LIETUVOS RESPUBLIKOS APLINKOS MINISTRO

Į S A K Y M A S

DĖL APLINKOS APSAUGOS NORMATYVINIO DOKUMENTO LAND 45-2001 PATVIRTINIMO

2002 m. sausio 3 d. Nr. 4

Vilnius

Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų įstatymo (Žin., 2000, Nr. 36-987) trečiojo skirsnio 6 straipsniu „Cheminių medžiagų ir preparatų tyrimas“, Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų aplinkai, savybių tyrimo tvarka (Žin., 2001, Nr. 3-60):

1. Tvirtinu Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos normatyvinį dokumentą LAND 45-2001 „Cheminių medžiagų ir preparatų ekotoksiškumo tyrimo metodai“ (pridedama).

2. Pavedu Aplinkos ministerijos Jungtiniam tyrimų centrui, atsižvelgiant į Tarybos direktyvą 67/458/EC dėl pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą bei ženklinimą reglamentuojančių įstatymų ir kitų teisės aktų derinimo su Komisijos direktyvų 98/73/EC ir 2001/59/EC pakeitimais, parengti ir pateikti tvirtinimui Lietuvos aplinkos normatyvinio dokumento LAND 45-2001 papildymų projektus, perkeliant:

Komisijos Direktyvos 98/73/EC nuostatas – iki 2003-04-01:

(C13) Biokoncentravimas: Testas žuvims srovės pratekėjimo sąlygomis;

Komisijos Direktyvos 2001/59/EC nuostatas – iki 2003-04-01:

(C14) Žuvų jauniklių augimo testas;

(C15) Trumpalaikio toksiškumo testas žuvims embriono ir trynio maišelio stadijose;

(C20) Daphnia magna reprodukcijos testas;

Komisijos Direktyvos 2001/59/EC nuostatas – iki 2003-11-01:

(C16) Bitės – Oralinis toksiškumo testas;

(C17) Bitės – Ūmus kontaktinio toksiškumo testas;

(C18) Adsorbcijos/desorbcijos statinis pusiausvyros metodas;

(C19) Adsorbcijos koeficiento nustatymas (KOC) dirvožemyje ir aktyviajame dumble aukštos skyrimo galios skystine chromatografija.

3. Aplinkos ministerijos informacijos kompiuterinėje sistemoje vadovautis reikšminiais žodžiais „valdymo sistema“, „cheminės medžiagos“.

Aplinkos Ministras Arūnas Kundrotas

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos aplinkos ministro

2002 m. sausio 3 d. įsakymu Nr. 4

CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ IR PREPARATŲ EKOTOKSIŠKUMO TYRIMO METODAI

LAND 45-2001

BENDRASIS ĮVADAS

Šiame normatyviniame dokumente pateikiami metodai skirti cheminių medžiagų arba preparatų ekotoksikologinių savybių tyrimams atlikti.

Šių tyrimų tikslas:

– toksiškumo vandens ekosistemoms nustatymas;

– biologiškai skaidomų medžiagų savybių nustatymas;

– biocheminio deguonies suvartojimo nustatymas;

– cheminio deguonies suvartojimo nustatymas;

– toksiškumo dirvožemio ekosistemoms nustatymas.

Žemiau aprašyti cheminių medžiagų ir preparatų tyrimų metodai parengti vadovaujantis Europos Tarybos direktyva 67/548/EEC dėl pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą reglamentuojančių įstatymų, įstatymų papildomų aktų ir administracinių nuostatų derinimo (Council Directive of 27 June 1967 on the approximation of the laws reguliations and administrative provisions relating to the classification packaging and labelling of dangerous substances (67/548/EEC)).

Šiame normatyviniame dokumente pateikti ekotoksiškumo tyrimo metodai neapima:

– ilgalaikio toksiškumo tyrimo su Daphnia magna;

– ilgalaikio toksiškumo tyrimo su žuvimis;

– bandymų su aukštesniaisiais augalais.

Šių savybių nustatymui parengti metodai bus išleisti dokumentų, skirtų technikos pažangai, pavidalu. Iki to laiko turi būti taikomi atitinkami, tarptautiniu mastu pripažinti ir patvirtinti metodai.

ŪMINIS TOKSINIS POVEIKIS ŽUVIMS

1. metodas

1.1. ĮVADAS

Šio metodo tikslas yra nustatyti bandomosios medžiagos ūminį letalinį toksiškumą gėlavandenėms žuvims. Norint sėkmingiau pasirinkti tinkamiausią bandymo metodą (stacionarų, pusiau stacionarų ar pratekėjimo sąlygomis), kad visą bandymo laiką būtų užtikrinta pakankamai pastovi bandomosios medžiagos koncentracija, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, cheminį patvarumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą.

Planuojant bandymą ir interpretuojant jo rezultatus, turi būti atsižvelgta į papildomą informaciją (pvz., struktūrinę formulę, grynumo laipsnį, reikšmingesnių priemaišų prigimtį ir procentinį kiekį, priedų buvimą ir jų kiekį, pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą, Pow).

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI

Ūminis toksiškumas yra pastebimas neigiamo poveikio reiškinys, sukeltas bandomajai medžiagai veikiant trumpą laiką (kelias paras).

Šiame bandyme ūminis toksiškumas išreikiamas medianine letaline koncentracija (LC₅₀) – tokia medžiagos koncentracija vandenyje, kai per nuolatinio veikimo laikotarpį, kuris turi būti nurodytas, žūsta 50% bandyme naudotos žuvų populiacijos.

Kiekviena bandomosios medžiagos koncentracija yra išreiškiama mase tūrio vienetui (mg/litre) arba mase masės vienetui (mg/kg).

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymo sąlygomis naudotų rūšių atsakas žymiai nepakito, gali būti atliekamas bandymas su etalonine medžiaga.

Šiam bandymui etaloninės medžiagos nėra apibrėžtos.

1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ

Ribinis bandymas atliekamas su 100 mg/litre bandomosios medžiagos koncentracija, siekiant parodyti, kad LC₅₀ yra didesnė už šią koncentraciją.

Atliekant pilnos apimties bandymą, žuvys 96 valandas veikiamos bandomąja medžiaga, įdėta į vandenį tam tikrame koncentracijų intervale. Mirtingumo duomenys turi būti užrašomi ne mažiau kaip kas 24 valandas ir, jei įmanoma, kiekvienai stebėjimo laiko atkarpai skaičiuojama koncentracija, kuriai esant žūsta 50% žuvų (LC₅₀).

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

Kokybės kriterijai turi būti taikomi ir ribinio bandymo metodui, ir viso bandymo metodui.

Mirtingumas kontroliniuose bandymuose bandymo pabaigoje neturi būti didesnis kaip 10% (arba viena žuvis, jei naudojama mažiau kaip dešimt žuvų).

Ištirpusio deguonies koncentracija visą laiką turi būti ne mažesnė kaip 60% oro soties vertės.

Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti palaikoma 80% pradinės koncentracijos vertės ribose.

Medžiagų, kurios lengvai tirpsta bandomojoje terpėje ir kurių tirpalai patvarūs, t.y. kuriuose ištirpinta medžiaga žymiai negaruoja, nesuyra, nesihidrolizuoja ar neadsorbuojama, pradine koncentracija galima laikyti vardinę medžiagos koncentraciją. Turi būti pateikti įrodymai, kad koncentracijos buvo išlaikytos per visą bandymą ir kad kokybės kriterijai buvo įvykdyti.

Medžiagų, kurios:

(i) mažai tirpsta bandymo terpėje, arba

(ii) gali sudaryti patvarias emulsijas ar suspensijas, arba

(iii) yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose,

pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija, nustatyta tirpale (arba, jei techniškai tai neįmanoma, išmatuota vandens tūryje) bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra, tačiau prieš bandymams skirtų žuvų įleidimą.

Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti daromi tolesni matavimai.

pH vertė neturi keistis daugiau kaip 1 pH vienetu.

1.6. bandymų METODO aprašymas

Galima naudoti trijų tipų procedūras:

Statinis bandymas (stacionariomis sąlygomis):

Toksiškumo bandymas, kai bandomasis tirpalas neteka (tirpalai visą bandymą nėra atnaujinami, lieka tie patys).

Pusiau statinis bandymas (pusiau stacionariomis sąlygomis):

Bandymas, kai bandomasis tirpalas neteka, tačiau per ilgesnį laiko tarpą (pvz., kas 24 valandas) daromas reguliarus dozuojamasis bandomojo tirpalo atnaujinimas.

Bandymas pratekėjimo sąlygomis:

Toksiškumo bandymas, kai vanduo bandymo talpose atnaujinamas visą laiką, bandomąją medžiagą tiekiant su vandeniu, naudojamu bandymo terpei atnaujinti.

1.6.1. Reagentai

1.6.1.1. Bandomųjų medžiagų tirpalai

Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2.

Pasirinktų koncentracijų bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Jei bandomos didelės koncentracijos, medžiaga gali būti ištirpinama praskiedimo vandenyje tiesiogiai.

Paprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Norint kai kurioms medžiagoms (pvz., vandenyje mažai tirpioms medžiagoms arba kurių didelis Pow, arba toms, kurios labiau sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) labiau užtikrinti galimybę pasiekti soties/pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui ir t.t.).

Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba siekiant pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, kaip papildomas priemones galima panaudoti dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius arba dispergatorius. Kai naudojamos pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis, taip pat kontrolinės žuvys turi būti veikiamos pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti parinkta mažiausia įmanoma ir turi būti ne didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės.

Bandymas turi būti atliekamas nereguliuojant pH vertės. Jei yra įrodymų apie žymų pH vertės kitimą, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HC1 ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti atliekamas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei, reguliuojant pH, vyksta kokia nors cheminė reakcija ar bandomoji medžiaga fiziškai krenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje.

1.6.1.2. Laikymo ir skiedimo vanduo

Galima naudoti geriamąjį vandentiekio vandenį (neužterštą potencialiai kenksmingos koncentracijos chloru, sunkiaisiais metalais ar kitomis medžiagomis), geros kokybės gamtinį vandenį arba skiedimo vandenį (žr. 1 priedą). Geriausiai tinka vanduo, kurio bendrasis kietumas yra nuo 10 iki 250 mg/litre (skaičiuojant CaCO₃) ir kurio pH yra nuo 6,0 iki 8,5.

1.6.2. Aparatūra

Visa aparatūra turi būti pagaminta iš chemiškai inertiškų medžiagų:

– automatinio skiedimo sistema (bandymui pratekėjimo sąlygomis),

– deguonies matuoklis,

– įranga vandens kietumui nustatyti,

– atitinkama termostatavimo aparatūra,

– pH-metras.

1.6.3. Bandymams skirtos žuvys

Žuvys turi būti sveikos ir neturėti jokių matomų apsigimimo požymių.

Žuvų rūšį reikia rinktis remiantis praktiniais kriterijais, pvz., lengvumu žuvis gauti ištisus metus ir jas prižiūrėti, patogumu bandyti, santykiniu jautrumu cheminėms medžiagoms, bei kiek nors susijusiais ekonominiais, biologiniais ar ekologiniais faktoriais. Be to, renkantis žuvų rūšis, reikia nepamiršti apie gautų duomenų palyginamumo būtinybę ir esamą tarptautinį derinimą (1 nuoroda).

Žuvų, kurios rekomenduojamos naudoti šiame bandyme, sąrašas pateiktas 2 priede. Tinkamiausios rūšys yra danija ir vaivorykštinis upėtakis.

1.6.3.1. Laikymas

Geriausia, jei bandymų žuvys būtų vienos populiacijos ir panašaus ilgio bei amžiaus. Žuvys turi būti laikomos bent 12 parų tokiomis sąlygomis:

įkrova:

atitinkanti sistemą (su recirkuliavimu ar su pratekėjimu) ir žuvų rūšį,

vanduo:

žr. 1.6.1.2,

šviesa:

kasdienis apšvietimas nuo 12 iki 16 valandų,

ištirpusio deguonies koncentracija:

ne mažiau kaip 80% oro soties vertės,

maitinimas:

tris kartus per savaitę ar kasdieną, nutraukiant maitinimą prieš 24 valandas iki bandymo pradžios.

1.6.3.2. Mirtingumas

Po 48 valandų stabilizavimo laikotarpio užrašomi mirtingumo duomenys ir taikomi tokie kriterijai:

– populiacijos mirtingumas per septynias paras didesnis kaip 10%:

visa partija atmetama,

– populiacijos mirtingumas 5–10%:

papildomai laikoma dar septynias paras. Jei mirtingumas nedidėja, partija priimama, priešingu atveju turi būti atmesta,

– populiacijos mirtingumas mažesnis kaip 5%:

partija priimama.

1.6.4. Adaptavimas

Prieš naudojimą visas žuvis bent septynias paras būtina laikyti vandenyje, kurio kokybė ir temperatūra atitinka bandymo sąlygas.

1.6.5. Bandymo eiga

Prieš galutinį bandymą gali būti atliekamas koncentracijų intervalo nustatymo bandymas.

Atliekamas vienas kontrolinis bandymas be bandomosios medžiagos ir, jei reikia arba jei tai svarbu, bandymų serija papildoma dar vienu kontroliniu bandymu, kuriame naudojama pagalbinė medžiaga.

Pagal tai, kokios yra bandomosios medžiagos fizikinės ir cheminės savybės, turi būti pasirinktas statinis bandymas, pusiau statinis ar pratekėjimo sąlygomis, kad būtų įvykdyti kokybės kriterijai.

Žuvys veikiamos medžiaga, kaip tai aprašyta žemiau:

– trukmė: 96 valandos,

– gyvūnų skaičius: ne mažiau kaip 7 vienai koncentracijai,

– talpos (indai): tinkamo tūrio, atsižvelgiant į rekomenduotą įkrovą,

– įkrova: didžiausia rekomenduota bandymo statinėmis ir pusiau statinėmis sąlygomis įkrova – 1 g/litre; sistemoms su pratekėjimu priimtina didesnė įkrova,

– bandomoji koncentracija: ne mažiau kaip penkios koncentracijos, kurios skiriasi pastoviu daugikliu, ne didesniu kaip 2,2, bei, kiek įmanoma, apima mirtingumo intervalą nuo 0 iki 100%,

– vanduo: žr. 1.6.1.2,

– šviesa: kasdienis apšvietimas, kurio trukmė nuo 12 iki 16 valandų,

– temperatūra: tinkama rūšiai (2 priedas), tačiau konkrečiame bandyme palaikoma ± 1°C tikslumu,

– ištirpusio deguonies koncentracija: ne mažesnė kaip 60% oro soties vertės pasirinktos temperatūros sąlygomis,

– maitinimas: jokio.

Žuvys tikrinamos iš pradžių po 2–4 valandų, po to – ne rečiau kaip kas 24 valandas. Žuvis laikoma negyva, jei, liečiant uodeginį peleką (caudal peduncle), ji nereaguoja ir nesimato jokių kvėpavimo judesių. Po apžiūros negyvos žuvys pašalinamos ir užrašomas negyvų žuvų skaičius.

Užrašomi visi pastebimi pakitimai (pvz., pusiausvyros netekimas, plaukimo pobūdžio pasikeitimas, kvėpavimo funkcijos, pigmentacijos pokyčiai ir t.t.).

Ištirpęs deguonis, pH ir temperatūra turi būti matuojami kiekvieną dieną.

Ribinis bandymas

Ribinis bandymas atliekamas ta pačia tvarka kaip pilnos apimties bandymas, bet naudojant 100 mg/litre koncentraciją, siekiant įrodyti, kad LC₅₀ yra didesnė už šią koncentraciją.

Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos bandymui skirtame vandenyje pasiekti negalima, ribinis bandymas turi būti atliekamas su koncentracija, lygia medžiagos tirpumui (arba su didžiausia koncentracija, kurioje susidaro patvari suspensija) naudojamoje terpėje (taip pat žr. 1.6.1.1 punktą).

Ribinis bandymas turi būti atliekamas, naudojant 7–10 žuvų, toks pat žuvų skaičius turi būti naudojamas kontroliniame (-iuose) bandyme (-uose). Pagal binominę teoriją, jei bandyme su 10 žuvų mirtingumas yra nulinis, pasikliovimo tikimybė, kad LC₅₀ yra didesnė nei ribiniame bandyme naudota koncentracija, yra 99,9%. Mirtingumo nebuvimas, naudojant 7, 8 ar 9 žuvis, užtikrina bent 99% pasikliovimo tikimybę, kad LC₅₀ yra didesnė nei naudota koncentracija.

Jei mirtingumo atvejai pasitaiko, turi būti atliekamas pilnos apimties bandymas. Jei stebimi subletaliniai padariniai, tai turi būti užrašyta ataskaitoje.

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Kiekvienam laikotarpiui, kuriam buvo užrašyti rezultatai (24, 48, 72 ir 96 valandos), logaritminiame tikimybiniame popieriuje braižoma mirtingumo, nustatyto kiekvienam rekomenduotam veikimo laikotarpiui, procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivė.

Kai tai įmanoma ir kiekvienam matavimo laikotarpiui reikia įvertinti LC₅₀ ir pasikliovimo ribas (p = 0,05), taikant standartines metodikas, šios vertės turi būti apvalinamos iki vieno arba daugiausia iki dviejų reikšmingų skaitmenų (apvalinimo iki dviejų skaitmenų pavyzdys: 170 vietoj 173,5; 0,13 vietoj 0,127; 1,2 vietoj 1,21).

Tais atvejais, kai atsako procentinės vertės ir koncentracijos priklausomybės kreivės polinkis yra per status, kad būtų galima skaičiuoti LC₅₀, pakanka grafinio šios vertės įverčio.

Kai dviem gretimoms koncentracijoms, kurių santykis 2,2, gaunamos 0 ir 100% mirtingumo vertės, šių dviejų verčių pakanka nustatyti intervalui, į kurį patenka LC₅₀.

Jei pastebėta, kad bandomosios medžiagos patvarumo ar homogeniškumo užtikrinti neįmanoma, tai turi būti pateikta ataskaitoje, o rezultatus interpretuoti reikia atsargiai.

3. ATASKAITA

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– informacija apie bandymų žuvis (mokslinis pavadinimas, rūšis, tiekėjas, bet koks išankstinis apdorojimas, dydis ir kiekvienai bandomajai koncentracijai naudotų žuvų skaičius);

– skiedimo vandens šaltinis ir pagrindinės cheminės savybės (pH, kietumas, temperatūra);

– mažai vandenyje tirpios medžiagos atveju pradinio tirpalo ir bandomųjų tirpalų ruošimo metodas;

– visų pagalbinių medžiagų koncentracijos;

– naudotų koncentracijų sąrašas ir visa turima informacija apie bandomosios medžiagos patvarumą naudotos koncentracijos bandomajame tirpale;

– jei daroma cheminė analizė, taikyti metodai ir gauti rezultatai;

– ribinio bandymo, jei jis buvo daromas, rezultatai;

– taikytos bandymo metodikos pasirinkimo priežastys ir detalės (pvz., stacionariomis sąlygomis, pusiau stacionariomis sąlygomis, dozavimo srautas, pratekėjimo srautas, ar buvo naudojamas aeravimas, žuvų įkrova ir t.t.);

– bandymų įrangos aprašymas;

– apšvietimo režimas;

– ištirpusio deguonies koncentracija bandomuosiuose tirpaluose, jų pH vertė ir temperatūra kas 24 valandas;

– įrodymas, kad kokybės kriterijai įvykdyti;

– lentelė, kurioje kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui pateiktas bendras mirtingumas kiekvienai koncentracijai ir kontroliniame bandyme (ir kontroliniame bandyme su pagalbine medžiaga, jei reikia);

– atsako procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivės grafikas bandymo pabaigoje;

– jei įmanoma, LC₅₀ vertes kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui (su 95% pasikliovimo ribomis);

– statistinės metodikos, taikytos LC₅₀ vertėms nustatyti;

– gauti rezultatai, jei naudota etaloninė medžiaga;

– didžiausia bandomoji koncentracija, kurią naudojant mirtingumas bandymo laikotarpiu yra nulinis;

mažiausia bandomoji koncentracija, bandymo laikotarpiu sukelianti 100% mirtingumą.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

(2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio – Static and Flow Through methods – NFT 90-303 June 1985.

(3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri – Static and Flow – Through methods – NFT 90-305 June 1985.

(4) ISO 7346/1, /2 and /3 – Water Quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan – Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.

(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden – Part II 1974.

(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15).

(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.

(8) NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.

(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.

(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.

(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Pan IV, 16 March 1979.

(12) Standard methods for the examination of water and wastewater, fourteen edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.

(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.

(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph. P. und Boje. R. Ökotoxikologie Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(15) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm. Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.

(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978.

(17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.

(18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32.

(19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.

(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.

1 priedas

Atkurtasis vanduo (Skiedimo vanduo)

Skiedimui tinkamo vandens pavyzdys

Visos cheminės medžiagos turi būti analiziškai grynos.

Vanduo turi būti geros kokybės distiliuotas arba dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų ne didesnis kaip 5mScm^-1.

Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių.

Pradiniai tirpalai

CaCl₂×2H₂O (kalcio chloridas, dihidratas):	11,76 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
MgSO₄×7H₂O (magnio sulfatas, heptahidratas):	4,93 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
NaHCO₃ (natrio hidrokarbonatas):	2,59 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
KCl (kalio chloridas):	0,23 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

Atkurtasis skiedimo vanduo

Sumaišoma po 25 ml kiekvieno iš šių keturių tirpalų ir praskiedžiama vandeniu iki 1 litro.

Aeruojama tol, kol ištirpusio deguonies koncentracija pasiekia oro soties vertę (OSV).

pH turi būti 7,8 ± 0,2.

Prireikus pH reguliuojamas NaOH (natrio hidroksidu) arba HC1 (druskos rūgštimi).

Taip paruoštas skiedimo vanduo laikomas padėtas 12 valandų, jo nereikia daugiau aeruoti.

Ca ir Mg jonų koncentracijų suma šiame tirpale yra lygi 2,5 mmol/litre (5 mgekv/l). Ca ir Mg jonų santykis lygus 4:1, o Na ir K jonų santykis – 10:1. Bendrasis šio tirpalo šarmingumas lygus 0,8 mmol/litre.

Joks nukrypimas nuo skiedimo vandens ruošimo būdo neturi keisti vandens sudėties arba savybių.

2 priedas

Žuvų rūšys, kurias rekomenduojama naudoti bandymuose:

Rekomenduojamos rūšys	Rekomenduojamas bandymų temperatūros intervalas, °C	Rekomenduojamas bandymų gyvūno bendras kūno ilgis, cm

Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan)	nuo 20 iki 24	3,0 ± 0,5
Dryžuotasis danio
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Rainė	nuo 20 iki 24	5,0 ± 2,0
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758)	nuo 20 iki 24	6,0 ± 2,0
Paprastasis karpis
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) Cyprinodontidae	nuo 20 iki 24	3,0 ± 1,0
(Tomminck and Schlegel 1850) Red killifish
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae (Peters 1859) Gupi	nuo 20 iki 24	3,0 ± 1,0
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)	nuo 20 iki 24	5,0 ± 2,0
(Rafinesque Linneaus 1758) Bluegill
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae)	nuo 12 iki 17	6,0 ± 2,0
(Walbaum 1988) Margasis upėtakis
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758)	nuo 20 iki 24	6,0 ± 2,0
Golden orfe

Lentelėje nurodytas žuvis lengva auginti ir (arba) jų galima gauti ištisus metus. Žuvis galima auginti ir veisti žuvų fermose arba laboratorijoje ligų ir parazitų kontrolės sąlygomis, kad bandymams skirti gyvūnai būtų sveiki ir būtų žinoma jų kilmė. Šių žuvų yra daugelyje pasaulio kraštų.

3 priedas

Koncentracija: mirtingumo dalis procentais

LC₅₀ nustatymo pavyzdys, naudojant logaritminį-tikimybinį popierių

ŪMINIS TOKSINIS POVEIKIS DAFNIJOMS

1. metodas

1.1. ĮVADAS

Šio bandymo tikslas yra nustatyti tiriamosios medžiagos medianinę efektyvią koncentraciją (EC₅₀) sukeliančią pusės Daphnia magna individų nejudrumą gėlame vandenyje. Prieš pradedant bandymą, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, stabilumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI

Direktyvos reikalavimas dėl dafnijas veikiančios LC₅₀ laikomas įvykdytu, jei EC₅₀ nustatoma tiksliai šiame bandymo metode aprašytomis sąlygomis.

Šiame bandyme ūminis toksinis poveikis išreikiamas medianine efektyvia judrumo slopinimo (imobilizavimo) koncentracija (EC₅₀). Tai koncentracija, išreikšta pradine koncentracijos verte, kurią naudojant per nuolatinio veikimo laikotarpį, kuris turi būti nurodytas, slopinamas 50% bandyme naudotų Daphnia organizmų judrumas.

Imobilizavimas:

Imobilizuotais laikomi tie gyvūnai, kurie negali plaukti 15 sekundžių laikotarpiu po švelnaus bandymų indo pajudinimo.

Visos bandomosios medžiagos koncentracijos yra pateikiamos mase tūrio vienetui (mg/litre) arba mase masės vienetui (mg/kg).

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymų sąlygomis naudojamų rūšių jautrumas žymiai nepakito, gali būti atliekamas bandymas su etalonine medžiaga.

EEC tarplaboratorinio lyginimo bandymo rezultatų, gautų keturioms medžiagoms, suvestinė pateikta 2 priede.

1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ

Galima atlikti ribinį bandymą su 100 mg/litre koncentracija, norint parodyti, kad EC₅₀ yra didesnė nei ši koncentracija.

Dafnijos 48 valandas veikiamos bandomąja medžiaga (įdėta į vandenį) tam tikrame koncentracijų intervale. Jei bandymo trukmė mažesnė, tai turi būti patvirtinta bandymų ataskaitoje.

Kai kitos bandymų sąlygos yra identiškos ir kai bandomoji medžiaga naudojama atitinkamame koncentracijų intervale, vidutinis poveikio į dafnijos gebėjimą plaukti laipsnis dėl skirtingos bandomosios medžiagos koncentracijos yra taip pat nevienodas. Bandymo pabaigoje negalinčių plaukti dafnijų procentinė dalis, esant skirtingoms koncentracijoms, bus nevienoda.

Koncentracijos, kurias naudojant imobilizavimas nulinis arba 100%, gaunamos tiesiogiai, remiantis bandymo metu darytais stebėjimais, tuo tarpu 48 valandų EC₅₀ skaičiuojama, jei tai įmanoma.

Šiame metode naudojama statinė sistema, veikimo laikotarpiu bandomieji tirpalai neatnaujinami.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

Kokybės kriterijai turi būti taikomi ir ribinio bandymo metodui, ir pilnos apimties bandymo metodui.

Bandymo pabaigoje imobilizavimas kontroliniuose bandymuose neturi būti didesnis kaip 10%.

Kontrolinėse grupėse bandymams panaudoti Daphnia gyvūnai neturi būti pakibę vandens paviršiuje.

Pageidautina, kad ištirpusio deguonies koncentracija bandymų induose visą bandymo laiką turi būti ne mažesnė kaip 3 mg/l. Tačiau jokiomis aplinkybėmis ištirpusio deguonies koncentracija neturi būti mažesnė kaip 2 mg/l.

Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti palaikoma 80% pradinės koncentracijos vertės ribose.

Medžiagų, kurios:

(i) mažai tirpsta bandymo terpėje, arba

(ii) gali sudaryti patvarias emulsijas ar suspensijas, arba

(iii) yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose,

pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija, išmatuota tirpale (ar, jei techniškai tai neįmanoma, išmatuota vandens tūryje) bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra, tačiau prieš bandymų organizmų įleidimą.

Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti atliekami tolesni matavimai.

pH vertė neturi keistis daugiau kaip 1 pH vienetu.

1.6. bandymų METODO aprašymas

1.6.1. Reagentai

1.6.1.1. Bandomųjų medžiagų tirpalai

Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2.

Pasirinktos bandymo koncentracijos tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Jei bandomos didelės koncentracijos, medžiaga gali būti ištirpinta praskiedimo vandenyje tiesiogiai.

Paprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Siekiant kai kurioms medžiagoms (pvz., vandenyje mažai tirpioms medžiagoms ar kurių didelis Pow, ar toms, kurios sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) užtikrinti sąlygas pasiekti soties arba pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., kad vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui, ir t.t.).

Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba siekiant pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, kaip papildomas priemones galima panaudoti dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius arba dispergatorius. Kai naudojamos tokios pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis, ir papildomai kontrolinės dafnijos turi būti veikiamos pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti kuo mažesnė ir jokiu būdu neturi būti didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės.

Bandymas turi būti atliekamas nereguliuojant pH vertės. Jei pH vertė turi polinkį žymiai pasikeisti, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HCl ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti atliekamas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei, reguliuojant pH, vyksta kokia nors cheminė reakcija arba bandomoji medžiaga fiziškai krenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje.

1.6.1.2. Bandymų vanduo

Šiame bandyme naudojamas atkurtasis vanduo (žr. 1 priedą ir 2 nuorodą: ISO 6341). Daphnia veisimui rekomenduojama naudoti vandenį, kurio kokybė (pH, kietumas) būtų panaši į bandyme naudojamo vandens kokybę, kad prieš bandymą nereikėtų aklimatizuoti.

1.6.2. Aparatūra

Turi būti naudojama įprasta laboratorinė aparatūra ir įranga.

Pageidautina, kad su bandomaisiais tirpalais kontaktuojanti įranga būtų pagaminta vien tik iš stiklo:

– deguonies matuoklis (su mikroelektrodu ar kitokiu įtaisu, tinkamu matuoti ištirpusį deguonį mažo tūrio bandiniuose),

– atitinkama termostatavimo aparatūra,

– pH-metras,

– vandens kietumo nustatymo įranga.

1.6.3. Bandomieji organizmai

Daphnia magna yra labiausiai bandymui naudotina rūšis, nors leidžiama naudoti ir Daphnia pulex. Bandymų gyvūnų amžius bandymo pradžioje turi būti ne didesnis kaip 24 valandos, jie turi būti užauginti laboratorijoje, nesirgti akivaizdžiomis ligomis ir būti žinomos kilmės (pvz., veisimo sąlygos, bet koks pradinis apdorojimas ir t.t.).

1.6.4. Bandymų procedūra

Siekiant gauti informacijos apie koncentracijų, kurias reikia naudoti pagrindiniame bandyme, intervalą, prieš galutinį bandymą gali būti daromas intervalo nustatymo bandymas.

Daromas vienas kontrolinis bandymas be bandomosios medžiagos ir, jei reikia, bandymų serija papildoma dar vienu kontroliniu bandymu, kuriame naudojama pagalbinė medžiaga.

Dafnijos veikiamos medžiaga, kaip tai aprašyta toliau:

– trukmė: geriau 48 valandos,

– gyvūnų skaičius: ne mažiau kaip 20 gyvūnų kiekvienai bandomajai koncentracijai, pageidautina, kad jie būtų padalyti į keturias grupes po penkis gyvūnus ar į dvi grupes po dešimt gyvūnų,

– įkrova: kiekvienam gyvūnui turi tekti ne mažiau kaip 2 ml bandomojo tirpalo,

– bandomoji koncentracija: bandomasis tirpalas turi būti ruošiamas prieš pat dafnijų įleidimą, ir geriau būtų nenaudoti jokio tirpiklio, išskyrus vandenį. Koncentracija parenkama pagal geometrinę progresiją, santykis tarp gretimų koncentracijų turi būti ne didesnis kaip 2,2. Kartu su kontroliniais bandiniais turi būti išbandytos koncentracijos, kuriose imobilizacija po 48 valandų yra 0 ir 100%, ir intervalas tarpinius imobilizacijos laipsnius atitinkančių koncentracijų, leidžiančių skaičiuoti 48 valandų EC50,

– vanduo: žr. 1.6.1.2,

– šviesa: šviesos ir tamsos ciklas pasirenkamas laisvai,

– temperatūra: bandymų temperatūra turi būti nuo 18 iki 22°C, tačiau kiekviename atskirame bandyme ji turi būti palaikoma ± 1°C ribose,

– aeravimas: bandomieji tirpalai neturi būti aeruojami burbulais,

– šėrimas: šerti neleidžiama.

Kontrolinių ir bandomųjų tirpalų pH ir deguonies koncentracija turi būti matuojama bandymo pabaigoje; bandomųjų tirpalų pH vertė turi būti nekeičiama.

Lakios medžiagos turi būti bandomos visiškai užpildytuose uždaruose induose, kurie būtų pakankamai dideli, kad juose negalėtų pritrūkti deguonies.

Dafnijos tikrinamos ne vėliau kaip po 24 veikimo valandų ir dar kartą po 48 valandų.

Ribinis bandymas

Taikant šiame bandymo metode aprašytas procedūras, galima atlikti ribinį bandymą, esant 100 mg/litre koncentracijai, siekiant parodyti, kad EC₅₀ yra didesnė nei ši koncentracija.

Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos pasiekti bandymų vandenyje negalima, ribinis bandymas turi būti atliekamas esant koncentracijai, lygiai medžiagos tirpumui (arba esant didžiausiai koncentracijai, kurioje dar gali susidaryti patvari suspensija) naudojamoje terpėje (taip pat žr. 1.6.1.1 punktą).

Ribinis bandymas turi būti atliekamas, naudojant 20 dafnijų, padalytų į dvi ar keturias grupes, tas pat dafnijų skaičius turi būti naudojamas kontroliniame (-iuose) bandyme (-uose). Jei pasitaiko imobilizacijos atvejų, turi būti atliekamas pilnos apimties bandymas.

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Kiekvienam laikotarpiui, kuriam rezultatai buvo užrašyti (24 ir 48), logaritminiame-tikimybiniame popieriuje braižoma mirtingumo procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivė.

Kai tai įmanoma ir kiekvienam matavimo laikotarpiui reikia įvertinti EC₅₀ ir pasikliovimo ribas (p = 0,05), taikant standartines metodikas; šios vertės turi būti apvalinamos iki vieno ar daugiausia iki dviejų reikšminių skaitmenų (apvalinimo iki dviejų skaitmenų pavyzdys: 170 vietoj 173,5; 0,13 vietoj 0,127; 1,2 vietoj 1,21).

Tais atvejais, kai atsako procentinės vertės ir koncentracijos priklausomybės kreivės nuožulnumas yra per status, kad būtų galima skaičiuoti EC₅₀, pakanka grafinio šios vertės įverčio.

Kai dviem gretimoms koncentracijoms, kurių santykis 2,2, gaunamos 0 ir 100% imobilizavimo vertės, šių dviejų verčių pakanka pažymėti intervalui, į kurį patenka EC₅₀.

Jei pastebėta, kad bandomosios medžiagos patvarumo ar homogeniškumo užtikrinti neįmanoma, tai turi būti pateikta ataskaitoje, o rezultatai turi būti interpretuojami atsargiai.

3. ATASKAITA

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– informacija apie bandymui panaudotą organizmą (mokslinis pavadinimas, rūšis, tiekėjas ar šaltinis, bet koks išankstinis apdorojimas, auginimo metodas, įskaitant maisto šaltinį, rūšį ir kiekį, maitinimo dažnį);

– skiedimo vandens šaltinis ir pagrindinės cheminės savybės (pH, temperatūra, kietumas);

– mažai vandenyje tirpios medžiagos atveju pradinio tirpalo ir bandomųjų tirpalų ruošimo metodas;

– visų pagalbinių medžiagų koncentracija;

– naudotų koncentracijų sąrašas ir visa turima informacija apie bandomosios medžiagos patvarumą bandomajame tirpale;

– jei atlikta cheminė analizė, taikyti metodai ir gauti rezultatai;

– ribinio bandymo, jei jis buvo atliktas, rezultatai;

– bandymų įrangos aprašymas;

– apšvietimo režimas;

– ištirpusio deguonies koncentracija bandomuosiuose tirpaluose, jų pH vertė ir temperatūra;

– įrodymai, kad kokybės kriterijai įvykdyti;

– lentelė, kurioje kiekvienam rekomenduotam nustatymo laikotarpiui (24 ar 48 valandos) pateiktas bendras imobilizuotų dafnijų skaičius kiekvienai koncentracijai ir kontroliniame bandyme (ir kontroliniame bandyme su pagalbine medžiaga, jei reikia);

– atsako procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivės grafikas bandymo pabaigoje;

– jei įmanoma, EC₅₀ vertes kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui (su 95% pasikliovimo riba);

– statistinės metodikos, taikytos EC₅₀ vertėms nustatyti;

– jei panaudota etaloninė medžiaga, gauti rezultatai;

– didžiausia bandomoji koncentracija, kurią naudojant imobilizavimas bandymo laikotarpiu yra nulinis;

– mažiausia bandomoji koncentracija, bandymo laikotarpiu sukelianti 100% imobilizavimą.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

(2) International Standard ISO, Water Quality – Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989.

(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera – crusiacea) NFT 90 301 (January 1983).

(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (LII).

(6) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978.

(7) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. and Exper. Ther., 1949, vol. 96, 99-113.

(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.

(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32.

(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1977, STP 634, 65-84.

(11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50 US EPA.

1 priedas

Atkurtasis vanduo

Skiedimui tinkamo vandens pavyzdys (pagal ISO 6341)

Visos cheminės medžiagos turi būti analiziškai grynos.

Vanduo turi būti geros kokybės, distiliuotas vanduo ar dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų ne didesnis kaip 5mScm-^1.

Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių.

Pradiniai tirpalai

CaCl2 2H2O (kalcio chloridas, dihidratas):	11,76 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
MgSO4 7H2O (magnio sulfatas, heptahidratas):	4,93 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
NaHCO3 (natrio hidrokarbonatas):	2,59 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
KC1 (kalio chloridas):	0,23 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

Atkurtasis skiedimo vanduo

Sumaišoma po 25 ml kiekvieno iš šių keturių tirpalų ir bendras tūris papildomas vandeniu iki 1 litro.

Skiedimo vanduo aeruojamas, kol ištirpusio deguonies koncentracija pasiekia oro soties lygį.

Paruošto skiedimo vandens pH turi būti 7,8 ± 0,2.

Jeigu yra būtina, pH vertė koreguojama NaOH (natrio hidroksidu) arba HC1 (druskos rūgštimi).

Taip paruoštas skiedimo vanduo paliekamas stovėti 12 valandų, jo nereikia daugiau aeruoti.

Ca ir Mg jonų koncentracijų suma šiame tirpale yra lygi 2,5 mmol/litre. Ca ir Mg jonų santykis lygus 4:1, o Na ir K jonų santykis lygus 10:1. Bendrasis šio tirpalo šarmingumas lygus 0,8 mmol/litre.

Joks nukrypimas nuo skiedimo vandens ruošimo būdo neturi keisti vandens sudėties arba savybių.

2 priedas

EEC tarplaboratorinio palyginamojo bandymo (ring test), atlikto 1978 (taip pat cituojamo 2 nuorodoje), rezultatų suvestinė

Įspėjimas: šio tarplaboratorinio palyginamojo bandymo tikslas buvo nustatyti 24 valandų EC_50.

Naudota medžiaga:

1) Kalio bichromatas

2) Tetrapropilbenzeno sulfoninė rūgštis

3) Tetrapropilbenzeno natrio sulfonatas

4) Kalio 2,4,5-trichlorfenoksiacetatas

Medžiaga	Dalyvavusių laboratorijų skaičius	Skaičiavimams naudotų rezultatų skaičius	24 h EC₅₀, mg/l,vidutinė vertė

1	46	129	1,5
2	36	108	27
3	31	84	27
4	32	72	770

3 priedas

Koncentracijos pavyzdys: imobilizavimo procentinė dalis

EC₅₀ nustatymo pavyzdys, naudojant logaritminį-tikimybinį popierių

Imobilizacija,%

DUMBLIŲ SLOPINIMO BANDYMAS

1. metodas

1.1. ĮVADAS

Šio bandymo tikslas yra nustatyti pasekmes, tiriamajai medžiagai veikiant vienaląsčių žaliųjų dumblių rūšių augimą. Per palyginti trumpai (72 valandas) trunkančius bandymus galima įvertinti poveikį kelioms kartoms. Šį metodą galima pritaikyti įvairioms vienaląsčių dumblių rūšims, tokiu atveju su bandymo ataskaita turi būti pateiktas metodo aprašymas.

Šį metodą lengviausia taikyti vandenyje tirpioms medžiagoms, kai tikimasi, kad bandymo sąlygomis jos išlieka vandenyje.

Metodą galima taikyti medžiagoms, kurios tiesiogiai netrukdo matuoti dumblių augimo.

Prieš pradedant bandymą, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, cheminį patvarumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI

Ląstelių tankis: ląstelių skaičius viename mililitre.

Augimas: ląstelių tankio padidėjimas per bandymo laiką.

Augimo greitis: ląstelių tankio didėjimas per laiko vienetą.

EC₅₀: šiame metode – tai tokia bandomosios medžiagos koncentracija, kurioje 50% sumažėja augimas (E_bC₅₀) arba augimo greitis (E_rC₅₀), lyginant su kontroliniu bandymu.

NOEC (maksimali neveikianti koncentracija): šiame metode – tai didžiausia bandomoji koncentracija, kurioje nėra statistiškai patikimo augimo arba augimo greičio sumažėjimo, lyginant su kontroliniu bandymu.

Kiekviena bandomosios medžiagos koncentracija yra skaičiuojama mase tūrio vienetui (mg/litre) arba mase masės vienetui (mg/kg).

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymų sąlygomis naudojamų rūšių jautrumas žymiai nepakito, gali būti atliekamas bandymas su etalonine medžiaga.

Jei panaudota etaloninė medžiaga, rezultatai turi būti pateikti ataskaitoje. Etalonine medžiaga galima naudoti kalio bichromatą, tačiau jo spalva gali turėti įtakos šviesos, kurią gauna ląstelės, kokybei ir intensyvumui bei spektrofotometrinių nustatymų, jei jie daromi, rezultatams. Kalio bichromatas buvo naudojamas tarptautiniame tarplaboratoriniame bandyme (žr. 3 nuorodą ir 2 priedą).

1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ

Galima atlikti ribinį bandymą su 100 mg/litre koncentracija, norint parodyti, kad EC₅₀ yra didesnė nei ši koncentracija.

Eksponentiškai augančios atrinktų žaliųjų dumblių kultūros apibrėžtomis sąlygomis per kelias kartas yra veikiamos įvairių koncentracijų bandomosios medžiagos tirpaluose.

Bandomieji tirpalai inkubuojami 72 valandoms; per tą laiką ne mažiau kaip kas 24 valandas kiekviename tirpale matuojamas ląstelių tankis. Nustatomas augimo slopinimas, lyginant su kultūros augimu kontroliniame bandyme.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

Kokybės kriterijai turi būti taikomi tiek ribinio bandymo metodui, tiek ir pilnos apimties bandymo metodui.

Ląstelių tankis kontrolinių bandymų kultūrose per tris paras turi būti padidėjęs bent 16 kartų.

Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti laikoma 80% pradinės koncentracijos vertės ribose.

Medžiagų, kurios lengvai tirpsta bandomojoje terpėje ir kurių tirpalai patvarūs, t.y. kuriuose ištirpinta medžiaga žymiai negaruoja, nesuyra, nesihidrolizuoja ar neadsorbuojama, pradine koncentracija galima laikyti vardinę medžiagos koncentraciją. Turi būti pateikti įrodymai, kad bandomosios koncentracijos buvo išlaikytos per visą bandymą ir kad kokybės kriterijai buvo įvykdyti.

Medžiagų, kurios:

(i) mažai tirpsta bandymo terpėje, arba

(ii) gali sudaryti patvarias emulsijas ar suspensijas, arba

(iii) yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose,

pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija, nustatyta bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra.

Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti daromi tolesni matavimai.

Yra pripažįstama, kad per tą laiką, kol vyksta bandymas, žymus bandomosios medžiagos kiekis gali būti sulaikytas dumblių biomasėje. Taigi, siekiant parodyti, kad vykdomi aukščiau minėti kokybės kriterijai, turi būti atsižvelgta ir į medžiagos kiekį, kuris patenka į dumblių biomasę, ir į medžiagos kiekį tirpale (arba, jei tai techniškai neįmanoma, į vandens tūryje nustatytą medžiagos kiekį). Tačiau, kadangi medžiagos koncentracijos dumblių biomasėje nustatymas gali kelti esminių techninių problemų, atitikimas kokybės kriterijams gali būti parodytas atliekant bandymą su didžiausia medžiagos koncentracija, bet be dumblių, ir išmatuojant jos koncentraciją tirpale (arba, jei tai techniškai neįmanoma, vandens tūryje) bandymo pradžioje ir pabaigoje.

1.6. bandymų PROCEDŪROS aprašymas

1.6.1. Reagentai

1.6.1.1. Bandomųjų medžiagų tirpalai

Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant tiriamąją medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2.

Pasirinktų bandymo koncentracijų tirpalai ruošiami kartotines pradinio tirpalo dalis įpilant į dumblių pradinę kultūrą (žr. 1 priedą). Įprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Siekiant užtikrinti kai kurių medžiagų (pvz., vandenyje mažai tirpių medžiagų ar kurių didelis Pow, arba tų, kurios sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) sąlygas pasiekti soties arba pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., kad vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui, ir t. t.).

Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba siekiant pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, galima panaudoti kaip papildomas priemones dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius ar dispergatorius. Kai naudojamos tokios pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis ir papildomi kontroliniai bandiniai turi būti veikiami pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti kuo mažesnė ir jokiu atveju neturi būti didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės.

Bandymas turi būti atliekamas nereguliuojant pH vertės. Jei yra įrodymų apie žymų pH vertės kitimą, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HC1 ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti daromas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei, reguliuojant pH, vyksta kokia nors cheminė reakcija ar bandomoji medžiaga fiziškai krenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje.

1.6.1.2. Bandymų terpė

Vanduo turi būti geros kokybės distiliuotas vanduo arba dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų mažesnis kaip 5mScm-1. Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių.

Rekomenduojama terpė:

Pagal žemiau pateiktą lentelę ruošiami keturi pradiniai tirpalai. Pradiniai tirpalai sterilizuojami membraninės filtracijos arba autoklavavimo būdu ir laikomi tamsoje 4°C temperatūroje. Pradinis tirpalas Nr. 4 turi būti sterilizuojamas, tik filtruojant pro membraną. Šie pradiniai tirpalai skiedžiami, kad bandomuosiuose tirpaluose būtų gautos galutinės mitybinių medžiagų koncentracijos.

Mitybinė terpė	Koncentracija pradiniame tirpale		Galutinė koncentracija bandomajame tirpale
1 pradinis tirpalas: mitybiniai makroelementai
NH₄C₁	1,5	g/l	15	mg/l
MgCl₂ 6H₂O	1,2	g/l	12	mg/l
CaCl₂ 2H₂O	1,8	g/l	18	mg/l
MgSO₄ 7H_2O	1,5	g/l	15	mg/l
KH₂PO₄	0,16	g/l	1,6	mg/l

2 pradinis tirpalas: Fe-EDTA
FeCl₃·6H₂O	80	mg/l	0,08	mg/l
Na₂EDTA 2H₂O	100	mg/l	0,1	mg/l
3 pradinis tirpalas: mikroelementai
H3BO3	185	mg/l	0,185	mg/l
MnCl₂ 4H₂O	415	mg/l	0,415	mg/l
ZnCl₂	3	mg/l	3 × 10-3	mg/l
CoCl₂ 6H₂O	1,5	mg/l	1,5 × 10-3	mg/l
CuCl₂ 2H₂O	0,01	mg/l	10-5	mg/l
Na₂MoO₄ 2H₂O	7	mg/l	7 × 10-3	mg/l

4 pradinis tirpalas: NaHCO₃	50	g/l	50	mg/l
NaHCO₃

Kai nusistovi pusiausvyra su oru, terpės pH vertė yra lygi maždaug 8.

1.6.2. Aparatūra

– Įprastoji laboratorijos įranga.

– Atitinkamo tūrio bandymų kolbos (pvz., jei bandomojo tirpalo tūris 100 ml, tinka 250 ml tūrio kūginės kolbos). Visos kolbos turi būti vienodos medžiagos ir matmenų atžvilgiu.

– Kultūros auginimo aparatūra: spinta ar kamera, kurioje temperatūrą būtų galima palaikyti intervale nuo 21°C iki 25°C ± 2oC tikslumu ir kurioje būtų nuolatinis tolygus apšvietimas intervale nuo 400 iki 700 nm. Jei dumblių kontrolinės kultūros pasiekė rekomenduotą augimo greitį, galima daryti prielaidą, kad augimo sąlygos, įskaitant šviesos intensyvumą, buvo tinkamos.

– Rekomenduojama, kad šviesos intensyvumas bandomųjų tirpalų viduriniame lygyje būtų intervale nuo 60 iki 120 μE m-2 s-1 (nuo 35 iki 70 × 1018 fotonų m-2 s-l), kai matuojama intervale nuo 400 iki 700 nm, naudojant tinkamą jutiklį. Jei naudojami apšvietos matavimo prietaisai kalibruoti liuksais, yra priimtinas lygiavertis intervalas nuo 6 000 iki 10 000 lx. Tokį šviesos intensyvumą galima pasiekti, jei 0,35 m atstumu nuo dumblių kultūros pastatomos nuo keturių iki septynių 30 W universalaus tipo baltų dienos šviesos lempų (spalvos temperatūra maždaug 4300 K).

– Ląstelių tankio matavimai turi būti atliekami naudojant tiesioginį gyvų ląstelių skaičiavimo metodą, pvz., mikroskopą su skaičiavimo kamera. Tačiau gali būti naudojami kiti metodai (fotometrija, turbidimetrija,…), jei jie yra pakankamai jautrūs ir jei būtų parodyta, kad jų rezultatai pakankamai gerai koreliuoja su ląstelių tankiu.

1.6.3. Bandomieji organizmai

Patariama naudoti greitai augančių žaliųjų dumblių rūšis, nes jas patogu auginti ir bandyti. Geriausia naudoti šias rūšis:

Selenastrum capricornutum, pvz., ATCC 22662 arba CCAP 278/4,

Scenedesmus subspicatus, pvz., 86.81 SAG,

Pastaba:

ATCC = American Type Culture Collection (U. S. A.)

CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (U. K.)

SAG = Collection of algal culture (Göttingen, F. R. G.)

Jei naudojamos kitos rūšys, turi būti nurodyta padermė.

1.6.4. Bandymų procedūra

Koncentracijos intervalas, kuriame tiriamosios medžiagos veikimas būtų pamatuojamas, nustatomas remiantis intervalo nustatymo bandymų rezultatais.

Du augimo matavimo būdai (biomasės kiekio ir augimo greičio nustatymas) gali duoti nesulyginamus augimo inhibavimo rezultatus; abu turi būti taikomi intervalo nustatymo bandyme, siekiant užtikrinti, kad geometrine progresija parinktos koncentracijos leistų įvertinti E_bC₅₀ ir E_rC₅₀.

Pradinis ląstelių tankis

Rekomenduojama, kad pradinis bandymo kultūrų Selenastrum capricornutum ir Scenedesmus subspicatus ląstelių tankis būtų apie 10⁴ ląstelių/ml. Kai naudojamos kitos rūšys, biomasė turi būti panaši.

Bandomosios medžiagos koncentracija

Bandymui imamos bent penkios geometrine progresija didėjančios koncentracijos, kad santykis tarp gretimų būtų ne didesnis kaip 2,2. Mažiausios koncentracijos bandomoji medžiaga turi neveikti dumblių augimo. Didžiausios koncentracijos bandomoji medžiaga turi inhibuoti augimą bent 50%, lyginant su kontroliniu bandymu, ir būtų geriausia, jei augimas būtų visiškai sustabdytas.

Lygiagrečių bandymų skaičius ir kontroliniai bandymai

Pagal bandymo schemą su kiekviena bandomąja koncentracija turi būti atliekami trys lygiagretūs bandymai. Daromi trys kontroliniai bandymai be bandomosios medžiagos, ir, jei reikia, dar daromi trys kontroliniai bandymai su pagalbine medžiaga. Jei pasiteisina, bandymo schemą galima keisti, didinant koncentracijų skaičių ir mažinant kartotinių bandymų vienai koncentracijai skaičių.

Bandymų eiga

Bandymų kultūros su reikiama bandomosios medžiagos koncentracija ir reikiamu dumblių kiekiu ruošiamos į reikiamą kiekį iš anksto paruoštos dumblių kultūros pilant kartotinius bandomosios medžiagos pradinių tirpalų tūrius (žr. 1 priedą).

Kolbos su kultūra supurtomos ir statomos į kultūros auginimo aparatą. Siekiant bandomuosiuose tirpaluose pagerinti dujų apykaitą ir sumažinti pH kitimą, dumblių ląstelės suspenduojamos, tirpalus purtant, maišant ar barbotuojant per juos orą. Kultūros turi būti laikomos temperatūrų intervale nuo 21 iki 25°C, reguliuojant ± 2°C tikslumu.

Kiekvienoje kolboje ląstelių tankis nustatomas bent po 24, 48 ir 72 valandų nuo bandymo pradžios. Kai ląstelių tankis matuojamas kitu nei tiesioginis skaičiavimas metodu, fonui nustatyti naudojama filtruota dumblių terpė su atitinkama bandomosios medžiagos koncentracija.

pH vertė nustatoma bandymo pradžioje ir po 72 valandų. pH vertė kontroliniuose bandymuose per visą bandymo laiką neturi pasikeisti daugiau kaip 1,5 vieneto.

Lakių tiriamųjų medžiagų bandymas

Iki šiol nėra visuotinai priimto būdo lakių medžiagų išbandymui. Jei žinoma, kad medžiaga turi polinkį garuoti, galima naudoti uždaras bandymų kolbas su padidintu laisvu tūriu virš tirpalo. Skaičiuojant uždarų kolbų laisvąjį tūrį, turi būti atsižvelgta į CO₂ trūkumo galimybę. Buvo pasiūlyti šio metodo variantai (žr. 4 nuorodą).

Reikia stengtis nustatyti tirpale likusios medžiagos kiekį, ir patariama ypač atsargiai interpretuoti bandymų rezultatus, gautus su lakiomis medžiagomis uždaroje sistemoje.

Ribinis bandymas

Taikant šiame bandymo metode aprašytas procedūras, galima atlikti ribinį bandymą su koncentracija 100 mg/litre, kai siekiama įrodyti, kad EC₅₀ yra didesnė nei ši koncentracija.

Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos bandymų vandenyje pasiekti negalima, ribinis bandymas turi būti atliekamas su koncentracija, lygia medžiagos tirpumui (ar su didžiausia koncentracija, kurioje dar susidaro patvari suspensija) naudojamoje terpėje (taip pat žr. 1.6.1.1 punktą).

Turi būti atliekama ne mažiau kaip trys ribiniai bandymai, toks pat turi būti ir kontrolinių bandymų skaičius. Ribiniame bandyme turi būti naudojami du augimo matavimo būdai (biomasės kiekis ir augimo greitis).

Jei ribiniame bandyme, lyginant su kontroliniu bandymu, nustatomas 25% arba didesnis vidutinis biomasės kiekio arba augimo greičio mažėjimas, turi būti atliekamas pilnos apimties bandymas.

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Išmatuotas ląstelių tankis bandomosiose kultūrose ir kontroliniuose bandiniuose kartu su bandomosios medžiagos koncentracijomis ir matavimo laikais pateikiamas lentelėje. Norint gauti augimo kreives, vidutinė ląstelių tankio vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai ir kontroliniuose bandiniuose vaizduojama grafiškai laiko atžvilgiu (0–72 h).

Turi būti taikomi du žemiau pateikti būdai, kad būtų galima įvertinti koncentracijos ir jos poveikio priklausomybę. Kai kurios medžiagos, būdamos mažos koncentracijos, gali skatinti augimą. Turi būti įskaitomi tik tie duomenų taškai, kuriuose inhibavimas kinta nuo 0 iki 100%.

2.1. Plotų po augimo kreivėmis lyginimas

Plotas tarp augimo kreivės ir horizontaliosios tiesės N = N₀ gali būti apskaičiuotas taikant formulę:

čia:

A = plotas,

N₀ = ląstelių skaičius laiku t0 (bandymo pradžia),

N₁ = išmatuotas ląstelių skaičius/ml laiku t1,

N_n = išmatuotas ląstelių skaičius/ml laiku tn,

t₁ = pirmojo matavimo laikas nuo bandymo pradžios,

t_n = n-ojo matavimo laikas nuo bandymo pradžios,

_n = nuo bandymo pradžios darytų matavimų skaičius.

Ląstelių augimo inhibavimo procentinė vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai (I_A) apskaičiuojama taikant formulę:

čia:

A_c = plotas tarp augimo kreivės, gautos kontroliniame bandyme, ir horizontaliosios tiesės N = N₀,

A_t = plotas tarp augimo kreivės, gautos koncentracijai t, ir horizontaliosios tiesės N = N₀.

I_A vertės atitinkamų koncentracijų atžvilgiu atidedamos pusiau logaritminiame ar pusiau logaritminiame tikimybiniame popieriuje. Jei vertės atidedamos tikimybiniame popieriuje, per taškus vedama tiesė arba iš akies, arba skaičiuojant iš regresijos lygties.

EC₅₀ įvertinama iš regresijos tiesės, randant joje koncentracijos vertę, kuri atitinka 50% inhibavimą (I_A = 50%). Norint šią vertę pažymėti vienareikšmiai, kaip gautą būtent šiuo skaičiavimo metodu, pasiūlyta vartoti simbolį E_bC₅₀. Svarbu, kad E_bC₅₀ būtų kiekybiškai nustatomas ir pateikiamas kartu su atitinkamu veikimo laikotarpiu, pvz., E_bC₅₀ (0–72 h).

2.2. Augimo greičių lyginimas

Vidutinis eksponentiškai augančių kultūrų savitasis augimo greitis (μ) gali būti apskaičiuotas pagal formulę:

čia: t₀ – bandymo pradžios laikas.

Kitaip augimo vidutinio savitojo greičio vertė gali būti gauta iš regresijos tiesės kampinio koeficiento ln N priklausomybės nuo laiko grafike.

Savitojo augimo greičio mažėjimo procentinė vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai (Iμt) skaičiuojama pagal formulę:

čia:

μc= vidutinis savitasis augimo greitis kontroliniame bandyme,

μt = vidutinis savitasis augimo greitis, kai bandomoji koncentracija t.

Kiekvienai koncentracijai gautos savitojo augimo greičio mažėjimo vertės ir kontrolinės greičio vertės santykio procentinė vertė brėžiama koncentracijos logaritmo atžvilgiu. Iš gauto grafiko galima gauti EC₅₀ vertę. Norint vienareikšmiai pažymėti šiuo metodu gautą EC₅₀, pasiūlyta naudoti simbolį E_rC₅₀. Turi būti nurodytos matavimo laiko ribos, pvz., jei vertė gauta 0 ir 72 valandų laikotarpiui, simbolis užrašomas E_rC₅₀ (0–72 h).

Pastaba: savitasis augimo greitis yra logaritminis dydis, ir nedideli augimo greičio pokyčiai gali būti didelių biomasės pokyčių priežastimi. Taigi E_bC ir E_rC skaitmeninės vertės nėra palyginamos.

2.3. NOEC skaičiavimas

NOEC (maksimali neveikianti koncentracija) nustatoma taikant didelio skaičiaus bandinių lyginimo statistinę procedūrą (pvz., dispersinė analizė ir Dunnett’o testas), naudojant individualias kartotines vertes A (žr. 2.1 poskyrį) arba μ (žr. 2.2 poskyrį) reikšmes.

3. ATASKAITA

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– bandomoji medžiaga: cheminio identifikavimo duomenys;

bandomieji organizmai: kilmė, laboratorinė kultūra, padermės numeris, ir auginimo metodas;

– bandymų sąlygos:

– bandymo pradžios ir pabaigos data bei jo trukmė,

– temperatūra,

– terpės sudėtis;

– auginimo aparatūra;

– tirpalų pH bandymo pradžioje ir pabaigoje (turi būti pateiktas aiškinimas, jei stebimas pH vertės nukrypimas yra didesnis nei 1,5 vieneto);

– nešiklis ir metodas, taikytas soliubilizuoti bandomąją medžiagą, bei nešiklio koncentracija bandomuosiuose tirpaluose;

– šviesos intensyvumas ir kokybė;

– bandomosios koncentracijos (matuotos ar vardinės);

– rezultatai:

– ląstelių tankis kiekvienoje kolboje bei kiekviename matavimo taške, taip pat ląstelių tankio nustatymo metodas,

– ląstelių tankio vidutinės vertės,

– augimo kreivės,

– koncentracijos poveikio priklausomybių grafinis vaizdavimas,

– EC vertės ir skaičiavimo metodas,

– NOEC,

– kiti pastebėti reiškiniai.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.

(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag ‘Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus, in: Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

(3) ISO 8692 – Water quality – Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.

(4) S. Galassi and M. Vighi – Chemosphere, 1981, vol. 10, 1123-1126.

1 priedas

Dumblių auginimo metodikos pavyzdys

Bendrosios pastabos

Šio kultūros auginimo pagal pateikiamą metodiką tikslas yra gauti dumblių kultūras toksiškumo bandymams.

Norint užtikrinti, kad dumblių kultūros nebūtų užkrėstos bakterijomis, turi būti naudojami tinkami metodai (ISO 4833). Pageidautina naudoti akseniškas kultūras, tačiau pagrindinės yra vienaląsčių dumblių kultūros.

Visi veiksmai turi būti daromi steriliomis sąlygomis, kad nebūtų užkrėsta bakterijomis ir kitais dumbliais. Užkrėstos kultūros turi būti atmestos.

Dumblių kultūros paruošimo eiga

Mitybinių tirpalų (terpės) ruošimas:

Terpė gali būti paruošta, skiedžiant pradinius mitybinių medžiagų koncentruotus tirpalus. Standžiai terpei gauti dedama 0,8% agaro. Naudojama terpė turi būti sterili. Sterilizuojant autoklave, galima prarasti NH₃.

Pradinė kultūra:

Pradinės kultūros yra mažos apimties dumblių kultūros, kurios reguliariai pernešamos į šviežią terpę, kad jas būtų galima naudoti kaip pradinę bandymams skirtą medžiagą. Jei kultūros reguliariai nenaudojamos, jos laikomos ant nuožulnaus agaro, mėgintuvėliuose. Šios kultūros pernešamos į šviežią terpę bent kartą per du mėnesius.

Pradinės kultūros auginamos kūginėse kolbose su atitinkama terpe (tūris apie 100 ml). Kai dumbliai inkubuojami 20°C temperatūroje su nuolatiniu apšvietimu, pernešti reikia kas savaitę.

Į kolbą su šviežia terpe sterilia pipete reikia pernešti tokį „senos“ kultūros kiekį, kad greitai augančių rūšių atveju pradinė koncentracija būtų maždaug 100 kartų mažesnė nei „senos“ kultūros.

Rūšių augimo greitis gali būti nustatytas iš augimo kreivės. Jei greitis žinomas, galima įvertinti, koks turi būti į naują terpę pernešamos kultūros tankis. Tai turi būti daroma prieš tai, kai kultūra pasiekia žūties tarpsnį.

Iš anksto paruošta kultūra:

Iš anksto paruošta kultūra skirta tam, kad būtų gautas bandomosioms kultūroms sėti reikalingas dumblių kiekis. Iš anksto paruošta kultūra inkubuojama bandymo sąlygomis ir naudojama tuomet, kai dar auga eksponentiškai, paprastai maždaug po trijų inkubavimo parų. Jei dumblių kultūrose randama deformuotų ar nenormalių ląstelių, tokios kultūros turi būti pašalintos.

2 priedas

ISO 8692 – Vandens kokybė – Gėlojo vandens dumblių augimo inhibavimo bandymas su Scenedesmus subspicatus ir Selenastrum capricornutum pateikia šiuos tarplaboratorinio palyginamojo bandymo rezultatus, gautus 16-oje laboratorijų, tyrusių kalio bichromatą:

	Vidutinė vertė, mg/l	Intervalas, mg/l
E_rC₅₀ (0–72 h)	0,84	nuo 0,60 iki 1,03
E_bC₅₀ (0–72 h)	0,53	nuo 0,20 iki 0,75

„LENGVO“ BIOLOGINIO SKAIDOMUMO NUSTATYMAS

I dalis. BENDRieji klausimai

I.1. ĮVADAS

Aprašyti šeši metodai, kurie leidžia chemines medžiagas rūšiuoti pagal jų biologinio skaidomumo aerobinėje vandeninėje terpėje lengvumą:

a) Ištirpusios organinės anglies (IOA) išnykimo (Die-Away) metodas (A metodas).

b) Modifikuotas OECD (Organization for Economic Cooperation and Development – Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacija) atrankos bandymas – IOA išnykimas (B metodas).

c) Anglies dioksido (CO₂) susidarymas (modifikuotas Sturm bandymas) (C metodas).

d) Manometrinė respirometrija (D metodas).

e) Uždarytos kolbos (Closed bottle) metodas (E metodas).

f) MITI [Ministry of International Trade and Industry (Tarptautinės prekybos ir pramonės ministerija) – Japonija] (F metodas).

Visų šešių bandymų atlikimo sąlygos, bendros ir įprastos, pateiktos metodų I dalyje. Atskiriems metodams specifiniai teiginiai pateikti II–VII dalyse. Prieduose pateikiami apibrėžimai, formulės ir rekomendacijos.

OECD tarplaboratoriniai palyginamieji bandymai, atlikti 1988 m., parodė, kad šiais metodais gauti rezultatai yra tarpusavyje suderinami. Tačiau priklausomai nuo fizikinių bandomosios medžiagos savybių pirmenybė gali būti teikiama vienam arba kitam metodui.

I.2. TINKAMO METODO PARINKIMAS

Tinkamiausio metodo parinkimą nulemia informacija apie cheminės medžiagos tirpumą, garų slėgį ir adsorbcijos charakteristikas. Teorinių verčių skaičiavimui ir (arba) parametrų išmatuotų verčių patikrinimui, pvz., TDS, TCO2, IOA, BOA, ChDS (žr. I ir II priedus), turi būti žinoma cheminė medžiagos formulė.

Bandomosios cheminės medžiagos, kurių tirpumas vandenyje yra bent 100 mg/l, ir jei jos nėra lakios ir neadsorbuojamos, gali būti įvertintos visais metodais. Toms cheminėms medžiagoms, kurios mažai tirpsta vandenyje, yra lakios arba yra adsorbuojamos, tinkami metodai nurodyti 1 lentelėje. Būdas, kaip reikia elgtis su mažai vandenyje tirpiomis ir lakiomis medžiagomis, yra aprašytas III priede. Vidutiniškai lakios cheminės medžiagos gali būti bandomos IOA išnykimo metodu, jei bandymų induose (kurie turi būti tinkamai užkimšti) dujoms yra pakankamai ertmės. Šiuo atveju turi būti įdiegta abiotinė kontrolė, kad būtų galima atsižvelgti į bet kokius fizinius nuostolius.

Gautų rezultatų interpretavimui, ypač kai rezultatų kiekybinės vertės yra mažos arba nežymios, reikalinga informacija apie bandomosios medžiagos grynumą arba apie pagrindinių komponentų santykinę dalį.

Informacija apie bandomųjų medžiagų toksiškumą bakterijoms (IV priedas) gali būti labai naudinga, kai reikia pasirinkti tinkamas bandomąsias koncentracijas, ir gali būti esminė, kai reikia teisingai paaiškinti, kodėl biologinio skaidymo vertės yra mažos.

1 lentelė. Bandymų metodų tinkamumas

Bandymas	Analizės metodas	Tinkamumas medžiagoms, kurios yra:
		mažai tirpios	lakios	adsorbuojamos
IOA išnykimas	Ištirpusi organinė anglis	–	–	+/-
Modifikuotas OECD atrankos	Ištirpusi organinė anglis	–	–	+/-
bandymas – IOA išnykimas
CO₂ susidarymas	Respirometrija: CO₂ susidarymas	+	–	+
Manometrinė respirometrija	Manometrinė respirometrija: deguonies suvartojimas	+	+/-	+
Uždarytos kolbos	Respirometrija: ištirpęs deguonis	+/-	+	+
MITI	Respirometrija: deguonies suvartojimas	+	+/-	+

I.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Siekiant patikrinti procedūrą, lygiagrečiai įprastiems bandymams tinkamai paruoštoje kolboje bandomos etaloninės medžiagos, kurios atitinka lengvo biologinio skaidomumo kriterijus.

Tinkamos cheminės medžiagos yra anilinas (šviežiai distiliuotas), natrio acetatas ir natrio benzoatas. Visos šios etaloninės medžiagos skaidomos šių bandymų sąlygomis, net jei užkratas ir nėra specialiai įdėtas.

Buvo padaryta prielaida, kad reikėtų rasti etaloninę medžiagą, kuri būtų lengvai biologiškai skaidoma, tačiau tik kai yra įdėta užkrato. Buvo pasiūlytas kalio hidroftalatas, tačiau prieš priimant jį kaip etaloninę medžiagą, reikia apie ją surinkti daugiau duomenų.

Respirometriniuose bandymuose junginiai, savo sudėtyje turintys azoto, gali turėti įtakos deguonies vartojimui dėl nitrifikavimo (žr. II ir V priedus).

I.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ

Į bandomosios medžiagos tirpalą arba suspensiją mineralinėje terpėje dedamas užkratas ir tirpalas inkubuojamas aerobinėmis sąlygomis tamsoje arba išsklaidytoje šviesoje. IOA kiekis bandomosios medžiagos tirpale, įterptas su užkratu, turi būti kiek įmanoma mažesnis, lyginant su bandomosios medžiagos IOA kiekiu. Reikia atsižvelgti į užkrato endogeninį aktyvumą, lygiagrečiai darant tuščiuosius bandymus su užkratu, bet be bandomosios medžiagos, nors ląstelių endogeninis aktyvumas, kai yra bandomosios medžiagos, ne visiškai tiksliai atitinka aktyvumą endogeninio aktyvumo kontroliniame bandyme. Atlikimo eigai patikrinti lygiagrečiai daromas bandymas su etalonine medžiaga.

Bendruoju atveju skaidymo eiga sekama nustatinėjant parametrus, pvz., IOA, CO2 susidarymą ir deguonies suvartojimą; matavimai daromi pakankamai dažnai, kad galima būtų nustatyti biologinio skaidymo pradžią ir pabaigą. Jei naudojami automatiniai respirometrai, matavimas yra nuolatinis. Kai matuojamas kitas parametras, kartais papildomai matuojama IOA, tačiau tai paprastai daroma tik bandymo pradžioje ir pabaigoje. Galima naudoti specifinę cheminę analizę, kai norima įvertinti pradinį bandomosios medžiagos suskaidymą ir nustatyti bet kurios susidariusios tarpinės medžiagos koncentraciją (privaloma MITI bandyme).

Paprastai bandymas tęsiamas 28 paras. Tačiau bandymą galima baigti anksčiau nei po 28 parų, t. y. kai biologinio skaidymo kreivė pasiekia gulsčiąją dalį sprendžiant ne mažiau kaip iš trijų iš eilės matavimų. Bandymai gali būti pratęsti ir daromi ilgiau nei 28 paras, jei kreivė rodo, kad biologinis skaidymas prasidėjo, tačiau 28 parą gulsčioji dalis dar nepasiekta.

I.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

I.5.1. Atkuriamumas

Dėl biologinio skaidymo prigimties ir dėl užkrato bakterijų populiacijos mišrios sudėties matavimai turi būti daromi bent du kartus.

Bendra patirtis rodo, kad kuo didesnė bandymo pradžioje į bandomąją terpę įneštų mikroorganizmų koncentracija, tuo mažesnė bus lygiagrečių bandymų sklaida. Tarplaboratoriniai palyginamieji bandymai taip pat parodė, kad gali būti didelė sklaida tarp rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose, tačiau lengvai biologiškai skaidomų junginių atveju paprastai gaunamas geras sutapimas.

I.5.2. Bandymų validumas (teisėtumas)

Bandymas yra validus (teisėtas), jei skirtumas tarp bandomosios medžiagos šalinimo pakartotinai gautų kraštinių verčių gulsčioje kreivės dalyje bandymo pabaigoje arba 10 parų lango pabaigoje yra mažesnis kaip 20% ir jei etaloninės medžiagos skaidymo procentinė vertė iki 14 paros pasiekė lengvojo biologinio skaidomumo lygį. Jei bet kuri iš šių sąlygų neįvykdyta, bandymas turi būti pakartotas. Mažos apimties vertės dėl metodų tikslumo nebūtinai reiškia, kad bandomoji medžiaga aplinkos sąlygomis biologiškai neskaidoma, tačiau jos rodo, kad biologiniam skaidomumui nustatyti būtinas didesnės apimties darbas.

2 lentelė. Bandymų sąlygos

Bandymas	IOA išnykimas	CO₂ susidarymas		Manometrinė respirometrija	Modifikuotas OECD atrankos bandymas		Uždarytos kolbos bandymas	MITI (I)
Bandomosios medžiagos koncentracija mg/l mg IOA/l mg TDS/l	10–40	10–20		100 50–100	10–40		2–10 5–10	100
koncentracija (ląstelių/l, apytikriai)	≤ 30 mg/l SD ar ≤ 100 ml ištakio/l (10⁷–10⁸)				0,5 ml antrinio ištakio/l (10⁵)		≤ 5 ml antrinio ištakio/l (10⁴–10⁶)	30 mg/l SD (10⁷–10⁸)
Elementų koncentracija mineralinėje terpėje (mg/l) P N Na K Mg Ca Fe	116 1,3 86 122 2,2 9,9 0,05–0,1						11,6 0,13 8,6 12,2 2,2 9,9 0,05–0,1	29 1,3 17,2 36,5 6,6 29,7 0,15
pH	7,4 ± 0,2							geriau 7,0
Temperatūra	22 ± 2oC							25 ± 1°C
IOA = ištirpusi organinė anglis			TDS = teorinis deguonies suvartojimas			SD = suspenduotos kietosios dalelės

Jei toksiškumo bandyme, kuriame yra ir bandomoji medžiaga, ir etaloninė cheminė medžiaga, skaidymas po 14 parų yra mažesnis kaip 35% (pagal IOA) arba mažesnis kaip 25% (pagal TDS arba TCO₂), bandomosios cheminės medžiagos gali būti laikomos inhibuojančiomis (dar žr. IV priedą). Bandymų serijos turi būti pakartotos, jei tai įmanoma, naudojant mažesnę bandomosios medžiagos koncentraciją ir (arba) didesnę užkrato koncentraciją, tačiau ne didesnę kaip 30 mg kietųjų dalelių/litre.

I.6. BENDROSIOS PROCEDŪROS IR PREPARATAI

Bendrosios bandymų sąlygos apibendrintos 2 lentelėje. Prietaisai ir kitos bandymo atlikimo sąlygos, specifiškai susijusios su kiekvienu atskiru bandymu, aprašytos toliau to bandymo aprašyme.

I.6.1. Skiedimo vanduo

Naudojamas dejonizuotas ar distiliuotas vanduo, kuriame nėra inhibuojančios nuodingųjų medžiagų (pvz., Cu²⁺ jonų) koncentracijos. Vandenyje organinės anglies neturi būti daugiau kaip 10% to kiekio, kuris yra bandomojoje medžiagoje. Didelis bandymams skirto vandens grynumas reikalingas tam, kad nesusidarytų didelės tuščiųjų bandinių vertės. Užterštumas gali atsirasti dėl vandeniui būdingų priemaišų ir dėl jonitinių dervų bei bakterijų ir dumblių irimo produktų. Kiekvienai bandymų serijai reikia naudoti tik vienos partijos vandenį, iš anksto patikrintą atliekant IOA analizę. Toks tikrinimas nėra būtinas uždarytos kolbos bandymams, tačiau deguonies suvartojimas vandeniu turi būti mažas.

I.6.2. Pradiniai mineralinių komponentų tirpalai

Paruošiant bandomuosius tirpalus, ruošiami atitinkamų koncentracijų mineralinių komponentų pradiniai tirpalai. IOA išnykimo, modifikuotos OECD atrankos, CO₂ susidarymo, manometrinės respirometrijos, uždarytos kolbos bandymuose galima naudoti tokius pradinius (su skirtingais skiedimo faktoriais) tirpalus.

Skiedimo faktoriai ir specialios mineralinės terpės ruošimas MITI bandymui pateikti konkrečių metodų aprašymuose.

Pradiniai tirpalai:

Paruošiami šie pradiniai tirpalai, naudojamos analiziškai grynos medžiagos.

a) Kalio dihidrofosfatas, KH₂PO₄	8,50 g
kalio hidrofosfatas, K₂HP0₄	21,75 g
natrio hidrofosfatas, dihidratas, Na₂HPO₄ 2H₂O	33,40 g
amonio chloridas, NH₄Cl	0,50 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. Tirpalo pH turi būti 7,4.
b) Kalcio chloridas, bevandenis, CaCl₂	27,50 g
ar kalcio chloridas, dihidratas, CaCl₂ 2 H₂O	36,40 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
c) Magnio sulfatas, heptahidratas, MgSO₄ 7H₂O	22,50 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
d) Geležies (III) chloridas, heksahidratas, FeCl₃ 6 H₂O	0,25 g

Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

Pastaba: jei nenorite ruošti šį tirpalą prieš patį bandymą, vienam tirpalo litrui įlašinkite vieną lašą konc. HCl arba įdėkite 0,4 g etilendiamintetraacto rūgšties (EDTA) dinatrio druskos.

I.6.3. Cheminių medžiagų pradiniai tirpalai

Pavyzdys: dejonizuotame vandenyje ištirpinama 1–10 g, kiek reikia, bandomosios arba etaloninės medžiagos ir skiedžiama iki 1 litro, jei tirpumas didesnis kaip 1 g/l. Kitu būdu pradiniai tirpalai ruošiami mineralinėje terpėje arba cheminė medžiaga dedama tiesiai į mineralinę terpę. Kaip ruošti mažiau tirpias chemines medžiagas, žr. III priedą, tačiau MITI bandyme (F metodas) nei tirpikliai, nei emulsikliai neturi būti naudojami.

I.6.4. Užkratai

Užkratus galima gauti iš įvairių šaltinių: aktyviojo dumblo, nuotekų ištakių (nechloruotų), paviršinio vandens ir dirvožemio ar mišinių iš šių šaltinių. Jei IOA išnykimo, CO₂ susidarymo ir manometrinės respirometrijos bandymams naudojamas aktyvusis dumblas, jis turi būti imamas iš nuotekų valymo įrenginių ar laboratorinių valymo įrenginių, į kuriuos daugiausia patenka buitinės nuotekos. Buvo nustatyta, kad, naudojant užkratus iš kitų šaltinių, rezultatų sklaida didesnė. Modifikuotam OECD atrankos ir uždarytos kolbos bandymui reikia labiau praskiesto užkrato be dumblo dribsnių, todėl labiau pageidautinas šaltinis yra antrinis ištakis iš buitinių nuotekų valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio. MITI bandymui užkratas ruošiamas iš mišinio, sudaryto iš įvairių šaltinių. Jis aprašytas šio specialaus bandymo skyriuje.

I.6.4.1. Užkratas iš aktyviojo dumblo

Iš buitines nuotekas valančio valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio aeravimo tanko surenkamas šviežias aktyviojo dumblo bandinys. Prireikus stambios dalelės pašalinamos, filtruojant per tankų tinklinį filtrą. Toliau dumblas laikomas aerobinėmis sąlygomis.

Arba pašalinamos visos stambios dalelės, leidžiama dumblui nusistoti, arba centrifuguojama (pvz., 10 min veikiant 1100 g). Skystis nuo dumblo nupilamas. Dumblas gali būti plaunamas mineraline terpe. Koncentruotas dumblas suspenduojamas mineralinėje terpėje taip, kad suspenduotų standžių dalelių koncentracija būtų 3–5 g/l, ir aeruojamas iki jo panaudojimo.

Dumblas turi būti imamas iš gerai veikiančio įprastinės technologijos įrenginio. Jei dumblas imamas iš didelio intensyvumo technologijos valymo įrenginio arba jei manoma, kad dumble yra inhibitorių, jis turi būti plaunamas. Gerai sumaišytas, pakartotinai suspenduotas dumblas paliekamas nusistoti arba centrifuguojamas, nuo jo nupilamas skystis ir išplautas dumblas dar kartą suspenduojamas kitame mineralinės terpės tūryje. Šiuos veiksmus reikia kartoti tol, kol bus galima manyti, kad substrato pertekliaus arba inhibitorių neliko.

Prieš pat dumblo panaudojimą paimamas pilnai suspenduoto ar neapdoroto dumblo bandinys suspenduotų standžiųjų dalelių sausai masei nustatyti.

Atliekant kitu būdu, aktyvusis dumblas homogenizuojamas (3–5 g/l suspenduotų kietųjų dalelių). Dumblas maišomas 2 min vidutiniu greičiu mechaniniu maišikliu. Sumaišytas dumblas paliekamas 30 min arba ilgiau, jei to reikia. Dekantuotas skystis bus naudojamas kaip užkratas pagal normą 10 ml/l mineralinės terpės.

I.6.4.2. Kiti užkrato šaltiniai

Užkratą galima gauti iš valymo įrenginio ar laboratorinio valymo įrenginio, apdorojančių daugiausia buitines nuotekas, antrinio ištakio. Paimamas šviežias bandinys ir gabenimo metu laikomas aerobinėmis sąlygomis. Paliekamas nusistoti vieną valandą arba filtruojamas per stambų filtrinį popierių. Dekantuotas ištakis arba filtratas laikomi aerobinėmis sąlygomis, kol bus panaudoti. Vienam litrui mineralinės terpės galima naudoti iki 100 ml šios rūšies užkrato.

Kitas užkrato šaltinis yra paviršinis vanduo. Šiuo atveju paimamas tinkamo paviršinio vandens, pvz., upės, ežero, bandinys ir laikomas aerobinėmis sąlygomis, kol bus panaudotas. Prireikus užkratas koncentruojamas filtravimo arba centrifugavimo būdu.

I.6.5. Užkratų pradinis kondicionavimas

Užkratai gali būti iš anksto kondicionuojami eksperimento sąlygoms, tačiau iš anksto prie bandomosios cheminės medžiagos neadaptuojami. Pradinis kondicionavimas susideda iš aktyviojo dumblo tirpalo mineralinėje terpėje arba antrinio ištakio 5–7 parų trukmės aeravimo bandymo temperatūroje. Kartais pradinis kondicionavimas gerina bandymo metodų tikslumą, nes sumažina tuščiųjų bandinių vertes. Laikoma, kad MITI bandymo užkrato išankstinis kondicionavimas yra būtinas.

I.6.6. Abiotinio skaidymo kontroliniai bandymai

Kai reikia, nustatomas galimas bandomosios medžiagos abiotinis skaidymas, matuojant IOA pašalinimą, deguonies suvartojimą arba anglies dioksido susidarimą steriliuose kontroliniuose bandiniuose be užkrato. Sterilizuojama filtravimu per membraną (0,2–0,45 μm) arba pridedant tinkamos reikiamos koncentracijos nuodingos medžiagos (sterilizavimo agento). Jei naudojamas filtravimas per membraną, sterilumui užtikrinti bandiniai imami steriliai. Jei bandomosios medžiagos adsorbcija nebuvo iš anksto pašalinta, bandymai, kuriuose skaidymas nustatomas, matuojant IOA šalinimą, ypač jei užkratas iš aktyviojo dumblo, turi būti atliekami kartu su abiotinio skaidymo kontroliniu bandymu, į kurį dedamas užkratas ir nuodas (nuodytojas).

I.6.7. Kolbų skaičius

Kolbų skaičius tipiškame bandyme yra nurodytas kiekviename skyriuje su atitinkamo metodo aprašymu.

Galima naudoti tokio tipo kolbas:

bandomoji suspensija: su bandomąja medžiaga ir užkratu;

užkrato tuščiasis bandymas: tik su užkratu;

atlikimo eigos tikrinimo bandymas: su etalonine medžiaga ir užkratu;

abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandymas: sterilus, su bandomąja medžiaga (žr. I.6.6);

adsorbcijos kontrolinis bandymas: su bandomąja medžiaga, užkratu ir sterilizavimo agentu;

toksiškumo kontrolinis bandymas: su bandomąja medžiaga, etalonine medžiaga ir užkratu.

Būtina, kad matavimai bandomojoje suspensijoje ir užkrato tuščiajame bandyme būtų daromi lygiagrečiai. Patartina matavimus ir kitose kolbose taip pat daryti lygiagrečiai.

Tačiau tai ne visuomet įmanoma. Reikia užtikrinti, kad būtų paimtas pakankamas skaičius bandinių arba padaryta matavimų, norint įvertinti pašalinimo procentinę vertę po 10 parų lango.

I.7. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Skaičiuojant skaidymo procentinę vertę, Dt, naudojamos dviejų parametro matavimų vidutinės vertės bandymo ir tuščiojo bandymo su užkratu kolboje. Formulės pateiktos kituose konkrečius bandymus aprašančiuose skyriuose. Skaidymo eiga vaizduojama grafiškai ir pažymimas 10 parų langas. Apskaičiuojama ir pateikiama medžiagos šalinimo, baigiantis 10 parų langui, procentinė vertė ir gulsčiąją kreivės dalį atitinkanti vertė arba bandymo pabaigos vertė, kuri tinka.

Respirometriniuose bandymuose junginiai, savo sudėtyje turintys azoto, gali veikti deguonies suvartojimą dėl nitrifikavimo (žr. II ir V priedus).

I.7.1. Skaidymo nustatymas pagal IOA kiekio matavimą

Skaidymo procentinė vertė, Dt, kiekvieną kartą, kai buvo paimtas bandinys, turi būti skaičiuojama atskirai kolboms su bandomąja medžiaga, naudojant dviejų IOA matavimų vidutines vertes, kad būtų galima įvertinti bandymo validumą (teisėtumą) (žr. I.5.2). Skaidymas skaičiuojamas pagal lygtį:

čia:

Dt = skaidymo% laiku t,

C₀ = vidutinė pradinė DOC koncentracija terpėje su bandomąja medžiaga ir užsėtu užkratu (IOA mg/l),

C_t = vidutinė IOA koncentracija terpėje su bandomąja medžiaga ir užsėtu užkratu laiku t (IOA mg/l),

C_b0 = vidutinė pradinė IOA koncentracija tuščiojo bandinio terpėje su užsėtu užkratu (IOA mg/l),

C_bt = vidutinė IOA koncentracija tuščiojo bandinio terpėje su užsėtu užkratu (IOA mg/l).

Visos koncentracijos nustatomos eksperimentiškai.

I.7.2. Skaidymo nustatymas, darant specifinę analizę

Kai yra specifinės analizės duomenys, pradinis biologinis skaidymas skaičiuojamas pagal formulę:

čia:

D_t = skaidymo% laiku t, paprastai 28 paros,

S_a= likutinis bandomosios medžiagos kiekis terpėje su užkratu bandymo pabaigoje (mg),

S_b = likutinis bandomosios medžiagos kiekis tuščiajame bandinyje su vandeniu (terpe), į kurį buvo įdėta tik bandomoji medžiaga (mg).

I.7.3. Abiotinis skaidymas

Naudojant sterilų kontrolinį bandymą abiotiniam skaidymui nustatyti, abiotinio skaidymo procentinė vertė skaičiuojama pagal formulę:

čia:

C_a(0)= IOA koncentracija steriliame kontroliniame bandyme 0 parą,

C_s(t)= IOA koncentracija steriliame kontroliniame bandyme t parą.

I.8. ATASKAITA

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– bandomoji ir etaloninė cheminė medžiaga, jų grynumas;

– bandymų sąlygos;

– užkratas: prigimtis ir ėmimo vieta (-os), koncentracija ir bet koks pradinis kondicionavimas;

– nuotekose esančių pramoninių nuotekų dalis ir kiekis, jei tai žinoma;

– bandymo trukmė ir temperatūra;

– apdorojimo būdas mažai tirpių cheminių medžiagų atveju;

– taikytas bandymų metodas; būtina moksliškai pagrįsti ir paaiškinti bet kokį metodikos keitimą;

– specifikacija;

– visi pastebėti inhibavimo reiškiniai;

– bet koks pastebėtas abiotinis skaidymas;

– specifinės cheminės analizės duomenys, jei yra;

– analiziniai duomenys apie tarpinius produktus, jei yra;

– bandomosios medžiagos ir etaloninės medžiagos skaidymo procentinės dalies kitimo laike grafikas; turi būti aiškiai nurodyta lag (vėlavimo) fazė, skaidymo fazė, 10 parų langas ir kreivės krypties koeficientas (I priedas). Jei bandymas atitinka validumo kriterijus, grafikui sudaryti galima naudoti skaidymo procentinių verčių vidutines vertes, gautas kolbose su bandomąja medžiaga;

– šalinimo procentinė dalis po 10 parų lango arba kreivės gulsčioje dalyje, arba bandymo pabaigoje.

II dalis. IOA išnykimo bandymas (A metodas)

II.1. metodo esmė

Išmatuotas mineralinės terpės su užkratu ir žinomos koncentracijos bandomąja medžiaga (nuo 10 iki 40 mg/l IOA), kuri nominaliai yra vienintelis organinės anglies šaltinis, tūris yra aeruojamas tamsoje ar išsklaidytoje šviesoje 22 ± 2°C temperatūroje.

Skaidymas sekamas 28 paras, trumpais intervalais atliekant IOA analizę. Biologinio skaidymo laipsnis skaičiuojamas pašalintos IOA koncentraciją (pataisyta dėl IOA koncentracijos užkrato tuščiajame kontroliniame bandinyje) reiškiant pradinės koncentracijos procentine dalimi. Pradinio biologinio skaidymo laipsnį galima skaičiuoti pagal papildomą cheminę analizę, daromą inkubavimo pradžioje ir pabaigoje.

II.2. METODO APRAŠYMAS

II.2.1. Prietaisai

a) Kūginės kolbos, pvz., nuo 250 ml iki 2 litrų, talpa parenkama priklausomai nuo IOA analizei reikalingo tūrio.

b) Mechaninė purtyklė, skirta kūginėms kolboms įstatyti arba su automatiniu termostatavimu, arba naudojama patalpoje su pastovia temperatūra ir pakankamo galingumo, kad visose kolbose galima būtų palaikyti aerobines sąlygas.

c) Filtravimo aparatas su tinkamomis membranomis.

d) IOA analizatorius.

e) Ištirpusio deguonies nustatymo prietaisas.

f) Centrifuga.

II.2.2. Mineralinės terpės ruošimas

Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2.

Sumaišoma 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilama po 1 ml (b)–(d) tirpalų ir skiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro.

II.2.3. Užkrato ruošimas ir pradinis kondicionavimas

Užkratą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyviojo dumblo; nuotekų ištakių; paviršinio vandens; dirvožemio arba mišinių iš šių šaltinių.

Žr. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ir I.6.5.

II.2.4. Kolbų ruošimas

Pavyzdžiui, į atskiras 2 l kūgines kolbas įpilama po 800 ml mineralinės terpės ir pakankamą tūrį bandomosios ir etaloninės medžiagos pradinių tirpalų, kad ekvivalentinė IOA koncentracija būtų 10–40 mg/l. Patikrinama pH vertė ir prireikus nustatoma lygi 7,4. Įdedama į kolbas užkrato iš aktyviojo dumblo arba kito šaltinio (žr. I.6.4), kad galutinė suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija būtų ne didesnė kaip 30 mg/l. Taip pat paruošiamas užkrato tirpalo mineralinėje terpėje kontrolinis bandinys, kuriame nebūtų bandomosios arba etaloninės medžiagos.

Jei reikia, vienas indas naudojamas patikrinti galimam bandomosios medžiagos inhibuojamajam poveikiui, į panašios koncentracijos bandomosios ir etaloninės medžiagų tirpalą mineralinėje terpėje įdėjus užkrato.

Be to, jei reikia, paruošiama dar viena sterili kolba su bandomąja medžiaga be užkrato, kad galėtumėte nustatyti, ar vyksta bandomosios medžiagos abiotinis skaidymas (žr. I.6.6).

Papildomai, jei kyla įtarimas, kad bandomąją medžiagą žymiai adsorbuoja stiklas, dumblas ir t. t., atliekamas parengiamasis įvertinimas galimam adsorbcijos laipsniui nustatyti ir kartu bandymo tinkamumui šiai bandomajai medžiagai (žr. 1 lentelę). Paruošiama kolba su bandomąja medžiaga, užkratu ir sterilizavimo agentu.

Visi tirpalai kolbose skiedžiami mineraline terpe iki 1 l ir, tirpalus sumaišius, iš kiekvienos kolbos paimamas bandinys IOA pradinei koncentracijai nustatyti (žr. II.4 priedą). Kolbų angos uždengiamos, pvz., aliuminio folija, taip, kad tarp kolbos ir ją supančios aplinkos būtų laisvo oro apykaita. Bandymas prasideda įstačius kolbas į purtyklę.

II.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle

1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija

3 ir 4 kolba: užkrato tuščiasis bandymas

5 kolba: procedūros (atlikimo eigos) tikrinimo bandymas

ir pageidautina, kai būtina:

6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandymas

7 kolba: adsorbcijos kontrolinis bandymas

8 kolba: toksiškumo kontrolinis bandymas

Žr. taip pat I.6.7.

II.2.6. Bandymų eiga

Visą bandymo laiką, žinomais laiko tarpais, bet pakankamai dažnai, kad galima būtų nustatyti 10 parų lango pradžią ir šalinimo procentinę vertę 10 parų lango pabaigoje, kiekvienoje kolboje po du kartus nustatoma IOA koncentracija. Imamas tik mažiausias bandomosios suspensijos tūris, būtinas kiekvienam nustatymui.

Jei būtina, prieš imant bandinį, kompensuojami garavimo iš kolbų nuostoliai, įpilant reikiamą kiekį skiedimo vandens (I.6.1). Prieš imant bandinį, reikia gerai sumaišyti kultivuojamą terpę ir užtikrinti, kad prieš bandinio ėmimą ant kolbos sienelių prilipusi medžiaga būtų ištirpinta ar suspenduota. Paėmus bandinį, jis iš karto filtruojamas pro membraninį filtrą arba centrifuguojamas (žr. II.4 priedą). Nufiltruoti arba centrifuguoti bandiniai analizuojami tą pačią dieną arba laikomi 2–4°C temperatūroje ne ilgiau kaip 48 h, jei ilgiau – žemesnėje kaip -18°C temperatūroje.

II.3. DUOMENYS IR ATASKAITA

II.3.1. Rezultatų apdorojimas

Apskaičiuojama skaidymo procentinė vertė laiku t, kaip nurodyta I.7.1 (IOA nustatymas), ir neprivalomai – kaip I.7.2 (specifinė analizė).

Visi rezultatai užrašomi pateiktose specifikacijose.

II.3.2. Rezultatų tinkamumas

Žr. I.5.2.

II.3.3. Ataskaita

Žr. I.8.

II.4. SPECIFIKACIJA

Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.

IOA IŠNYKIMO BANDYMAS

1. LABORATORIJA

2. BANDYMŲ PRADŽIOS DATA

3. BANDOMOJI MEDŽIAGA

Pavadinimas:

Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l, kaip cheminės medžiagos

Pradinė koncentracija terpėje, t0: mg/l, kaip cheminės medžiagos

4. UŽKRATAS

Šaltinis:

Kaip apdorota:

Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:

Suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l

5. ANGLIES NUSTATYMAS

Anglies analizatorius:

3493-28

8. SPECIFINĖ CHEMINĖ ANALIZĖ (neprivaloma)

Bandomosios medžiagos likutinis kiekis bandymo pabaigoje, mg/l

% pirminio skaidymo

Sterilus kontrolinis bandymas

S_b

Bandymo terpė su užkratu

S_a

S^b-S^a

S^b

= Í 100

III dalis. MODIFIkuotas OECD atrankos bandymas (B metodas)

III.1. metodo esmė

Į išmatuotą mineralinės terpės tūrį su žinoma bandomosios medžiagos koncentracija (nuo 10 iki 40 mg/l IOA), kuri nominaliai yra vienintelis organinės anglies šaltinis, įpilama užkrato 0,5 ml 1 l terpės. Mišinys yra aeruojamas tamsoje ar išsklaidytoje šviesoje 22 ± 2°C temperatūroje.

Skaidymas sekamas 28 paras, trumpais intervalais atliekant IOA analizę. Biologinio skaidymo laipsnis skaičiuojamas pašalintos IOA koncentraciją (pataisyta dėl IOA koncentracijos užkrato tuščiajame kontroliniame bandinyje) išreiškiant pradinės koncentracijos procentine dalimi. Pradinio biologinio skaidymo laipsnį galima skaičiuoti pagal papildomą cheminę analizę, daromą inkubavimo pradžioje ir pabaigoje.

III.2. METODO APRAŠYMAS

III.2.1. Prietaisai

a) Kūginės kolbos, pvz., nuo 250 ml iki 2 litrų, talpa parenkama priklausomai nuo IOA analizei reikalingo tūrio.

b) Mechaninė purtyklė skirta kūginėms kolboms įstatyti, kuri būtų arba su automatiniu termostatavimu, arba naudojama patalpoje su pastovia temperatūra, ir pakankamo galingumo, kad visose kolbose galima būtų palaikyti aerobines sąlygas.

c) Filtravimo aparatas su tinkamomis membranomis.

d) IOA analizatorius.

e) Ištirpusio deguonies nustatymo aparatas.

f) Centrifuga.

III.2.2. Mineralinės terpės ruošimas

Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2.

Sumaišoma 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilama po 1 ml (b)–(d) tirpalų ir skiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro.

Šiame metode užkratu naudojama tik 0,5 ml ištakio/litre, ir todėl gali tekti didinti terpės mikroelementų ir augimo faktorių koncentraciją. Tai daroma įpilant po 1 ml kiekvieno šių tirpalų vienam terpės tūrio litrui.

Mikroelementų tirpalas:

Mangano sulfatas, tetrahidratas, MnSO₄ 4H₂O	39,9 mg
Boro rūgštis, H₃BO₃	57,2 mg
Zinko sulfatas, heptahidratas, ZnSO₄ 7H₂O	42,8 mg
Amonio heptamolibdatas (NH₄)₆Mo₇O₂₄	34,7 mg
Fe-chelatas (FeCl₃ ir etilendiamintetraacto rūgštis)	100,0 mg
Ištirpinkite skiedimo vandenyje ir praskieskite juo iki 1000 ml.
Vitaminų tirpalas:
Mielių ekstraktas	15,0 mg

Mielių ekstraktas ištirpinamas 100 ml vandens. Sterilizuojamas filtruojant pro 0,2 μm membraną arba pagaminamas šviežiai.

III.2.3. Užkrato ruošimas ir pradinis kondicionavimas

Užkratas ruošiamas iš nuotekų valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio, valančio daugiausia buitines nuotekas, antrinio ištakio, žr. I.6.4.2 ir I.6.5.

Naudojama 0,5 ml vienam litrui mineralinės terpės.

III.2.4. Kolbų ruošimas

Pavyzdžiui, į atskiras 2 l talpos kūgines kolbas įpilama po 800 ml mineralinės terpės ir toks tūris bandomosios ir etaloninės medžiagos pradinių tirpalų, kad ekvivalentinė IOA koncentracija būtų 10–40 mg/l. Patikrinama pH vertė ir prireikus nustatoma lygi 7,4. Įdedama į kolbas po 0,5 ml/l užkrato iš nuotekų ištakio (žr. I.6.4.2). Taip pat paruošiamas užkrato mineralinėje terpėje kontrolinis tirpalas, kuriame nebūtų bandomosios arba etaloninės medžiagos.

Jei reikia, vienas indas naudojamas patikrinti galimam bandomosios medžiagos inhibuojamajam veikimui, į panašios koncentracijos bandomosios ir etaloninės medžiagų tirpalą mineralinėje terpėje įdedamas užkratas.

Be to, jei reikia, paruošiama dar viena sterili kolba su bandomąja medžiaga be užkrato, kad galima būtų nustatyti, ar vyksta bandomosios medžiagos abiotinis skaidymas (žr. I.6.6).

Visi tirpalai kolbose skiedžiami mineraline terpe iki 1 l, išmaišomi ir iš kiekvienos kolbos paimamas bandinys IOA pradinei koncentracijai nustatyti (žr. II.4 priedą). Kolbų angos uždengiamos, pvz., aliuminio folija, taip, kad tarp kolbos ir ją supančios aplinkos būtų laisvo oro apykaita. Tuomet bandymui pradėti kolbos įstatomos į purtyklę.

III.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle

1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija

3 ir 4 kolba: sėjimo kultūros tuščiasis bandymas

5 kolba: procedūros tikrinimo bandymas

ir, pageidautina, kai būtina:

6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandymas

7 kolba: adsorbcijos kontrolinis bandymas

8 kolba: toksiškumo kontrolinis bandymas

Žr. taip pat I.6.7.

III.2.6. Bandymų eiga

Visą bandymą žinomais laiko intervalais, bet pakankamai dažnai, kad galima būtų nustatyti 10 parų lango pradžią ir procentinę šalinimo vertę 10 parų lango pabaigoje, nustatoma IOA koncentracija kiekvienoje kolboje po du kartus. Imamas tik minimalus kiekvienam nustatymui būtinas bandomosios suspensijos tūris.

Jei būtina, prieš imant bandinį, kompensuojami garavimo iš kolbų nuostoliai, įpilant reikiamą kiekį skiedimo vandens (I.6.1). Prieš imant bandinį, gerai sumaišoma kultūros terpė ir užtikrinama, kad prieš bandinio ėmimą ant kolbos sienelių prilipusi medžiaga būtų ištirpinta ar suspenduota. Paėmus bandinį, jis iš karto filtruojamas pro membraninį filtrą ar centrifuguojamas (žr. II.4 priedą). Nufiltruoti ar centrifuguoti bandiniai analizuojami tą pačią dieną arba laikomi 2–4°C temperatūroje ne ilgiau kaip 48 h, jei ilgiau – žemesnėje kaip -18°C temperatūroje.

III.3. DUOMENYS IR ATASKAITA

III.3.1. Rezultatų apdorojimas

Apskaičiuojama skaidymo procentinė vertė laiku t, kaip nurodyta I.7.1 (IOA nustatymas), ir neprivalomai, kaip nurodyta I.7.2 (specifinė analizė).

Visi rezultatai užrašomi pateiktose specifikacijose.

III.3.2. Rezultatų validumas (teisėtumas)

Žr. I.5.2.

III.3.3. Ataskaita

Žr. I.8.

III.4. SPECIFIKACIJA

Žemiau pateiktas specifikacijos pavyzdys.

MODIFIKUOTAS OECD ATRANKOS BANDYMAS

1. LABORATORIJA

2. BANDYMO PRADŽIOS DATA

3. BANDOMOJI MEDŽIAGA

Pavadinimas:

Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l, kaip cheminės medžiagos

Pradinė koncentracija terpėje, t0: mg/l, kaip cheminės medžiagos

4. UŽKRATAS

Šaltinis:

Kaip apdorota:

Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:

Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l

5. ANGLIES NUSTATYMAS

Anglies analizatorius:

7. ABIOTINIO SKAIDYMO KONTROLINIS BANDYMAS (neprivalomas)

	Trukmė (paros)
	0	t
Sterilus kontrolinis bandymas, IOA koncentracija (mg/l)	C_s(0)	C_s(t)

8. SPECIFINĖ CHEMINĖ ANALIZĖ (neprivaloma)

Bandomosios medžiagos likutinis kiekis bandymo pabaigoje, mg/l

% pirminio skaidymo

Sterilus kontrolinis bandymas

S_b

Bandymo terpė su užkratu

S_a

S^b-S^a

S^b

= Í 100

IV dalis. CO₂ SUSiDArymo bandymas (C metodas)

IV.1. metodo esmė

Žinomas mineralinės terpės su užkratu tūris, kuriame kaip vienintelis nominalus organinės anglies šaltinis yra žinomos koncentracijos bandomoji cheminė medžiaga (10–20 mg IOA/l arba BOA/l), tamsoje ar išsklaidytoje šviesoje yra aeruojamas, reguliuojamu greičiu barbotuojant anglies dioksido neturintį orą. Skaidymas stebimas 28 paras, nustatant susidariusio anglies dioksido kiekį, sugeriamo bario arba natrio hidroksidu, kuris matuojamas titruojant likusį hidroksido kiekį arba kaip neorganinė anglis. Iš bandomosios cheminės medžiagos susidariusio anglies dioksido kiekis (pataisytas atimant anglies dioksido, susidariusio tuščiajame bandinyje su sėjimo kultūra, kiekį) yra skaičiuojamas kaip procentinė TCO₂ vertė. Kitu būdu biologinio skaidymo laipsnį galima skaičiuoti nustatant papildomą IOA kiekį inkubavimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje.

IV.2. METODO APRAŠYMAS

IV.2.1. Aparatūra

a) 2–5 litrų talpos kolbos, kiekviena su aeravimo vamzdeliu, siekiančiu beveik indo dugną, ir išleidimo anga.

b) Magnetiniai maišikliai, kai vertinamos mažai tirpios cheminės medžiagos.

c) Dujų sugėrimo kolbos.

d) Įtaisas reguliuoti ir matuoti oro srautą.

e) Prietaisas anglies dioksidui išplauti, kuriuo ruošiamas oras, neturintis anglies dioksido; pagal kitą būdą galima naudoti iš balionų tiekiamu CO₂ neturinčio deguonies ir CO₂ neturinčio azoto mišinį, dujas maišant teisingu santykiu (20% O₂: 80% N₂).

f) Įtaisas anglies dioksidui nustatyti titravimo būdu arba kokio nors tipo neorganinės anglies analizatorius.

g) Membraninio filtravimo įtaisas (neprivalomas).

f) IOA analizatorius (neprivalomas).

IV.2.2. Mineralinės terpės ruošimas

Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2.

Sumaišoma 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilama po 1 ml (b)–(d) tirpalų ir skiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro.

IV.2.3. Užkrato ruošimas ir pradinis kondicionavimas

Užkratą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyviojo dumblo; nuotekų ištakių; paviršinio vandens; dirvožemio ar mišinių iš šių šaltinių.

Žr. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ir I.6.5.

IV.2.4. Kolbų ruošimas

Kaip pavyzdys, žemiau nurodomi tūriai ir masės 5 litrų kolboms su 3 l suspensijos. Jei naudojami mažesni tūriai, atitinkamai keičiami kiekiai, tačiau reikia užtikrinti, kad būtų galima tiksliai išmatuoti susidariusio anglies dioksido kiekį.

Į kiekvieną 5 litrų kolbą įpilama 2400 ml mineralinės terpės. Įpilamas atitinkamas tūris paruošto aktyviojo dumblo (žr. I.6.4.1 ir I.6.5), kad suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija mišinio su užkratu galutiniame 3 l tūryje būtų ne didesnė kaip 30 mg/l. Kitas būdas, kai paruoštas dumblas iš pradžių skiedžiamas mineralinėje terpėje, paruošiant 500–1000 mg/l suspensiją, po to kartotinis šios suspensijos tūris pilamas į 5 litrų kolbos turinį, kad koncentracija būtų 30 mg/l; tai užtikrina didesnį preciziškumą. Galima naudoti kitus užkrato šaltinius (žr. I.6.4.2).

Per naktį šie mišiniai su užkratu aeruojami CO₂ neturinčiu oru, kad iš sistemos būtų išvalytas anglies dioksidas.

Į vienas lygiagrečiam bandymui skirtas kolbas atskirai įpilami bandomosios ir etaloninės medžiagų žinomi pradinių tirpalų tūriai taip, kad, įdėjus šių medžiagų, būtų gautos nuo 10 iki 20 mg IOA/l arba BOA/l koncentracijos; į kitas kolbas šių medžiagų nededama ir šios kolbos naudojamos kaip užkrato kontroliniai bandymai. Mažai tirpios medžiagos dedamos tiesiai į kolbas pagal masę arba tūrį arba daroma, kaip aprašyta III priede.

Jei reikia, viena kolba naudojama bandomosios medžiagos galimam inhibuojamajam veikimui tikrinti, į ją įdedama ir bandomosios, ir etaloninės medžiagų, kurių koncentracija turi būti tokia pat, kaip ir kitose kolbose.

Be to, jei reikia patikrinti, ar nevyksta bandomosios cheminės medžiagos abiotinis skaidymas, reikia turėti sterilią kolbą su bandomąja chemine medžiaga be užkrato (žr. I.6.6). Sterilizuojama įdėjus atitinkamos koncentracijos nuodingos medžiagos (sterilizavimo agento).

Suspensijos visose kolbose skiedžiamos iki 3 l. Įpilama mineralinės terpės, kuri prieš tai buvo aeruojama CO2 neturinčiu oru. Neprivaloma, bet galima paimti bandinius IOA analizei (žr. II.4 priedą) ir specifinei analizei. Prie kolbų oro išleidimo angų prijungiamos dujų sugėrimo kolbos.

Jei naudojamas bario hidroksidas, prie kiekvienos 5 l kolbos nuosekliai prijungiama po tris dujų sugėrimo kolbas, kurių kiekvienoje turi būti 100 ml 0,0125 M bario hidroksido tirpalo. Tirpale neturi būti sulfato ir karbonato nuosėdų ir jo koncentracija turi būti nustatyta prieš pat tirpalo naudojimą. Jei naudojamas natrio hidroksidas, jungiamos dvi gaudyklės, antroji turi būti kontrolinė, siekiant parodyti, kad visas anglies dioksidas buvo absorbuotas pirmoje gaudyklėje. Tinka dujų sugėrimo kolbos, uždarytos serumo butelių kamščiais. Į kiekvieną kolbą įpilama 200 ml 0,05 M natrio hidroksido tirpalo, kurio pakanka sugerti visą kiekį anglies dioksido, susidariusio visiškai suskaidant bandomąją medžiagą. Natrio hidroksido tirpalas, net šviežiai paruoštas, turi karbonatų pėdsakų; pataisa padaroma, atimant tuščiajame bandinyje susidariusio karbonato kiekį.

IV.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle

1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija

3 ir 4 kolba: užkrato tuščiasis bandymas

5 kolba: procedūros (atlikimo eigos) tikrinimo bandymas

ir, pageidautina, kai būtina:

6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandymas

7 kolba: toksiškumo kontrolinis bandymas

Žr. taip pat I.6.7.

IV.2.6. Bandymų eiga

Bandymas pradedamas pro suspensiją barbotuojant 30–100 ml/min oro srautą be CO₂. CO₂ nustatyti periodiškai imami anglies dioksido absorbento bandiniai. Norint identifikuoti 10 parų lango periodą, rekomenduojama pirmąsias dešimt dienų analizę daryti kas antrą arba trečią dieną, o po to iki 28 paros – kas penktą dieną.

28 parą imami bandiniai (neprivalomai) IOA ir (arba) specifinei analizei, išmatuojamos suspensijų pH vertės ir į kiekvieną kolbą įpilama po 1 ml koncentruotos druskos rūgšties; aeruojama per naktį, kad iš bandomųjų suspensijų būtų pašalintas anglies dioksidas. 29 parą atliekama paskutinė išsiskyrusio anglies dioksido analizė.

CO2 matavimo dieną atjungiamas arčiausiai kolbos prijungtas absorberis su bario hidroksidu, ir bario hidroksido tirpalas titruojamas 0,05 M HCl tirpalu, indikatoriumi naudojamas fenolftaleinas. Likusieji absorberiai perkeliami per vieną vietą arčiau kolbos ir kitame nuosekliai sujungtų absorberių gale prijungiamas naujas absorberis su 100 ml šviežio 0,0125 M bario hidroksido. Titruojama, kai tai būtina, pvz., kai pirmojoje gaudyklėje matyti daug nuosėdų, bet jų dar nėra antroje, arba bent kartą per savaitę. Iš kitos pusės, jei absorbentu naudojamas NaOH, švirkštu iš arčiau kolbos stovinčio absorberio paimamas nedidelis natrio hidroksido tirpalo bandinys (tai priklauso nuo naudojamo anglies analizatoriaus charakteristikų). Bandinys turi būti purškiamas inžektoriumi į anglies analizatoriaus neorganinės anglies reakcinį indą (NA dalį), kad galima būtų tiesiogiai nustatyti išsiskyrusį anglies dioksidą.

Antrosios gaudyklės turinys analizuojamas tik bandymo pabaigoje, kad būtų galima padaryti pataisą dėl galimo anglies dioksido išnešimo.

IV.3. DUOMENYS IR ATASKAITA

IV.3.1. Rezultatų apdorojimas

Absorberyje sugerto CO₂ kiekis nustatomas pagal tokią titravimo formulę:

mg CO₂ = (100 × C_B – 0,5 × V × C_A) × 44

čia:

V = 100 ml absorberio turinio titruoti sunaudotos HC1 tūris (ml),

C_B = bario hidroksido tirpalo koncentracija (M),

C_A = druskos rūgšties tirpalo koncentracija (M),

jei C_B lygi 0,0125 M ir C_A lygi 0,05 M, 100 ml bario hidroksido tirpalui titruoti reikia 50 ml, ir CO₂ masė nustatoma pagal lygtį:

× 44 × ml HC1 sunaudoto titravimui = 1,1 × ml HC1

Taigi šiuo atveju titravimui sunaudoto HC1 tūrio perskaičiavimo į susidariusio CO₂ mg daugiklis yra 1,1.

Naudojant atitinkamas titravimo vertes, apskaičiuojamos vien iš užkrato bei iš užkrato ir bandomosios cheminės medžiagos gautos CO₂ masės, ir šių masių skirtumas yra masė CO₂, susidariusio vien tik iš bandomosios cheminės medžiagos.

Pavyzdžiui, jei užkrato bandinio titravimas duoda 48 ml, o užkrato ir bandomosios cheminės medžiagos bandinio titravimas duoda 45 ml,

CO₂ iš užkrato = 1,1 × (50-48) = 2,2 mg

CO₂ iš užkrato ir bandomosios cheminės medžiagos = 1,1 x (50-45) = 5,5 mg

taigi iš bandomosios cheminės medžiagos susidariusio CO₂ masė lygi 3,3 mg.

Procentinė biologinio skaidymo vertė skaičiuojama pagal formulę:

arba

3,67 yra anglies masės perskaičiavimo į anglies dvideginio masę (44/12) daugiklis.

Skaidymo po bet kurio laiko intervalo procentinė vertė gaunama pridedant procentines TCO2 vertes, apskaičiuotas kiekvienai parai, iki to laiko, kuriuo jis buvo išmatuotas.

Absorberiams su natrio hidroksidu susidariusio anglies dioksido kiekis, išreikštas NA(mg), skaičiuojamas dauginant NA koncentraciją absorbente iš absorbento tūrio.

Procentinė skaidymo vertė skaičiuojama pagal:

NA kolboje su bandomąja medžiaga (mg) – NA kolboje su tuščiuoju bandiniu (mg)

Apskaičiuojamas IOA šalinimas (neprivaloma), kaip aprašyta I.7. Užrašomi šie ir visi kiti rezultatai pridėtose specifikacijose.

IV.3.2. Rezultatų validumas (teisėtumas)

Bandomosios cheminės medžiagos suspensijos mineralinėje terpėje NA kiekis bandymo pradžioje turi būti mažesnis kaip 5% BA, ir tuščiajame bandinyje bandymo pabaigoje viso išsiskyrusio CO₂ kiekis paprastai neturi būti didesnis kaip 40 mg/l terpės. Jei gaunamos didesnės kaip 70 mg CO₂/litre vertės, duomenys ir eksperimento atlikimo eiga turi būti kritiškai ištirti.

Žr. taip pat I.5.2.

IV.3.3. Ataskaita

Žr. I.8.

IV.4. SPECIFIKACIJA

Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.

ANGLIES DIOKSIDO SUSIDARYMO BANDYMAS

1. LABORATORIJA

2. BANDYMO PRADŽIOS DATA

3. BANDOMOJI MEDŽIAGA

Pavadinimas:

Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l, kaip cheminės medžiagos

Pradinė koncentracija terpėje: mg/l, kaip cheminės medžiagos

Bendrasis į kolbą įdėtos C kiekis: mg C

TCO₂: mg CO₂

4. UŽKRATAS

Šaltinis:

Kaip apdorota:

Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:

Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l

5. ANGLIES DIOKSIDO SUSIDARYMAS IR SKAIDOMUMAS

Metodas: Ba(OH)₂/NaOH/kitas

6. ANGLIES ANALIZĖ (neprivaloma)

Anglies analizatorius:

Laikas (paros)	Tuščiasis bandinys, mg/l	Bandomoji cheminė medžiaga, mg/l
0	C_b(0)	C₀
28*	C_b(t)	C₁
* ar inkubavimo pabaigoje

7. ABIOTINIS SKAIDYMAS (neprivalomas)

v dalis. MANOMETRInis RESPIROMETRinis bandymas (D metodas)

V. I. METODO ESMĖ

Išmatuotas mineralinės terpės su užkratu tūris, turintis žinomos koncentracijos bandomąją cheminę medžiagą (100 mg/litre bandomosios medžiagos, duodančios ne mažiau kaip 50–100 mg TDS/litre), kuri nominaliai yra vienintelis organinės anglies šaltinis, pastovioje temperatūroje (± 1oC ar tiksliau) maišomas graduotoje kolboje iki 28 parų. Deguonies suvartojimas nustatomas arba matuojant deguonies (elektrolitiškai pagaminto) kiekį, kurio reikia pastoviam dujų tūriui respirometro kolboje palaikyti, arba pagal tūrio arba slėgio (arba abiejų kartu) kitimą aparate. Išsiskyręs anglies dioksidas sugeriamas kalio hidroksido tirpalu ar kitu tinkamu absorbentu. Bandomąja chemine medžiaga suvartoto deguonies kiekis (darant pataisą deguonies kiekiui, suvartotam lygiagrečiai daromame tuščiajame bandyme su užkratu) yra reiškiamas procentine TDS arba ChDS verte. Neprivalomai iš papildomos specifinės analizės, kuri atliekama bandymo pradžioje ir pabaigoje, duomenų galima apskaičiuoti pirminį biologinį skaidymą, o darant IOA analizę, – biologinį suskaidymą.

V.2. METODO APRAŠYMAS

V.2.1. Aparatūra

a) tinkamas respirometras;

b) termostatas, palaikantis temperatūrą ± 1°C tikslumu;

c) membraninio filtravimo įrenginys (neprivalomas);

d) anglies analizatorius (neprivalomas).

V.2.2. Mineralinės terpės ruošimas

Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2.

Sumaišoma 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilama po 1 ml (b)–(d) tirpalų ir praskiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro.

V.2.3. Užkrato ruošimas ir pradinis kondicionavimas

Užkratą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyviojo dumblo; nuotekų ištakių; paviršinio vandens; dirvožemio ar mišinių iš šių šaltinių.

Žr. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ir I.6.5.

V.2.4. Kolbų ruošimas

Pradinius tirpalus skiedžiant mineraline terpe, paruošiamos atskiros serijos bandomosios ir etaloninės cheminių medžiagų tirpalų, kuriuose šių medžiagų koncentracija turėtų būti 100 mg/litre (kad TDS būtų ne mažiau kaip 50–100 mg/litre).

TDS skaičiuojamas pagal amonio druskų susidarymą, jei nesitikima nitrifikavimo, kada skaičiuoti reikia pagal nitratų susidarymą (žr. II.2 priedą).

Pamatuojamos pH vertės ir prireikus nustatoma 7,4 ± 0,2 vertė.

Mažai tirpios medžiagos turi būti pridedamos vėlesniame etape (žr. žemiau).

Jei reikia nustatyti bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą, ruošiamas dar vienas tirpalas mineralinėje terpėje, kuriame būtų ir bandomoji, ir etaloninė medžiaga tokios koncentracijos, kokios yra atskiruose tirpaluose.

Jei reikia matuoti fizikocheminį deguonies suvartojimą, ruošiamas bandomosios cheminės medžiagos tirpalas, paprastai 100 mg TDS/litre, kuris buvo sterilizuotas pridedant tinkamos nuodingos medžiagos (sterilizavimo agento) (žr. I.6.6.).

Bandomosios ir etaloninės medžiagų reikiami tirpalų tūriai įpilami atitinkamai bent į dvi kolbas. Į kitas kolbas įpilama tik mineralinės terpės (užkrato kontroliniai bandymai) ir, jei reikia, maišyto bandomosios ir etaloninės cheminių medžiagų tirpalo ir sterilaus tirpalo.

Jei bandomoji medžiaga mažai tirpi, dėkite jos pagal masę arba tūrį tiesiai šioje pakopoje arba apdorokite, kaip aprašyta III priede. Į CO₂ – absorberio sekcijas įpilkite kalio hidroksido, natrio kalkių granulių ar kito absorbento.

V.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle

1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija

3 ir 4 kolba: užkrato tuščiasis bandymas

5 kolba: procedūros (atlikimo eigos) tikrinimo bandymas

ir, pageidautina, kai būtina:

6 kolba: sterilus kontrolinis bandymas

7 kolba: toksiškumo kontrolinis bandymas

Žr. taip pat I.6.7.

V.2.6. Bandymų eiga

Leidžiama kolboms pasiekti tinkamą temperatūrą ir į atitinkamas kolbas įdedama tiek užkrato iš paruošto aktyviojo dumblo arba kitokio jo šaltinio, kad suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija būtų ne didesnė kaip 30 mg/litre. Surenkama įranga, įjungiamas maišiklis, patikrinamas hermetiškumas ir pradedama matuoti deguonies suvartojimą. Paprastai toliau prižiūrėti nereikia, išskyrus tai, kad užrašomi būtini rodmenys ir daromi kasdieniniai patikrinimai, ar teisinga temperatūra ir atitinkamas maišymas.

Pagal dažnai ir reguliariais tarpais užrašomus rodmenis skaičiuojamas deguonies suvartojimas (taikomi įrangos gamintojo nurodyti metodai). Inkubavimo pabaigoje, paprastai po 28 parų, matuojamas kolbų tūrinio pH, ypač jei deguonies suvartojimas yra mažas arba didesnis nei TDSNH (azoto turintiems junginiams).

Jei reikia, bandymo pradžioje ir pabaigoje iš respirometrinių kolbų imami bandiniai IOA analizei arba specifinei cheminei analizei (žr. II.4 priedą). Imant bandymo pradžioje, reikia užtikrinti, kad kolboje likusios bandomosios suspensijos tūris būtų žinomas. Kai deguonį vartoja azoto turinti bandomoji medžiaga, nustatomas nitrito ir nitrato koncentracijų didėjimas per 28 paras ir apskaičiuojama pataisa dėl deguonies, suvartoto nitrifikavimui (V priedas).

V.3. DUOMENYS IR ATASKAITA

V.3.1. Rezultatų apdorojimas

Padalijamas kiekis (mg) deguonies, suvartoto bandomajai cheminei medžiagai per tam tikrą laiką (pataisytą kiekiu deguonies, suvartoto per tą patį laiką tuščiajame užkrato bandinyje) iš paimtos bandomosios cheminės medžiagos masės. Taip gaunamas BDS, skaičiuojamas mg deguonies/mg bandomosios cheminės medžiagos, taigi:

biologinio skaidymo procentinė vertė skaičiuojama pagal:

arba pagal:

Reikia pažymėti, kad šie du metodai nebūtinai duoda tą pačią vertę; geriau naudoti pirmąjį metodą.

Azoto turinčioms medžiagoms naudojamos atitinkamos TDS vertės (NH ar NO pagal tai, kas yra žinoma apie nitrifikavimo galimybę ar ko iš jo laukiama (II.2 priedas). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisos nitrifikuoti suvartotam deguoniui turi būti skaičiuojamos pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (V priedas).

Kai atliekama neprivaloma organinės anglies ir (arba) specifinė analizė, apskaičiuojama skaidymo procentinė vertė, kaip tai aprašyta I.7.

Visi rezultatai užrašomi į pridedamas specifikacijas.

V.3.2. Rezultatų validumas (teisėtumas)

Paprastai deguonies suvartojimas sėjimo kultūros tuščiajame bandinyje per 28 paras yra 20–30 mg O2/litre ir neturi būti didesnis kaip 60 mg/litre. Jei vertės didesnės kaip 60 mg/litre, būtina kritiškai ištirti duomenis ir eksperimento atlikimo eigą. Jei pH vertė nepatenka į 6–8,5 intervalą, o bandomoji medžiaga deguonies suvartoja mažiau kaip 60%, bandymas turi būti pakartotas su mažesne bandomosios medžiagos koncentracija.

Žr. I.5.2.

V.3.3. Ataskaita

Žr. I.8.

V.4. SPECIFIKACIJA

Toliau pateikiamas specifikacijos pavyzdys.

MANOMETRINĖS RESPIROMETRIJOS BANDYMAS

1. LABORATORIJA

2. BANDYMO PRADŽIOS DATA

3. BANDOMOJI MEDŽIAGA

Pavadinimas:

Pradinio tirpalo koncentracija: mg/litre

Pradinė koncentracija terpėje, C0: mg/litre

Tūris bandymų kolboje (V): ml

TDS arba ChDS: mg O2/mg bandomosios medžiagos (NH ar NO)

4. UŽKRATAS

Šaltinis:

Kaip apdorota:

Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:

Suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l

5. DEGUONIES SUVARTOJIMAS: BIOLOGINIS SKAIDOMUMAS

3493-38

6. PATAISA DĖL NITRIFIKAVIMO (žr. V priedą)

	Para	0	28	Skirtumas
(i)	Nitrato koncentracija (mg N/litre)			(N)
(ii)	Deguonies ekvivalentas (4,57 × N × V) (mg)	–	–
(iii)	Nitrito koncentracija (mg N/litre)			(N)
(iv)	Deguonies ekvivalentas (3,43 × N × V) (mg)	–	–
(ii + iv)	Bendrasis deguonies ekvivalentas	–	–

7. ANGLIES ANALIZĖ (neprivaloma)

Anglies analizatorius:

Laikas (paros)	Tuščiasis bandinys, mg/l	Bandomoji cheminė medžiaga, mg/l
0	C_b(0)	C₀
28*	C_b(t)	C₁
* ar inkubavimo pabaigoje

8. SPECIFINĖ CHEMINĖ ANALIZĖ (neprivaloma)

Bandomosios medžiagos likutinis kiekis bandymo pabaigoje, mg/l

% pirminio skaidymo

Sterilus kontrolinis bandymas

Bandymo terpė su užkratu

S^b-S^a

S^b

= Í 100

Sb = koncentracija po fizikocheminių pakitimų (steriliame) kontroliniame bandyme po 28 parų.

Sa = koncentracija kolboje su užkratu po 28 parų.

9. ABIOTInis skaidymas (neprivalomas)

a = deguonies suvartojimas steriliose kolbose po 28 parų, (mg)

deguonies suvartojimas mg bandomosios cheminės medžiagos =. (žr. 1 ir 3 skyrius)

VI dalis. uždarytos kolbos bandymas (E metodas)

VI.1. BANDYMŲ METODO ESMĖ

Į bandomosios cheminės medžiagos tirpalą mineralinėje terpėje, paprastai 2–5 mg/litre, įnešamas užkratas, turintis palyginti mažai mikroorganizmų iš mišrios populiacijos, ir laikomas tamsoje, visiškai pilnose ir uždarytose kolbose pastovios temperatūros sąlygomis. Skaidymas sekamas 28 paras, analizuojant ištirpusį deguonį. Bandomąja medžiaga suvartotas deguonies kiekis, padarius pataisą deguoniui, suvartotam lygiagrečiai daromame tuščiajame bandyme tik su užkratu, yra išreiškiamas procentine TDS arba ChDS verte.

VI.2. METODO APRAŠYMAS

Vl.2.1. Aparatūra

a) BDS kolbos, su šlifo kamščiais, pvz., 250–300 ml.

b) Vandens vonia arba inkubatorius kolboms laikyti pastovioje temperatūroje (± 1°C) ir be apšvietimo.

c) Didelės stiklinės kolbos (2–5 litrų) terpei ruošti ir BDS kolboms pildyti.

d) Deguonies elektrodas ir matuoklis arba įranga ir reagentai titruoti Winkler’io metodu.

VI.2.2. Mineralinės terpės ruošimas

Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2.

Sumaišoma po 1 (vieną) ml (a)–(d) tirpalų ir praskiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro.

VI.2.3. Užkrato ruošimas

Užkratas paprastai gaunamas iš nuotekų valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio, į kuriuos daugiausia patenka buitinės nuotekos, antrinio ištakio. Alternatyvus užkrato šaltinis yra paviršinis vanduo. Paprastai 1 litrui terpės naudojama nuo vieno lašo (0,05 ml) iki 5 ml filtrato; gali tekti daryti bandymus, kad būtų nustatytas tam tikram ištakiui optimalus tūris (žr. I.6.4.2 ir I.6.5).

VI.2.4. Kolbų ruošimas

Mineralinė terpė stipriai aeruojama ne mažiau kaip 20 min. Kiekviena bandymų serija daroma su mineraline terpe, pagaminta vienoje partijoje. Paprastai terpė yra tinkama naudoti po 20 h laikymo bandymo temperatūroje. Kontrolės tikslams nustatoma ištirpusio deguonies koncentracija; jo vertė 20°C temperatūroje turi būti apie 9 mg/litre. Visi oru prisotintos terpės pernešimo ir užpildymo veiksmai turi būti daromi taip, kad nesusidarytų oro burbuliukai, pvz., naudojami sifonai.

Lygiagrečiai paruošiamos BDS kolbų grupės bandomajai ir etaloninei cheminei medžiagai nustatyti, tuo pat metu daromų bandymų serijose. Paruošiamas būtinas skaičius BDS kolbų, įskaitant kolbas tuščiajam bandymui su užkratu, kad galima būtų atlikti ne mažiau kaip po du deguonies suvartojimo matavimus tinkamais laiko tarpais, pvz., po 0, 7, 14, 21 ir 28 parų. Norint užtikrinti galimybę identifikuoti 10 parų langą, kolbų gali reikėti ir daugiau.

Į dideles kolbas įpilama visiškai aeruotos mineralinės terpės, kad ji užimtų maždaug trečdalį kolbos tūrio. Tuomet į atskiras dideles kolbas įpilamas reikiamas kiekis bandomosios ir etaloninės cheminių medžiagų pradinių tirpalų taip, kad galutinė cheminių medžiagų koncentracija būtų ne didesnė kaip 10 mg/litre. Į kolbą su tuščiojo kontrolinio bandinio terpe cheminių medžiagų nededama.

Norint užtikrinti, kad užkrato aktyvumas nebūtų ribojamas, deguonies koncentracija BDS kolbose neturi sumažėti daugiau kaip iki 0,5 mg/litre. Tai nustato maždaug 2 mg/litre bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos ribą. Tačiau sunkiai skaidomų junginių ir tų junginių, kurių TDS mažas, koncentracija gali būti 5–10 mg/litre. Kai kuriais atvejais reikia daryti lygiagrečias bandymų serijas su dviem bandomosios cheminės medžiagos koncentracijomis, pvz., 2 ir 5 mg/litre. Paprastai TDS skaičiuojama remiantis amonio druskų susidarymu, tačiau, jei manoma arba žinoma, kad gali vykti nitrifikavimas, skaičiuojama remiantis nitrato susidarymu (TDSNO3: žr. II.2 priedą). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisos nitrifikuoti suvartotam deguoniui skaičiuojamos pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (V priedas).

Jei turi būti ištirtas bandomosios medžiagos toksiškumas (pvz., jei anksčiau buvo nustatytos mažos biologinio skaidomumo vertės), reikia turėti dar vieną kolbų seriją.

Paruošiama dar viena didelė kolba, kurioje būtų aeruota mineralinė terpė (maždaug trečdalis kolbos tūrio) ir bandomoji bei etaloninė cheminės medžiagos, kurių galutinė koncentracija būtų tokia pati, kaip ir kitose didelėse kolbose.

Į tirpalus didelėse kolbose įpilama užkrato iš antrinio ištakio (nuo vieno lašo arba apie 0,05 ml iki 5 ml/litre) arba iš kito šaltinio, pvz., upės vandens (žr. I.6.4.2). Pabaigoje tirpalai skiedžiami aeruota mineraline terpe iki žymės ant kolbos, naudojant į jos dugną nuleistą žarną, kad būtų pasiektas pakankamas maišymas.

VI.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle

Tipiškame bandyme naudojamos tokios kolbos:

ne mažiau kaip 10 su bandomąja chemine medžiaga ir užkratu (bandomoji suspensija),

ne mažiau kaip 10 tik su užkratu (tuščiasis užkrato bandymas),

ne mažiau kaip 10 su etalonine chemine medžiaga ir užkratu (procedūros tikrinimo bandymas),

ir, jei būtina,

6 kolbos su bandomąja chemine medžiaga, etalonine chemine medžiaga ir užkratu (toksiškumo kontrolinis bandymas).

Tačiau, norint užtikrinti galimybę įdentifikuoti 10 parų langą, kolbų reikėtų maždaug du kartus daugiau.

VI.2.6. Bandymų eiga

Naudojant žarną, nuleistą į apatinį atitinkamos didelės kolbos ketvirtį (ne į dugną), iš karto išpilstomas kiekvienas paruoštas tirpalas į atitinkamą BDS kolbų grupę, taip kad visos BDS kolbos būtų visiškai užpildytos. Kolbos švelniai patapšnojamos, kad būtų pašalinti visi oro burbuliukai. Taikant Winkler’io arba elektrometrinį metodą, kolbose nustatoma pradinė deguonies koncentracija. Kolbų turinį galima išsaugoti vėlesnei analizei Winkler’io metodu, pridedant mangano (II) sulfato ir natrio hidroksido (pirmasis Winkler’io reagentas). Gerai užkimštos kolbos su deguonimi, surištu į rudą mangano (III) hidratuotą oksidą, laikomos tamsoje 10–20°C temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas, prieš darant likusius veiksmus pagal Winkler’io metodą. Likusios lygiagrečiai paruoštos kolbos užkemšamos taip, kad į jas nepatektų oro burbuliukų, ir inkubuojamos tamsoje 20°C temperatūroje. Kiekvieną seriją turi lydėti pilna lygiagreti serija, skirta tuščiojo bandinio terpės su užkratu analizei. Paimama iš kiekvienos serijos ne mažiau kaip po dvi kolbas ištirpusio deguonies analizei tam tikrais laiko tarpais (bent kas savaitę) per 28 inkubavimo paras.

Savaitiniai bandiniai turi leisti įvertinti šalinimo procentinę vertę 14 parų lange, tuo tarpu bandinių analizė kas 3–4 paras turi leisti identifikuoti 10 parų langą, o tam reikėtų maždaug du kartus daugiau kolbų.

Azoto turinčioms medžiagoms turi būti daroma pataisa dėl deguonies suvartojimo bet kokiame nitrifikavimo procese. Tai padaryti taikomas O₂ – elektrodo metodas ištirpusio deguonies koncentracijai nustatyti, o po to iš BDS kolbos paimamas bandinys nitrito ir nitrato analizei. Pagal nitrito ir nitrato koncentracijos padidėjimą apskaičiuojamas suvartotas deguonis (žr. V priedą).

VI.3. DUOMENYS IR ATASKAITA

VI.3.1. Rezultatų apdorojimas

Iš pradžių apskaičiuojamas BDS, kuris susikaupia po kiekvieno laiko periodo, atimant deguonies suvartojimo tuščiajame bandinyje vertę (mg O2/litre) iš deguonies suvartojimo bandomajai medžiagai. Atstojamoji BDS vertė gaunama pataisytą suvartojimo vertę padalijus iš bandomosios medžiagos koncentracijos (mg/litre) ir kuri skaičiuojama mg deguonies vienam mg bandomosios cheminės medžiagos. Biologinio skaidomumo procentinė vertė skaičiuojama dalinant atstojamąjį BDS iš TDS atstojamosios (apskaičiuoto pagal II.2 priedą) arba ChDS (nustatyto analizės būdu, žr. II.3 priedą), taigi:

Reikia pažymėti, kad šie du metodai nebūtinai duoda tą pačią vertę; geriau naudoti pirmąjį metodą.

Azoto turinčioms medžiagoms naudojamos atitinkamos TDS vertės (NH ar NO) pagal tai, kas yra žinoma apie nitrifikavimo galimybę arba ko iš jo laukiama (II.2 priedas). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisos nitrifikavimui suvartotam deguoniui skaičiuojamos pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (V priedas).

VI.3.2. Rezultatų validumas (teisėtumas)

Deguonies suvartojimas tuščiajame bandinyje su užkratu po 28 parų turi būti ne didesnis kaip 1,5 mg/litre ištirpusio deguonies. Jei vertės didesnės, reikia tikrinti bandymo atlikimo eigą. Likutinė deguonies koncentracija bet kuriuo momentu bandymo kolbose neturi sumažėti iki mažesnio nei 0,5 mg/litre lygio. Tokių mažų deguonies lygių nustatymas yra validus tik tokiu atveju, jei ištirpusio deguonies nustatymo metodu įmanoma tiksliai juos matuoti.

Žr. taip pat I.5.2.

Vl.3.3. Ataskaita

Žr. I.8.

VI.4. SPECIFIKACIJA

Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.

UŽDARYTOS KOLBOS BANDYMAS

1. LABORATORIJA

2. BANDYMO PRADŽIOS DATA

3. BANDOMOJI MEDŽIAGA

Pavadinimas:

Pradinio tirpalo koncentracija: mg/litre

Pradinė koncentracija kolboje: mg/litre

TDS ar ChDS: mg O2/mg bandomosios medžiagos

4. UŽKRATAS

Šaltinis:

Kaip apdorota:

Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:

Koncentracija reakcijos mišinyje: mg/litre

5. ID NUSTATYMAS

Metodas: Winkler’io arba elektrometrinis

Kolbų turinio analizė

3493-42

6. PATAISA DĖL NITRIFIKAVIMO (žr. V priedą)

Inkubavimo trukmė (paros)		n₁	n₂	n₃
(i)	Nitrato koncentracija (mg N/litre)
(ii)	Nitrato koncentracijos pokytis (mg N/litre)
(iii)	Deguonies ekvivalentas (mg/litre)
(iv)	Nitrito koncentracija (mg N/litre)
(v)	Nitrito koncentracijos pokytis (mg N/litre)
(vi)	Deguonies ekvivalentas (mg/litre)
(iii + vi)	Bendrasis deguonies ekvivalentas (mg/litre)

7. ID SuVARTOJiMAS% SKAIDYMO

3493-43

* Jei tarp lygiagrečių nustatymų yra didelis skirtumas, vidutinės vertės neskaičiuokite.

m_t0 = vertė bandymo kolboje laiku 0

m_tx= vertė bandymo kolboje laiku x

m_b0= tuščiojo bandymo vidutinė vertė laiku 0

m_bx = tuščiojo bandymo vidutinė vertė laiku x

Taip pat darykite pataisą dėl nitrifikavimo, naudodami 6 skyriaus iii + vi.

8. IŠTIRPUSIO DEGUONIES (ID) sUVARTOJIMAS TUŠČIAME BANDINYJE

Deguonies suvartojimas tuščiajame bandyme: (m_b0 – m_b28) mg/litre. Šis suvartojimas svarbus bandymo validumui. Suvartojimas turi būti mažesnis kaip 1,5 mg/litre.

VII dalis. M. I. T. I. bandymas (F metodas)

VII.1. metodo esmė

Deguonies suvartojimas maišomu bandomosios medžiagos tirpalu ar suspensija mineralinėje terpėje, į kurį dedama specialiai auginta neadaptuotų mikroorganizmų kultūra, 28 paras automatiškai matuojamas tamsoje ir 25 ± 1°C temperatūroje laikomame uždarame respirometre. Išsiskyręs anglies dioksidas absorbuojamas natrio kalkėmis. Biologinis skaidomumas reiškiamas deguonies suvartojimo (pataisyto dėl suvartojimo tuščiajame bandinyje) procentine teorinio suvartojimo (TDS) dalimi. Be to, pirminio biologinio skaidomumo procentinė vertė skaičiuojama pagal papildomos specifinės cheminės analizės, daromos inkubavimo pradžioje ir pabaigoje, duomenis ir neprivalomai pagal IOA analizės duomenis.

VII.2. METODO APRAŠYMAS

VII.2.1. Aparatūra

a) Automatinis elektrolitinis BDS matuoklis ar respirometras. paprastai su 6 kolbomis, kurių kiekvienos tūris 300 ml, ir su indu CO2 absorbentui laikyti.

b) Patalpa su pastovia temperatūra ir (arba) vandens vonia 25°C ± 1°C ar geriau.

c) Membraninio filtravimo įrenginys (neprivalomas).

d) Anglies analizatorius (neprivalomas).

VII.2.2. Mineralinės terpės ruošimas

Paruošiami šie pradiniai tirpalai, naudojant analiziškai grynus reagentus ir vandenį (I.6.1):

a) Kalio dihidrofosfatas, KH₂PO₄	8,50 g
Kalio hidrofosfatas, K₂HPO₄	21,75 g
Natrio hidrofosfatas, dodekahidratas, Na₂HPO₄ 12H₂O	44,60 g
Amonio chloridas, NH4Cl	0,50 g
Ištirpinami vandenyje ir praskiedžiami iki 1 litro.
Tirpalo pH turi būti 7,2.
b) Magnio sulfatas, heptahidratas, MgSO₄ 7H₂O	22,50 g
Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro.
c) Kalcio chloridas, bevandenis, CaCl₂	27,50 g
Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro.
d) Geležies (III) chloridas, heksahidratas, FeCl₃ 6H₂O	0,25 g

Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro.

Imama po 3 ml kiekvieno (a), (b), (c) ir (d) tirpalų ir praskiedžiama iki 1 litro.

VII.2.3. Užkrato ruošimas

Surenkami švieži bandiniai ne mažiau kaip iš dešimties vietų, daugiausia iš tokių, kuriose naudojamos ir šalinamos įvairios cheminės medžiagos. Iš įvairiausių vietų, pvz., nuotekų valymo įrenginių, pramoninių nuotekų valymo įrenginių, upių, ežerų, jūrų, surenkama po 1 l dumblo, paviršiaus dirvožemio, vandens ir t. t. bandinių ir po to jie supilami į vieną bendrą indą ir gerai sumaišomi. Pašalinamos paviršiuje plaukiojančios medžiagos ir paliekama nusistoti, po to natrio hidroksidu ar fosforo rūgštimi nustatoma skysčio virš nuosėdų pH vertė 7 ± 1.

Atitinkamas filtruoto skysčio virš nuosėdų tūris naudojamas užpildyti aktyviojo dumblo užpildymo ir išleidimo (fill-and-draw) indą ir aeruojamas skystis maždaug 23½ h. Trisdešimt minučių po aeravimo pabaigos maždaug trečdalis viso skysčio virš nuosėdų išpilamas lauk ir ant nusodintos medžiagos užpilamas toks pat tūris tirpalo (pH 7), kuriame būtų po 0,1% gliukozės, peptono ir kalio dihidrofosfato, ir vėl aeruojama. Kartojama ši procedūra kartą per dieną. Dumblo įrenginys turi būti eksploatuojamas laikantis geros praktikos rodiklių: ištakiai turi būti skaidrūs, turi būti palaikoma 25 ± 2°C temperatūra, pH turi būti 7 ± 1, dumblas turi gerai nusistoti, turi būti pakankamas aeravimas, kad mišinys visą laiką būtų aerobinis, pirmuonių ir dumblo aktyvumas turi būti tikrinamas pagal etaloninę medžiagą bent kas tris mėnesius. Dumblo kaip sėjamos kultūros negalima naudoti anksčiau kaip po mėnesio nuo proceso pradžios, bet ne vėliau kaip po keturių mėnesių. Po to reikia imti bandinius bent iš 10 vietų reguliariais laiko tarpais, kartą per tris mėnesius.

Norint, kad senojo ir naujojo dumblo aktyvumas būtų toks pat, reikia sumaišyti vienodus tūrius filtruoto skysčio virš naudojamo aktyviojo dumblo ir filtruoto skysčio virš šviežiai surinkto dešimties šaltinių mišinio ir auginti mikroorganizmus supiltuose skysčiuose, kaip tai aprašyta aukščiau. Reikia dumblą naudoti kaip užkrato kultūrą 18–24 h po to, kai įrenginys buvo įkrautas.

VII.2.4. Kolbų ruošimas

Paruošiamos šešios kolbos:

Nr. 1: bandomosios cheminės medžiagos tirpalas skiedimo vandenyje, 100 mg/l

Nr. 2, 3 ir 4: bandomosios cheminės medžiagos tirpalas mineralinėje terpėje, 100 mg/l

Nr. 5: etaloninės cheminės medžiagos (pvz., anilino) tirpalas mineralinėje terpėje, 100 mg/l

Nr. 6: tik mineralinė terpė

Mažai tirpios medžiagos dedamos pagal masę, pagal tūrį arba apdorotos, kaip aprašyta III priede, išskyrus tai, kad neturi būti naudojami nei tirpikliai, nei emulsikliai. Į visas kolbas įleidžiama specialiuose induose įdėto CO₂ absorbento. Kolbose Nr. 2, 3 ir 4 nustatoma pH vertė 7,0.

VII.2.5. Bandymų eiga

Į kolbas Nr. 2, 3 ir 4 (bandomosios suspensijos), Nr. 5 (aktyvumo kontrolinis bandinys) ir Nr. 6 (tuščiasis bandinys su užkrato kultūra) įpilama po mažą tūrį užkrato kultūros, kad suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija būtų 30 mg/l. Užkrato kultūros nededama į kolbą Nr. 1, kurioje yra abiotinio skaidymo kontrolinis bandinys. Surinkus įrangą, patikrinus hermetiškumą, įjungiamos maišyklės ir matuojamas deguonies suvartojimas tamsoje. Kiekvieną dieną tikrinama temperatūra, maišyklė ir kulonometrinis deguonies suvartojimo registravimo įrenginys bei stebimi bet kokie kolbų turinio spalvos pakitimai. Deguonies suvartojimo rodmenys šešioms kolboms registruojami tiesiogiai tinkamu metodu, pvz., šešių taškų savirašiu, rašančiu BDS kreivę. Inkubavimo pabaigoje, kuris paprastai tęsiamas 28 paras, išmatuojamas kolbų turinio pH ir nustatoma likusios bandomosios medžiagos ir kiekvieno tarpinio produkto koncentracija, o vandenyje tirpios medžiagos – IOA koncentracija (II.4 priedas). Reikia imtis ypatingų priemonių lakiųjų cheminių medžiagų atveju. Jei gali vykti nitrifikavimas, reikia nustatyti nitrito ir nitrato koncentraciją, jei tai įmanoma.

VII.3. DUOMENYS IR ATASKAITA

VII.3.1. Rezultatų apdorojimas

Deguonies kiekį (mg), suvartotą bandomajai cheminei medžiagai per tam tikrą laiką ir pataisytą kiekiu deguonies, suvartoto per tą patį laiką tuščiajame sėjimo kultūros bandinyje, padalijus iš paimtos bandomosios cheminės medžiagos masės, skaičiuojamas BDS, mg deguonies/mg bandomosios medžiagos, taigi:

Mišiniams TDS skaičiuojama pagal elementinę analizę, kaip paprastam junginiui, naudojant atitinkamas TDS (TDSNH ar TDSNO) vertes pagal tai, ar nitrifikavimas nevyksta, ar jis yra visiškas (II.2 priedas). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisos nitrifikuoti suvartotam deguoniui skaičiuojamos pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (V priedas).

Pirminio biologinio skaidymo procentinė vertė skaičiuojama pagal specifinės (pradinės) cheminės medžiagos kiekio mažėjimą (žr. I.7.2).

Ataskaitoje reikia nurodyti, jei sumažėjo bandomosios medžiagos koncentracija kolboje Nr. 1, kurioje matuojamas fizikocheminis pašalinimas. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija (S_b) šioje kolboje po 28 parų naudojama apskaičiuoti biologinio skaidymo procentinę vertę.

Kai nustatoma IOA (neprivaloma), biologinio suskaidymo procentinė vertė apskaičiuojama pagal,

Dt =

kaip aprašyta I.7.1 punkte. Jei kolboje Nr. 1, kurioje matuojamas fizikocheminis IOA šalinimas, IOA kiekis sumažėjo, IOA koncentracija šioje kolboje naudojama apskaičiuoti biologinio skaidymo procentinę vertę.

Visi rezultatai užrašomi pateiktose specifikacijose.

VII.3.2. Rezultatų validumas (teisėtumas)

Paprastai deguonies suvartojimas užkrato tuščiajame bandinyje per 28 paras yra 20–30 mg O2/litre ir neturi būti didesnis kaip 60 mg/litre. Jei vertės didesnės kaip 60 mg/litre, būtina kritiškai ištirti duomenis ir bandymo atlikimo eigą. Jei pH vertė nepatenka į 6–8,5 intervalą, o bandomoji medžiaga deguonies suvartoja mažiau kaip 60%, bandymas turi būti pakartotas su mažesne bandomosios medžiagos koncentracija.

Žr. taip pat I.5.2.

Jei anilino skaidymo procentinė vertė, apskaičiuota pagal deguonies suvartojimą, po 7 parų ne didesnė kaip 40% ir po 14 parų ne didesnė kaip 65%, laikoma, kad bandymas nevalidus.

VII.3.3. Ataskaita

Žr. I.8.

VII.4. SPECIFIKACIJA

Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.

MITI (I) BANDYMAS

1. LABORATORIJA

2. BANDYMO PRADŽIOS DATA

3. BANDOMOJI MEDŽIAGA

Pavadinimas:

Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l kaip cheminės medžiagos

Pradinė koncentracija terpėje, C₀: mg/l kaip cheminės medžiagos

Reakcijos mišinio tūris, V: ml

TDS: mg O₂/l

4. UŽKRATO KULTŪRA

Dumblo bandinių ėmimo vietos:

1)...	6)...
2)...	7)...
3)...	8)...
4)...	9)...
5)...	10)...

Suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija aktyviajame dumble po aklimatizavimo sintetinėmis nuotekomis =... mg/l

Aktyviojo dumblo tūris vienam litrui galutinai paruoštos terpės =... ml

Dumblo koncentracija galutinai paruoštoje terpėje =... mg/l

5. DEGUONIES SUVARTOJIMAS: BIOLOGINIS SKAIDOMUMAS

Naudoto respirometro tipas:

3493-46

6. ANGLIES ANALIZĖ (neprivaloma):

Anglies analizatorius:

Kolba		IOA				Pašalintos IOA%		Vidutinė vertė
		Matuota		Pataisyta
	Vanduo + bandomoji medžiaga		a				–		–
	Dumblas + bandomoji medžiaga		b₁		b₁-c
	Dumblas + bandomoji medžiaga		b₂		b₂-c
	Dumblas + bandomoji medžiaga		b₃		b₃-c
	Kontrolinis tuščiasis bandymas		c		–		–		–

7. SPECIFINĖS CHEMINĖS ANALIZĖS DUOMENYS

	Likutinis bandomosios medžiagos kiekis bandymo pabaigoje	Skaidymo%
Tuščiasis bandymas su vandeniu	S_b
Terpė su užkrato kultūra	S_a1
	S_a2
	S_a3

skaidymo%



Apskaičiuojamas skaidymo %, atitinkamai, kolbose a1, a2 ir a3.

8. PASTABa

Turi būti pridedama BDS kitimo laike kreivė, jei yra.

I priedas

SANTRUMPOS IR APIBRĖŽIMAI

ID: Ištirpęs deguonis (mg/l) yra vandeniniame bandinyje ištirpusio deguonies koncentracija.

BDS: Biocheminis deguonies suvartojimas (g) yra deguonies kiekis, kurį suvartoja mikroorganizmai, įsisavindami bandomąją medžiagą; taip pat skaičiuojamas g suvartoto deguonies 1g bandomosios medžiagos (žr. BDS metodą).

ChDS: Cheminis deguonies suvartojimas (g) yra deguonies kiekis, suvartotas bandomąją medžiagą oksiduojant karštu, rūgščiu bichromato tirpalu; ChDS yra turimo oksiduojamos medžiagos kiekio matas; taip pat skaičiuojamas g deguonies, suvartoto 1g bandomosios medžiagos (žr. ChDS metodą).

IOA: Ištirpusi organinė anglis yra organinė anglis tirpale arba organinė anglis, kuri praeina per 0,45 μm filtrą arba lieka skystyje virš nuosėdų po 15 min centrifugavimo 40000 m·s² (apie 4000 g) pagreičiu.

TDS: Teorinis deguonies suvartojimas (mg) yra bendras deguonies kiekis, kurio reikia visiškai oksiduoti cheminę medžiagą; jis skaičiuojamas pagal molekulinę formulę (žr. II.2 priedą), dar kitaip skaičiuojamas mg deguonies, suvartojamo oksiduoti 1 mg bandomosios medžiagos.

TCO₂: Teorinis anglies dioksido kiekis (mg) yra apskaičiuotas anglies dioksido, kuris susidaro iš žinomo ar išmatuoto anglies kiekio bandomojoje medžiagoje, kai ji visiškai mineralizuojama, kiekis; taip pat skaičiuojamas mg anglies dioksido, kuris susidaro iš 1 mg bandomosios medžiagos.

BOA: Bendroji bandinio organinė anglis yra ištirpusios ir suspenduotos organinės anglies kiekių suma.

NA: Neorganinės anglies kiekis.

BA: Bendrasis anglies kiekis yra bandinio organinės ir neorganinės anglies bendras kiekis.

Pirminis biologinis skaidymas:

yra biologiškai veikiamos medžiagos cheminės sandaros pokytis, kai ji netenka tai medžiagai būdingų savybių.

Biologinis suskaidymas (aerobinis):

tai pasiektas skaidymo lygis, kai mikroorganizmai bandomąją medžiagą visiškai suvartoja, susidarant anglies dioksidui, vandeniui, mineralinėms druskoms ir naujoms mikrobiologinėms ląstelinėms sudedamosioms dalims (biomasei).

Lengvai biologiškai skaidomas:

cheminių medžiagų, kurioms buvo daromi kai kurie apibrėžti atrankos pagal biologinį skaidymą bandymai, sutartinis klasifikavimas; šie bandymai yra tokie tikslūs, kad laikoma, kad vandens terpėse aerobinėmis sąlygomis tokie junginiai greitai ir visiškai biologiškai suyra.

Natūraliai biologiškai skaidomas:

cheminių medžiagų, apie kurių biologinį suskaidymą (pirminį ar visišką) bet kokiame pripažintame biologinio skaidomumo bandyme yra neabejotinų duomenų, klasifikavimas.

Apdorojamumas:

yra galimybė medžiagas paversti šalinamais junginiais biologinio nuotekų valymo metu, neigiamai neveikiant normalios valymo procesų eigos. Dažniausiai lengvai biologiškai skaidomos medžiagos yra tinkamos apdoroti, bet ne visi junginiai iš prigimties yra biologiškai skaidomi. Gali vykti ir abiotiniai procesai.

Vėlavimo trukmė – Lag laikas:

yra laikas nuo sėjimo kultūros įdėjimo IOA išnykimo bandyme iki skaidymo procentinė vertė pasiekia bent 10%. Vėlavimo trukmė dažnai yra labai kintamas dydis ir jo atkuriamumas blogas.

Skaidymo trukmė:

yra laikas nuo vėlavimo Lag laikotarpio pabaigos iki to laiko, kai skaidymas pasiekia 90% didžiausios vertės lygį.

10-parų langas:

10 parų iš karto po to, kai skaidymo vertė pasiekė 10%.

II priedas

atitinkamų BENDRŲJŲ PARAMETRŲ SKAIČIAVIMAS IR NUSTATYMAS

Nuo pasirinkto metodo priklauso, kokie bus reikalingi bendrieji parametrai. Šiame skyriuje aprašomas šių dydžių išvedimas. Šių parametrų taikymas aprašomas atskirai kiekviename metode.

1. Anglies kiekis

Anglies kiekis skaičiuojamas pagal žinomą cheminę sudėtį arba nustatomas bandomosios medžiagos elementine analize.

2. Teorinis deguonies suvartojimas (TDS)

Teorinis deguonies suvartojimas (TDS) gali būti apskaičiuotas, jei žinoma elementinė sudėtis, arba jis gali būti nustatytas, atliekant elementinę analizę. Junginio:

C_cH_hCl_ClN_nNa_naO_oP_pS_s,

jei nitrifikavimas nevyksta,

arba

kai nitrifikavimas vyksta.

3. Cheminis deguonies suvartojimas (ChDS)

Cheminis deguonies suvartojimas (ChDS) nustatomas pagal „Cheminis deguonies suvartojimas“ metodą.

4. Ištirpusi organinė anglis (IOA)

Ištirpusi organinė anglis (IOA) pagal apibrėžimą yra bet kurios cheminės medžiagos arba medžiagų mišinio vandenyje organinė anglis, praeinanti per 0,45 μm filtrą.

Bandiniai iš bandymo indų siurbiami ir iš karto filtruojami filtravimo įtaisu, naudojant atitinkamą membraninį filtrą. Pirmieji 20 ml (kiekis gali būti mažesnis, kai naudojami maži filtrai) filtrato pilami lauk. 10–20 ml tūrio arba mažesni bandiniai, jei jie įpurškiami (tūris priklauso nuo anglies analizatoriui reikalingo tūrio) paliekama anglies kiekiui analizuoti. IOA koncentracija nustatoma organinės anglies analizatoriumi, kuriuo būtų galima tiksliai nustatyti anglies koncentraciją, atitinkančią 10% bandyme naudotos pradinės IOA koncentracijos arba mažesnę.

Filtruotus bandinius, kurių negalima analizuoti tą pačią darbo dieną, 48 h galima laikyti šaldytuve 2–4°C temperatūroje arba žemiau -18oC, jei laikoma ilgiau.

Pastabos:

Membraniniai filtrai, kad būtų hidrofiliški, dažnai impregnuojami paviršinio aktyvumo medžiagomis. Todėl filtre gali būti iki kelių mg ištirpusios organinės anglies, kuri trukdytų biologinio skaidomumo nustatymams. Paviršinio aktyvumo medžiagos ir kitos tirpios organinės medžiagos iš filtrų šalinamos, juos virinant tris kartus po vieną valandą dejonizuotame vandenyje. Filtrai toliau gali būti savaitę laikomi vandenyje. Jei naudojamos vienkartinės filtravimo tūtos, kiekviena partija turi būti patikrinta, norint įsitikinti, kad nesusidaro ištirpusi organinė anglis.

Atsižvelgiant į membraninio filtro tipą, bandomoji cheminė medžiaga gali būti sulaikyta dėl jos adsorbavimo. Todėl būtų patartina tikrinti, ar filtras neadsorbuoja cheminės medžiagos.

Kai norima lyginti BOA ir IOA, vietoj filtravimo gali būti taikomas 15 min. centrifugavimas 40000 m·sec-2 (4000 g) pagreičiu. Metodas nepatikimas, jei IOA pradinė koncentracija yra < 10 mg/l, nes arba pašalinamos ne visos bakterijos arba anglis vėl ištirpsta kaip bakterijų plazmos dalis.

NUORODOS

– Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, P 65.

– Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139.

– DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 – Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser– und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs– und Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Nonnenausschuß Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e. V.

– Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol 13 (1), 169.

III priedas

MAŽAI TIRPIŲ MEDŽIAGŲ BIOLOGINIO SKAIDOMUMO VERTINIMAS

Mažai tirpių medžiagų biologinio skaidomumo bandymuose ypatingas dėmesys turi būti kreipiamas į šiuos aspektus.

Jei homogeniniai skysčiai retai kelia bandinio ėmimo problemų, tai kietąsias medžiagas rekomenduojama homogenizuoti tinkamu būdu, kad būtų išvengta paklaidų dėl nehomogeniškumo. Reikalingos specialios atsargumo priemonės, kai reikia paimti kelių miligramų reprezentatyvius cheminių medžiagų mišinių ar daug priemaišų turinčių medžiagų bandinius.

Bandymuose galima taikyti įvairius maišymo būdus. Reikia stengtis užtikrinti tik tokį maišymą, kad medžiaga būtų disperguotos būsenos, ir vengti perkaitinimo, per didelio putojimo ir per didelių šlyties jėgų.

Galima naudoti emulsiklį, su kuriuo gaunama patvari cheminės medžiagos dispersija. Jis neturi būti nuodingas bakterijoms ir neturi būti biologiškai skaidomas ar bandymo sąlygomis sukelti putas.

Emulsikliams taikomi kriterijai tinka ir tirpikliams.

Kietosioms bandomosioms medžiagoms nerekomenduojama naudoti kietuosius nešiklius, tačiau jie gali tikti aliejingoms medžiagoms.

Kai naudojamos pagalbinės medžiagos, pvz., emulsikliai, tirpikliai ir nešikliai, turi būti atliekamas tuščiasis bandymas, kuriame būtų pagalbinė medžiaga.

Bet kuris iš trijų respirometrinių bandymų, CO₂, BDS, MITI, gali būti taikomas tirti mažai tirpių junginių biologinį skaidomumą.

NUORODOS

– de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, vol. 16, 833.

– Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water-soluble compounds. Chemosphere. 1984, vol. 13, 169.

IV priedas

CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ, KURIOS GALI BŪTI NUODINGOS UŽKRATUI, BIOLOGINIO SKAIDOMUMO VERTINIMAS

Kai tiriant cheminę medžiagą lengvo biologinio skaidomumo bandymuose paaiškėja, kad ji biologiškai neskaidoma, tai, jei norima atskirti, ar tai inhibuojamasis veikimas, ar medžiagos inertiškumas, rekomenduojama toliau aprašyta procedūra (Reynolds et al., 1987).

Toksiškumo ir biologinio skaidomumo bandymuose turi būti naudojamas panašus ar identiškas užkratas.

Norint įvertinti toksiškumą cheminių medžiagų, tiriamų lengvo biologinio skaidomumo bandymuose, tiktų, kaip manoma, atskirai ar kartu taikyti dumblo kvėpavimo intensyvumo inhibavimo (aktyviojo dumblo kvėpavimo inhibavimo bandymas – direktyva 88/302/EEC), BDS ir (arba) augimo inhibavimo metodus.

Manoma, kad, jei reikia išvengti inhibavimo dėl medžiagos toksiškumo, bandomųjų medžiagų, naudojamų lengvo biologinio skaidomumo bandymuose, koncentracija turėtų būti mažesnė nei 1/10 EC₅₀ vertės (ar mažesnė nei EC20 vertė), gautos toksiškumo bandymuose. Nepanašu, kad junginiai, kurių EC₅₀ vertė yra didesnė kaip 300 mg/l, būtų toksiški biologinio skaidomumo bandymuose.

Mažesnės kaip 20 mg/l EC₅₀ vertės greičiausiai turėtų kelti problemų toliau atliekamiems bandymams. Turi būti naudojamos mažos bandomosios koncentracijos, dėl to reikia taikyti tikslų ir jautrų uždarytos kolbos metodą arba naudoti ¹⁴C žymėtas mežiagas. Kitaip dar būtų galima naudoti aklimatizuotą užkratą, kuris galbūt leistų naudoti didesnės koncentracijos bandomąją medžiagą. Tačiau šiuo atveju prarandamas specifiškas lengvo biologinio skaidomumo bandymo kriterijus.

NUORODOS

– Reynolds, L. et al.. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 225.

V priedas

DEGUONIES SUVARTOJIMO PATAISA DĖL NITRIFIKAVIMO KELIAMŲ TRUKDŽIŲ

Jei nekreipiamas dėmesys į nitrifikavimą, kai biologinis skaidomumas vertinamas pagal deguonies suvartojimą bandomosiomis medžiagomis, tai paklaidos medžiagoms, kuriose nėra azoto, yra nežymios (ne didesnės kaip 5%), net jei terpės amonio azoto oksidavimas bandomojo ir tuščiojo bandymo induose vyksta nevienodai. Tačiau, jei bandomosios medžiagos turi azoto, paklaidos gali būti didelės.

Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau nevisiškas, stebimas deguonies suvartojimas reakcijos mišinyje gali būti pataisytas deguonies kiekiu, suvartotu amonio jonui oksiduoti į nitritą ir nitratą, jei nitrito ir nitrato koncentracijų pokytis inkubavimo metu nustatomas atsižvelgiant į tokias reakcijų lygtis:

2NH₄C1 + 3O₂ = 2HNO₂ + 2HC1 + 2H₂O	(1)
2HNO₂ + O₂= 2HNO₃	(2)

Suminė reakcija:
2NH4C1 + 4 O2 = 2HNO3 + 2HC1 + 2H2O	(3)

Pagal (1) lygtį 28 g azoto, kuris yra amonio chloride (NH₄Cl), oksiduoti į nitritą, reikia 96 g deguonies, t. y. daugiklis lygus 3,43 (96/28). Tokiu pat būdu pagal (3) lygtį 28 g azoto, kai jis oksiduojamas į nitratą, suvartoja 128 g deguonies, t. y. daugiklis lygus 4,57 (128/28).

Kadangi reakcijos yra nuoseklios ir vyksta dėl tam tikrų ir skirtingų bakterijų rūšių veiklos, įmanomas dalykas, kad nitrito koncentracija gali kaip didėti, taip ir mažėti; pastaruoju atveju susidarytų ekvivalentiškas kiekis nitrato. Taigi deguonies, suvartoto nitratui susidaryti, kiekis lygus 4,57 ir nitrato koncentracijos padidėjimo sandaugai, o deguonies kiekis nitritui susidaryti lygus 3,43 ir nitrito koncentracijos padidėjimo sandaugai arba -3,43 ir nitrito koncentracijos sumažėjimo sandaugai, kai nitrito koncentracija mažėja.

T. y.:

O₂ suvartotas nitratui susidaryti = 4,57 × nitrato koncentracijos padidėjimo	(4)
ir
O₂ suvartota nitritui susidaryti = 3,43 × nitrito koncentracijos padidėjimo	(5)
ir
O₂ netenkama dėl nitrito išnykimo = -3,43 × nitrito koncentracijos padidėjimo	(6)
Taigi
O₂ suvartojimas dėl nitrifikavimo = ± 3,43 × nitrito konc. pokyčio. + 4,57 × nitrato konc. padidėjimo	(7)
ir todėl
O₂, suvartotas C oksiduoti = bendrasis stebėtas suvartotas kiekis – nitrifikavimui suvartotas kiekis	(8)

Kitaip, jei nustatytas tik bendrasis oksiduoto azoto kiekis, tai kaip pirminė aproksimacija galima laikyti, kad deguonies suvartojimas dėl nitrifikavimo lygus 4,57 × oksiduoto N koncentracijos padidėjimo.

Toliau angliai oksiduoti suvartoto deguonies kiekio pataisyta vertė lyginama su TDS NH3 verte, kuri skaičiuojama II priede.

SKAIDYMAS – BIOCHEMINIS DEGUONIES SUVARTOJIMAS

1. METODAS

1.1. Įvadas

Šio metodo tikslas yra išmatuoti kietųjų arba skystųjų organinių medžiagų biocheminį deguonies suvartojimą (BDS).

Šiame bandyme gauti duomenys taikomi vandenyje tirpioms medžiagoms; tačiau taip pat galima bandyti bent iš esmės lakiąsias medžiagas arba medžiagas, kurios mažai tirpsta vandenyje.

Metodas tinka tik toms bandomosioms organinėms medžiagoms, kurios bandyme naudojamos koncentracijos, neinhibuotų bakterijų veiklos. Jei bandomoji medžiaga nėra tiek tirpi, kad galima būtų pasiekti bandymo koncentraciją, gerai bandomosios medžiagos dispersijai gauti galima taikyti specialias priemones, pvz., dispergavimą ultragarsu.

Kai reikia aiškinti mažas rezultatų vertes ir parinkti tinkamas bandomąsias koncentracijas, gali būti naudinga informacija apie cheminės medžiagos toksiškumą.

1.2. Apibrėžimas ir vienetai

BDS apibrėžiamas kaip kiekis vandenyje ištirpusio deguonies, suvartoto biocheminio oksidavimo procesui nustatytame tirpalo tūryje vykti apibrėžtomis sąlygomis.

Rezultatai skaičiuojami BDS gramais vienam gramui bandomosios medžiagos.

1.3. Etaloninės medžiagos

Pageidautina naudoti atitinkamą etaloninę medžiagą, skirtą tikrinti sėjimo kultūros aktyvumą.

1.4. Bandymų metodo esmė

Gerai aeruojamoje tinkamoje terpėje ištirpinta ar disperguota medžiaga, kurios kiekis žinomas, užkrečiama mikroorganizmų užkratu ir tamsoje inkubuojama apibrėžtos pastovios temperatūros sąlygomis.

BDS yra nustatomas pagal ištirpusio deguonies kiekio skirtumą bandymo pradžioje ir pabaigoje. Bandymo trukmė turi būti ne mažesnė kaip penkios paros ir ne didesnė kaip 28 paros.

Lygiagrečiai turi būti daromas nustatymas tuščiajame bandyme, kuriame nebūtų bandomosios medžiagos.

1.5. Kokybės kriterijai

Negalima laikyti, kad BDS nustatymas yra validus medžiagos biologinio skaidomumo nustatymas. Į šį bandymą galima žiūrėti tik kaip į atrankos bandymą.

1.6. Bandymų metodo aprašymas

Ruošiamas pradinis medžiagos tirpalas arba dispersija gauti BDS koncentracijai, atitinkančiai taikomą metodą. Tuomet pagal bet kurį atitinkamą nacionalinį arba tarptautinį standartizuotą metodą nustatomas BDS (LST EN 1899-2 nuoroda).

2. DUOMENYS IR ĮVERTINIMAS

BDS pradiniame tirpale skaičiuojamas pagal parinktą standartinį metodą ir verčiamas į BDS gramus vienam gramui bandomosios medžiagos.

3. ATASKAITA

Turi būti nurodytas taikytas metodas.

Biocheminis deguonies suvartojimas turi būti vidurkis bent trijų validžių matavimų.

Turi būti pateikta visa rezultatams aiškinti reikalinga informacija ir pastabos, ypač apie priemaišas, fizinę būseną, toksiškumo įtaką ir medžiagai būdingą sudėtį, kuri turėtų įtakos rezultatams.

Turi būti nurodyta, ar buvo naudotas priedas biologinio nitrifikavimo inhibavimui.

4. NUORODOS

Standartizuotų metodų sąrašas, pavyzdžiui:

– NF T 90 – 103: Determination of the biochemical oxygen demand.

– NBN 407: Biochemical oxygen demand.

– NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV).

– The determination of biochemical oxygen demand. Methods for the examination of water and associated materials, HMSO, London.

– LST EN 1899-2 Vandens kokybė. Biocheminio deguonies suvartojimo per n parų (BDSn) nustatymas. 2 dalis. Neskiestų mėginių metodas (ISO 5815: 1989, modifikuotas).

– ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.

SKAIDYMAS – CHEMINIS DEGUONIES SUVARTOJIMAS

1. METODAS

1.1. Įvadas

Šio metodo tikslas yra standartiniu, sutartu būdu išmatuoti kietųjų arba skystųjų organinių medžiagų cheminį deguonies suvartojimą (ChDS) nustatytomis laboratorinėmis sąlygomis.

Atliekant šį bandymą ir aiškinant gautus rezultatus, bus naudinga informacija apie bandomosios medžiagos sudėtį (pvz., halogenų druskos, organinių junginių geležies (II) druskos, chloro organiniai junginiai).

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

Cheminis deguonies suvartojimas yra medžiagos oksiduojamumo matas, reiškiamas oksidavimo agento, kurį suvartoja medžiaga nustatytomis laboratorinėmis sąlygomis, kiekiui ekvivalentiniu deguonies kiekiu.

Rezultatas skaičiuojamas ChDS gramais vienam gramui bandomosios medžiagos.

1.3. Etaloninės medžiagos

Nebūtina kiekvienu atveju, kai tiriama nauja medžiaga, naudoti etalonines medžiagas. Jos naudojamos, kai daroma metodo veiksmingumo patikra, ir, norint palyginti rezultatus, kurie buvo gauti, taikant kitus metodus.

1.4. Bandymų metodo esmė

Iš anksto nustatytas vandenyje ištirpintos arba disperguotos medžiagos kiekis dvi valandas oksiduojamas, virinant kalio bichromatu stipriai rūgščioje sieros rūgšties terpėje su sidabro sulfato katalizatoriumi, grįžtamuoju šaldytuvu. Likusio bichromato kiekis nustatomas, titruojant standartizuotu geležies (II) amonio sulfato tirpalu.

Jei medžiaga turi chloro, chlorido įtakai sumažinti dedama gyvsidabrio (II) sulfato^*.

1.5. Kokybės kriterijai

Dėl to, kad tai sutartinis nustatymo būdas, ChDS yra „oksiduojamumo indikatorius“ ir naudojamas kaip praktinis organinės medžiagos kiekio nustatymo metodas.

Bandyme gali trukdyti chloridas; taip pat, nustatant ChDS, gali trukdyti neorganinės redukuojančios ar oksiduojančios medžiagos.

Kai kurie cikliniai junginiai ir didelis skaičius lakiųjų medžiagų (pvz., mažesnės molekulinės masės sočiosios rūgštys) šiame bandyme nėra visiškai suoksiduojamos.

1.6. Bandymų metodo aprašymas

Ruošiamas preliminarusis medžiagos tirpalas arba suspensija ChDS vertei nuo 250 mg iki 600 mg litre gauti.

Pastabos:

Mažai tirpių ir nedisperguojamų medžiagų atveju galima pasverti tam tikrą kiekį į labai smulkius miltelius sumaltos medžiagos ar skystos medžiagos, atitinkančios maždaug 5 mg ChDS, ir įdėti ją į eksperimento indą su vandeniu.

Dažnai, ir ypač mažai tirpių medžiagų atveju, cheminį deguonies poreikį (ChDS) geriau nustatyti taikant metodo pakeitimą, t. y., uždaroje sistemoje su slėgio lygintuvu (H. Kelkenberg, 1975). Taikant šį metodo keitimą, galima sėkmingai kiekybiškai nustatyti kai kurias medžiagas, pvz., acto rūgštį, kurias standartiniu metodu nustatyti sunku. Tačiau ir šiuo metodu nepasiseka nustatyti piridino. Jei kalio bichromato koncentracija, kaip nurodyta (1) nuorodoje, padidinama iki 0,25 N (0,0416 M), palengvėja tiesioginis 5–10 mg medžiagos svėrimas, kas yra svarbu nustatant mažai vandenyje tirpių medžiagų ChDS ((2) nuoroda).

Paprastai ChDS nustatomas pagal bet kurį atitinkamą nacionalinį arba tarptautinį standartizuotą metodą (LST ISO 6060, nuoroda).

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Bandymų kolboje turimas ChDS skaičiuojamas pagal pasirinktą standartizuotą metodą ir verčiamas į ChDS gramus vienam gramui bandomosios medžiagos.

3. ATASKAITA

Turi būti nurodytas taikytas metodas.

Cheminis deguonies poreikis turi būti vidurkis bent trijų validžių matavimų. Turi būti pateikta visa rezultatams aiškinti reikalinga informacija ir pastabos, ypač apie priemaišas, fizinę būseną ir medžiagai būdingas savybes (jei žinomos), kurios turėtų įtakos rezultatams.

Ataskaitoje turi būti nurodyta apie gyvsidabrio (II) sulfato panaudojimą chlorido įtakai mažinti.

4. NUORODOS

(1) Kelkenberg, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, vol. 8, 146.

(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.

Sąrašas standartizuotų metodų, pavyzdžiui:

– NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen demand.

– ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate value) of polluted and waste waters.

– NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.

– DS 217 Water analysis: Determination of the chemical oxygen demand.

– DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg per litre.

– NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.

– LST ISO 6060 Vandens kokybė. Cheminio deguonies suvartojimo nustatymas (ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichromate methods).

SKAIDYMAS – ABIOTINIO HIDROLIZINIO SKAIDYMO KAIP pH FUNKCIJOS NUSTATYMAS

1. METODAS

Šis metodas remiasi OECD bandymo rekomendacijomis (1).

1.1. Įvadas

Hidrolizė yra svarbi reakcija, kuri reguliuoja (valdo) abiotinį skaidymą. Ši reakcija yra ypač svarbi medžiagoms, kurių biologinis skaidomumas yra mažas; ši reakcija gali turėti įtakos medžiagos išsilaikymui aplinkoje.

Daugiausia hidrolizės reakcijų yra pseudo pirmojo laipsnio, taigi jų puslaikio trukmė nepriklauso nuo koncentracijos. Todėl rezultatus, gautus su laboratorijoje naudojamomis koncentracijomis, paprastai galima ekstrapoliuoti į aplinkos sąlygas.

Be to, buvo paskelbta keletas pavyzdžių (2), kuriuose nurodoma, kad keliems cheminių medžiagų tipams sutapimas tarp rezultatų, gautų gryname vandenyje ir gamtiniuose vandenyse, yra pakankamai geras.

Bandymui atlikti yra naudinga turėti išankstinę informaciją apie cheminės medžiagos garų slėgį. Šis metodas taikytinas tik vandenyje tirpioms medžiagoms. Įtakos rezultatams gali turėti priemaišos.

Cheminių medžiagų elgesys hidrolizės reakcijoje turi būti tiriamas pH verčių sąlygomis, kurios atitiktų aplinkoje dažniausiai pasitaikančias sąlygas (pH nuo 4 iki 9).

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

Hidrolizės reakcija vadinama cheminės medžiagos RX reakcija su vandeniu. Šią reakciją galima pavaizduoti sumine X grupės mainų su OH grupe lygtimi:

RX + HOH " ROH + HX [1]

Greitis, kuriuo mažėja RX koncentracija, aprašomas lygtimi:

greitis = k × [H2O] × [RX] [2]

Kadangi vandens perteklius, lyginant su cheminės medžiagos kiekiu, yra labai didelis, šio tipo reakcija paprastai aprašoma kaip pseudo pirmojo laipsnio reakcija, kurioje stebimoji greičio konstanta išreiškiama lygtimi:

kobs = k × [H₂O] [3]

Ši konstanta vienai pH vertei ir vienai temperatūrai T gali būti rasta pagal lygtį:

[4]

čia:

t = laikas,

C₀= medžiagos koncentracija laike 0,

C_t = medžiagos koncentracija laike t, ir

2,303 = perėjimo nuo natūraliųjų prie dešimtainių logaritmų daugiklis.

Koncentracijos skaičiuojamos gramais litre arba moliais litre.

Šios konstantos kobs dimensija yra (laikas)-1.

Puslaikio trukmė t½ yra apibrėžiama kaip laikas, per kurį bandomosios medžiagos koncentracija sumažėja 50%, būtent:

C_t = ½ C₀ [5]

Taikant lygtis (4) ir (5), galima parodyti, kad:

t½ = 0,693/_kobs [6]

1.3. Etaloninės medžiagos

Nebūtina kiekvienu atveju, kai tiriama nauja medžiaga, naudoti etalonines medžiagas. Jas daugiausia reikia naudoti tuomet, kai daroma metodo veiksmingumo patikra, ir, lyginant rezultatus, kai taikomas kitas metodas.

Etaloninėmis medžiagomis buvo naudotos šios medžiagos (1):

Acetilsalicilo rūgštis (aspirinas).

Fosforotioninės rūgšties O, O-dietil O-(6-metil-2-(1-metiletil) 4-pirimidinil) esteris (Dimpilatas, diazinonas).

1.4. Bandymų metodo esmė

Ruošiamas nedidelės koncentracijos medžiagos tirpalas vandenyje; pH ir temperatūra kontroliuojami.

Medžiagos koncentracijos mažėjimas laike nustatomas taikant bet kokią tinkamą analizės metodiką.

Brėžiamas koncentracijos logaritmo kitimo laike grafikas ir, jei šis grafikas yra tiesė, pirmojo laipsnio reakcijos greičio konstantą galima apskaičiuoti pagal tiesės nuožulnumo koeficientą (žr. 1.2 punktą).

Jei konkrečiai temperatūrai greičio konstantos nustatyti tiesiogiai nėra galimybės, paprastai būna įmanoma greičio konstantą įvertinti taikant Arrhenius lygtį, kuri aprašo greičio konstantos priklausomybę nuo temperatūros. Tiesinę reakcijos greičio konstantos nuo atvirkštinės absoliučios temperatūros, K, priklausomybę galima ekstrapoliuoti į greičio konstantos vertę, kurios tiesiogiai išmatuoti neįmanoma.

1.5. Kokybės kriterijai

Nuorodoje (2) pranešama, kad 13 klasių organinių junginių hidrolizės greičio konstantas galima matuoti dideliu tikslumu.

Atkartojamumas ypač priklauso nuo pH ir temperatūros reguliavimo ir gali būti veikiamas mikroorganizmų buvimo bei tam tikrais atvejais – ištirpusio deguonies koncentracijos.

1.6. Bandymų metodo aprašymas

1.6.1. Reagentai

1.6.1.1. Buferiniai tirpalai

Bandymas daromas trijų pH verčių sąlygomis: 4,0, 7,0 ir 9,0.

Šiam tikslui turi būti ruošiami buferiniai tirpalai, naudojant analiziškai grynas chemines medžiagas ir distiliuotą arba dejonizuotą vandenį. Kai kurios buferinių tirpalų sistemos pateiktos priede.

Naudojama buferinė sistema gali turėti įtakos hidrolizės greičiui; jei tai yra akivaizdu, reikia naudoti kitą buferinę sistemą. Vietoje fosfatinio buferio (2) nuorodoje rekomenduojama naudoti borato ar acetato buferinį tirpalą.

Jei buferinių tirpalų pH vertė bandymų temperatūroje nėra žinoma, ji pasirinktoje temperatūroje gali būti išmatuota kalibruotu pH-metru ± 0,1 pH vieneto tikslumu.

1.6.1.2. Bandomieji tirpalai

Bandomoji medžiaga turi būti ištirpinta parinktame buferiniame tirpale ir jos koncentracija neturi būti didesnė kaip 0,01 M arba pusė sočiojo tirpalo koncentracijos priklausomai nuo to, kuri koncentracija yra mažesnė.

Naudoti su vandeniu susimaišančius organinius tirpiklius rekomenduojama tik mažai vandenyje tirpioms medžiagoms.

Tirpiklio kiekis turi būti mažesnis kaip 1% ir neturi trukdyti hidrolizės procesui.

1.6.2. Aparatūra

Turi būti naudojamos stiklinės kolbos su šlifo kamščiais, tačiau ant šlifo neturi būti tepalo.

Jei cheminė medžiaga arba buferinė sistema yra lakios arba jei bandymas daromas aukštesnėje temperatūroje, geriau naudoti užlydytus arba pertvara uždarytus mėgintuvėlius ir virš tirpalo reikia vengti tuščios erdvės.

1.6.3. Analitinis metodas

Metodas turi būti specifinis, kad būtų galima nustatyti bandomąją medžiagą bandyme naudojamos koncentracijos, ir jis gali būti tam tikras analitinių metodikų derinys.

Taikomas analitinis metodas priklauso nuo medžiagos prigimties ir turi būti pakankamai tikslus ir jautrus, kad būtų galima nustatyti pradinės koncentracijos mažėjimą 10%.

1.6.4. Bandymų sąlygos

Bandymai turi būti atliekami naudojat termostatuojamą kamerą arba vonią su pasirinkta pastovia temperatūra, nustatytą ± 0,5°C tikslumu. Temperatūra turi būti palaikoma ir matuojama ± 0,1°C tikslumu. Fotolizės trukdančios įtakos reikia vengti naudojant atitinkamas priemones.

Jei medžiagos lengvai oksiduojamos, būtina šalinti ištirpusį deguonį (pvz., prieš ruošiant tirpalą, 5 minutes barbotuoti azotą arba argoną).

1.6.5. Procedūra

1.6.5.1. Parengiamasis bandymas

Visoms medžiagoms 50 ± 0,5°C temperatūroje ir trims pH vertėms: 4,0, 7,0 ir 9,0 – turi būti atliekamas parengiamasis bandymas. Daroma pakankamai matavimų, kad 50°C temperatūroje kiekvienai pH vertei būtų galima įvertinti, ar puslaikio trukmė (t½) yra mažesnė kaip 2,4 valandos, ar po penkių parų išmatuotos hidrolizės laipsnis yra mažesnis kaip 10%. (Galima apytikriai apskaičiuoti, kad sąlygomis, labiau panašiomis į aplinkos sąlygas (25°C), šios vertės prilygtų puslaikio trukmei, atitinkamai, mažesnei nei vieną para arba didesnei nei vieneri metai.) Jei parengiamasis bandymas rodo, kad visų trijų pH verčių (4, 7 ir 9) ir 50°C temperatūros sąlygomis per 2,4 valandas hidrolizuojasi 50% bandomosios medžiagos ar daugiau arba per penkias paras medžiagos hidrolizės laipsnis mažesnis kaip 10%, toliau bandyti nebūtina.

Kitais atvejais ir atskiroms pH vertėms, kurioms ši sąlyga nebuvo įvykdyta, daromas 1 bandymas.

1.6.5.2. 1 bandymas

1 bandymas daromas vienoje temperatūroje; geriau 50 ± 0,5°C, ir, jei įmanoma, steriliomis sąlygomis bei esant tokioms pH vertėms, kurioms parengiamasis bandymas parodė, kad būtina bandyti toliau.

Norint patikrinti, ar hidrolizę nustatytų pH verčių sąlygomis yra pseudo pirmojo laipsnio, turi būti pasirinktas pakankamas skaičius bandinių (ne mažiau kaip keturi), kad būtų apimtas hidrolizės intervalas nuo 20% iki 70%.

Kiekvienai pH vertei, kurioje daromas 1 bandymas, nustatomas reakcijos laipsnis.

Greičio konstantos 25oC temperatūroje įvertis:

Sprendimas, kaip tęsti eksperimentą, priklausys nuo to, ar iš 1 bandymo rezultatų galima daryti išvadą, kad reakcija yra pseudo pirmojo laipsnio arba taip nėra.

Jei po 1 bandymo negalima daryti neabejotinos išvados, kad reakcija yra pseudo pirmojo laipsnio, eksperimentai turi būti daromi toliau, kaip aprašyta 2 bandyme.

Jei pagal 1 bandymo rezultatus galima užtikrintai tvirtinti, kad reakcija yra pseudo pirmojo laipsnio, tolesni eksperimentai turi būti daromi, kaip aprašyta 3 bandyme. (Antraip, tam tikromis aplinkybėmis pagal greičio konstantas 50°C temperatūroje, apskaičiuotas naudojant 1 bandymo rezultatus (žr. 3.2), gali būti įmanoma apskaičiuoti greičio konstantas 25°C temperatūroje.)

1.6.5.3. 2 bandymas

Šis bandymas daromas kiekvienai pH vertei, kuriai 1 bandymo rezultatai parodė, kad tai būtina daryti:

– arba vienoje temperatūroje, mažesnėje kaip 40°C,

– arba dviejose temperatūrose, didesnėse kaip 50°C, kurios tarpusavyje skiriasi bent 10°C.

Kiekvienai pH vertei ir temperatūrai, kuriose daromas 2 bandymas, turi būti nustatyti bent šeši atitinkamai išdėstyti duomenų taškai taip, kad hidrolizės laipsnis būtų išmatuotas intervale nuo 20% iki 70%.

Vienai pH vertei ir vienai temperatūrai matavimas daromas du kartus. Kai 2 bandymas daromas dviejose temperatūrose virš 50°C, kartoti bandymą geriau mažesnėje iš tų dviejų temperatūroje.

Kiekvienai pH vertei ir temperatūrai, kuriose daromas 2 bandymas, pateikiamas grafinis puslaikio trukmės (t½) įvertinimas, kai tai yra įmanoma.

1.6.5.4. 3 bandymas

Šis bandymas daromas kiekvienai pH vertei, kuriai 1 bandymo rezultatai rodo, kad tai daryti būtina:

– arba vienoje temperatūroje, mažesnėje kaip 40°C,

– arba dviejose temperatūrose, didesnėse kaip 50°C, kurios tarpusavyje skiriasi bent 10°C.

Kiekvienai pH ir temperatūros vertei, kuriose daromas 3 bandymas, parenkami trys duomenų taškai, pirmasis laike 0, o antrasis ir trečiasis – kai hidrolizės laipsnis yra didesnis kaip 30%; turi būti apskaičiuoti k_obs ir t_½.

2. Duomenys

Pseudo pirmojo laipsnio reakcijai kobs vertės, kiekvienai bandymuose naudotai pH vertei ir kiekvienai temperatūrai, gali būti gautos iš koncentracijos logaritmo kitimo laike grafiko pagal tokią lygtį:

k_obs = – krypties koeficientas × 2,303 [7]

Be to, t_½ gali būti apskaičiuotas pagal [6] lygtį.

Jei tinka, gaunamas k_25oC įvertis, taikant Arėnijaus (Arrhenius) lygtį.

Jei reakcija yra ne pseudo pirmojo laipsnio, žr. 3.1.

3. ataskaita

3.1. Ataskaitos duomenys

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– medžiagos specifikacija;

– visi rezultatai, gauti etaloninėms medžiagoms;

– taikyto analizės metodo esmė ir detalės;

– kiekvieno bandymo: temperatūra, pH vertė, buferinio tirpalo sudėtis ir duomenų lentelė su visais koncentracijos kitimo laike taškais;

– pseudo pirmojo laipsnio reakcijai: k_obs ir t_½ vertės bei jų skaičiavimo procedūra;

– ne pseudo pirmojo laipsnio reakcijai rezultatai pateikiami brėžiant koncentracijos logaritmo priklausomybės nuo laiko grafiką;

– visa informacija ir pastabos, kurių reikia rezultatams interpretuoti.

3.2. Duomenų interpretavimas

Gali būti įmanoma apskaičiuoti priimtinas cheminių medžiagų hidrolizės reakcijos greičio konstantos vertes (25°C temperatūroje), jei yra žinomos bandomosios medžiagos homologų aktyvacijos energijos eksperimentinės vertės ir jei galima pagrįstai daryti prielaidą, kad bandomosios medžiagos aktyvacijos energija yra tos pačios eilės dydis.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 111, Decision of the Council C(81) 30 final.

(1) W. Mabey and T. Mill, ‘Critical Review of Hydrolysis of Organic Compounds in Water Under Environmental Conditions’, J. Phys. Chem. Ref. Data, 1978, vol. 7 (2), 383-415.

Priedas

BUFERINIAI MIŠINIAI

A. CLARK ir LUBS

Šiose lentelėse pateiktos pH vertės buvo apskaičiuotos pagal potencialo matavimus taikant standartines lygtis pagal Sörensen’ą. Tikroji pH vertė yra 0,04 vieneto didesnė nei nurodyta lentelėje.

Sudėtis	pH
0,1 M kalio hidroftalatas + 0,1 N HC1 20°C temperatūroje
2,63 ml 0,1 N HC1 + 50 ml ftalato iki 100 ml	3,8
0,1 M kalio hidroftalatas + 0,1 N NaOH 20 oC temperatūroje
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato iki 100 ml	4,0
3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato iki 100 ml	4,2
0,1 M kalio dihidrofosfatas + 0,1 N NaOH 20°C temperatūroje
23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml	6,8
29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki o 100 ml	7,0
35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml	7,2
0,1 M H3BO3 tirpalas 0,1 M KCI + 0,1 N NaOH 20°C temperatūroje
16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml	8,8
21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml	9,0
26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml	9,2

B. KOLTHOFF ir VLEESHOUWER

Sudėtis	pH
0,1 M kalio dihidrocitratas ir 0,1 N NaOH 18°C temperatūroje
(norėdami apsaugoti tirpalą nuo pelėsių, įdėkite nedidelį kristaliuką timolo)
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml	3,8
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml	4,0
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml	4,2

C. SÖRENSEN

0,05 M borakso + 0,1 N HC1

Sudėtis		pH
ml borakso	ml HCl	Sörensen 18oC	Intervalas
ml borakso	ml HCl	Sörensen 18oC	10°C	40°C	70°C
8,0	2,0	8,91	8,96	8,77	8,59
8,5	1,5	9,01	9,06	8,86	8,67
9,0	1,0	9,09	9,14	8,94	8,74
9,5	0,5	9,17	9,22	9,01	8,80
10,0	0,0	9,24	9,30	9,08	8,86

0,05 M borakso + 0,1 N NaOH

Sudėtis		pH
ml borakso	ml NaOH	Sörensen 18oC	Intervalas
ml borakso	ml NaOH	Sörensen 18oC	10°C	40°C	70°C
10,0	0,0	9,24	9.30	9,08	8,86
9,0	1,0	9,36	9,42	9,18	8,94
8.0	2,0	9,50	9,57	9,30	9,02
7,0	3,0	9,68	9,76	9,44	9,12

TOKSIŠKUMO SLIEKAMS NUSTATYMAS

Dirbtinio dirvožemio bandymas

1. METODAS

1.1. Įvadas

Šiame laboratoriniame bandyme bandomoji medžiaga maišoma su dirbtiniu dirvožemiu, į kurį 14 parų laikotarpiui dedami sliekai. Kai baigiasi šis laikas (ir neprivalomai po septynių parų), tiriama medžiagos įtaka sliekų mirtingumui. Bandyme pateiktas metodas, kaip atlikti palyginti greitą atranką medžiagų, kurios per odą ir virškinimo traktą veikia sliekus.

1.2. Apibrėžimas ir vienetas

LC₅₀: apytikriai apskaičiuota koncentracija medžiagos, kurią naudojant per bandymų laiką žūsta 50% bandomųjų gyvūnų.

1.3. Etaloninė medžiaga

Periodiškai naudojama etaloninė medžiaga, kaip priemonė parodyti, kad bandymų sistemos jautrumas žymiai nepakito.

Etalonine medžiaga rekomenduojama naudoti analiziškai gryną chloracetamidą.

1.4. Bandymo esmė

Dirvožemis yra nepastovi terpė, todėl šiame bandyme naudojamas tiksliai apibrėžtas dirbtinis priemolio dirvožemis. Suaugę Eisenia foetida rūšies sliekai (žr. priedo pastabą) laikomi apibrėžtos sudėties dirbtiniame dirvožemyje, prisodrintame įvairių koncentracijų bandomosios medžiagos. Indų turinys po 14 parų (ir neprivalomai po septynių parų) nuo bandymo pradžios yra pasklaidomas ant padėklo, ir kiekvienai naudotai koncentracijai skaičiuojami likę gyvi sliekai.

1.5. Kokybės kriterijai

Bandymas parengtas taip, kad atkuriamumas bandymo substrato ir organizmo atžvilgiu būtų kiek įmanoma geresnis. Mirtingumas kontroliniuose bandiniuose bandymo pabaigoje turi būti ne didesnis kaip 10%, kitaip bandymas yra nevalidus.

1.6. Bandymų metodo aprašymas

1.6.1. Medžiagos

1.6.1.1. Bandymų substratas

Kaip pagrindinis bandymų substratas naudojamas apibrėžtos sudėties dirbtinis dirvožemis.

(a) Pagrindinis substratas (procentinė sudėtis skaičiuojama sausos medžiagos masei)

– 10% samanų durpių (pH reikšmė kiek įmanoma arčiau 5,5–6,0, be matomų augalų liekanų ir smulkiai maltų),

– 20% kaolinito molio; pageidautina, kad kaolinito jame būtų daugiau kaip 50%,

– apie 69% pramoninio kvarco smėlio (daugiausia tai turi būti smulkus smėlis, kurio daugiau kaip 50% dalelių dydis būtų nuo 0,05 iki 0,2 mm). Jei medžiagos dispergavimas vandenyje nepakankamas, kiekvienam bandymų indui reikia turėti 10 g smėlio, kurį vėliau būtų galima maišyti su bandomąja medžiaga,

– apie 1% kalcio karbonato (CaCO3), smulkiai malto, chemiškai gryno, dedamo padidinti pH vertę iki 6,0 ± 0,5.

(b) Bandymų substratas

Bandymų substratas susideda iš pagrindinio substrato, bandomosios medžiagos ir dejonizuoto vandens.

Vanduo jame sudaro maždaug nuo 25% iki 42% sauso pagrindinio substrato masės. Vandens kiekis substrate nustatomas džiovinant bandinį 105°C temperatūroje iki pastoviosios masės. Pagrindinis vertinimas, drėkinant dirbtinį dirvožemį, yra nesugerto vandens nebuvimas. Būtina rūpestingai maišyti, kad bandomoji medžiaga tolygiai būtų pasiskirstyta substrate. Bandomosios medžiagos įterpimo į substratą būdas turi būti nurodytas ataskaitoje.

c) Kontrolinis substratas

Kontrolinį substratą sudaro pagrindinis substratas ir vanduo. Jei naudojamas priedas, papildomame kontroliniame bandinyje turi būti toks pat priedo kiekis.

1.6.1.2. Bandymų indai

Maždaug vieno litro talpos stiklinis indas (tinkamai uždengtas plastiko dangčiu, lėkštele ar plastiko plėvele su ventiliacijos angomis), užpildytas tokiu kiekiu drėgno bandymų substrato ar kontrolinio substrato, kuris atitiktų 500 g sauso substrato masę.

1.6.2. Bandymų sąlygos

Indai turi būti laikomi kamerose su nuolatiniu apšvietimu (20 ± 2°C) temperatūroje. Apšvieta turi būti nuo 400 iki 800 liuksų.

Bandymo trukmė 14 parų, tačiau mirtingumą neprivalomai galima vertinti ir po septynių parų nuo bandymo pradžios.

1.6.3. Procedūra

Bandomosios medžiagos koncentracija

Bandomosios medžiagos koncentracija skaičiuojama medžiagos mase sauso pagrindinio substrato masei (mg/kg).

Intervalo nustatymo bandymas

Siekiant gauti duomenų, kokias koncentracijas reikėtų naudoti galutiniame bandyme, intervalo nustatymo bandyme gali būti nustatytos koncentracijos, kurioms esant mirtingumas kinta nuo 0 iki 100%.

Medžiaga turi būti išbandyta tokių koncentracijų intervale: 1000; 100; 10; 1; 0,1 mg medžiagos/kilogramui bandymų substrato (sausos masės).

Jei turi būti atliekamas pilnos apimties galutinis bandymas, tai intervalo nustatymo bandyme kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam bandymui be medžiagos pakanka po vieną bandymų indą, kuriame būtų 10 sliekų.

Galutinis bandymas

Intervalo nustatymo rezultatai naudojami parinkti bent penkias geometrinę progresiją sudarančias koncentracijas, kurios apimtų tik mirtingumo intervalą nuo 0 iki 100% ir skirtųsi pastoviu daugikliu, ne didesniu kaip 1,8.

Bandymai, naudojant tokią koncentracijų seriją, turi leisti kiek įmanoma tiksliau įvertinti LC50 vertę ir jos pasikliovimo ribas.

Galutiniame bandyme kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam bandymui be medžiagos imama ne mažiau kaip po keturis bandymų indus, kurių kiekviename būtų po 10 sliekų. Šių lygiagrečių bandymų rezultatai pateikiami vidutinės vertės ir standartinio nuokrypio pavidalu.

Kai dvi gretimos koncentracijos, kurių santykis 1,8, duoda tik 0% ir tik 100% mirtingumą, šių dviejų verčių pakanka pažymėti intervalą, į kurį patenka LC₅₀.

Pagrindinio bandymų substrato ir bandomosios medžiagos mišinys

Bandymų substratas turi būti gaminamas, jei tai įmanoma, be jokių priedų, išskyrus vandenį. Prieš pat bandymo pradžią bandomosios medžiagos emulsija arba dispersija dejonizuotame vandenyje arba kitame tirpiklyje sumaišoma su pagrindiniu bandymo substratu arba tolygiai ant jo užpurškiama plonu chromatografiniu ar panašios rūšies purkštuvu.

Jei medžiaga netirpsta vandenyje, ji gali būti ištirpinta kiek įmanoma mažesniame tinkamo organinio tirpiklio (pvz., heksano, acetono arba chloroformo) tūryje.

Bandomajai medžiagai soliubilizuoti, disperguoti arba emulguoti galima naudoti tik lengvai garuojančias medžiagas. Prieš naudojant bandymų substratas turi būti vėdinamas. Išgaravusio vandens kiekis turi būti papildytas. Kontroliniame bandyme turi būti toks pat visų naudotų priedų kiekis.

Jei bandomoji medžiaga netirpsta ir negali būti disperguota arba emulguota organiniuose tirpikliuose, 10 g smulkaus malto kvarco ir bandomosios medžiagos mišinys vienodais kiekiais, kiek jos reikia 500 g sauso dirbtinio dirvožemio įsodrinimui, sumaišomas su 490 g sauso bandomojo substrato.

Į kiekvieną stiklinį bandymų indą dedama šlapio bandymų substrato, atitinkančio 500 g sauso substrato, ir ant bandymų substrato viršaus dedama 10 sliekų, kurie prieš tai 24 valandas buvo kondicionuoti panašiame šlapiame pagrindiniame substrate, po to greitai nuplauti vandeniu, vandens perteklių sugeriant filtriniu popieriumi.

Indai uždengiami perforuotu plastikiniu dangčiu, lėkštele arba plėvele, kad substratas nedžiūtų, ir 14 parų laikomi bandymų sąlygomis.

Vertinimas turi būti atliekamas po 14 parų (ir neprivalomai po septynių parų) nuo bandymo pradžios. Substratas paskleidžiamas ant stiklinės ar nerūdijančio plieno plokštės. Sliekai apžiūrimi ir nustatomas gyvųjų sliekų skaičius. Sliekai laikomi negyvais, jei jie nereaguoja į švelnų mechaninį priekinio galo dirginimą.

Kai tikrinimas daromas po septynių parų, indas vėl užpildomas substratu, ir likę gyvi sliekai dedami ant to paties bandymų substrato viršaus.

1.6.4. Bandomieji organizmai

Bandomieji organizmai turi būti suaugę Eisenia foetida (žr. priedo pastabą) (bent dviejų mėnesių amžiaus su clitellum), drėgna sliekų masė yra nuo 300 iki 600 mg. (Apie auginimo metodą žr. priedą.)

2. Duomenys

2.1. Rezultatų apdorojimas ir vertinimas

Ataskaitoje pateikiamos bandomosios medžiagos koncentracijos, kartu nuorodant atitinkamą procentinį žuvusių sliekų kiekį.

Jei duomenys yra tinkami skaičiuoti, LC50 vertė ir pasikliovimo ribos (p = 0,05) turi būti nustatyti taikant standartinius metodus (Litchfield and Wilcoxon, 1949, lygiaverčiam metodui). LC50 turi būti nurodyta mg bandomosios medžiagos vienam kilogramui (sauso) bandymų substrato.

Tais atvejais, kai koncentracijos kreivė yra per stati, kad būtų galima skaičiuoti LC₅₀, pakanka grafinio šios vertės įverčio.

Kai dvi gretimos koncentracijos, kurių santykis 1,8, duoda tik 0% ir tik 100% mirtingumą, šių dviejų verčių pakanka pažymėti intervalą, į kurį patenka LC₅₀.

3. ATASKAITA

3.1. Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– tvirtinimas, kad bandymas buvo atliktas pagal aukščiau minėtus kokybės kriterijus,

– atlikto bandymo pobūdis (intervalo nustatymo bandymas ir (arba) galutinis bandymas),

– tikslus bandymo sąlygų aprašymas arba tvirtinimas, kad bandymas buvo atliktas pagal metodą; turi būti nurodyti visi nukrypimai,

– tikslus aprašymas, kaip bandomoji medžiaga buvo įmaišyta į pagrindinį bandymų substratą,

– informacija apie bandymų organizmus (rūšis, amžius, masės vidutinė vertė ir intervalas, laikymo ir auginimo sąlygos, tiekėjas),

– metodas, taikytas LC50 nustatymui,

– bandymų rezultatai, įskaitant visus naudotus duomenis,

– bandymų organizmų pastebėtų simptomų ar elgesio pokyčių aprašymas,

– mirtingumas kontroliniuose bandymuose,

– LC50 arba didžiausia bandyta koncentracija, kurioje mirtingumas nulinis, ir mažiausia bandyta koncentracija, kurioje mirtingumas 100%, po 14 parų (ir neprivalomai po septynių parų) nuo bandymo pradžios,

– koncentracijos/atsako kreivės brėžinys,

– rezultatai, gauti su etalonine medžiaga, šiame bandyme arba iš ankstesniųjų kokybės kontrolės tyrimų.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207. Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) Edwards, C. A. and Lofty, J. R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and Hall, London, 331 pp.

(3) Bouche, M. B., 1972, Lombriciens de France, Écologie et Systématique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 pp.

(4) Litchfield. J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. J. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99.

(5) Commission of the European Communities, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.

(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land– und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag ‘Toxizitätstest am Regenwunn Eisenia foetida in künstlichem Boden’, in: Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

Priedas

Sliekų auginimas ir laikymas iki bandymų

Į auginimo dėžę su šviežiai paruoštu substratu dedama nuo 30 iki 50 suaugusių sliekų, kurie išimami po 14 parų. Šiuos gyvūnus galima naudoti kitoms auginimo partijoms. Iš kokonų išsiritę sliekai bandymuose naudojami, kai subręsta (nurodytomis sąlygomis po dviejų ar trijų mėnesių).

Laikymo ir auginimo sąlygos

Klimato kamera:

Temperatūra 20 ± 2°C, geriau, jei nuolat apšviesta (apšvieta nuo 400 iki 800 liuksų).

Auginimo dėžės:

Tinkami negilūs 10-20 l talpos indai.

Substratas:

Eisenia foetida gali būti veisiami įvairių gyvulių išmatose. Rekomenduojama kaip auginimo terpę naudoti mišinį, kurį sudaro 50% pagal tūrį durpės ir 50% karvių arba arklių mėšlas. Terpės pH vertė turi būti nuo 6 iki 7 (reguliuojama kalcio karbonatu), savitasis joninis laidumas mažas (mažesnis nei 6 mohm arba kaip 0,5% druskos tirpalo).

Substratas turi būti drėgnas, bet ne per šlapias.

Be aukščiau pateikto metodo, galima naudoti kitus sėkmingus būdus.

Pastaba: Eisenia foetida foetida ant segmentų turi tipiškus skersus dryžius arba juostas, o Eisenia foetida andrei to neturi ir yra margos rausvos spalvos. Jei įmanoma, turi būti naudojama Eisenia foetida andrei. Galima naudoti ir kitas rūšis, jei yra reikiamos metodikos.

BIOLOGINIS SKAIDYMAS ZAHN – WELLENS BANDYMAS

1. METODAS

1.1. Įvadas

Metodo tikslas yra įvertinti vandenyje tirpių, nelakių organinių medžiagų galimą suskaidymą statiniame bandyme, veikiant palyginti didelėms mikroorganizmų koncentracijoms.

Ant suspenduotų kietųjų dalelių gali vykti fizikocheminė adsorbcija, į tai turi būti atsižvelgta interpretuojant rezultatus (žr. 3.2).

Tiriamos medžiagos naudojamos tokios koncentracijos, kad ji atitiktų IOA vertes intervale nuo 100 iki 400 mg/litre arba ChDS vertes nuo 100 iki 1000 mg/litre (IOA – ištirpusi organinė anglis; ChDS – cheminis deguonies suvartojimas). Šios palyginti didelės koncentracijos turi analizinio patikimumo pranašumą. Junginiai, kurie turi toksiškų savybių, gali lėtinti arba inhibuoti skaidymo procesą.

Bandomosios medžiagos biologiniam suskaidymui įvertinti šiame bandyme taikomas ištirpusios organinės anglies koncentracijos arba cheminio deguonies suvartojimo nustatymas.

Lygiagrečiai, taikant specifinį analizės metodą, gali būti įmanoma įvertinti medžiagos pirminį biologinį skaidymą (pirminės cheminės sandaros išnykimas).

Metodas tinka tik toms organinėms bandomosioms medžiagoms, kurios bandyme naudojamos koncentracijos atveju yra:

– tirpios vandenyje bandymų sąlygomis,

– garų slėgis bandymo sąlygomis yra labai mažas,

– neinhibuoja bakterijų,

– bandymų sistemoje adsorbuojamos tik ribotu laipsniu,

– iš bandomojo tirpalo nepradingsta dėl putojimo.

Interpretuojant gautus rezultatus, ypač kai rezultatų vertės yra mažos arba nežymios, naudinga turėti informacijos apie bandomosios medžiagos pagrindinių komponentų santykinę dalį.

Kai reikia paaiškinti mažas rezultatų vertes ir pasirinkti tinkamas bandomąsias koncentracijas, pageidautina turėti informacijos apie medžiagos toksiškumą mikroorganizmams.

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

Bandymo pabaigoje pasiektas skaidymo lygis ataskaitoje pateikiamas kaip „Biologinis skaidomumas Zahn – Wellens’o bandyme“:

čia:

Dt = biologinis skaidymas (%) laiku T,

C_A = IOA (arba ChDS) vertės bandomajame mišinyje po trijų valandų nuo bandymo pradžios (mg/l) (IOA – ištirpusi organinė anglis, ChDS – cheminis deguonies suvartojimas),

C_T = IOA arba ChDS vertės bandomajame mišinyje bandinio ėmimo metu (mg/l),

C_B = IOA arba ChDS vertė tuščiajame bandinyje bandinio ėmimo metu (mg/l),

C_BA = IOA arba ChDS vertė tuščiajame bandinyje, išmatuota po trijų valandų nuo bandymo pradžios (mg/l).

Skaidymo laipsnis apvalinamas iki artimiausio sveikojo procentų skaičiaus.

Skaidymo procentinė vertė nurodoma kaip bandomosios medžiagos IOA (arba ChDS) pašalinimo procentinė vertė.

Skirtumas tarp skaidymo vertės, išmatuotos po trijų valandų, ir paskaičiuotos, bet geriau išmatuotos, pradinės vertės gali suteikti naudingos informacijos apie medžiagos šalinimą (žr. 3.2, Duomenų interpretavimas).

1.3. Etaloninės medžiagos

Kai kuriais atvejais, kai tiriamos naujos medžiagos, etaloninės medžiagos gali būti naudingos, tačiau specifinės etaloninės medžiagos dar negali būti rekomenduotos.

1.4. Bandymų metodo esmė

Aktyvusis dumblas, mineralinė mitybinė terpė ir bandomoji medžiaga, kaip vienintelis anglies šaltinis vandeniniame tirpale, dedami kartu į vieno keturių litrų tūrio stiklinį indą, turintį maišiklį ir aeratorių. Mišinys ne ilgiau kaip 28 paras maišomas ir aeruojamas 20–25°C temperatūroje išsklaidytoje šviesoje arba tamsioje patalpoje. Skaidymo procesas kontroliuojamas, nustatant IOA (arba ChDS) vertes filtruotame tirpale kiekvieną dieną arba per kitokį pasirinktą vienodą laiko tarpą. Po kiekvieno matavimo nustatytos IOA (arba ChDS) pašalinimo vertės santykis su verte, gauta po trijų valandų nuo bandymo pradžios, reiškiamas procentine biologinio skaidymo verte ir yra naudojamas kaip tam momentui nustatytas skaidymo laipsnio matas. Rezultatas atidedamas kaip kitimas laike ir gaunama biologinio skaidymo kreivė.

Kai taikomas specifinis analizės metodas, galima nustatyti pradinės medžiagos koncentracijos mažėjimą dėl jos molekulių biologinio skaidymo (pirminis biologinis skaidomumas).

1.5. Kokybės kriterijai

Tarplaboratoriniai palyginamieji bandymai parodė, kad šio metodo atkuriamumas yra patenkinamas.

Metodo jautrumą dideliu laipsniu lemia tuščiojo bandinio kintamumas ir kiek mažiau ištirpusios anglies nustatymo preciziškumas ir bandomosios medžiagos kiekis tirpale.

1.6. Procedūra

1.6.1. Pasirengimas

1.6.1.1. Reagentai

Bandymų vanduo: geriamasis vanduo, kuriame organinės anglies kiekis mažesnis nei 5 mg/litre. Bendra kalcio ir magnio jonų koncentracija neturi būti didesnė kaip 2,7 mol/litre (5,4 mgekv/l); priešingu atveju reikia atitinkamai skiesti dejonizuotu arba distiliuotu vandeniu.

Sieros rūgštis, analizinis reagentas (A. R.):	50 g/l,
Natrio hidroksido tirpalas A. R.:	40 g/l,
Mineralinis mitybinis tirpalas: viename litre dejonizuoto vandens ištirpinama:
amonio chlorido, NH4Cl, A. R.:	38,5 g,
natrio dihidrofosfato, NaH₂PO₄ 2H2O, A. R.:	33,4 g,
kalio dihidrofosfato, KH₂PO₄, A. R.:	8,5 g,
kalio hidrofosfato, K₂HPO₄, A. R.:	21,75 g.

Mišinys naudojamas ir kaip mitybinė, ir kaip buferinė terpė.

1.6.1.2. Aparatūra

Nuo vieno iki keturių litrų talpos stikliniai indai (pvz., cilindriniai indai).

Maišymo įtaisas su stikliniu ar metaliniu maišikliu ant tinkamo ilgio veleno (maišiklis turi suktis maždaug 5–10 cm virš indo dugno). Vietoj jo galima naudoti magnetinį maišiklį su 7–10 cm ilgio magnetu.

Stiklinis vamzdis, kurio vidinis skersmuo 2–4 mm, orui tiekti. Vamzdžio anga turi būti maždaug 1 cm aukštyje nuo indo dugno.

Centrifuga (apie 3550 g).

pH-metras.

Ištirpusio deguonies matuoklis.

Popieriniai filtrai.

Membraninio filtravimo aparatas.

Membraniniai filtrai, akučių dydis 0,45 μm. Membraniniai filtrai tinka, jei užtikrinama, kad filtravimo metu jie neišskiria anglies ir nesugeria medžiagos.

Analizės įranga organinės anglies kiekiui ir cheminiam deguonies poreikiui nustatyti.

1.6.1.3. Sėjimo kultūros ruošimas

Aktyvusis dumblas iš biologinio valymo įrenginio yra plaunamas (kelis kartus), centrifuguojant arba nusodinant iš bandymų vandens (aukščiau).

Aktyvusis dumblas turi būti atitinkamos būsenos. Tokio dumblo yra tinkamai veikiančiame nuotekų valymo įrenginyje. Siekiant gauti, kiek įmanoma, daugiau įvairių bakterijų rūšių arba štamų, geriau būtų maišyti skirtingų šaltinių bakterijų užkratus (pvz., skirtingų valymo įrenginių, dirvožemio ekstraktų, upės vandens ir t. t.). Mišinys turi būti apdorojamas, kaip aprašyta aukščiau.

Kaip tikrinti aktyviojo dumblo aktyvumą žr. „Funkcinė kontrolė“ toliau.

1.6.1.4. Bandomųjų tirpalų ruošimas

Į bandymo indą įpilama 500 ml bandymų vandens, 2,5 ml/litre mineralinio mitybinio tirpalo ir tiek aktyviojo dumblo, kad galutiniame mišinyje sausosios medžiagos būtų nuo 0,2 iki 1,0 g/litre. Įpilamas pakankamas kiekis pradinio bandomosios medžiagos tirpalo, kad IOA galutiniame mišinyje būtų nuo 50 iki 400 mg/litre. Atitinkamos ChDS vertės yra nuo 100 iki 1000 mg/litre. Bandymų vandeniu praskiedžiama iki bendrojo tūrio, nuo vieno iki keturių litrų. Bendrojo tūrio pasirinkimas priklauso nuo bandinių, kurie bus imami IOA arba ChDS nustatyti, skaičiaus ir nuo analizės procedūrai reikalingo tūrio.

Įprastai galima laikyti, kad pakanka dviejų litrų tūrio. Kiekvienai bandymų serijai lygiagrečiai ruošiamas mažiausiai vienas kontrolinis indas (su tuščiuoju bandiniu); jame yra tik aktyviojo dumblo ir mineralinio mitybinio tirpalo, praskiestų su bandymų vandeniu iki to paties tūrio, kaip ir induose su bandomąja medžiaga.

1.6.2. Bandymo eiga

Išsklaidytoje šviesoje arba tamsioje patalpoje 20–25°C temperatūroje laikomų bandymo indų turinys maišomas magnetinėmis maišyklėmis ar sraigtiniais maišytuvais. Aeruojama suslėgtu oru, valomu leidžiant per medvilnės filtrą ir, jei būtina, per plovimo kolbą. Reikia užtikrinti, kad dumblas nenusistotų, o deguonies koncentracija būtų ne mažesnė kaip 2 mg/litre.

pH vertė turi būti tikrinama vienodais laiko tarpais (pvz., kasdien) ir, jei būtina, pH vertė nustatoma nuo 7 iki 8.

Garavimo nuostoliai reikiamais kiekiais kompensuojami dejonizuotu ar distiliuotu vandeniu prieš kiekvieną bandinio ėmimą. Gerai būtų pažymėti skysčio lygį ant indo sienelės prieš bandymo pradžią. Naujos žymės daromos po kiekvieno bandinio ėmimo (neaeruojant ir nemaišant). Norint aptikti bandomosios medžiagos adsorbciją aktyviuoju dumblu, pirmieji bandiniai visuomet imami po trijų valandų nuo bandymo pradžios.

Bandomosios medžiagos šalinimas sekamas atliekant kiekvieną dieną arba pasirinktais vienodais laiko tarpais IOA arba ChDS nustatymą. Bandiniai iš bandymų ir tuščiojo bandymo indų filtruojami per kruopščiai išplautą popieriaus filtrą. Pirmieji bandomojo tirpalo filtrato 5 ml pilami į atliekas. Sunkiai filtruojamas dumblas gali būti pašalintas 10 minučių centrifuguojant. IOA ir ChDS nustatymas atliekamas ne mažiau kaip po du kartus. Bandymo trukmė – ne ilgesnė kaip 28 paros.

Pastaba: jei bandiniai lieka drumsti, jie filtruojami per membraninius filtrus. Membraniniai filtrai neturi išskirti ar adsorbuoti jokių organinių medžiagų.

Aktyviojo dumblo veikimo tikrinimas

Norint patikrinti funkcinę aktyviojo dumblo gebą, lygiagrečiai kiekvienai bandymų serijai turi būti atliekamas bandymas su žinoma medžiaga. Buvo nustatyta, kad šiam tikslui tinka dietilenglikolis.

Adaptavimas

Jei analizė atliekama palyginti dažnai (pvz., kiekvieną dieną), adaptavimą galima nustatyti iš skaidymo kreivės (žr. 2 paveikslą). Todėl bandymas neturi būti pradedamas prieš pat savaitgalį.

Jei adaptavimas įvyksta laikotarpio pabaigoje, bandymą galima pratęsti, kol skaidymas bus baigtas.

Pastaba: jei reikia daugiau duomenų apie adaptuoto dumblo elgesį, tas pats aktyvusis dumblas dar kartą naudojamas su ta pačia bandomąja medžiaga pagal tokią metodiką:

Išjungiami maišytuvas ir aeratorius ir leidžiama dumblui nusistoti. Skystis virš dumblo nusiurbiamas, įpilama ne daugiau kaip du litrai bandymų vandens, 15 minučių maišoma ir leidžiama vėl nusistoti. Skystis virš dumblo nusiurbiamas dar kartą, likęs dumblas naudojamas bandymui su ta pačia medžiaga pagal 1.6.1.4 ir 1.6.2 pakartoti. Vietoj nusodinimo aktyvųjį dumblą galima atskirti centrifugavimu.

Adaptuotas dumblas gali būti sumaišomas su šviežiu dumblu, kad sausos medžiagos koncentracija būtų nuo 0,2 iki 1 g/litre.

Analizės priemonės

Paprastai bandiniai filtruojami per kruopščiai išplautą filtrinį popierių (plaunamą dejonizuotu vandeniu).

Bandiniai, kurie lieka drumsti, filtruojami per membraninį filtrą (0,45 m).

IOA koncentracija bandinių filtratuose (pirmieji 5 ml pilami į atliekas) nustatomadu kartus naudojant BOA (bendros organinės anglies) nustatymo aparatūrą. Jei filtrato negalima analizuoti tą pačią dieną, iki kitos dienos jis turi būti laikomas šaldytuve. Ilgiau laikyti nerekomenduojama.

ChDS koncentracija bandinio filtratuose nustatoma su ChDS analizės įranga, taikant (2) nuorodoje aprašytą procedūrą.

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

IOA ir (arba) ChDS koncentracija bandiniuose, gautuose pagal 1.6.2, nustatoma ne mažiau kaip po du kartus. Skaidymas laiku T apskaičiuojamas pagal formulę (su apibrėžimais), pateiktą 1.2 aukščiau.

Skaidymo laipsnis apvalinamas iki artimiausio sveikojo procentų skaičiaus. Bandymo pabaigoje pasiekto skaidymo procentinė vertė ataskaitoje pateikiama kaip „Biologinis skaidomumas Zahn – Wellens bandyme“.

Pastaba: jei medžiaga visiškai suskaidoma, dar nesibaigus bandymui skirtam laikui ir rezultatą patvirtina kitą dieną atlikta dar viena analizė, bandymą galima baigti.

3. ATASKAITA

3.1. Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– pradinė medžiagos koncentracija,

– visa kita informacija ir bandymų rezultatai, susiję su bandomąja medžiaga, etalonine medžiaga, jei buvo naudota, ir tuščiuoju bandymu,

– koncentracija po trijų valandų,

– biologinio skaidymo kreivė su aprašymu,

– data ir vieta, kur buvo imti bandomieji organizmai, adaptavimo būsena, naudota koncentracija ir t. t.,

– mokslinis bet kokių bandymų procedūros pakeitimų pagrindimas.

3.2. Duomenų interpretavimas

Dienas ar savaites vykstantis laipsniškas IOA (ChDS) šalinimas rodo, kad medžiaga biologiškai skaidoma.

Tačiau kai kuriais atvejais gali vykti fizikocheminė adsorbcija ir tai matyti, kai nuo bandymo pradžios per pirmąsias tris valandas vyksta dalinis ar visiškas pašalinimas, o skirtumas tarp kontrolinio ir bandomojo skysčių virš dumblo išlieka netikėtai mažas.

Jei reikia išryškinti skirtumą tarp biologinio skaidymo (ar dalinio biologinio skaidymo) ir adsorbcijos, būtina daryti tolesnius bandymus.

Tai galima daryti įvairiais būdais, tačiau įtikinamiausias būdas yra pamatiniame bandyme (geriau, kad tai būtų respirometrinis bandymas) užkratu naudoti skystį virš dumblo arba dumblą.

Bandomosios medžiagos, kurių neadsorbcinio IOA (ChDS) šalinimo vertės bandyme yra didelės, turi būti laikomos potencialiai biologiškai skaidomomis. Dalinis neadsorbcinis šalinimas rodo, kad cheminė medžiaga bent kažkiek yra biologiškai skaidoma. Mažos ar nulinės IOA (ChDS) šalinimo vertės gali būti dėl mikroorganizmų inhibavimo bandomąja medžiaga, tai dar gali parodyti dumblo irimas ir jo praradimas, dėl ko skystis virš dumblo drumsčiasi. Bandymas turi būti pakartotas naudojant mažesnę bandomosios medžiagos koncentraciją.

Naudojant specifinį junginio analizės metodą arba bandomąsias medžiagas su žymėtais ¹⁴C atomais, gali būti pasiektas didesnis jautrumas. Jei bandomasis junginys turi ¹⁴C, tuomet ¹⁴CO₂ surinkimas patvirtintų, kad biologinis skilimas įvyko.

Kai duomenys pateikiami kaip pirminio biologinio skaidymo rezultatai, turi būti paaiškinta, jei tai įmanoma, kaip pakito cheminė sandara, kad neliko pradinės bandomosios medžiagos atsako.

Turi būti pateiktas analizės metodo galiojimo patvirtinimas ir tuščiojo bandinio terpėje nustatyta skaidymo vertė.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) C.6. Degradation: Chemical Oxygen Demand.

Priedas

VERTINIMO PAVYZDYS

Organinis junginys:	4-Etoksibenzenkarboninė rūgštis
Teorinė bandomoji koncentracija:	600 mg/l
Teorinis IOA kiekis:	390 mg/l
Užkratas	Nuotekų valymo įrenginys...
Koncentracija:	1 gramas sausos medžiagos/litre
Adaptavimo būsena:	Neadaptuotas
Analizės būdas:	IOA nustatymas
Bandinio kiekis:	3 ml
Kontrolinė medžiaga:	Dietilenglikolis
Junginio toksiškumas:	Nėra toksiškumo požymių, kai jo mažiau kaip 1000 mg/l Taikytas bandymas: Fermentavimo mėgintuvėlių bandymas

Bandymo trukmė	Kontrolinė medžiaga						Bandomoji medžiaga
	Tuščiojo bandinio IOA¹, mg/l	IOA¹ mg/l		IOA tikrasis kiekis, mg/l	Skaidymas, %	IOA, mg/l	IOAtikrasis kiekis, mg/l		Skaidymas, %
0	–	–	300,0		–	–		390,0		–
3 valandos	4,0	298,0	294,0		2	371,6		367,6		6
1 para	6,1	288,3	282,2		6	373,3		367,2		6
2 paros	5,0	281,2	276,2		8	360,0		355,0		9
5 paros	6,3	270,5	264,2		12	193,8		187,5		52
6 paros	7,4	253,3	245,9		18	143,9		136,5		65
7 paros	11,3	212,5	201,2		33	104,5		93,2		76
8 paros	7,8	142,5	134,7		55	58,9		51,1		87
9 paros	7,0	35,0	28,0		91	18,1		11,1		97
10 parų	18,0	37,0	19,0		94	20,0		2,0		99
¹ Trijų matavimų vidutinė vertė.

1 paveikslas

Biologinio skaidymo kreivių pavyzdžiai

2 paveikslas

Dumblo adaptavimo pavyzdžiai BIOloginis skaidymas Aktyviojo dumblo modeliavimo bandymas

BIOLOGINIS SKAIDYMAS AKTYVIOJO DUMBLO MODELIAVIMO BANDYMAS

1. METODAS

1.1. Įvadas

1.1.1. Bendrosios pastabos

Metodas tinka tik toms organinėms medžiagoms, kurios bandyme naudojamos koncentracijos:

– vandenyje yra tirpios tiek, kad pakanka ruošti bandomuosius tirpalus,

– garų slėgis bandymo sąlygomis yra labai mažas,

– neinhibuoja bakterijų.

Rezultatų interpretacijai, ypač kai rezultatų vertės yra mažos arba jų skirtumas nuo nulio nėra patikimas, naudinga turėti duomenų apie bandomosios medžiagos pagrindinių komponentų santykinę dalį.

Kai reikia paaiškinti gautas mažas vertes ir pasirinkti tinkamas bandomąsias koncentracijas, pageidautina turėti informacijos apie medžiagos toksiškumą mikroorganizmams.

1.1.2. Biologinio suskaidomumo nustatymas (IOA arba ChDS analizė)

Metodo tikslas yra nustatyti biologinį suskaidomumą, matuojant medžiagos ir bet kurių jos metabolitų šalinimą aktyviojo dumblo įrenginio modelyje, kai medžiagos koncentracija didesnė kaip > 12 mg IOA/litre (arba maždaug 40 mg ChDS/litre); manoma, kad 20 mg IOA/litre koncentracija yra optimali. (IOA – ištirpusi organinė anglis; ChDS – cheminis deguonies suvartojimas).

Turi būti nustatytas organinės anglies kiekis bandomojoje medžiagoje (arba cheminis deguonies suvartojimas).

1.1.3. Pirminio biologinio skaidomumo nustatymas (specifinė analizė)

Metodo tikslas yra nustatyti pirminį medžiagos biologinį skaidomumą aktyviojo dumblo įrenginio modelyje, taikant specifinį analizės metodą, kai medžiagos koncentracija yra apie 20 mg/litre (galima naudoti didesnę arba mažesnę koncentraciją, jei tai leidžia analizės metodas ir toksiškumo prielaida). Tai leidžia įvertinti medžiagos pirminį biologinį skaidomumą (pradinės cheminės sandaros junginio išnykimą).

Šio metodo tikslas nėra nustatyti bandomosios medžiagos mineralizavimą.

Būtina turėti atitinkamą analizės metodą bandomajai medžiagai nustatyti.

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

1.2.1. IOA arba ChDS analizė

Medžiagos šalinimo laipsnis reiškiamas lygtimi:

[1(a)],

čia:

DR = bandomosios medžiagos šalinimo laipsnis procentais IOA (arba ChDS) per duotą sulaikymo trukmę,

T = bandomosios medžiagos koncentracija intakyje, mg IOA/litre (arba mg ChDS/litre),

E = IOA (arba ChDS) koncentracija bandymų įrenginio ištakyje, mg IOA/litre (arba mg ChDS/litre),

E₀= be medžiagos veikiančio bandymo įrenginio ištakio IOA (arba ChDS) koncentracija, mg IOA/litre (arba mg ChDS/litre).

Skaidymas pateikiamas, nurodant bandomosios medžiagos IOA (arba ChDS) šalinimo per nustatytą sulaikymo trukmę procentinę vertę.

1.2.2. Specifinė analizė

Bandomosios medžiagos šalinimo iš vandeninės fazės procentinė vertė (RW) nustatytos vidutinės sulaikymo trukmės ribose skaičiuojama pagal lygtį:

R_W =

C₁-C₀

C₁

×100% [l(b)],

čia:

C₁ = medžiagos koncentracija bandymo įrenginio intakyje (medžiagos kiekis mg/litre, nustatant specifinės analizės metodu),

C₀ = medžiagos koncentracija bandymo įrenginio ištakyje (medžiagos kiekis mg/litre, nustatant specifinės analizės metodu).

1.3. Etaloninės medžiagos

Kai kuriais atvejais, kai tiriamos naujos medžiagos, gali būti naudingos etaloninės medžiagos, tačiau specifinės etaloninės medžiagos vis dar negali būti rekomenduotos.

1.4. Bandymų metodo esmė

Biologiniam suskaidomumui nustatyti lygiagrečiai atliekami bandymai dviejuose eksperimentiniuose aktyviojo dumblo įrenginiuose (OECD patvirtinamasis bandymas arba akytojo indo įrenginiai). Bandomoji medžiaga dedama į intakį vieno iš įrenginių (sintetinių ar buitinių nuotekų), tuo tarpu į antrąjį įrenginį tiekiamos tik nuotekos. Pirminiam biologiniam skaidymui nustatyti, darant specifinę medžiagos analizę intakyje ir ištakyje, naudojamas tik vienas įrenginys.

IOA (arba ChDS) koncentracijos matuojamos ištakiuose arba medžiagos koncentracija nustatoma atliekant specifinę analizę.

IOA atsiradusi dėl bandomosios medžiagos nematuojama, bet paprasčiausiai konstatuojamas jos kiekis.

Kai atliekami IOA (arba ChDS) matavimai, skirtumas vidutinių koncentracijų bandomajame ir kontroliniame ištakiuose priskiriamas nesuskaidytai bandomajai medžiagai.

Kai atliekamama specifinė analizė, galima išmatuoti pradinio junginio molekulių koncentracijos pokytį (pirminis biologinis skaidymas).

Įrenginiai gali būti eksploatuojami „sudvejintų įrenginių režimu“, atliekant persėjimą (transinokuliaciją).

1.5. Kokybės kriterijai

Pradinė tiriamos medžiagos koncentracija priklauso nuo taikomo analizės metodo ir jo apribojimų.

1.6. Bandymų metodo aprašymas

1.6.1. Pasirengimas

1.6.1.1. Aparatūra

Reikia dviejų to paties tipo įrenginių, išskyrus tą atvejį, kai atliekama specifinė analizė. Gali būti naudojami dviejų tipų įrenginiai:

OECD patvirtinamojo bandymo

Įrangą (1 priedas) sudaro indas sintetinėms nuotekoms laikyti (A), dozavimo siurblys (B), aeravimo indas C, nusodintuvas D, aeroliftinis siurblys E aktyviajam dumblui recirkuliuoti ir apdoroto ištakio rinktuvas F.

A ir F indai turi būti iš stiklo arba tinkamo plastiko ir jų talpa turi būti ne mažiau kaip 24 litrai. B siurblys turi užtikrinti nuolatinį sintetinių nuotekų srautą į aeravimo indą; galima naudoti bet kurį tinkamą įrenginį, svarbu, kad būtų užtikrintas tiekimo srautas ir koncentracija. Normalaus darbo metu nustatomas toks D nusodintuvo aukštis, kad maišomo skysčio tūris aeravimo inde būtų trys litrai. Sukepinto stiklo aeravimo kubas G yra pakabintas C indo kūginės dalies viršūnėje. Per aeratorių pučiamo oro kiekį galima kontroliuoti debitometru.

Aeroliftinis siurblys E reguliuojamas taip, kad aktyvusis dumblas iš nusodintuvo tolygiai ir nuolat grąžinamas į aeravimo indą C.

„Akytasis indas“

Akytasis indas yra pagamintas iš akyto polietileno lakštų (2 mm storio, didžiausias akučių dydis 95 μm), kurie susukami į 14 cm skersmens cilindrą su kūginiu 45° pagrindu (2 priedo 1 ir 2 paveikslai). Akytasis indas dedamas į iš tinkamo plastiko pagamintą 15 cm skersmens nepralaidų indą, cilindrinėje dalyje 17,2 cm aukštyje turintį išleidžiamąją angą, kuri nustato skysčio tūrį inde (3 litrai). Vidinio indo viršutinė dalis apjuosta standžiu laikančiuoju žiedu iš tinkamo plastiko taip, kad tarp vidinio ir išorinio indų būtų 0,5 cm ištakiui skirta erdvė.

Akytąjį indą galima įtaisyti ant termostatuojamos vandens vonios dugno. Pro vidinio indo dugną, ant kurio uždėti tinkami difuzoriai, tiekiamas oras.

A ir E indai turi būti iš stiklo ar tinkamo plastiko ir jų talpa turi būti ne mažiau kaip 24 litrai. B siurblys turi užtikrinti nuolatinį sintetinių nuotekų srautą į aeravimo indą; galima naudoti bet kurį tinkamą įrenginį, svarbu, kad būtų užtikrintas tiekimo srautas ir koncentracija.

Reikia turėti atsarginius vidinius akytuosius indus, kad būtų galima pakeisti bet kurį užkimštomis poromis indą; užkimšti indai plaunami 24 valandas, mirkant hipochlorito tirpale, po to gerai išplaunami vandentiekio vandeniu.

1.6.1.2. Filtravimas

Membraninio filtravimo įrenginys ir membraniniai filtrai, kurių akučių dydis 0,45 m. Tinka tokie membraniniai filtrai, kurie neišskiria tirpios anglies ir filtravimo etape neadsorbuoja medžiagos.

1.6.1.3. Nuotekos

Galima naudoti atitinkamą sintetinę mitybinę terpę arba buitines nuotekas.

Sintetinės mitybinės terpės pavyzdys:

Viename litre vandentiekio vandens ištirpinkite:

Peptono:	160 mg
Mėsos ekstrakto:	110 mg
Karbamido:	30 mg
NaCl:	7 mg
CaCl₂ 2H₂O:	4 mg
MgSO₄ 7H₂O:	2 mg
K₂HPO₄:	28 mg

Buitinės nuotekos

Buitinės nuotekos turi būti imamos kiekvieną dieną iš nuotekų valymo įrenginio, kuris daugiausia valo buitines nuotekas, pirminio nusodintuvo perpildos srauto.

1.6.1.4. Bandomosios medžiagos pradinis tirpalas

Bandymo įrenginiui papildyti bandomąja medžiaga turi būti ruošiamas jos tirpalas, pvz., 1%. Norint žinoti, kokį bandomosios medžiagos tirpalo tūrį reikia pilti į nuotekas arba tiesiai antruoju siurbliu į įrenginį, kad būtų gauta reikiama bandomoji koncentracija, turi būti nustatyta bandomosios medžiagos koncentracija.

1.6.1.5. Užkratas

Pastaba: naudojant buitines nuotekas, nėra prasmės naudoti užkrato su maža bakterijų koncentracija, bet galima naudoti aktyvųjį dumblą.

Galima naudoti įvairius užkratus.

Pateikiami trys užkratų pavyzdžiai:

a) užkratas iš antrinio ištakio

užkratas turi būti gautas iš geros kokybės antrinio ištakio, renkant jį iš valymo įrenginio, į kurį daugiausia patenka buitinės nuotekos. Nuo bandinio ėmimo iki naudojimo ištakis turi būti laikomas aerobinėmis sąlygomis. Ruošiant užkratą, bandinys filtruojamas per stambų filtrą ir pirmieji 200 ml filtrato išpilami į atliekas. Kol bus panaudotas, filtratas laikomas aerobinėmis sąlygomis. Užkratas turi būti panaudotas ėmimo dieną. Užkrato dedama ne mažiau kaip 3 ml.

b) sudėtinis užkratas

Užkratas iš antrinio ištakio:

žr. aprašymą aukščiau.

Užkratas iš dirvožemio:

100 g sodo dirvožemio (derlingo, nesterilaus) suspenduojama 1000 ml geriamo chloro neturinčio vandens. (Netinka dirvožemiai, kurių didelė dalis yra molis, smėlis arba humusas). Po sumaišymo suspensija 30 minučių paliekama nusistoti. Skystis virš nuosėdų filtruojamas per stambų filtrinį popierių, pirmuosius 200 ml pilant lauk. Filtratas aeruojamas iš karto ir visą laiką, kol bus panaudotas.

Užkratas turi būti panaudotas ėmimo dieną.

Užkratas iš paviršinio vandens:

Kita užkrato dalis imama iš mezosaprobinio paviršinio vandens. Bandinys filtruojamas per stambų filtrinį popierių, pirmuosius 200 ml pilant lauk. Kol bus panaudotas, filtratas laikomas aerobinėmis sąlygomis. Užkratas turi būti panaudotas ėmimo dieną.

Vienodi trijų atskirų užkratų bandinių tūriai sujungiami, gerai sumaišomi ir iš šio mišinio imamas galutinis užkratas. Užkrato dedama ne mažiau kaip 3 ml.

c) sėjimo kultūra iš aktyviojo dumblo

Užkratu galima naudoti aktyvųjį dumblą (suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija ne didesnė kaip 2,5 g/litre), kurio tam tikras tūris (ne didesnis kaip 3 litrai) imamas iš valymo įrenginio, kuris valo daugiausia buitines nuotekas, aeravimo tanko.

1.6.2. Procedūra

Bandymas atliekamas kambario temperatūroje, kuri turi būti nuo 18 iki 25°C.

Jei tinka, bandymą galima daryti žemesnėje temperatūroje (sumažintoje iki 10°C); jei medžiaga tokioje temperatūroje suiro, paprastai daugiau nereikia tęsti darbo. Tačiau jei medžiaga nesuiro, bandymas turi būti atliekamas įprastinėje, nusistovėjusioje temperatūroje nuo 18 iki 25°C.

1.6.2.1. Įdirbimo laikotarpis: dumblo formavimas/įrenginio stabilizavimas

Dumblo augimo/stabilizavimo laikotarpis, per kurį aktyviojo dumblo suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija ir įrenginio veikimas naudojamomis darbo sąlygomis artėja prie nusistovėjusios būsenos.

Įdirbimo laikotarpis tęsiasi nuo to momento, kai bandomoji medžiaga buvo įdėta pirmą kartą, iki tol, kol šalinimas pasiekia gulsčiąją kreivės dalį (palyginti pastovią vertę). Šio laikotarpio trukmė turi būti ne didesnė kaip šešios savaitės.

Vertinimo laikotarpis trunka tris savaites, tris savaites nuo to laiko, kai bandomosios medžiagos šalinimas pasiekia palyginti pastovią ir paprastai didelę vertę. Toms medžiagoms, kurių skaidymas per pirmąsias šešias savaites yra mažas arba visai nevyksta, vertinimo laikotarpiu laikomos dar trys po to einančios savaitės.

Iš pradžių vienam bandymui skirtą įrenginį (-ius) reikia užpildyti užkratu, sumaišytu su intakiu.

Tuomet įjungiamas aeratorius (ir aeroliftinis siurblys E OECD patvirtinamojo bandymo įrenginių atveju) bei dozavimo įtaisas (B).

Intakio be bandomosios medžiagos srautas per aeravimo indą C turi būti arba litras per valandą arba pusė litro per valandą; tuomet vidutinė sulaikymo trukmė bus lygi trims arba šešioms valandoms.

Aeravimo intensyvumas turi būti reguliuojamas taip, kad indo C turinys būtų visą laiką suspenduotas, o ištirpusio deguonies kiekis būtų ne mažesnis kaip 2 mg/litre.

Atitinkamomis priemonėmis būtina išvengti putojimo. Neturi būti naudojami putas slopinantys priedai, kurie inhibuotų aktyvųjį dumblą.

Dumblas, kuris kaupiasi aeravimo indo C viršuje (OECD patvirtinamojo bandymo įrenginių atveju ir nusodintuvo D apačioje bei cirkuliacijos sistemoje), turi būti grąžinamas į maišomą skystį ne mažiau kaip kartą per parą, nuvalant šepečiu arba kokiu nors kitu tinkamu būdu.

Jei dumblas nesėda, jo tankis gali būti padidintas pridedant, jei reikia, – ir pakartotinai,– 2 ml 5% geležies (III) chlorido tirpalo.

Nuotekos nuo 20 iki 24 valandų leidžiamos į rinktuvą (E arba F), tuomet, mišinį sumaišius, paimamas bandinys. Po to rinktuvas (E ar F) turi būti kruopščiai išplautas.

Proceso veiksmingumui tikrinti bent du kartus per savaitę sukaupto ištakio filtrate matuojamas cheminis deguonies suvartojimas (ChDS) arba ištirpusi organinė anglis (IOA), tai daroma ir intako filtrate (naudojama membrana, kurios akučių dydis 0,45 m, pirmieji 20 ml (maždaug) filtrato išpilami į atliekas).

ChDS arba IOA mažėjimas turi išsilyginti, kai gaunamas maždaug tolygios paros skaidymo vertės.

Sausos medžiagos kiekis aeravimo indo aktyviajame dumble turi būti nustatomas du kartus per savaitę (g/litre). Įrenginius galima eksploatuoti vienu iš dviejų būdų: sausos medžiagos kiekis aktyviajame dumble turi būti nustatomas du kartus per savaitę, ir, jei jis didesnis kaip 2,5 g/litre, perteklinis aktyvusis dumblas turi būti pašalintas arba iš kiekvieno indo kiekvieną dieną išpilama lauk 500 ml nuotekų ir aktyviojo dumblo mišinio, kad vidutinė dumblo sulaikymo trukmė būtų šešios paros.

Kai išmatuoti ir įvertinti dviejų įrenginių parametrai [(proceso veiksmingumas (ChDS arba IOA šalinimas), dumblo koncentracija, dumblo nusodinamumas, ištakių drumstumas ir t. t.] tampa gana stabilūs, į vieno iš įrenginių intaką galima dėti bandomosios medžiagos pagal 1.6.2.2.

Kitu būdu bandomąją medžiagą galima dėti dumblo augimo laikotarpio pradžioje (1.6.2.1), ypač kai dumblas yra dedamas kaip užkratas.

1.6.2.2. Procedūra

Palaikomos įdirbimo laikotarpio darbinės sąlygos ir į bandymo įrenginio intakį dedamas pakankamas kiekis (maždaug 1%) bandomosios medžiagos pradinio tirpalo, kad nuotekose būtų gauta norima bandomosios medžiagos koncentracija (maždaug nuo 10 iki 20 mg/litre DOC arba 40 mg/litre COD). Tai galima padaryti kiekvieną dieną maišant pradinį tirpalą į nuotekas arba naudojant atskirą pumpavimo įrenginį. Šią koncentraciją galima pasiekti laipsniškai. Jei bandomosios medžiagos toksiško poveikio aktyviajam dumblui nenustatyta, galima bandyti didesnes koncentracijas.

Į tuščiojo bandymo įrenginį tiekiamas tik intakis, nededant medžiagos. Analizei imami atitinkamo tūrio bandiniai, kurie filtruojami per membraninį filtrą (0,45 m), pirmuosius 20 ml (maždaug) filtrato pilant į atliekas.

Filtruoti bandiniai turi būti analizuojami tą pačią dieną, priešingu atveju jie turi būti konservuojami kokiu nors tinkamu būdu, pvz., 10 ml filtrato įpilti 0,05 ml 1% gyvsidabrio (II) chlorido (HgCl2) tirpalo arba laikyti bandinius 2–4°C temperatūroje, jei laikoma ne ilgiau kaip 24 valandas, arba mažesnėje nei -18°C temperatūroje, jei ilgesnį laiką.

Įdirbimo laikas, pridedant bandomosios medžiagos, neturi užtrukti ilgiau kaip šešias savaites, o įvertinimo laikotarpis neturi būti trumpesnis kaip trys savaitės, t. y. galutiniam rezultatui skaičiuoti reikia turėti maždaug nuo 14 iki 20 nustatymų.

Sudvejintų įrenginių režimas

Įrenginių sudvejinimas pasiekiamas kartą per dieną 1,5 litro nuotekų ir aktyviojo dumblo mišinio (įskaitant dumblą) iš aktyviojo dumblo aeravimo indų perpilant iš vieno į kitą. Jei bandomosios medžiagos yra labai absorbuojamos, iš nusodintuvų siurbiama po 1,5 litro skysčio virš dumblo ir supilama į kito įrenginio aktyviojo dumblo indą.

1.6.2.2. Analizė

Norint sekti medžiagos elgesį, galima daryti dviejų rūšių analizę:

IOA ir ChDS

IOA koncentracijų nustatymas anglies analizatoriumi daromas po du kartus, ir (arba) ChDS vertės nustatomos pagal (2) nuorodą.

Specifinė analizė

Bandomosios medžiagos koncentracija nustatoma atitinkamu analizės metodu. Tais atvejais, kai tai įmanoma, turi būti daroma ant dumblo absorbuotos medžiagos specifinė analizė.

2. DUOMENYS IR JŲ VERTINIMAS

2.1. Sudvejintų įrenginių režimas

Naudojant „sudvejintų įrenginių režimą“, kasdienis šalinimo laipsnis DR skaičiuojamas pagal 1.2.1.

Šioms kasdienio šalinimo laipsnio DR vertėms daroma pataisa dėl medžiagos pernešimo persėjimo (transinokuliavimo) procese į DRc vertes, taikant [2] lygtį trijų valandų arba [3] lygtį šešių valandų vidutinei sulaikymo trukmei.

DRc = [2]

[3]

Skaičiuojama DRc verčių sekos vidutinė vertė ir papildomai pagal [4] lygtį skaičiuojamas standartinis nuokrypis:

[4]

čia:

S_DR_c = DRc verčių sekos standartinis nuokrypis,

_DRc= vidutinė vertė,

n = nustatymų skaičius.

DRc sekos išskirtys (outliers) eliminuojamos naudojant atitinkamą statistinę metodiką, pvz., Nalimov (6), 95% pasikliovimo lygmeniui, ir DRc rinkinio be išskirčių vidutinė vertė ir standartinis nuokrypis skaičiuojami iš naujo.

Galutinis rezultatas skaičiuojamas pagal lygtį [5]:

[5]

čia:

tn-1;α = iš lentelės paimta t vertė n skaičiui E ir E₀ verčių porų ir statistinis pasikliovimo lygmuo P (P = 1– α), kai P užduotas 95% (1).

Rezultatas pateikiamas nurodant vidutinę vertę su nuokrypio ribomis 95% pasikliovimo lygmeniui, atitinkamą standartinį nuokrypį, DRc duomenų skaičių rinkinyje, atmetus išskirtis, ir išskirčių skaičių, pvz.:

DRc = 98,6 ± 2,3% IOA šalinimas,

s = 4,65% DOC šalinimas,

n = 18,

x = išskirčių skaičius.

2.1. Nesudvejintų įrenginių režimas

Įrenginių veikimas gali būti patikrintas tokiu būdu:

Šios kasdienio šalinimo vertės gali būti atidėtos grafiškai, kad būtų galima atskleisti bet kokias tendencijas, pvz,. aklimatizavimo.

2.2.1. Naudojant ChDS/IOA nustatymus

Kasdienis šalinimo laipsnis DR yra skaičiuojamas pagal 1.2.1.

Skaičiuojama DR verčių sekos vidutinė vertė; papildomai skaičiuojamas standartinis nuokrypis pagal:

[6]

čia:

S_DR = DRi verčių sekos standartinis nuokrypis,

= DR vidutinė vertė,

n = nustatymų skaičius.

DR sekos išskirtys eliminuojamos naudojant atitinkamą statistinę metodiką, pvz., Nalimov (6), 95% pasikliovimo lygmeniui, ir iš naujo skaičiuojami DR rinkinio be išskirties vidutinė vertė ir standartinis nuokrypis.

Rezultatas pateikiamas nurodant vidutinę vertę su nuokrypio ribomis 95% pasikliovimo lygmeniui, atitinkamą standartinį nuokrypį, DR duomenų skaičių rinkinyje, atmetus išskirtis, ir išskirčių skaičių, pvz.:

DR = (98,6 ± 2,3%) IOA šalinimo,

s = 4,65% IOA šalinimo,

n = 18,

x = išskirčių skaičius.

2.2.2. Naudojant specifinę analizę

Bandomosios medžiagos šalinimo iš vandeninės fazės procentinė vertė (R_W) yra skaičiuojama pagal 1.2.2.

3. ATASKAITA

3.1. Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– 3 priede pateiktas blankas, kuriame nurodytos eksploatavimo sąlygos,

– pasirinktasis aparatas (OECD patvirtinamojo bandymo arba akytasis indas),

– pasirinktas eksploatavimo režimas: sudvejintų įrenginių arba ne,

– nuotekos: sintetinės ar buitinės – buitinių nuotekų atveju nurodyti bandinio vietą ir ėmimo datą,

– užkratas su bandinio ėmimo vieta ir data,

– trumpas išdėstymas su analizės metodo aprašymu, jei buvo daroma specifinė analizė,

– ChDS arba IOA šalinimo kitimo laike grafikas, įskaitant įdirbimo ir įvertinimo laikotarpius,

– bandomosios medžiagos pradiniame tirpale analizinės vertės išgavimas ChDS arba IOA pavidalu,

– jei buvo darytos specifinės analizės, bandomosios medžiagos šalinimo iš vandeninės terpės procentinės vertės kitimo laike grafikas (įdirbimo ir įvertinimo laikotarpis),

– bandomosios medžiagos IOA ar ChDS šalinimo vidutinė vertė ir standartinis nuokrypis, skaičiuoti pagal įvertinimo laikotarpio rezultatus, t. y. kai vyksta pastovus bandomosios medžiagos šalinimas arba stabilaus veikimo laikotarpiu,

– aktyviojo dumblo koncentracijos kitimo laike grafikas,

– visos pastabos apie aktyvųjį dumblą (perteklinio dumblo šalinimas, tūrio didėjimas, FeCl3 ir t. t.),

– bandyme naudota bandomosios medžiagos koncentracija,

– visi rezultatai apie dumblo analizę,

– visa informacija ir eksperimentiniai rezultatai, susiję su bandomąja medžiaga ir etalonine medžiaga, jei ji buvo naudota,

– mokslinis bandymų metodikos bet kokių keitimų pagrindimas.

3.2. Duomenų interpretavimas

Mažų bandomosios medžiagos šalinimo iš vandeninės terpės verčių priežastimi gali būti mikroorganizmų inhibavimas veikiant bandomajai medžiagai. Tai galima nustatyti pagal dumblo irimą ir jo kiekio mažėjimą, dėl ko skystis virš dumblo pasidaro drumstas, ir pagal bandomojo įrenginio ChDS (arba IOA) šalinimo našumo mažėjimą.

Kartais įtakos gali turėti fizikocheminė adsorbcija. Skirtumai tarp biologinio poveikio molekulei ir fizikocheminės adsorbcijos gali būti nustatyti atliekant dumblo analizę po atitinkamos desorbcijos.

Siekiant išryškinti skirtumą tarp biologinio skaidymo (arba dalinio biologinio skaidymo) ir adsorbcijos, reikia atlikti tolesnius (papildomus) bandymus.

Tai galima daryti įvairiais būdais, tačiau patikimiausias būdas pamatiniame bandyme (geriau, kad tai būtų respirometrinis bandymas) užkratu naudoti skystį virš dumblo.

Jei stebimos didelės IOA arba ChDS šalinimo vertės, to priežastis yra biologinis skaidymas, tuo tarpu, jei šalinimo vertės mažos, biologinis skaidymas neatskiriamas nuo eliminavimo. Pvz., jei tirpus junginys turi didelę 98% adsorbcijos konstantą, o perteklinio dumblo nuostolių laipsnis yra 10% per parą, eliminavimas gali būti iki 40%; jei perteklinio dumblo nuostolių laipsnis yra 30%, eliminavimas dėl adsorbcijos ant perteklinio dumblo ir pašalinimo kartu su juo gali sudaryti iki 65% (4).

Taikant specifinę analizę, reikia kreipti dėmesį į ryšį tarp medžiagos sandaros ir taikomos specifinės analizės. Šiuo atveju stebimas reiškinys negali būti interpretuojamas kaip junginio mineralizacija.

2. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 303 A, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) EC.6. Degradation Test-Chemical Oxygen Demand.

(3) Painter, H. A., King, E. F., WRC Porous-Pot method for assessing biodegradability, Technical Report TR70, June 1978, Water Research Centre, United Kingdom.

(4) Wierich, P., Gerike, P., The fate of soluble, recalcitrant, and adsorbing compounds in activated sludge plants, Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 5, No 2, June 1981, pp. 161 to 171.

(5) Council Directives 82/242/EEC and 82/243/EEC, Official Journal of the European Communities, No L 109, 22.4.1982, amending Council Directives 73/404/EEC and 73/405/EEC on biodegradability of detergents, Official Journal of the European Communities, No L 347, 17.12.1973.

(6) Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreißetests, insbesondere bei Ringversuchen zur Überprüfung analytisch-chemischer Untersuchungsmetoden, Fresenius-Zeitschrift fur Analytiche Chemie, 303 (1980). pp. 406 to 408.

1 priedas

1 paveikslas

Detalizavimas:

A = indas nuotekoms laikyti;	E = aeroliftinis siurblys;
B = dozavimo įtaisas;	F = rinktuvas;
C = aeravimo kamera (3 l talpos);	G = aeratorius;
D = nusodintuvas;	H = oro debitmatis (neprivalomas).

2 paveikslas

2 priedas

1 paveikslas

Įranga, naudota įvertinant biologinį skaidymą

3493-74b

Detalizavimas:

A = indas nuotekoms laikyti;	E = ištakio rinktuvas;
B = dozavimo siurblys;	F = difuzinis aeratorius;
C = akytas aeravimo indas;	G = rotametras (neprivalomas).
D = išorinis indas su nelaidžiomis sienelėmis;

2 paveikslas

Trijų litrų talpos akyto indo tipo aeratoriaus detalės

3 priedas

Sąlygos vykdyti aktyviojo dumblo modeliavimo bandymą

Žymėti kiekvienoje grupėje

________________________________________________________________________________

Aparatūra

OECD patvirtinamasis bandymas

Akytojo indo bandymas

________________________________________________________________________________

Eksploatavimo režimas

Atskiras įrenginys

Sudvejinti įrenginiai

Nesudvejinti įrenginiai

________________________________________________________________________________

Persėjimas

Netaikomas

Aktyviojo dumblo

Skysčio virš dumblo

________________________________________________________________________________

Vidutinė sulaikymo trukmė

Trys valandos

Šešios valandos

________________________________________________________________________________

Pagrindinė mitybinė terpė

Buitinės nuotekos

Sintetinės nuotekos

Užkratas

Antrinis ištakis

Sudėtinė

Aktyvusis dumblas

________________________________________________________________________________

Bandomosios medžiagos dėjimas

Bandymo pradžioje

Laipsniškai didinant kiekį

Dumblui susidarius

________________________________________________________________________________

Analizė

Specifinė

ChDS

IOA

________________________________________________________________________________

BIOloginis skaidymas AKTYVIOJO DUMBLO KVĖPAVIMO INHIBAVIMO BANDYMAS

1. METODas

1.1. Įvadas

Aprašytas metodas įvertina bandomosios medžiagos poveikį mikroorganizmams, kai apibrėžtomis sąlygomis ir, naudojant skirtingas bandomosios medžiagos koncentracijas, matuojamas kvėpavimo intensyvumas.

Šio metodo tikslas yra duoti greitą atrankos metodą, kuriuo galima būtų identifikuoti medžiagas, galinčias neigiamai veikti aerobinius mikrobinio valymo įrenginius, ir nustatyti bandomųjų medžiagų koncentracijas, kurias naudojant nebūtų inhibavimo ir kurios būtų tinkamos naudoti biologinio skaidymo bandymuose.

Prieš galutinį bandymą gali būti atliekamas intervalo nustatymo bandymas. Jis suteikia informacijos apie koncentracijų, kurias reikia naudoti pagrindiniame bandyme, intervalą.

Į bandymo schemą įtraukti du kontroliniai bandymai be bandomosios medžiagos, vienas daromas bandymų serijos pradžioje, o kitas – pabaigoje. Be to, kiekviena aktyviojo dumblo partija turi būti patikrinta, naudojant etaloninę medžiagą.

Šį metodą lengviausia taikyti medžiagoms, kurios dėl jų tirpumo vandenyje ir mažo lakumo veikiausiai lieka vandenyje.

Medžiagoms, kurių tirpumas bandomojoje terpėje yra ribotas, gali būti neįmanoma nustatyti EC50.

Išvados, padarytos pagal rezultatus, kurie remiasi deguonies suvartojimu, gali būti klaidingos, kai bandomoji medžiaga turi polinkį perskirti oksidavimą ir fosforilinimą oksidacinio fosforilinimo procese.

Bandymui atlikti naudinga turėti tokią informaciją:

– tirpumas vandenyje,

– garų slėgis,

– struktūrinė formulė,

– bandomosios medžiagos grynumas.

Patarimas

Aktyviajame dumble gali būti potencialiai patogeninių organizmų, todėl elgtis su juo reikia atsargiai.

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

Kvėpavimo intensyvumas yra nuotekų aerobiniame dumble esančių mikroorganizmų deguonies suvartojimas, paprastai reiškiamas mg O2 vienam mg dumblo per valandą.

Norint skaičiuoti konkrečios koncentracijos bandomosios medžiagos inhibuojamąjį veikimą, kvėpavimo intensyvumas reiškiamas dviejų kontrolinių kvėpavimo intensyvumo verčių vidurkio procentine dalimi:

čia:

Rs = deguonies suvartojimo intensyvumas, bandant konkrečią bandomosios medžiagos koncentraciją,

= deguonies suvartojimo intensyvumas 1 kontroliniame bandyme,

= deguonies suvartojimo intensyvumas 2 kontroliniame bandyme.

EC₅₀ šiame metode yra bandomosios medžiagos koncentracija, kurią naudojant kvėpavimo intensyvumas sudaro 50% kvėpavimo intensyvumo kontroliniame kvėpavimo bandyme šiame metode aprašytomis sąlygomis.

1.3. Etaloninės medžiagos

Rekomenduojama kaip etaloninę medžiagą naudoti 3,5-dichlorfenolį, kuris yra žinomas kvėpavimo inhibitorius, ir naudoti jį kaip priemonę patikrinti, ar dumblo jautrumas nėra nenormalus, nustatant medžiagos EC₅₀ kiekvienai aktyviojo dumblo partijai.

1.4. Bandymų metodo esmė

Aktyvusis dumblas pamaitinamas standartiniu kiekiu mitybinės terpės, kurią sudaro sintetinės nuotekos, ir po 30 min arba 3 valandų sąlyčio arba abiem atvejais matuojamas dumblo kvėpavimo intensyvumas. Taip pat matuojamas to paties aktyviojo dumblo kvėpavimo intensyvumas, pridėjus skirtingų koncentracijų bandomosios medžiagos, kai kitos sąlygos yra identiškos. Bandomosios medžiagos inhibuojamasis veikimas, esant konkrečiai koncentracijai, išreiškiamas dviejuose kontroliniuose bandymuose gautų verčių vidurkio procentine dalimi. Pagal matavimus skirtingose koncentracijose apskaičiuojama EC₅₀ vertė.

1.5. Kokybės kriterijai

Bandymo rezultatai validūs, jei:

– kvėpavimo intensyvumo vertės abiejuose kontroliniuose bandymuose skiriasi mažiau kaip 15%,

– 3,5-dichlorfenolio EC₅₀ (30 minučių ir/arba trijų valandų) yra priimtiname intervale nuo 5 mg/litre iki 30 mg/litre.

1.6. Bandymų metodo aprašymas

1.6.1. Reagentai

1.6.1.1. Bandomosios medžiagos tirpalai

Bandomosios medžiagos tirpalai ruošiami iš pradinio tirpalo prieš pat tyrimo pradžią. Jei daroma pagal toliau aprašytą rekomenduojamą metodiką, tinka 0,5 g/litre koncentracijos pradinis tirpalas.

1.6.1.2. Etaloninės medžiagos tirpalas

3,5-dichlorfenolio tirpalą galima ruošti, pavyzdžiui taip: ištirpinama 0,5 g 3,5-dichlorfenolio 10 ml 1 M NaOH, praskiedžiama distiliuotu vandeniu maždaug iki 30 ml, maišant pilama 0,5 M H2SO4, kol pradeda kristi nuosėdos, tam reikia maždaug 8 ml 0,5 M H₂SO₄, ir galiausiai distiliuotu vandeniu mišinys praskiedžiamas iki vieno litro. pH vertė turi būti intervale nuo 7 iki 8.

1.6.1.3. Sintetinės nuotekos

Sintetinių nuotekų mitybinė terpė ruošiama tirpinant tokius šių medžiagų kiekius 1 litre vandens:

– 16 g peptono,

– 11 g mėsos ekstrakto,

– 3 g karbamido,

– 0,7 g NaCl,

– 0,4 g CaCl₂ 2H₂O,

– 0,2 g MgSO4 7H₂O,

– 2,8 g K₂HPO4.

1 pastaba: šios sintetinės nuotekos yra koncentratas, kurio koncentracija 100 kartų didesnė nei nuotekų, aprašytų OECD techninėje ataskaitoje „Proposed metod for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents“ (siūlomas paviršinio aktyvumo medžiagų, naudojamų sintetiniuose plovikliuose, biologinio skaidomumo nustatymo metodas) (1976 m. birželio 11 d.), ir pridedant kalio hidrofosfato.

2 pastaba: jei paruošta terpė naudojama ne iš karto, ji turi būti laikoma tamsoje nuo 0 iki 4°C ir ne ilgiau kaip vieną savaitę sąlygomis, kurios nekeistų nuotekų sudėties. Prieš dedant saugoti, terpę galima sterilizuoti, arba peptonas ir mėsos ekstraktas dedami prieš pat bandymo pradžią. Prieš naudojant terpė turi būti gerai sumaišoma ir nustatoma jos pH vertė.

1.6.2. Aparatūra

Matavimo aparatas: tiksli konstrukcija nėra svarbi. Tačiau turi būti talpa apie kakliuką skysčio pertekliui, o elektrodas turi būti priderintas sandariam įstatymui į matavimo butelio kakliuką.

Be įprastos laboratorijos įrangos, dar reikalinga tokia speciali įranga:

– matavimo aparatas,

– aeravimo įtaisas,

– pH-elektrodas ir pH matavimo įranga,

– O₂elektrodas.

1.6.3. Užkrato ruošimas

Bandymuose mikroorganizmų užkratu naudojamas aktyvusis dumblas iš valymo įrenginio, valančio daugiausia buitines nuotekas.

Jei būtina, grįžus į laboratoriją stambias daleles galima pašalinti, paliekant dumblą trumpą laiką, pvz., 15 minučių, nusistoti ir viršutinį smulkesnių dalelių sluoksnį dekantuoti bei toliau naudoti. Kitu būdu dumblą galima sumaišyti, kelioms sekundėms įjungus greitaeigį maišytuvą.

Be to, jei manoma, kad gali būti inhibuojančių medžiagų, dumblas turi būti išplautas vandentiekio vandeniu arba izotoniniu tirpalu. Po centrifugavimo skystis nuo nuosėdų dekantuojamas (taip plaunama tris kartus).

Nedidelis dumblo kiekis pasveriamas ir išdžiovinamas. Remiantis šiuo rezultatu, galima apskaičiuoti, kiek šlapio dumblo reikia suspenduoti vandenyje, kad gautame aktyviojo dumblo ir vandens mišinyje suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija būtų nuo 2 g/litre iki 4 g/litre. Toks kiekis atitinka koncentraciją bandomojoje terpėje nuo 0,8 iki 1,6 g/litre, jei būtų taikoma toliau rekomenduota metodika.

Jei nėra galimybės dumblą panaudoti rinkimo dieną, vienam litrui aktyviojo dumblo įpilama 50 ml sintetinių nuotekų mitybinės terpės, paruoštos, kaip aprašyta aukščiau; ir mišinys per naktį aeruojamas 20 ± 2°C temperatūroje. Dieną jis ir toliau aeruojamas, kol bus panaudotas. Prieš naudojant dumblą, tikrinama pH vertė ir prireikus nustatoma intervale nuo 6 iki 8. Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija aktyviojo dumblo ir nuotekų mišinio bandinyje turi būti nustatyta, kaip tai aprašyta ankstesnėje pastraipoje.

Jei ta pati dumblo partija turi būti naudojama kitomis dienomis (ne vėliau kaip po keturių parų), kiekvienos darbo dienos pabaigoje vienam litrui dumblo įpilama dar 50 ml sintetinių nuotekų mitybinės terpės.

1.6.4. Bandymo eiga

Trukmė/sąlyčio trukmė:	30 minučių ir (arba) trys valandos aeravimo sąlygomis
Vanduo:	Geriamasis vanduo (prireikus dechloruotas)
Oro tiekimas:	Švarus, be alyvos oras. Oro srautas – nuo 0,5 iki 1 l/min
Matavimo aparatūra:	Plokščiadugnė kolba, pvz., BDS kolba
Deguonies matuoklis:	Tinkamas deguonies elektrodas ir registravimo įrenginys (savirašis)
Mitybinis tirpalas:	Sintetinės nuotekos (žr. aukščiau)
Bandomoji medžiaga:	Bandomosios medžiagos tirpalas ruošiamas prieš bandymo pradžią
Etaloninė medžiaga:	Pvz., 3,5-dichlorfenolis (ne mažiau kaip trys koncentracijos)
Kontroliniai bandymai:	Užkrato bandinys be bandomosios medžiagos
Temperatūra:	20 ± 2°C.

Toliau pateikiama siūloma eksperimento procedūra, kurią galima taikyti ir bandomajai ir etaloninei medžiagai trijų valandų sąlyčio trukmės atvejui:

Naudojami keli indai (pvz., vieno trijų litrų talpos laboratorinės stiklinės). Turi būti naudojamos bent penkios koncentracijos, besiskiriančios pastoviu santykiu, geriausiai ne didesniu kaip 3,2.

Laiku „0“ 16 ml sintetinių nuotekų mitybinės terpės vandeniu skiedžiama iki 300 ml. Įpilama 200 ml mikrobinio užkrato ir visas mišinys (500 ml) supilamas į pirmąjį indą (pirmasis kontrolinis bandymas C1).

Bandymų indai turi būti visą laiką aeruojami tiek, kad ištirpusio O₂ kiekis būtų ne mažesnis kaip 2,5 mg/litre ir kad prieš pat kvėpavimo intensyvumo matavimą O₂ koncentracija būtų apie 6,5 mg/litre.

Laiku „15 minučių“ (15 minučių trukmė yra laisvai pasirenkama, tačiau tai patogus laiko tarpas) kartojama, kas padaryta anksčiau, tik prieš skiedžiant vandeniu iki 300 ml ir pilant mikrobinio užkrato iki 500 ml, į 16 ml sintetinių nuotekų įpilama 100 ml pradinio bandomosios medžiagos tirpalo. Šis mišinys supilamas į antrą indą ir aeruojamas, kaip nurodyta aukščiau. Kas 15 minučių veiksmų seka kartojama, imant skirtingus bandomosios medžiagos pradinio tirpalo tūrius, kad būtų gauta eilė indų su skirtingomis bandomosios medžiagos koncentracijomis. Paskutinis ruošiamas antrasis kontrolinis bandinys (C₂).

Po trijų valandų fiksuojama pH vertė, ir gerai sumaišytas pirmojo indo turinio bandinys supilamas į matavimo aparatą, kuriame ne ilgiau kaip 10 minučių matuojamas kvėpavimo intensyvumas.

Šis nustatymas kas 15 minučių kartojamas su kiekvieno indo turiniu tokiu būdu, kad sąlyčio trukmė visuose induose būtų trys valandos.

Tokiu pat būdu su kiekviena mikrobinio užkrato porcija bandoma etaloninė medžiaga.

Jei reikia matuoti 30 min sąlyčio sąlygomis, būtina taikyti kitokį matavimo režimą (pvz., turėti daugiau nei vieną deguonies matuoklį).

Jei reikia nustatyti cheminį deguonies suvartojimą, ruošiami papildomi indai su bandomąja medžiaga, sintetinių nuotekų mitybine terpe ir vandeniu, bet be aktyviojo dumblo. Deguonies suvartojimas matuojamas ir užrašomas po 30 minučių ir/ar trijų valandų aeravimo (sąlyčio trukmė).

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Kvėpavimo intensyvumas skaičiuojamas pagal savirašio užrašą apytikriai tarp 6,5 mg/litre O₂ ir 2,5 mg/litre O₂ arba 10 minučių tuo laikotarpiu, jei kvėpavimo intensyvumas yra mažas. Kvėpavimo kreivės dalis, kurioje matuojamas kvėpavimo intensyvumas, turi būti tiesiška.

Jei kvėpavimo intensyvumas dviejuose kontroliniuose bandymuose vienas nuo kito skiriasi daugiau kaip 15% arba etaloninės medžiagos EC₅₀ (30 minučių ir/arba trijų valandų) nėra priimtiname intervale (nuo 5 iki 30 mg/litre 3,5-dichlorfenoliui), bandymas yra nevalidus ir turi būti pakartotas.

Inhibavimo procentinė vertė skaičiuojama kiekvienai bandomajai koncentracijai (žr. 1.2). Procentinės inhibavimo vertės priklausomybė nuo koncentracijos brėžiama logaritminiame (arba logaritminiame-tikimybiniame) popieriuje, ir gaunama EC₅₀ vertė.

95% pasikliovimo intervalai EC₅₀ vertėms gali būti nustatyti, taikant standartines procedūras.

3. ATASKAITA

3.1. Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– bandomoji medžiaga: cheminio identifikavimo duomenys,

– bandymų sistema: aktyviojo dumblo šaltinis, koncentracija ir bet koks pradinis kondicionavimas,

– bandymų sąlygos:

– reakcijos mišinio pH vertė prieš kvėpavimo intensyvumo matavimą,

– bandymų temperatūra,

– bandymų trukmė,

– etaloninė medžiaga ir jos išmatuota EC₅₀vertė,

– abiotinis deguonies suvartojimas (jei tai vyko),

rezultatai:

– visi gauti duomenys,

– inhibavimo kreivė ir metodas EC₅₀ skaičiuoti,

– EC₅₀ ir, jei įmanoma, 95% pasikliovimo intervalus, EC₂₀ ir EC₈₀,

– visi pastebėjimai ir bet kokie nukrypimai nuo šio bandymo metodo, kurie galėtų turėti įtakos rezultatui.

3.2. Duomenų interpretavimas

Į EC₅₀ vertę turi būti žiūrima tiktai kaip į orientacinį bandomosios medžiagos toksiškumą nuotekų valymo aktyviuoju dumblu procesui arba nuotekų mikroorganizmams, kadangi aplinkos sudėtingų sąveikų laboratoriniame bandyme negalima tiksliai modeliuoti. Be to, bandomosios medžiagos, kurios gali inhibuoti amoniako oksidavimą, taip pat gali duoti netipiškas inhibavimo kreives. Taigi šios kreivės turi būti interpretuojamos atsargiai.

4. NUORODOS

(1) International Standard ISO 8192-1986.

(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, p. 165.

(3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer. L., Chemosphere 10, 1981, p. 245.

(4) ETAO (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries), Recommended Method No 103, dar aprašyti:

(5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, p. 80.

(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, p. 247.

(7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C(81) 30 final.

BIOloginis skaidymas

MODIFIkuotas SCAS bandymas

1. METODAS

1.1. Įvadas

Metodo tikslas yra įvertinti vandenyje tirpių, nelakių organinių medžiagų galimą biologinį suskaidymą, kai jas ilgą laiką veikia palyginti didelės mikroorganizmų koncentracijos. Mikroorganizmų gyvybingumas tuo laikotarpiu palaikomas kiekvieną dieną pridedant nusistojusių nuotekų mitybinės terpės. (Savaitgaliais nuotekas galima laikyti 4oC temperatūroje. Dar galima naudoti sintetines nuotekas, kurios naudojamos OECD patvirtinamajame bandyme).

Ant suspenduotų standžiųjų dalelių gali vykti fizikocheminė adsorbcija, todėl į tai turi būti atsižvelgta interpretuojant rezultatus (žr. 3.2).

Dėl skystosios fazės didelės sulaikymo trukmės (36 valandos) ir dėl nutrūkstamo mitybinių medžiagų pridėjimo bandymas nemodeliuoja nuotekų valymo įrenginio sąlygų. Rezultatai, gauti įvairioms bandymų medžiagoms, rodo, kad bandymas turi didelį biologinio skaidymo potencialą.

Bandyme sudarytos sąlygos yra labai palankios atrankai ir /arba adaptavimui mikroorganizmų, galinčių suskaidyti bandomąją medžiagą. (Procedūra gali būti taikoma ruošimui aklimatizuotų užkratų kitiems bandymams.)

Šiame metode bandomosios medžiagos biologiniam suskaidymui įvertinti naudojamas ištirpusios organinės anglies (IOA) kiekio matavimas. Pirmenybė teikiama atvejui, kai IOA nustatoma po parūgštinimo ir prapūtimo, o ne kaip skirtumas C_bendroji – C_neorganinė.

Lygiagrečiai taikant specifinį analizės metodą, gali būti įmanoma įvertinti medžiagos pirminį biologinį skaidymą (pirminės cheminės sandaros išnykimas).

Metodas tinka tik toms organinėms bandomosioms medžiagoms, kurios, esant bandyme naudojamai koncentracijai:

– tirpios vandenyje (ne mažiau kaip 20 mg/litre ištirpusios organinės anglies),

– garų slėgis yra labai mažas,

– neinhibuoja bakterijų,

– bandymų sistemoje adsorbuojamos tik nežymiu laipsniu,

– iš bandomojo tirpalo nepradingsta dėl putojimo.

Turi būti nustatytas organinės anglies kiekis bandomojoje medžiagoje.

Norint paaiškinti gautus rezultatus, ypač kai rezultatai yra maži arba nežymūs, naudinga būtų turėti informacijos apie bandomosios medžiagos pagrindinių komponentų santykinę dalį.

Mažų rezultatų verčių interpretavimui ir tinkamos bandomosios koncentracijos parinkimui pageidautina turėti informacijos apie medžiagos toksiškumą mikroorganizmams.

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

CT = bandomosios medžiagos koncentracija, skaičiuojama organinės anglies kiekiu, kuris yra nusistovėjusiose nuotekose ar pridedamas į jas aeravimo laikotarpio pradžioje (mg/litre),

Ct = ištirpusios organinės anglies koncentracija, nustatyta bandomajame skystyje virš nuosėdų aeravimo laikotarpio pabaigoje (mg/litre),

Cc = ištirpusios organinės anglies koncentracija, nustatyta kontrolinio bandinio skystyje virš nuosėdų aeravimo laikotarpio pabaigoje (mg/litre).

Šiame bandyme biologinis skaidymas nustatomas kaip organinės anglies išnykimas.

Biologinį skaidymą galima išreikšti:

1. Kiekvieną dieną įdedamos medžiagos šalinimo procentinė vertė D_ds:

[1]

čia D_ds = skaidymas/kasdienis pridėjimas.

2. Kiekvienos dienos pradžioje turimo medžiagos kiekio šalinimo procentinė vertė Dssd:

čia D_ssd = skaidymas/medžiagos kiekis dienos pradžioje;

indeksai i ir (i + 1) nurodo matavimo dieną.

2(a) lygtį rekomenduojama taikyti, jei ištakio IOA kinta diena po dienos, o 2(b) lygtis gali būti taikoma, kai ištakio IOA diena po dienos palyginti pastovi.

1.3. Etaloninės medžiagos

Kai kuriais atvejais, kai tiriamos naujos medžiagos, etaloninės medžiagos gali būti naudingos, tačiau nėra specifinės etaloninės medžiagos, kurią galima būtų rekomenduoti šiam bandymui.

Yra pateikti pirminiai duomenys apie kelis junginius, įvertintus tarplaboratorinio lyginimo bandymuose (žr. 1 papildymą), taigi retkarčiais metodą galima patikrinti ir rezultatus palyginti su rezultatais, gautais kitais metodais.

1.4. Bandymų metodo esmė

Aktyvusis dumblas iš nuotekų valymo įrenginio dedamas į pusiau nepertraukiamo veikimo aktyviojo dumblo įrenginį [Semi-Continuous Activated Sludge (SCAS)]. Įdedama bandomosios medžiagos ir nusistojusių buitinių nuotekų, mišinys aeruojamas 23 valandas. Paskui aeravimas stabdomas, dumblas paliekamas nusistoti ir skystis virš dumblo pašalinamas.

Aeravimo kameroje likęs dumblas maišomas su kita bandomosios medžiagos ir nuotekų dalimi ir ciklas kartojamas.

Biologinio skaidymo buvimas įrodomas nustatant ištirpusios organinės anglies kiekį skystyje virš dumblo. Ši vertė lyginama su verte, gauta skysčiui kontroliniame reaktoriaus vamzdyje, kuriame buvo tik nuotekos.

Taikant specifinį analizės metodą, galima nustatyti pradinės medžiagos koncentracijos mažėjimą dėl jos molekulių biologinio skaidymo (pirminį biologinį skaidomumą).

1.5. Kokybės kriterijai

Šio metodo, kuris remiasi ištirpusios organinės medžiagos šalinimu, atkuriamumas dar nėra nustatytas. (Kai tiriamas pirminis biologinis skaidymas, labai tikslūs duomenys yra gauti medžiagoms, kurios skaidomos dideliu laipsniu.)

Metodo jautrumą dideliu laipsniu lemia tuščiojo bandymo kintamumas ir kiek mažiau ištirpusios anglies nustatymo preciziškumas ir bandomosios medžiagos kiekis skystyje kiekvieno ciklo pradžioje.

1.6. Bandymų eigos aprašymas

1.6.1. Paruošiamieji darbai

Oro tiekimo vamzdeliai (1 paveikslas) jungiami prie reikiamo skaičiaus švarių aeravimo įrenginių, skirtų kiekvienai bandymo medžiagai ir kontroliniams bandymams, arba galima naudoti originalųjį 1,5 litro SCAS bandymo įrenginį. Į įrenginius per medvilnės filtrą tiekiamame suslėgtame ore neturi būti organinės anglies ir garavimo nuostoliams mažinti oras turi būti prisotintas vandens garų.

Aktyviojo dumblo ir nuotekų mišinio bandinys, kuriame būtų nuo 1 iki 4 g/litre suspenduotų standžiųjų dalelių, gaunamas iš daugiausia buitines nuotekas valančio aktyviojo dumblo įrenginio. Kiekvienam aeravimo įrenginiui reikia maždaug 150 ml aktyviojo dumblo ir nuotekų mišinio.

Pradiniams bandomosios medžiagos tirpalams ruošti naudojamas distiliuotas vanduo; paprastai reikia, kad organinės anglies koncentracija būtų 400 mg/litre, tokiu atveju bandomosios medžiagos koncentracija kiekvieno aeravimo ciklo pradžioje, kai nevyksta biologinis skaidymas, yra 20 mg/litre.

Galima naudoti didesnes koncentracijas, jei tai įmanoma, dėl medžiagos toksiškumo mikroorganizmams.

Nustatomas organinės anglies kiekis pradiniuose tirpaluose.

1.6.2. Bandymų sąlygos

Bandymas turi būti atliekamas 20–25°C temperatūroje.

Naudojama didelė aerobinių mikroorganizmų koncentracija (nuo 1 iki 4 g/litre suspenduotų standžiųjų dalelių), ir veiksmingoji sulaikymo trukmė yra 36 valandos. Anglingoji medžiaga nuotekų mitybinėje terpėje oksiduojama dideliu laipsniu, paprastai tai įvyksta per aštuonias valandas nuo kiekvieno aeravimo ciklo pradžios. Po to iki aeravimo laikotarpio pabaigos dumblas kvėpuoja endogeniškai, tuo metu vienintelis substratas yra bandomoji medžiaga, jei ji pati nebuvo lengvai įsisavinta. Šios savybės, kartu su užkrato kasdieniu keitimu, kada kaip terpė naudojamos buitinės nuotekos, užtikrina labai palankias aklimatizavimo sąlygas ir galimybę biologiškai skaidyti dideliu laipsniu.

1.6.3. Bandymų eiga

Iš tinkamo aktyviojo dumblo valymo įrenginio arba laboratorinio įrenginio, skirto valyti daugiausia buitines nuotekas, imamas nuotekų ir aktyviojo dumblo mišinys, kuris visą laiką, kol bus panaudotas laboratorijoje, laikomas aerobinėmis sąlygomis. Į kiekvieną aeravimo įrenginį ir į kontrolinį įrenginį įpilama po 150 ml šio mišinio (jei naudojamas originalus SCAS bandymo įtaisas, nurodytus tūrius reikia dauginti iš 10) ir pradedama aeruoti. Po 23 valandų aeravimas baigiamas ir dumblas 45 minutėms paliekamas nusistoti. Kiekvieno indo čiaupas paeiliui atidaromas, ir iš jo paimama po 100 ml skysčio virš dumblo. Prieš pat naudojimą paimamas nusistojusių buitinių nuotekų bandinys, ir 100 ml nuotekų įpilama į kiekvieną aeravimo įrenginį su likusiu jame dumblu. Vėl pradedama aeruoti. Šioje pakopoje bandomoji medžiaga nededama, ir į įrenginius kiekvieną dieną pilama buitinių nuotekų tol, kol skystis virš nusistojusio dumblo tampa skaidrus. Tai dažniausiai trunka ne ilgiau kaip dvi savaites, per tą laiką ištirpusios organinės anglies kiekis skystyje virš dumblo kiekvieno aeravimo ciklo pabaigoje pasiekia pastovią vertę.

Kai šis laikotarpis baigiasi, atskirieji nusistojusio dumblo bandiniai yra sumaišomi ir į kiekvieną įrenginį dedama po 50 ml gauto sudėtinio dumblo.

Į kontrolinius įrenginius įpilama 95 ml nusistojusių nuotekų ir 5 ml vandens, į bandomuosius įrenginius įpilama 95 ml nusistojusių nuotekų ir 5 ml atitinkamos bandomosios medžiagos pradinio tirpalo (400 mg/litre). Aeruoti pradedama iš naujo ir aeravimas tęsiamas 23 valandas. Po to dumblas paliekamas 45 minutėms nusistoti, skystis virš dumblo nusiurbiamas ir jame nustatomas ištirpusios organinės anglies kiekis.

Aukščiau aprašytas užpylimo ir siurbimo procesas kartojamas kasdien iki bandymo pabaigos.

Prieš paliekant dumblą nusistoti, gali tekti jį nuvalyti nuo įrenginio sienelių, kad kietosios dalelės nesikauptų virš skysčio. Norint išvengti kryžminio užkrėtimo, kiekvienas įrenginys turi turėti atskirą gremžtuką ar šepetį.

Geriausia būtų, kad ištirpusi organinė anglis skystyje virš dumblo būtų nustatoma kiekvieną dieną, nors analizę leidžiama daryti rečiau. Prieš analizę skysčiai filtruojami per išplautus 0,45 m membraninius filtrus arba centrifuguojami. Membraniniai filtrai tinka, jei užtikrinama, kad filtravimo pakopoje jie neišskiria anglies ir nesugeria medžiagos. Centrifuguojamo bandinio temperatūra neturi būti didesnė kaip 40°C.

Bandymo trukmė junginiams, kurie yra mažai skaidomi arba visiškai neskaidomi, nėra apibrėžta, tačiau patyrimas sako, kad dažniausiai tai turi trukti bent 12 savaičių, bet ne ilgiau kaip 26 savaites.

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Ištirpusios anglies kiekio vertės, nustatytos bandomųjų ir kontrolinių įrenginių skysčiuose virš nuosėdų, atidedamos grafiškai kaip laiko funkcija.

Baigus biologinį skaidymą, bandomajame įrenginyje nustatytas lygis artėja prie kontroliniame bandinyje rasto lygio. Kai skirtumas tarp abiejų lygių trijuose iš eilės matavimuose nekinta, dar atliekama tiek matavimų, kiek jų pakanka duomenims statistiškai apdoroti, ir skaičiuojama bandomosios medžiagos biologinio skaidymo procentinė vertė (Dds ar Dssd, žr. 1.2).

3. ATASKAITA

3.1. Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– visa informacija apie nuotekų prigimtį, naudoto įrenginio tipą ir eksperimentiniai rezultatai, gauti bandomajai medžiagai, etaloninei medžiagai, jei buvo naudojama, ir tuščiajam bandymui,

– temperatūra,

– šalinimo kreivė su aprašymu, skaičiavimo būdu (žr. 1.2),

– data ir vieta, kur buvo imti aktyviojo dumblo ir nuotekų bandiniai, adaptavimo būsena, koncentracija ir t. t.,

– mokslinis bet kokių bandymų metodikos keitimų pagrindimas,

– parašas ir data.

3.1. Duomenų interpretavimas

Kadangi medžiaga, skirta šiuo metodu bandyti, biologiškai nėra lengvai skaidoma, bet koks IOA šalinimas vien tik dėl biologinio skaidymo paprastai vyksta laipsniškai dienas arba savaites, išskyrus tuos atvejus, kai įvyksta staigus aklimatizavimas, apie kurį rodo staigus išnykimas, įvykstantis po kelių savaičių.

Svarbų vaidmenį gali vaidinti fizikocheminė adsorbcija; ją rodo pridėtos IOA visiškas arba dalinis išnykimas bandymo pradžioje. Kas atsitinka vėliau, priklauso nuo kai kurių faktorių, pvz., adsorbcijos laipsnio, ir suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracijos išleidžiamajame ištakyje. Paprastai skirtumas tarp IOA koncentracijos kontrolinio bandymo ir bandomosios medžiagos skystyje virš nuosėdų laipsniškai didėja nuo pradinės mažos vertės ir toliau šis skirtumas pasiekęs naują vertę išlieka toks iki bandymo pabaigos, jei neįvyksta aklimatizavimas.

Jei reikia išryškinti skirtumą tarp biologinio skaidymo (ar dalinio biologinio skaidymo) ir adsorbcijos, būtina atlikti tolesnius bandymus. Tai galima daryti įvairiais būdais, tačiau įtikinamiausias būdas yra pamatiniame bandyme (geriau, kad tai būtų respirometrinis bandymas), kaip užkratą naudojant skystį virš dumblo arba dumblą.

Bandomosios medžiagos, kurių neadsorbcinio IOA šalinimo vertės bandyme yra didelės, turi būti laikomos potencialiai biologiškai skaidomomis. Dalinis neadsorbcinis šalinimas rodo, kad cheminė medžiaga bent kažkiek yra biologiškai skaidoma.

Mažos ar nulinės IOA (ChDS) šalinimo vertės gali būti dėl mikroorganizmų inhibavimo bandomąja medžiaga, tai dar gali parodyti dumblo irimas ir jo praradimas, dėl ko skystis virš dumblo drumsčiasi. Bandymas turi būti pakartotas, naudojant mažesnę bandomosios medžiagos koncentraciją.

Naudojant specifinį junginio analizės metodą ar bandomąsias medžiagas su žymėtais ¹⁴C atomais, gali būti pasiektas didesnis jautrumas. Jei bandomasis junginys turi ¹⁴C, ¹⁴CO₂ surinkimas patvirtintų, kad biologinis skilimas įvyko.

Kai duomenys pateikiami, kaip pirminio biologinio skaidymo rezultatai, turi būti paaiškinta, jei tai įmanoma, kaip pakito cheminė sandara, kad neliko pradinės bandomosios medžiagos atsako.

Turi būti pateiktas analizės metodo galiojimo patvirtinimas ir tuščiojo bandymo terpėje nustatyta skaidymo vertė.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 A. Decision of the Council C(81) 30 final.

1 priedas

SCAS bandymas: rezultatų pavyzdys

Medžiaga	C_T (mg/l)	C_t – C_c (mg/l)	Biologinio skaidymo procentinė vertė, Dds	Bandymo trukmė(paros)
4-acetilaminobenzensulfonatas	17,2	2,0	85	40
Tetrapropenbenzensulfonatas	17,3	8,4	51,4	40
4-nitrofenolis	16,9	0,8	95,3	40
Dietilenglikolis	16,5	0,2	98,8	40
Anilinas	16,9	1,7	95,9	40
Ciklopentantetrakarboksilatas	17,9	3,2	81,1	120

2 priedas

1 paveikslas

______________

^* Norint išvengti gyvsidanbrio diseminavimo aplinkoje, panaudoti tirpalai su gyvsidabrio druskomis turi būti apdoroti