirsnio 3 dalies d punkte.
(11) Auginimas terpėje arba biotestai gali nepavykti dėl saprofitinių bakterijų konkurencijos arba vykdomo slopinimo. Jei atrankos testų rezultatai teigiami, tačiau išskyrimo testų rezultatai neigiami, reikia pakartoti išskyrimo iš tų pačių nuosėdų testus arba, naudojant to paties bandinio papildomą vaskuliarinį audinį, paimtą šalia stiebagumbių viršūnės gabaliukų išpjovimo vietos, arba, jei būtina, ištirti papildomus bandinius.
(12) Galimų R. solanacearum izoliatų grynas kultūras galima patikimai identifikuoti atlikus VI skirsnio B dalyje aprašytus testus.
(13) Patogeniškumo testas aprašytas VI skirsnio C dalyje.
II SKIRSNIS
RALSTONIA SOLANACEARUM NUSTATYMO BULVIŲ STIEBAGUMBIUOSE IR BULVIŲ, POMIDORŲ IR KITUOSE AUGALUOSE ŠEIMININKUOSE, TURINČIUOSE RUDOJO PUVINIO ARBA BAKTERINIO VYTULIO POŽYMIŲ, IŠSAMŪS METODAI
1. Simptomai (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main)
1.1. Bulvių simptomai
Bulvės augalas. Pirmoji užkrėtimo stadija – viršutinių augalo lapų vytimas esant aukštai dienos temperatūrai ir atsigavimas naktį. Ankstyvojo užkrėtimo metu vystantys lapai išlieka žali, tačiau vėliau pageltonuoja ir vystosi rudoji nekrozė. Gali pasitaikyti ir epinastijų. Tačiau labai greitai lapai negrįžtamai nuvysta ir augalas žūva. Skersai nupjautų nuvytusių augalų stiebų apytakinis audinys gali paruduoti, ir iš nupjauto paviršiaus išsiskiria arba gali būti lengvai išspaudžiamos į pieną panašios išskyros. Nupjautą stiebą vertikaliai panardinus į vandenį, iš apytakinių pluoštų nusidriekia gleivių siūlai.
Bulvės stiebagumbis. Bulvės stiebagumbis turi būti perpjaunamas skersai arti stolonų prisisegimo vietos. Ankstyvajai užkrėtimo stadijai būdingas apytakinio žiedo išblukimas, spalva keičiasi nuo blizgančios geltonos iki šviesiai rudos spalvos. Iš apytakinio žiedo po kelių minučių spontaniškai išsiveržia šviesiai kreminės spalvos išskyros. Vėliau apytakinis išblukimas paruduoja, ir nekrozė gali išsiplėsti iki parenchimos. Progresuojančios ligos stadijose užkrečiančios bakterijos išsiveržia iš stolono prisisegimo vietos ir akučių, dėl to prie bakterijų gleivių prilimpa dirvos dalelės. Dėl vidinių vaskuliarinių audinių suirimo odelėje gali atsirasti lengvai įdubusių raudonai rudų pažeidimų. Paskesnėms ligos stadijoms būdingas grybų ir bakterijų sukeliamo šlapiojo puvinio susidarymas.
1.2. Pomidorų simptomai
Pomidoro augalas. Pirmasis pastebimas požymis – tai labai glebni jauniausi augalo lapeliai. Palankiomis patogenui aplinkos sąlygomis (dirvos temperatūra – apie 25 °C, dirva prisotinta drėgmės) po keleto dienų vyksta epinastija ir vienos augalo pusės arba viso augalo vytimas ir galiausiai augalas žūva. Mažiau palankiomis sąlygomis (dirvos temperatūra – mažesnė nei 21 °C) ant stiebo gali išsivystyti daug papildomų šaknų. Nuo stiebo pagrindo galima pastebėti kylančius stiebe vandeningus dryželius, kurie įrodo apytakinės sistemos nekrozę. Perpjovus stiebą, iš išblukusių rudų apytakinių stiebo audinių išsiskiria balti arba gelsvi bakterinio skysčio lašeliai.
1.3. Kitų augalų šeimininkų simptomai
Solanum dulcamara ir S. nigrum augalai. Natūraliomis sąlygomis vytimo simptomai retai stebimi šiuose piktžoliniuose augaluose šeimininkuose, nebent dirvos temperatūra viršija 25 °C arba inokuliavimo laipsnis yra pernelyg didelis (pvz., S. nigrum auga šalia sergančių bulvių ar pomidorų augalų). Vytulio atveju simptomai panašūs į pomidorų simptomus. Nevystančiuose S. dulcamara augaluose, kurių stiebai ir šaknys auga vandenyje, galima pastebėti neryškų išblukimą stiebo pagrindo arba povandeninių augalo dalių vaskuliariniuose audiniuose, atlikus skersinį pjūvį. Bakterijos gali sunktis iš prapjautų vaskuliarinių audinių arba sudaryti gleivėtus siūlus, jei prapjautas stiebas įkišamas į vandenį vertikaliai, netgi nesant vytulio simptomų.
2. Greitieji atrankos testai
Greitieji atrankos testai palengvina spėjamos diagnozės nustatymą, bet jie nėra būtini. Taikykite vieną ar kelis iš šių testų:
2.2. Poli-β-hidroksibutirato (PHB) granulių aptikimas
Būdingos PHB granulės stebimos R. solanacearum ląstelėse, kai iš užkrėsto audinio gautų bakterinių išskyrų karščiu fiksuoti tepinėliai stebimi mikroskopu, prieš stebėjimą tepinėlį nudažius Nile Blue A arba Sudan Black dažu (žr. VI skirsnio A dalies 2 punkte).
3. Išskyrimo tvarka
a) Paimti bulvių stiebagumbio apytakinio žiedo dalį arba bulvių, pomidorų ar kitų vystančių augalų šeimininkų stiebų apytakinio pašviesėjusio audinio segmentus arba išskyras. Suspenduoti nedideliame sterilaus distiliuoto vandens kiekyje arba 50 mM fosfatinio buferinio tirpalo (4 priedėlis) ir palikti 5–10 minučių.
c) Pernešti 50–100 ml suspensijos ir tirpalų kiekį į pagrindinę mitybinę terpę (NA, YPGA ir SPA, 2 priedėlis) ir (arba) ant Kelmano tetrazolio terpės (2 priedėlis) ir (arba) į selektyvią SMSA terpę (2 priedėlis). Paskleisti arba ruožuoti taikant tinkamą pasėjimo į terpę metodą. Jei reikia, paruošti atskiras lėkšteles kaip teigiamą kontrolę naudojant Ralstonia solanacearum 2 biotipo ląstelių atskiestą suspensiją.
d) Lėkšteles inkubuoti 2–6 dienas 28 °C temperatūroje.
– Pagrindinėje mitybinėje terpėje virulentiški R. solanacearum izoliatai sudaro perlines, kremines baltas, plokščias, netaisyklingas ir takias kolonijas, dažnai su būdingais menturiais centre. Nevirulentinės R. solanacearum formos sudaro mažas, apskritas, netakias, riebias kolonijas, kurios yra tiktai baltos spalvos.
– Kelmano tetrazolio arba SMSA terpėje menturiai yra ryškiai raudonos spalvos. Nevirulentinės Ralstonia solanacearum formos sudaro mažas, apskritas, netakias, riebias tamsiai raudonas kolonijas.
III SKIRSNIS
1. Ralstonia solanacearum nustatymo ir identifikavimo besimptominių bulvių stiebagumbių bandiniuose išsamūs metodai
1.1. Bandinio paruošimas
Pastabos:
– Standartinis vienam testui skirto bandinio dydis – 200 stiebagumbių. Intensyvesnės imties atveju reikia atlikti daugiau šio dydžio bandinio testų. Dėl didesnio stiebagumbių skaičiaus viename bandinyje neįmanoma arba sunku aiškinti rezultatus. Tačiau turint vos keletą stiebagumbių šią procedūrą galima taikyti mažiau nei 200 stiebagumbių bandiniams.
– Visų toliau aprašytų aptikimo metodų patvirtinimas pagrįstas 200 stiebagumbių bandinių tyrimu.
– Toliau aprašytą bulvių ekstraktą taip pat galima naudoti aptinkant bulvių žiedinio puvinio sukėlėją – bakteriją Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
Prieš bandinio paruošimą galima atlikti išankstinį apdorojimą:
a) 2 savaites prieš tyrimą bandinius inkubuoti 25–30 °C temperatūroje, kad būtų paskatintas R. solanacearum kolonijų dauginimasis.
b) Nuplauti stiebagumbius. Naudoti atitinkamus dezinfektantus (chloro junginius, kai PGR naudojama visiškai pašalinti patogeno DNR) ir detergentus tarpuose tarp bandinių plovimų. Stiebagumbiai išdžiovinami oru. Ši plovimo tvarka ypač naudinga (bet kurio naudoti nereikalaujama), kai naudojami bandiniai, turintys dirvožemio perteklių ir kai būtina atlikti PGR testą arba taikyti kitą tiesioginį DNR išskyrimo metodą.
1.1.1. Kiekvieno stiebagumbio (stolono) viršūnės oda pašalinama švariu ir dezinfekuotu skalpeliu arba daržovėms pjaustyti skirtu peiliu taip, kad vaskuliarinis audinys taptų matomas. Kruopščiai išpjaunama stiebagumbio viršūnės vaskuliarinio audinio šerdis, kad nevaskuliarinio audinio būtų kuo mažiau (žr. Komisijos svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main).
Pastaba. Atskirti bet kurį pūvantį stiebagumbį: stiebagumbius su įtariamais rudojo puvinio simptomais ištirti atskirai.
Jei šalinant stiebagumbio viršūnę yra stebimi įtariami rudojo puvinio simptomai, tai reikia apžiūrėti šio stiebagumbio dalį prie viršūnės. Bet kurį perpjautą stiebagumbį reikia mažiausiai dvi dienas laikyti kambario temperatūroje, kad šis sukamštėtų, ir paskiau stiebagumbį atitinkamomis karantino sąlygomis laikyti atšaldytą (4–10 °C temperatūroje). Visus stiebagumbius, įskaitant ir stiebagumbius su įtariamais simptomais, reikėtų laikyti, atsižvelgiant į III priedą.
1.1.2. Stiebagumbių viršūnių gabaliukai surenkami į nepanaudotas vienkartines talpyklas, kurias galima uždaryti ir (arba) užplombuoti. Jau panaudotas talpyklas reikėtų kruopščiai išvalyti ir dezinfekuoti chloro junginiais. Pirmiausia stiebagumbių viršūnių gabaliukus reikėtų apdoroti nedelsiant. Jei tai padaryti neįmanoma, jie, nepridedant buferio, šaltai ne ilgiau kaip 72 valandas arba kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas yra saugomi talpykloje.
Stiebagumbio viršūnės gabaliukai apdorojami pagal vieną iš šių procedūrų:
a) gabaliukai pamerkiami į pakankamą (apie 40 ml) išskyrimo buferinio tirpalo tūrį (4 priedėlis) ir 4 valandas žemesnėje nei 24 °C temperatūroje kratomi rotorine kratykle (50–100 rpm), arba 16–24 valandas šaldytuve,
arba
b) gabaliukai homogenizuojami pakankame (apie 40 ml) išskyrimo buferinio tirpalo tūryje (4 priedėlis) arba naudojant maišykle (pvz., Waring arba Ultra Thurax), arba užplombuotame vienkartiniame mirkymo maišelyje (pvz., Stomacher ar Bioreba tvirto polietileno maišelyje, 150 mm x 250 mm; sterilizuotame apšvita) juos sutraiškant guma apkaltu mediniu plaktuku arba atitinkamu malimo prietaisu (pvz., Homex).
Pastaba. Bandinių kryžminės taršos rizika yra ypač didelė, kai bandiniai homogenizuojami naudojant maišyklę. Stengiantis išvengti aerozolio susidarymo arba nuotėkio išskyrimo metu yra imamasi atsargumo priemonių. Užtikrinama, kad kiekvienam bandiniui būtų naudojami atskiri ką tik sterilizuoti maišyklės peiliai ir indai. Jei atliekamas PGR testas, stengiamasi išvengti dauginamosios medžiagos pernešimo per talpyklas ar malimo aparatą. Atliekant PGR testą malimą rekomenduojama atlikti vienkartiniuose maišeliuose ir vienkartiniuose vamzdeliuose.
1.1.3. Viršnuosėdinis skystis nupilamas. Jei jis pernelyg drumstas, skaidrinamas lėtai centrifuguojant (10 minučių ne didesniu kaip 180 g greičiu 4–10 °C temperatūroje) arba filtravimu vakuume (40–100 um), perplaunant filtrą papildomu (10 ml) išskyrimo buferiniu tirpalu.
1.1.4. Bakterijos frakcija koncentruojama 15 minučių centrifuguojant 7 000 g greičiu (arba 10 minučių – 10 000 g greičiu) 4–10 °C temperatūroje, ir viršnuosėdinis skystis nupilamas nepažeidžiant nuosėdų.
1.1.5. Nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 1,5 ml nuosėdoms skirtame buferiniame tirpale (4 priedėlis). Naudojama 500 ml R. solanacearum, 500 ml Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ir 500 ml etaloniniams tikslams. Įpilama sterilaus glicerino, kad etaloninės alikvotinės dalies ir likutinės tiriamosios alikvotinės dalies 500 ml galutinė koncentracija siektų 10–25 % (tūris/tūris), sumaišoma ir saugoma temperatūroje nuo -16 iki -24 °C (savaites) arba nuo -68 iki -86 °C (mėnesius). Tyrimo metu tiriamosios alikvotinės dalys saugomos 4–10 °C temperatūroje.
Kartotinis sušaldymas ir atitirpdinimas nerekomenduotini.
Jei ekstraktą reikia vežti, jis šaldomoje dėžėje pristatomas per 24 valandas.
1.2. Tyrimas
Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų bei optimizuotų metodikų aprašymą, pateikiamą atitinkamuose prieduose:
Selektyvus išskyrimas (žr. VI skirsnio A dalies 4 punktą)
IF testas (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą)
PGR (žr. VI skirsnio A dalies 6 punktą)
FISH (žr. VI skirsnio A dalies 7 punktą)
Imunofermentinė analizė (ELISA) (žr. VI skirsnio A dalies 8 punktą)
Biotestas (žr. VI skirsnio A dalies 9 punktą)
2. R. solanacearum nustatymo ir identifikavimo besimptominių bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų bandiniuose išsamūs metodai
2.1. Bandinio paruošimas
Pastaba. Siekiant aptikti latentines R. solanacearum populiacijas, rekomenduojama tirti sudėtinius bandinius. Ši tvarka gali būti sėkmingai taikoma tiriant 200 stiebų dalių sudėtinius bandinius. Atliekant apžiūras, rekomenduojama naudoti statistiškai patikimą tiriamąjį augalo populiacijos bandinį.
2.1.1. Nuo kiekvieno stiebo antžeminės dalies švariu dezinfekuotu peiliu arba genėjimui skirtu sekatoriumi atpjaunamas 1-2 cm segmentas.
Jauni pomidorų daigai: švariu dezinfekuotu peiliu nuo kiekvieno stiebo pagrindo dalies, esančios šiek tiek aukščiau dirvos paviršiaus, atpjaunamas 1 cm segmentas.
Lauke arba šiltnamyje auginami pomidorų augalai: švariu dezinfekuotu peiliu nuo pagrindinio kiekvieno augalo stiebo atpjaunama žemiausiai esanti šakelė. Nuo kiekvienoje pusėje esančios šakelės žemiausios dalies atpjaunamas 1 cm segmentas.
Kiti augalai šeimininkai: švariu dezinfekuotu peiliu arba sekatoriumi nuo kiekvieno stiebo pagrindo dalies, esančios šiek tiek aukščiau dirvos paviršiaus, atpjaunamas 1 cm segmentas. S. dulcamara ar kitų vandenyje auginamų augalų šeimininkų atveju nuo povandeninių stiebo dalių ar stolonų, turinčių vandenyje esančias šaknis, atpjaunami 1–2 cm segmentai.
Kai imtis atliekama konkrečioje vietoje, rekomenduojama tirti statistiškai reprezentatyvių 10 augalų imtį, paimtą kiekvienoje galimų piktžolinių augalų šeimininkų bandinių paėmimo vietoje. Patogeninio organizmo aptikimą patikimiausiai galima atlikti pavasario pabaigoje, vasarą ir rudenį, nors gamtoje vykstančius užkrėtimus ištisus metus galima nustatyti tarp daugiamečių Solanum dulcamara augalų, augančių vandentakiuose. Žinomiems augalams šeimininkams priklauso savaime įsisėjantys augalai (dirvožemio tvarkytojai) Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium ir kiti bulvinių šeimos augalai. Kiti šeimininkai yra Pelargonium spp. ir Portulaca oleracea. Prie kai kurių augalų šeimininkų, augančių Europoje ir tam tikromis aplinkos sąlygomis savo šaknyse ir (arba) rizosferoje galinčių turėti 2 biovarieteto 3 rasės R. solanacearum populiacijų, galima priskirti šiuos augalus: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra ir Urtica dioica.
Pastaba. Vidinių simptomų (vaskuliarinio audinio dažymasis arba bakterijų išskyros) vizualinį įvertinimą reikia atlikti šio tyrimo etape. Bet kurie simptomų turintys stiebo segmentai atskiriami vieni nuo kitų ir išanalizuojami (žr. II skirsnį).
2.1.2. Stiebo segmentai trumpai dezinfekuojami 70 % etilo alkoholiu ir nedelsiant išdžiovinami sugeriamuoju popieriumi. Po to stiebo segmentai apdorojami taikant vieną iš šių procedūrų:
a) segmentai pamerkiami į pakankamo tūrio (apytiksliai 40 ml) išskyrimo buferinį tirpalą (4 priedėlis) ir 4 valandas maišomi besisukančia kratykle (50–100 rpm greičiu) mažesnėje nei 24 °C temperatūroje arba 16–24 valandas šaldomi, arba
b) apdorojami nedelsiant guma apkaltu plaktuku arba atitinkamu malimo aparatu (pvz., Homex), segmentus sumalant tvirtame mirkymo maišelyje (pvz., Stomacher arba Bioreba), įpylus atitinkamą išskyrimo buferinio tirpalo kiekį (4 priedėlis). Jei šito padaryti neįmanoma, tai stiebo segmentai saugomi šaltai ne ilgiau kaip 72 valandas arba kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas.
2.1.4. Paprastai paskiau nereikalaujama skaidrinti ekstrakto arba koncentruoti bakterinės frakcijos, tačiau tai galima atlikti filtruojant ir (arba) centrifuguojant, kaip aprašyta III.1.1.3-1.1.5 skirsniuose.
2.1.5. Neskiestas arba koncentruotas bandinio ekstraktas padalijamas į dvi lygias dalis. Viena dalis tiriama ir saugoma 4–10 °C temperatūroje, o kita saugoma 10–25 % (tūris/tūris) steriliame glicerine temperatūroje nuo -16 iki -24°C (savaites) arba nuo -68 iki -86 °C (mėnesį) tuo atveju, jeigu bus reikalingi tolesni bandymai.
2.2. Tyrimas
Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų bei optimizuotų metodikų aprašymą, pateikiamą atitinkamuose prieduose:
Selektyvus išskyrimas (žr. VI skirsnio A dalies 4 punktą)
IF testas (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą)
PGR (žr. VI skirsnio A dalies 6 punktą)
FISH (žr. VI skirsnio A dalies 7 punktą)
Imunofermentinė analizė (ELISA) (žr. VI skirsnio A dalies 8 punktą)
Biotestas (žr. VI skirsnio A dalies 9 punktą)
IV SKIRSNIS
1. R. solanacearum nustatymo ir identifikavimo vandenyje planas
(1) Žr. IV skirsnio 2 punkto 1 papunktį dėl rekomenduojamos bandinių ėmimo tvarkos.
(2) Patogeninio organizmo koncentravimo metodai aprašyti IV skirsnio 2 punkto 1 papunktyje. Koncentravimas, kurio metu padidinamos tiek patogeninio organizmo ir konkuruojančių saprofitinių bakterijų populiacijos, rekomenduojamas, jei dėl to nepablogėja išskyrimo testo rezultatai.
(3) Selektyvus išskyrimas aprašytas VI skirsnio A dalies 4 punkte.
(4) Biotestas aprašytas VI skirsnio A dalies 9 punkte.
(5) Praturtintos PGR metodai VI skirsnio A dalies 4 punkto 2 papunktyje ir VI skirsnio A dalies 6 punkte.
(6) Praturtintos imunofermentinės analizės metodai (ELISA) VI skirsnio A dalies 4 punkto 2 papunktyje ir VI skirsnio A dalies 8 punkte.
(7) Tipiška kolonijos morfologija aprašyta II skirsnio 3 dalies d punkte.
(8) Auginimas gali nevykti dėl saprofitinių bakterijų keliamos konkurencijos ar slopinimo. Jei įtariama, kad didelis saprofitinių bakterijų skaičius gali sumažinti išskyrimo patikimumą, praskiedus bandinį steriliu vandeniu pakartojami išskyrimo testai.
(9) Galimų R. solanacearum izoliatų grynas kultūras galima patikimai identifikuoti taikant VI skirsnio B dalyje aprašytus metodus.
(10) Patogeniškumo testas aprašytas VI skirsnio C dalyje.
2. R. solanacearum nustatymo ir identifikavimo vandenyje metodai
Principas
Pagal šiame skirsnyje aprašytą aptikimo planą ligos sukėlėjas aptinkamas paviršiniame vandenyje ir taip pat bulvių perdirbimo atliekose arba nuotekų vandenyse. Tačiau reikia pabrėžti, kad aptikimo skirtingame substrate jautrumas kinta. Išskyrimo testo nustatymo jautrumui didelės įtakos turi konkuruojančios saprofitinės bakterijos, kurių skaičius bulvių perdirbimo atliekose ir nuotekų vandenyse yra gerokai didesnis nei paviršiniame vandenyje. Kadangi pagal paskesnį planą 1 litre paviršinio vandens tikimasi aptikti ne mažiau kaip 103 ląstelių, tai atrodo, kad organizmo aptikimo bulvių perdirbimo atliekose ar nuotekų vandenyse jautrumas bus gerokai mažesnis. Atsižvelgiant į tai, nuotekų vandenis siūloma tirti baigus visas gryninimo operacijas (pvz., nusodinimą arba filtravimą), kurių metu sumažinamas saprofitinių bakterijų kolonijų skaičius. Aptikimo pagal šį tyrimo planą jautrumo apribojimus reikia apsvarstyti atlikus gautų neigiamų rezultatų patikimumo įvertinimą. Kadangi pagal šį tyrimo planą atlikti patogeninio organizmo buvimo ar nebuvimo paviršiniame vandenyje tyrimai buvo sėkmingi, reikia atsižvelgti į šio plano trūkumus, kai atliekamas patogeninio organizmo buvimo bulvių perdirbimo atliekose ir nuotekų vandenyse tyrimas.
2.1. Bandinio paruošimas Pastabos:
– R. solanacearum aptikimą paviršiniame vandenyje geriausia atlikti pavasario pabaigoje, vasarą ir rudenį, kai vandens temperatūra viršija 15 °C.
– Dėl pakartotinio bandinių ėmimo skirtingu laiku pirmiau nurodytu laikotarpiu nustatytose imties vietose padidės aptikimo patikimumas, kartu sumažinant klimato kaitos sukeltą poveikį.
– Siekiant išvengti praskiedimų, užmaskuojančių patogeną, reikia atsižvelgti į liūčių laikotarpį ir vandentakio geografinę padėtį.
– Paimti paviršinio vandens, esančio netoli augalų šeimininkų, jei šie šeimininkai tebeegzistuoja, bandinius, jei šis vanduo yra netoliese augalų šeimininkų.
2.1.1. Pasirinktose imties vietose paimti vandens bandinius, pripildant vienkartinius mėgintuvėlius ar butelius vandens, paimto iš 30 cm gylio ir ne daugiau kaip 2 m nuo kranto. Jei bus tiriama perdirbimo atliekos arba nuotekų vandenys, bandinius paimti nuotekų išmetimo vietoje. Rekomenduojama imties vietoje paimti iki 500 ml tūrio bandinius. Jei paimami mažesnio tūrio bandiniai, rekomenduojama paimti bandinius imties vietoje mažiausiai tris kartus, kiekvieno bandinio atlikti du poėmių pakartojimus, kurių kiekvieno tūris yra mažiausiai 30 ml. Atliekant intensyvesnį tyrimą, pasirinkti mažiausiai tris imties vietas 3 km ilgio vandentakyje ir užtikrinti, kad bandiniai taip pat bus paimami iš intakų, įtekančių į vandentakį.
2.1.3. Jei reikia, bakterijų frakcija gali būti koncentruojama šiais metodais:
a) 30–50 ml tūrio bandiniai centrifuguojami 10 000 g greičiu 10 minučių (arba 7 000 g greičiu 15 minučių) 4–10 °C temperatūroje, viršnuosėdinį skystį nupilant ir nuosėdas pakartotinai suspenduojant 1 ml nuo sėdų buferiniame tirpale (4 priedėlis).
b) Atliekamas filtravimas per membraną (mažiausiam skylučių dydžiui esant 0,45 mM), paskiau atliekamas filtro perplovimas 5–10 ml nuosėdų buferiniu tirpalu ir nuoplovų išsaugojimas. Šis metodas tinkamas atlikti naudojant vandenį, kuriame yra nedaug saprofitinių bakterijų.
Tiriant bulvių perdirbimo arba nuotekų vandenų bandinius koncentravimas paprastai nerekomenduojamas, nes dėl padidėjusių saprofitinių bakterijų skaičiaus yra slopinamas Ralstonia solanacearum nustatymas.
V SKIRSNIS
1. R. solanacearum nustatymo ir identifikavimo dirvožemyje planas
(1) Žr. V skirsnio 2 punkto 1 papunktį dėl rekomenduojamos ėmimo tvarkos.
(2) Selektyvus išskyrimas aprašytas VI skirsnio A dalies 4 punkte.
(3) Praturtintos PGR metodai aprašyti VI skirsnio A dalies 4 punkto 2 papunktyje ir VI skirsnio A dalies 6 punkte.
(4) Biotestas aprašytas VI skirsnio A dalies 9 punkte.
(5) Tipiška kolonijų morfologija aprašyta II skirsnio 3 dalies d punkte.
(6) Auginimas gali nevykti dėl saprofitinių bakterijų keliamos konkurencijos ar slopinimo. Jei įtariama, kad didelis saprofitinių bakterijų skaičius gali sumažinti išskyrimo patikimumą, praskiedus bandinį steriliu vandeniu yra pakartojami išskyrimo testai.
(7) Galimų R. solanacearum izoliatų grynas kultūras galima patikimai identifikuoti taikant VI skirsnio B dalyje aprašytus metodus.
(8) Patogeniškumo testas aprašytas VI skirsnio C dalyje.
2. R. solanacearum nustatymo ir identifikavimo dirvožemyje metodai
Principai
Pagal šiame skirsnyje aprašytą patvirtintą aptikimo planą dirvožemio bandiniuose yra aptinkamas ligos sukėlėjas ir taip pat tiriami bulvių perdirbimo atliekų ir nuotekų dumblo bandiniai. Tačiau reikia pažymėti, kad taikant šiuos metodus nustatymo jautrumas nėra pakankamas, kad būtų galima garantuoti nedidelio skaičiaus ir (arba) nevienodai išplitusių Ralstonia solanacearum populiacijų, randamų šiuose natūraliai užkrėstuose substratuose, aptikimą.
Aptikimo jautrumo apribojimus, susijusius su šiuo tyrimo planu, reikėtų apsvarstyti, kai yra vertinamas bet kokių gautų neigiamų rezultatų patikimumas ir taip pat kai yra atliekami patikrinimai, siekiant nustatyti patogeno buvimą arba nebuvimą dirvožemyje ir dumble. Patikimiausias patogeninio organizmo buvimo lauko dirvožemyje tyrimas yra jautraus užkrėtimui augalo šeimininko pasodinimas ir jo užkrėtimo stebėsena, tačiau ir šio metodo nustatymo jautrumas nėra pakankamas nedideliam užkrėtimo laipsniui nustatyti.
2.1. Bandinio paruošimas
2.1.1. Imant lauko dirvožemio bandinius, reikia laikytis nematodų imčiai taikomų standartinių principų. Kiekvienam bandiniui reikia surinkti 0,5–1 kg dirvožemio 60 imties vietų 0,3 ha ploto lauke 10–20 cm gylyje (arba iš 7 x 7 m žemės ploto). Įtarus patogeninio organizmo buvimą, bandinių imties vietų skaičių 0,3 ha plote reikia padidinti iki 120. Iki tyrimo bandiniai laikomi 12–15 °C temperatūroje. Bulvių perdirbimo atliekų ir nuotekų dumblo bandinių bendras svoris siekia 1 kg ir jie imami tiek imties vietų, kad būtų atitinkamas viso reikiamo ištirti dumblo tūris. Prieš tiriant kiekvienas bandinys sumaišomas.
2.1.2. 10–25 g dirvožemio arba dumblo poėmių dispergavimas 2 valandas atliekamas rotorine kratykle 250 rpm greičiu 60–150 ml išskyrimo buferiniame tirpale (4 priedėlis). Jei dispergavimą reikia pagreitinti, galima pripilti 0,02 % sterilaus Tween-20 ir įberti 10–20 g sterilaus žvirždo.
A. DIAGNOSTINIAI IR NUSTATYMO TESTAI
1. Stiebo gleivių siūlų susidarymo testas
Ralstonia solanacearum bakterijos buvimą vystančiuose bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų stiebuose galima įvertinti atlikus šį paprastą spėjamąjį bandymą: nupjauti stiebą truputį virš dirvos paviršiaus. Įmerkti nupjautą stiebą į menzūrą su vandeniu. Po kelių minučių stebėti būdingą spontaninį bakterijų gleivių siūlų tekėjimą iš apytakinių pluoštų.
1. Ant mikroskopo objektinio stiklelio paruošti išskyrų arba suspenduoto audinio tepinėlį, arba 48 valandas YPGA ar SPA terpėje augintos kultūros tepinėlį (2 priedėlis).
2. Paruošti 2 biovarieteto R. solanacearum teigiamų kontrolinių bandinių tepinėlius ir, jei manoma, kad tai naudinga, paruošti heterologiško biovarieteto neigiamo kontrolinio bandinio kontrolės tepinėlį.
3. Leisti išdžiūti ore ir keletą kartų greitai perleisti apatinį stiklelio paviršių per liepsną, kol tepinėlis užsifiksuos.
4. Preparatą dažyti arba Nile Blue, arba Sudan Black dažu ir stebėti mikroskopu, kaip aprašyta toliau:
Nile Blue dažo testas:
a) Fiksuotą tepinėlį pamerkti į 1 % vandeninį Nile Blue A tirpalą. 10 minučių laikyti 55 °C temperatūroje.
b) Nupilti dažantį tirpalą. Nuplauti, trumpai palaikant po silpna vandens srovele, ir filtriniu popieriumi pašalinti vandens perteklių.
f) Nudažytą tepinėlį stebėti epifluorescenciniu mikroskopu, šviesos bangos ilgiui siekiant 450 nm po aliejine imersija, padidinus 600–1 000 kartų ir naudojant imersinį aliejaus ar vandens objektyvą.
g) Stebėti ryškiai oranžinį polibetahidroksibutirato granulių švytėjimą. Taip pat stebėti įprastinėje šviesoje, kad būtų įsitikinta, jog nuosėdos yra ląstelės viduje ir ląstelių morfologija yra būdinga R. solanacearum.
Sudan Black dažo testas:
a) Kiekvieną fiksuotą tepinėlį pamerkti į 0,3 % Sudan Black B tirpalą 70 % etanolyje ir 10 minučių palaikyti kambario temperatūroje.
b) Nupilti dažantį tirpalą, trumpai palaikyti po vandeniu iš čiaupo ir filtriniu popieriumi pašalinti vandens perteklių.
c) Tepinėlį trumpam panardinti į ksilolą ir nusausinti filtravimo popieriumi. Atsargiai! Ksilolas yra kenksmingas sveikatai. Imtis visų atsargumo priemonių ir dirbti traukos spintoje.
d) Užpilti tepinėlį 0,5 % (g/ml) vandeniniu safranino tirpalu ir 10 minučių palikti kambario temperatūroje. Atsargiai! Safraninas yra kenksmingas sveikatai. Imtis visų atsargumo priemonių ir dirbti traukos spintoje.
e) Nuplauti silpna vandens srovele. Nusausinti tepinėlį filtravimo popieriumi ir uždengti dengiamuoju stikleliu.
f) Šviesos mikroskopu stebėti nudažytą tepinėlį, naudojant išsklaidytą šviesą, imersinį aliejų ir 1 000 kartų didinantį imersinį aliejaus objektyvą.
3. Serologinės agliutinacijos testai
R. solanacearum ląstelių bakterinėse išskyrose arba simptominių audinių ekstraktuose serologinė agliutinacija geriausiai stebima naudojant patvirtintus antikūnus (žr. 3 priedėlį), žymėtus atitinkamomis spalvinėmis žymėmis, tokiomis kaip raudonos Staphylococcus aureus ląstelės arba dažyto latekso dalelės. Jei naudojamasi nusipirktu rinkiniu (žr. 3 priedėlį), vadovaujamasi gamintojo instrukcijomis. Kitais atvejais operacija atliekama šia tvarka:
a) Žymėtų antikūnių suspensijos ir bakterinių išskyrų lašai (kiekvieno apytiksliai po 5 ml) sumaišomi mikrotitravimo plokštelių duobutėse.
b) Naudojant R. solanacearum 2 biovarieteto ir heterologinio štamo suspensijas, paruošiami teigiami ir neigiami kontroliniai bandiniai.
4. Selektyvus pasėjimas
4.1. Selektyvus pasėjimas
Pastaba. Prieš pradedant taikyti šį metodą pirmąkart, atliekami išankstiniai testai, užtikrinant atkartojamą 103–104 R. solanacearum kolonijas sudarančių vienetų, pridėtų prie bandinių, kurie pirmiau buvo įvertinti kaip neigiami, nustatymą viename mililitre.
Naudojamasi atitinkama patvirtinta selektyvią terpe, tokia kaip SMSA (kaip modifikuota Elphinstone et al., 1996; žr. 2 priedėlį).
Reikia rūpestingai atlikti R. solanacearum atskyrimą nuo kitų bakterijų, nes terpėje gali augti ir kitų rūšių bakterijos. Be to, gali išaugti netipiškos morfologijos R. solanacearum kolonijos dėl peraugimo ar bakterijų antagonistų. Įtarus konkurencijos ar antagonizmo atvejus, bandinys pakartotinai tiriamas kitu metodu.
Didžiausio nustatymo jautrumo galima tikėtis, kai naudojamas šviežiai paruoštas bandinio ekstraktas ir laikomasi optimalių augimo sąlygų. Tačiau šį metodą galima sėkmingai taikyti, tiriant ekstraktus, laikytus glicerine temperatūroje nuo -68 iki -86 °C.
Kaip teigiamą kontrolinį bandinį paruošti R. solanacearum virulentiško 2 biovarieteto štamo (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) 106 kolonijų sudarančių vienetų viename mililitre suspensijos praskiedimų seką santykiu 1:10. Siekiant išvengti taršos, paruošiami teigiami kontroliniai bandiniai atskirai nuo tiriamųjų bandinių.
Kiekvienos selektyvios terpės partija patikrinama pagal patogeno sugebėjimą augti joje prieš pradedant įprastinių bandinių tyrimą.
Kontrolinė medžiaga tiriama taip pat, kaip ir bandinys.
4.1.1. Atlikti atitinkamą pasėjimo praskiedžiant operaciją, siekiant užtikrinti bet kokių pašalinių saprofitinių bakterijų populiacijų praskiedimą. Į kiekvieną lėkštelę pasėti po 50–100 ml kiekvieno praskiedimo bandinio.
4.1.2. Lėkštelės inkubuojamos 28 °C temperatūroje. Plokštelės analizuojamos po 48 valandų ir po to kasdien – auginimas trunka 6 dienas. Tipiškos R. solanacearum kolonijos SMSA terpėje būna pieno baltumo, lygios, netaisyklingos formos bei takios ir po 3 inkubacijos dienų kolonijų centre atsiranda nuo rausvos iki kraujo spalvos centrinis vidinis ruožuotumas arba menturiai (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/MembersPublic/irc/sanco/sancoeurophyt/libraryHome/main).
Pastaba. Kartais šioje terpėje išauga netipiškos R. solanacearum kolonijos. Jos gali būti mažos, apvalios, visiškai raudonos ir netakios arba iš dalies takios, todėl jas būna sunku atskirti nuo saprofitinių kolonijas sudarančių bakterijų.
4.1.3. R. solanacearum spėjamos kolonijos išgryninamos po pasėjimo į pagrindinę mitybinę terpę brėžimo arba praskiedimo būdu atskiroms kolonijoms gauti (žr. 2 priedėlį).
4.1.4. Kolonijos trumpai laikomos tamsoje steriliame kambario temperatūros vandenyje (pH 6–8, neturinčiame chloro) arba ilgą laiką – kriogeninėje apsauginėje terpėje esant temperatūrai nuo -68 iki -86 °C arba liofilizuojamos.
4.1.5. Spėjamos kultūros identifikuojamos (žr. VI skirsnio B dalį) ir atliekamas patogeniškumo testas (žr. VI skirsnio C dalį).
Selektyvaus pasėjimo rezultatų aiškinimas
Selektyvaus pasėjimo testo rezultatai laikomi neigiamais, jei po 6 dienų auginimo bakterijų kultūros nestebimos arba tipiškų R. solanacearum kolonijų nėra, laikantis nuostatos, kad slopinimas nevyko dėl kitų bakterijų konkurencijos ar antagonizmo ir kad tipiškos R. solanacearum kolonijos aptinkamos tik teigiamuose bandiniuose.
Selektyvaus pasėjimo testas teigiamas, jei išskiriamos spėjamos R. solanacearum kolonijos.
4.2. Praturtinimo procedūra
Naudoti tokią patvirtintą terpę, kaip modifikuotas Wilbrink buljonas (žr. 2 priedėlį).
Ši procedūra gali būti taikoma R. solanacearum populiacijų bandinyje atrankai pagerinti ir aptikimo jautrumui padidinti. Sios procedūros metu PGR reakcijos inhibitoriai tinkamai praskiedžiami (1:100). Tačiau reikėtų pažymėti, kad R. solanacearum praturtinimas gali nepasisekti dėl saprofitinių bakterijų praturtinamų tuo pačiu metu, konkurencijos ar antagonizmo. Dėl šios priežasties R. solanacearum išskyrimas is praturtintų buljono terpėje auginamų kultūrų gali būti problemiškas. Be to, kadangi serologiškai giminingų saprofitų populiacijos gali padidėti, rekomenduojama imunofermentinei analizei atlikti vietoj specifinių monokloninių antikūnų naudoti polikloninius antikūnus.
4.2.1. Praturtinant PGR, 100 ml bandinio ekstrakto įpilama į 10 ml praturtinamojo sultinio (2 priedėlis), prieš tai išpilstyto alikvotinėmis dalimis į mėgintuvėlius ar kolbutes, neužkrėstas DNR. Praturtinant imunofermentinę analizę (ELISA), į praturtinamąjį sultinį galima įpilti didesnio tūrio tiriamųjų bandinių (pvz., 100 ml į 1,0 ml praturtinamojo sultinio).
4.2.2. Kultūros 72 valandas inkubuojamos 27–30 °C ant kratyklės arba nekratant kolbose, neužkimštose aklinai tam, kad šios vėdintųsi.
4.2.4. Atliekant abu testus, praturtinamasis sultinys paveikiamas lygiai taip pat, kaip ir tiriamasis bandinys.
Pastaba. Jei R. solanacearum praturtinimas slopinamas dėl didelio konkuruojančių saprofitinių bakterijų populiacijų skaičiaus, bandinių ekstraktų praturtinimą geriau atlikti prieš centrifugavimo ar koncentravimo kitu būdu operaciją.
5. Imunofluorescencinės analizės (IF) testas
Principas
Imunofluorescencinės analizės testas, kaip pagrindinis atrankos testas, rekomenduojamas taikyti dėl to, kad jį atliekant yra pasiekiamos reikalaujamos slenkstinės vertės.
Kai IF testas atliekamas kaip pagrindinis atrankos testas ir IF rezultatai teigiami, išskyrimo, PGR ar FISH testą reikia atlikti kaip antrąjį atrankos testą. Kai IF testas atliekamas kaip antrasis atrankos testas ir IF rezultatai teigiami, reikia atlikti paskesnį testavimą pagal vaizduojamąją diagramą tam, kad analizė būtų baigta.
Pastaba. Naudojami patvirtinti antikūniai, specifiški R. solanacearum (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Rekomenduojama nustatyti kiekvienos naujos antikūnių partijos titrą. Titras apibrėžiamas kaip didžiausias praskiedimas, kuriam esant vyksta reakcija, tiriant homologinio R. solanacearum štamo 105–106 ląstelių/ml suspensiją ir naudojant atitinkamą gamintojo rekomenduojamą fluoresceino izotiocianato (FITC) konjugatą. Neišgrynintų polikloninių arba monokloninių antikūnių titras turėtų būti ne mažesnis kaip 1:2 000. Tyrimo metu antikūnius reikėtų praskiesti iki darbinio praskiedimo (DP), artimo ar lygaus jų titrui. Reikėtų tirti tik šviežiai pagamintus ekstraktus. Jei būtina, galima tirti glicerine temperatūroje nuo -68 iki -86 °C laikomus ekstraktus. Gliceriną iš bandinio galima pašalinti, įpylus 1 ml nuosėdų buferinio tirpalo (4 priedėlis), pakartotinai 15 minučių centrifuguoti 7 000 g greičiu ir pakartotinai suspenduoti, pripylus nuosėdų buferinio tirpalo lygų tūrį. Dažnai šitai atlikti nebūtina, ypač jei bandiniai fiksuojami ant plokštelės liepsna.
Paruošti atskiras teigiamas kontrolines plokšteles su homologiniu arba bet kuriuo etaloniniu R. solanacearum štamu, suspenduotu bulvių ekstrakte, kaip nurodyta 3 priedėlio B dalyje, ir pirmiausia buferiniame tirpale.
Jei įmanoma, į tos pačios plokštelės duobutes turėtų būti pripilama natūraliai užkrėsto audinio preparato (palaikomo liofilizacijos arba šaldymo būdu nuo -16 iki -24 °C temperatūroje) kaip panašaus kontrolinio bandinio.
Anksčiau nustatytų kaip neigiamų bandinių ekstraktų alikvotinės dalys galėtų būti naudojamos kaip neigiamos kontrolės.
Prieinamos standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos išvardytos 3 priedėlyje.
Naudoti daug duobučių turinčias mikroskopines plokšteles, mažiausiai 6 mm storio ir geriausia turinčias 10 langelių.
Kontrolinis bandinys tiriamas taip pat, kaip ir tiriamasis bandinys.
5.1. Tyrimui skirtos plokštelės paruošiamos taikant vieną iš šių procedūrų:
i) Nuosėdos, turinčios palyginti nedaug krakmolo:
Standartinis tūris (15 ml tinka dirbti, kai naudojamos 6 mm storio plokštelės, o jei langeliai didesni, tūris padidinamas) 1:100 praskiestų pakartotinai suspenduotų bulvių nuosėdų lašinamas į pirmąjį langelį. Paskiau nepraskiestų (1/1) pakartotinai suspenduotų nuosėdų panašus tūris lašinamas į vienos tos pačios eilės langelius. Antrojoje eilutėje pakartojamas pirmasis bandinys arba lašinamas antrasis bandinys, kaip parodyta 1 pav.
ii) Esant kitoms nuosėdoms:
Pakartotinai suspenduotos nuosėdos praskiedžiamos santykiu 1:10 ir 1:100 nuosėdų buferiniame tirpale. Standartinis pakartotinai suspenduotų nuosėdų tūris (15 ml tinka dirbti, kai naudojamos 6 mm storio plokštelės, o jei langeliai didesni, tūris padidinamas) lašinamas į langelį ir vienoje langelių eilutėje atliekamas praskiedimas. Antrojoje eilutėje pakartojamas pirmasis bandinys arba lašinamas antrasis bandinys, kaip parodyta 2 pav.
5.2. Lašeliai išdžiovinami kambario temperatūroje arba šildomi 40–45 °C temperatūroje. Bakterinės ląstelės fiksuojamas prie plokštelės arba kaitinant (15 minučių 60 °C temperatūroje), arba liepsna, 95 % etilo alkoholiu arba bet kuria kita antikūnių tiekėjų nurodyta tvarka.
Jei būtina, fiksuotos plokštelės paskiau iki tyrimo gali būti kiek galima trumpiau (ilgiausiai 3 mėnesius) saugomos šaltai sausoje dėžėje.
5.3. IF tvarka
i) Plokštelė paruošta, kaip nurodyta 5.1 skirsnio i punkte:
Paruošiamas antikūnių, dukart praskiestų IF buferiniu tirpalu, rinkinys. Į pirmąją duobutę įpilama 1/2 titro (T/2), į kitas – 1/4 titro (T/4), 1/2 titro (T/2), 1 titras (T) ir dukart titro antikūnių (2T).
Pakartotinai suspenduotų nuosėdų praskiedimai
2 pav. Tiriamosios plokštelės paruošimas pagal 5.1 skirsnio ii punktą ir 5.3 skirsnio ii punktą
Antiserumo/antikūnių darbinis praskiedimas
5.3.1. Plokštelės išdėliojamos ant sudrėkinto sugeriamojo popieriaus. Kiekvienas testuojamasis langelis sklidinai pripildomas praskiestų antikūnų tirpalo. Į kiekvieną langelį įpilamo antikūnių tirpalo tūris turi atitikti bent mažiausiai tiriamojo ekstrakto tūrį.
Antikūnių tiekėjams nepateikus vartojimo instrukcijų, laikomasi šios tvarkos:
5.3.2. Plokštelės 30 minučių laikomos uždengtos ant drėgno popieriaus kambario temperatūroje (18–25 °C).
5.3.3. Nukratyti antikūnių lašelius nuo kiekvienos plokštelės ir atsargiai nuplauti su IF buferiniu tirpalu. Plaunama panardinant plokštelę į IF buferinį tirpalą, turintį Tween (4 priedėlis), ir palaikoma 5 minutes, o po to įpilama IF buferinio tirpalo ir laikoma dar 5 minutes. Vengti aerozolio susidarymo arba lašelių pernešimo, dėl kurio gali įvykti kryžminė tarša. Perteklinis vanduo atsargiai pašalinamas nusausinant.
5.3.4. Plokštelės išdėliojamos ant drėgno popieriaus ir į duobutes įpilama FITC konjugato, atskiesto tiek, kiek jo tirpalas buvo panaudotas titrui nustatyti. Į duobutes įpilamo konjugato turis turi atitikti įpilamo antikūnio tirpalo tūrį.
5.3.5. Plokštelės 30 minučių laikomos uždengtos ant drėgno popieriaus kambario temperatūroje (18–25 °C).
5.3.6. Konjugato lašeliai pašalinami iš plokštelės juos nukratant. Plokštelė skalaujama ir plaunama, kaip pirmiau aprašyta (5.3.3).
Atsargiai pašalinamas perteklinis vanduo.
5.3.7. Į kiekvieną tiriamąjį langelį pipete įlašinama po 5–10 ml 0,1 M glicerino fosfatinio buferinio tirpalo arba komercinio priešblukinančiu aktyvumu pasižyminčio tirpalo (4 priedėlis) ir plokštelė uždengiama dengiamuoju stikleliu.
5.4. IF testo rezultatai:
5.4.1. Tiriamąsias plokšteles stebėti epifluorescenciniu mikroskopu naudojant filtrus, tinkamus FITC sužadinimui, aliejaus ar vandens imersinius tirpalus bei 500-1 000 kartų padidinus. Langeliai stebimi per dvigubą skersmenį dešiniuose kampuose ir aplink perimetrą. Bandinių, neturinčių arba turinčių nedaug ląstelių, stebima mažiausiai 40 laukelių.
Pirmiausia stebima teigiama kontrolinė plokštelė. Ląstelės turi šviesiai fluorescuoti ir būti visiškai nusidažiusios esant nustatytam antikūnių titrui ar darbiniam praskiedimui. Jei dažymasis nepavyko, IF testą (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą) reikia pakartoti.
5.4.2. Tiriamųjų plokštelių tiriamuosiuose langeliuose stebimos šviesiai fluorescuojančios tipiškos morfologijos R. solanacearum ląstelės (žr. žiniatinklio svetainę: http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescencijos intensyvumas privalo būti lygiavertis arba net didesnis už teigiamo kontrolinio štamo fluorescencijos intensyvumą esant tam pačiam antikūnių praskiedimui. Į ne visai nusidažiusias ląsteles ar silpnai fluorescuojančios ląsteles nekreipiama dėmesio.
Įtarus bet kokį užkrėtimą, testą privaloma pakartoti. Šitai gali atsitikti tokiu atveju, kai visose vienos partijos plokštelėse matomos teigiamos ląstelės dėl buferinio tirpalo taršos arba dėl to, kad ant plokštelės dangtelio stebimos teigiamos ląstelės (už plokštelės lango ribų).
5.4.3. Yra keletas būdingų IF testo specifiškumo problemų. Gali pasitaikyti foninių fluorescuojančių netipiškos morfologijos ląstelių populiacijų, panašių į R. solanacearum savo dydžiu bei morfologija panašių kryžmiškai reaguojančių saprofitinių bakterijų, pasitaikančių bulvių stiebagumbių viršūnių gabaliukų segmentų nuosėdose.
5.4.4. Tirti tik tipiško dydžio ir morfologijos fluorescuojančias ląsteles esant antikūnių titrui arba darbiniam praskiedimui, kaip nurodyta 5.3 skirsnyje.
5.4.5. IF rezultatų aiškinimas:
i) Jei stebimos šviesiai fluorescuojančios tipiškos morfologijos ląstelės, apskaičiuojamas tipiškų ląstelių viename mikroskopiniame laukelyje vidurkis ir tipiškų ląstelių skaičius pakartotinai suspenduotų nuosėdų viename mililitre (5 priedėlis).
Bandiniai, kurių 1 ml yra mažiausiai 5 x 103 tipiškų ląstelių, laikomi užkrėstais. Reikalaujama juos tirti toliau.
6. PGR testai
Principas
Kai PGR testas atliekamas kaip pagrindinis atrankos testas ir gaunami teigiami rezultatai, išskyrimo arba IF testą būtina atlikti kaip antrąjį privalomąjį atrankos testą. Kai PGR testas atliekamas kaip antrasis atrankos testas ir gaunami teigiami rezultatai, tai paskesnį testavimą reikia atlikti pagal vaizduojamąją diagramą tam, kad būtų baigtas diagnozavimas.
Šio metodo, kaip pagrindinio atrankos testo, visas galimybes rekomenduojama panaudoti tik turint patirties tam tikroje srityje.
Pastaba. Išankstinio testavimo taikant šį metodą nustatymo geba 1 mililitre turėtų siekti 103–104 R. solanacearum ląstelių bandinio ekstraktų, kurie anksčiau buvo įvertinti kaip neigiami. Kad visose laboratorijose būtų pasiektas didžiausias metodo nustatymo jautrumas ir specifiškumas, gali būti reikalaujama atlikti optimizavimo eksperimentus.
Naudoti patvirtintus PGR reagentus ir metodikas (žr. 6 priedėlį). Pirmiausia pasirinkti metodą, kurį taikant naudojama vidinė kontrolė.
Siekiant išvengti bandinio užteršimo tiriamąja DNR, imtis atitinkamų atsargumo priemonių. Kad būtų sumažinta taršos tiriamąja DNR galimybė, PGR testą turėtų atlikti prityręs molekulinės biologijos srityje dirbančių laboratorijų techninis personalas.
Neigiami kontroliniai bandiniai (DNR išskyrimo ir PGR atlikimo metu) visada turėtų būti laikomi galutiniais bandiniais, kuriais įrodoma, ar įvyko tarša DNR.
Atliekant PGR testą reikėtų taikyti šiuos neigiamus kontrolinius bandinius:
– bandinio ekstraktą, kuris per ankstesnį tyrimą buvo rastas neužkrėstas R. solanacearum,
– buferinius kontrolinius tirpalus, naudojamus išskirti iš bandinio bakterijai ir DNR,
– PGR reakcinį mišinį.
Reikėtų naudoti šiuos teigiamus kontrolinius bandinius:
– pakartotinai suspenduotų nuosėdų, prie kurių pridėta R. solanacearum, alikvotines dalis (apie paruošimą žr. 3B priedėlyje),
– virulentiško R. solanacearum izoliato (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; žr. 3B priedėlyje) 106 ląstelių/ml vandeninę suspensiją
– jei įmanoma, atliekant PGR testą reikėtų taip pat naudoti DNR, išskirtą iš teigiamų kontrolinių bandinių.
Siekiant išvengti galimos taršos, teigiami kontroliniai bandiniai paruošiami atskirai nuo tiriamųjų bandinių.
Reikėtų stengtis, kad bandinių ekstraktuose nebūtų dirvožemio. Todėl tam tikrais atvejais rekomenduotina išskyrimą atlikti naudojant plautas bulves, jei dirbama pagal PGR metodikas. Standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos, naudojamos šiam testui atlikti, išvardytos 3 priedėlyje.
6.1. DNR gryninimo metodai
Naudoti teigiamus ir neigiamus kontrolinius bandinius, kaip aprašyta pirmiau 3 priedėlyje.
Kontrolinę medžiagą tirti taip pat, kaip ir bandinį.
Tiriamoji DNR iš sudėtingų bandinių substratų išskiriama įvairiais metodais, taigi PGR ir kitų fermentinių reakcijų inhibitoriai pašalinami ir tiriamoji DNR sukoncentruojama bandinio ekstrakte. Paskesnis metodas buvo optimizuotas tam, kad būtų panaudotas su patvirtintais PGR metodais, aprašytais 6 priedėlyje.
1) 220 ml lizės buferinio tirpalo (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) įpilama į 1,5 ml tūrio Eppendorfo mėgintuvėlį.
2) Įpilti 100 ml bandinio ekstrakto ir mėgintuvėlį 10 minučių laikyti termostate arba vandens vonelėje 95 °C temperatūroje.
4) Įpilti 80 ml lizocimo pradinio tirpalo (50 mg lizocimo/ml 10 mM Tris HCl, pH 8,0 buferiniame tirpale) ir 30 minučių inkubuoti 37 °C temperatūroje.
5) Įpilti 220 ml Easy DNA® tirpalo A (Invitrogen), gerai sumaišyti maišyklėje ir 30 minučių inkubuoti 65 °C temperatūroje.
6) Įpilti 100 ml Easy DNA® tirpalo B (Invitrogen), intensyviai maišyti maišyklėje, kol nuosėdos gausiai susidarys mėgintuvėlyje, ir bandinys taps visiškai klampus.
8) 20 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje, kad būtų atskirtos fazės ir susidarytų interfazė.
11) 20 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje ir pašalinti etilo alkoholį iš nuosėdų.
13) 10 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje ir išsaugoti nuosėdas bei pašalinti etilo alkoholį.
15) Pakartotinai suspenduoti nuosėdas 100 ml steriliame ypač gryname vandenyje ir mažiausiai 20 minučių palikti kambario temperatūroje.
17) Centrifuguojant išsodinti bet kurį baltos spalvos precipitatą ir 5 ml supernatanto, turinčio DNR, panaudoti PGR atlikti.
6.2. PGR
6.2.1. Tiriamosios ir kontrolinės PGR matricos paruošiamos pagal patvirtintą metodiką (VI. A.6 skirsnis). Bandinio DNR ekstraktas praskiedžiamas ypač grynu vandeniu santykiu 1:10.
6.2.2. Pagal paskelbtą metodiką paruošiamas atitinkamas PGR reakcijos mišinys taršai atsparioje aplinkoje (6 priedėlis). Jei įmanoma, rekomenduojama naudoti daugybinę PGR metodiką, kurioje yra panaudojama ir vidinė kontrolė.
6.2.3. 2-5 ml DNR ekstrakto įpilama į PGR reakcijos mišinį, esantį steriliuose PGR skirtuose mėgintuvėliuose (žr. 6 priedėlis), kad bendras PGR reakcijos tūris būtų 25 ml.
6.2.4. Naudojamas neigiamas kontrolinis bandinys, sudarytas tik iš PGR reakcinio mišinio, ir vietoj bandinio į jį įpilama ypač gryno vandens.
6.3. PGR produkto analizė
6.3.1. Padaugintos matricinės DNR bandiniai analizuojami elektroforezės agarozės gelyje metodu. Kiekvieno bandinio į gelį įnešama mažiausiai po 12 ml padaugintos DNR reakcinio mišinio, sumaišyto su 3 ml įnešimo buferinio tirpalo (6 priedėlis). Naudojami 2,0 % (svoris/tūris) agarozės geliai, pagaminti taikant TRIS-acetato-EDTA (TAE) buferinį tirpalą (6 priedėlis), ir elektroforezė atliekama esant 5-8 V/cm. Naudojama atitinkamo ilgio DNR žymė, pvz., 100bp ilgio fragmentas.
6.3.2. DNR juostelės išryškinamos dažant etidiumo bromido dažu (0,5 mg/l) 30–60 minučių, imantis atsargumo priemonių, dirbant su šiuo mutagenu.
6.3.3. Gelis apžiūrimas, apšviečiant jį trumpųjų UV bangų peršvietėju (pvz., bangos ilgiui siekiant λ = 302 nm), stebimi numatomo ilgio padaugintos DNR fragmentai (6 priedėlis) ir nufotografuojami.
6.3.4. Gavus naujų duomenų arba esant naujiems atvejams, nustatomas padaugintos DNR autentiškumas atliekant likusios padaugintos DNR bandinio analizę restriktaze, jį inkubuojant kambario temperatūroje atitinkamo fermento ir buferinio tirpalo mišinyje (žr. 6 priedėlį). Suskaldyti fragmentai analizuojami agarozės gelio elektroforezės metodu ir stebimas būdingas restrikcijos fragmentas, gelį apšviečiant UV peršvietėju, nudažius etidiumo bromidu ir palyginant su nesuskaldytu ir suskaldytu teigiamu kontroliniu bandiniu.
PGR testo rezultato aiškinimas:
PGR testas neigiamas, jei specifinės padaugintas R. solanacearum DNR fragmentas tiriamajame bandinyje nenustatomas, bet jis nustatomas visuose teigiamuose kontroliniuose bandiniuose (kai daugybinė PGR atliekama naudojant augalo atžvilgiu specifinius vidinius kontrolinius pradmenis: antrasis PGR produktas numatomo dydžio turėtų būti padaugintas kartu su tiriamuoju bandiniu).
PGR testas yra teigiamas, jei aptinkama specifinė padaugintos R. solanacearum numatomo dydžio DNR ir jos fragmentas, suskaldytas restriktaze (kai reikalaujama), ir laikomasi nuostatos, kad jis negaunamas iš bet kurio neigiamo kontrolinio bandinio. Patikimas teigiamo rezultato patvirtinimas gali būti gaunamas pakartojant testą ir naudojant antrąjį DNR pradmenų rinkinį (6 priedėlis).
Pastaba. PGR inhibiciją galima įtarti, jei padaugintos matricinės DNR gaunama iš teigiamo kontrolinio bandinio, turinčio R. solanacearum vandenyje, tačiau neigiami rezultatai gaunami naudojant teigiamą kontrolinį bandinį, turintį R. solanacearum bulvių ekstrakte. Daugybinę PGR atliekant ir naudojant vidinę PGR kontrolę, reakcijos inhibicija stebima negavus abiejų padaugintų matricinių DNR.
Taršą galima įtarti, jei numatoma padauginta DNR gaunama iš daugiau nei vieno neigiamo kontrolinio bandinio.
7. Fluorescencinės hibridizacijos in situ (FISH) testas
Principas
Kai FISH testas taikomas kaip pirmasis atrankos testas ir nustatoma, kad jis teigiamas, IF testą reikia atlikti kaip antrąjį privalomąjį atrankos testą. Kai FISH testas taikomas kaip antrasis privalomasis testas ir nustatoma, kad jis teigiamas, tai reikalaujama paskesnį testavimą pagal vaizduojamąją diagramą atlikti tam, kad būtų baigtas diagnozavimas.
Pastaba. Naudoti patvirtintus oligonukleotidų, specifiškų R. solanacearum bandinius (7 priedėlis). Taikant šį metodą, išankstinio testavimo nustatymo geba turėtų siekti 103–104 R. solanacearum ląstelių viename mililitre bandinio ekstraktų, kurie anksčiau buvo įvertinti kaip neigiami.
Ši tvarka pirmiausia turėtų būti taikoma šviežiai paruoštam bandinio ekstraktui, tačiau ją taip pat galima taikyti bandinio ekstraktui, kuris buvo laikomas glicerine nuo -16 iki -24 °C arba nuo -68 iki -86 °C temperatūroje.
Bandinio ekstrakto, nustatyto kaip neturinčio R. solanacearum ląstelių, alikvotines dalis naudoti kaip neigiamus kontrolinius bandinius.
3-5 dienų amžiaus kultūrų suspensijas, turinčias R. solanacearum (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857 štamo) 0,01 M fosfatiniame buferiniame tirpale 105–106 ląstelių/ml, reikėtų naudoti kaip teigiamus kontrolinius bandinius (apie paruošimą žr. 3 priedėlyje). Paruošti atskiras teigiamas kontrolines plokšteles, skirtas homologiniam arba bet kuriam etaloniniam R. solanacearum štamui, suspenduotam bulvių ekstrakte, kaip nurodyta 3B priedėlyje.
Fluoresceino izotiocianato (FITC) žyme pažymėti oligonukleotidiniai bandiniai, specifiški eubakterijoms, labai naudingi kontroliuojant hibridizavimo procesą, kadangi jais nudažomos visos bandinyje esančios bakterijos.
Įsigyjamos standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos, naudojamos šiam testui atlikti, išvardytos 3 priedėlio A dalyje.
Kontrolinis bandinys tiriamas tokiu pat būdu, kaip ir tiriamasis bandinys.
7.1. Bulvių ekstrakto fiksavimas
Paskesnė metodika pagal Wullings et al. (1998):
7.1.2. Į Eppendorf mėgintuvėlį įlašinama po 100 ml kiekvieno bandinio ekstrakto ir mėgintuvėlis 7 minutes centrifuguojamas 7 000 g greičiu.
7.1.3. Nupilamas viršnuosėdinis skystis ir nuosėdos ištirpinamos 200 ml fiksažo, paruošto prieš trumpiau kaip 24 valandas. Mėgintuvėlis sumaišomas ir 1 valandą inkubuojamas šaldytuve.
7.1.4. 7 minutes centrifuguojama 7 000 g, nupilamas viršnuosėdinis skystis ir nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 75 ml 0,01 M fosfatiniame buferiniame tirpale (žr. 7 priedėlį).
7.1.5. Į švarios daug duobučių turinčios plokštelės duobutes įlašinama po 16 ml fiksuotų suspensijų taip, kaip parodyta 3 pav. Kiekviena plokštelė skiriama 2 bandiniams ištirti, įlašinant juos nepraskiestus po 10 ml, ir paskiau padaryti 1:100 praskiedimą (0,01 M fosfatiniu buferiniu tirpalu). Likusį bandinio tirpalą (49 ml) galima saugoti 20 °C temperatūroje, pripylus 1 tūrį 96 % etilo alkoholio. Jei reikia pakartoti FISH testą, etilo alkoholis pašalinamas, centrifuguojant ir pripilant tokį pat tūrį 0,01 M fosfatinio buferinio tirpalo (sumaišoma, pavartant aukštyn ir žemyn).
7.1 pav. FISH testui skirtos plokštelės išklotinė
7.2. Hibridizavimas
7.2.1. Vanduo pašalinamas iš ląstelių, kas minutę įpilant laipsniškai didėjančios koncentracijos – 50 %, 80 % ir 96 % – etilo alkoholio. Plokštelės džiovinamos, įdėjus jas į plokštelėms skirtą laikiklį.
7.2.2. Parengiama drėgna inkubavimo kamera, oro nepraleidžiančios dėžės dugną uždengus sugeriamuoju arba filtriniu popieriumi, išmirkytu 1x hybmix (7 priedėlis). Dėžė mažiausiai 10 minučių paliekama hibridizavimui skirtoje krosnelėje 45 °C temperatūroje.
7.2.3. Paruošti hibridizacijos tirpalą (7 priedėlis), į vienos plokštelės 8 duobutes (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 ir 10 duobutes, žr. 7.1 pav.) įpilti 10 ml ir 2 centrines duobutes (3 ir 8) palikti laisvas.
7.2.4. Kiekviena plokštelė uždengiama dviem apsauginėmis juostelėmis (24 x 24 mm), kad neprasiskverbtų oras. Plokštelės sudedamos į pašildytą drėgną kamerą ir 5 valandas krosnelėje 45 °C temperatūroje tamsoje atliekamas hibridizavimas.
7.2.5. Į tris laboratorines kolbas įpilama po 1 l Milli Q (molekulinės biologijos darbams skirto) vandens, po 1 1 lx hybmix tirpalo (334 ml 3x hybmix ir 666 ml Milli Q vandens) ir 1 1 l/8x hybmix (42 ml 3x hybmix ir 958 ml Milli Q vandens). Kiekviena kolba pašildoma vandens vonioje 45 °C temperatūroje.
7.2.7. Bandinio perteklius pašalinamas 15 minučių inkubuojant plokštelę laboratorinėje kolboje, į ją įpylus lx hybmix, 45 °C temperatūroje.
7.2.8. Plokštelių laikiklis pamerkiamas į 1/8 hybmix plovimo tirpalą ir inkubuojamas dar 15 minučių.
7.2.9. Plokštelės trumpam pamerkiamos į Milli Q vandenį ir padedamos ant filtrinio popieriaus. Perteklinis vanduo pašalinamas, paviršių padengiant filtriniu popieriumi. Į kiekvieną langelį pipete įlašinama po 5–10 ml priešblukinančiu aktyvumu pasižyminčio ryškintojo tirpalo (pvz., Vectashield, Vecta Laboratories, CA, JAV, arba jam lygiaverčio) ir visa plokštelė uždengiama viena (24 x 60 mm) dengiančiąja juostele.
7.3. FISH testo rezultatai
7.3.1. Plokšteles, pamerktas į imersinį aliejų, nedelsiant stebėti mikroskopu, tinkančiu epifluorescencinei mikroskopijai, ir padidinus 630 ir 1 000 kartų. Bandinyje esančias eubakterines ląsteles (įskaitant Gram(-) ląsteles) stebint per filtrą, tinkantį fluoresceino izotiocianatui (FITC), jos atrodo fluorescuojančiai žaliai. Cy3 dažu dažytas R. solanacearum ląsteles stebint per filtrą, skirtą tetrametilrodamino-5-izotiocianatui, jos fluorescuoja raudonai. Palyginti tiriamųjų ir teigiamų kontrolinių ląstelių morfologiją. Ląstelės turi fluorescuoti šviesia spalva ir būti visiškai nusidažiusios. FISH testą (VI. A.7 skirsnis) reikia pakartoti, jei dažymasis nepavyko. Langeliai stebimi per dvigubą skersmenį dešiniuose kampuose ir aplink perimetrą. Bandinių, neturinčių arba turinčių nedaug ląstelių, stebima mažiausiai 40 laukelių.
7.3.2. Stebėti būdingos morfologijos šviesiai fluorescuojančias R. solanacearum ląsteles tiriamųjų plokštelių tiriamuosiuose langeliuose (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescencijos intensyvumas privalo būti lygiavertis arba net didesnis už teigiamo kontrolinio štamo fluorescencijos intensyvumą. Į ne visai nusidažiusias ląsteles ar silpnai fluorescuojančias ląsteles nekreipiama dėmesio.
7.3.3. Įtarus bet kokią taršą, testą privaloma pakartoti. Šitai gali atsitikti tokiu atveju, kai dėl buferinio tirpalo taršos visose vienos partijos plokštelėse matomos teigiamos ląstelės, arba dėl to, kad stebimos teigiamos ląstelės (už plokštelės lango ribų) ant plokštelės dangtelio.
7.3.4. Yra keletas būdingų FISH testo specifiškumo problemų. Gali pasitaikyti foninių fluorescuojančių netipiškos morfologijos ląstelių populiacijų ir į R. solanacearum savo dydžiu bei morfologija panašių kryžmiškai reaguojančių saprofitinių bakterijų, nors tokie atvejai gerokai retesni nei IF testo atveju tiriant bulvių stiebagumbių viršūnės gabaliukų segmentų nuosėdas.
7.3.6. FISH testo rezultatų aiškinimas:
i) Teigiami FISH testo rezultatai gaunami tada, kai per FITC filtrą stebimos tipiško dydžio bei morfologijos šviesiai žaliai fluorescuojančios R. solanacearum ir per rodamino filtrą stebint visas teigiamas kontrolines ląsteles, šios fluorescuoja šviesiai raudona spalva, o tarp neigiamų kontrolinių ląstelių jokios fluorescencijos nėra. Jei randama šviesiai fluorescuojančių būdingos morfologijos ląstelių, apskaičiuojamas tipiškų ląstelių viename mikroskopiniame laukelyje vidurkis ir tipiškų ląstelių skaičius pakartotinai suspenduotų nuosėdų viename mililitre (4 priedėlis). Bandiniai, kurių 1 ml yra mažiausiai 5 x 103 tipiškų ląstelių, laikomi užkrėstais. Reikalaujama juos tirti toliau. Bandiniai, kurių pakartotinai suspenduotų nuosėdų 1 ml yra mažiau kaip 5 x 103 tipiškų ląstelių, laikomi neigiamais.
ii) FISH testas yra neigiamas tada, kai stebint per rodamino filtrą tipiško dydžio ir morfologijos šviesiai raudonai fluorescuojančios R. solanacearum nėra stebimos, laikantis nuostatos, kad šviesiai raudonai fluorescuojančios ląstelės teigiamuose kontroliniuose bandiniuose stebimos, šiuos stebint per rodamino filtrą.
8. Imunofermentinės analizės (ELISA) testai
Principas
Imunofermentinė analizė gali būti taikoma tik kaip papildomas testas atliekant IF, PGR ir FISH testus dėl palyginti mažo nustatymo jautrumo šio testo metu. Kai atliekama dviejų antikūnų sluoksnių netiesioginė imunofermentinė analizė (DASI ELISA), praturtinimo operacija ir monokloninių antikūnų naudojimas yra privalomi (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Mėginių praturtinimas prieš imunofermentinę analizę gali atnešti naudos, kad nustatymo jautrumas šio testo metu padidėtų, tačiau dėl kitų praturtinamų konkuruojančių bakterijų jis gali ir sumažėti.
Pastaba. Naudoti tik patvirtintus antikūnus, specifiškus R. solanacearum (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Rekomenduojama nustatyti kiekvienos naujos antikūnų partijos titrą. Titras apibrėžiamas kaip didžiausias praskiedimas, kuriam esant vyksta optimali reakcija, kai tiriama R. solanacearum homologinio štamo 105–106 ląstelių viename mililitre suspensija, naudojant atitinkamus antrinių antikūnų konjugatus, remiantis gamintojo rekomendacijomis. Tyrimo metu antikūnų titras turi būti darbinis ir artimas arba lygus komercinio preparato titrui. Nustatyti antikūnų titrą R. solanacearum homologinio štamo suspensijoje, kurios 1 ml yra 105–106 ląstelių.
Bandinio ekstraktą, kuris, kaip anksčiau įrodyta, buvo neigiamas R. solanacearum atžvilgiu, ir kryžmiškai nereaguojančių bakterijų fosfatiniame buferiniame tirpale suspensiją naudoti kaip neigiamus kontrolinius bandinius.
Bandinio ekstrakto alikvotines dalis, kurias sumaišius su 103–104 R. solanacearum 2 biovarieteto (pvz., štamo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, žr. 2A ir B priedus) suspensija ir nustačius, kad jos buvo neigiamos R. solanacearum atžvilgiu, naudoti kaip neigiamą kontrolinį bandinį. Atliekant kiekvienos plokštelės rezultatų palyginimą naudojama standartinė R. solanacearum 105–106 ląstelių fosfatiniame buferiniame tirpale suspensija. Užtikrinti, kad atliekant testą plokštelės duobutėse įpilti teigiami kontroliniai bandiniai būtų tinkamai atskirti nuo tiriamųjų bandinių
Standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos, skirtos šiam testui atlikti, išvardytos 3 priedėlio A dalyje.
Testui skirtą kontrolinę medžiagą tirti taip pat, kaip ir bandinį (bandinius).
Patvirtintos dvi imunofermentinės analizės metodikos.
1) Naudoti 100–200 ml bandinio ekstrakto alikvotines dalis (4 minutes kaitinant 100 °C temperatūroje vandens vonelėje arba termostate, kai kuriais atvejais galima sumažinti nespecifinių rezultatų skaičių).
2) Įpilti tokio pat tūrio dvigubos joninės jėgos plokštelės padengimo buferinio tirpalo (4 priedėlis) ir sukratyti.
3) 100 ml alikvotinių dalių įpilti mažiausiai į dvi mikrotitravimo plokštelės (pvz., Nunc-Polysorp ar lygiavertės markės) duobutes ir 1 valandą inkubuoti 37 °C temperatūroje arba per naktį 4 °C temperatūroje.
4) Ekstraktus išpilti iš duobučių, šias tris kartus perplauti fosfatiniu buferinio tirpalo ir Tween mišiniu (4 priedėlis), paskutinę plovimo tirpalo porciją mažiausiai 5 minutes paliekant duobutėse.
5) Paruošti atitinkamo praskiedimo antikūnų, specifiškų R. solanacearum, blokavimo buferiniame tirpale bandinį (4 priedėlis). Naudojant patvirtintų antikūnų komercinį preparatą, atlikti rekomenduojamus praskiedimus (paprastai dvigubai didesnius už darbinį titrą).
8) Paruošti atitinkamo praskiedimo antrinių antikūnų ir šarminės fosfatazės konjugato blokavimo buferiniame tirpale bandinį. Įpilti jo po 100 ml ir 1 valandą inkubuoti 37 °C temperatūroje.
10) Į kiekvieną duobutę įpilti po 100 ml šarminės fosfatazės substrato tirpalo (4 priedėlis). Inkubuoti tamsoje kambario temperatūroje ir atlikti plokštelėje esančių bandinių spektrofotometrinį matavimą, išmatuojant absorbciją, bangos ilgiui siekiant 405 nm, reguliariais intervalais 90 minučių laikotarpiu.
1) Paruošti atitinkamo praskiedimo polikloninių antikūnų, specifiškų R. solanacearum, plokštelės padengimo buferiniame tirpale pH 9,6 (4 priedėlis) bandinį, po 200 ml įpilti į kiekvieną duobutę ir 4–5 valandas inkubuoti 37 °C temperatūroje arba 16 valandų 4 °C temperatūroje.
2) Duobutes tris kartus perplauti fosfatinio buferinio tirpalo ir Tween mišiniu (4 priedėlis).
Į mažiausiai dvi duobutes įpilti po 190 ml bandinio ekstrakto. Į kiekvienos plokštelės dvi duobutes įpilti teigiamų ir neigiamų kontrolinių tirpalų ir 16 valandų inkubuoti 4 °C temperatūroje.
4) Paruošti atitinkamo praskiedimo monokloninių antikūnų, specifiškų R. solanacearum, fosfatiniame buferiniame tirpale, taip pat turinčiame 0,5 % galvijų serumo albumino (4 priedėlis), bandinį, į kiekvieną duobutę įpilti po 190 ml ir 2 valandas inkubuoti 37 °C temperatūroje.
6) Paruošti atitinkamo praskiedimo antikūnų, specifiškų pelių imunoglobulinams, ir šarminės fosfatazės konjugato fosfatiniame buferiniame tirpale bandinį, į kiekvieną duobutę įpilti po 190 ml ir 2 valandas inkubuoti 37 °C temperatūroje.
8) Paruošti šarminės fosfatazės substrato tirpalą, kurio 1 ml yra 1 mg p-nitrofenilfosfato (4 priedėlis). Į kiekvieną duobutę pripilti po 200 ml. Plokštelė inkubuojama tamsoje, kambario temperatūroje, ir po to matuojama absorbcija, bangos ilgiui siekiant 40 nm reguliariais intervalais 90 minučių laikotarpiu.
Imunofermentinės analizės rezultatų aiškinimas
Imunofermentinė analizė laikoma neigiama, jei bandinių, esančių dviejose duobutėse (bandinys ir jo pakartojimas), vidutinis optinis tankis (OT) dukart mažesnis už neigiamo bandinio ekstrakto, esančio 1 duobutėje, optinį tankį, laikantis nuostatos, kad visų teigiamų kontrolinių bandinių optinis tankis didesnis nei 1,0 (pasibaigus 90 minučių trukusiai inkubacijai su substratu) ir dukart didesnis už neigiamų bandinių ekstraktų optinį tankį.
Imunofermentinė analizė laikoma teigiama, jei bandinių, esančių dviejose duobutėse (bandinys ir jo pakartojimas), vidutinis optinis tankis (OT) dukart didesnis už neigiamo bandinio ekstrakto, esančio 1 duobutėje, optinį tankį, laikantis nuostatos, kad visų neigiamų kontrolinių bandinių optinis tankis dukart mažesnis už visų teigiamų kontrolinių bandinių optinį tankį.
Teigiamo kontrolinio bandinio optinio tankio rodmenims esant neigiamiems, įrodoma, kad testas nebuvo tinkamai atliktas arba jo metu įvyko slopinimas. Neigiamų kontrolinių bandinių teigiami optinio tankio rezultatai rodo, kad įvyko kryžminė tarša arba prisijungė nespecifiniai antikūnai.
9. Biotestas
Pastaba. Šiuo metodu atliekant išankstinį tyrimą bandinių ekstraktuose, kurie anksčiau buvo nustatyti kaip neigiami, o vėliau juos dirbtinai užkrėtus, 1 ml galima nustatyti 103–104 R. solanacearum kolonijas sudarančių vienetų (apie paruošimą žr. 3 priedėlyje).
Didžiausio nustatymo jautrumo galima tikėtis, kai naudojamas šviežiai paruoštas bandinio ekstraktas ir laikomasi optimalių augimo sąlygų. Tačiau šį metodą galima sėkmingai taikyti tiriant ekstraktus, laikytus glicerine nuo -68 iki -86 °C temperatūroje.
Taikoma Janse metodika (1988):
9.1. Auginti 10 tiriamųjų jautrios veislės pomidorų augalų (pvz., veislę „Moneymaker“ arba lygiaverčio jautrumo užkrėtimui veislę, kaip nustatyta tyrimų laboratorijoje), kiekvienam bandomajam augalui esant trečiojo tikrojo lapelio stadijoje. Dėl auginimo žr. 8 priedėlį. Panašiai naudoti baklažanus (pvz., veislę „Black Beauty“ arba lygiavertę užkrėtimui jautrią veislę). Naudoti tik augalus, esančius 2–3 lapelio stadijoje, iki bus visiškai pasiekta trečiojo tikrojo lapelio stadija. Nustatyta, kad simptomai pasireiškia ne taip ūmiai ir lėčiau pasireiškia baklažanuose. Kai įmanoma, rekomenduojama auginti pomidorų daigus.
9.2. 100 ml bandinio ekstrakto paskirstoma po lygiai visiems tiriamiesiems augalams.
9.2.1. Inokuliavimas švirkštu
Augalų stiebai virš sėklaskilčių inokuliuojami naudojant švirkštą su hipodermine adata (ne mažiau kaip 23G). Inokuliuojant visus augalus bandinio ekstraktas padalijamas po lygiai.
9.2.2. Inokuliavimas įpjovos vietoje
Laikant augalą dviem pirštais, suspenduotų nuosėdų lašas (apytiksliai 5–10 ml) užlašinamas ant stiebo tarp sėklaskilčių ir pirmojo lapelio.
Steriliu skalpeliu padaromas įstrižinis 1 cm ilgio ir 2/3 stiebo storio gylio pjūvis nuo tos vietos, kur buvo užlašintas suspenduotų nuosėdų lašas.
Naudojant švirkštą, pjūvis užsandarinamas steriliu vazelinu.
9.3. Taikant tą patį inokuliavimo metodą, 5 daigai inokuliuojami R. solanacearum virulentiško 2 biovarieteto štamo kultūros 105–106 ląstelių/ml vandenine suspensija 48 val., kaip teigiamu kontroliniu bandiniu, ir nuosėdų buferiniu tirpalu (4 priedėlis), kaip neigiamu kontroliniu bandiniu. Siekiant išvengti kryžminės taršos, teigiami ir neigiami kontroliniai augalai atskiriami nuo kitų augalų.
9.4. Augalai testams karantino sąlygomis 4 savaites laikomi 25–30 °C temperatūroje ir esant didelei santykinei drėgmei, tinkamai drėkinant, kad būtų išvengta vytimo, skurdimo dėl vandens trūkumo. Siekiant išvengti taršos, teigiami kontroliniai ir neigiami kontroliniai augalai auginami aiškiai atskirtuose loveliuose šiltnamyje arba auginimui skirtoje patalpoje, o jei trūksta erdvės, juos prižiūrint yra užtikrinama atskirtis. Jei skirtingais bandiniais inokuliuojamus augalus reikia auginti kartu, jie atskiriami skydeliais. Tręšimo, laistymo, tikrinimo ir kitų operacijų metu labai rūpinamasi išvengti kryžminės taršos. Būtina užtikrinti, kad į šiltnamius ir auginimui skirtas patalpas nepatektų jokie vabzdžiai kenkėjai, nes jie gali pernešti bakteriją nuo vieno bandinio prie kito.
Stebėti vytimo, epinastijos, chlorozės ir (arba) žemaūgiškumo simptomus.
9.5. Atskirti užkrėstus augalus (II.3 skirsnis) ir identifikuoti grynas kultūras iš spėjamos R. solanacearum (VI. B skirsnis).
9.6. Jei simptomų nepastebima, po trijų savaičių atliekamas IF/PGR testas, naudojant sudėtinį bandinį, gautą iš kiekvieno tiriamojo augalo aukščiau inokuliavimo vietos paėmus 1 cm dydžio stiebo segmentą. Jei testo rezultatai teigiami, atliekamas selektyvaus pasėjimo į auginimo terpę testas (4.1 skirsnis).
9.7. Identifikuoti bet kurias išgrynintas spėjamas R. solanacearum kultūras (VI. B skirsnis).
Biotesto rezultatų aiškinimas
Biotesto patikimi rezultatai gaunami, kai teigiamuose kontroliniuose augaluose pasireiškia tipiški simptomai, iš šių augalų galima išskirti bakteriją ir neigiamuose kontroliniuose augaluose simptomų pastebėta nebuvo.
Biotestas neigiamas, jei tiriamieji augalai neužkrečiami R. solanacearum, laikantis nuostatos, kad R. solanacearum aptinkama teigiamuose kontroliniuose augaluose.
Biotestas teigiamas, jei tiriamieji augalai užkrečiami R. solanacearum.
B. IDENTIFIKAVIMO TESTAI
Spėjamų R. solanacearum izoliatų grynos kolonijos identifikuojamos taikant bent šiuos du testus, pagrįstus skirtingais biologiniais principais.
Atliekant kiekvieną testą, naudojami atitinkami etaloniniai štamai (žr. 3 priedėlį).
1. Mitybiniai ir fermentiniai identifikavimo testai
Fenotipinės savybės, kurios paprastai stebimos arba nėra stebimos R. solanacearum atveju, nustatomos Lelliott ir Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001) metodais.
Testas Numatomas rezultatas
Fluorescuojančio pigmento sintezė -
Polibetahidroksibutirato intarpai +
Oksidavimo/Fermentacijos (O/F) testas O+/F-
Katalazės aktyvumas +
Kovac'o oksidazės testas +
Nitrato redukavimas +
Citrato sunaudojimas +
Augimas 40 °C temperatūroje -
Augimas esant 1 % NaCl +
Augimas esant 2 % NaCl -
Arginino dihidrolazės aktyvumas -
Želatinos skystėjimas -
Krakmolo hidrolizė -
Eskulino hidrolizė -
Levano sintezė -
2. Imunofluorescencinė analizė (IF)
2.2. Atitinkamą antiserumą dukart praskiesti (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main).
3. Imunofermentinė analizė (ELISA)
Pastaba. Atliekant du identifikavimo testus, taikyti tik šį metodą.
3.1. Paruošti apytiksliai 108 ląstelių vienąkart koncentruotame fosfatiniame buferiniame tirpale suspensiją (4 priedėlis).
3.2. Atitinkamai atlikti imunofermentinę analizę, naudojant monokloninį antikūną, specifišką R. solanacearum.
4. PGR
4.1. Paruošti apytiksliai 106 ląstelių/l ml molekulinės biologijos tyrimams skirto vandens suspensiją.
4.2. 100 ml ląstelių suspensijos 4 minutes pakaitinti uždaruose mėgintuvėliuose termostate arba vandens vonelėje 100 °C temperatūroje. Paskui bandinius galima saugoti -16–24 °C temperatūroje tol, kol jų prireiks.
4.3. Atitinkamomis PGR procedūromis padauginami atitinkami R. solanacearum matricinės DNR fragmentai (pvz., Seal et al. (1993); Pastrik and Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)).
5. FISH testas
5.2. Taikyti FISH procedūrą (VI. A.7 skirsnis) naudojant mažiausiai du oligonukleotidinius bandinius, specifiškus R. solanacearum (7 priedėlis).
6. Riebiųjų rūgščių tipo nustatymas
6.3. Riebiųjų rūgščių tipo nustatymo testo teigiamas rezultatas gaunamas, jei spėjamos kultūros riebiųjų rūgščių tipas atitinka teigiamo kontrolinio bandinio riebiųjų rūgščių tipą. Būdingų riebiųjų rūgščių – 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH ir 18:1 2OH – buvimas ir 16:0 3OH nebuvimas visiškai patvirtina užkrėtimą Ralstonia sp.
7. Štamo apibūdinimo metodai
Kiekvienu nauju R. solanacearum išskyrimo atveju rekomenduojama štamą apibūdinti taikant toliau pateikiamus metodus.
Atliekant kiekvieną testą, prireikus naudojamasi etaloniniais štamais (žr. 3 priedėlį).
7.1. Biovarieteto nustatymas
R. solanacearum skirstoma į biovarietetus pagal sugebėjimą panaudoti ir (arba) oksiduoti tris disacharidus ir tris heksozės alkoholius (Hayward, 1964 ir Hayward et al., 1990). Atliekant biovarieteto nustatymo testą, naudojamasi auginimo terpe, aprašyta 2 priedėlyje. Testas atliekamas sėkmingai, jei terpė inokuliuojama grynomis R. solanacearum izoliatų kultūromis dūrio metodu ir inkubuojama 28 °C temperatūroje. Jei terpė išpilstoma į sterilias 96 duobučių plokšteles (1 duobutės tūriui siekiant 200 ml), tai per 72 valandas galima stebėti spalvos pokytį nuo alyvų žalumo iki geltonumo, įrodantį teigiamą testo rezultatą.
|
|
Biovertas |
||||
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
| Sugebėjimas sunaudoti: |
|
|
|
|
|
| Maltozę |
- |
+ |
+ |
- |
+ |
| Laktozę |
- |
+ |
+ |
- |
+ |
| D (+) Celiobiozę |
- |
+ |
+ |
- |
+ |
| Manitolį |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
| Sorbitolį |
- |
- |
+ |
+ |
- |
| Dulcitolį |
- |
- |
+ |
+ |
- |
Nustatant 2 biovarieteto subfenotipus, atliekami papildomi testai.
|
|
Biovarietetas 2A (paplitęs visame pasaulyje) |
Biovarietetas 2A (aptinkamas Čilėje ir Kolumbijoje) |
Biovarietetas 2T (aptinkamas tropikuose) |
| Trehalozės sunaudojimas |
- |
+ |
+ |
| Mezo-inozitolio sunaudojimas |
+ |
- |
+ |
| D ribozės sunaudojimas |
- |
- |
+ |
| Pektino skaldymo aktyvumas (1) |
mažas |
mažas |
didelis |
| (1) Žr. Lelliott and Stead(1987). |
|
|
|
7.2. Genominis „pirštų antspaudų“ metodas
R. solanacearum štamų nustatymas molekulinės biologijos metodais apskritai atliekamas taikant šiuos tris metodus:
7.2.2. Pakartojamos sekos PGR naudojant pradmenis, specifiškus bakterinėms REP, BOX ir ERIC sekoms (Louws et al. 1995; Smithetal, 1995).
7.3. PGR metodai
Specifiniai PGR pradmenys (Pastrik et al., 2002; žr. 6 priedėlį) gali būti naudojami nustatant R. solanacearum atskirus štamus, priklausančius 1 skyriui (3, 4 ir 5 biovarietetai) ir 2 skyriui (1, 2A ir 2T biovarietetai), kai anksčiau buvo nustatyta, atlikus restrikcijos fragmentų polimorfizmo analizę (Cook et al, 1989) bei nustatant 16S rDNR nukleotidų seką (Taghavi et al., 1996).
C. Patvirtinimo metodas
Patogeniškumo testą privaloma atlikti galiausiai diagnozuojant R. solanacearum ir įvertinant kultūrų, identifikuojamų kaip R. solanacearum, virulentiškumą.
1) Paruošti apytiksliai 106 ląstelių, po 24–48 valandų auginimo paimtų iš tiriamojo izoliato ir atitinkamo teigiamo kontrolinio R. solanacearum (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; žr. 3 priedėlį), inokuliatą.
2) Inokuliuoti 5–10 pomidorų arba baklažanų daigų 3 lapelio stadijoje esančius stiebus (žr. VI skirsnio A dalies 9 punktą).
3) 2 savaites inkubuoti 25–28 °C temperatūroje esant pakankamai šviesos ir palyginti daug drėgmės, atitinkamai laistant, stengiantis išvengti permirkimo arba sausros sukeliamo poveikio. Grynų kultūrų atveju tipiškas vytimas turėtų įvykti per 14 dienų. Jei pasibaigus šiam laikotarpiui simptomai nestebimi, R. solanacearum kultūros negalima laikyti patogenine.
5) Išskirti iš simptominių augalų, 2 cm virš inokuliavimo vietos paimti stiebo segmentą. Paimta dalis susmulkinama ir suspenduojama nedideliame sterilaus vandens tūryje arba 50 mM fosfatiniame buferiniame tirpale (4 priedėlis). Iš suspensijos išskiriama praskiedimo arba persėjimo į tinkamą terpę, pirmiausia mitybinę, būdu (2 priedėlis), 48–72 valandoms inkubuojant 28 °C temperatūroje ir stebint R. solanacearum tipiškų kolonijų susiformavimą.
______________
1 priedėlis
Metodikas optimizuojančios ir patvirtinančios laboratorijos
| Laboratorija (1) |
Buvimo vieta |
Šalis |
| Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit |
Viena ir Lincas |
Austrija |
| Departement Gewasbescherming |
Merelbekas |
Belgija |
| Plantedirektoratet |
Lingbis |
Danija |
| Central Science Laboratory |
Jorkas |
Anglija |
| Scottish Agricultural Science Agency |
Edinburgas |
Škotija |
| Laboratoire National de la Protection |
Anžeras |
Prancūzija |
| des Végétaux, Unité de Bactériologie |
|
|
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre |
Le Rheu |
Prancūzija |
| Biologische Bundesanstalt |
Kleinmachnovas |
Vokietija |
| Pflanzenschutzamt Hannover |
Hanoveris |
Vokietija |
| State Laboratory |
Dublinas |
Airija |
| Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali |
Bolonija |
Italija |
| Regione Veneto Unità Periférica per i Servizi Fitosanitari |
Verona |
Italija |
| Nederlandse Algemene Keuringsdienst |
Emmeloordas |
Nyderlandų Karalystė |
| Plantenziektenkundige Dienst |
Vageningenas |
Nyderlandų Karalystė |
| Direcção-Geral de Protecção das Culturas |
Lisabona |
Portugalija |
| Centro Diagnostico de Aldearrubia |
Salamanka |
Ispanija |
| Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias |
Valensija |
Ispanija |
| Swedish University of Agricultural Sciences |
Upsala |
Švedija |
(1) Mokslininkai ryšiams palaikyti: žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main.
______________
2 priedėlis
R. solanacearum išskyrimo ir auginimo terpė
a) Pagrindinė auginimo terpė
Mitybinis agaras (MA)
Mitybinis agaras (Difco) 23,0 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ingredientus ištirpinti ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.
Mielių peptono gliukozės agaras (MPGA)
Mielių ekstraktas (Difco) 5,0 g
„Bacto“ peptonas (Difco) 5,0 g
D(+) gliukozė (monohidratas) 10,0 g
„Bacto“agaras (Difco) 15,0 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ingredientus ištirpinti ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.
Sacharozės peptono agaras (SPA)
Sacharozė 20,0 g
„Bacto“ peptonas (Difco) 5,0 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,25 g
„Bacto“agaras (Difco) 15,0 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
pH 7,2–7,4
Ingredientus ištirpinti ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.
Kelmano tetrazolio terpė
Kazamino rūgštys (Difco) 1,0 g
„Bacto“ peptonas (Difco) 10,0 g
Dekstrozė 5,0 g
„Bacto“ agaras (Difco) 15,0 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ingredientus ištirpinti ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.
Atvėsinti iki 50 °C ir pripilti steriliai perfiltruoto 2,3,5-trifeniltetrazoliumo chlorido (Sigma) tirpalo, kad galutinė koncentracija siektų 50 mg/l.
b) Patvirtinta selektyvi auginimo terpė
SMSA terpė (Englebrecht, 1994, modifikuota Elphinstone et al., 1996)
Pagrindinė terpė
Kazamino rūgštys (Difco) 1,0 g
„Bacto“peptonas (Difco) 10,0 g
Glicerolis 5,0 ml
„Bacto“agaras (Difco); žr. 2 pastabą 15,0 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ingredientus ištirpinti ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.
Atvėsinti iki 50 °C ir įpilti šių ingredientų tirpalų, prieš tai juos steriliai perfiltravus, kad būtų gautos nurodytos galutinės koncentracijos:
Kristalvioleto (Sigma) 5 mg/l
Polimiksino B sulfato (Sigma P-1004) 600 000 U/l (apytiksliai 100 mg)
Bacitracino (Sigma B-0125) 1 250 U/l (apytiksliai 25 mg)
Chloramfenikolo (Sigma C- 317 5) 5 mg/l
Penicilino G (Sigma P-3032) 825 U/l (apytiksliai 0,5 mg)
2,3,5-trifeniltetrazoliumo chlorido (Sigma) 50 mg/l
Pastaba.
1. Jei naudojami reagentai, kurie skiriasi nuo pirmiau išvardytųjų, jie gali turėti įtakos R. solanacearum augimui.
2. Oxoid-agarą #1 galima naudoti vietoj „Bacto“ agaro (Difco). Šiuo atveju R. solanacearum augs lėčiau, nors konkuruojančių saprofitų augimą taip pat galima sumažinti. Tipiškų R. solanacearum kolonijų susidarymas užtruks 1–2 dienas ir raudona kolonijų spalva gali būti šviesesnė nei Bacto- agaro terpėje augančių kolonijų.
3. Padidinus bacitracino koncentraciją iki 2 500 V/l, konkuruojančių bakterijų populiacijų skaičius gali sumažėti, nepadarant įtakos R. solanacearum augimui.
Terpę ir antibiotikų koncentruotus tirpalus saugoti 4 °C temperatūroje tamsoje ir sunaudoti per vieną mėnesį. Prieš naudojimą lėkštelių paviršiuje neturi būti vandens lašelių. Vengti perteklinio plokštelių perdžiovinimo.
Kokybės kontrolę reikėtų atlikti paruošus kiekvienos naujos partijos terpę ir, pasėjus į ją R. solanacearum etaloninio štamo ląstelių suspensijos (žr. 3 priedėlį), pasibaigus 2-5 dienų trukmės inkubacijai 28 °C temperatūroje, stebėti tipiškų kolonijų susidarymą.
c) Patvirtinta praturtinančioji terpė
SMSA buljonas (Elphinstone et al., 1996)
Ruošti taip pat, kaip ir SMSA selektyvią agaro terpę, tik neįdedant „Bacto“ agaro ir 2,3,5-tetrazoliumo chlorido.
Modifikuotas Wilbrink buljonas (Caruso et al., 2002)
Sacharozė 10 g
Proteazės peptonas 5 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4 0,25 g
NaNO3 0,25 g
Distiliuotas vanduo 1 l
15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje ir atvėsinti iki 50 °C.
Antibiotikų koncentruotų tirpalų įpilama tiek, kiek pilama ruošiant SMSA buljono terpę.
______________
3 priedėlis
A. Parduodama standartizuota kontrolinė medžiaga
a) Bakterijų izoliatai
Toliau pateikiamus bakterijos izoliatus rekomenduojama naudoti kaip standartinę etaloninę medžiagą, taikomą kaip teigiamą kontrolinę medžiagą (1 lentelė) arba, siekiant išvengti kryžminių reakcijų, optimizuojant testus (2 lentelė). Visus štamus galima įsigyti:
1. Iš Nacionalinės augalų patogeninių bakterijų kolekcijos (NCPPB), esančios centrinėje mokslinėje laboratorijoje Jorke (Jungtinė Karalystė).
3. I Nacionalinės fitopatogeninių bakterijų kolekcijos, esančios Prancūzijos nacionaliniame žemės ūkio moksliniame institute (INRA) Anžere (Prancūzija).
1 lentelė. Etaloninių standartinių (SMT) R. solanacearum izoliatų rinkinys
| NCPPB kodas |
SMT # |
Kiti kodai |
Kilmės šalis |
Biovarietetas |
| NCPPB 4153 |
6 |
CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 |
Egiptas |
2 |
| NCPPB 4154 |
10 |
CFBP4585, 550, EURS21 |
Turkija |
2 |
| NCPPB 3857 |
12 |
CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 |
Anglija |
2 |
| NCPPB 1584 |
23 |
CFBP 4598, EURS49 |
Kipras |
2 |
| NCPPB 2505 |
24 |
CFBP 4599, EURS50 |
Švedija |
2 |
| NCPPB 4155 |
26 |
CFBP 4601, 502, EURS55 |
Belgija |
2 |
| NCPPB 4156 (*) |
71(*) |
PD 2762, CFBP 3857 |
Nyderlandai |
2 |
| NCPPB 4157 |
66 |
LNPV 15.59 |
Prancūzija |
2 |
| NCPPB 4158 |
39 |
CFBP 4608, Port 448, EURS80 |
Portugalija |
2 |
| NCPPB 4160 |
69 |
IVIA-1632-2 |
Ispanija |
2 |
| NCPPB 4161 |
76 |
B3B |
Vokietija |
2 |
| NCPPB 325 |
41 |
CFBP 2047, KEL60-1, R842 |
JAV |
1 |
| NCPPB 3967 |
42 |
CFBP 4610, R285, GONg7 |
Kosta Rika |
1 |
| NCPPB 4028 |
43 |
CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 |
Kolumbija |
2 |
| NCPPB 3985 |
44 |
CFBP 4612, R578, CIP312 |
Peru |
2T |
| NCPPB 3989 |
45 |
CFBP 4613, R568, CIP226 |
Brazilija |
2T |
| NCPPB 3996 |
46 |
CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 |
Peru |
3 |
| NCPPB 3997 |
47 |
CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a |
Australija |
3 |
| NCPPB 4029 |
48 |
CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 |
Šri Lanka |
4 |
| NCPPB 4005 |
49 |
CFBP 4616, R470 |
Filipinai |
4 |
| NCPPB 4011 |
50 |
CFBP 4617, R288, HEmps2 |
Kinija |
5 |
(*) Kaip standartinį etaloninį štamą naudoti R. solanacearum 2 biovarietetą (3 rasės).
Pastaba. Pirmiau pateiktų štamų autentiškumas garantuojamas, jei šie įsigyjami tik iš autentiškos kultūrų kolekcijos.
2 lentelė. Serologiškai ar genetiškai giminingų bakterijų, naudojamų testų optimizavimui, standartinis etaloninis rinkinys
| NCPPB kodas |
SMT # |
Kitas kodas |
Identifikavimas |
| NCPPB 4162 |
51 |
CFBP 1954 |
Bacillus polymyxa (1) |
| NCPPB 4163 |
52 |
CFBP 1538 |
Pseudomonas marginalis pv. marginalis (1) |
| NCPPB 4164 |
– |
CFBP 2227 |
Burkholderia cepacia (2) |
| NCPPB 4165 |
– |
CFBP 2459 |
Ralstonia pickettii (3) |
| NCPPB 4166 |
58 |
CFBP 3567 CSLPr1150 |
Ralstonia pickettii f) |
| NCPPB 4167 |
60 |
CFBP 4618 PD 2778 |
Ralstonia sp. f) |
| NCPPB 1127 |
53 |
CFBP 3575 |
Burkholderia andropogonis (1) |
| NCPPB 35354CFBP3 |
54 |
CFBP 3572 |
Burkholderia caryophylli (1) |
| NCPPB 945 |
55 |
CFBP 3569 |
Burkholderia cepacia (1) |
| NCPPB 3708 |
56 |
CFBP 3574 |
Burkholderia glumae (1) |
| NCPPB 3590 |
57 |
CFBP 3573 |
Burkholderia plantarii (1) |
| NCPPB 3726 |
59 |
CFBP 3568 |
Banana Blood Disease Bacterium (1) (2) (3) |
| NCPPB 4168 |
61 |
CFBP 4619 IPOS339 |
Enterobacter sp. (1) |
| NCPPB 4169 |
62 |
IPO 1695 |
Enterobacter sp. (1) |
| NCPPB 4170 |
63 |
CFBP 4621 IPO S306 |
Ochrobactrum anthropi (1) (2) |
| NCPPB 4171 |
64 |
CFBP 4622 IPO 1693 |
Curtobacterium sp. f) (2) |
| NCPPB 4172 |
65 |
IPO 1696a |
Pseudomonas sp. (1) |
| NCPPB 4173 |
– |
PD 2318 |
Aureobacterium sp. (2) |
| NCPPB 4174 |
81 |
IVIA 1844.06 |
Flavobacterium sp. f) (2) |
(1) Atliekant serologinius testus (imunofluorescencinę arba imunofermentinę analizę) ir štamas gali kryžmiškai reaguoti su polikloniniais antikūnais.
(2) Štamas, kurį galima panaudoti padauginant kai kuriose laboratorijose PGR produktą, kurio dydis panašus į prognozuojamo produkto dydį, naudojant pradmenis OLI-1 ir Y-2 (žr. 6 priedėlį).
(3) Atrodo, kad štamas gali kryžmiškai reaguoti atliekant daugelį testų, tačiau žinoma, kad kryžminė reakcija įvyksta tiriant bananus Indonezijoje.
b) Parduodama standartizuota kontrolinė medžiaga
Iš Nacionalinės augalų patogeninių bakterijų kultūrų kolekcijos (NCPPB) galima įsigyti šią standartizuotą kontrolinę medžiagą.
Atliekant visus testus kaip neigiamą kontrolę naudoti šalčiu išdžiovinto bulvių ekstrakto, gauto iš 200 sveikų bulvių stiebagumbių, nuosėdas.
Atliekant serologinius testus ir PGR kaip teigiamą kontrolę naudoti šalčiu išdžiovinto bulvių ekstrakto, gauto iš 200 sveikų bulvių stiebagumbių, turinčio 103–104 ir 104–106 R. solanacearum 2 biovarieteto (štamo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) ląstelių, nuosėdas. Kadangi džiovinimas šalčiu daro įtaką ląstelių gyvybingumui, šie ekstraktai nėra tinkama standartinė kontrolinė medžiagą atliekant išskyrimą biotestu.
Atliekant serologinius testus kaip teigiama kontrolė naudojamos R. solanacearum 2 biovarieteto (štamas 156 = PD 2762 = CFBP 3857) 106 ląstelių/ml koncentracijos suspensijos, fiksuotos formalinu.
B. Pagrindinių atrankos testų PGR/IF ir FISH teigiamų ir neigiamų kontrolinių bandinių paruošimas
R. solanacearum 3 rasės/2 biovarieteto virulentiškas štamas (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) 48 valandas auginamas SMSA terpėje ir suspenduojamas 10 mM fosfatiniame buferiniame tirpale, kad ląstelių tankis siektų apie 2 x 108 ksv/ml. Paprastai gaunama šiek tiek drumsta suspensija, kurios optinis tankis, matuojant 600 nm bangų ilgio spektre, siekia 0,15.
Kūgio formos gabaliukai išpjaunami iš 200 stiebagumbių, kurie, kaip žinoma, neužkrėsti R. solanacearum.
Kūgio formos gabaliukai susmulkinami kaip įprasta ir gautos nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 10 ml.
Į kiekvieną iš dešimties 1,5 ml tūrio miniatiūrinių mėgintuvėlių įpilama po 900 ml pakartotinai suspenduotų nuosėdų.
100 ml R. solanacearum suspensijos įpilama į pirmąjį miniatiūrinį mėgintuvėlį. Suplakama.
Naudoti dešimtainius užkrato praskiedimus, santykiu 1:10, atliekant praskiedimus penkiuose paskesniuose miniatiūriniuose mėgintuvėliuose.
Šeši miniatiūriniai mėgintuvėliai su užkratu bus naudojami kaip teigiami kontroliniai bandiniai. Keturi miniatiūriniai mėgintuvėliai be užkrato bus neigiami kontroliniai bandiniai. Šie mėgintuvėliai atitinkamai paženklinami.
Į sterilius 1,5 ml tūrio miniatiūrinius mėgintuvėlius įpilama po 100 ml alikvotinių dalių ir gaunama po 9 kiekvieno kontrolinio bandinio pakartojimus, iki panaudojimo saugomus -16-24 °C temperatūroje.
Atliekant IF testą, R. solanacearum buvimas ir kiekis pirmiausia nustatomi kontroliniuose bandiniuose.
Atliekant kiekvienos serijos tiriamųjų bandinių PGR testą, DNR išskiriama tiek iš teigiamų, tiek iš neigiamų kontrolinių bandinių.
Atliekant kiekvienos serijos tiriamųjų bandinių IF ir FISH testą, tiriami ir teigiami, ir neigiami kontroliniai bandiniai.
Atliekant IF, FISH ir PGR testus, R. solanacearum būtina aptikti mažiausiai 106 ląstelių ir esant 104 ląstelių/ml tankiui tik teigiamuose kontroliniuose bandiniuose, o ne neigiamuose kontroliniuose bandiniuose.
______________
4 priedėlis
Buferiniai tirpalai tyrimui
Bendra pastaba. Neatidarius talpyklų, buferinius tirpalus galima saugoti iki vienerių metų.
1. Buferiniai tirpalai išskyrimui
1.1. Išskyrimo buferinis tirpalas (50 mM fosfatinis buferinis tirpalas, pH 7,0)
Šis buferinis tirpalas naudojamas bakterijai išskirti iš augalinės kilmės audinių homogenizacijos arba kratymo būdu.
Na2HPO4 (bevandenis) 4,26 g
KH2PO4 2,72 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ištirpinti ingredientus, patikrinti pH ir 15 minučių sterilizuoti autoklave
121 °C temperatūroje. Galima panaudoti šiuos papildomus junginius:
|
|
Naudojimo tikslas |
Kiekis 1 litre |
| Lubrolio dribsnius |
Deflokuliantas (*) |
0,5 g |
| DC (tiesioginio stingimo) silicio priešputis |
Priešputis (*) |
1,0 ml |
| Tetranatrio pirofosfatas |
Antioksidantas |
1,0 g |
| Polivinilpirolidonas-40000 (PVP-40) |
PGR inhibitorių surišėjas |
50 g |
____________________
(*) Naudoti išskiriant homogenizacijos metodu.
1.2. Buferinis tirpalas nuosėdoms suspenduoti (10 mM fosfatinis buferinis tirpalas, pH 7,2)
Šis buferinis tirpalas naudojamas bulvių stiebagumbių viršūnių kūgio formos gabaliukų ekstraktų pakartotiniam suspendavimui ir praskiedimui baigus nuosėdų koncentravimą centrifuguojant.
Na2HPO4.12H2O 2,7 g
NaH2PO4.2H2O 0,4 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ištirpinti ingredientus, patikrinti pH ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.
2. Buferiniai tirpalai IF testui
2.1. IF-buferinis tirpalas (10 mM fosfatinis buferinis druskos tirpalas (PBS), pH 7,2) Šis buferinis tirpalas naudojamas antikūnų praskiedimams
Na2HPO4.12H2O 2,7 g
NaH2PO4.2H2O 0,4 g
NaCl 8,0 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ištirpinti ingredientus, patikrinti pH ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.
2.2. IF-buferinis tirpalas, turintis Tween
Šis buferinis tirpalas naudojamas plokštelėms plauti. Įpilti 0,1 % Tween-20 į IF buferinį tirpalą.
2.3. Fosfatinis buferinis glicerino tirpalas, pH 7,6
Šis buferinis tirpalas naudojamas kaip dengiamųjų stiklelių sukibimo su IF plokštelėmis skystis fluorescencijai sustiprinti.
Na2HPO4.12H2O 3,2 g
NaH2PO4.2H2O 0,15 g
Glicerinas 50 ml
Distiliuotas 100 ml vanduo
Priešblukinančiu aktyvumu pasižyminčius sukibimą skatinančius tirpalus galima įsigyti prekyboje, pvz., komercinį tirpalą Vectashield® (Vector Laboratories) arba Citifluor® (Leica).
3. Buferiniai tirpalai netiesioginei imunofermentinei analizei
3.1. Dvigubos joninės jėgos plokštelės padengimo buferinis tirpalas, pH 9,6.
Na2CO3 6,36 g
NaHCO3 11,72 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ištirpinti ingredientus, nustatyti pH ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.
Kaip antioksidanto galima įpilti natrio sulfito (0,2 %), jei reikalaujama apsisaugoti nuo oksiduotų aromatinių junginių susidarymo.
3.2. 10X fosfatinis buferinis tirpalas (PBS), pH 7,4
NaCL 80,0 g
KH2PO4 2,0 g
Na2HPO4.12H2O 29,0 g
KCl 2,0 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
3.4. Antikūnų blokavimo buferinis tirpalas (privaloma paruošti šviežią)
10XPBS 10,0 ml
Polivinilpirolidonas-44000 2,0 g
(PVP-44)
10% Tween 20 0,5 ml
Pieno milteliai 0,5 g
Distiliuotas vanduo įpilti iki 100 ml
4. Buferiniai tirpalai dviejų antikūnų sluoksnių netiesioginei imunofermentinei analizei (DASI ELISA)
4.1. Plokštelės padengimo buferinis tirpalas, pH 9,6.
Na2CO3 1,59 g
NaHCO3 2,93 g
Distiliuotas vanduo 1 000 ml
Ištirpinti ingredientus ir nustatyti pH 9,6.
4.2. 10X fosfatinis buferinis tirpalas(PBS) pH 7,2-7,4
NaCl 80,0 g
NaH2PO4.2 H2O 4,0 g
Na2HPO4.12H2O 27,0 g
Distiliuotas vanduo 1 000 ml
5 priedėlis
Užkrėtimo laipsnio nustatymas IF ir FISH testais
2. Suskaičiuoti tipiškų fluorescuojančių ląstelių viename mikroskopu stebimos plokštelės langelyje skaičių
(C) C = c x S/s,
čia S = daug langelių turinčios plokštelės paviršiaus plotas
ir s = objektyvo laukelio paviršiaus plotas.
s = πi2/4G2K2, čia i = lauko koeficientas (kinta nuo 8 iki 24 priklausomai nuo okuliaro tipo),
K = tubuso koeficientas (1 arba 1,25),
G = objektyvo padidinimas (100 kartų, 40 kartų ir pan.).
6 priedėlis
Patvirtinta PGR darbo tvarka ir reagentai
Pastaba. Atliekant išankstinį testą turėtų būti pakartojamai aptinkama mažiausiai 103–104 R. solanacearum ląstelių viename bandinio ekstrakto mililitre.
Atliekant išankstinį tyrimą auginant pasirinktą bakterijų štamų rinkinį taip pat neturėtų būti gaunama netikrųjų teigiamų rezultatų (3 priedėlis).
1. PGR darbo tvarka pagal Seal et al. (1993)
1.1. Oligonukleotidiniai pradmenys
Priekinis pradmuo OLI-1 5‘-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3‘
Atvirkštinis pradmuo Y-2 5‘-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3‘
Numatomos padauginti R. solanacearum matricinės DNR dydis = 288 bp
1.2. PGR reakcinis mišinys
| Reagentas |
Reakcinis kiekis |
Galutinė koncentracija |
| Sterilus YGV |
17,65 ml |
|
| 10X PGR buferinis tirpalas p) (15 mM MgCl2) |
2,5 ui |
1X (1,5 mM MgCl2) |
| dNTP mišinys (20mM) |
0,25 ml |
0,2 mM |
| Pradmuo OLI-1 (20 mM) |
1,25 ml |
1 mM |
| Pradmuo Y-2 (20 mM) |
1,25 ml |
1 mM |
| Taq polymerazė (5 U/ml) (1) |
0,1 ml |
0,5 U |
| Bandinio tūris |
2,0 ml |
|
| Bendras tūris |
25 ml |
|
(1) Metodas buvo patvirtintas naudojant Taq polimerazę, gautą iš Perkin Elmer (AmpliTaq) ir Gibco BRL.
1.3. PGR reakcijos sąlygos
Atlikti pagal šią programą:
1 ciklas: i) 2 minutės 96 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija).
35 ciklai: ii) 20 sekundžių 94 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija).
iv) 30 sekundžių 72 °C temperatūroje (matricinės DNR kopijos liginimas).
1 ciklas: v) 10 minučių 72 °C temperatūroje (galutinis liginimas),
2. PGR metodika pagal Pastrik ir Maiss (2000)
2.1. Oligonukleotidiniai pradmenys
Priešakinis pradmuo Ps-1 5'-agt cga acg gca gcg ggg g-3'
Atvirkštinis pradmuo Ps-2 5'-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3'
R. solanacearum matricinės DNR numatomos padauginti kopijos dydis =553 bp.
2.2. PGR reakcinis mišinys
| Reagentas |
Reakcinis kiekis |
Galutinė koncentracija |
| Sterilus YGV |
16,025 ml |
|
| 10X PGR buferinis tirpalas (1) |
2,5 ui |
1X (1,5 mM MgCl2) |
| GSA (V frakcija) (10%) |
0,25 ml |
0,1 % |
| d-nTP mišinys (20 mM) |
0,125 ml |
0,1 mM |
| Pradmuo Ps-1 (10 mM) |
0,5 ml |
0,2 mM |
| Pradmuo Ps-2 (10 mM) |
0,5 ml |
0,2 mM |
| Taq polimerazė (5 V/ml) (1) |
0,1 ml |
0,5 U |
| Bandinio tūris |
5,0 ml |
|
| Bendras tūris |
25,0 ml |
|
(1) Metodai patvirtinti naudojant Taq polimerazę, gautą iš Perkin Elmer (AmpliTaq) ir Gibco BRL.
Pastaba. Iš pradžių optimizuota naudojant MJ Research PTC 200 šiluminį reaktorių ir Gibco Taq polimerazę. Galima naudoti tos pačios koncentracijos Perkin Elmer AmpliTaq ir buferinį tirpalą.
2.3. PGR reakcijos sąlygos Atlikti šią programą:
1 ciklas: i) 5 minutės 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija).
35 ciklai: ii) 30 sekundžių 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija).
iv) 45 sekundės 72 °C temperatūroje (kopijos liginimas).
1 ciklas: v) 5 minutės 72 °C temperatūroje (galutinis liginimas).
2.4. Padaugintos matricinės DNR restrikcinė analizė.
Padauginus R. solanacearum DNR gauti PGR produktai buvo veikiami restriktaze Taq I, 30 minučių inkubuojant 65 °C temperatūroje, ir buvo stebimas skirtingo ilgio restrikcinio fragmento polimorfizmas. R. solanacearum padaugintos matricinės DNR fragmentą suskaldžius restriktazėmis, buvo gauti 457 bp ir 96 bp fragmentai.
3. Daugkartinės PGR naudojant vidinę PGR kontrolę metodika (Pastrik, 2002)
3.1. Oligonukleotidiniai pradmenys
Priešakinis pradmuo RS-1 F 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
Priešakinis pradmuo RS-1 F 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Priešakinis pradmuo NS-5-F 5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'
Atvirkštinis pradmuo NS-6-R 5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'
R. solanacearum matricinės DNR numatomos padauginti kopijos dydis = 718 bp (RS-pradmenų rinkinys)
E Vidinio kontrolinio bandinio – 18S rRNA – numatomas padaugintos matricinės DNR kopijos dydis = 310 bp (NS-pradmenų rinkinys).
3.2. PGR reakcinis mišinys
| Reagentas |
Reakcinis kiekis |
Galutinė koncentracija |
| Sterilus YGV |
12,625 ml |
|
| 10X PGR buferinis tirpalas (1) (15 mM MgCl2) |
2,5 ui |
1X(1,5 mM MgCl2) |
| GSA (V frakcija) (10%) |
0,25 ml |
0,1 % |
| d-nTP mišinys (20mM) |
0,125 ml |
0,1 mM |
| Pradmuo RS-1-F (10MM) |
2,0 ml |
0,8 mM |
| Pradmuo RS-1-R (10 mM) |
2,0 ml |
0,8 mM |
| Pradmuo NS-5-F (10 mM) (2) |
0,15 ml |
0,06 mM |
| Pradmuo NS-6-R (10 mM) (2) |
0,15 ml |
0,06 mM |
| Taq polimerazė (5V/ml) (1) |
0,2 ml |
1,0 U |
| Mėginio tūris |
5,0 ml |
|
| Bendras tūris |
25,0 ml |
|
(1) Metodai patvirtinti naudojant Taq polimerazę, gautą iš Perkin Elmer (AmpliTaq) ir Gibco BRL.
(2) Pradmenų NS-5-F ir NS-6-R koncentracijos buvo optimizuotos bulvių stiebagumbių viršūnių gabaliukų ekstraktą gavus homogenizavimo ir DNR išgryninus Pastriko metodu Pastrik (2000)) (žr. VI akieanio A dalies 6.1 punkto a papunktį). Reagentų koncentracijas reikia pakartotinai optimizuoti, jei DNR išskiriama kratymo ar kitu metodu.
3.3. PGR reakcijos sąlygos Atlikti šią programą:
1 ciklas: i) 5 minutės 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija).
35 ciklai: ii) 30 sekundžių 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija).
iv) 45 sekundės 72 °C temperatūroje (kopijos liginimas).
1 ciklas: v) 5 minutės 72 °C temperatūroje (galutinis liginimas).
4. R. solanacearum biovarietetų atveju atliekamos PGR metodika (Pastrik et al, 2001)
4.1. Oligonukleotidiniai pradmenys
Priešakinis pradmuo Rs-1-F 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
Atvirkštinis pradmuo Rs-1-R 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Atvirkštinis pradmuo Rs-3-R 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'
Numatomas padauginti R. solanacearum matricinės DNR dydis:
naudojant Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp
naudojant Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp
4.2. PGR reakcinis mišinys
a) 1/2 biovarieteto atveju atliekama PGR
| Reagentas |
Reakcinis kiekis |
Galutinė koncentracija |
| Sterilus YPV |
12,925 ml |
|
| 10X PGR buferinis tirpalas(1) |
2,5 ui |
1X (1,5 mM MgCl2) |
| GSA (V frakcija) (10%) |
0,25 ml |
0,1 % |
| d-NTP mišinys (20 mM) |
0,125 ml |
0,1 mM |
| Pradmuo Rs-1-F (10 mM) |
2 ml |
0,8 mM |
| Pradmuo Rs-1-R (10 mM) |
2 ml |
0,8 mM |
| Taq polimerazė (5V/ml) (1) |
0,2 ml |
1U |
| Mėginio tūris |
5,0 ml |
|
| Bendras tūris |
25,0 ml |
|
(1) Metodai buvo patvirtinti naudojant Taq polimerazę, gautą iš Perkin Elmer (AmpliTaq) ir Gibco BRL.
b) 3/4/5 biovarieteto atveju atliekama PGR
| Reagentas |
Reakcinis kiekis |
Galutinė koncentracija |
|
| Sterilus YPV |
14,925 ml |
|
|
| 10X PGR buferinis tirpalas (1) |
2,5 ul |
1X (1,5 mM MgCl2) |
|
| GSA (V frakcija) (10%) |
0,25 ml |
0,1 % |
|
| dNTP mišinys (20mM) |
0,125 ml |
0,1 mM |
|
| Pradmuo Rs-1-F (10 mM) |
1 ml |
0,4 mM |
|
| Pradmuo Rs-3-R (10 mM) |
1 ml |
0,4 mM |
|
| Taq polimerazė (5V/ml) (1) |
0,2 ml |
1U |
|
| Mėginio tūris |
5,0 ml |
|
|
| Bendras tūris |
25,0 ml |
|
|
(1) Metodai patvirtinti naudojant Taq polimerazę, gautą iš Perkin Elmer (AmpliTaq) ir Gibco BRL.
4.3. PGR reakcijos sąlygos
Atlikti šią programą 1/2 ir 3/4/5 biovarietetų atveju:
1 ciklas: i) 5 minutės 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija).
35 ciklas: ii) 30 sekundžių 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija)
iv) 45 sekundės 72 °C temperatūroje (kopijos liginimas)
1 ciklas: v) 5 minutės 72 °C temperatūroje (galutinis liginimas)
4.4. Padaugintos DNR kopijos restrikcinė analizė
R. solanacearum padaugintos DNR gauti PGR produktai, gauti naudojant pradmenis Rs-1-F ir Rs-1-R, buvo veikiami restriktaze Bsm I arba jos izomeru (pvz., Mva 1269 I) 30 minučių inkubuojant 65 °C temperatūroje ir buvo stebimas skirtingo ilgio restrikcinio fragmento polimorfizmas.
5. Užpildo buferinio tirpalo paruošimas
5.1. Bromfenolio mėlynasis (10 %-koncentruotas tirpalas)
Bromfenolio mėlynasis 5 g
Distiliuotas vanduo (perdistiliuotas) 50 ml
6. 10X Tris acetatinis buferinis tirpalas EDTA (TAE) buferinis tirpalas, pH 8,0
Tris buferinis tirpalas 48,40 g
Ledinė acto rūgštis 11,42 ml
EDTA (di-natrio druska) 3,72 g
Distiliuotas vanduo 1,00 l
Vienąkart praskiesti prieš naudojimą.
Taip pat galima įsigyti (Invitrogen ar panašioje bendrovėje).
______________
7 priedėlis
Patvirtinti reagentai FISH testui
1. Oligonukleotidiniai bandiniai
R. solanacearum – specifinis bandinys OLI-1-CY3: 5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3'
Nespecifinis Eubacteriaceae bandinys EUB-338-FITC: 5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3'
2. Fiksavimo tirpalas
(DĖMESIO! FIKSAVIMO TIRPALE YRA NUODINGO PARAFORMALDEHIDO. DIRBDAMI MŪVĖKITE PIRŠTINES IR NEĮKVĖPKITE. REKOMENDUOJAMA DIRBTI TRAUKOS SPINTOJE)
i) 9 ml molekulinės biologijos darbams skirto vandens (pvz., ypač gryno vandens (YGV)) pakaitinti 60 °C temperatūroje ir pridėti 0,4 g paraformaldehido. Paraformaldehidas ištirpsta įdėjus 5 lašus 1N NaOH ir maišant magnetine maišykle.
ii) Įdėjus 1 ml 0,1 M fosfatinio buferinio tirpalo (FB; pH 7,0) ir 5 lašus 1N HCl, nustatomas pH 7,0. Patikrinti pH indikatorinėmis juostelėmis ir nustatyti pH, pridedant HCl arba NaOH. (DĖMESIO! NENAUDOTI PH MATAVIMO PRIETAISO, JEI NAUDOJAMI PARAFORMALDEHIDO TURINČIUOSE TIRPALUOSE)
3. 3X Hybmix tirpalas
NaCl 2,7 M
Tris-HCl 60 mM(ph 7,4)
EDTA (filtruotas steriliu filtru ir sterilizuotas autoklave) 15 mM
Kaip reikalaujama, praskiesti 1 kartą.
4. Hibridizavimo darbinis mišinys
1 kartą koncentruotas Hybmix
Natrio dodecilsulfatas (SDS) 0,01 %
Formamidas 30 %
Bandinys EUB 338 5 ng/ml
Bandiniai OLI-1 arba OLI-2 5 ng/ml
Pagal 1 lentelėje pateikiamus apskaičiavimus paruošti hibridizavimo mišinio kiekius. Kiekvienos plokštelės (į kurios duobutes įpilama po 2 skirtingus bandinius su pakartojimais) reikia 90 ml hibridizavimo mišinio. (DĖMESIO! FORMAMIDAS LABAI NUODINGAS, TODĖL MŪVĖKITE PIRŠTINES IR IMKITĖS ATITINKAMŲ SAUGUMO PRIEMONIŲ!)
1 lentelė. Siūlomi kiekiai hibridizavimo mišiniui paruošti
| Plokštelių skaičius |
1 |
4 |
6 |
8 |
10 |
| Sterilus YGV |
23,1 |
92,4 |
138,6 |
184,8 |
231,0 |
| 3x hybmix tirpalas |
300,0 |
120,0 |
180,0 |
240,0 |
300,0 |
| 1 %SDS |
0,9 |
3,6 |
5,4 |
7,2 |
9,0 |
| Formamidas |
27,0 |
108,0 |
162,0 |
216,0 |
270,0 |
| Mėginys EUB 338 (100 ng/ml) |
4,5 |
18,0 |
27,0 |
36,0 |
45,0 |
| Mėginys OLI-1 arba OLI-2 (100 ng/ml) |
4,5 |
18,0 |
27,0 |
36,0 |
45,0 |
| Bendras tūris (ml) |
90,0 |
360,0 |
540,0 |
720,0 |
900,0 |
Pastaba. Visus tirpalus, turinčius šviesai jautrių oligonukleotidinių bandinių, saugoti tamsoje -20 °C temperatūroje. Naudojimo metu saugoti nuo tiesioginės saulės šviesos ar elektros šviesos.
8 priedėlis
Baklažano ir pomidoro kultūra
Pomidoro (Lycopersicon esculentum) arba baklažano (Solanum melongena) sėklos pasodinamos pasterizuotame sėklų komposte. Daigai su visiškai išsiskleidusiomis sėklaskiltėmis (10–14 dienų) persodinami į vazonėlį su pasterizuotu kompostu.
Pomidorai arba baklažanai turi būti auginami šiltnamyje esant tokioms aplinkos sąlygoms:
dienos ilgumas: 14 valandų arba natūralus dienos ilgumas, jeigu diena ilgesnė;
temperatūra: dieną nuo 21 iki 24 °C,
naktį nuo 14 iki 18 °C.
Jautri užkrėtimui pomidorų veislė:„Moneymaker“
Jautri užkrėtimui baklažanų veislė:„Black Beauty“
Tiekėjas: žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main
______________
NUORODOS
1. Amann, R. I., L. Krumholz and D. A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762–770.
2. Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1–39.
3. Boudazin, G., A. C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373–380.
4. Caruso, P., Gorris, M. T., Cambra, M., Palomo, J. L., Collar, J and Lopez, M. M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634–3638.
5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113–121.
6. Elphinstone, J. G., Hennessy, J., Wilson, J. K. and Stead, D. E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663–678.
7. Englebrecht, M. C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A. C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.
8. Hayward, A. C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265–277.
9. Hayward, A. C., El-Nashaar, H. M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269–280.
10. Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379–384.
11. Janse, J. D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343–351.
12. Janse, J. D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335–345.
13. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693–695.
14. Klement Z.; Rudolph, K and D. C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.
15. Lelliott, R. A. and Stead, D. E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.
16. Lopez, M. M., Gorris, M. T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H. W. Dehne et al., (eds). Kiewer Academic Publishers. pp. 117–121.
17. Louws, F. J., Fulbright, D. W., Stephens, C. T. and De Bruijn, F. J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286–2295.
18. Louws, F. J., Fulbright, D. W., Stephens, C. T. and De Bruijn, F. J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatória. Phytopathology 85; 528–536.
19. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A. C. Hayward, V. Krishnapillai, W. F Hong, B. W. Holloway, J. N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19–33.
20. Pastrik, K. H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619–626.
21. Pastrik, K. H., Elphinstone, J. G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831–842.
22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J. G. and Forde, S. M. D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67–79.
23. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. – 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.
24. Seal, S. E., L. A. Jackson, J. P. W. Young, and M. J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587–1594.
25. Smith, J. J., Offord, L. C., Holderness, M. and Saddler, G. S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262–4268.
26. Stead, D. E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281–295.
27. Taghavi, M., Hayward, A. C., Sly, L. I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10–15.
28. Van Der Wolf, J. M., Bonants, P. J. M., Smith, J. J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J. R. C., Saddler, G. S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44–49.
29. Weiler, S. A., Elphinstone, J. G., Smith, N., Stead, D. E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5' nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853–2858.