LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS
Į S A K Y M A S
DĖL VEISLINIŲ BULIŲ SPERMOS TYRIMO METODŲ TECHNINIO REGLAMENTO
2005 m. lapkričio 29 d. Nr. 3D-550
Vilnius
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro
2005 m. lapkričio 29 d. įsakymu Nr. 3D-550
VEISLINIŲ BULIŲ SPERMOS TYRIMO METODŲ TECHNINIS REGLAMENTAS
1. Veislinių bulių spermos tyrimo metodų techninis reglamentas (toliau – Reglamentas) nustato šviežios ir kriokonservuotos veislinių bulių spermos fizinių, cheminių ir fiziologinių rodiklių tyrimo metodus.
2. Reglamento turi laikytis sėklinimo centrai (įmonės), laboratorijos, mokslo institucijos, gaminančios ir tiriančios šviežią ir kriokonservuotą veislinių bulių spermą, naudojamą karvėms ir telyčioms sėklinti. Reglamentas netaikomas tiriant importuotą ir kergti naudojamą veislinių bulių spermą.
3. Buliai, kurių sperma naudojama karvėms ir telyčioms sėklinti, turi būti pripažinti grynaveisliais pagal Galvijų pripažinimo grynaveisliais ir jų naudojimo veisimui taisykles, patvirtintas Valstybinės gyvulių veislininkystės priežiūros tarnybos prie Žemės ūkio ministerijos viršininko 2003 m. gegužės 2 d. įsakymu Nr. 1A-20 (Žin., 2003, Nr. 74-3453).
4. Šiame Reglamente vartojamos sąvokos:
Arbitražinis tyrimas – tyrimas, kurį atlieka Lietuvos veterinarijos akademijos (toliau – LVA) Gyvulių reprodukcijos laboratorijos ir LVA Gyvulininkystės instituto Gyvūnų reprodukcijos skyriaus darbuotojai iškilusiems ginčams dėl spermos kokybės spręsti.
Koli titras – minimalus spermos kiekis, kuriame nustatyta viena žarnyno lazdelės bakterija.
Kriokonservuota sperma – nuosekliai pagal technologinius reikalavimus praskiesta, fasuota, atvėsinta ir užšaldyta sperma, laikoma skystame azote.
Sėklinimas – dirbtinio spermos suleidimo į patelės lytinius organus metodas.
Spermatozoidų judrumas – statistiškai apskaičiuotas judrių spermatozoidų skaičiaus santykis su bendruoju spermatozoidų skaičiumi tiriamajame spermos tūryje, išreikštas balais arba procentais.
Spermatozoidų koncentracija – statistiškai apskaičiuotas spermatozoidų skaičius spermos tūrio vienete.
Spermos atšildymas – technologinė operacija, kurios metu kriokonservuotos spermos dozės atšildomos optimaliu režimu iki technologijos reikalavimuose numatytos temperatūros, tinkamos sėklinimui.
Spermos dozė – technologiškai apdorotos spermos kiekis, paruoštas vienam sėklinimui.
Spermos kokybės vertinimas – spermos biologinių, fiziologinių-morfologinių, fizikinių ir cheminių rodiklių nustatymas.
Šviežia sperma – ką tik paimta sperma (iki technologinio apdorojimo).
5. Koli titras, nepatogeninių mikroorganizmų skaičius, patogeniniai mikroorganizmai ir toksigeniniai grybeliai nustatomi Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos akredituotose laboratorijose jose taikomais metodais.
6. Kriokonservuotos spermos apvaisinamoji galia nustatoma pagal kontroliuojamų bandų karvių ir telyčių apsivaisinimo rezultatus.
7. Visi spermos kokybės rodikliai turi būti nustatomi laboratorinėse sąlygose, kai:
8. Tirpalai spermos kokybės rodikliams nustatyti ruošiami naudojant distiliatoriumi pagamintą distiliuotą vandenį ir chemiškai švarius reagentus.
9. Sperma atšildoma laikantis technologinių reikalavimų:
9.1. ištraukus iš Diuaro indo šiaudelį su sperma, nuo jo paviršiaus ir galų nupurtomi skysto azoto lašai;
9.2. sperma, užšaldyta pagal bulių spermos kriokonservavimo technologiją, atšildoma:
9.2.2. iš karto ne daugiau kaip po 2 dozes, laikant ištraukus iš skysto azoto iki panardinant į vandenį ne ilgiau kaip 5 sekundes;
9.3. atšildžius šiaudelis su sperma nušluostomas popierine arba marline servetėle. Purtant kaip medicininį termometrą, oro tarpelis nustumiamas iš šiaudelio su sperma vidurio į jo galą, po to 5 mm pastarojo kartu su užhermetizuotu galu nukerpama statmenai išilginei jo ašiai;
10. Spalva ir išvaizda nustatoma vizualiai apžiūrint šviežią ir šiaudelyje esančią atšildytą spermą:
10.1. šviežioje spermoje neturi būti:
10.1.3. be optikos prietaisų matomų mechaninių priemaišų, į dribsnius arba putų sankaupas panašių darinių;
11. Šviežios spermos tūris nustatomas naudojantis matavimo cilindru, sugraduotu 0,1 cm³ padalomis, ir (38±0,5)°C vandens vonia:
11.1. į matavimo cilindrą, esantį (38±0,5)°C vandens vonioje, įpilamas tam tikras (38±0,5)°C temperatūros spermos skiediklio kiekis, atitinkantis šviežios spermos ejakuliato tūrį;
12. Spermatozoidų judrumas nustatomas naudojant 100–200 kartų didinantį binokuliarinį mikroskopą, šildomąjį mikroskopo stalelį (38–40°C), objektinius ir dengiamuosius stiklelius, sterilias žirkles, stiklines lazdeles bei popierines arba marlines servetėles:
12.1. šviežia sperma kartu su spermos rinktuvu įdedama į plastmasinio rėmelio, esančio (38±0,5)°C vandens vonioje, skyrelį;
12.2. ant objektinio stiklelio, esančio ant šildomo mikroskopo stalelio, steriliu šiaudeliu užlašinamas lašas natrio citrato tirpalo. Sterilia stikline lazdele paimamas šviežios spermos mėginys ir ta pačia lazdele sumaišomas su natrio citrato tirpalo lašu. Preparatas uždengiamas dengiamuoju stikleliu;
12.3. tiriant kriokonservuotą spermą į flakoną, esantį vandens vonioje, įpilama (38±0,5)°C temperatūros 0,75 ml 2,9 proc. natrio citrato tirpalo. Nukerpamas kitas atšildyto šiaudelio su sperma galas ir jo turinys išpilamas į flakoną. Sperma ir natrio citratas sumaišomi tuo pačiu šiaudeliu;
12.4. sterilus šiaudelis įleidžiamas į flakoną iki dugno, rodomuoju pirštu užspaudžiamas kitas jo galas ir šiaudelis ištraukiamas. Iš šiaudelio užlašinamas lašas ant objektinio stiklelio, esančio ant šildomo mikroskopo stalelio, ir uždengiamas dengiamuoju stikleliu;
12.7. vertinamas judrių spermatozoidų skaičiaus santykis su bendru spermatozoidų skaičiumi. Vizualiai nustatytam spermatozoidų judrumui priskiriamas įvertinimo balas, kuris pateikiamas šio Reglamento priede;
13. Spermatozoidų koncentracija nustatoma naudojant 300 kartų didinantį binokuliarinį mikroskopą, Goriajevo kamerą, šlifuotus dengiamuosius stiklelius, 0,2 cm3 mikropipetes, melanžeres kraujo raudoniesiems kūneliams nustatyti, 3 proc. natrio chlorido tirpalą, spirito ir eterio mišinį.
13.1. Šviežios spermos koncentracijos tyrimo eiga:
13.1.2. Goriajevo kamera ir šlifuotas dengiamasis stiklelis nuplaunami spirito ir eterio mišiniu. Šlifuotas dengiamasis stiklelis pritrinamas prie šoninių Goriajevo kameros plokštumų;
13.1.3. į melanžerę pritraukiama spermos iki 1,0 padalos, po to 3 proc. natrio chlorido tirpalo iki 101 padalos;
13.1.5. išlašinus iš melanžerės 4 pirmuosius lašus, penktasis lašas įleidžiamas į tarpelį tarp Goriajevo kameros plokštumos ir šlifuoto dengiamojo stiklelio;
13.1.6. suskaičiuojami spermatozoidai, esantys Goriajevo kameros tinklelio 5 dideliuose įstrižai išdėstytuose kvadratuose (80 mažų kvadratėlių). Skaičiuojami tik tie spermatozoidai, kurių galvutės yra didžiojo kvadrato viduje ir ant kairės ir viršutinės kraštinės;
13.2. Kriokonservuotos spermos koncentracijos tyrimo eiga:
13.2.1. į flakoną, esantį vandens vonioje, įpilama 0,75 ml (38±0,5)°C temperatūros 2,9 proc. natrio citrato tirpalo. Nukerpamas kitas atšildyto šiaudelio su sperma galas ir jo turinys išpilamas į flakoną. Sperma ir natrio citratas sumaišomi tuo pačiu šiaudeliu;
13.2.2. į kitą flakoną įpilama 1,9 ml 3 proc. natrio chlorido ir mikropipete įleidžiama 0,1 ml spermos iš pirmojo flakono;
13.2.3. Goriajevo kamera ir šlifuotas dengiamasis stiklelis nuplaunami spirito ir eterio mišiniu. Šlifuotas dengiamasis stiklelis pritrinamas prie šoninių Goriajevo kameros plokštumų;
13.2.4. mišinio lašas iš antrojo flakono įleidžiamas į tarpelį tarp Goriajevo kameros plokštumos ir šlifuoto dengiamojo stiklelio;
13.2.5. suskaičiuojami spermatozoidai, esantys Goriajevo kameros tinklelio 5 dideliuose įstrižai išdėstytuose kvadratuose (80 mažų kvadratėlių). Skaičiuojami tik tie spermatozoidai, kurių galvutės yra didžiojo kvadrato viduje ir ant kairės ir viršutinės kraštinės;
14. Arbitražiniams tyrimams tam pačiam spermos mėginiui šio Reglamento 13 punkto procedūros pakartojamos dar tris kartus ir apskaičiuojamas trijų pakartojimų aritmetinis vidurkis. Kiekvieno pakartojimo reikšmė neturi skirtis nuo vidurkio daugiau kaip 10 proc.
15. Bendras spermatozoidų skaičius ejakuliate mlrd. nustatomas apskaičiuojant pagal formulę:
Sb=V·K,
čia:
Sb – bendras spermatozoidų skaičius ejakuliate, mlrd.;
V – ejakuliato tūris, cm3;
K – spermatozoidų koncentracija, mlrd./cm3.
16. Tiesiai judančių spermatozoidų skaičius dozėje nustatomas apskaičiuojant pagal formulę:
Sd=250·J·K,
čia:
Sd – tiesiai judančių spermatozoidų skaičius dozėje, mln.;
J – spermatozoidų judrumas, balais;
K – spermatozoidų koncentracija, mlrd./cm3.
17. Patologinių spermatozoidų kiekis nustatomas naudojant 700–900 kartų didinantį binokuliarinį mikroskopą, dažus (1,7 proc. eozino arba azur-eozino, anilino, ištirpintus 3 proc. natrio citrato tirpale), objektinius stiklelius, stiklelius šlifuotais galais, spirito ir eterio mišinį:
17.1. stikleliai šlifuotais galais ir objektiniai stikleliai nuplaunami spirito ir eterio mišiniu, nudžiovinami;
17.2. ant švaraus objektinio stiklelio užlašinamas šviežios ar kriokonservuotos (atšildytos) spermos lašas ir, sumaišius su dažais, per visą objektinį stiklelį padaromas plonas tepinėlis;
17.4. ant išdžiūvusio tepinėlio užlašinamas lašas imersinio aliejaus ir spermatozoidai apžiūrimi pro mikroskopą;
17.5. tepinėlyje suskaičiuojama 200 spermatozoidų ir atskirai užrašoma, kiek jų yra normalių ir kiek patologinių;
17.6. patologinių spermatozoidų kiekis apskaičiuojamas pagal formulę:
Sp=(P/(P+N))·100,
čia:
Sp – patologinių spermatozoidų kiekis, proc.;
P – patologinių spermatozoidų skaičius, vnt.;
N – normalių spermatozoidų skaičius, vnt.;
17.7. atliekant arbitražinius tyrimus to paties mėginio patologinių spermatozoidų kiekiui apskaičiuoti tyrimas atliekamas 3 kartus ir apskaičiuojamas trijų pakartojimų aritmetinis vidurkis. Kiekvieno pakartojimo reikšmė neturi skirtis nuo vidurkio daugiau kaip 10 proc. Jeigu vidurkio paklaida viršija 10 proc., tyrimas kartojamas.