LIETUVOS RESPUBLIKOS SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRAS
Į S A K Y M A S
DĖL CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ IR PREPARATŲ MUTAGENIŠKUMO TYRIMO MEODŲ PATVIRTINIMO
2004 m. liepos 5 d. Nr. V-507
Vilnius
Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų įstatymo (Žin., 2000, Nr. 36-987) 6 straipsnio 2 dalimi, Cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmogaus sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos, patvirtintos Lietuvos Respublikos aplinkos ministro 2000 m. gruodžio 29 d. įsakymu Nr. 762/556 „Dėl cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmonių sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos“ (Žin., 2001, Nr. 3-60) 11.1 punktu ir įgyvendindamas 1967 m. birželio 27 d. Tarybos direktyvos 67/548/EEB dėl šalių narių įstatymų, reglamentų ir administracinių nuostatų, susijusių su pavojingų medžiagų klasifikavimu, pakavimu ir ženklinimu, suvienodinimo, Komisijos direktyvos 1988 m. lapkričio 18 d. devintąjį kartą su technikos pažanga derinančios Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo 88/302/EEB, 1999 m. gegužės 31 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyvos 1999/45/EB dėl šalių narių įstatymų, reglamentų ir administracinių nuostatų, susijusių su pavojingų preparatų klasifikavimu, pakavimu ir ženklinimu, suvienodinimo, Komisijos direktyvos 2000/32/EB 2000 m. gegužės 19 d. dvidešimt šeštą kartą derinančios su technikos pažanga Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo reikalavimus:
1. Tvirtinu pridedamus cheminių medžiagų ir preparatų mutageniškumo tyrimo metodus:
1.5. Mutageniškumas ir kancerogeniškumo patikrinimas. Genų mutacijos. Saccharomyces cerevisiae bandymas (B15);
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B10 metodas: MUTAGENIŠKUMAS. ŽINDUOLIŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJŲ In vitro bandymas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas
1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 473 metodu.
1.2. Chromosomų aberacijų tyrimo tikslas – identifikuoti medžiagas, sukeliančias žinduolių ląstelių, kultivuojamų in vitro, chromosomų aberacijas. Struktūrinės aberacijos gali būti dviejų tipų – chromosominės arba chromatidinės. Nors dauguma cheminių mutagenų sukelia chromatidines aberacijas, tačiau pasitaiko ir chromosominių aberacijų. Poliploidiškumo reiškimosi intensyvumas rodo, kad cheminė medžiaga gali sukelti chromosomų skaičiaus pasikeitimus. Tačiau šio metodo tikslas nėra nustatyti chromosomų skaičiaus pokyčius, ir paprastai tam jis nėra taikomas. Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra chromosomų mutacijos bei su jomis susiję įvykiai; esama pakankamai įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl chromosomų mutacijų bei su jomis susijusių įvykių.
1.3. Tiriant chromosomų aberacijas in vitro galima naudoti gerai žinomų ląstelių linijų, ląstelių kamienų arba pirminių ląstelių kultūras. Naudojamos ląstelės pasirenkamos pagal jų sugebėjimą augti kultūroje, kariotipų stabilumą, chromosomų skaičių, chromosomų įvairovę ir spontaninių chromosomų aberacijų dažnį.
1.4. Atliekant tyrimus in vitro reikia naudoti egzogeninį metabolinės aktyvacijos šaltinį. Ši metabolinės aktyvacijos sistema negali visiškai pakeisti žinduolių in vivo sąlygų. Reikia stengtis išvengti tokių sąlygų, kurioms esant būtų gaunami teigiami rezultatai, neatspindintys vidinio mutageniškumo ir galintys atsirasti pakeitus pH, osmosinį slėgį arba dėl citotoksiškumo.
1.5. Tyrimas atliekamas, kai ieškoma galimų žinduolių mutagenų ar kancerogenų. Daugelis cheminių medžiagų, taikant šį tyrimą duodančių teigiamus rezultatus, yra žinduolių kancerogenai; tačiau nėra aiškaus ryšio tarp šio tyrimo rezultatų ir kancerogeniškumo. Ryšys priklauso nuo cheminių medžiagų klasės; yra neginčijamų įrodymų, kad šio tyrimo metu negalima nustatyti tam tikrų kancerogenų, nes jie ne tiesiogiai pakenkia DNR. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
2. Apibrėžimai
2.1. Chromatidinė aberacija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip pavienių chromatidžių suardymas arba kaip chromatidžių suardymas ir susijungimas.
2.2. Chromosominė aberacija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip abiejų seserinių chromatidžių trūkis arba kaip jų abiejų trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje.
2.3. Endoreduplikacija – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos sintezės (S) periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S periodas. Taip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 ir t. t. chromatidžių.
2.4. Spraga (plyšys) – achromatinė, mažesnė nei vienos chromatidės plotis spraga, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių.
2.5. Mitozės indeksas – mitozės metafazėje esančių ląstelių ir viso ląstelių populiacijos skaičiaus santykis, rodantis tos ląstelių populiacijos proliferacijos laipsnį.
2.6. Chromosomų skaičiaus aberacija – ląstelėse esančių chromosomų skaičiaus pokytis palyginus su normaliu jų skaičiumi, būdingu toms ląstelėms.
2.7. Poliploidija – haploidinio chromosomų skaičiaus (n), išskyrus diploidinį skaičių (t. y. 3n, 4n ir t. t.), kartotinis.
3. Bandymo metodo principas
3.1. Ląstelių kultūros veikiamos tiriamąja chemine medžiaga esant metabolinei aktyvacijai ar be jos.
3.2. Ląstelių kultūras paveikus tiriamąja medžiaga, tam tikrais laiko tarpais jos veikiamos ląstelių dalijimąsi metafazėje stabdančia medžiaga (pavyzdžiui, Kolcemidu© arba kolchicinu), surenkamos, dažomos, o metafazėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu, kad būtų nustatytos chromosomų aberacijos.
4. Bandymo metodo aprašymas
4.1. Pasiruošimas
4.1.1. Ląstelės. Galima naudoti įvairiausias ląstelių linijas, kamienus arba pirmines ląstelių, tarp jų ir žmonių ląstelių, kultūras (pavyzdžiui, kiniško žiurkėno fibroblastus, žmogaus ar kitų žinduolių periferinio kraujo limfocitus).
4.1.2. Terpė ir kultivavimo sąlygos. Kultūros turėtų būti kultivuojamos reikiamoje terpėje, esant reikiamoms inkubacijos sąlygoms (kultivavimui skirtuose induose, esant reikiamai CO2 koncentracijai, temperatūrai ir drėgmei). Nuolat tikrinama, ar gerai žinomų ląstelių linijos ir kamienai išlaiko pastovų modalinį chromosomų skaičių, ar jos neužkrėstos mikoplazmomis (jei užkrėstos, tai toliau nebenaudojamos). Turi būti žinoma ląstelių ciklo trukmė bei taikomos kultivavimo sąlygos.
4.1.3. Kultūrų paruošimas
4.1.3.1. Gerai žinomų ląstelių linijų ir kamienų ląstelės padauginamos iš kamieninių kultūrų, pasėjamos terpėje tokiu tankumu, kad, prieš ląsteles surenkant, kultūros nesusilietų, po to jos inkubuojamos 37 °C temperatūroje.
4.1.4. Metabolinė aktyvacija
4.1.4.1. Ląstelės turėtų būti paveikiamos tiriamąja medžiaga tiek esant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai, tiek ir nesant. Plačiausiai naudojama sistema yra iš graužikų kepenų, paveiktų fermentinį aktyvumą skatinančiais agentais Aroklor 1254 ar fenobarbitono ir b-naftoflavono mišiniu, postmitochondrine frakcija, praturtinta kofaktoriumi.
4.1.4.2. Postmitochondrinė frakcija paprastai naudojama tokių koncentracijų, kurių intervalas tyrimo metu naudojamoje galutinėje terpėje siekia 1–10 % (pagal tūrį). Metabolinės aktyvacijos sistema gali priklausyti nuo bandomosios medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga naudoti daugiau nei vieną postmitochondrinės frakcijos koncentraciją.
4.1.4.3. Endogeninę aktyvaciją galima pagerinti, taikant genetinės inžinerijos metodais gautas ląstelių linijas, gaminančias specifinius, aktyvacijoje dalyvaujančius fermentus. Tyrime naudojamų ląstelių linijų pasirinkimas turėtų būti moksliškai pagrįstas (pavyzdžiui, pagal citochromo P450 izofermento svarbą tiriamos cheminės medžiagos metabolizmui).
4.1.5. Bandomoji cheminė medžiaga ar preparatas. Kietosios medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinančiuosiuose įrenginiuose, o jeigu reikia, tai ir praskiestos prieš paveikiant ląsteles šia medžiaga. Prieš bandymą į bandymo sistemą gali būti tiesiogiai suleidžiamos ir/ar praskiedžiamos skystosios bandomosios medžiagos. Bandomieji preparatai naudojami naujai pagaminti, išskyrus atvejus, kai tyrimais įrodytas jų stabilumas.
4.2 Bandymo sąlygos
4.2.1. Tirpiklis ir tirpinantysis įrenginys. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys neturi chemiškai reaguoti su bandomąja medžiaga. Turi būti užtikrinta, kad ląstelės liks išsaugotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai ar tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturėtų būti vandens. Vandenį galima pašalinti molekuliniu filtru.
4.2.2. Poveikio koncentracijos
4.2.2.1. Parenkant pačią didžiausią koncentraciją, vadovaujamasi citotoksiškumu, tirpumu tiriamojoje sistemoje ir pH arba osmosinio slėgio pokyčiais. Citotoksiškumas turėtų būti nustatomas pagrindinio eksperimento metu, esant metabolinei aktyvacijai, remiantis atitinkamais ląstelių vientisumo ir augimo rodikliais, tokiais kaip ląstelių kolonijų susiliejimo laipsnis, gyvų ląstelių skaičius arba mitozės indeksas. Pirminio eksperimento metu naudinga nustatyti toksiškumą ir tirpumą.
4.2.2.2. Naudojamos mažiausiai trys koncentracijos. Jei nustatomas citotoksiškumas, tai šios koncentracijos turėtų svyruoti nuo maksimalaus iki minimalaus citotoksiškumo laipsnio arba jo apskritai neturėtų būti; tai reiškia, kad koncentracijos turi skirtis 2–Ö10 karto. Ląstelių surinkimo metu didžiausia koncentracija turėtų parodyti, kad gerokai sumažėjo ląstelių kolonijų susiliejimo laipsnis ir ląstelių skaičius arba mitozės indeksas (visi rodikliai sumažėjo daugiau nei 50 %). Mitozės indeksas yra tik netiesioginis citotoksinių/citostatinių pasekmių įvertinimo matas ir priklauso nuo laiko, praėjusio po tiriamosios medžiagos poveikio. Mitozės indeksas tinka ląstelių, auginamų suspensijoje, kultūroms, kuriose kiti toksiškumo tyrimai gali būti sudėtingi ir nepraktiški. Duomenys apie ląstelių ciklo kinetinius parametrus, tokius kaip vidutinis ląstelių kartos susiformavimo laikas, gali būti panaudoti kaip pagalbinė informacija. Vidutinis ląstelių kartos susiformavimo laikas, laikomas bendru vidurkiu, ne visada parodo, kad egzistuoja sulėtinto vystymosi subpopuliacijos, ir netgi menkas ląstelių susiformavimo laiko pailgėjimas gali būti susijęs su kur kas ilgesne optimalaus aberacijų skaičiaus atsiradimo trukme.
4.2.2.3. Kai bandomoji medžiaga necitotoksinė, didžiausia poveikio koncentracija turėtų būti 5 ml/ml, 5,5 mg/ml arba 0,01 M, priklausomai nuo to, kuri iš išvardytų koncentracijų pati mažiausia.
4.2.2.4. Kai bandomoji medžiaga mažai tirpi ir netoksiška, o jos koncentracijos mažesnės už tas, kurioms esant medžiaga netirpsta, tai baigiantis veikimui bandomąja medžiaga didžiausios naudojamos dozės koncentracija turėtų viršyti tirpumo ribą paruoštoje, kultivavimui skirtoje terpėje. Kai kuriais atvejais, pavyzdžiui, kai toksiškumas pasireiškia tik tada, kai medžiagos koncentracija šiek tiek didesnė už pačią mažiausią koncentraciją, kuriai esant medžiaga visiškai netirpsta, rekomenduojama patikrinti daugiau nei vieną koncentraciją, kuriai esant susiformuoja matomas precipitatas. Derėtų įvertinti tirpumą prieš veikimą bandomąja medžiaga ir po jo, kadangi tirpumas gali pakisti dėl ląstelių ir S9 serumo, esančių bandymo sistemoje. Netirpumą galima nustatyti vizualiai. Precipitato susidarymas neturėtų trukdyti įvertinti duomenis.
4.2.3. Neigiami ir teigiami kontroliniai bandiniai
4.2.3.1. Atliekant kiekvieną eksperimentą esant metabolinei aktyvacijai arba be jos, kartu naudojami teigiami ir neigiami (tirpikliai, tirpinantysis įrenginys) kontroliniai bandiniai. Kai naudojama metabolinė aktyvacija, tai kartu su teigiamu kontroliniu bandiniu turi būti naudojama aktyvuojanti cheminė medžiaga tam, kad būtų sukuriamas atsakas į mutageną.
4.2.3.2. Teigiamuose kontroliniuose bandiniuose turi būti tokios žinomo elastogeno koncentracijos, kurioms esant bei veikiant bandomąja medžiaga, būtų galima nesunkiai sumažinti pašalinį foną pakartotinai (tai parodo bandymo sistemos jautrumą).
4.2.3.4. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunamas atsakas būtų aiškus, bet tyrėjas negalėtų jo iškart nustatyti. Teigiamų kontrolinių bandinių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje.
1 lentelė. Teigiamų kontrolinių bandinių medžiagų pavyzdžiai
Metabolinės aktyvacijos sąlygos Medžiagos pavadinimas CAS Nr. EINECS Nr.
Be egzogeninės metabolinės Metilmetansulfonatas 66-27-3 200-625-0
aktyvacijos Etilmetansulfonatas 62-50-0 200-536-7
Etilnitrošlapalas 759-73-9 212-072-2
Mitomicinas C 50-07-7 200-008-6
4-nitrokvinolino-N- oksidas 56-57-5 200-281-1
Su egzogenine Benzpirenas 50-32-8 200-028-5
metaboline aktyvacija Ciklofosfamidas 50-18-0 200-015-4
Ciklofosfamido monohidratas 6055-19-2
4.2.3.5. Galima naudoti ir kitas teigiamas kontrolines medžiagas. Kai įmanoma, reikia apsvarstyti teigiamų kontrolinių medžiagų, priklausančių konkrečiai klasei, panaudojimą.
4.2.3.6. Auginant kiekvieną ląstelių rinkinį, reikia naudoti neigiamus kontrolinius bandinius, sudarytus iš terpėje esančio tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio, kurie paveikiami šia terpe lygiai taip pat kaip ir ląstelių kultūros. Taip pat reikia papildomai naudoti ir nepaveiktus kontrolinius bandinius, nekreipiant dėmesio į tai, kad anksčiau atliktų eksperimentų aprašymuose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis nesukėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio.
4.3. Darbo eiga
4.3.1. Poveikis bandomąja medžiaga. Proliferuojančios ląstelės veikiamos bandomąja medžiaga esant metabolinės aktyvacijos sistemai ar be jos. Limfocitai veikiami bandomąja medžiaga, praėjus maždaug 48 valandoms po stimuliacijos mitogenu.
4.3.2. Paprastai naudojamos pakartotinės kiekvienos koncentracijos kultūros, ypač rekomenduojama tai daryti, kai kultivuojamos neigiamos kontrolinės kultūros, terpėje esant vien tirpiklio. Jeigu, remiantis anksčiau atliktų eksperimentų aprašymais, galima parodyti, kad tarp kartotinio pasėjimo kultūrų egzistuoja minimalūs skirtumai, tai pavienes kultūras galima tirti terpėje esant skirtingoms tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijoms.
4.3.3. Dujinės ir lakiosios medžiagos tiriamos atitinkamais metodais, tokiais kaip kultivavimas sandariuose induose.
4.3.4. Kultūrų surinkimo laikas. Atliekant pirmąjį eksperimentą, ląstelės, esant metabolinės aktyvacijos sistemai arba jos nesant, bandomąja medžiaga veikiamos 3–6 valandas ir yra surenkamos maždaug kas 1,5 normalaus ląstelinio ciklo nuo poveikio pradžios. Jeigu esant metabolinei aktyvacijai gaunami neigiami rezultatai, reikia atlikti papildomą eksperimentą be metabolinės aktyvacijos, surenkant ląsteles maždaug kas 1,5 normalaus ląstelinio ciklo nuo poveikio pradžios. Kai kurių medžiagų poveikį lengviau nustatyti, jei jomis veikiama ilgiau, o mėginiai paimami praėjus daugiau nei 1,5 ląstelinio ciklo. Neigiami duomenys, gauti naudojant metabolinę aktyvaciją, visada turi būti patvirtinami. Jei manoma, kad nereikia patvirtinti neigiamų rezultatų, tai privalo būti pagrįsta.
4.3.5. Chromosomų paruošimas. Paprastai likus 1–3 valandoms iki surinkimo ląstelių kultūros yra paveikiamos Kolcemidu© arba kolchicinu. Kiekviena ląstelių kultūra surenkama ir atskirai apdorojama. Ruošiant chromosomas, ląstelės paveikiamos hipotoniniu šoku, fiksuojamos ir dažomos.
4.3.6. Analizė
4.3.6.1. Prieš pradedant mikroskopinę analizę, visos skaidrės, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius bandinius, atskirai koduojamos. Kadangi fiksavimo metu metafazėje esančios ląstelės dažnai suyra bei prarandamos chromosomos, tai suskaičiuotos ląstelės turės centromeras, kurių skaičius lygus visų tipų ląstelių modaliniam skaičiui ¹ 2. Jei tiriant kartotinio pasėjimo kultūras, galima naudotis ta pačia kontrole, tai nustatytas centromerų skaičius bus lygus 200 gerai matomų metafazių. Centromerų skaičius gali sumažėti, kai stebima daug aberacijų.
II. Duomenys
5. Duomenų apdorojimas
5.1. Ląstelė yra eksperimentinis vienetas, todėl ląstelių, turinčių struktūrines aberacijas, skaičius išreiškiamas procentais. Pateikiami chromosomų struktūrinių aberacijų tipai nurodant jų skaičių bei pasireiškimo dažnį bandomosiose ir kontrolinėse ląstelių kultūrose. Atskirai registruojami chromosomų plyšiai, tačiau nustatant absoliutų aberacijų dažnį, į juos neatsižvelgiama.
5.2. Registruojamos tarpusavyje sutampančios priemonės, kurios naudojamos citotoksiškumui vertinti pagrindinio bandymo bandomosiose ir neigiamose kontrolinėse kultūrose.
6. Duomenų įvertinimas ir interpretacija
6.1. Nuo koncentracijos priklausomas bei pakartojamas chromosomines aberacijas turinčių ląstelių skaičiaus padidėjimas yra kriterijai, kuriais remiantis nustatoma, ar bandymo rezultatai teigiami. Vertinant tyrimo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis kriterijus, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas.
6.2. Poliploidinių ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad bandomoji medžiaga gali slopinti mitozę ir sukelti chromosomų skaičiaus ląstelėje pakitimus. Ląstelių, turinčių endoreduplikuotas chromosomas, skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti ląstelinį ciklą.
6.3. Jei gauti rezultatai neatitinka šio metodo 6.1 ir 6.2 punktuose nurodytų kriterijų, tai bandomoji medžiaga pagal šio metodo sąlygas laikoma nemutageniška.
6.4. Po daug bandymų, gavus aiškius teigiamus ir aiškius neigiamus rezultatus, dažniausiai galima padaryti išvadą apie bandomosios medžiagos savybes, remiantis gautų duomenų visuma. Net ir daug kartų pakartojus konkretų bandymą, jo rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs.
6.5. Šiuo metodu gauti teigiami rezultatai rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia chromosomų aberacijas kultivuotose somatinėse žinduolių ląstelėse. Neigiami rezultatai rodo, kad šiame metode aprašytomis bandymo sąlygomis bandomoji medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų kultivuotose somatinėse žinduolių ląstelėse.
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
7. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija:
7.1. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys
7.2. Ląstelės
7.2.5. kraujo donorų, iš kurių buvo gauti viso kraujo mėginiai ar iš kurių kraujo buvo išskirti limfocitai, lytis bei panaudotas mitogenas;
7.3. Bandymo sąlygos
7.3.1. metafazę sustabdančios cheminės medžiagos prigimtis, koncentracija bei laikas, kurį ši medžiaga veikė ląsteles;
7.3.2. pagrindinė priežastis, dėl kurios buvo pasirinktos koncentracijos ir ląstelių kultūrų kultivavimo skaičius nurodant, jei įmanoma, citotoksiškumo tyrimo duomenis ir tirpumo ribas;
7.4. Rezultatai
7.4.1. toksiškumo požymiai, pavyzdžiui, ląstelių kultūrų kolonijų susiliejimo laipsnis, ląstelinio ciklo duomenys, ląstelių skaičius, mitozinis indeksas;
7.4.5. ląstelių, esančių tiriamąja medžiaga veiktose bei kontrolinėse kolonijose ir turinčių chromosomų aberacijas, skaičius bei chromosomų aberacijų tipas;
7.4.9. vienu metu gauti neigiamų (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) ir teigiamų kontrolinių bandinių tyrimų duomenys;
IV. NUORODOS
9. Evans H. J. (1976), Cheminių mutagenų aptikimo citologiniai metodai (Cheminių mutagenų aptikimo principai ir metodai, 4 t., red. Hollaender A., Plenum Press, Niujorkas, Londonas, 1–29).
10. Ishidate M. Jr., Sofumi T. (1985), In vitro chromosomų aberacijos bandymas naudojant kinietiškų žiurkėnų plaučių (CHL) fibroblastų ląstelių kultūras (Mutacijų tyrimų progresas, 5 t., red. Ashby J. ir kt., Elsevier Science Publishers, Amsterdamas, Niujorkas, Oksfordas, 427–432).
11. Galloway S. M., Armstrong M. J., Reuben C., Colman S., Brown B., Cannon C., Bloom A. D., Nakamura F., Ahmed M., Duk S., Rimpo J., Margolin G. H., Resnick M. A., Anderson G., Zeiger E. (1978), Chromosomų aberacijos ir seserinių chromatidžių apsikeitimai kinietiško žiurkėno kiaušidės ląstelėse. 108 cheminių medžiagų įvertinimas, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl.10), 1–175.
12. Scott D., Galloway S. M., Marshall R. R., Ishidate M. Jr., Brusick D., Ashby J., Myhr B. C. (1991), Genotoksiškumas ekstremaliomis kultūros sąlygomis. ICPEMC 9 darbo grupės ataskaita, Mutation Res., 257, 147–204.
13. Morita T., Nagaki T., Fukuda I., Okumura K. (1992), Mažo pH klastogeniškumas įvairioms kultivuojamoms žinduolių ląstelėms, Mutation Res., 268, 297–305.
14. Ames B. N., McCann J., Yamasaki E. (1975), Kancerogenų ir mutagenų nustatymo metodai naudojant Salmonella. Žinduolių mikrosomų mutageniškumo bandymas, Mutation Res., 31, 347–364.
15. Maron D. M., Ames B. N. (1983), Patikslinti Salmonella mutageniškumo bandymai, Mutation Res., 113, 173–215.
16. Natarajan A. T., Tates A. D., van Buul P. P. W., Meijers M., de Vogel N. (1976), Mutagenų ir kancerogenų citogeniniai poveikiai po aktyvacijos mikrosominėse sistemose in vitro. I. Chromosomų aberacijų ir seserinių chromatidžių apsikeitimų CHO ląstelėse indukcija dietilnitrozaminu (DEN) ir dimetilnitrozaminu (DMN) naudojant žiurkių kepenų mikrosomas, Mutation Res., 37, 83–90.
17. Matsuoka A., Hayashi M., Ishidate M. Jr. (1979), 29 cheminių medžiagų chromosomų tyrimas naudojant S9 mišinį in vitro, Mutation Res., 66, 277–290.
18. Elliot B. M., Combes R. D., Elcombe C. R., Gatehouse D. G., Gibson G. G., Mackay J. M., Wolf, R. C. (1992), Jungtinės Karalystės aplinkos mutagenų draugijos darbo grupės ataskaita. Alternatyva Aroclor 1254 indukuotam S9 in vitro genotoksiškumo įvertinime, Mutagenesis, 7, 175–177.
19. Matsushima T., Sawamura M., Hara K., Sugimura T. (1976), Saugus polichlorintųjų bifenilų, naudojamų kaip metabolinių aktyvacijos sistemų induktorių, pakaitalas (de Serres F. J., Fouts J. R., Bend J. R., Philpot R. M. (red.), In vitro mutageniškumo tyrimų metabolinė aktyvacija, Elsevier, Šiaurės Olandija, 85–88).
20. Galloway S. M., Aardema M. J., Ishidate M. Jr., Ivett J. L., Kirkland D. J., Morita T., Mosesso P., Sofumi T. (1994), Darbo grupės ataskaita apie chromosomų aberacijų in vitro bandymus, Mutation Res., 312, 241–261.
21. Richardson C., Williams D. A., Allen J. A., Amphlett G., Chanter D. O., Phillips B. (1989), In vitro citogeniškumo įvertinimo duomenų analizė (Mutageniškumo tyrimų duomenų statistinis įvertinimas, Kirkland D. J., Cambridge University Press, Kembridžas, 141–154).
22. Soper K. A., Galloway S. M. (1994), Replikavimo kolbos nereikalingos in vitro chromosomų aberacijoms CHO ląstelėse įvertinti, Mutation Res., 312, 139–149.
23. Krahn D. F., Barsky F. C., McCooey K. T. (1982), CHO/HGPRT mutageniškumo įvertinimas. Dujų ir lakių skysčių įvertinimas (red. Tice R. R., Costa D. L., Schaich K. M., Oro veiksnių genotoksinis poveikis, Niujorkas, Plenum, 91–103.
24. Zamora P. O., Benson J. M., Li A. P., Brooks A. L. (1983), Ląstelių augimą ant kolageno gelių labai lakiems mutagenams aptikti CHO/HGPRT mutacijų įvertinime taikančios poveikio sistemos įvertinimas, Environmental Mutagenesis, 5, 795–801.
25. Locke-Huhle C. (1983), Kinietiško žiurkėno ląstelių endoreduplikacija alfa spinduliuotės indukuoto G2 sustabdymo metu, Mutation Res., 119, 403–413.
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B11 metodas: MUTAGENIŠKUMAS. ŽINDUOLIŲ kaulų čiulpų CHROMOSOMŲ
ABERACIJŲ In vivo bandymas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas
1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 475 metodu.
1.2. Žinduolių chromosomų aberacijų bandymas in vivo naudojamas nustatyti struktūrinėms chromosomų aberacijoms, kurias bandomoji cheminė medžiaga sukelia žinduolių, paprastai graužikų, kaulų čiulpų ląstelėse. Chromosomų struktūrinės aberacijos gali būti dviejų tipų – chromosominės arba chromatidinės. Poliploidiškumo reiškimosi intensyvumas rodo, kad cheminė medžiaga gali sukelti chromosomų skaičiaus pasikeitimus. Dauguma cheminių mutagenų sukelia chromatidines aberacijas, tačiau pasitaiko ir chromosominių aberacijų. Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra chromosomų mutacijos bei su jomis susiję įvykiai; esama pakankamai įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl chromosomų mutacijų bei su jomis susijusių įvykių.
1.3. Šiam bandymui paprastai naudojamas griaužikų stuburo skliautas. Pagrindinis tiriamasis audinys yra kaulų čiulpai, nes jie išvagoti daugybės kraujagyslių, be to, kaulų čiulpuose yra daug greitai besidauginančių ląstelių, kurios lengvai išskiriamos ir apdorojamos. Šiuo metodu netiriami kitų rūšių žinduoliai bei jų audiniai.
1.4. Šis bandymas ypač svarbus, kai vertinama mutagenų daroma žala, nes juo galima ištirti metabolizmo, farmakokinetikos ir DNR pažaidų reparacinių procesų veiksnius in vivo, nors jie gali varijuoti tarp skirtingų žinduolių rūšių ir skirtingų audinių. Tyrimas in vivo naudingas ir tuo, kad galima ištirti mutageninius poveikius, anksčiau nustatytus in vitro.
1.5. Jeigu įrodoma, kad bandomoji medžiaga arba reaktyvus jos metabolitas neįsiskverbia į audinį, į kurį buvo nukreiptas, jis nėra naudojamas šiam tyrimui. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
2. Apibrėžimai
2.1. Chromatidinė aberacija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip pavienių chromatidžių suardymas arba kaip chromatidžių suardymas ir susijungimas.
2.2. Chromosominė aberacija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip abiejų seserinių chromatidžių trūkis arba kaip jų abiejų trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje.
2.3. Endoreduplikacija – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos sintezės (S) periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S periodas. Taip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 ir t. t. chromatidžių.
2.4. Spraga (plyšys) – achromatinė, mažesnė nei vienos chromatidės plotis spraga, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių.
2.5. Mitozės indeksas – mitozės metafazėje esančių ląstelių ir viso ląstelių populiacijos skaičiaus santykis, rodantis tos ląstelių populiacijos proliferacijos laipsnį.
2.6. Chromosomų skaičiaus aberacija – ląstelėse esančių chromosomų skaičiaus pokytis palyginus su normaliu jų skaičiumi, būdingu toms ląstelėms.
2.7. Poliploidija – haploidinio chromosomų skaičiaus (n), išskyrus diploidinį skaičių (t. y. 3n, 4n ir t. t.), kartotinis.
3. Bandymo metodo principas. Gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga pagal atitinkamą procedūrą ir atitinkamais laiko tarpais numarinami. Prieš numarinimą gyvūnai paveikiami medžiaga, sustabdančia ląstelių dalijimąsi metafazėje (pavyzdžiui, kolchicinu arba Kolcemidu©). Po to iš kaulų čiulpų ląstelių išskiriamos ir dažomos chromosomos; metafazėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu.
4. Bandymo metodo aprašymas
4.1. Pasiruošimas
4.1.1. Gyvūnų rūšies pasirinkimas. Paprastai naudojamos žiurkės, pelės ir kiniški žiurkėnai, tačiau gali būti panaudotos ir kitos atitinkamos žinduolių rūšys. Reikia naudoti dažniausiai naudojamus jaunų sveikų suaugusių gyvūnų laboratorinius kamienus. Bandymo pradžioje gyvūnų kūno masių skirtumai turi būti kuo mažesni ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūnų vidutinės masės.
4.1.2. Laikymo ir šėrimo sąlygos. Taikomos Bendrajame įvade nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad santykinis oro drėgnumas būtų 50–60 %.
4.1.3. Gyvūnų paruošimas. Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę ir bandomąją grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos poveikiai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas individualiai paženklinamas. Gyvūnams ne mažiau kaip 5 dienas leidžiama prisitaikyti prie bandymo sąlygų.
4.1.4. Dozių paruošimas. Kietosios medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinančiuosiuose įrenginiuose, o jeigu reikia, tai ir praskiestos prieš paveikiant ląsteles šia medžiaga. Prieš bandymą į bandymo sistemą gali būti tiesiogiai suleidžiamos ir/ar praskiedžiamos skystosios bandomosios medžiagos. Bandomieji preparatai naudojami naujai pagaminti, išskyrus atvejus, kai tyrimais įrodytas jų stabilumas.
4.2. Bandymo sąlygos
4.2.1. Tirpiklis ir tirpinantysis įrenginys. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys neturi chemiškai reaguoti su bandomąja medžiaga. Turi būti užtikrinta, kad ląstelės liks išsaugotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai ar tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturėtų būti vandens. Vandenį galima pašalinti molekuliniu filtru.
4.2.2. Kontroliniai bandiniai
4.2.2.1. Kiekvieno bandymo metu tiriami iš kiekvienos lyties gyvūnų paimti bei tuo pačiu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) kontroliniai bandiniai. Kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir gyvūnai, paveikti bandomąja chemine medžiaga (bandomosios grupės gyvūnai), išskyrus tą laiką, kai bandomosios grupės gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga.
4.2.2.2. Teigiamuose kontroliniuose bandiniuose, paveiktuose tokia pačia bandomosios medžiagos doze in vivo, turi būti aptinkamos struktūrinės aberacijos, kurioms esant bei veikiant bandomąja medžiaga, būtų galima nesunkiai sumažinti pašalinį foną pakartotinai (tai parodo bandymo sistemos jautrumą). Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunamas atsakas būtų aiškus, bet tyrėjas negalėtų jo iškart nustatyti.
4.2.2.3. Teigiami kontroliniai bandiniai dozuojami vieną kartą ir gyvūnams suleidžiami tokiu būdu, kuris skiriasi nuo bandomosios cheminės medžiagos suleidimo būdo. Kai įmanoma, reikia apsvarstyti teigiamų kontrolinių medžiagų, priklausančių konkrečiai klasei, panaudojimą. Teigiamų kontrolinių bandinių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje.
1 lentelė. Teigiamų kontrolinių bandinių medžiagų pavyzdžiai
Medžiagos pavadinimas CAS Nr. EINECS Nr.
Etilmetansulfonatas 62-50-0 200-536-7
Etilnitrošlapalas 759-73-9 212-072-2
Mitomicinas C 50-07-7 200-008-6
Ciklofosfamidas 50-18-0 200-015-4
Ciklofosfamido monohidratas 6055-19-2
Trietilenmelaminas 51-18-3 200-083-5
4.2.2.4. Neigiami kontroliniai bandiniai, paveikti vien tirpikliu, vien tirpinančiuoju įrenginiu, arba kiti bandiniai, paveikti tuo pačiu būdu kaip ir bandomosios grupės, turi būti paimami kiekvieną kartą, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų metu gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad variacijos laipsnis tarp gyvūnų ir ląstelių, kuriose stebimos chromosomų aberacijos, yra tinkamas. Jei neigiami kontroliniai bandiniai paimami tik vieną kartą, tai pirmojo paėmimo laikas yra tinkamiausias. Taip pat reikia papildomai naudoti ir nepaveiktus kontrolinius bandinius, nekreipiant dėmesio į tai, kad anksčiau atliktų eksperimentų ataskaitose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys nesukėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio.
5. Darbo eiga
5.1. Gyvūnų skaičius ir lytis. Kiekvienoje bandomojoje ir kontrolinėje grupėje turi būti ne mažiau kaip 5 vienos lyties gyvūnai. Kai anksčiau atliktų bandymų naudojant tą pačią gyvūnų rūšį ir tą patį poveikio būdą duomenys rodo, kad toksiškumo tarp atskirų lyčių skirtumai yra labai nedideli, pakanka tirti vienos lyties gyvūnus. Jeigu žmogaus jautrumas cheminėms medžiagoms, kuriomis jis yra veikiamas, priklauso nuo lyties, pavyzdžiui, jautrumas kai kurioms farmakologiškai aktyvioms medžiagoms, tai reikia tirti atitinkamos lyties gyvūnus.
5.2. Dozavimas
5.2.1. Bandomąja medžiaga veikiama vieną kartą. Galima taikyti išskaidytą dozę, kai tą pačią dieną du kartus su kelių valandų pertrauka paveikiama bandomąja medžiaga. Tai gali būti reikalinga, norint įvesti pakankamai didelį bandomosios medžiagos tūrį. Taikant kitokį dozavimą, tai turi būti moksliškai pagrįsta.
5.2.2. Prieš poveikį bandomąja medžiaga tą pačią dieną reikia dukart atskirai paimti bandinius. Tiriant graužikus, pirmasis bandinys paimamas praėjus maždaug 1,5 ląstelinio ciklo (parprastai šis ciklas trunka 12–18 valandų) po veikimo. Kadangi tiriamosios medžiagos įsiskverbimas, metabolizmas bei įtaka ląsteliniam ciklui gali paveikti optimalų laiką, per kurį nustatomos chromosomų aberacijos, tai rekomenduojama, kad antrasis bandinys būtų paimamas praėjus 24 valandoms po veikimo. Jei dozės duodamos daugiau nei vieną dieną, bandinys paimamas po veikimo maždaug 1,5 normalaus ląstelinio ciklo trukmės.
5.2.3. Prieš numarinant gyvūnams į pilvaplėvės ertmę suleidžiama atitinkama dozė metafazę sustabdančios medžiagos (pavyzdžiui, Kolcemido© ar kolchicino). Po atitinkamo laiko iš gyvūnų paimami bandiniai. Pelėms tas laikas yra maždaug 3–5 valandos, kiniškiems žiurkėnams – 4–5 valandos. Iš kaulų čiulpų išskiriamos ląstelės ir analizuojamos, siekiant nustatyti chromosomų aberacijas.
5.3. Dozės dydis. Jeigu bandymas atliekamas siekiant surasti dozių intervalą (neturint duomenų apie jį), tai jis turi būti atliekamas toje pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei taikant tokį patį dozavimą, koks buvo naudojamas pagrindinio bandymo metu. Jeigu nustatomas toksiškumas, tai, pirmąkart imant bandinius, naudojamos trys skirtingos dozės. Šios dozės turi apimti visą intervalą, pradedant nuo didžiausią toksiškumą sukeliančios ir baigiant mažiausią toksiškumą sukeliančia arba tokia doze, kuri visiškai netoksiška. Vėliau, imant bandinius, naudojama tik pati didžiausia dozė. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, išryškėja toksiškumo, priklausomo nuo dozės, požymiai, pasirodantys, kai naudojant tokį patį dozavimą suleidžiama didžiausia dozė ir spėjama, kad ji bus mirtina. Cheminėms medžiagos, kurių mažos ir netoksiškos dozės pasižymi specifiniu biologiniu aktyvumu (pavyzdžiui, hormonai ir mitogenai), taikomos dozavimo kriterijų išimtys, jų dozavimas nustatomas atskirai kiekvienu atveju. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kurią suleidus į kaulų čiulpus, pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (pavyzdžiui, mitozės indeksas sumažėja daugiau nei 50 %).
5.4. Ribinis bandymas. Jeigu bandymas atliekamas taikant vieną dozę, kuri įvedus vienu ar dviem kartais per vieną dieną, yra ne mažesnė kaip 2000 mg/kg ir nesukelia toksiškumo bei, atsižvelgiant į struktūriškai panašių medžiagų tyrimų duomenis, nesitikima jos genotoksinio poveikio, tai tikslinga atlikti pagrindinį bandymą taikant tris dozes. Atliekant ilgiau trunkančius tyrimus ir bandomąja medžiaga veikiant ne ilgiau kaip 14 dienų, ribinė dozė turi būti 2000 mg/kg, kai ilgiau kaip 14 dienų – 1000 mg/kg. Atsižvelgiant į galimą bandomosios medžiagos poveikį, žmonėms gali reikėti taikyti didesnę dozę.
5.5. Dozių įvedimas. Bandomoji medžiaga paprastai suleidžiama į skrandį zondu arba į pilvaplėvės ertmę švirkštu. Galima įvesti ir kitais būdais, moksliškai juos pagrindus. Didžiausias skysčio į skrandį ar pilvaplėvės ertmę suleidžiamo skysčio tūris priklauso nuo eksperimentinio gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 g kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių suleidimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus dirginančias ir ardančias medžiagas, kurių didesnės koncentracijos sukelia žalingas pasekmes, bandomosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad įvedant visas dozes įvedamos medžiagos tūris būtų vienodas.
5.6. Chromosomų paruošimas. Kai tik gyvūnai numarinami, iš jų iškart išimami kaulų čiulpai, pamerkiami į hipotoninį tirpalą ir fiksuojami. Vėliau kaulų čiulpų ląstelės išsklaidomos ant tepinėlių ir nudažomos.
5.7. Analizė
5.7.1. Mitozės indeksas nustatomas įvertinant citotoksiškumą mažiausiai 1000 ląstelių, paimtų iš 1 gyvūno. Tai atliekama, ištiriant visus bandomąja medžiaga veiktus (įskaitant teigiamus kontrolinius) ir neveiktus (neigiamus kontrolinius) gyvūnus.
5.7.2. Išanalizuojama mažiausiai 100 ląstelių, gautų iš vieno gyvūno. Šis skaičius gali būti sumažinamas, jei stebima daug chromosomų aberacijų. Visos skaidrės (įskaitant teigiamų ir neigiamų kontrolinių bandinių skaidres) turi būti užkoduojamos nepriklausomai viena nuo kitos tolesniam mikroskopiniam tyrimui. Ruošiant skaidres dažnai suardomos metafazėje esančios ląstelės bei prarandamos chromosomos, todėl vėliau suskaičiuotos ląstelės turi turėti 2n ± 2 centromerų.
II. Duomenys
6. Duomenų apdorojimas. Kiekvieno gyvūno tyrimų rezultatai turi būti pateikiami lentelėse. Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Reikia nustatyti kiekvieno gyvūno ląstelių, chromosomų aberacijų vienoje ląstelėje skaičių bei ląstelių, turinčių chromosomas su struktūrinėmis aberacijomis, skaičių, išreiškiamą procentais. Reikia išvardyti skirtingus chromosomų struktūrinių aberacijų tipus, nurodant jų skaičių bei pasireiškimo dažnį gyvūnų, paveiktų ir nepaveiktų bandomąja medžiaga, grupėse. Atskirai registruojami plyšiai, tačiau į juos neatsižvelgiama, nustatant absoliutų aberacijų dažnį. Jeigu tarp lyčių nenustatoma jokių atsako skirtumų, tai atliekant statistinę analizę, abiejų lyčių gyvūnų tyrimo duomenys apjungiami.
7. Duomenų įvertinimas ir interpretacija
7.1. Egzistuoja keli kriterijai, tokie, kaip nuo koncentracijos priklausomas bei pakartojamas chromosomines aberacijas turinčių ląstelių skaičiaus padidėjimas, kuriuo remiantis nustatoma, ar gautas rezultatas yra teigiamas. Pirmiausia reikia aptarti gautų rezultatų biologinę reikšmę. Vertinant bandymo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis kriterijus, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas. Abejotini rezultatai turėtų būti išsiaiškinti toliau tęsiant tyrimą ir pirmiausia pakeičiant bandymo sąlygas.
7.2. Poliploidinių ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad bandomoji medžiaga gali slopinti mitozę ir sukelti chromosomų skaičiaus ląstelėje pakitimus. Ląstelių, turinčių endoreduplikuotas chromosomas, skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti ląstelinį ciklą.
7.3. Jei gauti rezultatai neatitinka šio metodo 7.1 ir 7.2 punktuose nurodytų kriterijų, tai bandomoji medžiaga pagal šio metodo sąlygas laikoma nemutageniška.
7.4. Po daug bandymų gavus aiškius teigiamus ir aiškius neigiamus rezultatus, dažniausiai galima padaryti išvadą apie bandomosios medžiagos savybes remiantis gautų duomenų visuma. Net ir daug kartų pakartojus konkretų bandymą, jo rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs.
7.5. Šiuo metodu gauti teigiami rezultatai rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia chromosomų aberacijas gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse. Neigiami rezultatai rodo, kad šiame metode aprašytomis bandymo sąlygomis bandomoji medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų tirtos gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse. Reikia aptarti bandomosios medžiagos ar jos metabolitų galimybę į specifinį audinį patekti per bendrąją medžiagų apykaitos sistemą arba specifiniu būdu (pavyzdžiui, sisteminio toksiškumo atveju).
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
8. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija:
8.1. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys
8.2. Eksperimentiniai gyvūnai
8.3. Bandymo sąlygos
8.3.6. metodai, kuriais patvirtinama, kad bandomoji medžiaga pateko į specifinį audinį per bendrąją medžiagų apykaitos sistemą arba specifiniu būdu, jei jie taikyti;
8.3.7. bandomosios medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (md) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg per dieną), jei tai įmanoma;
8.4. Rezultatai
8.4.4. absoliutus aberacijų vienos grupės gyvūnų ląstelėse skaičius, kartu nurodant vidurkius ir standartinius nuokrypius;
8.4.9. anksčiau gauti neigiami kontroliniai duomenys, kartu pateikiant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nuokrypius;
IV. NUORODOS
10. Adler I. D. (1984), Žinduolių citogenetiniai tyrimai (Mutageniškumo tyrimas. Praktinis požiūris, red. Venitt S., Parry J. M., IRL Press, Oksfordas, Vašingtono apygarda, 275–306).
11. Preston R. J., Dean B. J., Galloway S., Holden H., McFee A. F., Shelby M. (1987), Žinduolių citogenetiniai tyrimai in vivo. Kaulų čiulpų ląstelių chromosomų aberacijų analizė, Mutation Res., 189, 157–165.
12. Richold M., Chandley A., Ashby J., Gatehouse D. G., Bootman J., Henderson L. (1990), Citogenetiniai įvertinimai in vivo (red. Kirkland D. J., Pagrindiniai mutageniškumo bandymai. UKEMS rekomenduojamos procedūros. UKEMS mutageniškumo tyrimų vadovo pakomitetis. Ataskaita, I dalis, Cambridge University Press, Kembridžas, Niujorkas, Portčesteris, Melburnas, Sidnėjus, 115–141).
13. Tice R. R., Hayashi M., MacGregaro J. T., Anderson D., Blakey D. H., Holden H. E., Kirsch-Volders M., Oleson Jr. F. B., Pacchierotti F., Preston R. J., Romagna F., Shimada H., Sutou S., Vannier B. (1994), Žinduolių kaulų čiulpų ląstelių chromosomų aberacijų in vivo bandymų darbo grupės ataskaita, Mutation Res., 312, 305–312.
14. Fielder R. J., Allen J. A., Boobis A. R., Botham P. A., Doe J., Esdaile D. J., Gatehouse D. G., Hodson-Walker G., Morton D. B., Kirkland D. J., Richold M. (1992), Britanijos toksikologijos draugijos ir Jungtinės Karalystės aplinkos mutagenų draugijos darbo grupės ataskaita. In vivo mutageniškumo bandymų dozių parinkimas, Mutagenesis, 7, 313–319.
15. Lovell D. P., Anderson D., Albanese R., Amphlett G. E., Clare G., Ferguson R., Richold M., Papworth D. G., Savage J. R. K. (1989), In vivo citogenetinių įvertinimų statistinė analizė (UKEMS mutageniškumo tyrimų vadovo pakomitetis. Ataskaita, III dalis. Mutageniškumo tyrimų duomenų statistinis įvertinimas, red. Kirkland D. J., Cambridge University Press, Kembridžas, 184–232.
16. Locke-Huhle C. (1983), Kinietiško žiurkėno ląstelių endoreduplikacija alfa spinduliuotės indukuoto G2 sustabdymo metu, Mutation Res., 119, 403–413.
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B12 metodas: MUTAGENIŠKUMAS. ŽINDUOLIŲ eritrocitų
mikrobranduolių In vivo bandymas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas
1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 474 metodu.
1.2. Bandymas taikomas analizuoti gyvūnų, paprastai graužikų, kaulų čiulpų eritrocitus bei periferinio kraujo ląsteles, siekiant nustatyti bandomosios cheminės medžiagos sukeltus eritroblastų chromosomų arba mitozės mechanizmo pažeidimus.
1.3. Bandymo tikslas – identifikuoti chemines medžiagas, sukeliančias citogenetinius pažeidimus, dėl kurių susiformuoja mažieji branduoliai, kai chromosomų fragmentai ar ištisos chromosomos įgyja pirminę struktūrą („išnyksta“).
1.4. Kai kaulų čiulpų eritroblastas vystydamasis virsta polichrominiu eritrocitu, pagrindinis (didysis) branduolys suspaudžiamas ir bet kuris susiformavęs mikrobranduolys gali likti už citoplazmos, neturinčios branduolio, ribų. Šiose ląstelėse galima pamatyti mikrobranduolius, nes ląstelė yra praradusi savo pagrindinį branduolį. Jei gyvūnuose, paveiktuose tiriamąja chemine medžiaga, padaugėja polichrominių eritrocitų su mikrobranduoliais, tai rodo, kad pažeistos chromosomos.
1.5. Atliekant šį bandymą, paprastai naudojami griaužikų kaulų čiulpai, nes būtent šiame audinyje susiformuoja polichrominiai eritrocitai. Periferinio kraujo polichrominių (nesubrendusių, turinčių mikrobranduolius) eritrocitų tyrimą galima atlikti su bet kuria rūšimi, kurios blužnis nesugebėjo pašalinti eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, arba kuri buvo pakankamai jautri žinomoms medžiagoms, sukeliančioms chromosomų aberacijas. Mikrobranduolius galima atskirti pagal daugelį kriterijų. Vienas jų yra kinetochorų arba centromerinės DNR, esančios arba nesančios mikrobranduoliuse, nustatymas. Bandymo, kai gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga kelias ar daugiau savaičių, pagrindinis tikslas taip pat gali būti periferiniame kraujyje esančių subrendusių (normochrominių) eritrocitų, turinčių mikrobranduolius, skaičiaus palyginimas su subrendusių eritrocitų skaičiumi.
1.6. Šis bandymas ypač svarbus, įvertinant mutagenų daromą žalą, pagal kurią galima spręsti apie metabolizmą, farmakokinetiką bei DNR pažaidų reparaciją in vivo nulemiančius veiksnius, nors jie gali skirtis priklausomai nuo gyvūnų rūšies, audinio ir genetinio lygmens. Tyrimas in vivo taip pat naudingas, toliau tiriant mutageninius atsakus, nustatytus in vitro.
1.7. Jeigu įrodoma, kad bandomoji medžiaga arba reaktyvus jos metabolitas neįsiskverbia į audinį, į kurį buvo nukreiptas, jis nėra naudojamas šiam tyrimui. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
2. Apibrėžimai
2.1. Centromera (kinetochoras) – chromosomos regionas, su kuriuo ląstelės dalijimosi metu asocijuojasi verpstės siūlai ir dėl to dukterinės chromosomos tvarkingai išsidėsto dukterinių ląstelių poliuose.
2.2. Mikrobranduoliai – papildomi branduoliai, atsiskyrę nuo didžiojo ląstelės branduolio, susidarantys tada, kai mitozės telofazės metu chromosomų fragmentai ar ištisos chromosomos įgauna pirminę struktūrą („išnyksta“).
2.3. Normochrominis eritrocitas – subrendęs, neturintis ribosomų eritrocitas, kuris skiriasi nuo nesubrendusio polichrominio eritrocito pagal ribosomų nusidažymą specifiniais dažais.
3. Bandymo metodo principas. Gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga pasirinktu būdu. Jeigu naudojami kaulų čiulpai, tai, praėjus tam tikriems laiko tarpams po veikimo tiriamąja medžiaga, gyvūnai numarinami, iš jų išimami kaulų čiulpai, paruošiami jų preparatai ir nudažomi. Kai naudojamas periferinis kraujas, tai po veikimo tiriamąja medžiaga praėjus atitinkamiems laiko tarpams, paruošiami tepinėliai, kurie vėliau nudažomi. Tiriant periferinį kraują, kaip galima mažiau laiko turi praeiti tarp paskutinio veikimo ir ląstelių surinkimo. Preparatai analizuojami, siekiant identifikuoti mikrobranduolius.
4. Bandymo metodo aprašymas
4.1. Pasiruošimas
4.1.1. Gyvūnų rūšies pasirinkimas. Kai tiriami kaulų čiulpai, rekomenduojama naudoti peles ar žiurkes, nors galima pasirinkti ir bet kokias kitas žinduolių rūšis. Kai tiriamas periferinis kraujas, rekomenduojama pasirinkti peles. Tačiau galima naudoti bet kokias kitas žinduolių rūšis, jeigu įrodoma, kad tos rūšies žinduolių blužnis nesugeba pašalinti eritrocitų su mikrobranduoliais arba tos rūšies žinduoliai pakankamai jautrūs žinomoms medžiagoms, sukeliančioms struktūrines chromosomų aberacijas ar chromosomų skaičiaus viename chromosomų rinkinyje pakitimus. Reikia naudoti dažniausiai naudojamus jaunų sveikų suaugusių gyvūnų laboratorinius kamienus. Bandymo pradžioje gyvūnų kūno masių skirtumai turi būti kuo mažesni ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūnų vidutinės masės.
4.1.2. Laikymo ir šėrimo sąlygos. Taikomos Bendrajame įvade nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad santykinis oro drėgnumas būtų 50–60 %.
4.1.3. Gyvūnų paruošimas. Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę ir bandomąją grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos poveikiai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas individualiai paženklinamas. Gyvūnams ne mažiau kaip 5 dienas leidžiama prisitaikyti prie bandymo sąlygų.
4.1.4. Dozių paruošimas. Kietosios medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinančiuosiuose įrenginiuose, o jeigu reikia, tai ir praskiestos. Skystųjų bandomųjų medžiagų dozės ruošiamos iškart arba prieš įvedimą gyvūnams jos praskiedžiamos. Bandomieji preparatai naudojami naujai pagaminti, išskyrus atvejus, kai tyrimais įrodytas jų stabilumas.
4.2. Bandymo sąlygos
4.2.1. Tirpiklis ir tirpinantysis įrenginys. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys neturi chemiškai reaguoti su bandomąja medžiaga. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai ar tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį.
4.2.2. Kontroliniai bandiniai
4.2.2.1. Kiekvieno bandymo metu tiriami iš kiekvienos lyties gyvūnų paimti bei tuo pačiu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) kontroliniai bandiniai. Kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir gyvūnai, paveikti bandomąja chemine medžiaga (bandomosios grupės gyvūnai), išskyrus tą laiką, kai bandomosios grupės gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga.
4.2.2.2. Teigiamuose kontroliniuose bandiniuose, paveiktuose tokia pačia bandomosios medžiagos doze in vivo, užgožiančia pašalinį foną, turi susidaryti mikrobranduoliai.. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunamas atsakas būtų aiškus, bet tyrėjas negalėtų jo iškart nustatyti.
4.2.2.3. Teigiami kontroliniai bandiniai dozuojami vieną kartą ir gyvūnams suleidžiami tokiu būdu, kuris skiriasi nuo bandomosios medžiagos suleidimo būdo. Kai įmanoma, reikia apsvarstyti teigiamų kontrolinių medžiagų, priklausančių konkrečiai klasei, panaudojimą. Teigiamų kontrolinių bandinių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje.
1 lentelė. Teigiamų kontrolinių bandinių medžiagų pavyzdžiai
Medžiagos pavadinimas CAS Nr. EINECS Nr.
Etilmetansulfonatas 62-50-0 200-536-7
Etilnitrošlapalas 759-73-9 212-072-2
Mitomicinas C 50-07-7 200-008-6
Ciklofosfamidas 50-18-0 200-015-4
Ciklofosfamido monohidratas 6055-19-2
Trietilenmelaminas 51-18-3 200-083-5
4.2.2.4. Neigiami kontroliniai bandiniai, paveikti vien tirpikliu, vien tirpinančiuoju įrenginiu, arba kiti bandiniai, paveikti tuo pačiu būdu kaip ir bandomosios grupės, turi būti paimami kiekvieną kartą, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų metu gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad variacijos laipsnis tarp gyvūnų ir eritrocitų su mikrobranduoliais yra tinkamas. Jei neigiami kontroliniai bandiniai paimami tik vieną kartą, tai pirmojo paėmimo laikas yra tinkamiausias. Taip pat reikia papildomai naudoti ir nepaveiktus kontrolinius bandinius, nekreipiant dėmesio į tai, kad anksčiau atliktų eksperimentų ataskaitose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys nesukėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio.
4.2.2.5. Jei naudojamas periferinis kraujas, tai bandinys prieš veikimą bandomąja medžiaga gali būti naudojamas kaip neigiama kontrolė, tačiau tik trumpai trunkančių periferinio kraujo tyrimų metu (pavyzdžiui, 1–3 kartus veikiant bandomąja medžiaga), nes taip gaunami duomenys atitinka anksčiau naudotos kontrolės intervalą.
5. Darbo eiga
5.1. Gyvūnų skaičius ir lytis. Kiekvienoje bandomojoje ir kontrolinėje grupėje turi būti ne mažiau kaip 5 vienos lyties gyvūnai. Kai anksčiau atliktų bandymų, naudojant tą pačią gyvūnų rūšį ir tą patį poveikio būdą, duomenys rodo, kad toksiškumo tarp atskirų lyčių skirtumai yra labai nedideli, pakanka tirti vienos lyties gyvūnus. Jeigu žmogaus jautrumas cheminėms medžiagoms, kuriomis jis yra veikiamas, priklauso nuo lyties, pavyzdžiui, jautrumas kai kurioms farmakologiškai aktyvioms medžiagoms, tai reikia tirti atitinkamos lyties gyvūnus.
5.2. Dozavimas
5.2.1. Taikyti standartinio dozavimo (t. y. 1, 2 ar daugiau veikimų atliekami kas 24 valandos) nerekomenduojama. Geriau dozuoti tol, kol nustatomas teigiamas atsakas arba, atliekant neigiamą kontrolinį bandymą, tol, kol nustatomas toksiškumas arba, naudojant ribinę dozę, iki bandinio paėmimo. Siekiant įvesti didesnį bandomosios medžiagos tūrį, ji gali būti įvedama ir išskaidyta doze, t. y per 1 dieną atliekami 2 poveikiai bandomąja medžiaga ir abi procedūras skiria ne ilgesnis kaip kelių valandų laikas.
5.2.2. Bandymas gali būti atliekamas dviem būdais:
5.2.2.1. gyvūnai vienąkart veikiami bandomąja medžiaga. Kaulų čiulpų bandiniai paimami mažiausiai 2 kartus, ne anksčiau kaip 24 valandos ir ne vėliau kaip 48 valandos po veikimo bandomąja medžiaga. Jeigu mėginiai imami anksčiau nei praėjus 24 valandoms po veikimo, tai turi būti nurodomos priežastys, paskatinusios imtis tokių veiksmų. Periferinio kraujo bandiniai imami atitinkamais intervalais mažiausiai 2 kartus, ne anksčiau kaip 36 valandos ir ne vėliau kaip 72 valandos po veikimo bandomąja medžiaga. Kai nustatomas teigiamas atsakas viename bandinyje, kitų bandinių imti nereikia;
5.2.2.2. jei per dieną atliekami du ir daugiau veikimų (pavyzdžiui, atliekami du ir daugiau veikimų kas 24 valandos), tai bandiniai paimami vieną kartą, praėjus 18–24 valandoms po paskutinio kaulų čiulpų paveikimo bandomąja medžiaga, ir praėjus 36–48 valandoms po paskutinio periferinio kraujo ląstelių paveikimo tiriamąja medžiaga. Bandiniai, jei reikia, gali būti papildomai paimami ir kitu laiku.
5.3. Dozės dydis. Jeigu bandymas atliekamas, siekiant surasti dozių intervalą (neturint duomenų apie jį), tai jis turi būti atliekamas to pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei taikant tokį patį dozavimą, koks buvo naudojamas pagrindinio bandymo metu. Jeigu nustatomas toksiškumas, tai pirmąkart imant mėginius naudojamos trys skirtingos dozės. Šios dozės turi apimti visą intervalą, pradedant nuo didžiausią toksiškumą sukeliančios ir baigiant mažiausią toksiškumą sukeliančia arba tokia doze, kuri visiškai netoksiška. Vėliau imant bandinius naudojama tik pati didžiausia dozė. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, išryškėja toksiškumo, priklausomo nuo dozės požymiai, pasirodantys, kai naudojant tokį patį dozavimą, suleidžiama didžiausia dozė ir spėjama, kad ji bus mirtina. Cheminėms medžiagos, kurių mažos ir netoksiškos dozės pasižymi specifiniu biologiniu aktyvumu (pavyzdžiui, hormonai ir mitogenai), taikomos dozavimo kriterijų išimtys, jų dozavimas nustatomas atskirai kiekvienu atveju. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kurią suleidus į kaulų čiulpus, pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (nesubrendusių eritrocitų skaičius, lyginant su absoliučiu visų eritrocitų, esančių kaulų čiulpuose ir periferiniame kraujyje, skaičiumi, sumažėja).
5.4. Ribinis bandymas. Jeigu tyrimas atliekamas taikant vieną dozę, kuri įvedus vienu ar dviem kartais per vieną dieną, yra ne mažesnė kaip 2000 mg/kg ir nesukelia toksiškumo bei, atsižvelgiant į struktūriškai panašių medžiagų tyrimų duomenis, nesitikima jos genotoksinio poveikio, tai tikslinga atlikti pagrindinį bandymą, taikant tris dozes. Atliekant ilgiau trunkančius tyrimus ir bandomąja medžiaga veikiant ne ilgiau kaip 14 dienų, ribinė dozė turi būti 2000 mg/kg, kai ilgiau kaip 14 dienų – 1000 mg/kg. Atsižvelgiant į galimą bandomosios medžiagos poveikį, žmonėms gali reikėti taikyti didesnę dozę.
5.5. Dozių įvedimas. Bandomoji medžiaga paprastai suleidžiama į skrandį zondu arba į pilvaplėvės ertmę švirkštu. Galima įvesti ir kitais būdais, moksliškai juos pagrindus. Didžiausias skysčio į skrandį ar pilvaplėvės ertmę suleidžiamo skysčio tūris priklauso nuo eksperimentinio gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 g kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių suleidimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus dirginančias ir ardančias medžiagas, kurių didesnės koncentracijos sukelia žalingas pasekmes, bandomosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad, įvedant visas dozes, įvedamos medžiagos tūris būtų vienodas.
5.6. Kaulų čiulpų ir kraujo paruošimas. Kaulų čiulpų ląstelės paprastai išskiriamos iš numarintų gyvūnų šlaunikaulių ir blauzdikaulių. Gerai žinomais metodais paruošiami ir vėliau nudažomi išskirtų ląstelių preparatai. Periferinis kraujas imamas iš uodeginės venos ar kitos kraujagyslės. Iš kraujo išskirtos ląstelės arba iškart dažomos supravitaliniais dažais, arba paruošiami tepinėliai, kurie vėliau nudažomi DNR specifiniais dažais. Akridino oranžinis arba Hoechst 33258 dažas, turintis pironino-Y, gali pašalinti kai kuriuos artefaktus, kurie atsiranda, naudojant DNR nespecifinius dažus, tačiau galima naudoti ir įprastinius dažus (pavyzdžiui, Giemsa dažą). Galima naudoti ir papildomas sistemas, pavyzdžiui, celiulioze užpildytas chromatografines kolonėles, skirtas branduolius turinčioms ląstelėms pašalinti, kadangi įrodyta, kad šiomis sistemomis mikrobranduolius galima tinkamai išskirti laboratorinėmis sąlygomis.
5.7. Analizė. Nustatomas kiekvieno gyvūno nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykis, suskaičiuojant mažiausiai 200 eritrocitų, esančių kaulų čiulpuose ir 1000 eritrocitų, esančių periferiniame kraujyje. Prieš mikroskopinę analizę visos skaidrės, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius bandinius, nepriklausomai užkoduojamos. Identifikuojant nesubrendusius eritrocitus, turinčius mikrobranduolius, reikia suskaičiuoti mažiausiai 2000 eritrocitų, gautų iš vieno gyvūno. Papildoma informacija gali būti gaunama, kai skaičiuojami subrendę eritrocitai su mikrobranduoliais. Nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykis turi būti ne mažesnis kaip 20 % kontrolinė vertės. Jeigu gyvūnai buvo veikiami bandomąja medžiaga mėnesį ir ilgiau, reikia suskaičiuoti mažiausiai 2000 eritrocitų, gautų iš vieno gyvūno. Vietoj rankinio skaičiavimo, atitinkamai pagrindus, galima naudoti patvirtintas automatizuotas analizės sistemas (vaizdo analizės ir ląstelių suspensijos srauto tėkmės citometrinės analizės sistemas).
II. Duomenys
6. Duomenų apdorojimas. Kiekvieno gyvūno tyrimų rezultatai turi būti pateikiami lentelėse. Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Reikia nustatyti kiekvieno gyvūno nesubrendusių eritrocitų ir nesubrendusių eritrocitų, turinčių mikrobranduolius, skaičių bei nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykį. Jeigu gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga mėnesį ar ilgiau, turi būti pateikti duomenys apie subrendusius eritrocitus, jei tokie duomenys buvo renkami. Jeigu įmanoma, pateikiamas kiekvieno gyvūno nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis bei eritrocitų, turinčių mikrobranduolius, skaičius, išreikštas procentais. Jeigu tarp lyčių nenustatoma jokių atsako skirtumų, tai, atliekant statistinę analizę, abiejų lyčių gyvūnų tyrimo duomenys apjungiami.
7. Duomenų įvertinimas ir interpretacija
7.1. Rezultatą priskirti teigiamam galima pagal kelis kriterijus: nuo dozės priklausomas ląstelių su mikrobranduoliais skaičiaus padidėjimas arba akivaizdus ląstelių su mikrobranduoliais skaičiaus padidėjimas po vienkartinio poveikio. Pirmiausia reikia aptarti gautų rezultatų biologinę reikšmę. Vertinant bandymo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis kriterijus, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas. Abejotini rezultatai turėtų būti išsiaiškinti toliau tęsiant tyrimą ir pirmiausia, pakeičiant bandymo sąlygas.
7.2. Jei gauti rezultatai neatitinka šio metodo 7.1 punkte nurodytų kriterijų, tai bandomoji medžiaga pagal šio metodo sąlygas laikoma nemutageniška.
7.3. Po daug bandymų, gavus aiškius teigiamus ir aiškius neigiamus rezultatus, dažniausiai galima padaryti išvadą apie bandomosios medžiagos savybes, remiantis gautų duomenų visuma. Net ir daug kartų pakartojus konkretų bandymą, jo rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs.
7.4. Šiuo metodu gauti teigiami rezultatai rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia mikrobranduolių atsiradimą, kurį sąlygoja tiriamosios rūšies gyvūnų eritroblastų chromosomų ar mitozinio mechanizmo pažeidimai. Neigiami rezultatai rodo, kad šiame metode aprašytomis bandymo sąlygomis bandomoji medžiaga nesukelia mikrobranduolių atsiradimo tiriamos rūšies gyvūnų nesubrendusiuose eritroblastuose. Reikia aptarti bandomosios medžiagos ar jos metabolitų galimybę į specifinį audinį patekti per bendrąją medžiagų apykaitos sistemą arba specifiniu būdu (pavyzdžiui, sisteminio toksiškumo atveju).
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
8. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija:
8.1. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys
8.2. Eksperimentiniai gyvūnai
8.3. Bandymo sąlygos
8.3.6. metodai, kuriais patvirtinama, kad bandomoji medžiaga pateko į specifinį audinį per bendrąją medžiagų apykaitos sistemą arba specifiniu būdu, jei jie taikyti;
8.3.7. bandomosios medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (md) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg per dieną), jei tai įmanoma;
8.4. Rezultatai
8.4.4. kiekvienos grupės gyvūnų nesubrendusių eritrocitų, turinčių mikrobranduolius, skaičiaus vidurkis ir standartinis nuokrypis;
8.4.8. anksčiau gauti neigiami kontroliniai duomenys, kartu pateikiant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nuokrypius;
IV. NUORODOS
12. Heddle J. A., Salamone M. F., Hite M., Kirkhart B., Mavournin K., MacGregor J. G., Newell G. W. (1983), Mikrobranduolių indukcija kaip genotoksiškumo matas, Mutation Res. 123, 61–118.
13. Mavournin K. H., Blakey D. H., Cimino M. C., Salamone M. F., Heddle J. A. (1990), Žinduolių kaulų čiulpų ir periferinio kraujo mikrobranduolių in vivo įvertinimas, JAV Aplinkos apsaugos agentūros Gene-Tox programos ataskaita, Mutation Res., 239, 29–80.
14. MacGregor J. T., Schlegel R., Choy W. N., Wehr C. M. (1983), Cirkuliuojančių eritrocitų mikrobranduoliai. Greitas chromosomų pažeidimo įvertinimas atliekant standartinius toksiškumo tyrimus su pelėmis (Toksikologijos mokslo ir praktikos pasiekimai, red. Hayes a. W., Schnell R. C.,. Miya T. S., Elsevier, Amsterdamas, 555–558.
15. MacGregor J. T., Heddle J. A., Hite M., Margolin G. H., Ramel C., Salamone M. F., Tice R. R., Wild D. (1987), Žinduolių kaulų čiulpų eritrocitų mikrobranduolių įvertinimo atlikimo vadovas, Mutation Res., 189, 103–112.
16. MacGregor J. T., Wehr C. M., Henika P. R., Shelby, M. E. (1990), Eritrocitų mikrobranduolių in vivo bandymas. Pastovios fazės matavimai padidina įvertinimo efektyvumą ir sudaro sąlygas integruoti į toksikologinius tyrimus, Fund. Appl. Toxicol. 14, 513–522.
17. Hayashi M., Morita T., Kodama Y., Sofumi T., Ishidate M. Jr. (1990), Pelių periferinio kraujo retikuliocitų mikrobranduolių įvertinimas naudojant oranžiniu akridinu dažytas skaidres, Mutation Res., 245, 245–249
18. Mikrobranduolių bandymo bendra tyrimo grupė (1992), Pelių periferinio kraujo eritrocitų mikrobranduolių supravitalinis dažymas oranžiniu akridinu. CSGMT/JEMMS ir MMS 5 bendro tyrimo ataskaitos santrauka, Mutation Res., 278, 83–98.
19. Mikrobranduolių bandymo bendra tyrimo grupė (CSGMT/JEMMS, MMS. Japonijos aplinkos mutagenų draugijos Žinduolių mutagenezės tyrimo grupė) (1995), Rekomenduojama trumpoji pelių periferinio kraujo mikrobranduolių bandymo procedūra, Mutagenesis, 10, 53–159.
20. Hayashi M., Tice R. R., MacGregor J. T., Anderson D., Blackey D. H., Kirsch-Volders M., Oleson Jr. F. B., Pacchicrotti F., Romagna F., Shimada H., Sutou S., Vannier B. (1994), Žinduolių eritrocitų mikrobranduolių in vivo įvertinimas, Mutation Res., 312, 293–304.
21. Higashikuni N., Sutou S. (1995), Pelių periferinių mikrobranduolių bandymo optimalus bendrųjų bandinių paėmimo laikas 30 ± 6 valandos po dviejų dozių, Mutagenesis, 10, 313–319.
22. Fielder R. J., Allen J. A., Boobis A. R., Botham P. A., Doe J., Esdaile D. J., Gatehouse D. G., Hodson-Walker G., Morton D. B., Kirkland D. J., Richold M. (1992), Britanijos toksikologijos draugijos ir Jungtinės Karalystės aplinkos mutagenų draugijos darbo grupės ataskaita. In vivo mutageniškumo bandymų dozių parinkimas, Mutagenesis, 7, 313–319.
23. Hayashi M., Sofumi T., Ishidate M. Jr. (1983), Oranžinio akridino taikymas fluorescentiniam dažymui mikrobranduolių bandyme, Mutation Res., 120, 241–247.
24. MacGregor J. T., Wehr C. M., Langlois R. G. (1983), Paprasta mikrobranduolių ir RNR fluorescentinio dažymo procedūra naudojant Hoechst 33258 ir Pyromin Y, Mutation Res., 120, 269–275.
25. Romagna F., Staniforth, C. D. (1989), Automatizuotas kaulų čiulpų mikrobranduolių bandymas, Mutation Res., 213, 91–104.
26. Gollapudi B., McFadden L. G. (1995), Kaulų čiulpų mikrobranduolių bandymo bandinių dydis santykiui tarp polichrominių ir normochrominių eritrocitų nustatyti, Mutation Res., 347, 97–99.
27. Richold M., Chandley A., Ashby J., Gatehouse D. G., Bootman J., Henderson L. (1990), Citogenetiniai įvertinimai in vivo (red. Kirkland D. J., Pagrindiniai mutageniškumo bandymai. UKEMS rekomenduojamos procedūros. UKEMS mutageniškumo tyrimų vadovo pakomitetis. Ataskaita, I dalis, Cambridge University Press, Kembridžas, Niujorkas, Portčesteris, Melburnas, Sidnėjus, 115–141).
28. Lovell D. P., Anderson D., Albanese R., Amphlett G. E., Clare G., Ferguson R., Richold M., Papworth D. G., Savage J. R. K. (1989), In vivo citogenetinių įvertinimų statistinė analizė (UKEMS mutageniškumo tyrimų vadovo pakomitetis. Ataskaita, III dalis. Mutageniškumo tyrimų duomenų statistinis įvertinimas, red. Kirkland D. J., Cambridge University Press, Kembridžas, 184–232.
______________
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B13/14 metodas: MUTAGENIŠKUMAS. Bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas
1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 471 metodu.
1.1. Tiriant grįžtamąsias mutacijas bakterijose, naudojami amino rūgščių reikalaujantys Salmonella typhimurium ir Escherichia coli kamienai, kad būtų galima nustatyti taškines mutacijas, tokias kaip vienos ar kelių DNR bazių porų pakaitos, intarpai ar delecijos. Šio grįžtamųjų mutacijų bakterijose bandymo principas yra tai, kad jo metu nustatomos mutacijos, kurios pakeičia tiriamuosiuose kamienuose esančias mutacijas taip, kad atstato bakterijų funkcinį sugebėjimą sintetinti pagrindinę amino rūgštį. Bakterijos-revertantai aptinkamos pagal sugebėjimą augti terpėje, kurioje nėra amino rūgšties, reikalingos jų tėviniam tiriamajam kamienui.
1.2. Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra taškinės mutacijos bei su jomis susiję įvykiai. Pakanka įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl taškinių mutacijų. Grįžtamųjų mutacijų bakterijose bandymas yra nebrangus ir greitai bei pakankamai lengvai atliekamas. Dauguma tiriamųjų kamienų pasižymi keletu ypatybių, pagal kurias, analizuojant mutacijas DNR sekose, esančiose grįžtamųjų mutacijų vyksmo vietose bei sukuriančiose atsaką į signalą, galima lengvai nustatyti padidintą ląstelių pralaidumą didelės molekulinės masės molekulėms ir DNR pažaidų atstatymo sistemų sunaikinimą arba pažaidoms atsparių DNR atstatymo procesų suintensyvėjimą. Tiriant kamienų specifiškumą, gaunama vertingos informacijos apie genotoksiškų medžiagų sukeltų mutacijų tipus. Tiriant chemines medžiagas, tarp jų ir lakius junginius, pasižyminčius skirtingomis fizikinėmis bei cheminėmis savybėmis, buvo sukaupta didelė duomenų apie įvairiausias struktūras bazė, kuri naudojama atliekant grįžtamųjų mutacijų bakterijose bandymus visuotinai pripažintais metodais. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
2. Apibrėžimai
2.1. Grįžtamųjų mutacijų bandymu naudojant Salmonella typhimurium arba Escherichia coli nustatoma kamieno, kuriam reikalinga amino rūgštis (atitinkamai histidinas ar triptofanas), mutacija, dėl kurios atsiranda kamienas, kuriam nereikalinga amino rūgštis, tiekiama egzogeniniu būdu.
2.2. Mutagenai, sukeliantys bazių porų pakaitas – medžiagos, sukeliančios DNR bazių porų pakaitas. Atliekant reversijos tyrimą, pakaita gali vykti pradinės mutacijos ar kitoje bakterijos genomo vietoje.
3. Metodo aptarimas
3.1. Atliekant bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymą, naudojamos prokariotinės ląstelės, kurios skiriasi nuo žinduolių ląstelių pagal medžiagų transportą į ląstelę, metabolizmą, chromosomų struktūrą bei DNR pažaidų atstatymo procesus. Paprastai, atliekant tyrimus in vitro, reikia naudoti metabolinės aktyvacijos egzogeninį šaltinį. Metabolinės aktyvacijos sistemos in vitro negali absoliučiai imituoti žinduolių metabolinės aktyvacijos sąlygų in vivo. Taigi, atliekant tyrimą, negaunama tiesioginės informacijos apie cheminių medžiagų mutageniškumą ir kancerogeniškumą žinduoliams.
3.2. Bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymas paprastai naudojamas pirmiausia medžiagų atrankai pagal genotoksiškumą, konkrečiai, pagal sugebėjimą sukelti taškines mutacijas. Gausi duomenų bazė parodė, kad daugelio cheminių medžiagų genotoksiškumas buvo nustatytas tiek bakterijų grįžtamųjų mutacijų, tiek ir kitų bandymų metu. Tačiau šiuo bandymu negalima nustatyti keleto mutagenų, taip yra dėl bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymo pagrindinio tikslo savitumo, metabolinės aktyvacijos skirtumų bei mutagenų paplitimo gamtoje skirtumų. Kita vertus, dėl sąlygų, padidinančių bandymo jautrumą, galima pervertinti mutageninį medžiagų aktyvumą.
3.3. Metodas netinka konkrečių cheminių medžiagų klasėms, pavyzdžiui, junginiams, pasižymintiems pernelyg dideliu baktericidiniu aktyvumu (konkretūs antibiotikai) ir tiems junginiams, kurie, kaip manoma, blokuoja žinduolių ląstelių DNR replikacijos sistemą (keletas topoizomerazių inhibitorių ir nukleozidų analogų). Tokiais atvejais labiau tinka tirti žinduolių mutacijas.
3.4. Nors šiuo metodu gavus teigiamus rezultatus dažnai medžiaga ir žinduolių kancerogenas, šio tarpusavio ryšio nereikia suabsoliutinti. Tai priklauso nuo cheminių medžiagų klasės; atliekant šį bandymą neįmanoma nustatyti tam tikrų kancerogenų, kadangi jų veikimo mechanizmas nesiremia genotoksiškumu arba jie veikia visai kitaip nei bakterinėse ląstelėse.
4. Bandymo metodo principas
4.1. Bakterinės ląstelės veikiamos bandomąja medžiaga naudojant arba nenaudojant egzogeninės metabolinės aktyvacijos sistemą. Pagal inkorporacijos į lėkštelę būdą bakterijų suspensijos padengiamos agaru ir užliejamos ant minimalios terpės. Pagal išankstinės inkubacijos būdą suspensija iš pradžių inkubuojama su medžiaga, kuria bus veikiamos bakterinės ląstelės, o vėliau padengiama agaru ir po to užpilama ant minimalios terpės. Taikant abu metodus, po 2–3 inkubacijos dienų skaičiuojamos revertantų kolonijos ir lyginamos su spontaninių revertantų kolonijų, auginamų kontrolinėse lėkštelėse su tirpikliu, skaičiumi.
4.2. Šiame metode dažniausiai naudojama keletas procedūrų: inkorporacijos į lėkštelę, išankstinės inkubacijos, fliuktuacijos ir suspendavimo. Aprašytos ir dujinių bei lakiųjų medžiagų tyrimo modifikacijos.
4.3. Šio metodo aprašyme pateiktos bandymo atlikimo procedūros pirmiausia siejasi su inkorporacijos į lėkštelę ir išankstinės inkubacijos būdais. Šie būdai tinka atliekant eksperimentus, kai naudojama arba nenaudojama metabolinė aktyvacijos sistema. Alifatinius aminus, turinčius trumpąją grandinę, dvivalenčius metalus, turinčius NO grupę, alkaloidus, turinčius pirolizidiną, alilo grupę turinčius junginius bei azoto junginius geriau tirti taikant išankstinės inkubacijos būdą. Naudojant inkorporacijos į lėkštelę bei išankstinės inkubacijos būdus, ne visada galima nustatyti tam tikroms klasėms priklausančius mutagenus. Šie mutagenai yra laikomi „ypatingais atvejais“ ir ypač rekomenduojama, kad jų nustatymui būtų panaudojamos ir kitos, alternatyvios bandymo atlikimo procedūros. Šiuos „ypatingus atvejus“ (pavyzdžiui, azo dažai, diazo grupę turintys junginiai, dujos, lakiosios medžiagos ir glikozidai) galima identifikuoti, kartu pateikiant ir jų nustatymo metodus. Nukrypimas nuo standartinio bandymo atlikimo metodo turi būti moksliškai pagrįstas.
5. Bandymo metodo aprašymas
5.1. Pasiruošimas
5.1.1. Bakterijos
5.1.1.1. Grynos bakterijų kultūros auginamos tol, kol pasiekia vėlyvąją eksponentinę ir ankstyvąją plato augimo fazę (apie 109 ląstelių/ml). Kultūros, pasiekusios vėlyvąją plato augimo fazę, neturi būti naudojamos. Bakterijų kultūrose, kurios naudojamos eksperimentams, turi būti didelis gyvų bakterijų ląstelių titras. Titras nustatomas arba pagal anksčiau gautas augimo kreives, arba kiekvieno bandymo metu nustatant gyvų ląstelių skaičių pagal jų augimą lėkštelėje.
5.1.1.3. Turi būti naudojami mažiausiai 5 bakterijų kamienai. Tarp jų turi būti 4 Salmonella typhimurium kamienai (TA 1535, TA 1537 arba TA 97a, arba TA 97; TA 98 ir TA 100), kurie, kaip įrodyta daugelyje laboratorijų, duoda patikimai pakartojamus duomenis. Šių 4 Salmonella typhimurium kamienų G-C bazių pora lokalizuota pirminės reversijos vietoje; žinoma, kad panaudojant šiuos kamienus, negalima identifikuoti kryžmiškai rišančių mutagenų ir hidrazinų. Šios medžiagos nustatomos, panaudojant Escherichia coli WP2 ir Salmonella typhimurium TA 102 kamienus, kurių pirminėje reversijos vietoje lokalizuota A-T bazių pora. Todėl rekomenduojama naudoti S. typhimurium TA 1535, S. typhimurium TA 1537 arba TA 97, arba TA 97a, S. typhimurium TA 98, S. typhimurium TA 100, E. coli WP 2 uvr A arba WP 2 uvr A (pkM 101), arba S. typhimurium TA 102 kamienų derinį.
5.1.1.4. Kryžmiškai surišantiems mutagenams nustatyti reikia papildomai naudoti S. typhimurium TA 102 arba E. coli WP 2, arba WP 2 (pKM 101) kamienus, sugebančius atstatyti DNR pažaidas.
5.1.1.5. Naudojamos gerai žinomos pagrindinės kultūros paruošimo, žymės patvirtinimo bei saugojimo metodikos. Reikia parodyti, kad amino rūgštis būtina kiekvieno preparato, paruošto iš užšaldytos pradinės kultūros, augimui (histidinas S. typhimurium kamienams, triptofanas E. coli kamienams). Kitos fenotipinės charakteristikos, būtent plazmidžių, turinčių R-faktorių, buvimas ar nebuvimas, jei tai reikalinga (kamienų TA 98, TA 100 ir TA 97a arba TA 97, WP 2 uvrA ir WP 2 uvrA (pKM 101) atsparumas ampicilinui bei kamieno TA 102 atsparumas ampicilinui ir tetraciklinui), būdingos mutacijos (S. typhimurium rfa mutacija, apsprendžianti jautrumą violetinei šviesai, E. coli uvr A mutacija arba S. typhimurium uvr B mutacija, nulemianti jautrumą ultravioletinei šviesai). Kamienai turi spontaniškai sukurti revertantų kolonijas, kurių skaičius turi būti dažnumo ribose ir kuris numatomas, remiantis anksčiau gautais laboratorijoje duomenimis, ir pirmiausia turi atitikti literatūroje nurodytas ribas.
5.1.2. Terpė. Naudojamas atitinkamas minimalus agaras (pavyzdžiui, turintis minimalios Vogel-Bonner terpės E ir gliukozės) ir ant viršaus užliejamas agaras, turintis histidino ir biotino arba triptofano tam, kad vyktų keleto ląstelių dalijimasis.
5.1.3. Metabolinė aktyvacija. Bakterijos turi būti veikiamos bandomąja medžiaga esant ir nesant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai. Plačiausiai vartojama sistema yra iš graužikų kepenų, paveiktų fermentinį aktyvumą skatinančiomis medžiagomis – AROCLOR 1254 ar fenobarbitono ir b-naftoflavono mišiniu, post-mitochondrine frakcija, praturtinta kofaktoriumi. Post-mitochondrinė frakcija paprastai vartojama koncentracijomis, kurių intervalas S9 mišinyje siekia nuo 5 iki 30 % pagal tūrį. Metabolinės aktyvacijos sistema pasirenkama priklausomai nuo tiriamosios cheminės medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga varoti daugiau nei post-mitochondrinės frakcijos koncentraciją. Tiriant azo dažus ir diazo grupę turinčias medžiagas, geriau naudoti redukcinę metabolinę aktyvacijos sistemą.
5.1.4. Bandomoji medžiaga (preparatas)
5.1.4.1. Kietosios medžiagos turi būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinančiuosiuose įrenginiuose ir, jei reikia, praskiedžiamos prieš paveikiant bakterijas. Skystosios medžiagos įvedamos tiesiogiai į tyrimo sistemas, jei reikia, jas praskiedus. Bandomieji preparatai naudojami naujai pagaminti, išskyrus atvejus, kai tyrimais įrodytas jų stabilumas.
5.1.4.2. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys neturi chemiškai reaguoti su bandomąja medžiaga. Turi būti užtikrinta, kad ląstelės liks išsaugotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai ar tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturėtų būti vandens.
5.2. Bandymo sąlygos
5.2.2. Poveikio koncentracijos
5.2.2.1. Kriterijai, į kuriuos reikia atsižvelgti nustatant didžiausią tiriamosios medžiagos koncentraciją, yra medžiagos citotoksiškumas ir tirpumas galutiniame veikimo mišinyje. Naudinga nustatyti toksiškumą bei netirpumą išankstiniu eksperimentu. Citotoksiškumas gali būti nustatomas pagal revertantų skaičiaus sumažėjimą, šalutinės terpės praskaidrėjimą ar sunykimą arba pagal kultūrų, paveiktų tiriamąja medžiaga, išgyvenimo laipsnį. Medžiagos citotoksiškumas gali kisti dėl metabolinės aktyvacijos sistemų. Netirpumas gali būti įvertinamas plika akimi stebint precipitato susidarymą galutiniame veikimo mišinyje atliekant bandymą.
5.2.2.2. Didžiausia rekomenduojama tirpių bandomųjų medžiagų, nepasižyminčių citotoksiškumu, koncentracija yra 5 mg/lėkštelėje arba 5 ml/lėkštelėje. Jei necitotoksiškos medžiagos netirpsta, jų koncentracijoms esant 5 mg/lėkštelėje arba 5 ml/lėkštelėje, tai turi būti ištirta viena ar kelios netirpios šių medžiagų koncentracijos. Bandomosios medžiagos, kurios yra citotoksiškos, kai jų koncentracijos yra mažesnės nei 5 mg/lėkštelėje arba 5 ml/lėkštelėje, turi būti tiriamos įvairiomis koncentracijomis, įskaitant citotoksinę. Precipitato susidarymas neturi trukdyti įvertinti duomenis.
5.2.2.3. Reikia panaudoti mažiausiai 5 išanalizuojamas tiriamosios medžiagos koncentracijas, kurių vertes pradinio eksperimento metu skirtų intervalai, lygūs ½ log (Ö10). Mažesni skiriamieji intervalai tinka tada, kai tiriama atsako priklausomybė nuo koncentracijos. Koncentracija, mažesnė už 5 mg/lėkštelėje arba 5 ml/lėkštelėje, pasirenkama tuo atveju, jei bandomosios medžiagos mutageniškumas neaiškus.
5.2.3. Neigiami ir teigiami kontroliniai bandiniai
5.2.3.1. Atliekant kiekvieną bandymą, kartu su metaboline aktyvacija arba be jos būtina vienu metu naudoti neigiamus (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) bei teigiamus kontrolinius bandinius, specifiškus bakterijų kamienui.
5.2.3.2. Kai bandymų metu naudojama metabolinės aktyvacijos sistema, tai teigiama kontrolinė pamatinė medžiaga pasirenkama pagal naudojamą bakterinio kamieno tipą. 1 lentelėje pateikiami tinkamų teigiamų kontrolinių medžiagų, naudojamų esant metabolinei aktyvacijai, pavyzdžiai.
1 lentelė. Teigiamos kontrolinės medžiagos, naudojamos esant metabolinei aktyvacijai
Medžiagos pavadinimas CAS Nr. EINECS Nr.
9,10-dimetilantracenas 781-43-1 212-308-4
7,12-dimetilbenzaantracenas 57-97-6 200-359-5
Benzpirenas 50-32-8 200-028-5
2-aminoantracenas 613-13-8 210-330-9
Ciklofosfamidas 50-18-0 200-015-4
Ciklofosfamido monohidratas 6055-19-2
5.2.3.3. Tinkama teigiama kontrolinė medžiaga, kai naudojamas redukcinės metabolinės aktyvacijos metodas, yra Kongo raudonasis (CAS Nr. 573-58-0, EINECS Nr. 209-358-4).
5.2.3.4. 2-aminoantracenas neturi būti naudojamas kaip vienintelis S9 mišinio veikimo efektyvumo indikatorius. Jei 2-aminoantracenas naudojamas, tai kiekviena S9 mišinio partija išanalizuojama panaudojant mutageną, kuriam reikalinga metabolinė aktyvacija mikrosominiais fermentais, pavyzdžiui, benzpireną ar dimetilbenzaantraceną.
5.2.3.5. Tinkamų teigiamų kontrolinių medžiagų, specifiškų bakterijų kamienui, naudojamų nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos, pavyzdžiai pateikti 2 lentelėje.
2 lentelė. Specifiškos bakterijų kamienui teigiamos kontrolinės medžiagos, naudojamos nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos
Medžiagos pavadinimas CAS Nr. Einecs Nr. Bakterijų kamienas
Natrio azidas 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 ir TA 100
2-nitrofluorenas 607-57-8 210-138-5 TA 98
9-aminoakridinas 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 ir TA 97a
ICD 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 ir TA 97a
Kumeno hidroksiperoksidas 80-15-9 201-254-7 TA 102
Mitomicinas C 50-07-7 200-008-6 WP 2 uvrA ir TA 102
N-etil-N-nitro-N-nitrozoguanidinas 70-25-7 200-730-1 WP 2, WP 2 uvrA ir WP 2 uvrA (pKM101)
4-nitrokvinolino-1-oksidas 56-57-5 200-281-1 WP 2, WP 2 uvrA ir WP 2 uvrA (pKM101)
Furilfuramidas (AF2) 3688-53-7 Kamienai su plazmidėmis
5.2.3.6. Kitas kontrolines medžiagas irgi galima naudoti kaip teigiamus kontrolinius mėginius. Jei įmanoma, pagrindžiamas konkrečios klasės cheminių medžiagų, kaip teigiamų kontrolinių bandinių, naudojimas.
5.2.3.7. Būtina naudoti ir neigiamus kontrolinius bandinius, sudarytus vien tik iš tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio be bandomosios medžiagos, veiktus tokiu pat būdu kaip ir tiriamieji bandiniai. Reikia naudoti ir bandomąja medžiaga neveiktus neigiamus kontrolinius bandinius, išskyrus tuos atvejus, kai anksčiau gauti kontroliniai duomenys rodo, kad pasirinktas tirpiklis nėra žalingas ir mutageniškas.
5.3. Darbo eiga
5.3.1. Atliekant bandymą inkorporacijos į lėkštelę būdu 2 ml padengiančiojo agaro sumaišoma su 0,05 ar 0,1 ml šviežiai išaugintos bakterijų kultūros (turinčios apie 108 gyvų ląstelių) ir 0,5 ml sterilaus buferio. Įprastiniu atveju atliekant bandymą, kai naudojama metabolinė aktyvacija, 0,5 ml metabolinės aktyvacijos mišinio, turinčio pakankamą post-mitochondrinės frakcijos kiekį (5–30% pagal tūrį metabolinės aktyvacijos mišinyje), sumaišoma su 2 ml padengiančiojo agaro, bakterijomis ir bandomąja medžiaga. Kiekvieno mėgintuvėlio turinys suplakamas ir užpilamas ant minimalaus agaro, esančio lėkštelėje, paviršiaus. Prieš inkubaciją padengiančiajam agarui leidžiama sukietėti.
5.3.2. Atliekant bandymą išankstinės inkubacijos būdu, bandomoji medžiaga iš anksto inkubuojama su naudojamu bakterijų kamienu (turinčiu apie 108 gyvų ląstelių) ir steriliu buferiu arba metabolinės aktyvacijos sistema (0,5 ml), ir paprastai inkubuojama 20 ar daugiau minučių 30–37 °C temperatūroje prieš sumaišant su padengiančiuoju agaru ir užpilant ant minimalaus agaro, esančio lėkštelėje, paviršiaus. Paprastai 2 ml padengiančiojo agaro sumaišoma su 0,05 ar 0,1 ml bandomosios medžiagos, 0,1 ml bakterijų ir 0,5 ml S9 mišinio ar sterilaus buferio. Atliekant išankstinę inkubaciją, mėgintuvėliai purtomi ant kratytuvo, kad jų turinys prisisotintų oro.
5.3.3. Tiriant kiekvieną dozę, turi būti gautas patenkinamas variacijos koeficientas, todėl bakterijos pasėjamos į 3 lėkšteles. Jeigu sėjama tik į 2 lėkšteles, tai reikia moksliškai pagrįsti. Atsitiktinis lėkštelės praradimas nereiškia, kad bandymas nepavyko.
II. Duomenys
6. Duomenų apdorojimas
6.1. Pateikiant duomenis, nurodomas revertantų kolonijų, esančių 1 lėkštelėje, skaičius. Taip pat reikia nurodyti revertantų kolonijų, esančių tiek teigiamose, tiek ir neigiamose (tirpiklio kontrolinis bandinys ir bandomąja medžiaga neveiktas kontrolinis bandinys) kontrolinėse lėkštelėse, skaičių. Pateikiant duomenis apie bandomąją medžiagą ir teigiamus bei neigiamus (tirpiklio kontrolinis bandinys ir/ar bandomąja medžiaga neveiktas kontrolinis bandinys) kontrolinius bandinius, nurodomas revertantų kolonijų, esančių kiekvienoje lėkštelėje, skaičius, jo vidurkis bei standartinis nuokrypis.
6.2. Gauto aiškaus teigiamo rezultato patvirtinti nebūtina. Abejotini rezultatai išaiškinami, tęsiant bandymus pakeitus eksperimento sąlygas. Neigiami rezultatai patvirtinami kiekvienu atskiru atveju. Tais atvejais, kai manoma, jog nebūtina patvirtinti neigiamų rezultatų, tai reikia pagrįsti.
6.3. Tęsiant eksperimentus, apsvarstoma, ar reikia keisti bandymo sąlygas siekiant išplėsti vertinamų sąlygų ribas. Sąlygos, kurias galima keisti, yra koncentracijas skiriančios ribos, bandymo atlikimo būdai (inkorporacijos į lėkštelę bei išankstinės inkubacijos) bei metabolinės aktyvacijos sąlygos.
7. Duomenų įvertinimas ir interpretacija
7.1. Teigiamo rezultato įvertinimo kriterijai yra nuo koncentracijos priklausomas mažiausiai vieno kamieno revertantų kolonijų, esančių vienoje lėkštelėje, skaičiaus padidėjimas virš tiriamos ribos, kai naudojama arba nenaudojama metabolinės aktyvacijos sistema ir/ar jį atkartojant, kai naudojama viena ar daugiau koncentracijų. Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Vertinant tyrimo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis kriterijus, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas.
7.2. Jei gauti rezultatai neatitinka šio metodo 7.1 punkte nurodytų kriterijų, tai bandomoji medžiaga pagal šio metodo sąlygas laikoma nemutageniška.
7.3. Po daug bandymų gavus aiškius teigiamus ir aiškius neigiamus rezultatus, dažniausiai galima padaryti išvadą apie bandomosios medžiagos savybes, remiantis gautų duomenų visuma. Net ir daug kartų pakartojus konkretų bandymą, jo rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs.
7.4. Rezultatai, gauti tiriant bakterijų grįžtamąsias mutacijas, rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia taškines mutacijas (bazių pakaitas arba grandinės pasislinkimą) Salmonella typhimurium ir/ar Escherichia coli genome. Neigiami rezultatai rodo, kad bandymo sąlygomis bandomoji medžiaga nesukelia mutacijų tirtose bakterijų rūšyse.
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
8. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija:
8.1. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys
8.2. Bakterijos
8.3. Bandymo sąlygos
8.3.1. bandomosios medžiagos kiekis vienoje lėkštelėje (mg arba ml lėkštelėje), nurodant pagrindinę priežastį, dėl kurios tiriant vieną koncentraciją, buvo pasirinkta konkreti dozė bei lėkštelių skaičius;
8.3.3. metabolinės aktyvacijos sistemos tipas ir sudėtis, įskaitant ir sistemos tinkamumo kriterijus;
8.4. Rezultatai
8.4.7. vienu metu naudojamų neigiamų (tirpiklis ar tirpinantysis įrengimas) ir teigiamų kontrolinių bandinių tyrimo duomenys, nurodant intervalus, vidurkius bei standartinius nuokrypius;
IV. NUORODOS
10. Ames B. N., McCann J., Yamasaki E. (1975), Kancerogenų ir mutagenų nustatymo metodai naudojant Salmonella ir žinduolių mikrosomų mutageniškumo bandymą, Mutation Res., 31, 347–364.
11. Maron D. M., Ames B. N. (1983), Patikslinti Salmonella mutageniškumo bandymo metodai, Mutation Res., 113, 173–215.
12. Gatehouse D., Haworth S., Cebula T., Gocke E., Kier L., Matsushima T., Melcion C., Nohmi T., Venitt S., Zeiger E. (1994), Bakterijų mutacijų įvertinimo rekomendacijos, Mutation Res., 312, 217–233.
13. Kier L. D., Brusick D. J., Auletta A. E., Von Halle E. S., Brown M. M., Simmon V. F., Dunkel V., McCann J., Mortelmans K., Prival M., Rao T. K., Ray V. (1986), Salmonella typhimurium ir žinduolių mikrosomų įvertinimas. JAV Aplinkos apsaugos agentūros Gene-Tox programos ataskaita, Mutation Res., 168, 69–240.
14. Yahagi T., Degawa M., Seino Y. Y., Matsushima T., Nagao M., Sugimura T., Hashimoto, Y. (1975), Kancerogeninių azodažiklių ir jų junginių mutageniškumas, Cancer Letters 1, 91–96.
15. Matsushima M., Sugimura T., Nagao M., Yahagi T., Shirai A., Sawamura M. (1980), Mikroorganizmų mutageniškumo bandymus įtakojantys veiksniai (kancerogenų aptikimo trumpalaikės sistemos, red. Norpoth K. H., Garner R. C., Springer, Berlynas, Heidelbergas, Niujorkas, 273–285).
16. Gatehouse D. G., Rowland I. R., Wilcox P., Callender R. D., Foster R. (1980), Bakterijų mutacijų įvertinimai (Pagrindiniai mutageniškumo bandymai. Patikslinta UKEMS 1 dalis, red. Kirkland D. J., Cambridge University Press, 13–61).
17. Aeschacher H. U., Wolleb U., Porchet, L. (1987), Maisto skystosios preinkubacijos mutageniškumo bandymai, J. Food Safety, 8, 167–177.
18. Green M. H. L., Muriel W. J., Bridges B. A. (1976), Supaprastinto fliuktuacijos bandymo taikymas mažiems mutagenų kiekiams aptikti, Mutation Res., 38, 33–42.
19. Hubbard S. A., Green M. H. L., Gatehouse D., Bridges J. W. (1984), Bakterijų fliuktuacijos bandymas (Mutageniškumo bandymų procedūrų vadovas, 2 leidimas, red. Kilbey B. J., Legator M., Nichols W., Ramel, C., Elsevier, Amsterdamas, Niujorkas, Oksfordas, 141–161).
20. Thompson E. D., Melampy P. J. (1981), An Examination of the Suspensijos kiekybinio įvertinimo taikymo Salmonella typhimurium kamienų mutageniškumui tyrimas, Environmental Mutagenesis, 3, 453–465.
21. Araki A., Noguchi T., Kato F., Matsushima T. (1994), Dujinių medžiagų mutageniškumo bandymo pagerintas metodas, naudojant dujų bandinių paėmimo kamerą, Mutation Res., 307, 335–344.
22. Prival M. J., Bell S. J., Mitchell V. D., Reipert M. D., Vaughan V. L. (1984), Benzidino ir benzidinui giminingų dažiklių bei tam tikrų monoazodažiklių mutageniškumas taikant modifikuotą Salmonella įvertinimą, Mutation Res., 136, 33–47.
23. Zeiger E., Anderson B. E., Haworth S., Lawlor T., Mortelmans K. (1992), Salmonella mutageniškumo bandymai. V. 311 chemikalų bandymų rezultatai, Environ. Mol. Mutagen., 19, 2–141.
24. Simmon V., Kauhanen K., Tardiff R. G. (1977), Geriamąjame vandenyje aptinkamų chemikalų mutageniškumas (Genetinės toksikologijos vystymasis, red. Scott D., Bridges B., Sobels F., Amsterdamas, 249–258).
25. Hughes T. J., Simmons D. M., Monteith I. G., Claxton L. D. (1987), Lakių organinių junginių garinimas siekiant nustatyti mutageniškumą Ames (Salmonella) įvertinime, Environmental Mutagenesis, 9, 421–441.
26. Matsushima T., Matsumoto A., Shirai M., Sawamura M., Sugimura T. (1979), Natūralaus kancerogeno kikazino ir sintetinių metilazoksimetano junginių mutageniškumas Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, 3780–3782.
27. Tamura G., Gold C., Ferro-Luzzi A., Ames B. N. (1980), Fekalazė. Maisto glikozidų aktyvavimo į mutagenus žarnyno flora modelis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4961–4965.
28. Wilcox P., Naidoo A., Wedd D. J., Gatehouse D. G. (1990), Salmonella typhimurium TA 102 ir Escherichia coli WP2 kamienų bandomasis palyginimas, Mutagenesis, 5, 285–291.
29. Matsushima T., Sawamura M., Hara K., Sugimura T. (1976), Saugus polichlorintųjų bifenilų, naudojamų kaip metabolinių aktyvacijos sistemų induktorių, pakaitalas (de Serres F. J., Fouts J. R., Bend J. R., Philpot R. M. (red.), In vitro mutageniškumo tyrimų metabolinė aktyvacija, Elsevier, Šiaurės Olandija, 85–88).
30. Elliot B. M., Combes R. D., Elcombe C. R., Gatehouse D. G., Gibson G. G., Mackay J. M., Wolf R. C. (1992), Aroclor 1254 indukuoto S9 alternatyvos in vitro genotoksiškumo įvertinimuose, Mutagenesis, 7, 175–177.
31. Maron D., Katzenellenbogen J., Ames B. N. (1981), Compatibility of Organinių tirpiklių ir Salmonella mikrosomų bandymo suderinamumas, Mutation Res., 88, 343–350.
32. Claxton L. D., Allen J., Auletta A., Mortelmans K., Nestmann E., Zeiger E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium ir žinduolių mikrosomų bandymų vadovas bakterijų mutageniškumui nustatyti, Mutation Res., 189, 83–91.
33. Mahon G. A. T., Green M. H. L., Middleton B., Mitchel I., Robinson W. D., Tweats D. J. (1989), Mikroorganizmų kolonijų įvertinimo duomenų analizė (UKEMS mutageniškumo bandymų vadovo pakomitetis. II dalis. Mutageniškumo bandymų duomenų statistinis įvertinimas, red. Kirkland D. J., Cambridge University Press, 28–65).
______________
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B15 metodas: MUTAGENIŠKUMAS ir kancerogeniškumo patikrinimas. GENŲ MUTACIJOS.
SACCHAROMYCES CEREVISIAE bandymas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472)
4. Bandymo metodo principas
4.1. Siekiant įvertinti cheminių medžiagų, esant arba nesant metabolinės aktyvacijos sistemai, sukeliamas genų mutacijas, gali būti naudojami įvairiausi haploidiniai ir diploidiniai Saccharomyces cerevisiae kamienai.
4.2. Haploidiniuose kamienuose gali būti naudojamos tiesioginės mutacinės sistemos, pavyzdžiui, mutacinis virsmas iš raudonos spalvos mutantų, kurių augimui reikalingas adeninas (ade-1, ade-2) į dvigubus baltos spalvos mutantus, kurių augimui reikalingas adeninas bei atrankos sistemos, pavyzdžiui, atsparumo kanavalinui ir cikloheksimidui indukcinė sistema.
4.3. Plačiausiai naudojamą grįžtamųjų mutacijų tyrimo sistemą sudaro haploidinis kamienas XV 185-14C, kuris turi geno, koduojančio ochros spalvą, beprasmes mutacijas ade-2-1, arg 4-17, lys 1-1, trp 5-48, kurios tampa grįžtamosiomis mutacijomis atlikus bazių pakeitimą mutagenais, sukeliančiais vietos atžvilgiu specifines mutacijas arba geno, koduojančio ochros spalvą, veiklą slopinančias mutacijas. Kamienas XV 185-14C taipogi turi žymę bis 1-7 – beprasmę mutaciją, kuri gali virsti grįžtamąja mutacija, įvykus mutacijai antroje vietoje, bei žymę bom 3-10, kuri tampa grįžtamąja mutacija, paveikus ją mutagenais, sukeliančiais grandinės pasislinkimą.
6. Bandymo metodo aprašymas
6.1. Pasiruošimas. Prieš bandymą, naudojant atitinkamą prietaisą, paruošiami bandomųjų ir kontrolinių medžiagų tirpalai. Jei tiriami organiniai, vandenyje netirpūs junginiai, tai reikėtų naudoti ne daugiau kaip 2 % pagal tūrį organinių tirpiklių, pavyzdžiui, etanolio, acetono ar dimetilsulfoksido (DMSO) tirpalus (v/v). Galutinė tirpalo koncentracija neturėtų labai įtakoti ląstelių gyvybingumo bei augimo parametrų.
6.2. Metabolinė aktyvacija
6.2.1. Ląstelės veikiamos bandomosiomis medžiagomis, esant arba nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos sistemai.
6.2.2. Graužikų, iš anksto paveiktų fermentus indukuojančiomis medžiagomis, kepenų postmitochondrinė frakcija, praturtinta kofaktoriumi, yra plačiausiai naudojama metabolinė aktyvacijos sistema. Metabolinei aktyvacijai galima naudoti ir kitų rūšių bei audinių postmitochondrines frakcijas bei procedūras.
6.3. Bandymo sąlygos
6.3.1. Bandomieji kamienai. Atliekant genų mutacijų tyrimus labiausiai yra naudojami haploidinis kamienas XV 185-14C ir diploidinis kamienas D7. Galima naudoti ir kitus kamienus.
6.3.2. Terpė. Nustatant kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko mutacijos, skaičių, naudojama atitinkama kultivavimo terpė.
6.3.3. Teigiama ir neigiama kontrolė. Vienu metu naudojamos teigiamos, nepaveiktos bandomąja medžiaga ir tirpiklio kontrolės. Nustatant kiekvieną specifinę galutinę mutaciją, naudojamos atitinkamos teigiamos kontrolės.
6.3.4. Koncentracijos. Naudojamos mažiausiai penkios tinkamai atskirtos bandomosios medžiagos koncentracijos. Toksiškų medžiagų didžiausia tiriamoji koncentracija neturėtų sumažinti kolonijų išgyvenimo daugiau nei iki 5–10 %. Reikėtų tirti santykinai vandenyje netirpstančių medžiagų tirpumo ribą pagal atitinkamas procedūras. Lengvai vandenyje tirpstančių netoksiškų medžiagų didžiausia koncentracija turėtų būti nustatoma kiekvienu atveju.
6.3.6. Spontaninių mutacijų dažnis. Turi būti naudojamos subkultūros, kuriose spontaninių mutacijų dažniai yra normalūs.
6.3.7. Replikatų skaičius. Atliekant prototrofų, atsirandančių dėl genų mutacijų, bei ląstelių gyvybingumo tyrimą, vienai koncentracijai tirti naudojamos mažiausiai trys replikatų lėkštelės. Jei bandyme naudojamos žymės hom 3-10, pasižyminčios nedideliu mutacijų dažniu, tai reikėtų naudoti daugiau replikatų lėkštelių, kad gaunami duomenys būtų statistiškai patikimi.
7. Darbo eiga
7.1. S. cerevisiae kamienai paprastai veikiami bandomąja medžiaga, ląstelėms esant stacionarinėje arba augimo stadijoje skystoje terpėje. Iš pradžių eksperimentai atliekami su ląstelėmis, esančiomis augimo stadijoje; 1-5×107 ląstelių/ml veikiamos bandomąja medžiaga 18 valandų 28–37 °C temperatūroje ant kratyklės; jeigu reikia, tai veikimo metu į terpę įvedamas atitinkamas metabolinės aktyvacijos sistemos kiekis. Po poveikio ląstelės centrifuguojamos, plaunamos ir pasėjamos į atitinkamą kultivavimo terpę. Po inkubacijos nustatomas kolonijų, kuriose neįvyko arba įvyko genų mutacijos, skaičius.
II. Duomenys
8. Duomenys pateikiami lentelėse, nurodant kolonijų skaičių, kolonijų, kuriose neįvyko ir kuriose įvyko mutacijos, skaičių ir mutacijos dažnį.
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
11. Bandymo protokole, jei įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija:
11.2. bandymo sąlygos (ląstelių stacionarioji ar augimo fazė, terpės sudėtis, inkubacijos temperatūra ir trukmė, metabolitinės aktyvacijos sistema);
11.3. dozavimas (veikimo laipsnis, procedūra, trukmė ir temperatūra, teigiamos ir neigiamos kontrolės);
11.4. kolonijų skaičius, kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko mutacijos skaičius bei mutacijų dažnis, dozės ir atsako sąryšis, jei tai įmanoma nustatyti, statistinis duomenų įvertinimas;
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B16 metodas: mitozinė rekombinacija. SACCHAROMYCES CEREVISIAE bandymas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472)
4. Bandymo metodo principas. Saccharomyces cerevisiae mitozinė rekombinacija gali būti nustatoma tarp genų (tarp geno ir jo centromeros) ir genų viduje. Ši rekombinacija, vykstanti tarp genų, vadinama mitoziniu krosingoveriu, kurio susiformuoja atvirkštiniai produktai, tuo tarpu kai rekombinacijos metu genų viduje metu susidaro neatvirkštiniai produktai, vadinami genų konversijomis. Apskritai, krosingoveris įvertinamas pagal homozigotinių kolonijų arba sektorių, turinčių recesyvinius genų alelius, produkcijos laipsnį heterozigotiniame kamiene, tuo tarpu genų konversija vertinama pagal prototrofinių revertantų, susiformavusių auksotrofiniame heteroaleliniame kamiene, turinčiame du neveiklius to paties geno alelius, skaičių. Siekiant nustatyti mitozinio geno konversiją, dažniausiai naudojami D4 (heteroalelinis pagal ade 2 ir trp 5), D7 (heteroalelinis pagal trp 5), BZ34 (heteroalelinis pagal arg 4) ir JD1 (heteroalelinis pagal his 4 ir trp 5) kamienai. Raudonos ir violetinės spalvos homozigotiniai sektoriai, sukuriantys mitozinį krosingoverį, gali būti vertinami naudojant D5 arba D7 kamienus (taip pat galima įvertinti mitozinę genų konversiją ir grįžtamąją mutaciją, vykstančią ilv 1-92), kurie yra heteroaleliški pagal papildančiuosius geno ade 2 alelius
6. Bandymo metodo aprašymas
6.1. Pasiruošimas. Prieš bandymą, naudojant atitinkamą, prietaisą paruošiami bandomųjų ir kontrolinių medžiagų tirpalai. Jei tiriami organiniai, vandenyje netirpūs junginiai, tai reikėtų naudoti ne daugiau kaip 2 % pagal tūrį organinių tirpiklių, pavyzdžiui, etanolio, acetono ar dimetilsulfoksido (DMSO) tirpalus. Galutinė tirpalo koncentracija neturėtų labai įtakoti ląstelių gyvybingumo bei augimo parametrų.
6.2. Metabolinė aktyvacija
6.2.1. Ląstelės veikiamos bandomosiomis medžiagomis, esant arba nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos sistemai.
6.2.2. Graužikų, iš anksto paveiktų fermentus indukuojančiomis medžiagomis, kepenų postmitochondrinė frakcija, praturtinta kofaktoriumi, yra plačiausiai naudojama metabolinė aktyvacijos sistema. Metabolinei aktyvacijai galima naudoti ir kitų rūšių bei audinių postmitochondrines frakcijas bei procedūras.
6.3. Bandymo sąlygos
6.3.1. Bandomieji kamienai. Dažniausiai naudojami diploidiniai D4, D5, D7 ir JD1 kamienai. Galima naudoti ir kitus kamienus.
6.3.2. Terpė. Nustatant kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko mitozinės rekombinacijos, skaičių, naudojama atitinkama kultivavimo terpė.
6.3.3. Teigiama ir neigiama kontrolė. Vienu metu naudojamos teigiamos, nepaveiktos bandomąja medžiaga ir tirpiklio kontrolės. Nustatant kiekvieną specifinę galutinę rekombinaciją, naudojamos atitinkamos teigiamos kontrolės.
6.3.4. Koncentracijos
6.3.4.1. Naudojamos mažiausiai penkios tinkamai atskirtos bandomosios medžiagos koncentracijos. Reikėtų apsvarstyti citotoksiškumą ir tirpumą. Mažiausia koncentracija neturi įtakoti ląstelių gyvybingumo. Toksiškų medžiagų didžiausia tiriamoji koncentracija neturėtų sumažinti kolonijų išgyvenimo daugiau nei iki 5–10 %. Reikėtų tirti santykinai vandenyje netirpstančių medžiagų tirpumo ribą pagal atitinkamas procedūras. Lengvai vandenyje tirpstančių netoksiškų medžiagų didžiausia koncentracija turėtų būti nustatoma kiekvienu atveju.
6.3.5. Inkubacijos sąlygos. Lėkštelės inkubuojamos tamsoje 4–7 dienoms 28–30 °C temperatūroje. Analizei naudojamos plokštelės, kuriose dėl mitozinio krosingoverio atsiranda raudonos ir violetinės spalvos sektoriai, turėtų būti laikomos šaldytuve (apie 4 °C temperatūroje) papildomai vieną arba dvi dienas prieš nustatant atitinkamai nusidažiusių kolonijų skaičių.
6.3.6. Spontaninės mitozinės rekombinacijos dažnis. Turi būti naudojamos subkultūros, kuriose spontaninių mitozinių rekombinacijų dažniai yra normalūs.
6.3.7. Replikatų skaičius. Atliekant prototrofų, atsirandančių dėl mitozinio geno konversijos, bei ląstelių gyvybingumo tyrimą, vienai koncentracijai tirti naudojamos mažiausiai trys replikatų lėkštelės. Tiriant recesyvinį homozigotiškumą, atsirandantį dėl mitozinio krosingoverio, reikėtų panaudoti daugiau lėkštelių, kad būtų galima nustatyti tinkamą kolonijų skaičių.
7. Darbo eiga
7.1. S. cerevisiae kamienai paprastai veikiami bandomąja medžiaga ląstelėms esant stacionarinėje arba augimo stadijoje skystoje terpėje. Iš pradžių bandymai atliekami su ląstelėmis, esančiomis augimo stadijoje; 1-5×107 ląstelių/ml veikiamos bandomąja medžiaga 18 valandų 28–37 °C temperatūroje ant kratyklės; jeigu reikia, tai veikimo metu į terpę įvedamas atitinkamas metabolinės aktyvacijos sistemos kiekis.
7.2. Po poveikio ląstelės centrifuguojamos, plaunamos ir pasėjamos į atitinkamą kultivavimo terpę. Po inkubacijos nustatomas kolonijų, kuriose neįvyko arba įvyko mitozinė rekombinacija, skaičius.
II. Duomenys
8. Duomenys pateikiami lentelėse, nurodant kolonijų skaičių, kolonijų, kuriose neįvyko ir kuriose įvyko mitozinės rekombinacijos, skaičių ir rekombinacijos dažnį.
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
11. Bandymo protokole, jei įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija:
11.2. bandymo sąlygos (ląstelių stacionarioji ar augimo fazė, terpės sudėtis, inkubacijos temperatūra ir trukmė, metabolitinės aktyvacijos sistema);
11.3. dozavimas (veikimo laipsnis, procedūra, trukmė ir temperatūra, teigiamos ir neigiamos kontrolės);
11.4. kolonijų skaičius, kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko rekombinacijos skaičius bei rekombinacijų dažnis, dozės ir atsako sąryšis, jei tai įmanoma nustatyti, statistinis duomenų įvertinimas;
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B17 metodas: MUTAGENIŠKUMAS. ŽINDUOLIŲ ląsteliŲ genų mutacijų In vitro bandymas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas
1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 476 metodu.
1.2. Žinduolių ląstelių genų mutacijų in vitro bandymas naudojamas aptikti cheminių medžiagų sukeltas mutacijas. Tinkamoms ląstelių linijoms priklauso pelių limfomos ląstelių linija L5178Y, kiniškojo žiurkėno ląstelių linijos CHO, CHO-ASS2 bei V79 ir žmogaus limfoblastų linija TK. Naudojant šias linijas, dažniausiai įvertinamos timidinkinazę (TK) bei hipoksantinguaninfosforiboziltransferazę (HFRT) koduojančių genų bei ksantinguaninfosforiboziltransferazę (KFRT) koduojančio transgeno mutacijos. Atliekant TK, KFRT bei HFRT koduojančių genų mutacijų tyrimus, nustatomi ir skirtingi genetinių įvykių spektrai. TK ir KFRT koduojantys genai lokalizuoti autosominėse chromosomose, todėl galima nustatyti genetinius įvykius (pavyzdžiui, didelių genų segmentų delecijas), kurie nenustatomi HFRT koduojančio geno, esančio X chromosomose, lokuse.
1.3. Atliekant šį bandymą galima naudoti gerai žinomas ląstelių linijas ar kamienus. Tyrimo metu naudojamos ląstelės atrenkamos pagal sugebėjimą augti kultūroje bei stabilumą spontaniškai vykstančių mutacijų atžvilgiu.
1.4. Atliekant in vitro bandymus, paprastai reikia naudoti egzogeninį metabolinės aktyvacijos šaltinį. Ši metabolinė aktyvacijos sistema negali absoliučiai atitikti žinduolių sąlygų in vivo. Reikia stengtis vengti tokių sąlygų, kurioms esant bus gaunami rezultatai, neatspindintys tikrojo mutageniškumo. Teigiami rezultatai, neatspindintys tikrojo mutageniškumo, gali būti gaunami dėl pH ir osmosinio slėgio pokyčių bei didelio citotoksiškumo.
1.5. Bandymas naudojamas atrinkti galimus žinduolių mutagenus bei kancerogenus. Daugelis medžiagų, kurias ištyrus šiuo metodu gaunami teigiami rezultatai, yra žinduolių kancerogenai, tačiau nėra aiškaus ryšio tarp šio bandymo rezultatų ir kancerogeniškumo. Tarpusavio ryšys priklauso nuo cheminių medžiagų klasės; vis daugėja įrodymų, kad šiuo bandymu negalima nustatyti kai kurių kancerogenų, galbūt dėl to, kad jie nepasižymi genotoksiškumu arba bakterinėse ląstelėse veikia visiškai kitaip. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
2. Apibrėžimai
2.1. Tiesioginė mutacija – geno tėvinio tipo mutantinės formos mutacija, dėl kurios šio geno koduojamas baltymas praranda fermentinį aktyvumą arba šis pakinta.
2.2. Bazių porų pakaitas sukeliantys mutagenai – medžiagos, sukeliančios vienos ar kelių bazių porų, esančių DNR molekulėje, pakaitas.
2.3. Grandinės pasislinkimą sukeliantys mutagenai – medžiagos, sukeliančios vienos ar daugelio bazių porų intarpus ar iškritas.
2.4. Fenotipinės ekspresijos laikas – laikas, per kurį nepakitusio geno produktai pašalinami iš naujai mutavusių ląstelių.
2.6. Absoliutus santykinis augimas – per konkretų laiką padidėjęs ląstelių, lyginant su kontroline populiacija, skaičius, įvertinamas kaip suspensijos augimas, lyginant su neigiamos kontrolinės ląstelių grupės kloninio augimo efektyvumu, o pastarasis lyginamas su neigiamu kontroliniu mėginiu.
2.7. Santykinis suspensijos augimas – fenotipinės ekspresijos periodu padidėjęs ląstelių, lyginant su neigiamu kontroliniu bandiniu, skaičius.
2.8. Gyvybingumas – ląstelių, paveiktų bandomąja medžiaga, kloninio augimo efektyvumas tuo metu, kai, pasibaigus ekspresijai, jos pasėjamos į terpę esant atrankos sąlygoms.
3. Bandymo metodo principas
3.1. Ląstelės, nesugebančios sintetinti timidinkinazės (TK) dėl mutacijos TK+/- ir/ar TK-/-, yra atsparios pirimidino analogo – trifluortimidino (TFT) – sukeliamiems citotoksiniams efektams. Ląstelės, sugebančios sintetinti TK, yra jautrios TFT, kuris blokuoja ląstelės metabolizmą bei sustabdo tolimesnį jos dalijimąsi. Mutantinės ląstelės gali proliferuoti terpėje su TFT, kai normalios ląstelės, sintetinančios TK, šito padaryti negali. Ląstelės, nesugebančios sintetinti HFRT ir KFRT, panašiai atrenkamos pagal atsparumą 6-tioguaninui (TG) arba 8-azaguaninui (AG). Jeigu žinduolių genų mutacijos tiriamos panaudojant medžiagą, kuri naudojama ląstelių atrankai ir yra bazių analogas arba cheminis junginys, tai reikia atkreipti dėmesį į bandomosios cheminės medžiagos savybes. Pavyzdžiui, reikia tirti bet kokį įtarimą keliantį bandomosios medžiagos toksiškumą mutantinėms ir normalioms ląstelėms. Atrankos sistemos arba atrankos medžiagos parinkimas turi būti patvirtinamas tada, kai tiriamos cheminės medžiagos, savo struktūra panašios į atrankos medžiagą.
3.2. Ląstelės, esančios suspensijoje arba vienasluoksnėje kultūroje, veikiamos bandomąja medžiaga, esant arba nesant metabolinės aktyvacijos sistemos, ir prieš pradedant bandymą šiek tiek paauginamos, kad būtų nustatytas citotoksiškumas bei vyktų fenotipo ekspresija. Įprastiniu atveju citotoksiškumas nustatomas pagal santykinį kloninio augimo efektyvumą ar absoliutų santykinį kultūros augimą, matuojamą tada, kai baigiasi ląstelių veikimas bandomąja medžiaga. Kultūros, paveiktos bandomąja medžiaga, palaikomos terpėje tam tikrą laiką, būdingą kiekvienam lokusui bei ląstelių tipui, kad vyktų beveik optimali atsiradusių mutacijų fenotipo ekspresija. Mutavimo dažnis nustatomas, pasėjant žinomą ląstelių skaičių į terpę, turinčią atrankai naudojamos medžiagos, kad, siekiant įvertinti kloninio augimo efektyvumą, būtų identifikuotos mutantinės ląstelės, esančios terpėje, neturinčioje atrankai naudojamos medžiagos. Pasibaigus inkubacijai, suskaičiuojamos kolonijos. Mutavimo dažnis nustatomas, suskaičiavus kolonijas, kuriose įvyko mutacijos ir kurios buvo auginamos terpėje, turinčioje arba neturinčioje atrankai naudojamos medžiagos.
4. Bandymo metodo aprašymas
4.1. Pasiruošimas
4.1.1. Ląstelės
4.1.1.1. Galima naudoti įvairius ląstelių tipus, įskaitant L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 klonus arba TK6 ląsteles. Bandyme naudojami ląstelių tipai turi būti jautrūs cheminiams mutagenams, jų kloninio augimo efektyvumas turi būti pakankamai didelis bei jose vykstančių spontaninių mutacijų dažnis turi būti pakankamai stabilus. Ląstelės turi būti patikrintos, ar neužkrėstos mikoplazmomis (užkrėstos ląstelės bandyme nenaudojamos).
4.1.1.2. Bandymas parengiamas taip, kad jis būtų atliekamas, esant kuo didesniam nustatymo jautrumui bei visapusiškumui. Naudojamų ląstelių bei jų kultūrų skaičius ir bandomosios medžiagos koncentracijos turi atitikti nustatytus kriterijus. Minimalus gyvų ląstelių, išlikusių po veikimo bandomąja medžiaga bei naudojamų kiekviename bandymo etape, skaičius turi būti pagrįstas spontaninių mutacijų dažniu. Rekomenduojama panaudoti mažiausiai 106 ląstelių. Turi būti sudaryta galimybė susipažinti su anksčiau gautais duomenimis apie ląstelių sistemą, rodančiais, kad tyrimas atliekamas nuosekliai.
4.1.2. Terpė ir kultivavimo sąlygos. Reikia naudoti atitinkamą terpę, skirtą kultivavimui, bei laikytis atitinkamų inkubavimo sąlygų (kultivavimo indai, temperatūra, CO2 koncentracija ir drėgmė). Terpė turi būti parinkta atsižvelgiant į šio bandymo metu naudojamas atrankos sistemas bei ląstelių tipą. Ypač svarbu tai, kad pasirinktos kultivavimo sąlygos užtikrintų optimalų ląstelių augimą ekspresijos metu bei normalių ir mutantinių ląstelių gebėjimą suformuoti kolonijas.
4.1.3. Kultūrų paruošimas. Ląstelės padauginamos iš kamieninių kultūrų, pasėjamos į terpę, skirtą kultivavimui ir inkubuojamos 37 °C temperatūroje. Prieš pradedant šį bandymą, kultūros turi būti išgryninamos, atsikratant jau esančių mutantinių ląstelių.
4.1.4. Metabolinė aktyvacija
4.1.4.1. Ląstelės inkubuojamos su bandomąja chemine medžiaga tiek esant, tiek ir nesant atitinkamos metabolinės aktyvacijos sistemos. Plačiausiai vartojama sistema yra postmitochondrinė frakcija, išskirta iš graužikų kepenų, paveiktų fermentinį aktyvumą skatinančiomis medžiagomis, pavyzdžiui, AROCLOR 1254 ar fenobarbitono ir b-naftoflavono mišiniu, bei praturtinta kofaktoriumi.
4.1.4.2. Postmitochondrinė frakcija paprastai vartojama koncentracijomis, kurių intervalas bandymo metu naudojamoje galutinėje terpėje siekia nuo 1 iki 10 % pagal tūrį. Metabolinės aktyvacijos sistema pasirenkama priklausomai nuo bandomosios cheminės medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga varoti daugiau nei vieną postmitochondrinės frakcijos koncentraciją.
4.1.4.3. Endogeninę aktyvaciją gali pagerinti genetine inžinerija sukurtos ląstelių linijos, kurios gamina specifinius fermentus, dalyvaujančius aktyvacijoje. Bandyme naudojamos ląstelių linijos pasirenkamos moksliškai pagrįstai (pavyzdžiui, pagal citochromo P450 izofermento svarbą bandomosios cheminės medžiagos metabolizmui).
4.1.5. Bandomoji medžiaga ar preparatas. Kietosios medžiagos turi būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinamuosiuose įrenginiuose ir, jeigu reikia, tai prieš tai, kai šia medžiaga bus paveiktos ląstelės, praskiestos. Prieš paveikiant ląsteles skystosiomis medžiagomis arba po veikimo, šios medžiagos gali būti tiesiogiai įvedamos į bandymo sistemas ir praskiedžiamos. Bandomieji preparatai naudojami naujai pagaminti, išskyrus atvejus, kai tyrimais įrodytas jų stabilumas.
4.2. Bandymo sąlygos
4.2.1. Tirpiklis ir tirpinantysis įrenginys. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys neturi chemiškai reaguoti su bandomąja medžiaga. Turi būti užtikrinta, kad ląstelės liks išsaugotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai ar tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturėtų būti vandens. Vandenį galima pašalinti molekuliniu filtru.
4.2.2. Poveikio koncentracijos
4.2.2.1. Parenkant pačią didžiausią koncentraciją, vadovaujamasi citotoksiškumu, tirpumu tiriamojoje sistemoje ir pH arba osmosinio slėgio pokyčiais. Citotoksiškumas turėtų būti nustatomas pagrindinio eksperimento metu, esant metabolinei aktyvacijai, remiantis atitinkamais ląstelių vientisumo ir augimo rodikliais, rodančiais, kad ląstelės yra vientisos ir kad jos auga – santykiniu kloninio augimo efektyvumu arba absoliučiu santykiniu augimu. Pirminio ekperimento metu naudinga nustatyti citotoksiškumą ir tirpumą.
4.2.2.2. Turi būti naudojamos mažiausiai 4 nustatomos koncentracijos. Jei nustatomas citotoksiškumas, tai šios koncentracijos turėtų svyruoti nuo maksimalaus iki minimalaus citotoksiškumo laipsnio arba jo apskritai neturėtų būti; tai reiškia, kad koncentracijos turi skirtis 2–Ö10 karto. Jei didžiausia koncentracija parinkta atsižvelgiant į citotoksiškumą, ją naudojant santykinis išgyvenimas arba santykinis absoliutus augimas turi sudaryti apie 10–20 % (bet ne mažiau kaip 10%). Santykinai necitotoksiškų medžiagų atveju maksimali koncentracija turi būti mažiausia iš šių: 5 mg/ml, 5 ml/ml arba 0,01 M.
4.2.2.3. Santykinai netirpios medžiagos turi būti tiriamos kultivavimo sąlygomis, jų koncentracijai siekiant ar viršijant tirpumo ribą. Netirpumas turi būti nustatomas galutinėje terpėje, kuria paveikiamos ląstelės. Prieš pradedant ir baigiant veikimą bandomąja medžiaga, naudinga nustatyti tirpumą, kadangi veikimo metu tirpumas gali pakisti dėl bandymo sistemoje esančių ląstelių, S9 mišinio, serumo ir pan. Netirpumą galima įvertinti plika akimi. Precipitatas neturi trukdytu rezultatų vertinimui.
4.2.3. Kontroliniai bandiniai
4.2.3.1. Atliekant kiekvieną eksperimentą, vienu metu reikia naudoti teigiamus ir neigiamus (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) kontrolinius bandinius, esant arba nesant metabolinės aktyvacijos sistemos. Kai naudojama metabolinė aktyvacija, tai teigiamas kontrolinis bandinys turi būti cheminė medžiaga, kuri sukelia mutageninį atsaką tik ją aktyvavus. Teigiamų kontrolinių bandinių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje.
4.2.3.2. Galima naudoti ir kitas standartines teigiamas kontrolines medžiagas. Pavyzdžiui, jei laboratorijoje anksčiau gauti duomenys apie 5-brom-2’-dezoksiuridiną (CAS Nr. 59-14-3; EINECS Nr. 200-415-9), tai galima naudoti šią medžiagą. Kai įmanoma, reikia apsvarstyti teigiamų kontrolinių medžiagų, priklausančių konkrečiai klasei, panaudojimą.
4.2.3.3. Reikia naudoti neigiamus kontrolinius bandinius, sudarytus vien iš tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio ir neturinčius bandomosios medžiagos bei paveiktus tokiu pat būdu kaip ir tiriamieji bandiniai. Be to, reikia naudoti ir bandomąja medžiaga neveiktus neigiamus kontrolinius bandinius, išskyrus atvejus, kai įrodyta, kad pasirinktas tirpiklis nėra žalingas ir mutageniškas.
4.3. Darbo eiga
4.3.1. Poveikis bandomąja medžiaga
4.3.1.1. Proliferuojančios ląstelės veikiamos bandomąja medžiaga esant metabolinės aktyvacijos sistemai ar be jos. Poveikis turi trukti atitinkamą laiką (efektyvus poveikis paprastai užtrunka 3–6 valandas). Poveikio trukmė gali būti pailginta vienu ar keliais ląstelės ciklais.
4.3.1.2. Tiriant kiekvieną koncentraciją, gali būti atliekami kultūrų, paveiktų bandomąja medžiaga, 1 ar 2 persėjimai. Atliekant kultūrų, paveiktų bandomąja medžiaga, vienetinį persėjimą, koncentracijų skaičius padidinamas, kad susidarytų pakankamas analizuojamų kultūrų skaičius (turi būti naudojamos mažiausiai 8 nustatomos koncentracijos). Reikia mažiausiai dukart panaudoti neigiamas (tirpikliu paveiktas) kontrolines kultūras.
4.3.2. Išgyvenimo, gyvybingumo bei mutavimo dažnio nustatymas
4.3.2.1. Baigiantis veikimui bandomąja medžiaga, ląstelės perplaunamos ir paauginamos, siekiant nustatyti jų išgyvenimą bei užtikrinti mutantinio fenotipo ekspresiją. Pasibaigus veikimui bandomąja medžiaga, iškart nustatomas citotoksiškumas, įvertinant santykinį kloninio augimo efektyvumą (išgyvenimą) arba absoliutų santykinį augimą.
4.3.2.2. Kiekvienas lokusas turi apibrėžtą mažiausią laiko tarpą, per kurį turi įvykti beveik optimali naujai atsiradusio mutantinio fenotipų ekspresija (HFRT ir KFRT fenotipas – 6–8 dienas, TK fenotipas – mažiausiai 2 dienas). Ląstelės auginamos terpėje, kurioje yra arba nėra medžiagos, kuria remiantis mutantai atrenkami pagal kloninio augimo efektyvumą ir nustatomas jų skaičius. Gyvybingumas pradedamas tirti (tam, kad būtų galima apskaičiuoti mutavimo dažnį) baigiantis ekspresijai, kai kamienai pasėjami į terpę, kuri nėra skirta atrankai (kurioje nėra atrankai naudojamos medžiagos).
4.3.2.3. Jei L5178Y TK+/- tyrimo metu nustatoma, kad bandomoji medžiaga duoda teigiamus rezultatus, tai mažiausiai vienąkart nustatomas bandomųjų kultūrų (esant pačiai didžiausiai teigiamai koncentracijai) bei teigiamų ir neigiamų kontrolinių kultūrų dydis. Jei L5178y TK+/- tyrimo metu nustatoma, kad bandomoji medžiaga duoda neigiamus rezultatus, tai nustatomas teigiamų bei neigiamų kontrolinių kolonijų skaičius. Atliekant TK6TK+/- tyrimą, taip pat galima įvertinti kolonijų dydį.
II. Duomenys
5. Duomenų apdorojimas
5.1. Pateikiant duomenis turi būti nurodytas kontrolinių bei paveiktų bandomąja medžiaga kultūrų citotoksiškumas, gyvybingumas, kolonijų skaičius bei mutavimo dažnis. Jei atliekant L5178y TK+/- tyrimą buvo gauti teigiami rezultatai, tai kolonijos vertinamos naudojant mažų ir didelių kolonijų, paveiktų mažiausiai viena (didžiausia teigiama) bandomosios medžiagos koncentracija, duomenis bei teigiamų ir neigiamų kontrolinių kolonijų duomenis. Didelėse bei mažose kolonijose esančių mutantų molekulinė ir citogenetinė prigimtis detaliai ištirta. Atliekant TK+/- tyrimą, kolonijos vertintos naudojant normalaus augimo (didelės kolonijos) ir sulėtinto augimo (mažos kolonijos) kriterijus. Mutantinės ląstelės, kuriose įvyko dideli genetiniai pažeidimai, pasižymi ilgesniu nei paprastai dalijimosi periodu ir todėl jos suformuoja mažas kolonijas. Šis sutrikimas įprastiniu atveju gali pasireikšti arba kaip atskiro geno praradimas, arba kariotipiškai įvertinamomis chromosomų aberacijomis. Cheminės medžiagos, sukeliančios dideles chromosomų aberacijas, skatina mažas kolonijas sudarančių mutantų susiformavimą. Mažiau pažeistos mutantinės ląstelės auga panašiai kaip ir tėvinės ląstelės bei sudaro dideles kolonijas.
5.2. Reikia pateikti išgyvenimo (santykinio kloninio augimo efektyvumo) ar absoliutaus santykinio augimo duomenis. Mutavimo dažnis turi būti išreiškiamas kaip mutantinių ir išgyvenusių ląstelių skaičiaus santykis.
5.3. Kiekvienos kultūros tyrimų duomenys pateikiami atskirai. Visi apibendrinti duomenys pateikiami lentelėse.
5.4. Teigiamo atsako patvirtinti nebūtina. Abejotini rezultatai patvirtinami arba atmetami tiriant toliau pakeitus bandymo sąlygas, pavyzdžiui, koncentracijas ir metabolinę aktyvaciją. Neigiami rezultatai patvirtinami kiekvienu atveju. Jei manoma, jog nėra reikalo patvirtinti neigiamus rezultatus, tai būtina pagrįsti.
6. Duomenų įvertinimas ir interpretacija
6.1. Nuo koncentracijos priklausomas bei pakartojamas chromosomines aberacijas turinčių ląstelių skaičiaus padidėjimas yra kriterijai, kuriais remiantis nustatoma, ar bandymo rezultatai teigiami. Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Vertinant tyrimo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis kriterijus, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas.
6.2. Jei gauti rezultatai neatitinka šio metodo 6.1 punkte nurodytų kriterijų, tai bandomoji medžiaga pagal šio metodo sąlygas laikoma nemutageniška.
6.3. Po daug bandymų gavus aiškius teigiamus ir aiškius neigiamus rezultatus, dažniausiai galima padaryti išvadą apie bandomosios medžiagos savybes remiantis gautų duomenų visuma. Net ir daug kartų pakartojus konkretų bandymą, jo rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs.
6.4. Šiuo metodu gauti teigiami rezultatai rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia genų mutacijas kultivuotose žinduolių ląstelėse. Svarbiausias yra nuo koncentracijos priklausantis atsakas. Neigiami rezultatai rodo, kad šiame metode aprašytomis bandymo sąlygomis bandomoji medžiaga nesukelia genų mutacijų kultivuotose žinduolių ląstelėse.
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
7. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija:
7.1. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys
7.2. Ląstelės
7.3. Bandymo sąlygos
7.3.1. pagrindinė priežastis, dėl kurios buvo pasirinktos koncentracijos ir ląstelių kultūrų skaičius, nurodant, jei įmanoma, citotoksiškumo tyrimo duomenis ir tirpumo ribas;
7.3.11. ekspresijos trukmė, įskaitant pasėtų ląstelių skaičių, subkultivavimo bei augimui skirtų medžiagų papildymo duomenis, jei juos įmanoma pateikti;
7.3.13. kriterijai, pagal kuriuos sprendžiama, ar tyrimų metu gauti rezultatai teigiami, neigiami bei abejotini;
7.4. Rezultatai
7.4.5. laboratorijos kompetentingumas L5178Y TK+/- sistema nustatyti mutantus, sudarančius mažas kolonijas, jei tai būtina nurodyti;
7.4.8. vienu metu gauti neigiamų (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) ir teigiamų kontrolinių bandinių tyrimų duomenys;
7.4.9. duomenys, gauti anksčiau atliktų tyrimų metu išanalizavus neigiamus (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) ir teigiamus kontrolinius bandinius, nurodant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus;
IV. NUORODOS
9. Moore M. M., DeMarini D. M., DeSerres F. J., Tindal K. R. (red.) (1987), 28 Banbury ataskaita; Žinduolių ląstelių mutagenezė, Cold Spring Harbor Laboratory, Niujorkas.
10. Chu E. H. Y., Malling H. V. (1968), Žinduolių ląstelių genetika. II d. Kiniško žiurkėno ląstelių specifinio lokuso mutacijų cheminė indukcija in vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, 1306–1312.
11. Liber H. L., Thilly, W. G. (1982), Žmogaus diploidinių limfoblastų timidinkinazės lokuso mutacijos įvertinimas, Mutation Res. 94, 467–485.
12. Moore M. M., Harington-Brock K., Doerr C. L., Dearfield K. L. (1989), Pelių limfomos TK ir CHO HGPRT lokusų mutacijų diferencinis apskaičiavimas, Mutagenesis, 4, 394–403.
13. Aaron C. S., Stankowski Jr. L. F., (1989), AS52/XPRT ir CHO/HPRT įvertinimo palyginimas. Šešių kandidatų į vaistus įvertinimas, Mutation Res. 223, 121–128.
14. Aaron C. S., Bolcsfoldi G., Glatt H. R., Moore M., Nishi Y., Stankowski Jr. L. F., Theiss J., Thompson E. (1994), Žinduolių ląstelių genų mutacijų įvertinimo darbo grupės ataskaita. Tarptautinio genotoksiškumo bandymų procedūrų standartizacijos seminaro ataskaita, Mutation Res. 312, 235–239.
15. Scott D., Galloway S. M., Marshall R. R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J., Myhr B. C. (1991), Genotoksiškumas ekstremaliomis kultūros sąlygomis. ICPEMC 9 darbo grupės ataskaita, Mutation Res., 257, 147–204.
16. Clive D., McCuen R., Spector J. F. S., Piper C., Mavournin K. H. (1983), L5178Y ląstelių kultūros specifinės genų mutacijos. JAV Aplinkos apsaugos agentūros Gene-Tox programos ataskaita, Mutation Res., 115, 225–251.
17. Li A. P., Gupta R. S., Heflich R. H., Wasson J. S. (1988), Kiniško žiurkėno kiaušidės ir hipoksantinguaninfosforibosiltransferazės sitemos cheminių medžiagų mutageniškumui nustatyti apžvalga ir analizė. JAV Aplinkos apsaugos agentūros Gene-Tox programos III fazės ataskaita, Mutation Res., 196, 17–36.
18. Li A. P., Carver J. H., Choy W. N., Hsie A. W., Gupta R. S., Loveday K. S., ÓNeill J. P., Riddle J. C., Stankowski L. F. Jr., Yang, L. L. (1987), Kiniško žiurkėno kiaušidės ir hipoksantinguaninfosforibosiltransferazės genų mutacijos bandymo atlikimo vadovas, Mutation Res., 189, 135–141.
19. Liber H. L., Yandell D. W., Little J. B. (1989), Žmogaus limfoblastoidinių ląstelių TK and HPRT lokusų mutacijų indukcijos palyginimas. Kiekybiniai skirtumai atsiranda dėl autosominio TK lokuso papildomos mutacijų klasės, Mutation Res., 216, 9–17.
20. Stankowski L. F. Jr., Tindal K. R., Hsie A. W. (1986), Etilmetansulfonato kiekybinės ir molekulinės analizės bei etilmetansulfonato ir ICR 191 indukuotų mutacijų AS52 ląstelėse kiekybinės ir molekulinės analizės, Mutation Res., 160, 133–147.
21. Turner N. T., Batson A. G., Clive, D. (1984), Pelių limfomos L5178Y/TK+/- – TK+/- ląstelių mutacijų įvertinimo procedūra (red. Kilbey, B. J. ir kt., Mutageniškumo bandymų procedūrų vadovas, Elsevier Science Publishers, Niujorkas, 239–268).
22. Arlett C. F., Smith D. M., Clarke G. M., Green M. H. L., Cole J., McGregor D. B., Asquith S. C. (1989), Žinduolių ląstelių genų mutacijos įvertinimai, besiremiantys kolonijų formavimu (Mutageniškumo bandymų duomenų statistinis įvertinimas, red. Kirkland D. J., Cambirdge University Press, 66–101).
23. Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N., Mazzaccoro A. (1977), 6-tioguaninui atsparių mutantų indukcija kiniško žiurkėno V79 ląstelėse naudojant pelių kepenų mikrosomų aktyvuotą dimetilnitrozaminą, Mutation Res. 46, 365–373.
24. Ames B. N., McCann J., Yamasaki E. (1975), Kancerogenų ir mutagenų nustatymo metodai naudojant Salmonella. Žinduolių mikrosomų mutageniškumo bandymas, Mutation Res., 31, 347–364.
25. Clive D., Johnson K. O., Spector J. F. S., Batson A. G., Brown M. M. M. (1979), L5178Y/TK+/- apibūdinimo validizacija. Pelių limfomos mutageniškumo įvertinimo sistema, Mutat. Res. 59, 61–108.
26. Maron D. M., Ames B. N. (1983), Patikslinti Salmonella mutageniškumo bandymai, Mutation Res., 113, 173–215.
27. Elliot B. M., Combes R. D., Elcombe C. R., Gatehouse D. G., Gibson G. G., Mackay J. M., Wolf, R. C. (1992), Mutagenesis, 7, 175–177.
28. Matsushima T., Sawamura M., Hara K., Sugimura T. (1976), Saugus polichlorintųjų bifenilų, naudojamų kaip metabolinių aktyvacijos sistemų induktorių, pakaitalas (de Serres F. J., Fouts J. R., Bend J. R., Philpot R. M. (red.), In vitro mutageniškumo tyrimų metabolinė aktyvacija, Elsevier, Šiaurės Olandija, 85–88).
29. Krahn D. F., Barsky F. C., McCooey K. T. (1982), CHO/HGPRT mutageniškumo įvertinimas. Dujų ir lakių skysčių įvertinimas (red. Tice R. R., Costa D. L., Schaich K. M., Oro veiksnių genotoksinis poveikis, Niujorkas, Plenum, 91–103.
30. Zamora P. O., Benson J. M., Li A. P., Brooks A. L. (1983), Ląstelių augimą ant kolageno gelių labai lakiems mutagenams aptikti CHO/HGPRT mutacijų įvertinime taikančios poveikio sistemos įvertinimas, Environmental Mutagenesis, 5, 795–801.
31. Applegate M. L., Moore M. M., Broder C. B., Burrell A., Hozier J. C. (1990), Pelių limfomos ląstelių heterozigotinio timidinkinazės lokuso mutacijų molekulinis atskyrimas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 51–55.
32. Moore M. M., Clive D. Hozier J. C., Howard B. E., Batson A. G., Turner N. T., Sawyer J. (1985), Pelių limfomos L5178Y/TK+/- ląstelių trifluorontimidinui atsparių mutantų analizė, Mutation Res. 151, 161–174.
33. Yandell D. W., Dryja T. P., Little J. B. (1990), Žmogaus ląstelių heterozigotinio autosominio lokuso recesyvinių mutacijų analizė, Mutation Res. 229, 89–102.
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B18 metodas: DNR PAŽAIDOS IR JŲ REPARACIJA. netaisyklinga DNR SINTEZĖ
ŽINDUOLIŲ LĄSTELĖSE IN VITRO
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 „Dėl cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų patvirtinimo“ (Žin., 2004, Nr. 70-2472) patvirtintame Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas).
4. Bandymo metodo principas. Netaisyklingos DNR sintezės (NDS) bandymo metu įvertinama DNR sintezė reparacijos metu, kai cheminėmis medžiagomis arba fiziniu poveikiu iškerpama ir pašalinama pažeista DNR atkarpa. Bandymas remiasi tričiu žymėto timidino (3H-TdR) įjungimu į žinduolių ląstelių, nesančių ląstelinio ciklo S (sintezės) fazėje, DNR. 3H-TdR įsijungimas į DNR gali būti nustatomas atliekant paveiktų ląstelių DNR autoradiografiją arba registruojant skystosios scintiliacijos įvykius (SSĮ). Išskyrus pirminius žiurkių hepatocitus, naudojamos žinduolių ląstelės, kultivuojamos kartu su bandomąja medžiaga, esant arba nesant metabolinės aktyvacijos sistemos. NDS galima įvertinti ir in vivo.
6. Bandymo metodo aprašymas
6.1. Pasiruošimas
6.1.1. Bandomosios, kontrolinės ar pamatinės medžiagos turėtų būti paruošiamos kultivavimui skirtoje terpėje arba, panaudojant atitinkamus prietaisus, ištirpinamos ar suspenduojamos ir vėliau praskiedžiamos kultivavimui skirta terpe, kad tyrimo metu būtų galima jas naudoti. Galutinė medžiagų koncentracija, pasiekta naudojant prietaisą, neturėtų daryti įtakos ląstelių gyvybingumui.
6.1.2. Bandyme galima naudoti žiurkių hepatocitų pirmines kultūras, žmogaus limfocitus arba gerai žinomas ląstelių linijas, pavyzdžiui, žmogaus diploidinius fibroblastus.
6.2. Bandymo sąlygos
6.2.1. Kultūrų skaičius. Atliekant NDS bandymą autoradiografijos metodu, reikėtų naudoti mažiausiai dvi ląstelių kultūras, o skystosios scintiliacijos įvykių registravimo metodu – mažiausiai šešias kultūras (arba mažiau, jei moksliškai pagrindžiama) kiekvienam eksperimento etapui.
6.2.2. Kontroliniai bandiniai
6.2.2.1. Atliekant kiekvieną eksperimentą, reikėtų vienu metu naudoti teigiamas ir neigiamas (neveiktas ir/ar tirpiklio) kontroles, esant ir nesant metabolinės aktyvacijos sistemos.
6.2.2.2. Bandyme naudojant žiurkių hepatocitų pirmines kultūras, kaip teigiama kontrolė naudojamas 7,12-dimetilbenzantracenas (7,12-DMBA) arba 2-acetilaminofluorenas (2-AAF). Jei naudojamos gerai žinomos ląstelių linijos ir NDS bandymas atliekamas autoradiografijos arba skystosios scintiliacijos įvykių registravimo metodais, nesant metabolitinės aktyvacijos sistemos, 4–nitrokvinolin-N-oksidas naudojamas kaip teigiama kontrolė, o esant metabolitinės aktyvacijos sistemai – N-dimetilnitrozaminas.
6.3. Poveikio koncentracijos. Reikia naudoti daug bandomosios medžiagos koncentracijų, išdėstytų dideliame intervale, pakankamame atsakui nustatyti. Didžiausia koncentracija turėtų sukelti kelis citotoksinius poveikius. Reikia nustatyti santykinai netirpių vandenyje medžiagų tirpumo ribą. Gerai vandenyje tirpstančių netoksiškų medžiagų didžiausia tiriamoji koncentracija parenkama atskirai kiekvienu konkrečiu atveju.
6.4. Ląstelės. Kultivuojant kultūras reikia naudoti atitinkamą terpę ir užtikrinti reikiamą CO2 koncentraciją, temperatūrą ir drėgmę. Gerai žinomos ląstelių linijos periodiškai tikrinamos siekiant nustatyti mikoplazmų infekciją.
7. Darbo eiga
7.1. Kultūrų paruošimas
7.1.1. Gerai žinomos ląstelių linijos paruošiamos iš kamieninių kultūrų (veikiant tripsinu arba kratant), atitinkamu tankumu pasėjamos į terpę kultivavimui skirtuose induose ir inkubuojamos 37 °C temperatūroje.
7.1.2. Trumpalaikės žiurkių hepatocitų kultūros sukuriamos šviežiai disocijuotus hepatocitus pasėjant į atitinkamą terpę ir leidžiant jiems prisitvirtinti prie augimo paviršiaus.
7.2. Poveikis bandomąja medžiaga
7.2.1. Pirminiai žiurkių hepatocitai. Šviežiai išskirti žiurkių hepatocitai atitinkamą laiką veikiami bandomąja medžiaga terpėje, turinčioje 3H-TdR. Baigiantis veikimui, terpė atskiriama nuo ląstelių. Atskirtos ląstelės sudrėkinamos, fiksuojamos bei išdžiovinamos. Skaidrės panardinamos į autoradiografinę emulsiją (galima naudoti ir fotografinę juostelę), eksponuojamos, išryškinamos, nudažomos ir suskaičiuojamos ląstelės.
7.2.2. Gerai žinomos ląstelių linijos ir limfocitai
7.2.2.1. Autoradiografija. Ląstelių kultūros veikiamos bandomąja medžiaga atitinkamą laiką, po to veikiamos 3H-TdR. Laiko trukmė parenkama atsižvelgiant į bandomosios medžiagos prigimtį, metabolinių sistemų aktyvumą bei ląstelių tipą. Intensyviausiai NDS pasiekti 3H-TdR įvedamas arba vienu metu su bandomąja medžiaga, arba praėjus kelioms minutėms po bandomosios medžiagos įvedimo. Kurią procedūrą pasirinkti, lemia bandomosios medžiagos ir 3H-TdR tarpusavio sąveika. Kad būtų galima NDS atskirti nuo pusiau konservatyvios DNR sintezės, pastaroji turi būti blokuojama, pavyzdžiui, naudojant terpę be arginino arba su mažu serumo kiekiu, arba į terpę pridedant pridedant hidroksišlapalo. Pusiau konservatyvios DNR sintezės blokuoti nebūtina tais atvejais, kai bandyme naudojami žmogaus limfocitai be metabolinės aktyvacijos.
7.2.2.2. Skystosios scintiliacijos įvykių registracija. Prieš veikiant bandomąja medžiaga blokuojamas ląstelių perėjimas į S fazę. Vėliau ląstelės veikiamos bandomąja medžiaga taip, kaip aprašyta šio metodo 7.2.2.1 punkte. Baigiantis inkubacijos periodui iš ląstelių išskiriama DNR ir nustatomas absoliutus DNR bei į ją įsijungusio 3H-TdR kiekis.
7.3. Analizė
7.3.1. Autoradiografija. Įvertinant NDS intensyvumą ląstelių kultūroje neskaičiuojami branduoliai, esantys S fazėje. Reikia suskaičiuoti mažiausiai 50 ląstelių kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai. Kiekvienoje skaidrėje reikia suskaičiuoti keletą atsitiktinių regionų, plačiai atskirtų vienas nuo kito. Į citoplazmą įsijungusio 3H-TdR kiekis nustatomas suskaičiuojant tris branduolio apribotus laukelius, esančius jau suskaičiuotų ląstelių citoplazmoje.
II. Duomenys
8. Autoradiografija
8.1. Atskirai registruojamas į citoplazmą įsijungusio 3H-TdR kiekis ir ląstelės branduolyje esančių granulių skaičius.
9. SSĮ. Nustatant skystosios scintiliacijos įvykius 3g DNR vidurkį bei standartinį nuokrypį.g DNR. Apibūdinant įsijungimo pasiskirstymą galima panaudoti dpm/H-TdR įsijungimas išreiškiamas dpm/
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
11. Bandymo protokole, jei įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija:
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B19 metodas: Seserinių chromatidžių apsikeitimo in vitro įvertinimas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
4. Bandymo metodo principas
4.1. Seserinių chromatidžių apsikeitimo (SCA) bandymas trunka trumpai, juo nustatomi dviejų besidalijančių seserinių chromatidžių DNR grįžtamieji apsikeitimai. SCA atspindi homologinių lokusų DNR replikacijos produktų apsikeitimą. Apsikeitimo proceso metu neabejotinai įvyksta DNR trūkis ir susiuvimas, tačiau apie šio proceso molekulinius mechanizmus žinoma nedaug. SCA nustatymui reikia skirtingai pažymėti seserines chromatides, tai galima padaryti įjungiant bromdeoksiuridiną (BrdU) į chromosominę DNR dviejų ląstelinių ciklų metu.
4.2. Žinduolių ląstelės veikiamos bandomąja medžiaga in vitro naudojant arba nenaudojant žinduolių metabolinę aktyvacijos sistemą ir, jeigu reikia, kultivuojamos du replikacijos ciklus terpėje su BrdU. Paveikus verpsčių inhibitoriumi (pavyzdžiui, kolchicinu) ląstelės surenkamos ir paruošiami chromosomų preparatai.
6. Bandymo metodo aprašymas
6.1. Pasiruošimas
6.1.1. Bandyme galima naudoti pirmines kultūras (žmogaus limfocitai) arba gerai žinomas ląstelių linijas (pavyzdžiui, kiniško žiurkėnų kiaušidžių ląsteles). Reikėtų patikrinti, ar ląstelių linijos neužsikrėtusios mikoplazmomis.
6.1.2. Naudojama atitinkama kultivavimo terpė ir parenkamos tinkamos inkubacijos sąlygas (pavyzdžiui, temperatūra, kultivavimo indai, CO2 koncentracija ir drėgmė).
6.1.3. Prieš poveikį bandomosios medžiagos turi būti paruoštos kultivavimui skirtoje terpėje arba, panaudojant atitinkamus prietaisus, ištirpintos ar suspenduotos. Naudojant tirpiklį kaip kontrolę, reikia stebėti, kad, panaudojant atitinkamą prietaisą, pasiekta bandomosios medžiagos galutinė koncentracija kultivavimui skirtoje sistemoje smarkiai neįtakotų ląstelių gyvybingumo ar augimo greičio bei apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis dažnumo.
6.2. Bandymo sąlygos
6.2.2. Kontroliniai bandiniai
6.2.2.1. Kiekvieno eksperimento metu reikia naudoti teigiamas kontroles iš tiesiogiai veikiančios medžiagos ir medžiagos, kurią reikia metabolitiškai aktyvuoti (netiesiogiai veikiančios medžiagos); taip pat reikia naudoti tirpiklio kontrolę.
6.2.2.2. Kaip teigiamą kontrolę galima naudoti tiesiogiai veikiančią medžiagą etilmetansulfonatą ir netiesiogiai veikiančią medžiagą ciklofosfamidą.
6.3. Poveikio koncentracijos. Reikia naudoti mažiausiai tris bandomosios medžiagos koncentracijas, tinkamai atskirtas vieną nuo kitos. Didžiausia koncentracija turėtų sukelti intensyvų toksinį atsaką, tačiau nesutrukdyti ląstelių replikacijos ciklo. Reikia nustatyti santykinai netirpių vandenyje medžiagų tirpumo ribą. Gerai vandenyje tirpstančių netoksiškų medžiagų didžiausia tiriamoji koncentracija parenkama atskirai kiekvienu konkrečiu atveju.
7. Darbo eiga
7.1. Kultūrų paruošimas. Gerai žinomos ląstelių linijos paruošiamos iš kamieninių kultūrų (veikiant tripsinu arba kratant), atitinkamu tankumu pasėjamos į terpę kultivavimo induose ir inkubuojamos 37 °C temperatūroje. Vienasluoksnių kultūrų atveju ląstelių, esančių kultivavimo inde, skaičius turėtų būti taip sureguliuotas, kad ląstelių surinkimo metu kultūros susimaišymas siektų ne daugiau kaip 50 %. Ląsteles galima kultivuoti ir suspensijoje. Žmogaus limfocitų kultūros paruošiamos iš heparinizuoto kraujo ir inkubuojami 37 °C temperatūroje.
7.2. Poveikis bandomąja medžiaga
7.2.1. Ląstelės, esančios eksponentinėje augimo fazėje, veikiamos bandomąja medžiaga atitinkamą laiką. Paprastai užtenka vienos–dviejų valandų, tačiau konkrečiais atvejais veikimas gali būti pratęsiamas iki dviejų ląstelinių ciklų. Ląstelės, nepasižyminčios pakankamu metabolitiniu aktyvumu, turėtų būti veikiamos bandomąja medžiaga esant ar nesant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai. Baigiantis veikimui, nuo ląstelių nuplaunama bandomoji medžiaga ir jos kultivuojamos du replikacijos ciklus terpėje su BrdU. Ląsteles galima veikti vienu metu bandomąja medžiaga ir BrdU du ląstelinius ciklus.
7.2.3. Ląstelės analizuojamos, kai pradeda dalytis antrą kartą po veikimo, užtikrinant, kad bandomąja medžiaga buvo paveiktos ląstelės, esančios pačiose jautriausiose ląstelinio ciklo fazėse. Visos kultūros, į kurias buvo įvesta BrdU, laikomos tamsoje arba blankioje dienos šviesos lempų šviesoje, kol bus surinktos ląstelės, taip sumažinant DNR su BrdU fotolizę.
7.3. Ląstelių surinkimas. Prieš surenkant ląsteles, šios veikiamos verpstės inhibitoriumi (pavyzdžiui, kolchicinu) vieną–dvi valandas. Chromosomoms paruošti kiekviena kultūra surenkama ir apdorojama atskirai.
7.4. Chromosomų paruošimas ir dažymas. Chromosomos paruošiamos standartiniais citogenetiniais metodais. Skaidrės, skirtos SCA nustatymui, gali būti dažomos keliais būdais (pavyzdžiui, fluorescenciniais dažais ar Giemsa būdu).
7.5. Analizė. Analizuojamų ląstelių skaičius turėtų būti pagrįstas SCA spontaniniu kontroliniu dažniu. Paprastai analizuojamos mažiausiai 25 gerai matomos metafazės. Prieš analizę skaidrės užkoduojamos. Žmogaus limfocitų atveju analizuojamos tik metafazėje esančios chromosomos, turinčios 46 centromeras. Gerai žinomų ląstelių linijų atveju analizuojamos tik tos metafazinės chromosomos, kurios turi ±2 modalinį centromerų skaičių. Reikėtų nurodyti, ar centromeros pakitimai priskiriami SCA. Rezultatai turi būti patvirtinti atlikus nepriklausomą eksperimentą.
II. Duomenys
8. Duomenys pateikiami lentelėse. SCA kiekvienoje metafazinėje ir nemetafazinėje chromosomoje skaičius pateikiamas atskirai kiekvienai veiktai ir neveiktai bandomąja medžiaga kultūrai.
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
10. Bandymo protokole, jei įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija:
10.2. bandymo sąlygos: terpės sudėtis, CO2 koncentracija, tiriamosios medžiagos koncentracija, tirpiklis, inkubacijos temperatūra, veikimo laikas, verpstės inhibitorius, jo koncentracija ir veikimo inhibitoriumi trukmė, panaudotos žinduolių metabolinės aktyvacijos sistemos tipas, teigiami ir neigiami kontroliniai bandiniai;
10.7. SCA vienoje ląstelėje ir vienoje chromosomoje vidurkis (kiekvienos kultūros duomenys pateikiami atskirai);
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B20 metodas: Drosophila melanogaster nuo lyties priklausomo
recesyvinio letališkumo bandymas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
4. Bandymo metodo principas
4.1. Nuo lyties priklausomo recesyvinio letališkumo (LPRL) bandymo naudojant Drosophila melanogaster metu vabzdžio embrioninės linijos ląstelėse nustatomos mutacijos, tiek taškinės, tiek ir nedidelės delecijos. Šis bandymas skirtas tiesioginėms mutacijoms analizuoti, jo metu galima nustatyti mutacijas, lokalizuotas apie 800 lokusų, sudarančių apie 80 % visų X chromosomos lokusų. X-chromosoma sudaro maždaug penktadalį haploidinio Drosophila genomo.
4.2. Drosophila melanogaster X-chromosomoje vykstančios mutacijos fenotipiškai pasireiškia patinuose, turinčiuose mutantinį geną. Kai mutacija hemizigotinėmis sąlygomis letali, tai viena iš dviejų patinų grupių neturės palikuonių, kuriuos normaliomis sąlygomis atsiveda heterozigotinės patelės. Atliekant LPRL bandymą, pasinaudojus šia informacija specifiškai pažymimos bei išdėstomos chromosomos.
6. Bandymo metodo aprašymas
6.1. Pasiruošimas
6.1.1. Padermės. Bandyme galima naudoti gerai žinomos laukinės padermės patinus ir padermės Muller-5 pateles. Taip pat galima naudoti kitas atitinkamai pažymėtas patelių padermes, turinčias daug invertuotų X chromosomų.
6.1.2. Bandomoji medžiaga. Bandomoji medžiaga turėtų būti tirpinama vandenyje. Prieš veikimą vandenyje netirpstančios medžiagos gali būti ištirpinamos arba suspenduojamos panaudojus atitinkamus tirpiklius, pavyzdžiui, etanolio ir Tween-60 arba Tween-80 mišinį, po to praskiedžiamos vandeniu ar druskų tirpalu. Reikėtų vengti naudoti dimetilsulfoksidą (DMSO) kaip tirpinimo priemonę.
6.1.3. Vabzdžių skaičius. Bandymą reikia suplanuoti taip, kad iš anksto būtų numatytas jo jautrumas ir skiriamoji geba. Dažnai pasireiškiančios kontrolinių vabzdžių spontaninės mutacijos labai padidina paveiktų bandomąja medžiaga chromosomų, reikalingų bandymui atlikti, skaičių.
6.1.4. Dozavimas. Bandomoji medžiaga gali būti duodama per os, ją injekuojant arba vabzdį veikiant dujomis ar garais. Bandomąją medžiagą galima duoti ir cukraus tirpale (su maistu). Jeigu reikia, medžiaga gali būti ištirpinama 0,7 % NaCl tirpale ir injekuojama į stemplę ar pilvelį.
6.1.5. Kontroliniai bandiniai. Reikia naudoti neigiamas (tirpiklis) ir teigiamas kontroles. Jei galima pasinaudoti anksčiau atliktų laboratorinių bandymų duomenimis, kontrolių galima nenaudoti.
6.1.6. Koncentracijos. Naudojamos trys koncentracijos. Atliekant išankstinį bandomosios medžiagos įvertinimą galima naudoti vieną koncentraciją, kuri yra arba didžiausia toleruojamoji koncentracija, arba sukelia kai kuriuos toksiškumo požymius. Veikiant netoksiškomis medžiagomis naudojama didžiausia koncentracija.
7. Darbo eiga
7.1. Laukinio tipo patinai (trijų–penkių dienų amžiaus) veikiami bandomąja medžiaga ir poruojami individualiai su daugeliu Muller-5 ar kitos atitinkamai pažymėtos (turinčios daug invertuotų X chromosomų) padermės patelių, kurios iki tol nebuvo suporuotos. Kas dvi–trys dienos apvaisintos patelės keičiamos naujomis siekiant apimti visą embrioninių ląstelių ciklą. Vertinami šių patelių palikuonių subrendusios spermos, vidurinėje ar vėlyvojoje stadijoje esančių spermatidžių, spermatocitų ir spermatogonijų letaliniai pokyčiai dėl bandomosios medžiagos poveikio.
7.2. Ankstesniuose kryžminimuose naudotoms heterozigotinėms pirmos palikuonių kartos (F1) patelėms leidžiama individualiai kryžmintis (viena patelė inde) su jų broliais. Kiekviena F2 karta įvertinama pagal laukinio tipo patinų nebuvimą. Jei nustatoma, kad F1 patelės turi letalią X chromosomos mutaciją (pavyzdžiui, nėra patinų su paveikta chromosoma), tai tiriamos tą patį genotipą turinčios šios patelės dukterys siekiant įsitikinti, jog letalumas pasikartoja kitoje kartoje.
II. Duomenys
8. Duomenys pateikiami lentelėse. Nurodomas ištirtų X chromosomų skaičius, nevaisingų patinų skaičius ir kiekvieno paveikto patino kiekvieno poravimosi periodo metu nustatytų letalių chromosomų skaičius kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai. Pateikiamas skirtingų dydžių genų klasterių kiekvieno patino genome skaičius. Duomenys turi būti patvirtinti atlikus atskirą bandymą.
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
10. Bandymo protokole, jei įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija:
10.1. panaudotos Drosophila padermės ar kamienai, vabzdžių amžius, paveiktų patinų skaičius, sterilių patinų skaičius, sukurtų F2 kartos kultūrų skaičius, F2 kultūrų, neturinčių palikuonių, skaičius, chromosomų, turinčių letalią mutaciją, nustatytą embrioninės linijos ląstelėse, skaičius;
10.3. bandymo sąlygos: detalus veikimo ir mėginių paėmimo tvarkaraštis, veikimo koncentracijos, toksiškumo tyrimo duomenys, neigiamos (tirpiklis) ir teigiamos kontrolės, jeigu reikia;
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B21 metodas: žinduolių ląstelių transformacijos in vitro bandymai
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
4. Bandymo metodų principas. Siekiant nustatyti cheminių medžiagų, sukeliančių ląstelių piktybinę transformaciją in vivo ir ląstelių fenotipo pokyčius in vitro, gali būti naudojamos žinduolių ląstelių kultūrų sistemos. Plačiai naudojamoms ląstelių linijoms priklauso C3h10T1/2. 3T3, SHE bei Fischer žiurkių ląstelės. Bandymų pagrindą sudaro ląstelių morfologinių pokyčių, ligos židinio formavimosi bei prisitvirtinimo prie pusiau kieto agaro pokyčių tyrimai. Mažiau naudojamoms sistemoms priklauso tos, kurios naudojamos fiziologiniams bei morfologiniams ląstelių, paveiktų kancerogeninėmis cheminėmis medžiagomis, pokyčiams nustatyti. Nė vieno in vitro bandymų metu nebuvo nustatyta mechanistinio ryšio tarp vėžio ir ląstelių pokyčių. Naudojant kai kurias bandymo sistemas galima nustatyti auglių promotorius. Įvertinant bandomosios medžiagos įtaką ląstelių kultūrų gebėjimui formuoti kolonijas (klonavimo efektyvumas) arba augimo greičiui, galima nustatyti citotoksiškumą. Citotoksiškumo tyrimu nustačius, kad bandomoji medžiaga sukelia toksikologiškai reikšmingus pokyčius, jos negalima naudoti transformacijos dažnio nustatymo bandymuose, nes reikėtų persėti ląsteles ir/ar pratęsti jų inkubaciją.
6. Bandymo metodo aprašymas
6.1. Pasiruošimas
6.1.1. Ląstelės. Atsižvelgiant į transformacijos įvertinimo būdą, galima naudoti įvairiausias ląstelių linijas ar pirmines ląsteles. Tyrėjas privalo užtikrinti, kad bandomąsias ląsteles paveikus žinomais kancerogenais, jose pasireikš atitinkami fenotipiniai pokyčiai. Tyrėjo laboratorijoje naudojamas bandymas turi būti patikimas ir oficialiai pripažintas.
6.1.2. Terpės. Atliekant transformacijos tyrimą reikia naudoti atitinkamą terpę bei parinkti atitinkamas bandymo sąlygas.
6.1.3. Bandomoji medžiaga. Prieš veikiant ląsteles bandomoji medžiaga gali būti paruošiama kultivavimo terpėje arba ištirpinama ar suspenduojama atitinkamame tirpiklyje. Tirpiklio galutinė koncentracija ląstelių kultūrų sistemoje neturėtų įtakoti ląstelių gyvybingumo, augimo greičio ar pasitaikančios transformacijos.
6.2. Bandymo sąlygos
6.2.1. Kontroliniai bandiniai
6.2.1.1. Kiekvieno eksperimento metu reikia naudoti teigiamas kontroles iš tiesiogiai veikiančios medžiagos ir medžiagos, kurią reikia metabolitiškai aktyvuoti (netiesiogiai veikiančios medžiagos); taip pat reikia naudoti tirpiklio kontrolę.
6.2.1.2. Kaip teigiamą kontrolę galima naudoti tiesiogiai veikiančias medžiagas etilmetansulfonatą arba beta propiolaktoną, ir netiesiogiai veikiančias medžiagas 2-acetilaminofluoreną, 4-dimetilaminoazobenzeną arba 7,12-dimetilbenz-antraceną.
6.3. Poveikio koncentracijos. Reikia naudoti kelias bandomosios medžiagos koncentracijas. Koncentracijos parenkamos taip, kad būtų galima nustatyti koncentracijos ir toksiškumo ryšį. Didžiausia koncentracija turėtų sumažinti ląstelių išgyvenimą, o mažiausia sukeltų tokį patį atsaką, kaip tirpiklis (neigiama kontrolė). Reikia nustatyti santykinai netirpių vandenyje medžiagų tirpumo ribą. Gerai vandenyje tirpstančių netoksiškų medžiagų didžiausia tiriamoji koncentracija parenkama atskirai kiekvienu konkrečiu atveju.
7. Darbo eiga. Ląstelės veikiamos atitinkamą laiką, atsižvelgiant į naudojamą bandymo sistemą. Jei veikimo laikas pailginamas, galima pakartotinai veikti ta pačia medžiagos doze, pakeitus terpę (jei būtina, tai į terpę įvedama naujai paruošto metabolinės aktyvacijos mišinio). Ląstelės, nepasižyminčios pakankamu metabolitiniu aktyvumu, turėtų būti veikiamos bandomąja medžiaga esant ar nesant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai. Baigiantis veikimui, nuo ląstelių nuplaunama bandomoji medžiaga ir, nustačius transformaciją bei transformuotą fenotipą, kultivuojamos atitinkamomis sąlygomis. Visi rezultatai patvirtinami atlikus nepriklausomą bandymą.
II. Duomenys
8. Duomenys, atsižvelgiant į taikytą bandymo metodą, pateikiami įvairių formų lentelėse, nurodant, pavyzdžiui, lėkštelių skaičių, lėkštelių su teigiamais rezultatais skaičių ar transformuotų ląstelių skaičių. Kai tinka, nurodomas procentinis išgyvenusių ir kontrolinių ląstelių skaičiaus santykis bei transformacijos dažnis (transformuotų ir visų išgyvenusių ląstelių santykis) procentais.
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
10. Bandymo protokole, jei įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija:
10.2. bandymo sąlygos: bandomosios medžiagos koncentracija, naudotas tirpiklis, inkubacijos laikas, veikimo trukmė ir dažnis, ląstelių populiacijos tankis veikimo metu, panaudotos egzogeninės metabolinės aktyvacijos sistemos tipas, teigiamos ir neigiamos kontrolės, nustatyti ląstelių fenotipo ypatumai, naudota atrankos sistema (jei įmanoma), dozės pasirinkimo kriterijai;
11. Rezultatų įvertinimas ir interpretavimas. Šio metodo rezultatų įvertinimas ir interpretavimas pateiktas Bendrajame įvade.
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B22 metodas: graužikų dominantinio letališkumo bandymas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
4. Bandymo metodų principas
4.1. Dominantinės letalinės pasekmės reiškia embriono arba gemalo žuvimą. Veikiant chemine medžiaga sukeliamos dominantinės letalinės pasekmės rodo, kad bandomoji medžiaga paveikė tiriamosios rūšies gyvūnų embrionų audinius. Manoma, kad dominantinės letalinės pasekmės pasireiškia dėl chromosomų pažeidimų (struktūrinių anomalijų arba chromosomų skaičiaus pokyčių). Jei patelės paveikiamos medžiaga ir dėl to jų embrionai žūna, tai gali būti ir toksinio poveikio pasekmė.
4.2. Bandomųjų gyvūnų patinai paveikiami bandomąja medžiaga, po to poruojami su palikuonių neturėjusiomis patelėmis, kurios nebuvo veiktos bandomąja medžiaga. Poruojant individus paeiliui tam tikrais laiko tarpais, galima atskirai tirti įvairius embrioninės ląstelės vystymosi etapus. Jei, lyginant su kontrolinės grupės patelių negyvų implantų skaičiumi, tokių implantų skaičius padaugėja kiekvienoje paveiktos grupės patelėje, tai rodo, kad implantacija nepavyko. Nepavykusi implantacija gali būti vertinama pagal corpora lutea kiekį arba lyginant absoliutų implantų tiriamos bei kontrolinės grupės patelėse skaičių. Absoliutus dominantinis letališkumas apima nepavykusias ankstyvąsias ir vėlesnes implantacijas. Absoliutaus dominantinio letališkumo įvertinimas paremtas gyvų implantų, esančių tiriamos bei kontrolinės grupės patelėse, skaičiaus palyginimu. Implantų skaičius tam tikrais atvejais gali sumažėti ir dėl dėl spermatocitų ir/ar spermatogonijų žūties.
6. Bandymo metodo aprašymas
6.1. Pasiruošimas. Jei įmanoma, bandomosios medžiagos ištirpinamos ar suspenduojamos izotoniniame druskų tirpale. Vandenyje netirpios cheminės medžiagos turi būti ištirpintos ar suspenduotos panaudojant atitinkamas priemones. Naudojama priemonė neturi iškreipti bandomosios medžiagos veikimo bei toksinių pasekmių pasireiškimo. Bandomieji preparatai naudojami naujai pagaminti.
6.2. Dozavimas. Paprastai bandomoji medžiaga suleidžiama vieną kartą. Turint atitinkamų duomenų, suleidimą galima pakartoti. Dažniausiai bandomoji medžiaga suleidžiama per os, į trachėją arba injekuojama į pilvaplėvės ertmę. Medžiagą galima suleisti ir kitais būdais.
6.3. Eksperimentiniai gyvūnai. Rekomenduojama naudoti žiurkes arba peles. Sveiki lytiškai subrendę gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į bandomąsias ir kontrolines grupes.
6.4. Gyvūnų skaičius ir lytis. Atsižvelgiant į spontaninę naudojamos biologinės rūšies variaciją, reikėtų naudoti pakankamą skaičių patinų, paveiktų bandomąja medžiaga. Skaičius pasirenkamas remiantis iš anksto nustatytu bandymo jautrumu bei gaunamų duomenų patikimumu. Pavyzdžiui, atliekant tipinį bandymą patinų, priklausančių bandomosioms grupėms, kurių kiekvienai duodama skirtinga dozė, turi būti tiek, kad vieno poravimosi periodo metu būtų apvaisinta 30–50 patelių.
6.5. Teigiamos ir neigiamos kontrolės. Atliekant kiekvieną bandymą naudojama teigiama ir neigiama (tirpiklis) kontrolė. Kai turima duomenų apie toje pačioje laboratorijoje neseniai gautus teigiamos kontrolės naudojimo patenkinamus duomenis, šiuos duomenis galima naudoti vietoj teigiamos kontrolės. Siekiant patikrinti bandymo jautrumą, teigiamos kontrolinės medžiagos naudojamos mažomis dozėmis (pavyzdžiui, injekuojant MMS į pilvaplėvės ertmę, jos dozė turi būti 10 mg/kg).
8. Darbo eiga
8.1. Bandomąją medžiagą galima dozuoti įvairiai. Dažniausiai bandomoji medžiaga suleidžiama vieną kartą.
8.2. Pasibaigus veikimui, bandomųjų gyvūnų patinai poruojami su palikuonių neturėjusiomis patelėmis, kurios nebuvo veiktos bandomąja medžiaga. Patelės paliekamos su patinais vienai rujai arba tol, kol susiporuos (tai nustatoma pagal spermos patekimą į makštį arba pagal makšties kamščio susidarymą).
8.3. Pasibaigus veikimui, atliekama tiek poravimų, kiek numatyta bandymo plane. Bandiniai tyrimams paimami atskirais embrioninių ląstelių vystymosi etapais.
II. Duomenys
9. Duomenys pateikiami lentelėse, nurodant patinų ir nėščių bei nenėščių patelių skaičių. Atskirai registruojami kiekvieno suporavimo rezultatai, nurodant kiekvieno patino ir patelės identifikavimo duomenis. Registruojama kiekvienos patelės suporavimo savaitė, patinų gauta dozė, gyvų bei negyvų implantų dažnis.
10. Absoliutus dominantinių letalinių pasekmių skaičius nustatomas lyginant gyvų implantų skaičių bandomosios bei kontrolinės grupės patelėse. Bandomosios grupės patelių gyvų ir negyvų implantų skaičiaus santykis palyginamas su tokiu pačiu kontrolinės grupės patelių implantų skaičiaus santykiu siekiant nustatyti, ar implantacija nepavyko.
11. Jei lentelėse pateikiami ankstyvųjų ir vėlyvųjų žūčių duomenys, tai turi būti aiškiai parodyta. Nustačius, kad ankstyvoji implantacija nepavyko, tai turi būti užregistruota. Ar ankstyvoji implantacija pavyko ar ne, sprendžiama lyginant pagal corpora lutea ir implantų skaičiaus skirtumus arba pagal vidutinio implantų gimdoje skaičiaus sumažėjimą bandomojoje grupėje, lyginant kontrolinės grupės duomenimis.
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
13. Bandymo protokole, jei įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija:
13.1. eksperimentinių gyvūnų rūšis, kamienas, amžius bei kūno masė, bandomųjų ir kontrolinių grupių kiekvienos lyties gyvūnų skaičius;
13.2. bandomoji medžiaga, tirpiklis, dozės ir dozių parinkimo kriterijai, neigiamos ir teigiamos kontrolės, toksiškumo tyrimų duomenys;
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B23 metodas: ŽINDUOLIŲ SPERMATOGONIJŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJų Bandymas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas
1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 483 metodu.
1.1. Žinduolių spermatogonijų chromosomų aberacijų in vivo bandymo tikslas – nustatyti medžiagas, sukeliančias žinduolių spermatogonijų chromosomų struktūrines aberacijas. Struktūrinės aberacijos gali būti dviejų tipų: chromosominės ir chromatidinės. Dauguma mutagenų sukelia chromosomines mutacijas, tačiau pasitaiko ir chromatidinių aberacijų. Šis metodas neskirtas chromosomų skaičiaus pokyčiams įvertinti ir šiam tikslui paprastai nenaudojamas. Chromosomų mutacijos bei su jomis susiję įvykiai sukelia daug žmonių genetinių ligų.
1.2. Bandymu nustatomi vyriškų lytinių ląstelių chromosomų pokyčiai, kuriais remiantis prognozuojamas paveldimų mutacijų atsiradimas gemalinėse ląstelėse.
1.3. Paprastai bandyme naudojami graužikai. Šio citogenetinio in vivo bandymo metu nustatomos chromosominio tipo aberacijos, atsirandančios spermatogonijų mitozinėse chromosomose. Kitos ląstelės šiame bandyme nenaudojamos.
1.4. Chromatidinėms aberacijoms spermatogonijose nustatyti tiriama pirmoji ląstelių mitozė, vykstanti iškart po ląstelių paveikimo bandomąja medžiaga, kad, ląstelėms toliau dalijantis, šie pakitimai nebūtų prarandami. Papildomą informaciją apie bandomąja medžiaga paveiktas spermatogonijų kamienines ląsteles galima gauti analizuojant mejozines chromosomas bei ieškant chromosominių aberacijų ląstelių, paveiktų bandomąja medžiaga ir esančių I diakinezės metafazės stadijoje, kai šios tampa spermatocitais, chromosomose.
1.5. In vivo sąlygomis atliekamu bandymu siekiama nustatyti, ar somatinių ląstelių mutacijas sukeliantys mutagenai gali jas sukelti ir gemalinėse ląstelėse. Be to, spermatogonijų tyrimas yra svarbus, įvertinant mutagenų padarytą žalą, pagal kurią sprendžiama apie faktorių, reguliuojančių metabolizmą, farmakokinetiką bei DNR pažaidų atstatymo procesus, reikšmę.
1.6. Sėklidėse yra daug skirtingoms generacijoms priklausančių spermatogonijų, kurios skiriasi pagal jautrumą cheminių medžiagų poveikiui. Todėl identifikuotos aberacijos parodo spermatogonijų populiacijų, kurių pagrindinę dalį sudaro daug diferencijuotų spermatogonijų, paveiktų bandomąja medžiaga, bendrąjį atsaką. Priklausomai nuo jų lokalizacijos sėklidėse skirtingų generacijų spermatogonijos gali arba patekti, arba nepatekti į bendrąją cirkuliaciją dėl fizinio ir fiziologinio (Sertoli ląstelių bei kraujo ir sėklidžių) barjero.
1.7. Jeigu nustatoma, kad bandomoji medžiaga arba reaktyvus jos metabolitas nepasiekia audinio taikinio, tai šiame bandyme ji nebenaudojama. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
2. Apibrėžimai.
2.1. Chromatidinė aberacija – chromosomos struktūros pakitimas, sukuriant trūkį seserinėse chromatidėse ar tarp jų ir neleidžiant joms pakartotinai susijungti.
2.2. Chromosominė aberacija – chromosomos struktūros pakitimas sukuriant arba trūkį, arba trūkį ir susijungimą toje pačioje vietoje abiejose seserinėse chromatidėse.
2.3. Plyšys – achromatinė spraga, kurios plotis mažesnis už vienos chromatidės plotį, su minimaliu chromatidėje esančių klaidingai suporuotų bazių skaičiumi.
2.5. Poliploidiškumas – haploidinio chromosomų skaičiaus (skirtingai nei haploidinio skaičiaus 3n, 4n …) didėjimas.
3. Bandymo metodo principas. Gyvūnai veikiami bandomąja chemine medžiaga pagal atitinkamą metodiką ir atitinkamais laiko tarpais po veikimo numarinami. Prieš numarinimą gyvūnai paveikiami medžiaga, sustabdančia ląstelių dalijimąsi metafazėje (pavyzdžiui, kolchicinu arba Kolcemidu©). Iš gemalinių ląstelių išskiriamos chromosomos, jos dažomos, metafazėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu siekiant nustatyti chromosomų aberacijas.
4. Bandymo metodo aprašymas.
4.1. Gyvūnų rūšies parinkimas. Paprastai naudojami kiniško žiurkėno ir pelių patinėliai. Gali būti naudojami ir kitų žinduolių rūšių patinai. Reikia naudoti visuotinai naudojamus jaunų sveikų subrendusių gyvūnų kamienus. Bandymo pradžioje gyvūnų kūno masių variacija turi būti minimali ir neviršyti ±20 % vidutinės masės.
4.2. Laikymo ir šėrimo sąlygos. Taikomos Bendrajame įvade nurodytos sąlygos, išskyrus oro drėgnumą, kuris turi būti 50–60 %.
4.3. Gyvūnų paruošimas. Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę bei bandomąją (kurios gyvūnai bus paveikti bandomąja medžiaga) grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų sumažinta aplinkos įtaka dėl narvų padėties). Kiekvienas gyvūnas individualiai paženklinamas. Prieš bandymą gyvūnai aklimatizuojami laboratorinėse sąlygose mažiausiai 5 dienas.
4.4. Dozių paruošimas. Kietosios bandomosios medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinamuosiuose įrenginiuose ir, jei reikia, praskiedžiamos. Skystųjų bandomųjų medžiagų dozės ruošiamos iškart, jos praskiedžiamos prieš įvedimą gyvūnams. Bandomieji preparatai naudojami naujai pagaminti, išskyrus atvejus, kai tyrimais įrodytas jų stabilumas.
5. Bandymo sąlygos
5.1. Tirpiklis ir tirpinantysis įrengimas. Tirpiklis ar tirpinantysis įrengimas naudojamomis dozėmis neturi sukelti jokio toksinio poveikio ir neturi chemiškai reaguoti su bandomąja medžiaga. Jeigu naudojami kiti, nežinomi tirpikliai ar tirpinantieji įrengimai, tai prieš naudojant reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrengimą.
5.2. Kontroliniai bandiniai
5.2.1. Kiekvieno bandymo metu turi būti tiriami iš kiekvienai lyčiai priklausančių gyvūnų paimti vienu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis ar tirpinantysis įrengimas) kontroliniai bandiniai. Kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir gyvūnai, paveikti bandomąja medžiaga (bandomoji grupė).
5.2.2. Spermatogonijų, paveiktų tokia pačia bandomosios medžiagos doze in vivo, teigiamuose kontroliniuose mėginiuose turi būti nustatomos struktūrinės aberacijos, kurios užgožtų lengvai nustatomą pašalinį foną.
5.2.3. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunami poveikiai būtų ryškūs, bet kad tyrėjas ne iškart atpažintų užkoduotas skaidres. Teigiamos kontrolinės medžiagos gali būti įvedamos gyvūnams kitaip nei bandomoji medžiaga bei kontroliniai bandiniai būtų paimami tik vieną kartą. Jeigu įmanoma, galima svarstyti apie konkrečiai klasei priklausančių medžiagų, kaip teigiamų kontrolinių bandinių, naudojimą. Teigiamų kontrolinių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje:
1 lentelė. Teigiamos kontrolinės medžiagos
Medžiagos pavadinimas CAS Nr. Einecs Nr.
Ciklofosfamidas 50-18-0 200-015-4
Ciklofosfamido monohidratas 6055-19-2 -
Cikloheksilaminas 108-91-8 203-629-0
Mitomicinas C 50-07-7 200-008-6
Monomerinis akrilamidas 79-06-1 201-173-7
Trietilenmelaminas 51-18-3 200-083-5
5.2.4. Neigiami kontroliniai bandiniai, paveikti tirpikliu ar tirpinamuoju įrenginiu, turi būti paimami kiekvieną kartą, išskyrus atvejus, kai anksčiau atliktų bandymų metu gauti kontroliniai duomenys rodo, kad gyvūnų ir ląstelių su chromosomų aberacijomis kintamumas yra priimtinas. Jei neigiami kontroliniai bandiniai paimami tik vieną kartą, tai pirmojo paėmimo laikas yra pats tinkamiausias. Papildomai reikia naudoti bandomąja medžiaga neveiktus kontrolinius bandinius, išskyrus atvejus, kai istoriniai duomenys rodo, kad pasirinktas tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys nesukėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio.
6. Darbo eiga.
6.1. Gyvūnų skaičius. Kiekvienoje bandomojoje ir kontrolinėje grupėje turi būti mažiausiai 5 patinai.
6.2. Dozavimas
6.2.1. Bandomąja medžiaga veikiama vieną arba du kartus. Galima taikyti išskaidytą dozę, kai tą pačią dieną du kartus su kelių valandų pertrauka paveikiama bandomąja medžiaga. Tai gali būti reikalinga norint įvesti pakankamai didelį bandomosios medžiagos tūrį. Taikant kitokį dozavimą, tai turi būti moksliškai pagrįsta.
6.2.2. Kai gyvūnų grupei įvedama didžiausia dozė, tai, pasibaigus veikimui, bandiniai paimami 2 kartus. Kadangi bandomoji medžiaga gali turėti įtakos ląstelės ciklo kinetikai, tai, pasibaigus veikimui, bandiniai paimami labai anksti bei labai vėlai 24–48 valandų laikotarpiu. Kai tiriamos kitos dozės, tai, pasibaigus veikimui, bandiniai paimami 24 valandų (arba 1,5 ląstelės ciklo trukmės) laikotarpiu, nebent yra žinomas kitas tinkamesnis bandinių paėmimo laikas.
6.2.3. Bandinius galima paimti ir kitu metu, pavyzdžiui, tiriant chemines medžiagas, sukeliančias chromosomų trūkius arba galinčias turėti įtakos nuo S nepriklausantiems poveikiams.
6.2.4. Pakartotinio dozių įvedimo tinkamumas turi būti pagrindžiamas kiekvienu atveju. Gyvūnai numarinami 24 valandų laikotarpiu (1,5 ląstelės ciklo trukmės) po paskutinio veikimo. Jeigu reikia, tai bandiniai papildomai paimami ir kitu metu.
6.3. Dozės dydis
6.3.1. Jeigu bandymas atliekamas siekiant surasti dozių intervalą (neturint duomenų apie jį), tai jis turi būti atliekamas toje pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei taikant tokį patį dozavimą, koks buvo naudojamas pagrindinio bandymo metu. Jeigu nustatomas toksiškumas, tai pirmąkart imant bandinius naudojamos trys skirtingos dozės. Šios dozės turi apimti visą intervalą, pradedant nuo didžiausią toksiškumą sukeliančios ir baigiant mažiausią toksiškumą sukeliančia arba tokia doze, kuri visiškai netoksiška. Vėliau imant bandinius naudojama tik pati didžiausia dozė. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant išryškėja toksiškumo, priklausomo nuo dozės požymiai, pasirodantys, kai naudojant tokį patį dozavimą suleidžiama didžiausia dozė ir spėjama, kad ji bus mirtina.
6.3.2. Cheminėms medžiagos, kurių mažos ir netoksiškos dozės pasižymi specifiniu biologiniu aktyvumu (pavyzdžiui, hormonai ir mitogenai), taikomos dozavimo kriterijų išimtys, jų dozavimas nustatomas atskirai kiekvienu atveju. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant spermatogonijose pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (pavyzdžiui, I ir II mejozinės metafazės metu spermatogonijų mitozių santykis sumažėja; šis sumažėjimas neviršija 50 %).
6.4. Ribinis bandymas. Jeigu bandymas atliekamas taikant vieną dozę, kuri, įvedus vienu ar dviem kartais per vieną dieną, yra ne mažesnė kaip 2000 mg/kg ir nesukelia toksiškumo bei, atsižvelgiant į struktūriškai panašių medžiagų tyrimų duomenis, nesitikima jos genotoksinio poveikio, tai tikslinga atlikti pagrindinį bandymą taikant tris dozes. Atsižvelgiant į galimą bandomosios medžiagos poveikį žmonėms gali reikėti taikyti didesnę dozę.
6.5. Dozių įvedimas. Bandomoji medžiaga paprastai suleidžiama į skrandį zondu arba į pilvaplėvės ertmę švirkštu. Galima įvesti ir kitais būdais, moksliškai juos pagrindus. Didžiausias į skrandį ar pilvaplėvės ertmę suleidžiamo skysčio tūris priklauso nuo eksperimentinio gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 g kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių suleidimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus dirginančias ir ardančias medžiagas, kurių didesnės koncentracijos sukelia žalingas pasekmes, bandomosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad įvedant visas dozes įvedamos medžiagos tūris būtų vienodas.
6.6. Chromosomų paruošimas. Kai tik gyvūnai numarinami, vieno ar abiejų sėklidžių ląstelių suspensijos pamerkiamos į hipotoninį tirpalą ir fiksuojamos. Vėliau ląstelės išsklaidomos ant tepinėlių ir nudažomos.
6.7. Analizė. Analizuojama mažiausiai 100 vieno gyvūno ląstelių (mažiausiai 500 vienos gyvūnų grupės metafazių). Šis skaičius gali būti sumažinamas, jei stebima daug chromosomų aberacijų. Šis skaičius gali būti sumažinamas, jei stebima daug chromosomų aberacijų. Visos skaidrės (įskaitant teigiamų ir neigiamų kontrolinių bandinių skaidres) turi būti užkoduojamos nepriklausomai viena nuo kitos tolesniam mikroskopiniam tyrimui. Ruošiant skaidres dažnai suardomos metafazėje esančios ląstelės bei prarandamos chromosomos, todėl vėliau suskaičiuotos ląstelės turi turėti 2n ± 2 centromerų.
II. Duomenys
6. Duomenų apdorojimas
6.1. Kiekvieno gyvūno tyrimų rezultatai turi būti pateikiami lentelėse. Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Reikia nustatyti kiekvieno gyvūno ląstelių, chromosomų aberacijų vienoje ląstelėje skaičių bei ląstelių, turinčių chromosomas su struktūrinėmis aberacijomis, skaičių procentais. Reikia išvardyti skirtingus chromosomų struktūrinių aberacijų tipus, nurodant jų skaičių bei pasireiškimo dažnį gyvūnų, paveiktų ir nepaveiktų bandomąja medžiaga, grupėse. Atskirai registruojami plyšiai, tačiau į juos neatsižvelgiama, nustatant absoliutų aberacijų dažnį.
6.2. Jei stebima tiek mitozė, tiek ir mejozė, tai turi būti nustatytas spermatogonijų mitozių I ir II mejozinės metafazės metu santykis, naudojamas kaip citotoksiškumo matas. Paimamas bandinys (100 vieno gyvūno ląstelių) iš visų bandomųjų bei neigiamų kontrolinių gyvūnų galimam citotoksiniam poveikiui nustatyti. Jeigu stebima tik mitozė, tai imant mažiausiai 1000 kiekvieno gyvūno ląstelių nustatomas jų mitozės indeksas.
7. Duomenų įvertinimas ir interpretacija
7.1. Egzistuoja keli kriterijai, tokie kaip nuo koncentracijos priklausomas chromosomines aberacijas turinčių ląstelių skaičiaus padidėjimas, arba akivaizdus ląstelių, turinčių aberacijas ir priklausančių pavienės dozės grupei pagal vienkartinį bandinio paėmimo laiką, skaičiaus padidėjimas. Pirmiausia reikia aptarti gautų rezultatų biologinę reikšmę. Vertinant bandymo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis kriterijus, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas. Abejotini rezultatai turėtų būti išsiaiškinti toliau tęsiant tyrimą ir pirmiausia pakeičiant bandymo sąlygas.
7.2. Jei gauti rezultatai neatitinka šio metodo 7.1 punkte nurodytų kriterijų, tai bandomoji medžiaga pagal šio metodo sąlygas laikoma nemutageniška.
7.3. Po daug bandymų gavus aiškius teigiamus ir aiškius neigiamus rezultatus, dažniausiai galima padaryti išvadą apie bandomosios medžiagos savybes remiantis gautų duomenų visuma. Net ir daug kartų pakartojus konkretų bandymą, jo rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs.
7.4. Šiuo metodu gauti teigiami rezultatai rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia chromosomų aberacijas tirtos gyvūnų rūšies spermatogonijose. Neigiami rezultatai rodo, kad šiame metode aprašytomis bandymo sąlygomis bandomoji medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų tirtos gyvūnų rūšies spermatogonijose. Reikia aptarti bandomosios medžiagos ar jos metabolitų galimybę patekti į specifinį audinį.
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
8. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija:
8.1. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys
8.2. Eksperimentiniai gyvūnai
8.3. Bandymo sąlygos
8.3.7. bandomosios medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (md) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg per dieną), jei tai įmanoma;
8.4. Rezultatai
8.4.11. anksčiau gauti neigiami kontroliniai duomenys, kartu pateikiant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nuokrypius;
IV. NUORODOS
10. Adler I. D. (1986), Cheminių mutagenų klastogeninis potencialas pelių spermatogonijoms, susijęs su ląstelinio ciklo specifika (Aplinkos chemikalų genetinė toksikologija. B dalis. Genetinis poveikis ir taikomoji mutagenetika, red. Ramel C., Lambert B., Magnusson J., Liss, Niujorkas, 477–484).
11. Adler I. D. (1984), Žinduolių citogenetinia tyrimai (Mutageniškumo tyrimas. Praktinis požiūris, red. Venitt S., Parry J. M., IRL Press, Oksfordas, Vašingtono apygarda, 275–306).
12. Evans E. P., Breckon G., Ford C. E. (1964), Žinduolių sėklidžių mejotinių preparatų paruošimas džiovinimo ore metodu, Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289–294.
13. Richold M., Chandley A., Ashby J., Gatehouse D. G., Bootman J., Henderson L. (1990), Citogenetiniai įvertinimai in vivo (red. Kirkland D. J., Pagrindiniai mutageniškumo bandymai. UKEMS rekomenduojamos procedūros. UKEMS mutageniškumo tyrimų vadovo pakomitetis. Ataskaita, I dalis, Cambridge University Press, Kembridžas, Niujorkas, Portčesteris, Melburnas, Sidnėjus, 115–141).
14. Yamamoto K., Kikuchi Y. (1978), Naujas metodas žinduolių spermatogonijų chromosomoms paruošti, Mutation Res., 52, 207–209.
15. Adler I. D., Shelby M. D., Bootman J., Favor J., Generoso W., Pacchierotti F., Shibuya T., Tanaka N. (1994), Genotoksiškumo bandymų procedūrų standartizavimo tarptautinis seminaras. Žinduolių lytinių ląstelių bandymų darbo grupės ataskaitos santrauka, Mutation Res., 312, 313–318.
16. Fielder R. J., Allen J. A., Boobis A. R., Botham P. A., Doe J., Esdaile D. J., Gatehouse D. G., Hodson-Walker G., Morton D. B., Kirkland D. J., Richold M. (1992), Britanijos toksikologijos draugijos ir Jungtinės Karalystės aplinkos mutagenų draugijos darbo grupės ataskaita. In vivo mutageniškumo bandymų dozių parinkimas, Mutagenesis, 7, 313–319.
17. Lovell D. P., Anderson D., Albanese R., Amphlett G. E., Clare G., Ferguson R., Richold M., Papworth D. G., Savage J. R. K. (1989), In vivo citogenetinių įvertinimų statistinė analizė (UKEMS mutageniškumo tyrimų vadovo pakomitetis. Ataskaita, III dalis. Mutageniškumo tyrimų duomenų statistinis įvertinimas, red. Kirkland D. J., Cambridge University Press, Kembridžas, 184–232.
______________
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B24 metodas: pelių taškinis bandymas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
4. Bandymo metodo principas. Besivystantys pelių embrionai veikiami cheminėmis medžiagomis. Šios medžiagos veikia besivystančių embrionų ląsteles – melanoblastus, kuriuose lokalizuoti genai, kontroliuojantys kailio plaukų spalvą. Besivystantys embrionai yra heterozigotiški pagal daugelį genų, apsprendžiančių kailio plaukų spalvą. Įvykus mutacijai melanoblasto geno dominantiniame alelyje arba šį alelį praradus, iš melanoblasto atsirandančios ląstelės įgyja recesyvų fenotipą, dėl to pelių palikuonių kailyje atsiranda skirtingos spalvos taškai. Nustatomas palikuonių, turinčių tokius taškus, skaičius (mutacijų dažnis) ir palyginamas su palikuonių, veiktų tik tirpikliu, atitinkamais dydžiais. Šiuo bandymu nustatomos spėjamos gemalinių ląstelių somatinės mutacijos.
6. Bandymo metodo aprašymas
6.1. Pasiruošimas
6.1.1. Jei įmanoma, bandomosios medžiagos ištirpinamos ar suspenduojamos izotoniniame druskų tirpale. Vandenyje netirpios cheminės medžiagos turi būti ištirpintos ar suspenduotos panaudojus atitinkamas priemones. Naudojama priemonė būti netoksiška ir neiškreipti bandomosios medžiagos poveikio. Preparatai naudojami naujai pagaminti.
6.1.2. Bandomieji gyvūnai. T kamieno (nonagouti, a/a, šinšilės, violetinės akys, cchp/cchp; rudos, b/b; atmieštos spalvos, trumpų ausų, d se/d se; margas taškuotumas, s/s) pelės poruojamos arba su HT kamieno (blyškios, nonagouti, trumpų kojų, pa a bp/pa a bp; labai tankaus kailio ln fz/ln fz; perlų spalvos pe/pe), arba su C57 BL (nonagouti, a/a) pelėmis. Galima poruoti kamienų NMRI (nonagouti, a/a; albinosai, c/c) ir DBA (nonagouti, a/a; rudos, b/b, atmieštos spalvos d/d) peles, kad jų palikuonys turėtų „nonagouti“ tipo mutaciją.
6.1.3. Gyvūnų skaičius ir lytis. Pakankamas skaičius apvaisintų patelių veikiamas kiekviena bandomosios medžiagos doze, kad kiekvienu atveju jos atsivestų pakankamai palikuonių. Bandinio dydis nustatomas atsižvelgiant į pelių, paveiktų bandomąja medžiaga, kailio taškuotumą bei kontrolinius duomenis. Neigiamas rezultatas laikomas priimtinu, jei buvo įvertinta mažiausiai 300 palikuonių, kuriuos atsivedė bandomąja medžiaga paveiktos patelės.
6.1.4. Kontroliniai bandiniai. Kontroliniai duomenys gaunami tuo pačiu metu ištyrus peles, paveiktas tik tirpinimui naudojama priemone (neigiamomis kontrolėmis). Anksčiau toje pačioje laboratorijoje atliktų bandymų kontroliniai duomenys irgi gali būti naudojami siekiant užtikrinti duomenų vientisumą ir padidinti bandymo jautrumą. Jei nustatyta, kad bandomoji medžiaga nemutageniška, tai toje pačioje laboratorijoje turi būti atliekamas bandymas su mutageniška medžiaga ir gaunamas teigiamas atsakas.
6.1.5. Dozavimas. Bandomoji medžiaga paprastai suleidžiama į skrandį zondu arba į pilvaplėvės ertmę švirkštu. Kai reikia, bandomoji medžiaga gali būti įvedama kitais būdais.
7. Darbo eiga. Poveikis bandomąja medžiaga paprastai atliekamas 8, 9 ar 10 nėštumo dieną (pirmąja diena laikoma ta diena, kai makšties kamštis buvo pastebėtas pirmą kartą). Šios dienos atitinka 7,25, 8,25 ir 9,25 dienas po apvaisinimo. Tomis dienomis galima sėkmingai atlikti veikimą bandomąja medžiaga.
8. Analizė
8.1. Palikuonys užkoduojami ir, praėjus 3–4 savaitėms po gimimo, įvertinami atsižvelgiant į taškus. Skiriamos trys taškų klasės:
8.1.1. baltos spalvos 5 mm skersmens taškai, išsidėstę pilvo dalyje ir tikriausiai atsiradę dėl ląstelių žūties (BVPT);
8.1.2. geltonos spalvos, panašūs į nonagouti taškai krūties, lytinių liaukų, viršugalvio ašinėje ir kirkšninėje srityse, kurie, kaip manoma, atsirado dėl sutrikusios ląstelių diferenciacijos (SDT);
8.2. Taškų klasės, išskyrus paskutiniąją, įvertinamos pagal genetinę reikšmę. Ar taškai atsirado dėl sutrikusios ląstelių diferenciacijos, ar dėl somatinių mutacijų, nustatoma atlikus kailio bandinių fluorescencinę analizę.
II. Duomenys
9. Pateikiant duomenis, reikia nurodyti ištirtų palikuonių bei palikuonių, turinčių vieną ar daugiau spėjamų somatinių mutacijų, skaičių.
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
12. Bandymo protokole, jei įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija:
12.9. absoliutus įvertintų palikuonių skaičius, bandomojoje ir kontrolinėje grupėse esančių BVPT, SMT ir SPT skaičius;
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B25 metodas: pelių paveldimos translokacijos bandymas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
4. Bandymo metodo principas. Tiriant paveldimą translokaciją pelėse, nustatomi žinduolių embrioninių ląstelių chromosomų struktūriniai bei skaičiaus pokyčiai, kurie išnyksta pirmos kartos palikuonyse. Tiriant palikuonių pateles nustatomos atvirkštinės translokacijos ir X chromosomos praradimas. Gyvūnų, turinčių translokacijas bei X0-patelių vaisingumas yra sumažėjęs ir pagal tai atrenkami F1 palikuonys, kurie naudojami citogenetinei analizei. Esant konkrečioms translokacijoms (X-autosoma ir c-t tipas) nustatomas visiškas sterilumas. Atliekant citogenetinę analizę, translokacijos nustatomos arba F1 patinuose, arba F1 patelių vyriškos lyties palikuonių ląstelėse, besidalijančiose mejozės būdu, ląstelėms esant diakinezės-I metafazės stadijoje. Atliekant citogenetinę analizę, X0 patelės nustatomos tik pagal kaulų čiulpų ląsteles, besidalijančias mitozės būdu ir turinčias tik 39 chromosomas.
6. Bandymo metodo aprašymas
6.1. Pasiruošimas
6.1.1. Bandomosios medžiagos ištirpinamos izotoniniame druskų tirpale. Vandenyje netirpios cheminės medžiagos turi būti ištirpintos ar suspenduotos panaudojus atitinkamas priemones. Naudojama priemonė būti netoksiška ir neiškreipti bandomosios medžiagos poveikio. Preparatai naudojami naujai pagaminti.
6.1.2. Dozavimas. Bandomoji medžiaga paprastai suleidžiama į skrandį zondu arba į pilvaplėvės ertmę švirkštu. Kai reikia, bandomoji medžiaga gali būti įvedama kitais būdais.
6.1.2. Bandomieji gyvūnai. Tam, kad palengvėtų kryžminimas bei citologinis patvirtinimas, bandymas atliekamas su pelėmis. Specifinis pelių kamienas nėra būtinas. Vienam kamienui priklausančių gyvūnų vadoje vidutiniškai bei pastoviai turėtų būti daugiau nei aštuoni palikuonys. Naudojami sveiki lytiškai subrendę gyvūnai.
6.1.3. Gyvūnų skaičius ir lytis
6.1.3.1. Reikiamas gyvūnų skaičius priklauso nuo spontaninės translokacijos dažnio bei mažiausio translokacijos sukėlimo greičio, kuris būtinas teigiamam rezultatui gauti.
6.1.4. Kontroliniai bandiniai. Remiamasi atitinkamais kontroliniais duomenimis, gautais atliekant tyrimą, ir vienu metu naudojant kontroles bei anksčiau atliktų tyrimų metu naudotas kontroles. Kai žinomi toje pačioje laboratorijoje ką tik atliktų bandymų, naudojant teigiamas kontroles, gauti patenkinami rezultatai, tai šiuos rezultatus galima naudoti vietoj teigiamos kontrolės.
6.1.5. Dozės dydis. Paprastai naudojama viena dozė. Ji turi būti pati didžiausia dozė, kuri sukelia silpno apnuodijimo požymius, bet neįtakojanti išgyvenimo ir elgesio dauginimosi metu. Siekiant nustatyti dozės ir atsako sąsają, reikėtų panaudoti dvi nedideles papildomas dozes. Netoksiškų medžiagų įvedama pati didžiausia praktiškai įmanoma dozė.
7. Darbo eiga
7.1. Veikti bandomąja medžiaga galima dvejopai. Dažniausiai bandomoji medžiaga įvedama vieną kartą. Medžiagą galima įvesti per 35 dienas, septynias dienas per savaitę. Pasibaigus veikimui, pagal planą atliekami poravimai, užtikrinant visų brendimo stadijų paveiktų embrioninių ląstelių bandinių paėmimą. Baigiantis poravimui, patinai ir patelės patalpinami į atskirus narvelius. Kai patelės atsiveda jauniklius, registruojama palikuonių atsivedimo data, vados dydis bei palikuonių lytis. Visi vyriškos lyties palikuonys atjunkomi, o visi moteriškos lyties palikuonys pašalinami nepaisant to, kad jie naudojami bandymo metu.
7.2. Translokacijos heterozigotiškumo tyrimas
7.2.1. Translokacijos heterozigotiškumą galima tirti dviem metodais:
7.2.1.1. tirti F1 palikuonių vaisingumą ir citogenetinės analizės būdu identifikuoti gyvūnus, kurie gali turėti translokacijas,
7.2.2. Vaisingumo tyrimas
7.2.2.1. Sumažėjęs F1 gyvūno vaisingumas gali būti nustatomas, stebint vados gausą ir/ar analizuojant patelių, kurios buvo naudojamos poravimui, gimdos turinį. Kriterijai, pagal kuriuos sprendžiama apie normalų ir sumažėjusį vaisingumą, pasirenkami atsižvelgiant į naudojamą pelių kamieną.
7.2.2.2. Vados dydžio stebėjimas. Tiriami F1 patinai laikomi atskirai arba nuo tame pačiame eksperimente naudojamų, arba nuo visos pelių kolonijos patelių. Narvai stebimi kasdien, pradedant nuo 18 dienos, praėjusios po suporavimo. Patelėms atsivedus F2 palikuonis, užregistruojamas vados dydis bei palikuonių, kurie po to pašalinami, lytis. Jei tiriami moteriškos lyties F1 palikuonys, tai mažos F2 vados bus tiriamos vėliau. Translokacijas turinčios patelės identifikuojamos, atliekant translokacijos citogenetinę analizę, naudojant bet kurį jų vyriškos lyties palikuonį. X0 patelės identifikuojamos pagal lyčių santykio jų palikuonių tarpę pokyčius – 1:1 (patinai/patelės), 1:2 (patinai/patelės). Jei F2 vados dydis pasiekia arba peržengia iš anksto nustatytą normalią ribą, normalūs F1 gyvūnai toliau nebetiriami, priešingu atveju stebimos antroji bei trečioji F2 vados.
7.2.2.3. F1 gyvūnų, kurių negalima laikyti normaliais, baigus net trijų F2 vadų stebėjimus, atveju reikia arba tirti patelių, kurios buvo poruojamos su patinais, gimdos turinį, arba iškart pradėti gyvūnų citogenetinę analizę.
7.2.2.4. Gimdos turinio analizė. Translokacijas turinčių gyvūnų vados dydis sumažėja dėl embrionų žūties, todėl daug žuvusių implantų parodo, kad bandomieji gyvūnai turi translokacijas. Kiekvienas toliau tiriamas F1 patinas suporuojamas su dviem-trimis patelėmis. Apvaisinimas nustatomas, kiekvienos dienos rytą ieškant makšties kamščio. Praėjus 14–16 dienų po apvaisinimo patelės numarinamos, užregistruojami esantys gimdoje gyvi bei žuvę implantai.
7.2.3. Citogenetinė analizė
7.2.3.1. Sėklidės paruošiamos, išdžiovinant jas ore. Gyvūnai, turintys translokacijas, identifikuojami pagal pirminių spermatocitų, esančių mejozės diakinezės-I metafazės stadijoje, multivalentinių chromosomų konfigūracijas. Nustačius šiuos multivalentinius darinius mažiausiai dviejose ląstelėse, galima teigti, kad tirtas gyvūnas turi translokacijas.
7.2.3.2. Jei nebuvo vykdoma atranka pagal kryžminimus, tai visi F1 patinai tiriami citogenetiškai. Reikia mikroskopiškai ištirti mažiausiai 25 vieno patino ląsteles, esančias diakinezės-I metafazės stadijoje. Jei įtariama, kad F1 patinuose, turinčiuose menkas sėklides bei F1 X0 patelėse mejozė nutraukiama prieš prasidedant diakinezei, tai reikia ištirti šių patinų spermatogonijų arba kaulų čiulpų ląstelių bei patelių kaulų čiulpų ląstelių mitozines metafazines chromosomas. Mažiausiai dešimtyje ištirtų ląstelių nustatytos neįprastai ilgos ar trumpos chromosomos parodo, kad vienas ar kitas patinas yra sterilus pagal chromosomų translokacijas (c-t tipas). Kai kurios X autosomų translokacijos, apsprendžiančios patinų sterilumą, gali būti nustatomos tiktai atliekant mitozinių chromosomų juostų elektroforezinę analizę. Jei tirtos patelės atveju bent 10 mitozės atvejų užregistruojamos 39 chromosomos, tai tokia patelė laikoma X0.
II. Duomenys
9. Atliekant kiekvieną poravimą registruojamas vidutinis vados dydis bei lyčių santykis, pradedant nuo tėvų poravimo ir baigiant palikuonių atsivedimu bei jų atjunkymu.
10. Įvertinant F1 gyvūnų vaisingumą, pateikiamas vidutinis vados dydis normalių poravimų atveju bei atskirų F1 gyvūnų, turinčių translokacijas, vadų dydžiai. Tiriant gimdos turinį, pateikiamas vidutinis gyvų bei žuvusių implantų skaičius normalių poravimu atveju ir atskirų F1 gyvūnų, turinčių translokacijas, gyvų bei žuvusių implantų skaičius kiekvieno poravimo atveju.
11. Atliekant ląstelių, esančių diakinezės-I metafazės stadijoje, citogenetinę analizę, nurodomas multivalentinių chromosomų konfigūracijų tipų kiekis bei absoliutus ląstelių, naudotų tiriant kiekvieną translokacijas turintį gyvūną, absoliutus skaičius.
12. Tiriant sterilius F1 gyvūnus, pateikiamas absoliutus poravimų skaičius bei poravimo periodo trukmė. Nurodomos sėklidžių masės bei citogenetinės analizės duomenys.
13. Tiriant X0 pateles, nurodomas vidutinis vados dydis, F2 palikuonių lyčių santykis bei citogenetinės analizės duomenys.
14. Jei numanomi F1 gyvūnai, turintys translokacijas, tiriami vaisingumo požiūriu atrenkant juos iš anksto, tai pateikiamos lentelės, kuriose nurodoma, kiek iš tų F1 gyvūnų yra heterozigotų pagal translokacijas.
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
16. Bandymo protokole, jei įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija:
16.4. kiekvienos patelės atsivestų palikuonių skaičius bei lytis, palikuonių, užaugintų translokacijos tyrimams, skaičius bei lytis;
16.6. gyvūnų, turinčių translokacijas, detalus apibūdinimas bei skaičius, įskaitant kryžminimo duomenis bei gimdos turinio analizės rezultatus (jei reikia);
16.7. citogenetinės procedūros ir mikroskopinės analizės apibūdinimas pateikiant atitinkamas schemas;
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507
B39 metodas: ŽINDUOLIŲ kepenų ląstelių netaisyklingos dnr sintezės In vivo bandymas
I. BENDROSIOS NUOSTATOS
1. Įvadas
1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 486 metodu.
1.2. Žinduolių kepenų ląstelių netaisyklingos DNR sintezės (NDS) in vivo bandymas naudojamas nustatyti DNR pažaidų reparaciją, kurias bandomoji cheminė medžiaga sukelia žinduolių kepenų ląstelėse.
1.3. Šiuo metodu galima ištirti kepenyse esančių cheminių medžiagų genotoksinius poveikius. Rezultatas parodo, kad iš pradžių kepenų ląstelėse atsiranda DNR pažaidos, o vėliau vyksta jų reparacija. Rezorbuotų medžiagų metabolizmo pagrindinė vieta yra kepenys, todėl kepenys yra tinkamas DNR pažaidų tyrimo in vivo objektas.
1.4. Jeigu bandomoji medžiaga nepasiekia audinio, į kurį buvo nukreipta, tai ji netinkama šiam bandymui.
1.5. NDS produktai analizuojami, įvertinant žymėtų nukleozidų transportą į ląsteles, kuriose nevyksta taisyklinga DNR sintezė (paprastai vykstanti ląstelės ciklo S fazės metu). Plačiausiai naudojamas būdas yra tričiu (3H) žymėto timidino autoradiografija. Atliekant NDS in vivo bandymus paprastai naudojamos žiurkių kepenys. Galima naudoti ir kitus audinius, tačiau jie nėra šio tyrimo objektas.
1.6. NDS nustatymas priklauso nuo pažaidos vietoje iškirptų DNR bazių, pakeistų kitomis, skaičiaus. Todėl NDS tyrimas ypač vertingas tada, kai siekiama identifikuoti ilgų fragmentų pažaidų (fragmentų ilgis siekia nuo 20 iki 30 bazių), reparacijas dėl bandomosios medžiagos poveikio. Trumpų fragmentų pažaidos nustatomos žymiai mažesniu tikslumu. Be to, mutageniniai įvykiai pasireiškia dėl nevykstančios pažaidų reparacijos, klaidingai vykstančios reparacijos ar klaidingos DNR replikacijos. NDS aktyvumas neparodo pažaidų reparacijos efektyvumo. Visai įmanoma, kad mutagenas sąveikauja su DNR, tačiau pažaidos reparacija iškirpos atstatymo būdu nevyksta. NDS bandymu negaunant specifinės informacijos apie mutageninį aktyvumą, šį trūkumą kompensuoja didelis metodo jautrumas, nes tiriamas visas genomas. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
2. Apibrėžimai
2.1. Ląstelės, kuriose vyksta reparacija – ląstelės, kurių branduolinio tinklo granulių (BTG) vertė didesnė negu pradinė ir tai patvirtinta atlikus šį bandymą;
2.2. Branduolinio tinklo granulės (BTG) – kiekybinis NDS aktyvumo ląstelėse, atliekant bandymą autoradiografijos metodu, įvertinimo matas, išreiškiamas iš branduolinio tinklo granulių (BG) skaičiaus atimant vidutinį citoplazminių granulių, esančių nukleoplazminiuose ploteliuose, skaičių (CG): BTG = BG – CG. BGT nustatomas kiekvienoje ląstelėje, tada apskaičiuojama kultūroje ar lygiagrečiose kultūrose esančių ląstelių BTG bendra vertė;
3. Bandymo metodo principas. Tiriant NDS žinduolių kepenų ląstelėse in vivo parodoma, kad reparacinė DNR sintezė vyksta po to, kai cheminėmis medžiagomis ar fiziniais veiksniais sukeltos DNR pažaidos apimtas regionas iškerpamas ir pašalinamas. Šis bandymas pagrįstas 3H žymėto timidino įterpimu į kepenų ląstelių, kurios sudaro labai nedidelę ląstelių, esančių ląstelinio ciklo S fazėje, dalį, DNR. 3H žymėto timidino transportas į ląstelę vertinamas autoradiografijos metodu, kadangi šiam metodui esančios S fazėje ląstelės daro žymiai mažesnę įtaką, negu scintiliacijos skystyje nustatymo metodui.
4. Bandymo metodo aprašymas
4.1. Pasiruošimas
4.1.1. Gyvūnų rūšies pasirinkimas. Paprastai naudojamos žiurkės, tačiau gali būti panaudotos ir kitos atitinkamos žinduolių rūšys. Reikia naudoti dažniausiai naudojamus jaunų sveikų suaugusių gyvūnų laboratorinius kamienus. Bandymo pradžioje gyvūnų kūno masių skirtumai turi būti kuo mažesni ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūnų vidutinės masės.
4.1.2. Laikymo ir šėrimo sąlygos. Taikomos Bendrajame įvade nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad santykinis oro drėgnumas būtų 50–60 %.
4.1.3. Gyvūnų paruošimas. Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę ir bandomąją grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos poveikiai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas individualiai paženklinamas. Gyvūnams ne mažiau kaip 5 dienas leidžiama prisitaikyti prie bandymo sąlygų.
4.1.4. Dozių paruošimas. Kietosios bandomosios medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinamuosiuose įrenginiuose ir, jei reikia, praskiedžiamos. Skystųjų bandomųjų medžiagų dozės ruošiamos iškart, jos praskiedžiamos prieš įvedimą gyvūnams. Bandomieji preparatai naudojami naujai pagaminti, išskyrus atvejus, kai tyrimais įrodytas jų stabilumas.
4.2. Bandymo sąlygos
4.2.1. Tirpiklis ir tirpinantysis įrengimas. Tirpiklis ar tirpinantysis įrengimas naudojamomis dozėmis neturi sukelti jokio toksinio poveikio ir neturi chemiškai reaguoti su bandomąja medžiaga. Jeigu naudojami kiti, nežinomi tirpikliai ar tirpinantieji įrengimai, tai prieš naudojant reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrengimą.
4.2.2. Kontroliniai bandiniai
4.2.2.1. Kiekvieno bandymo metu turi būti tiriami vienu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis ar tirpinantysis įrengimas) kontroliniai bandiniai. Kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir gyvūnai, paveikti bandomąja medžiaga (bandomoji grupė).
4.2.2.2. Teigiami kontroliniai bandiniai turi būti žinomos medžiagos, sukeliančios NDS tokiomis dozėmis, kurios lengvai užgožia pašalinį foną. Kai naudojamos vidutinį atsaką sukeliančios dozės, reikia naudoti teigiamus kontrolinius bandinius, kuriems būtina metabolinė aktyvacija. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunami poveikiai būtų ryškūs, bet kad tyrėjas ne iškart atpažintų užkoduotas skaidres. Teigiamų kontrolinių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje:
1 lentelė. Teigiamos kontrolinės medžiagos
Mėginių paėmimo laikas Medžiagos pavadinimas CAS Nr. Einecs Nr.
Ankstyvasis (po 2–4 valandų) N-nitrozodimetilaminas 62-75-9 200-249-8
Vėlyvasis (po 12–16 valandų) N-2-fluorenilacetamidas (2-AAF) 53-96-3 200-188-6
5. Darbo eiga.
5.1. Gyvūnų skaičius ir lytis
5.1.1. Atsižvelgiant į tiriamojo atsako natūraliąją biologinę variaciją, reikia naudoti tinkamą gyvūnų skaičių. Kiekvienoje grupėje turi būti mažiausiai 3 gyvūnai. Jei turima anksčiau atliktų bandymų duomenų, vienu metu naudojamose teigiamose ir neigiamose kontrolinėse grupėse turi būti po 1 ar 2 gyvūnus.
5.1.2. Kai anksčiau atliktų bandymų naudojant tą pačią gyvūnų rūšį ir tą patį poveikio būdą duomenys rodo, kad toksiškumo tarp atskirų lyčių skirtumai yra labai nedideli, pakanka tirti vienos lyties gyvūnus, pirmiausiai patinus. Jeigu žmogaus jautrumas cheminėms medžiagoms, kuriomis jis yra veikiamas, priklauso nuo lyties, pavyzdžiui, jautrumas kai kurioms farmakologiškai aktyvioms medžiagoms, tai reikia tirti atitinkamos lyties gyvūnus.
5.3. Dozės dydis
5.3.1. Paprastai naudojamos dvi dozės. Didžiausia doze laikoma dozė, kuri sukelia toksiškumą ir dar didesnė dozė būtų mirtina. Didžiausia dozė gali būti apibrėžiama ir kaip dozė, kurią davus, kepenyse pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (pavyzdžiui, piknotiniai branduoliai). Mažesnioji dozė turi sudaryti 25–50 % didesniosios dozės.
5.3.2. Cheminėms medžiagos, kurių mažos ir netoksiškos dozės pasižymi specifiniu biologiniu aktyvumu (pavyzdžiui, hormonai ir mitogenai), taikomos dozavimo kriterijų išimtys, jų dozavimas nustatomas atskirai kiekvienu atveju. Jeigu bandymas atliekamas siekiant surasti dozių intervalą (neturint duomenų apie jį), tai jis turi būti atliekamas toje pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei taikant tokį patį dozavimą, koks naudojamas pagrindinio bandymo metu.
5.4. Ribinis bandymas. Jeigu bandymas atliekamas taikant vieną dozę, kuri įvedus vienu ar dviem kartais per vieną dieną, yra ne mažesnė kaip 2000 mg/kg ir nesukelia toksiškumo bei, atsižvelgiant į struktūriškai panašių medžiagų tyrimų duomenis, nesitikima jos genotoksinio poveikio, tai bandymo atlikti nereikia. Atsižvelgiant į galimą bandomosios medžiagos poveikį žmonėms gali reikėti taikyti didesnę dozę.
5.5. Dozių įvedimas. Bandomoji medžiaga paprastai suleidžiama į skrandį zondu arba į pilvaplėvės ertmę švirkštu. Galima įvesti ir kitais būdais, moksliškai juos pagrindus. Įvedimas į pilvaplėvės ertmę nerekomenduotinas, nes bandomoji medžiaga gali tiesiogiai paveikti kepenis per cirkuliacinę sistemą. Didžiausias skysčio į skrandį ar pilvaplėvės ertmę suleidžiamo skysčio tūris nuo eksperimentinio gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 g kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių suleidimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus dirginančias ir ardančias medžiagas, kurių didesnės koncentracijos sukelia žalingas pasekmes, bandomosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad įvedant visas dozes įvedamos medžiagos tūris būtų vienodas.
5.6. Kepenų ląstelių paruošimas. Kepenų ląstelės paimamos iš gyvūnų po dozės įvedimo praėjus 12–16 valandų. Ankstesnis papildomas bandinio paėmimas (paprastai po veikimo praėjus 2–4 valandoms) yra būtinas, nebent gautas vėlyvojo bandinio (12–16 valandų) aiškus teigiamas atsakas. Bandinius paimti galima ir kitu metu, tai pagrindus toksikokinetinių tyrimų duomenimis. Perleidžiant kolagenazę per kepenis in situ ir sudarant sąlygas naujai disocijavusioms kepenų ląstelėms pačioms prisitvirtinti prie tinkamo paviršiaus, gaunamos žinduolių kepenų ląstelių trumpalaikės kultūros. Neigiamų kontrolinių gyvūnų kepenų ląstelių gyvybingumas turi būti ne mažesnis kaip 50 %.
5.7. NDS nustatymas. Šviežiai išskirtos žinduolių kepenų ląstelės paprastai inkubuojamos terpėje, turinčioje 3H žymėto timidino, atitinkamą laiką (pavyzdžiui, nuo 3 iki 8 valandų). Baigiantis inkubacijai, terpė atskiriama nuo ląstelių, kurios vėliau gali būti inkubuojamos terpėje, turinčioje nežymėto timidino perteklių, kad sumažėtų neįsijungusio timidino radioaktyvumas (vadinamasis „šaltasis atsekimas“). Po inkubacijos ląstelės sudrėkinamos, fiksuojamos bei džiovinamos. Jei inkubacija užtrunka ilgiau, tai nežymėto timidino perteklius terpėje nėra būtinas. Skaidrės pamerkiamos į autoradiografinę emulsiją, eksponuojamos tamsoje (jas šaldant 1–2 savaites), išryškinamos, dažomos ir skaičiuojamos sidabro granulės, susidariusios ekspozicijos metu. Iš kiekvieno gyvūno paimtų bandinių paruošiamos 2–3 skaidrės.
5.8. Analizė
5.8.1. Ląstelės, esančios paruoštose skaidrėse, turi pasižymėti normaliomis morfologinėmis ypatybėmis, kad būtų galima įvertinti NDS. Preparatai tiriami mikroskopu, ieškant akivaizdžių toksiškumo požymių (pavyzdžiui, piknotinių branduolių arba sumažėjusio įvestos žymės radioaktyvumo).
5.8.2. Prieš skaičiuojant granules, skaidrės užkoduojamos. Normaliai kiekvieno gyvūno 2 skaidrėse įvertinama 100 ląstelių. Jei kiekvieno gyvūno įvertinama mažiau nei 100 ląstelių, tai būtina pagrįsti. Granulės neskaičiuojamos branduoliuose, jei ląstelės yra S fazėje, tačiau reikia nurodyti ląstelių, esančių S fazėje, skaičių.
II. Duomenys
6. Duomenų apdorojimas
6.1. Lentelėse turi būti pateikiami kiekvieno gyvūno ir kiekvienos skaidrės duomenys. BTG skaičius nustatomas kiekvienoje ląstelėje, kiekvieno gyvūno ląstelėse, kiekvienai dozei ir kiekvienam bandinio paėmimo laikui. Iš branduolio granulių (BG) skaičiaus atimamas citoplazminių granulių (CG) skaičius. Jei skaičiuojamos ląstelės, kuriose vyksta reparacija, tai kriterijai, taikomi šioms ląstelėms apibūdinti, turi būti pagrindžiami bei remtis anksčiau gautais neigiamų kontrolinių bandinių tyrimo duomenimis. Skaitiniai duomenys gali būti vertinami statistiniais metodais. Jei atliekami statistiniai skaičiavimai, jie turi būti pasirinkti bei pagrįsti prieš bandymą.
7. Duomenų įvertinimas ir interpretacija
7.1. Atsakas yra teigiamas, jeigu:
7.1.1. BTG vertė didesnė už pradinę, kuri pagrįsta remiantis anksčiau laboratorijoje gautais duomenimis;
7.2. Atsakas yra neigiamas, jeigu:
7.3. Reikia aptarti gautų rezultatų biologinę reikšmę – atsižvelgti į variaciją tarp atskirų gyvūnų, dozės ir atsako tarpusavio ryšį bei citotoksiškumą. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis kriterijus, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas.
7.4. Daug bandymų gavus aiškius teigiamus ir aiškius neigiamus rezultatus, dažniausi galima padaryti išvadą apie bandomosios medžiagos savybes remiantis gautų duomenų visuma. Net ir daug kartų pakartojus konkretų bandymą, jo rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs.
7.5. Teigiami rezultatai, gauti tiriant NDS žinduolių kepenų ląstelėse in vivo, rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia DNR pažaidas žinduolių kepenų ląstelėse in vivo, o pažaidų reparacija vyksta NDS metu in vitro. Neigiami rezultatai rodo, kad bandymo sąlygomis bandomoji medžiaga nesukelia DNR pažaidų, nustatomų šiuo bandymu.
III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
8. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija:
8.1. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys
8.2. Eksperimentiniai gyvūnai
8.3. Bandymo sąlygos
8.3.7. metodai, kuriais patvirtinama, kad bandomoji medžiaga pateko į bendrąją cirkuliaciją ar audinį, į kurį ji buvo nukreipta, jei įmanoma;
8.3.8. bandomosios medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (md) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg per dieną), jei tai įmanoma;
8.4. Rezultatai:
8.4.1. branduolinių, citoplazminių bei branduolinio tinklo granulių, esančių kiekvienos skaidrės, gyvūno ir gyvūnų grupės ląstelėse, skaičių vidurkiai;
8.4.5. duomenys apie tuo pačiu metu naudotus neigiamus (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) ir teigiamus kontrolinius bandinius;
8.4.6. anksčiau gauti neigiami kontroliniai duomenys, kartu pateikiant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nuokrypius;
IV. NUORODOS
10. Ashby J. Lefevre P. A., Burlinson B., Penman, M. G. (1985), Žiurkių hepatocitų DNR reparacijos in vivo bandymo įvertinimas, Mutation Res., 156, 1–18.
11. Butterworth B. E., Ashby J., Bermudez E., Casciano D., Mirsalis J., Probst G., Williams G. (1987), Žiurkių hepatocitų DNR reparacijos in vivo bandymo vadovas ir protokolas, Mutation Res., 189, 123–133.
12. Kennelly J. C., Waters R., Ashby J., Lefevre P. A., Burlinson B., Benford D. J., Dean S. W., Mitchell I. de G. (1993), Žiurkių kepenų NDS in vivo (Kirkland D. J., Fox M. (red.), Pagalbiniai mutageniškumo bandymai. UKEM rekomenduotos procedūros. UKEMS mutageniškumo bandymų vadovo pakomitetis. Ataskaita, II d., Cambridge University Press, Kembridžas, Niujorkas, Portčesteris, Melburnas, Sidnėjus, 52–77).
13. Madle S., Dean S. W., Andrac U., Brambilla G., Burlinson B., Doolittle D. J., Furihata C., Hertner T., McQueen C. A., Mori H. (1993), NDS in vivo ir in vitro bandymų atlikimo rekomendacijos, Mutation Res., 312, 263–285.
14. Fautz R., Hussain B., Efstathiou E., Hechenberger-Freudl. C. (1993), Pradinio gyvybingumo ir šviežiai išskirtų žiurkių hepatocitų, naudojamų NDS in vitro ir in vivo bandyme, pridėjimo sąryšio įvertinimas, Mutation Res., 291, 21–27.