LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS
Į S A K Y M A S
DĖL ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO 2001 M. GEGUŽĖS 9 D. ĮSAKYMO NR. 146 „DĖL PIENO SUPIRKIMO TAISYKLIŲ PATVIRTINIMO“ PAKEITIMO
2006 m. sausio 4 d. Nr. 3D-1
Vilnius
Pakeičiu Pieno supirkimo taisykles, patvirtintas Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2001 m. gegužės 9 d. įsakymu Nr. 146 „Dėl Pieno supirkimo taisyklių patvirtinimo“ (Žin., 2001, Nr. 40-1406; 2005, Nr. 135-4868):
1. Išdėstau 2 punktą taip:
2. Išdėstau 5 punktą taip:
„5. Supirkėjas privalo supažindinti gamintoją, o gamintojas susipažinti su 2004 m. balandžio 29 d. Europos Parlamento ir Tarybos Reglamentu (EB) Nr. 853/2004, šiomis taisyklėmis, Lietuvos Respublikos Vyriausybės 2003 m. birželio 4 d. nutarimu Nr. 726. Šie norminiai dokumentai turi būti supirkimo vietose. Supirkėjas teikia informaciją gamintojams aktualiais pieno kokybės ir supirkimo tvarkos bei pieno gamybos kvotų sistemos klausimais.“.
4. Išdėstau 12 punkto pirmąją pastraipą taip:
„12. Supirkimo metu, vadovaujantis Žalio pieno pirminių kokybės rodiklių įvertinimo instrukcija, patvirtinta Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 1999 m. birželio 29 d. įsakymu Nr. 287 (Žin., 1999, Nr. 60-1963), nustatomi pirminiai kokybės rodikliai. Inhibitorinės (slopinančiosios) medžiagos tiriamos sparčiaisiais metodais, nurodytais šių taisyklų 4 priede. Inhibitorines (slopinančiąsias) medžiagas tiria tam nešališkoje akredituotoje pieno ir pieno produktų tyrimams laboratorijoje apmokytas bei turintis jos išduotą pažymėjimą supirkėjo įgaliotas asmuo ir kiekvieną atliktą tyrimą registruoja pieno supirkimo įmonės patvirtintame žurnale, nurodydamas, kokiu metodu tirta, tyrimo datą, tyrimą atlikusio asmens vardą ir pavardę. Šiame žurnale pasirašo inhibitorines (slopinančiąsias) medžiagas tyręs asmuo ir pieno gamintojas ar jo įgaliotas asmuo.“.
5. Išdėstau 43 punktą taip:
„43. Gamintojas privalo parduodamą pieną paruošti pagal 2004 m. balandžio 29 d. Europos Parlamento ir Tarybos Reglamente (EB) Nr. 853/2004 ir šiose taisyklėse nustatytus reikalavimus ir sutartą pieno kiekį pristatyti laiku į pieno supirkimo vietą, vykdyti kitus sutarties su supirkėju bei teisės aktais nustatytus reikalavimus.“.
6. Išdėstau 45.1. punktą taip:
„45.1. būti nešališka ir akredituota pagal standarto LST EN ISO/IEC 17025 reikalavimus tyrimų įstaiga, turinti juridinio asmens statusą. Ji privalo būti akredituota visiems 2004 m. balandžio 29 d. Europos Parlamento ir Tarybos Reglamente (EB) Nr. 853/2004 ir šiose taisyklėse nurodytiems pieno sudėties ir kokybės tyrimams;“.
7. 3 priede:
Pieno supirkimo taisyklių
4 priedas
INHIBITORINIŲ (SLOPINANČIŲJŲ) MEDŽIAGŲ NUSTATYMAS PIENE SPARČIAISIAIS METODAIS
I. ANTIBIOTIKŲ, TURINČIŲ BETA-LAKTAMINĮ ŽIEDĄ, NUSTATYMAS NAUDOJANT PREPARATUS PENZYM (SPARTUSIS METODAS)
1. Metodo esmė
Metodas pagrįstas tuo, kad naudojamas fermentas DD-karboksipeptidazė, hidrolizuojanti R-D-Ala-D-Ala tipo sintetinius substratus ir greitai reaguojanti su beta-laktaminį žiedą turinčiais antibiotikais, sudarydama pastovų kompleksą.
Šiuo metodu galima aptikti piene nuo 0,005 iki 0,006 TV penicilino mililitre, naudojant preparatus Penzym S, ir daugiau kaip 0,017 TV penicilino mililitre, naudojant preparatus Penzym.
2. Įranga
Naudojama įprastinė ir toliau nurodyta specialioji mikrobiologijos laboratorijos įranga:
a) naudojant Penzym preparatus:
– termostatas, kuriame galima palaikyti 47°C ± 0,5°C temperatūrą;
– pipetės, 10 μl ir 50 μl vardinio tūrio, su vienkartiniais antgaliais;
– 1 ml dozavimo švirkštas (pipetė);
– Eppendorf mėgintuvėliai, 1,5 ml, kūginiai, su kamšteliais;
3. Medžiagos
Penzym ar Penzym S rinkinys (UCB-Bioproducts firmos, Belgija), kuriame yra:
4. Pasiruošimas tyrimui
Tyrimui naudojamas UCB-Bioproducts firmos (Belgija) fermentas DD-karboksipeptidazė. Prieš naudojimą į buteliuką su liofilizuotu fermentu (reagentas Nr. 1) įpilama 1 ml šalto sterilaus distiliuoto vandens. Rekomenduojama sterilų distiliuotą vandenį pilti švirkštu per guminį kamštuką ir sumaišyti neplakant. Fermento tirpalą galima laikyti 1 mėn. tamsoje, 4°C temperatūroje.
PASTABA. Rekomenduojama buteliuką su reagentu Nr. 2, išėmus iš šaldytuvo, keletą minučių palaikyti kambario temperatūroje, kad buteliuke nesikondensuotų drėgmė.
5. Tyrimo eiga
Tiriama saugant nuo tiesioginių saulės spindulių.
5.1. Tyrimas naudojant preparatus Penzym
Į Eppendorf mėgintuvėlius įpilama 10 μl reagento Nr. 1 ir 50 μl tiriamojo pieno, mėgintuvėliai sukamai papurtomi, kad jų turinys susimaišytų arba sumaišoma purtant mechaniniu maišytuvu. Neužkimšti mėgintuvėliai laikomi 5 min. termostate ar vandens vonelėje 47°C ± 0,5°C temperatūroje. Tuo tarpu pasiruošiama kitam etapui: po vieną tabletę reagento Nr. 2 pincetu įdedama į kiekvieną termostate ar vandens vonelėje laikomo mėgintuvėlio kamštelį. Praėjus 5 min. mėgintuvėliai užkemšami kamšteliais, tabletės sukrenta į mėgintuvėlius. Mėgintuvėliai atsargiai supurtomi, kad tabletės nusileistų ant dugno. Po to užkimšti mėgintuvėliai laikomi 8 min. termostate ar vandens vonelėje 47°C ± 0,5°C temperatūroje. Ištrauktų iš termostato ar vandens vonelės mėginių negalima laikyti ilgiau kaip 15 sek.
5.2. Tyrimas naudojant preparatus Penzym S
Į Eppendorf mėgintuvėlius įpilama 10 μl reagento Nr. 1 ir 100 μl tiriamojo pieno, mėgintuvėliai sukamai papurtomi, kad jų turinys susimaišytų arba sumaišoma purtant mechaniniu maišytuvu. Neužkimšti mėgintuvėliai laikomi 7,5 min. termostate ar vandens vonelėje 47°C ± 0,5°C temperatūroje. Tuo tarpu pasiruošiama kitam etapui: po vieną tabletę reagento Nr. 2 pincetu įdedama į kiekvieną termostate ar vandens vonelėje laikomo mėgintuvėlio kamštelį. Praėjus 7,5 min. mėgintuvėliai užkemšami kamšteliais, tabletės sukrenta į mėgintuvėlius. Mėgintuvėliai atsargiai supurtomi, kad tabletės nusileistų ant dugno. Po to užkimšti mėgintuvėliai laikomi 15 min. termostate ar vandens vonelėje 47°C ± 0,5°C temperatūroje. Ištrauktų iš termostato ar vandens vonelės mėginių negalima laikyti ilgiau kaip 15 sek.
6. Rezultatų vertinimas
6.1. Vertinimas, kai tyrimui buvo naudoti preparatai Penzym
Pirmą kartą vertinama, praėjus 8 min. nuo tabletės įdėjimo į mėgintuvėlį.
Kai tabletės spalva rausva, panaši į persikų ar rausvai oranžinė, tiriamajame piene nėra antibiotikų.
Kai dominuoja geltoni tonai (tarp persikų ir geltonos spalvos) – tiriamajame piene gali būti antibiotikų, tada mėginiai papildomai laikomi termostate ar vandens vonelėje dar 7 min. Išėmus mėgintuvėlius su mėginiais iš termostato ar vandens vonelės, tuoj pat vertinama spalva aplink tabletę, lyginant su spalvų skale (3 punkto d papunktis).
Kai spalva rausvai oranžinė (pirmas skalės langelis) – tiriamajame piene nėra antibiotikų (mažiau kaip 0,005 TV penicilino mililitre).
Kai spalva yra panaši į persikų (antras skalės langelis) – įtariama, kad tiriamajame piene yra antibiotikų (apie 0,008 TV penicilino mililitre).
Kai spalva geltona (trečias skalės langelis) – tiriamajame piene yra antibiotikų (daugiau kaip 0,017 TV penicilino mililitre).
6.2. Vertinimas, kai tyrimui buvo naudoti Penzym S preparatai
Išėmus mėgintuvėlius su mėginiais iš termostato ar vandens vonelės, tuoj pat vertinama spalva aplink tabletę, lyginant su spalvų skale (3 punkto d dalis).
Kai spalva yra persikų – oranžinė (pirmas skalės langelis) – tiriamajame piene nėra antibiotikų (mažiau kaip 0,0025 TV penicilino mililitre).
Kai spalva yra geltonai oranžinė (antras skalės langelis) – tiriamajame piene yra antibiotikų (nuo 0,005 TV iki 0,006 TV penicilino mililitre).
Kai spalva yra geltona (trečias skalės langelis) – tiriamajame piene taip patyra antibiotikų (daugiau kaip 0,0064 TV penicilino mililitre).
PASTABA. Tiriama ir rezultatai vertinami pagal gamintojo (UCB-Bioproducts firmos, Belgija) nurodymus, naudojantis gamintojo pridėtomis spalvų skalėmis Penzym ir Penzym S rinkiniuose.
II. ANTIBIOTIKŲ, TURINČIŲ BETA-LAKTAMINĮ ŽIEDĄ, NUSTATYMAS NAUDOJANT PREPARATUS BETA STAR (SPARTUSIS METODAS)
BetaStar 25 skirtas 25, o BetaStar 100 – 100 pieno mėginių tirti.
7. Metodo esmė
Metodas pagrįstas specifine beta-laktaminį žiedą turinčių antibiotikų receptoriaus, susijungusio su aukso dalelėmis, ir šių antibiotikų, esančių piene, sąveika. Pirmajame etape, inkubuojant nurodytą receptoriaus kiekį su pienu, turinčiu antibiotikų, įvyksta antibiotikų sąveika su receptoriumi. Antrajame etape chromatografine indikacine juostele nustatoma, ar tokia sąveika buvo. Ant juostelės esantis biomolekulių ruoželis sustabdo receptoriaus molekules, kurių neužblokavo antibiotikai, ir suformuoja pirmąją (apatinę) raudoną liniją. Antroji raudona linija yra kontrolinė, palyginamoji. Jeigu antibiotikai užblokuoja visus receptorius, tai pirmoji raudona linija nesusiformuoja, o tai rodo, jog beta-laktaminį žiedą turinčių antibiotikų kiekis tiriamajame piene yra lygus arba didesnis kaip minimali jų aptikimo šiuo metodu riba.
Šiuo metodu galima aptikti mililitre piene 0,003 ± 0,001 TV penicilino ir firmos gamintojos nurodytus kitų antibiotikų kiekius.
8. Įranga
Naudojama įprastinė ir toliau nurodyta specialioji mikrobiologijos laboratorijos įranga:
a) naudojant preparatus BetaStar 25
– termostatas, kuriame galima palaikyti 47,5°C ± 0,5°C temperatūrą;
9. Medžiagos
BetaStar 25 testo rinkinį (UCB-Bioproducts firmos, Belgija) sudaro:
d) automatinis dozavimo švirkštas 0,2 ml tūriui matuoti. BetaStar 100 testo rinkinį (UCB-Bioproducts firmos, Belgija) sudaro:
10. Pasiruošimas tyrimui
BetaStar 25 testui pasiruošimo nereikia.
BetaStar 100 testo rinkinyje esančio sublimacinio džiovinimo būdu pagaminti receptoriaus milteliai prieš naudojimą turi būti ištirpinti vandenyje. Gautas tirpalas iš vieno buteliuko turi būti išpilstytas į 50 kūginių Eppendorf mėgintuvėlių ir sunaudotas per vieną dieną, kai tirpalas laikomas nuo 2°C iki 8°C temperatūroje, arba per 5 dienas, kai tirpalas sušaldomas ir laikomas šaldyklėje. Prieš ruošiant tirpalą buteliukas su receptoriumi supurtomas, nuimama plomba ir guminis kamštelis. Pipete į buteliuką įpilama 1350 μl šalto distiliuoto vandens, jis užkemšamas guminiu kamšteliu ir pamažu pasukiojamas, kad ištirptų milteliai. Gautas tirpalas išpilstomas po 25 μl į kūginius Eppendorf mėgintuvėlius. Mėgintuvėliai užkemšami ir iki naudojimo laikomi šaltai.
11. Tyrimo eiga
11.1. Tyrimas naudojant preparatus BetaStar 25
Iš šaldytuvo išimama dėžutė, paimamas buteliukas su receptoriumi ir atsargiai supurtoma, nuimama plomba bei guminis kamštelis.
Vienkartinis antgalis uždedamas ant švirkšto. Švirkšto stūmoklis įstumiamas iki galo, antgalis įmerkiamas 1 cm į tiriamąjį pieną, stūmoklis lėtai atleidžiamas. Paimtas 0,2 ml pieno mėginys švirkštu suleidžiamas į buteliuką. Buteliukas užkemšamas guminiu kamščiu, atsargiai pamažu pasukiojamas, kol ištirps sausosios medžiagos. Laikoma 3 min. 47,5°C temperatūroje.
Sausomis, švariomis rankomis atidengiamas indelis su chromatografinėmis indikacinėmis juostelėmis. Laikant už mėlynojo galo paimama viena indikacinė juostelė ir įmerkiama į tiriamąjį pieną buteliuke. Ant indikacinės juostelės esančios rodyklės turi būti nukreiptos į buteliuko dugną. Laikoma 2 min. 47,5°C temperatūroje. Indikacinė juostelė išimama, ir analizuojami tyrimo rezultatai.
11.2. Tyrimas naudojant preparatus BetaStar 100
Į kūginį Eppendorf mėgintuvėlį su receptoriaus tirpalu (4.18.7.4 p.) pipete įpilama 100 μl tiriamojo pieno, išmaišoma ir laikoma 3 min. 47,5°C temperatūroje.
Sausomis, švariomis rankomis atidengiamas indelis su chromatografinėmis indikacinėmis juostelėmis. Laikant už mėlynojo galo paimama viena indikacinė juostelė ir įmerkiama į tiriamąjį pieną mėgintuvėlyje. Ant indikacinės juostelės esančios rodyklės turi būti nukreiptos į mėgintuvėlio dugną. Laikoma 2 min. 47,5°C temperatūroje. Indikacinė juostelė išimama ir analizuojami tyrimo rezultatai.
12. Rezultatų vertinimas
Kai pirmoji (apatinė) raudona linija ant indikacinės juostelės yra ryškesnė už antrąją (palyginamąją), testas laikomas neigiamu, t. y. tiriamajame pieno mėginyje antibiotikų nėra.
Kai pirmoji linija yra panaši arba mažiau ryški lyginant su antrąja, tai reiškia, kad tiriamajame pieno mėginyje antibiotikų yra, bet jų kiekis ne didesnis kaip minimali jų aptikimo šiuo testu riba.
Kai pirmosios linijos nėra, testas laikomas teigiamu, – antibiotikų kiekis lygus arba didesnis kaip minimali jų aptikimo šiuo testu riba.
Kai ant indikacinės juostelės nėra nė vienos raudonos linijos, testas laikomas negaliojančiu.
III. ANTIBIOTIKŲ NUSTATYMAS NAUDOJANT SNAP TESTUS (SPARTUSIS METODAS)
13. Antibiotikams nustatyti gali būti naudojami trys skirtingi SNAP testai: beta-laktaminį žiedą turintiems antibiotikams, tetraciklinams ir gentamicinui. Testai vartojami antibiotikams nustatyti žaliame maišytame karvių piene. Mėginiai turi būti atšaldyti ir ištirti per 3 dienas po jų surinkimo. Pieno mėginys prieš tyrimą kruopščiai sumaišomas. Metodas netinka pienui, kuris pagal spalvą ir konsistenciją neatitinka šių taisyklių 13 punkte nurodytų reikalavimų.
14. Metodo esmė
Visų SNAP testų veikimo principas yra konkurentinė imunofermentinė reakcija. Metodas pagrįstas tuo, kad naudojamas konjugatas (antibiotikus surišantys receptoriniai baltymai, konjuguoti su fermentu – krienų peroksidaze), kuris prijungia piene esančius tiriamus antibiotikus, sudarydamas stabilius kompleksus. Šis procesas įvyksta pirmajame tyrimo etape, įpylus pieną į mėgintuvėlį su konjugatu. Jei piene nėra antibiotikų, nesurištas į kompleksus konjugatas antrajame tyrimo etape rišasi prie antibiotikų, esančių SNAP prietaiso mėginio duobutėje, ir ten sudaro kompleksus (tamsiai mėlyna spalva). Tačiau, jei piene buvo antibiotikų, jau mėgintuvėlyje surištas į kompleksus konjugatas grįžtamosios srovės (nuspaudus aktyvatorių) yra išplaunamas iš mėginio duobutės (šviesiai mėlyna spalva).
SNAP testų jautrumas atitinka didžiausius leistinus arba šiek tiek mažesnius antibiotikų likučių piene kiekius. SNAP beta-laktaminį žiedą turintiems antibiotikams nustatyti skirtais rinkiniais piene galima aptikti 0,004 μg penicilino G mililitre. Be to, šie testai nustato ir kitus beta-laktaminį žiedą turinčius antibiotikus: ampiciliną (0,004 μlg/ml), amoksiciliną (0,004 μg/ml), cefapiriną (0,004 μlg/ml), ceftiofurą (0,006 μlg/ml), kloksaciliną (0,030 μlg/ml), dikloksaciliną (0,025 μg/ml). SNAP tetraciklinų testais galima aptikti 0,020 μg tetraciklino mililitre, 0,030 μg chlortetraciklino mililitre ir 0,030 μg oksitetraciklino mililitre; SNAP gentamicino testais – 0,030 μg gentamicino mililitre.
15. Įranga
Naudojama įprastinė mikrobiologijos laboratorijos įranga ir žemiau nurodyta specialioji:
– mėgintuvėlių šildytuvas, termostatas ar vandens vonelė, kurioje palaikoma 45°C ± 5°C temperatūra;
– mėgintuvėlių stovas;
– šaldytuvas, kuriame palaikoma nuo 0°C iki 7°C temperatūra.
PASTABA. Tiriant patartina naudoti šildytuvą, sukurtą specialiai SNAP testui (IDEXX Laboratories, Inc. firmos, JAV). Naudojant šį šildytuvą nereikia jokios papildomos įrangos, išskyrus šaldytuvą testams laikyti. Šildytuvas gali būti naudojamas ir pienvežyje.
16. Medžiagos
SNAP testo rinkinys (IDEXX Laboratories, Inc., JAV), kuriame yra:
17. Pasiruošimas tirti
Prieš tyrimą patikrinama, ar mėgintuvėlių šildytuvas (vandens vonelė) rodo 45°C ± 5°C temperatūrą.
Iš maišelio išimamas SNAP prietaisas, pipetė ir mėgintuvėlis su konjugatu. Naujo SNAP prietaiso dėmės rezultatų laukelyje ir aktyvacijos apskritimas turi būti šviesiai mėlynos spalvos. Patikrinama, ar konjugato milteliai yra mėgintuvėlio dugne. Priešingu atveju mėgintuvėlis lengvai pakratomas, kad milteliai nukristų į dugną.
18. Tyrimo eiga
SNAP prietaisas uždedamas ant šildytuvo arba įdedamas į termostatą. Pieno mėginys kruopščiai supurtomas. SNAP prietaisas viso tyrimo metu turi būti horizontalioje padėtyje.
1-asis etapas. Pieno mėginys prieš tyrimą sumaišomas. Mėgintuvėlio su konjugatu dangtelis nuimamas. Iš mėginio taros vidurio pipete įtraukiama tiriamojo pieno be oro burbuliukų (450 μl ± 50 μl) iki pipetės indikacinės linijos. Mėgintuvėlis pasukiojamas, kad piene ištirptų konjugatas, įstatomas į specialią įdubą mėgintuvėlių šildytuve (ar stovelį termostate) ir laikomas 5 min. 45°C ± 5°C temperatūroje (nustatant beta-laktamus). Negalima šildyti ilgiau kaip 6 min. Naudojant tetraciklinų ir gentamicino nustatymo SNAP rinkinius inkubuojama 2 min. toje pačioje temperatūroje.
2-asis etapas. Pašildytas pieno mėginys su konjugatu iš mėgintuvėlio supilamas į SNAP prietaiso mėginio duobutę, mėgintuvėlis išmetamas. Stebima, kaip pieno mėginys slenka per rezultatų laukelį iki mėlyno aktyvacijos apskritimo (tai trunka vidutiniškai apie 30 sek., bet ne ilgiau kaip 1 min.).
3-iasis etapas. Kai aktyvacijos apskritimas ima blukti, nuspaudžiamas SNAP testo aktyvatorius, nelaukiant kol spalva visiškai išnyks. SNAP prietaisas turi būti ant šildytuvo tol, kol išryškės spalva. Beta-laktamų tyrimo rezultatai (kontrolinės ir mėginio dėmės spalva) vizualiai vertinami po 4 min. Spalvos išlieka stabilios 15 min. Tetraciklinų ir gentamicino tyrimų rezultatai vertinami po 7 min. Spalvos išlieka stabilios dar 5 min. Visų trijų testų bendras atlikimo laikas – 9 min.
PASTABA. Naudojant specialų SNAP STOP tirpalą (IDEXX Laboratories, Inc. firmos, JAV, 200 testų, vartojimo laikas – 1 metai), spalvos išlieka stabilios 1 val.
19. Rezultatų vertinimas
Vertinant rezultatus SNAP prietaisas padedamas taip, kad mėginio duobutė būtų kairėje pusėje, o nuspaustas aktyvatorius -dešinėje. Taip padėjus SNAP prietaisą kontrolinė dėmė rezultatų laukelyje visada bus viršuje, o mėginio dėmė – apačioje.
Kai mėginio dėmė tamsesnė už kontrolinę, tiriamajame piene nėra antibiotikų (penicilino mažiau kaip 0,004 TV/ml, tetraciklinų mažiau kaip nuo 0,020 μg/ml iki 0,030 μg/ml, gentamicino mažiau kaip 0,030 μg/ml).
Kai mėginio dėmė šviesesnė už kontrolinę ar tokios pat spalvos, tiriamajame piene yra antibiotikų (penicilino daugiau kaip 0,004 TV/ml, tetraciklinų daugiau kaip nuo 0,020 μg/ml iki 0,030 μg/ml gentamicino daugiau kaip 0,030 μg/ml).
PASTABA Tyrimo rezultatų automatiniam vertinimui galima naudoti prietaisą SNAP Image Reader (IDEXX Laboratories, Inc. JAV).
20. Teigiamų tyrimo rezultatų, gautų SNAP beta-laktamų testais, patvirtinimas
Kai tiriamajame piene rasta antibiotikų, rezultatams patvirtinti gali būti atliekamas pakartotinis tyrimas.
Pakartotinai tiriama naudojant keturis SNAP prietaisus – du tiriamajam pieno mėginiui, vieną – teigiamai kontrolei, antrą -neigiamai kontrolei.
Teigiama kontrolė – etaloninis penicilino G tirpalas, ruošiamas vartojant IDEXX Laboratories, Inc. (JAV) preparatą. Penicilino G preparatų rinkinį sudaro 50 buteliukų, skirtų 100 tyrimų. Buteliukai laikomi šaldytuve arba kambario temperatūroje (nuo 0°C iki 30°C). Prieš vartojimą į buteliuką įpilamas 1 ml žalio maišyto pieno be inhibitorių (užtenka dviems tyrimams). Palaikoma 10 min. ir sumaišoma, atsargiai apverčiant 10 kartų. Gautame tirpale – 0,005 μg/ml penicilino G.
Teigiama kontrolė vartojama įtariamiems teigiamiems rezultatams patvirtinti, naujai SNAP prietaisų partijai ir tyrėjo pasiruošimui patikrinti.
Neigiama kontrolė – pienas be inhibitorių.
Pakartotinio tyrimo rezultatai vertinami taip:
– jeigu teigiama kontrolė rodo, kad antibiotikų rasta, neigiama kontrolė – antibiotikų nerasta, o vienas ar abu tiriamojo pieno mėginiai – teigiami, laikoma, kad tiriamajame piene antibiotikų rasta.
IV. ANTIBIOTIKŲ NUSTATYMAS NAUDOJANT ROSA TESTUS (SPARTUSIS METODAS)
Antibiotikams nustatyti gali būti vartojami keturi skirtingi ROSA (Rapid One Step Assay) testai: beta-laktaminį žiedą turintiems antibiotikams (Charm MRL™ Beta-lactam Test), tetraciklinams (Charm ROSA™ Tetracycline Test), sulfametazinui (Charm ROSA™ Sulfamethazine Test) ir sulfadimetoksinui su sulfametazinu (Charm SDSM ROSA™ Test for Sulfadimetoxine and Sulfamethazine). Neigiami testo rezultatai laikomi patikimais, o teigiami rezultatai, gauti taikant šį metodą, turi būti patvirtinti pakartotiniu tyrimu kartu su teigiama ir neigiama kontrole arba metodu, nurodytu 1991 m. vasario 14 d. Komisijos sprendime 91/180/EEB, nustatančiame tam tikrus žalio ir termiškai apdoroto pieno tyrimų ir analizės metodus, arba to metodo analogais.
Testai vartojami antibiotikams nustatyti žaliame maišytame karvių piene. Mėginiai turi būti atšaldyti nuo 0°C iki 7°C ir ištirti per 5 dienas po jų surinkimo. Pieno mėginys prieš tyrimą kruopščiai išmaišomas. Metodas netinka pienui su pastebimomis baltymų nuosėdomis.
21. Metodo esmė
Visų ROSA testų veikimo principas yra konkurentinė receptorinė reakcija.
Pienas teka chromatografine testo juostele, ir, jeigu jame nėra ieškomų medžiagų, atitinkamoje vietoje išryškėja T (testo) linija. Jeigu ieškomų medžiagų yra, susidaro mažesnio intensyvumo linija. T (testo) linija lyginama su C (kontrolės), kuri parodo artimą didžiausiam leistinam likučių kiekiui koncentraciją.
ROSA testų jautrumas atitinka didžiausius leistinus arba šiek tiek mažesnius antibiotikų likučius piene. Beta-laktaminį žiedą turintiems antibiotikams nustatyti skirtu specialiai Europos Sąjungos rinkai Charm MRLTM Beta-lactam Test (penicilino testu) piene galima aptikti 0,004 μg penicilino G mililitre. Taip pat šis testas reaguoja su kitais beta-laktaminį žiedą turinčiais antibiotikais: amoksicilinu, ampicilinu, cefazolinu, ceftiofuru ir jo metabolitu, cefchinomu, cefaloniumu, cefapirinu, kloksacilinu, dikloksacilinu, oksacilinu, nafcilinu. Charm ROSA“ Tetracycline Test (tetraciklinų testais) galima aptikti nuo 0,015 μg iki 0,020 μg tetraciklino mililitre, nuo 0,070 μg iki 0,100 μg chlortetraciklino mililitre ir nuo 0,070 μg iki 0,100 μg oksitetraciklino mililitre; Charm ROSA™ Sulfamethazine Test (sulfametazino testais) – 0,008 μg sulfametazino mililitre, Charm SDSM ROSA™ Test for Sulfadimetoxine and Sulfamethazine (sulfadimetoksino ir sulfametazino testais) – 0,006 μg sulfadimetoksino mililitre ir 0,008 μg sulfametazino.
22. Įranga
– testo juostelių šildytuvas, kuris palaiko 56°C ± 1°C temperatūrą ir turi laikmatį, pranešantį apie inkubavimo pabaigą;
– šaldytuvas (nuo 0°C iki 7°C);
– šaldyklė (minus 15°C);
– automatinė pipetė su vienkartiniais 300 μl antgaliais;
– portatyvus testų skaitytuvas, kurį tiekia Charm Sciences Inc. firma, JAV.
23. Medžiagos
– ROSA testo juostelės (Charm Sciences Inc. firma, JAV);
– pipetės (300 μl) pienui įpilti (vietoj jų galima vartoti automatinę pipetę su vienkartiniais 300 μl antgaliais);
– penicilino G tabletės (arba kitos etaloninės medžiagos kitos rūšies testams) 0,004 μg penicilino G mililitre tirpalo teigiamai kontrolei paruošti.
PASTABA. Testo juostelės ir kontrolinės medžiagos laikomos nuo 0°C iki 7°C temperatūroje. Prieš vartojimą testo juostelės parą (pageidautina trumpiau) gali būti laikomos kambario (nuo 18°C iki 29°C) temperatūroje. Nepanaudotos tyrimo metu testo juostelės vėl padedamos į šaldytuvą.
25. Tyrimo eiga
ROSA testo juostelė pažymima. Tada atidaromas šildytuvas ir juostelė įdedama į jai skirtą vietą plokščiąja puse į viršų. Plėvelė ant juostelės iš vieno krašto atsargiai atlenkiama iki mėlynos juostos. Pipete suleidžiama 300 μl ± 15 μl tiriamojo pieno. Plėvelė užlenkiama, šildytuvas uždaromas. Automatiškai įsijungia laikmatis. Pasibaigus inkubavimo trukmei (po 8-10 min.), kol skamba garso ir mirksi šviesos signalas, testo juostelė išimama iš šildytuvo, ir jis uždaromas.
26. Rezultatų vertinimas
Juostelė laikoma nukreipus žemyn. Jeigu yra pašalinių medžiagų (pieno, pieno miltelių, dulkių ir t. t.), jos visos atsargiai nuvalomos nuo juostelės. Apžiūrint vertinamos C (kontrolės) ir T (testo) linijos. Jeigu kontrolės linija neišryškėjo, yra trūkinėjanti arba pienas dengia C arba T linijas, tyrimas laikomas negaliojančiu, ir jį reikia pakartoti.
Jei T (testo) linija tamsesnė, ryškesnė už C (kontrolės), tiriamajame piene nėra ieškomų antibiotikų. Kai T (testo) linija šviesesnė už kontrolinę ar tokios pat spalvos, tiriamajame piene gali būti ieškomų antibiotikų (penicilino daugiau kaip 0,004 μg/ ml, tetraciklinų daugiau kaip nuo 0,020 μg/ml iki 0,030 μg/ml ir t. t.).
Laikant juosteles, neigiami rezultatai mažai kinta, o teigiami išryškėja. Išryškintos juostelės kambario temperatūroje išlieka patikimai nepakitusios 10 min, šaldytuve (nuo 0°C iki 7°C) – 1 val., šaldyklėje (minus 15°C ir žemesnėje) – 1 savaitę.
PASTABA. Tyrimo rezultatų skaitmeniniam vertinimui ir duomenų išsaugojimui galima naudoti prietaisą ROSA Reader (Charm Sciences Inc. firmos, JAV) arba Imager ir LUM-T (Charm Sciences Inc. firmos, JAV).
V. ANTIBIOTIKŲ, TURINČIŲ BETA-LAKTAMINĮ ŽIEDĄ, NUSTATYMAS NAUDOJANT CHARM II SISTEMĄ (SPARTUSIS METODAS)
27. Metodo esmė
CHARM II sistema remiasi radioreceptoriniu principu. Testas skirtas beta-laktaminį žiedą turintiems antibiotikams nustatyti žaliame maišytame karvių piene.
CHARM II sistemos jautrumas beta-laktaminį žiedą turintiems antibiotikams parodytas 1 lentelėje.
1 lentelė
| Antibiotiko pavadinimas |
ES didžiausi leistini antibiotikų likučių kiekiai, μg/kg (angl. MRL – Maximum Residue Limits) |
Charm II sistemos metodo jautrumas, antibiotiko μg/kg |
| Amoksicilinas |
4 |
5 |
| Ampicilinas |
4 |
4 |
| Cefazolinas |
50 |
15 |
| Ceftiofuras + metabolitai |
100 |
40 |
| Cefchinomas |
20 |
20 |
| Cefapirinas |
60 |
3 |
| Kloksacilinas |
30 |
30 |
| Dikloksacilinas |
30 |
20 |
| Nafcilinas |
30 |
30 |
| Oksacilinas |
30 |
30 |
| Penetamatas |
4 |
2 |
| Penicilinas G |
4 |
2 |
PASTABA Testų jautrumas nustatytas statistiškai apskaičiuojant, kokia antibiotiko koncentracija duoda 90% teigiamų rezultatų.
Testui vartojami specifiniai bakteriniai receptoriai, nustatyti beta-laktaminį žiedą turinčius antibiotikus. Taip pat į pieno mėginį dedama radioaktyviu izotopu žymėtos medžiagos, pagal struktūrą ir biologinį veikimą panašios į ieškomą antibiotiką. Beta-laktaminį žiedą turintiems antibiotikams nustatyti vartojamas 14C izotopu žymėtasis penicilinas. Jei tiriamajame pieno mėginyje yra kurio nors beta-laktaminį žiedą turinčio antibiotiko, jis konkuruoja su žymėtuoju penicilinu dėl receptorių surišimo vietų. Scinciliacijos/ liuminescencijos skaitikliu nustatomas surišto žymėtojo 14C izotopu penicilino kiekis, kuris lyginamas su kontrolinio taško verte. Kuo didesnis žymėtojo penicilino kiekis nustatomas, tuo mažiau tiriamame mėginyje beta-laktaminį žiedą turinčių antibiotikų, kuo mažesnis – tuo daugiau.
28. Įranga
Įranga, esanti komplekte:
– scinciliacijos/liuminescencijos skaitiklis, modelis 6600 (Charm Sciences Inc., JAV);
– 13 mm ×16 mm borosilikato stiklo mėgintuvėliai su plastikiniais kamšteliais;
– medvilniniai tamponėliai;
– 5 ml pipetė;
– 300 μl pipetė;
– mėgintuvėlių šildytuvas, kuriame palaikoma nuo 63°C iki 67°C temperatūra;
– mėgintuvėlių centrifuga (1200 g);
– mėgintuvėlių purtyklė (Vortex).
Įranga, kurios nėra komplekte (galima įsigyti iš Charm Sciences Inc., JAV):
– mėgintuvėlių žymeklis, atliekų konteineris ir tablečių išėmiklis;
– graduotas cilindras, 100 ml vardinio tūrio;
– stiklinis termometras, padalos vertė 0,5°C;
– mėgintuvėlių stovas, dvylikai vienetų.
29. Medžiagos ir reagentai
Charm II sistemos rinkinys (Charm Sciences Inc., JAV), kuriame yra:
– geltonos spalvos 14C žymėtojo penicilino tabletės, supakuotos po vieną (kiekviena geltona tabletė turi 0,15 kilobekerelių (kBq));
– žalios spalvos bakterinių receptorių tabletės, supakuotos po vieną;
– scinciliacijos skystis „Opti-Fluor“ reikalingas tam, kad būtų galima išmatuoti su bakteriniais receptoriais surišto 14C izotopu žymėtojo penicilino kiekį. 14C izotopo išspinduliuojami gama kvantai „Opti-Fluor“ transformuojami į matomos šviesos impulsus, kurie ir registruojami scinciliacijos/liuminescencijos skaitiklyje;
– penicilino G etalonas 4,5 ppb (0,008 TV/ml) – teigiamai kontrolei paruošti. Prieš naudojimą etalonas ištirpinamas 100 ml pasterizuoto pieno, be beta-laktaminį žiedą turinčių antibiotikų. Tam galima vartoti ir neigiamą kontrolę. Ištirpintas etalonas gerai supurtomas, įstatomas į indą su ledais ir palaikomas apie 15 min. prieš tyrimą;
– pieno milteliai, pagaminti iš pieno be inhibitorių, skirti neigiamai kontrolei paruošti. Prieš vartojimą milteliai ištirpinami 100 ml 37°C temperatūros distiliuoto ar dejonizuoto vandens. Neigiamai kontrolei galima naudoti žalią arba pasterizuotą pieną, kurio beta-laktaminį žiedą turinčių antibiotikų kiekis, apskaičiavus 3-jų matavimų vidurkį, atitinka neigiamos kontrolės vertę ± 10 %. Ištirpintas etalonas gerai supurtomas, įstatomas į indą su ledais ir palaikomas apie 15 min. prieš tyrimą.
Reagentai laikomi:
– geltonos ir žalios tabletės laikomos minus 15°C arba žemesnėje temperatūroje. Iš šaldyklės reikia išimti tiek tablečių, kiek bus suvartota per vieną dieną. Tabletės kambario temperatūroje gali būti laikomos iki 12 val.;
– scinciliacijos skystis „Opti-Fluor“ laikomas kambario temperatūroje;
– sausas penicilino G etalonas teigiamai kontrolei paruošti laikomas nuo 0°C iki 4,4°C temperatūroje. Ištirpintas etalonas gali būti laikomas 2 dienas nuo 0°C iki 4,4°C temperatūroje. Išpilsčius po 6 ml į mikromėgintuvėlius ir sušaldžius (minus 15°C temperatūroje), etalonas gali būti laikomas 2 mėn. Etalonas turi būti sušaldomas per 6 val. po ištirpinimo. Norint atšildyti etaloną, jis palaikomas po tekančio šilto vandens srove, supurtomas ir patikrinama, ar nesusidarė nuosėdų. Atšildytas etalonas laikomas nuo 0°C iki 4,4°C temperatūroje ir turi būti sunaudotas per 24 val.;
PASTABA Pakartotinai sušaldyti negalima.
– pieno milteliai, skirti neigiamai kontrolei paruošti, laikomi nuo 0°C iki 4,4°C temperatūroje. Ištirpintas neigiamos kontrolės etalonas gali būti laikomas 3 dienas nuo 0°C iki 4,4°C temperatūroje. Sušaldžius (minus 15°C) etalonas gali būti laikomas 2 mėn.
30. Pasiruošimas tirti
30.1. Mėginių ėmimas.
Mėginių ėmimas – labai svarbi tyrimo dalis. Būtina užtikrinti, kad laboratoriją pasiektų nepažeisti ir nesukeisti pieno mėginiai. Pieno mėginys turi būti ištirtas per 5 dienas po melžimo (saugant sandariame indelyje nuo 0°C iki 4,4°C temperatūroje). Prieš tyrimą mėginys gerai supurtomas.
Tiriant individualių karvių pieną arba labai riebų pieną (> 5 %), patartina jį centrifuguoti 3 min. centrifuga, sukuriančia 1200 g pagreitį.
30.2. Kontrolinio taško nustatymas.
Kontrolinis taškas nustatomas 6 kartus išmatavus penicilino G etalono tirpalą (teigiamą kontrolę) ir apskaičiavus gautų verčių vidurkį. Vidurkis padauginamas iš 1,25 – tai ir yra kontrolinis taškas. Visų 6 matavimų vertės turi būti mažesnės už kontrolinį tašką. Jeigu matavimo vertės kitokios – visa procedūra kartojama iš naujo.
Neigiamos kontrolės matavimai atliekami 3 kartus ir apskaičiuojamas vidurkis – nulinis taškas. Kontrolinis ir nulinis taškai nustatomi kiekvieną kartą, gavus naujos serijos reagentus.
Kiekvieną dieną išmatuojama teigiama ir neigiama kontrolė – tokiu būdu patikrinamas analizatoriaus veikimas.
Neigiamos kontrolės vertė turi būti ± 20 % ribose, lyginant su nuliniu tašku.
Teigiamos kontrolės vertė turi būti mažesnė už kontrolinio taško.
31. Tyrimo eiga
Mėgintuvėliai pažymimi ir į kiekvieną įdedama po žalią tabletę su bakteriniais receptoriais. Į kiekvieną mėgintuvėlį įlašinama po 300 μl ± 100 μl distiliuoto (dejonizuoto) vandens. Tabletės tirpinamos, įstačius mėgintuvėlį į Vortex purtyklę ir leidžiant tirpalui 10 kartų pakilti iki mėgintuvėlio viršaus ir nusileisti. Pieno mėginiai bei kontroliniai etalonai kruopščiai išmaišomi ir keičiant pipetės antgalius išpilstomi po 5 ml ± 0,25 ml. Pieno temperatūra turi būti nuo 0°C iki 7°C. Išmaišoma, įstačius mėgintuvėlius į Vortex purtyklę ir leidžiant tirpalui 10 kartų pakilti iki mėgintuvėlio viršaus ir nusileisti.
Mėgintuvėliai laikomi 2 min. nuo 63°C iki 67°C temperatūroje.
Tada mėgintuvėliai išimami iš šildytuvo, ir į kiekvieną mėgintuvėlį įdedama po geltoną tabletę. Įstačius mėgintuvėlius į Vortex purtyklę, leidžiama tirpalui 10 kartų pakilti iki mėgintuvėlio viršaus ir nusileisti.
ĮSPĖJIMAS. Tabletės įdėjimas ir ištirpinimas visuose mėgintuvėliuose turi užtrukti ne ilgiau kaip 40 sek.
Mėgintuvėliai laikomi 2 min. nuo 63°C iki 67°C temperatūroje.
Centrifuguojama 3 min. Išėmus mėgintuvėlį iš centrifugos, pienas nedelsiant nupilamas. Jeigu reikia, medvilnės tamponėliu suardomas riebalų žiedas.
Medvilnės tamponėliu riebalų likučiai nuvalomi nuo vidinių mėgintuvėlio sienelių. Dugne esančios nuosėdos neliečiamos.
Į kiekvieną mėgintuvėlį įlašinama po 300 μl ± 100 μl distiliuoto (dejonizuoto) vandens ir gerai išmaišoma Vortex purtyklėje, kad nuosėdos pereitų į suspensiją.
Į kiekvieną mėgintuvėlį įlašinama 3,0 ml ± 0,5 ml scinciliacijos skysčio. Mėgintuvėlis užkemšamas ir vartomas tol, kol tirpalas taps vienalytis.
Mėgintuvėlis įstatomas į scinciliacijos/liuminescencijos skaitiklį ir, pasirinkus 14C kanalą, per 60 sek. užrašomi rezultatai (skaičius per minutę, angl. cpm).
32. Rezultatų vertinimas
Kontrolinis taškas yra riba tarp neigiamo ir įtariamo teigiamo rezultato.
Kai tiriamojo mėginio cpm vertė yra didesnė už kontrolinį tašką – rezultatas neigiamas.
Kai tiriamojo mėginio cpm vertė yra mažesnė arba lygį kontroliniam taškui – rezultatas teigiamas.
Įtariamas teigiamas mėginys turi būti pakartotinai ištirtas:
– jeigu tiriamo mėginio cpm vertė yra 50 cpm didesnė už kontrolinį tašką – tyrimas kartojamas;
– jeigu pakartojus gauta vertė yra didesnė už kontrolinį tašką – rezultatas neigiamas;
– jeigu pakartojus tyrimą gauta vertė yra mažesnė už kontrolinį tašką arba jam lygi – įtariamas teigiamas rezultatas: tyrimas kartojamas pagal 33 punktą.
33. Patvirtinimas
Įtariami teigiami mėginiai tiriami kartu su teigiamos ir neigiamos kontrolės etalonais. Šie etalonai turi būti paruošti iš kitų reagentų buteliukų (nevartotų kontroliniam ir nuliniam taškui nustatyti). Patvirtinimo rezultatai vertinami taip:
– neigiama kontrolė turi būti 20 % didesnė už nulinį tašką;
– teigiama kontrolė turi būti mažesnė už kontrolinį tašką.
Jeigu kontrolės atitinka visas sąlygas, o tiriamojo mėginio cpm vertė yra mažesnė už kontrolinį tašką arba jam lygi – rezultatas teigiamas.