LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS
Į S A K Y M A S
DĖL ANTIBAKTERINIŲ MEDŽIAGŲ LIKUČIŲ ŠVIEŽIOJE MĖSOJE NUSTATYMO TECHNINIO REGLAMENTO PATVIRTINIMO
2003 m. sausio 24 d. Nr. 3D-23
Vilnius
Siekdamas, kad antibakterinių medžiagų likučiai šviežioje mėsoje būtų nustatomi pagal tarptautinius reikalavimus atitinkančią metodiką,
tvirtinu Antibakterinių medžiagų likučių šviežioje mėsoje nustatymo techninį reglamentą (pridedama).
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro
2003 m. sausio 24 d. įsakymu Nr. 3D-23
ANTIBAKTERINIŲ MEDŽIAGŲ LIKUČIŲ ŠVIEŽIOJE MĖSOJE nustatymo
Techninis REGLAMENTAS
Šis reglamentas parengtas vadovaujantis Europos Tarybos 1996 m. balandžio 29 d. direktyva 96/23/EB dėl priemonių nustatant žinomas medžiagas ir likučius gyvuose gyvūnuose ir gyvūniniuose produktuose. Didžiausi leistini veterinarinės medicinos preparatų likučių kiekiai gyvūniniuose maisto produktuose patvirtinti Lietuvos Respublikos valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus 2000 m. gruodžio 29 d. įsakymu Nr. 395 (Žin., 2001, Nr. 13-416).
Europos ekonominės bendrijos šalyse antibakterinių medžiagų likučiams šviežioje mėsoje nustatyti vartojamas mikrobiologinis difuzinis taip vadinamas „EEB keturių lėkštelių“ metodas (angl. EEC-four-plate-method), parengtas Bogaerts ir Wolf 1980 m., ir įvairios jo modifikacijos. Metode naudojamos dvi jautrios antibakterinėms medžiagoms etaloninės kultūros – Bacillus subtilis BGA ir Micrococcus luteus ATCC 9341. Metodas yra kokybinis (aptikimo). Aptikimo ribos priklauso nuo antibakterinių medžiagų grupės. Metodo jautrumas mikrogramais kilograme skirtingiems antibiotikams matuojamas kaip optimalus jautris 10 µl etaloninio tirpalo ant 6 mm popierinio skrituliuko, susidarant 6 mm (streptomicinui – 8 mm) jautrios kultūros augimo stabdymo skaidriai inhibicijos zonai.
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Antibakterinių medžiagų likučių šviežioje mėsoje nustatymo techninis reglamentas (toliau – Reglamentas) nustato antibakterinių medžiagų likučių kiekius apibūdinančius rodiklius Lietuvoje pagamintoje ar įvežtoje bei į rinką teikiamoje mėsoje bei jų nustatymo metodus. Tai rutininis metodas, kuris gali būti tikrinamas chromatografiniu metodu (HPLC).
II. VARTOJAMOS SĄVOKOS
3. Šiame reglamente vartojamos tokios sąvokos:
Mėsa – visos atrajotojų, kiaulių, neporakanopių žemės ūkio gyvulių ir nelaisvėje užaugintų žvėrių, išskyrus paukščius, kūno dalys, tinkančios žmonių maistui.
Šviežia mėsa – mėsa, taip pat ir įpakuota vakuuminiu būdu ar inertinių dujų atmosferoje, kuri saugant nuo gedimo nebuvo specialiai apdorota jokiu kitu būdu, išskyrus šaltį.
Antibakterinės medžiagos (veterinarinės medicinos preparatų likučiai) – įvairios biologinės ar cheminės prigimties medžiagos, slopinančios mikroorganizmų augimą.
III. TYRIMO METODAS
4. Šis metodas skirtas antibakterinių medžiagų (benzilpenicilino, sulfanilamidų, streptomicino ir eritromicino) likučiams nustatyti šviežioje mėsoje.
5. Metodas pagrįstas difuzijos į agarą testu: filtrinio popieriaus skrituliukai, sumirkyti mėsos syvuose, dedami ant keturių Petri lėkštelių, iš kurių į tris įpilta standžios terpės (pH 6,0; pH 7,2; ir pH 8,0) su Bacillus subtilis sporomis, ir į vieną – standžios terpės (pH 8,0) su Micrococcus luteus sporomis. Kad būtų padidintas B. subtilis jautrumas sulfonamidams, į terpę, kurios pH 7,2, įpilama trimetoprimo tirpalo. Kai mėsos mėginiuose yra antibakterinių medžiagų likučių, po inkubacijos aplink popierinius skrituliukus atsiranda jautrios kultūros augimo stabdymo skaidrios zonos.
6. Sporų suspensijos ruošimas:
6.1. Sporų suspensijai ruošti naudojamos etaloninės padermės Bacillus subtilis BGA ir Micrococcus luteus ATCC 9341.
6.2. Gautos etaloninių padermių kultūros persėjamos ant nuožulniai sustangdinto mitybos agaro (10.5 p.) ir inkubuojamos 18 h:B. subtilis – 30 °C temperatūroje, M. luteus – 37 °C temperatūroje. Persėtos kultūros laikomos 2 °–6 °C temperatūroje, persėjamos vieną kartą per mėnesį.
6.3. Roux buteliai ar Petri lėkštelės su mitybos agaru (9.5 p.) užsėjamos tiršta B. subtilis BGA ląstelių suspensija fiziologiniame tirpale. Buteliai ar lėkštelės inkubuojami 10 dienų 30 °C temperatūroje. Tada į kiekvieną butelį ar į kiekvieną Petri lėkštelę įpilama fiziologinio tirpalo, išaugusi kultūra suspenduojama ir perpilama į butelį ar kolbą. Ši procedūra kartojama dar kartą. Surinkta suspensija centrifuguojama 10 min. 3000 min.-1 greičiu. Atsiskyręs nuo nuosėdų skystis nusiurbiamas. Nuosėdos suspenduojamos kitame fiziologinio tirpalo tūryje ir vėl centrifuguojama. Procedūra kartojama, kol skystis virš nuosėdų tampa skaidrus. Skaidrus skystis virš nuosėdų nusiurbiamas, nuosėdos suspenduojamos fiziologiniame tirpale, ir gauta suspensija kaitinama 30 min. 70 °C temperatūroje. Kaitinta suspensija atvėsinama šaltame vandenyje, skiedžiama fiziologiniu tirpalu iki 107 sporų 1 ml (sporų skaičius nustatomas sėjimo į mitybos agarą būdu).
Sporų suspensija gali būti laikoma keletą savaičių 2 °–6 °C temperatūroje. 1 ml sporų suspensijos pilamas į 1000 ml tyrimui naudojamos terpės (8.1 p.; 8.2 p. ir 8.3 p.), kad būtų gauta 104 sporų 1 ml terpės.
7. Visi reagentai turi būti analiziškai gryni. Turi būti naudojamas distiliuotas arba lygiavertės kokybės vanduo, t. y. be medžiagų, kurios galėtų stabdyti ar veikti mikroorganizmų augimą tyrimo sąlygomis. Gali būti naudojamos įgytos prekyboje sausos terpės.
8. Tyrimo terpės:
8.1. Penicilinų ir tetraciklinų nustatymo terpės, kurios pH 6,0 (Merck, katalogo Nr. 1.10663), sudėtis:
peptonas iš kazeino, hidrolizuoto tripsinu 3,45 g;
peptonas iš mėsos, hidrolizuotos tripsinu 3,45 g;
natrio chloridas 5,1 g;
agaras 13,0 g;
vanduo 1000 ml.
8.2. Sulfanilamidų nustatymo terpės, kurios pH 7,2 (Merck, katalogo Nr. 1.15787), sudėtis:
peptonas 7,0 g;
natrio chloridas 5,0 g;
Na3 PO4×12 H2O 0,8 g;
agaras 13 g;
vanduo 1000 ml.
9. Terpių ir tirpalų paruošimas:
9.1. Terpių difuzijai į agarą paruošimas. 8.1 p., 8.2 p., 8.3 p. nurodyti komponentai ar sausos terpės (8.1 p. – 25 g; 8.2 p. – 25,8 g ir 8.3 p. – 27,5 g) ištirpinamos vandenyje. Jeigu reikia, pH paderinamas taip, kad po sterilizavimo jis būtų: 8.1 p. terpės – pH 6,0±0,1; 8.2 p. – pH 7,2±0,1 ir 8.3 p. – pH 8,0±0,1, esant 25 °C temperatūrai. Terpės sterilizuojamos 15 min. autoklave 121 °C temperatūroje. Į atvėsintas iki 45 °C–50 °C terpes (8.1 p., 8.2 p. ir 8.3 p.) įpilama po 1 ml/l B. subtilis BGA sporų suspensijos, o į terpę, kurios pH 7,2 (8.2 p.), įpilamas 1 ml (5 µg/ml) trimetoprimo tirpalo (9.2 p.). Į terpę, kurios pH 8,0 (8.3 p.), įpilamas toks M. luteus ATCC 9341 suspensijos kiekis, kad sporų skaičius terpėje būtų apytiksliai 104 KSV/ml. Terpės išpilstomos į Petri lėkšteles maždaug 2 mm sluoksniu (90 mm skersmens lėkštelei reikia maždaug 12 ml terpės). Kai lėkštelės nesunaudojamos tuoj pat, jos gali būti laikomos ne ilgiau kaip vieną savaitę 2 °C–6 °C temperatūroje.
9.2. Trimetoprimo tirpalo paruošimas: 50 mg trimetoprimo (Sigma, katalogo Nr. 7883) ištirpinama 5 ml 5 % acto rūgšties ir skiedžiama vandeniu iki 500 ml. Po to 1 ml tirpalo skiedžiamas vandeniu iki 20 ml. Gauto darbinio tirpalo koncentracija 5 µg/ml. Paruošto tirpalo 1 ml pilamas į 100 ml terpės. Trimetoprimo tirpalas gali būti laikomas 2 °C–6 °C temperatūroje ne ilgiau kaip dvi savaites.
9.3. Fiziologinio tirpalo paruošimas: 8 g natrio chlorido ištirpinami vandenyje, praskiedžiama iki 1 000 ml ir sterilizuojama 15 min. autoklave 121 °C temperatūroje.
9.4. Smegenų ir širdies ekstrakto sultinio paruošimas. Jo sudėtis:
veršelių smegenų ekstraktas 12,5 g;
galvijų širdžių ekstraktas 5,0 g;
peptonas 10,0 g;
natrio chloridas 5,0 g;
gliukozė 2,0 g;
natrio hidrofosfatas (Na2HPO4) 2,5 g;
vanduo 1000 ml.
Nurodyti komponentai ar sausa terpė (Merck, katalogo Nr. 1.10493; Oxoid, katalogo Nr. CM 225; Difco, katalogo Nr. 0037-01-6) ištirpinama vandenyje. Jeigu reikia, pH paderinamas taip, kad po sterilizavimo jis būtų 7,4±0,1 esant 25 °C temperatūrai. Terpė sterilizuojama 15 min. 121 °C temperatūroje.
9.5. Mitybos agaro paruošimas. Jo sudėtis:
peptonas iš mėsos 3,45 g;
peptonas iš kazeino 3,45 g;
natrio chloridas 5,1 g;
agaras 13,0 g;
vanduo 1000 ml.
Nurodyti komponentai ar sausa terpė (25 g Merck, katalogo Nr. 1.07883) ištirpinama vandenyje. Jeigu reikia, pH paderinamas taip, kad po sterilizavimo jis būtų pH 7,5±0,1 esant 25 °C temperatūrai. Terpė sterilizuojama 15 min. 121 °C temperatūroje. Po sterilizavimo terpė išpilstoma į mėgintuvėlius (sustangdinant nuožulniai) ir Roux butelius maždaug po 300 ml ar Petri lėkšteles maždaug 2 mm sluoksniu (90 mm skersmens lėkštelei reikia maždaug 12 ml terpės).
9.6. Etaloninių tirpalų paruošimas:
9.6.1. Sulfametazino tirpalo paruošimas: 10 mg sulfametazino (Sigma, katalogo Nr. S 6256 arba United States Pharmacopea – USP 62900) ištirpinama 5 ml 0,2 N (arba 0,1 N) NaOH ir skiedžiama vandeniu iki 200 ml. Gauto darbinio tirpalo koncentracija – 50 μg/ml (1 mg ‒966 μg veikliosios medžiagos). Sulfametazino tirpalas gali būti laikomas 2°C–6°C temperatūroje ne ilgiau kaip dvi savaites.
9.6.2. Penicilino G (natrio druskos) tirpalo paruošimas: 61 mg penicilino (Sigma, katalogo Nr. PEN-NA arba USP 50250) skiedžiama vandeniu iki 100 ml. Gauto tirpalo 0,1 ml skiedžiamas vandeniu iki 100 ml. Darbinio tirpalo koncentracija 1 TV/ml (1 mg – 1664 TV). Penicilino G tirpalas gali būti laikomas 2 °C–6°C temperatūroje ne ilgiau kaip 4 dienas.
9.6.3. Streptomicino tirpalo paruošimas: 64 mg streptomicino (Sigma, katalogo Nr. S 6501 arba USP 62300) skiedžiama vandeniu iki 50 ml. Gauto tirpalo 1 ml skiedžiamas vandeniu iki 20 ml. Darbinio tirpalo koncentracija 50 µg/ml (1 mg – 777 µg veikliosios medžiagos). Streptomicino tirpalas gali būti laikomas 2 °C–6°C temperatūroje ne ilgiau kaip dvi savaites.
9.6.4. Eritromicino tirpalo paruošimas: 52 mg eritromicino (Sigma, katalogo Nr. S 6376 arba USP 24200) ištirpinama 3 l. Gauto tirpalo 0,1 ml etanolio ir supilama į matavimo kolbą. Po to skiedžiama vandeniu iki 50 ml skiedžiamas vandeniu iki 20 ml. Darbinio tirpalo koncentracija 50 µg/ml (1 mg – 966 g veikliosios medžiagos). Eritromicino tirpalas gali būti laikomas 2 °C–6 °C temperatūroje ne ilgiau kaip dvi savaites.
10. Tyrimo eiga:
10.1. Kontrolinių Petri lėkštelių paruošimas. Ant Petri lėkštelių su išpilstyta terpe (su B. subtilis sporomis – pH 6,0; 7,2; 8,0 ir su M. luteus sporomis – pH 8,0) išdėliojama po du 6 mm skersmens popierinius skrituliukus (Schleicher and Schuell Ref. Nr. 10321260), ant kurių užpilama po 10 µl etaloninių antibiotikų tirpalų pagal lentelę.
| Nr. |
Terpės pH |
Testavimo kultūra |
Antibakterinės medžiagos kiekis |
Testavimo kultūros |
|
|
|
|
6 mm skersmens popieriniame |
augimo stabdymo zonos |
|
|
|
|
skrituliuke |
plotis, mm |
|
|
|
|
|
|
| 1. |
6,0 |
Bacillus subtilis |
0,01 TV penicilino G |
6 |
| 2. |
7,2 |
– „ – |
0,5 µg sulfametazino |
6 |
| 3. |
8,0 |
– „ – |
0,5 µg streptomicino |
8 |
| 4. |
8,0 |
Micrococcus luteus |
0,5 µg eritromicino |
6 |
|
|
tiriamas skritulys (12 mm skersmens filtrinio popieriaus skrituliukas, sumirkytas mėsos syvuose) |
| testavimo kultūros augimo stabdymo zonos plotis |
10.2. Tiriamųjų mėginių ruošimas ir tyrimo atlikimas. Tyrimui ruošiami mėsos mėginiai, paimti aseptinėmis sąlygomis. Tiriami atšaldytos iki 2 °C–6 °C temperatūros arba atšildytos (sušaldytos minus 18 °C temperatūroje) mėsos mėginiai. Kiekvieno mėginio viršutinis sluoksnis nupjaunamas steriliu skalpeliu. Tada mėginys įpjaunamas steriliu skalpeliu arba peiliu. Ant kiekvieno mėsos mėginio įpjauto paviršiaus steriliu pincetu sudėliojama po aštuonis 12 mm skersmens filtrinio popieriaus skrituliukus (Schleicher and Schuell Ref. Nr. 10321262) ir uždengiama viršutiniu mėsos sluoksniu. Taip paruošti mėginiai paliekami 0,5 h 18 °C–22 °C temperatūroje, kad į popierinius skrituliukus įsigertų reikiamas mėsos syvų kiekis (0,05 ml). Į kiekvieną paruoštą Petri lėkštelę ant terpės paviršiaus priešpriešiais padedama po du popierinius skrituliukus. Petri lėkštelės su B. subtilis BGA sporomis inkubuojamos 18–24 h 30 °C temperatūroje, o su M. luteus ATCC 9341 sporomis 18–24 h 37 °C temperatūroje.
11. Kai mėginiai tiriami, praėjus daugiau kaip 6 h po paėmimo, jie turi būti sušaldomi minus 18°C temperatūroje.
12. Mėsa, kurios mikrobinis užterštumas yra didesnis už nurodytą HN 26, netinka antibakterinių medžiagų tyrimams.
13. Rezultatų aiškinimas: kontrolinėse Petri lėkštelėse testavimo kultūrų augimo stabdymo zonų pločiai turi būti apie 6 mm. Tyrimo rezultatas teigiamas (antibakterinių medžiagų rasta), kai ant vienos ar daugiau Petri lėkštelių testavimo kultūros augimo stabdymo zonos plotis ne siauresnis kaip 2 mm. Į atskiras kolonijas stabdymo zonoje nekreipiama dėmesio.
14. Tyrimas kartojamas, kai platesnė kaip 2 mm testavimo kultūros augimo stabdymo zona būna tik aplink vieną skrituliuką su tiriamu mėginiu ant vienos lėkštelės ar kai rezultatai gali būti netikslūs dėl bakterinio užterštumo.