LIETUVOS RESPUBLIKOS VALSTYBINĖS AUGALŲ APSAUGOS TARNYBOS VIRŠININKAS
Į S A K Y M A S
DĖL BAKTERIJOS CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL. SSP. SEPEDONICUS (SPIECKERMANN ET KOTTHOFF) DAVIS ET AL., SUKELIANČIOS ŽIEDINĮ PUVINĮ, DIAGNOZAVIMO, NUSTATYMO IR IDENTIFIKAVIMO TYRIMO METODIKOS PATVIRTINIMO
2007 m. balandžio 3 d. Nr. A1-091
Vilnius
Vadovaudamasis Bulvių žiedinio puvinio fitosanitarinės kontrolės ir fitosanitarijos priemonių taikymo taisyklių, patvirtintų Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2007 m. vasario 28 d. įsakymo Nr. 3D-97 (Žin., 2007, Nr. 29-1061), 4 punktu:
1. Tvirtinu Bakterijos Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al, sukeliančios žiedinį puvinį, diagnozavimo, nustatymo ir identifikavimo tyrimo metodiką (pridedama).
2. Pripažįstu netekusiu galios Lietuvos Respublikos valstybinės augalų apsaugos tarnybos viršininko 2006 m. kovo 10 d. įsakymą Nr. A1-63 „Dėl Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff 1914) Davis, Gillaspie, Vidaver et Harris 1984 nustatymo ir diagnozavimo metodikos patvirtinimo“.
PATVIRTINTA
Valstybinės augalų apsaugos tarnybos
viršininko
2007 m. balandžio 3 d. įsakymu Nr. A1-091
BAKTERIJOS CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL. SSP. SEPEDONICUS (SPIECKERMANN ET KOTTHOFF) DAVIS ET AL., SUKELIANČIOS ŽIEDINĮ PUVINĮ, DIAGNOZAVIMO, NUSTATYMO IR IDENTIFIKAVIMO TYRIMO METODIKA
Ši metodika parengta vadovaujantis ir įgyvendinant 2006 m. birželio 18 d. Komisijos direktyvą 2006/56/EB, iš dalies keičiančią Tarybos direktyvos 93/85/EEB dėl bulvių žiedinio puvinio kontrolės priedus (OL, 2006, L 182, p. 1). Šioje metodikoje pateikiami bakterijos Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., sukeliančios žiedinį puvinį, nustatymo ir diagnozavimo metodai.
TYRIMO PLANO TAIKYMO SRITIS
Pateiktame plane aprašomos įvairios procedūros, taikomos:
PAGRINDINIAI PRINCIPAI
Įvairios tinkamiausios metodikos, patvirtinti reagentai ir duomenys apie pasirengimą testui bei kontrolines medžiagas pateikiami priedėliuose. Laboratorijų, dalyvavusių optimizuojant ir tvirtinant metodikas, sąrašas pateikiamas 1 priedėlyje.
Metodikose numatyta karantine laikomą organizmą ir gyvybingas C. m. subsp. sepedonicus kultūras naudoti kaip kontrolines medžiagas, todėl tinkamomis karantino sąlygomis ir oficialių augalų karantino įstaigų išduotose licencijose atitinkamomis nurodytomis sąlygomis reikės atlikti procedūras, taikant atitinkamą atliekų pašalinimo metodą.
Testavimo parametrai privalo užtikrinti nuolatinį ir atkartojamą C. m. subsp. sepedonicus aptikimo lygmenį, esant nustatytoms pasirinktų metodų detekcijos slenkstinėms riboms.
Privaloma tiksliai paruošti teigiamas kontrolines medžiagas.
Atliekant tyrimą atsižvelgus į reikalaujamas metodo jautrumo slenkstines ribas taip pat daroma prielaida, kad reikia pasirinkti teisingus nustatymus, atlikti įrangos kalibravimą ir techninę priežiūrą, rūpestingai tvarkyti ir saugoti reagentus ir imtis visų priemonių, kad būtų išvengta kryžminio bandinių užsikrėtimo, t. y. teigiamus kontrolinius bandinius atskirti nuo tiriamųjų bandinių. Siekiant išvengti administracinių ir kitokių klaidų, ypač susijusių su ženklinimu etiketėmis ir dokumentų tvarkymu, privaloma taikyti kokybės kontrolės standartus.
Įtarus organizmo buvimą, kaip nurodyta Direktyvos 93/85/EEB 4 straipsnio 2 dalyje, daroma prielaida, kad atliekant bandinio diagnostinį arba atrankos testą gaunamas teigiamas rezultatas, kaip nurodyta vaizduojamose diagramose.
Jei pirmojo atrankos testo (IF arba PGR/FISH) rezultatas teigiamas, tai įtariamas užkrėtimas C. m. subsp. sepedonicus ir privaloma atlikti antrąjį atrankos testą. Jei antrojo atrankos testo rezultatas teigiamas, tai įtarimas (įtariamas organizmo buvimas) patvirtinamas ir išsiunčiamas pranešimas apie karantininio organizmo įtarimą ir būtina toliau atlikti tyrimą pagal nurodytą planą. Jei antrojo atrankos testo rezultatas neigiamas, tada bandinys nėra laikomas užkrėstu C. m. subsp. sepedonicus.
Taigi 4 straipsnio 2 dalyje nurodyto IF testo rezultatas yra teigiamas, kaip apibrėžta pagal IF testo parodymus, patvirtinimui atlikus antrąjį atrankos testą (PGR/FISH).
Jei organizmo buvimas patvirtinamas, tai padaroma prielaida, kaip nurodyta Direktyvos 93/85/EEB 5 straipsnio 1 dalyje, kad buvo išskirta ir identifikuota patogeninė grynoji C. m. subsp. sepedonicus kultūra.
1. VAIZDUOJAMOSIOS DIAGRAMOS PRISTATYMAS
1.1. Žiedinio puvinio diagnozavimo bulvių stiebagumbiuose ir augaluose planas
Ši tyrimo tvarka taikoma tiriant bulvių stiebagumbius ir augalus, turinčius arba įtariamus turint tipinių žiedinio puvinio simptomų. Ją taikant atliekamas greitosios atrankos testas, patogeno išskyrimas iš užkrėsto vaskuliarinio audinio ir pasėjimas į kultūrinę terpę ir, gavus teigiamą rezultatą, C. m. subsp. sepedonicus kultūros identifikavimas.
__________________
(1) Simptomų aprašymas pateikiamas 2 skirsnyje.
(2) Atitinkami testai:
– IF testas (4 skirsnis),
– PGR testas (6 skirsnis),
– FISH testas (5 skirsnis).
(3) Nors patogeno išskyrimas iš tipiškų simptomų turinčios augalinės medžiagos praskiedimo būdu atliekamas tiesiogiai, paskesnėse užkrėtimo stadijose kultūros gali neaugti. Saprofitinės bakterijos, augančios ant sergančio audinio, gali peraugti arba slopinti patogeno augimą kultūroms auginti skirtoje terpėje. Todėl rekomenduojama naudoti abi: ne selektyvią ir selektyvią terpes, pirmiausia MTNA (8 skirsnis) arba biotestą(7 skirsnis).
(4) Tipiškos morfologijos kolonijos aprašymas pateikiamas 8 skirsnyje.
(5) Jei išskyrimo testo rezultatas neigiamas, o ligos simptomai tipiški, tokiu atveju privaloma pakartoti išskyrimą.
(6) Cm. subsp. sepedonicus kultūros grynumas patikimai identifikuojamas tik atliekant 9 skirsnyje išvardytus testus.
(7) Patogeniškumo testas aprašytas 10 skirsnyje.
1.2. Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus nustatymo ir identifikavimo besimptomiuose bulvių stiebagumbių bandiniuose planas
Principas
Testavimo tvarka skirta bulvių stiebagumbių latentinėms infekcijoms nustatyti. Išskiriant patogeną, ypač tipiškų kolonijų atveju, o vėliau tvirtinant jo kolonijų grynumą, kaip Cm. subsp. sepedonicus atveju, privaloma papildomai atlikti du atrankos testus, pagrįstus skirtingais biologijos principais, ir gauti teigiamą rezultatą. Tik vieno atrankos testo teigiamo rezultato nepakanka, kad būtų galima įtarti bandinį.
Atrankos ir išskyrimo testų slenkstinė nustatymo jautrumo riba turėtų siekti 103–104 ląstelių/ml pakartotinai suspenduotose nuosėdose, naudojamose kaip teigiami kontroliniai bandiniai atliekant kiekvieną testų seriją.
(1) Standartinį bandinį sudaro 200 stiebagumbių, tačiau šią tvarką galima taikyti mažesniems nei 200 stiebagumbių bandiniams, turint mažiau stiebagumbių.
(2) Patogeno išskyrimo ir koncentravimo metodai aprašyti 3.1 skirsnyje.
(3) Jei bent dviejų testų, besiskiriančių pagal biologinius atlikimo principus, rezultatai teigiami, būtina atlikti išskyrimą ir patvirtinimą. Atliekamas bent vienas atrankos testas. Jei šio testo rezultatas neigiamas, bandinys laikomas neigiamu. Jei šio testo rezultatas teigiamas, reikalaujama atlikti du ar daugiau atrankos testų, besiskiriančių pagal biologinius principus, pirmajam teigiamam rezultatui patvirtinti. Jei antrojo testo arba kitų testų rezultatai neigiami, bandinys laikomas neigiamu. Paskesnių testų nereikalaujama atlikti.
(4) Imunofluorescencijos (IF) testas.
Atliekant imunofluorescencijos testą, visada naudojami polikloniniai antikūnai, o papildomi monokloniniai antikūnai gali suteikti papildomo specifiškumo (žr. 4 skirsnį).
(5) PGR testas.
Naudoti atitinkamai patvirtintus PGR reagentus ir metodikas (žr. 6 skirsnį).
(6) Fish testas.
Naudoti atitinkamai patvirtintus reagentus ir metodikas (žr. 5 skirsnį).
(7) Selektyvus išskyrimas.
Auginimas MTNA arba NCP-88 terpėje ir pakartotinai suspenduotų nuosėdų praskiedimas santykiu 1:100 dauguma atvejų yra tinkamas C. m. subsp. sepedonicus tiesioginio išskyrimo metodas. Tipiškos kolonijos gaunamos praėjus 3–10 dienų nuo pasėjimo į lėkšteles. Po to patogeną galima išgryninti ir identifikuoti. Atliekant testą, kad būtų panaudotos visos jo teikiamos galimybės, išpjautus stiebagumbio viršūnės šerdies gabaliukus reikia kruopščiai paruošti, kad būtų išvengta antrinių bakterijų, užkrečiančių stiebagumbius, kurios augimo terpėje yra C. m. subsp. sepedonicus antagonistai, infekcijos, nes jos gali peraugti patogeną. Jei auginimo lėkštelėse testas nepavyksta, patogeną reikia išskirti iš biotestui naudojamų augalų (žr. 8 skirsnį).
(8) Biotestas taikomas C. m. subsp. sepedonicus išskirti iš bulvių ekstrakto nuosėdų selektyvaus praturtinimo baklažanuose (Solanummelongena) būdu. Atliekant testą, privaloma laikytis optimalių inkubavimo sąlygų, kaip nurodyta šio metodo aprašyme. C. m. subsp. sepedonicus augimą MTNA ar NCP-88 terpėje slopinančios bakterijos netrukdys atlikti šio testo (žr. 7 skirsnį).
(9) Tipiška kolonijų morfologija apibūdinta 8 skirsnyje.
(10) Auginimo terpėje arba biotesto rezultatai gali būti neigiami dėl saprofitinių bakterijų konkurencijos arba vykdomo slopinimo. Jei atrankos testų rezultatai teigiami, o išskyrimo testų rezultatai neigiami, reikia pakartoti išskyrimo iš tų pačių nuosėdų testus arba naudojant papildomą vaskuliarinį audinį, paimtą šalia to paties bandinio stiebagumbių viršūnės gabaliukų išpjovimo vietos, jei būtina ištirti papildomus bandinius.
(11) Siekiant patikimai identifikuoti grynas galimas C. m. subsp. sepedonicus kolonijas, reikia atlikti 9 skirsnyje aprašytus testus. (12) Patogeniškumo testas aprašytas 10 skirsnyje.
1.3. Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus nustatymo ir identifikavimo besimptomiuose bulvių augaluose planas
(1) Žr. 3.2 skirsnį dėl rekomenduojamų bandinio dydžių.
(2) Patogeno išskyrimo ir koncentravimo metodai aprašyti 3.2 skirsnyje.
(3) Jei bent dviejų pagal biologinius principus besiskiriančių testų rezultatai teigiami, reikia atlikti išskyrimą ir patvirtinimą.
Atliekamas mažiausiai vienas atrankos testas. Jei šio testo rezultatas neigiamas, bandinys laikomas neigiamu. Tuo atveju, kai šio testo rezultatas teigiamas, reikalaujama atlikti antrą testą arba daugiau pagal biologinius principus besiskiriančių testų pirmajam teigiamam rezultatui patvirtinti. Jei antrojo testo arba kitų testų rezultatai neigiami, bandinys laikomas neigiamu. Paskesnių testų atlikti nereikia.
(4) Selektyvaus išskyrimo testas ir tipiška kolonijų morfologija aprašyti 8 skirsnyje.
(5) IF testas aprašytas 4 skirsnyje.
(6) PGR testai aprašyti 6 skirsnyje.
(7) FISH testas aprašytas 5 skirsnyje.
(8) Biotestas aprašytas 7 skirsnyje.
(9) Auginimo terpėje arba biotesto rezultatai gali būti neigiami dėl saprofitinių bakterijų keliamos konkurencijos arba slopinimo. Kai atrankos testų rezultatai yra teigiami, tačiau išskyrimo testų rezultatai neigiami, išskyrimo testai pakartojami, jei būtina, tiriant papildomus bandinius.
(10) Siekiant patikimai identifikuoti galimas grynas C. m. subsp. sepedonicus kolonijas, reikia atlikti 9 skirsnyje aprašytus testus.
(11) Patogeniškumo testas aprašytas 10 skirsnyje.
2. VIZUALINIS ŽIEDINIO PUVINIO SIMPTOMŲ TYRIMAS
2.1. Bulvių augalai
Europos klimato sąlygomis simptomai labai retai stebimi lauke ir dažnai tik vegetacijos laikotarpio pabaigoje. Be to, šie simptomai dažnai yra paslėpti ir (arba) painiojami su kitomis ligomis, senėjimu ar mechaniniais augalų pažeidimais. Taigi, atliekant patikrinimus lauko sąlygomis, labai lengva simptomų nepastebėti. Vytimo simptomai labai skiriasi nuo rudojo puvinio simptomų; paprastai vytimas vyksta labai lėtai ir iš pradžių stebimas tik lapų pakraščiuose. Jauni užkrėsti lapai toliau auga, išskyrus užkrėstas lapo dalis, kurios auga lėčiau. Dėl to susiformuoja keistų formų lapai. Lapų, patyrusių pažeidimą dėl stiebo vaskuliarinių audinių vystymosi blokavimo, žalia spalva dažnai išblunka ir juose susidaro geltonos ir oranžinės spalvos zonos tarp lapo gyslų. Pažeisti lapai, sudėtinių lapų lapeliai ir netgi stiebai gali visiškai sunykti. Dažnai lapų ir stiebagumbių dydis sumažėja. Išimtiniais atvejais augai būna žemaūgiai. Simptomų spektro spalvotus atvaizdus galima rasti tinklavietėje http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main
2.2. Bulvių stiebagumbiai
Pirminiai simptomai yra tam tikras audinio skaidrumas arba peršviečiamumas, neminkštėjimas aplink vaskuliarinę sistemą, ypač prie viršūnės. Vaskuliarinis žiedas prie viršūnės gali būti šiek tiek tamsesnės spalvos negu paprastai. Pirmasis lengvai nustatomas simptomas – vaskuliarinis žiedas yra gelsvas, o švelniai paspaudus gumbą iš indų pradeda sunktis į sūrio konsistenciją panaši medžiaga. Šioje besisunkiančioje medžiagoje yra milijonai bakterijų. Šioje stadijoje vaskuliarinis audinys gali paruduoti ir stiebagumbio simptomai yra panašūs į Ralstonia solanaceamm sukeliamo rudojo puvinio simptomus. Iš pradžių šie simptomai gali būti matomi tik vienoje žiedo dalyje, nebūtinai prie viršūnės, ir palaipsniui gali išplisti visame žiede. Užkratui plintant, vaskuliarinis audinys žūva; išorinė žievės dalis gali atsiskirti nuo vidinės žievės. Vėlesnėse užkrėtimo stadijose stiebagumbio paviršiuje atsiranda įtrūkimų, kurių pakraščiai dažnai būna raudonai rudi. Neseniai Europoje buvo užregistruota keletas atvejų, kai centrinės žievės puvinys vyko tuo pačiu metu kaip ir vaskuliarinio žiedo, o tai sąlygojo tuščiaviduriškumo ir nekrozės atsiradimą. Antrinis užkrėtimas bakterijomis arba grybais gali užmaskuoti simptomus ir gali būti sunku, netgi neįmanoma, vėlyvuosius žiedinio puvinio simptomus atskirti nuo kitų stiebagumbių puvinių. Gali pasitaikyti ir netipiškų simptomų. Simptomų spektro spalvotus atvaizdus galima rasti tinklavietėje http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main
3. BANDINIO PARUOŠIMAS
3.1. Bulvių stiebagumbiai
Pastabos:
– Standartinis vienam testui skirto bandinio dydis – 200 stiebagumbių. Intensyvesnės imties atveju reikia atlikti daugiau šio dydžio bandinio testų. Dėl didesnio stiebagumbių skaičiaus viename bandinyje neįmanoma arba sunku aiškinti rezultatus. Tačiau šią tvarką galima taikyti mažesniems nei 200 stiebagumbių bandiniams, turint mažiau stiebagumbių.
– Visų toliau aprašytų aptikimo metodų patvirtinimas pagrįstas 200 stiebagumbių bandinių tyrimu.
– Toliau aprašytą bulvių ekstraktą taip pat galima naudoti aptinkant bulvių rudojo puvinio sukėlėją – bakteriją Ralstonia solanaceamm.
Galima atlikti išankstinį apdorojimą prieš bandinio paruošimą:
Nuplauti stiebagumbius. Naudoti atitinkamus dezinfektantus (chloro junginius, kai PGR testas bus naudojamas ir kad pašalintų galimo patogeno DNR ir detergentus, skirtus kiekvienam bandiniui. Stiebagumbiai išdžiovinami oru. Ši plovimo tvarka ypač naudinga (bet jos taikyti nereikalaujama), kai naudojami bandiniai, turintys dirvožemio perteklių ir kai būtina atlikti PGR testą arba taikyti kitą tiesioginį DNR išskyrimo metodą.
3.1.1. Kiekvieno stiebagumbio viršūnės oda pašalinama švariu ir dezinfekuotu skalpeliu arba daržovėms pjaustyti skirtu peiliu taip, kad vaskuliarinis audinys taptų matomas. Kruopščiai išpjaunamas stiebagumbio viršūnės vaskuliarinio audinio gabaliukas taip, kad nevaskuliarinio audinio butų kuo mažiau (žr. tinklavietę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main).
Pastaba.
Atskirti bet kurį stiebagumbį su įtariamais žiedinio puvinio simptomais ir ištirti atskirai.
Jei šalinant stiebagumbio viršūnę pastebimi įtariami žiedinio puvinio simptomai, nupjovus stiebagumbio dalį prie viršūnės reikia vizualiai apžiūrėti stiebagumbį. Bet kurį perpjautą stiebagumbį reikia laikyti dvi dienas kambario temperatūroje, kad šis sukamštėtų, o vėliau laikyti karantino sąlygomis (4–10 °C temperatūroje), kol bus atlikti visi testai. Visus vienam bandiniui priklausančius stiebagumbius (įskaitant stiebagumbius su įtariamais simptomais) reikėtų laikyti taip, kaip nurodyta II priede.
3.1.2. Stiebagumbių viršūnių gabaliukai surenkami į nepanaudotas vienkartines talpyklas, kurias galima uždaryti ir (arba) užplombuoti (tuo atveju, kai jos naudojamos pakartotinai, jau panaudotas talpyklas reikėtų kruopščiai išvalyti ir dezinfekuoti chloro junginiais). Pirmiausia stiebagumbių viršūnių gabaliukus reikėtų nedelsiant apdoroti. Jei tai padaryti neįmanoma, jie saugomi talpykloje, nepridedant buferio, šaltai ne ilgiau kaip 72 valandas arba kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas. Gabaliukų džiūvimas, kamštėjimas ir saprofitinių bakterijų augimas gali kliudyti aptikti žiedinį puvinį sukeliančią bakteriją.
3.1.3. Stiebagumbio viršūnės gabaliukai apdorojami taikant vieną iš šių procedūrų:
a) Gabaliukai pamerkiami į pakankamą (apie 40 ml) ekstrahavimo buferinio tirpalo tūrį (3 priedėlis) ir 4 valandas žemesnėje nei 24 °C temperatūroje kratomi rotorine kratykle (50–100 rpm), arba 16–24 valandas laikomi šaldytuve, arba
b) Gabaliukai pakankamame (apie 40 ml) ekstrahavimo buferinio tirpalo tūryje (3 priedėlis) homogenizuojami naudojant maišyklę (pvz., Waring arba Ultra Thurax) arba juos sutraiškant užplombuotame vienkartiniame mirkymo maišelyje (pvz., Stomacher ar Bioreba tvirto polietileno maišelyje, 150 mm x 250 mm; sterilizuotame apšvita) guma dengtu mediniu plaktuku arba atitinkamu malimo prietaisu (pvz., Homex).
Pastaba.
Bandinių kryžminio užsikrėtimo rizika yra ypač didelė, kai bandiniai homogenizuojami naudojant maišyklę. Atsargumo priemonių imamasi stengiantis išvengti aerozolio susidarymo arba nuotėkio išskyrimo metu. Užtikrinama, kad kiekvienam bandiniui būtų naudojami atskiri ką tik sterilizuoti maišyklės peiliai ir indai. Jei atliekamas PGR testas, stengiamasi išvengti DNR pernešimo į talpyklas ar malimo aparatą. Atliekant PGR testą malimą rekomenduojama atlikti vienkartiniuose maišeliuose ir vienkartiniuose vamzdeliuose.
3.1.4. Viršnuosėdinis skystis nupilamas. Jei jis pernelyg drumstas, yra skaidrinamas lėtai centrifuguojant (ne didesniu kaip 180 g greičiu 10 minučių 4–10 0C temperatūroje) arba filtravimu vakuume (40–100 mM), perplaunant filtrą papildomu (10 ml) ekstrahavimo buferiniu tirpalu (3 priedėlis).
3.1.5. Bakterijos frakcija koncentruojama centrifuguojant 7 000 g greičiu 15 minučių (arba 10 000 g greičiu 10 minučių) 4–10 °C temperatūroje ir viršnuosėdinis skystis nupilamas nepažeidžiant nuosėdų.
3.1.6. Nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 1,5 ml nuosėdų buferiniame tirpale (3 priedėlis). Naudojama 500 ml tirpalo C. m. subsp. sepedonicus tyrimams, 500 ml tirpalo Ralstonia solanacearum tyrimams ir 500 ml tirpalo lyginamiesiems tyrimams. Pripilama sterilaus glicerino į 500 ml lyginamąją ir likutinę bandinio dalis, kad galutinė koncentracija siektų 10–25 % (tūris/tūris), sumaišoma ir saugoma -16–24°C temperatūroje (savaites) arba -68–86 °C temperatūroje (mėnesius). Tyrimo metu tiriamosios alikvotinės bandinio dalys saugomos 4–10 °C temperatūroje.
Kartotinis sušaldymas ir tirpdymas nerekomenduotini.
Jei ekstraktą reikia vežti, jis pristatomas šaldomoje dėžėje per 24–48 valandas.
3.2. Bulvių augalai
Pastaba.
Kad būtų aptiktos latentinės C. m. subsp. sepedonicus populiacijos, rekomenduojama tirti sudėtinius bandinius. Ši tvarka gali būti sėkmingai taikoma tiriant 200 stiebo dalių sudėtinius bandinius. Atliekant apžiūras, rekomenduojama naudoti statistiškai patikimą tiriamosios augalo populiacijos bandinį.
3.2.1. Nuo kiekvieno stiebo pagrindo virš pat dirvos sluoksnio atpjaunamas 1–2 cm segmentas švariu dezinfekuotu peiliu arba genėjimui skirtu sekatoriumi.
Stiebo segmentai trumpai dezinfekuojami 70 % etanoliu ir nedelsiant išdžiovinami sugeriamuoju popieriumi.
Stiebo segmentai surenkami į uždarą sterilią talpyklą šia bandinių imties tvarka:
3.2.2. Stiebo segmentai apdorojami taikant vieną iš šių procedūrų:
a) Segmentai pamerkiami į pakankamo tūrio (apytiksliai 40 ml) ekstrahavimo buferinį tirpalą (3 priedėlis) ir 4 valandas maišomi besisukančia kratykle (50–100 rpm greičiu) mažesnėje nei 24 °C temperatūroje arba laikomi šaldytuve 16–24 valandas, arba
b) Apdorojami nedelsiant, sumalant segmentus tvirtame mirkymo maišelyje (pvz., Stomacher arba Bioreba), įpylus atitinkamą ekstrakcijos buferinio tirpalo kiekį (3 priedėlis) guma dengtu plaktuku arba atitinkamu malimo aparatu (pvz., Homex). Jei šito padaryti neįmanoma, kamieno segmentai saugomi šaltai ne ilgiau kaip 72 valandas arba kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas.
3.2.4. Paprastai vėliau nereikalaujama skaidrinti ekstrakto arba koncentruoti bakterinės frakcijos, tačiau tai galima atlikti filtruojant ir (arba) centrifuguojant, kaip aprašyta 3.1.4–3.1.6 skirsniuose.
3.2.5. Neskiestas arba koncentruotas bandinio ekstraktas padalijamas į dvi lygias dalis. Viena ekstrakto dalis tiriama 4–10 °C temperatūroje, o kita saugoma 10–25 % (tūris/tūris) steriliame glicerine -16–24 °C temperatūroje (savaites) arba -68–86 °C temperatūroje (mėnesius) iki paskesnio tyrimo pradžios.
Principas
Imunofluorescencinės analizės testas kaip svarbiausias atrankos testas rekomenduojamas taikyti dėl jo tinkamumo pasiekti reikalaujamas slenkstines vertes.
Kai IF testas atliekamas kaip pagrindinis atrankos testas ir IF rezultatai teigiami, PGR arba FISH testą reikia atlikti kaip antrąjį atrankos testą. Kai IF testas atliekamas kaip antrasis atrankos testas ir IF rezultatai teigiami, reikia atlikti paskesnį testavimą pagal vaizduojamąją diagramą, kad būtų baigta analizė.
Pastaba.
Visada naudoti polikloninius antikūnus, kai IF testas atliekamas kaip pagrindinis atrankos testas. Jei naudojant polikloninius antikūnus IF testo rezultatai teigiami, paskesnė atranka naudojant monokloninius antikūnus suteiktų daugiau specifiškumo, tačiau gali būti ne tokia jautri.
Naudojami antikūnai, būdingi etaloniniam C. m. subsp. sepedonicus štamui. Rekomenduojama nustatyti kiekvienos naujos antikūnų partijos titrą. Titras apibrėžiamas kaip didžiausias praskiedimas, kuriam esant vyksta reakcija, tiriant homologinio C. m. subsp. sepedonicus štamo 105–106 ląstelių/ml ląstelių suspensiją ir naudojant atitinkamą gamintojo rekomenduojamą fluoresceino izotiocianato (FITC) konjugatą. Neišgrynintų polikloninių arba monokloninių antikūnų titras turėtų būti ne mažesnis kaip 1:2000. Tyrimo metu antikūnus reikėtų praskiesti iki darbinio praskiedimo (DP), artimo jų titrui arba lygaus jam. Naudoti patvirtintus antikūnus (žr. tinklavietę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Reikėtų tirti tik šviežiai pagamintus ekstraktus. Jei būtina, galima tirti ekstraktus, laikomus glicerine -68–86 °C temperatūroje. Gliceriną iš bandinio galima pašalinti pridėjus 1 ml nuosėdų buferinio tirpalo (4 priedėlis), pakartotinai centrifuguoti 15 minučių 7 000 g greičiu ir pakartotinai suspenduoti, pripylus nuosėdų buferinio tirpalo lygų tūrį. Dažnai šitai atlikti nebūtina, ypač jei bandiniai fiksuojami ant plokštelės liepsna (žr. 2.2 skirsnį). Paruošti atskiras teigiamas kontrolines plokšteles, į kurių langelius bus pripilta homologinio arba kurio nors etaloninio C. m. subsp. sepedonicus štamo, suspenduoto bulvių ekstrakte, kaip nurodyta 2 priedėlyje, ir pasirinktinai buferiniame tirpale.
Jei įmanoma, į tos pačios plokštelės langelius turėtų būti pripilama natūraliai užkrėsto audinio preparato (palaikomo liofilizacijos arba šaldymo -16–24 °C temperatūroje būdu) kaip panašaus kontrolinio bandinio.
Bandinių, kurie po ankstesnių tyrimų buvo laikomi neigiamais, ekstraktų dalys turėtų būti naudojamos kaip neigiami kontroliniai bandiniai.
Naudoti daug langelių turinčias mikroskopines plokšteles, pageidautina su 10 langelių, mažiausiai 6 mm skersmens. Kontrolinis bandinys tiriamas taip pat, kaip ir tiriamasis bandinys.
4.1. Tyrimui skirtos plokštelės paruošiamos taikant vieną iš šių procedūrų:
i) Nuosėdos, turinčios santykinai nedaug krakmolo:
Standartinis tūris (15 ml tinka dirbti, kai naudojamos plokštelės, kurių langelio skersmuo yra 6 mm, o esant didesniems langeliams, padidinamas tūris) 1:100 praskiestų pakartotinai suspenduotų bulvių nuosėdų lašinamas į pirmąjį langelį. Vėliau nepraskiestų (1/1) pakartotinai suspenduotų nuosėdų panašus tūris lašinamas į vienos tos pačios eilės langelius. Antrojoje eilutėje pakartojamas pirmasis bandinys arba lašinamas antrasis bandinys, kaip parodyta 1 pav.
ii) Kitų nuosėdų atveju:
Pakartotinai suspenduotos nuosėdos praskiedžiamos nuosėdų buferiniame tirpale santykiu 1:10 ir 1:100. Standartinis pakartotinai suspenduotų ir kiekvieno praskiedimo nuosėdų tūris (15 ml tinka dirbti, kai naudojamos plokštelės, kurių langelio skersmuo yra 6 mm, o esant didesniems langeliams, padidinamas tūris) lašinamas į langelius vienoje langelių eilutėje. Antrojoje eilutėje pakartojamas pirmasis bandinys arba lašinamas antrasis bandinys, kaip parodyta 2 pav.
4.2. Lašeliai išdžiovinami kambario temperatūroje arba kaitinami 40–45 °C temperatūroje. Bakterinės ląstelės fiksuojamos prie plokštelės kaitinant (15 minučių 60 °C temperatūroje) arba liepsna, 95 % etanoliu arba bet kuria kita antikūnų tiekėjų nurodyta tvarka.
Jei būtina, fiksuotos plokštelės vėliau gali būti saugomos šaldiklyje sausoje dėžėje kiek galima trumpiau (ilgiausiai 3 mėnesius) iki tyrimo.
4.3. IF tvarka:
i) Plokštelė paruošta, kaip nurodyta 4.1 (i):
Paruošiamas antikūnų, dukart praskiestų IF buferiniu tirpalu, rinkinys. Į pirmą langelį pripilama 1/2 titro (T/2), į kitus – 1/4 titro (T/4), 1/2 titro, (T/2), titrą (T) ir dukart titro antikūnų (2T).
ii) Plokštelė, paruošta, kaip nurodyta 4.1 (ii):
Atliekamas antikūnų darbinis praskiedimas (DP) IF buferiniame tirpale. Darbinis praskiedimas turi įtakos antikūnų specifiškumui.
1 pav. Tiriamosios plokštelės paruošimas pagal 4.1 (i) ir 4.3 (i)
Pakartotinai suspenduotų nuosėdų praskiedimai
2 pav. Tiriamosios plokštelės paruošimas pagal 4.1 (ii) ir 4.3 (ii)
Antiserumo/antikūnų darbinis praskiedimas
4.3.1. Plokštelės išdėliojamos ant drėgno popieriaus. Kiekvienas testuojamasis langelis sklidinai pripildomas praskiestų antikūnų tirpalo. Į kiekvieną langelį pripilamo antikūnų tirpalo tūris turi atitikti bent tiriamojo ekstrakto tūrį.
Antikūnų tiekėjams nepateikus naudojimo instrukcijų, laikomasi šios tvarkos:
4.3.2. Plokštelės laikomos uždengtos ant drėgno popieriaus 30 minučių kambario temperatūroje (18–25 °C).
4.3.3. Nukrėsti nuo kiekvienos plokštelės lašelius ir kruopščiai nuplauti IF buferiniu tirpalu. Perplaunama pripilant IF buferinio tirpalo, turinčio Tween (3 priedėlis), ir laikoma 5 minutes, po to pripilama IF buferinio tirpalo ir laikoma dar 5 minutes. Vengti aerozolio susidarymo arba lašelių pernešimo, dėl kurio gali įvykti kryžminė tarša. Perteklinis vanduo atsargiai pašalinamas nusausinant.
4.3.4. Plokštelės išdėliojamos ant drėgno popieriaus, į langelius pripilama praskiesto titrui nustatyti naudojamo FITC konjugato. { langelius pripilamo konjugato tūris turi atitikti pripilamų antikūnų tirpalo tūrį.
4.3.5. Plokštelės 30 minučių laikomos uždengtos ant drėgno popieriaus kambario temperatūroje (18–25 °C).
4.3.6. Konjugato lašeliai nukratomi nuo plokštelės. Plokštelė sudrėkinama ir plaunama, kaip aprašyta 4.3.3 skirsnyje. Atsargiai pašalinamas perteklinis vanduo.
4.4. IF testo rezultatai:
4.4.1. Tiriamąsias plokšteles stebėti epifluorescenciniu mikroskopu naudojant filtrus, tinkamus FITC sužadinimui, ir aliejaus arba vandens imersinius tirpalus esant 500–1 000 kartų padidinimui. Langeliai stebimi per dvigubą skersmenį dešiniuosiuose kampuose ir aplink perimetrą. Bandinių, neturinčių arba turinčių nedaug ląstelių, atveju stebima mažiausiai 40 laukelių.
Pirmiausia stebima teigiama kontrolinė plokštelė. Ląstelės turi šviesiai fluorescuoti ir būti visiškai nusidažiusios esant nustatytam antikūnų titrui arba darbiniam praskiedimui. IF testą (4 skirsnis) reikia pakartoti, jei dažymasis nepavyko.
4.4.2. Tiriamųjų plokštelių tiriamuosiuose langeliuose stebimos šviesiai fluorescuojančios tipiškos morfologijos C. m. subsp. sepedonicus ląstelės (žr. tinklavietę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescencijos intensyvumas privalo būti lygiavertis teigiamo kontrolinio štamo fluorescencijos intensyvumui arba net didesnis už jį esant tam pačiam antikūnų praskiedimui. Į ne visai nusidažiusias ląsteles ar silpnai fluorescuojančias ląsteles nekreipiama dėmesio.
Įtarus kokią nors taršą, testą privaloma pakartoti. Taip gali atsitikti tuo atveju, kai visose vienos partijos plokštelėse matomos teigiamos ląstelės dėl buferinio tirpalo taršos arba dėl to, kad stebimos teigiamos ląstelės (už plokštelės lango ribų) ant plokštelės dangtelio.
4.4.3. Yra keletas būdingų IF testo specifiškumo problemų. Gali pasitaikyti foninių fluorescuojančių netipiškos morfologijos ląstelių populiacijų ir į C. m. subsp. sepedonicus savo dydžiu bei morfologija panašių kryžmiškai reaguojančių saprofitinių bakterijų, randamų bulvių stiebagumbių viršūnių gabaliukų nuosėdose.
4.4.4. Tirti tik tipiško dydžio ir morfologijos fluorescuojančias ląsteles esant antikūnų titrui arba darbiniam praskiedimui, kaip nurodyta 4.3.
4.4.5. IF testo rezultatų aiškinimas:
i) Jei stebimos šviesiai fluorescuojančios tipiškos morfologijos ląstelės, apskaičiuojamas tipiškų ląstelių viename mikroskopiniame laukelyje vidurkis ir tipiškų ląstelių skaičius pakartotinai suspenduotų nuosėdų viename mililitre (4 priedėlis).
IF testo rezultatai yra teigiami bandiniams, kurių pakartotinai suspenduotų nuosėdų viename ml yra mažiausiai 5 x 103 tipiškų ląstelių. Bandinys laikomas galimai užkrėstu, ir būtinas tolimesnis tyrimas.
Principas
Kai FISH testas taikomas kaip pirmasis atrankos testas ir nustatoma, kad jis teigiamas, IF testą reikia atlikti kaip antrąjį privalomąjį atrankos testą. Kai FISH testas taikomas kaip antrasis privalomasis testas ir nustatoma, kad jis teigiamas, yra reikalaujama atlikti paskesnį testavimą pagal vaizduojamąją diagramą tam, kad diagnozė būtų baigta.
Pastabos:
Naudoti patvirtintus oligonukleotidų, būdingų C. m. subsp. sepedonicus, bandinius (7 priedėlis). Šiuo metodu atliekant išankstinį testą, bandinių ekstraktuose, kurie anksčiau buvo neigiami, viename mililitre turėtų būti pakartotinai aptinkama mažiausiai 103–104 C. m. subsp. sepedonicus ląstelių.
Ši tvarka pirmiausia turėtų būti taikoma šviežiai paruoštam bandinio ekstraktui, tačiau ją galima taikyti ir ekstraktui, kuris buvo laikomas glicerine -16–24 °C arba -68–86 °C temperatūroje.
Bandinio ekstrakto, kuriame nenustatyta C. m. subsp. sepedonicus ląstelių, alikvotines dalis naudoti kaip neigiamus kontrolinius bandinius.
3–5 dienų amžiaus kultūrų suspensijas, turinčias C. m. subsp. sepedonicus (pvz., NCPPB 4053 arba PD 406 štamo) 0,01 M fosfatiniame buferiniame tirpale 105–106 ląstelių/ml, reikėtų naudoti kaip teigiamus kontrolinius bandinius (apie paruošimą žr. 2 priedėlyje). Paruošti atskiras teigiamas kontrolines plokšteles, skirtas homologiniam arba bet kuriam etaloniniam C. m. subsp. sepedonicus štamui, suspenduotam bulvių ekstrakte, kaip nurodyta 2 priedėlyje.
FITC žyma pažymėti oligonukleotidiniai bandiniai, būdingi eubakterijoms, labai naudingi kontroliuojant hibridizavimo procesą, kadangi jais nudažomos visos bandinyje esančios eubakterijos.
Kontrolinis bandinys tiriamas tokiu pat būdu, kaip ir tiriamasis bandinys.
5.1. Bulvių ekstrakto fiksavimas
Paskesnė metodika pagal Wullings et al. (1998):
5.1.2. Į Eppendorfo mėgintuvėlį įlašinama po 100 ml kiekvieno bandinio ekstrakto, ir mėgintuvėlis centrifuguojamas 8 min 7 000 g greičiu.
5.1.3. Nupilamas viršnuosėdinis skystis ir nuosėdos ištirpinamos 500 ml fiksavimo tirpalo, paruošto prieš mažiau kaip 24 valandas. Mėgintuvėlis sukratomas pavartant ir per naktį inkubuojamas 4° C temperatūroje.
Kita fiksuojanti medžiaga yra 96 % etanolis. Nuosėdos, gautos 5.1.2 etape, ištirpinamos 50 ml 0,01 M fosfatinio buferinio tirpalo 50 ml 96 % etanolio. Mišinys apverčiamas aukštyn sumaišant ir 30–60 minučių inkubuojamas 4 °C temperatūroje.
5.1.4. Mėgintuvėlis centrifuguojamas 8 min 7 000 g greičiu, viršnuosėdinis skystis nupilamas ir nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 75 ml 0,01 M fosfatinio buferinio tirpalo (žr. 3 priedėlį).
5.1.5. Į švarios daug langelių turinčios plokštelės langelius įlašinama po 16 ml fiksuotų suspensijų taip, kaip parodyta 3 pav. Kiekviena plokštelė skiriama 2 bandiniams ištirti, įlašinus juos nepraskiestus po 10 ml, ir vėliau padaryti 1:100 praskiedimą (0,01 M fosfatiniu buferiniu tirpalu). Likusį bandinio tirpalą (49 ml) galima saugoti -20 °C temperatūroje, įpylus 1 tūrį 96 % etanolio. Jei reikia pakartoti FISH testą, etanolis pašalinamas centrifuguojant ir įpilant tokį pat tūrį 0,01 M fosfatinio buferinio tirpalo (sumaišoma pavartant).
3 pav. FISH testui skirtos plokštelės išklotinė
| 1 bandinys O 1 langelis |
tuščias O 2 langelis |
tuščias O 3 langelis |
tuščias O 4 langelis |
2 bandinys O 5 langelis |
| 1 bandinys O 6 langelis |
tuščias O 7 langelis |
tuščias O 8 langelis |
tuščias O 9 langelis |
2 bandinys O 10 langelis |
1 dengiamasis stiklelis 2 dengiamasis stiklelis
5.2. Pasiruošimas hibridizacijai ir hibridizacija
5.2.1. Paruošiamas lizocimo tirpalas, 10 mg lizocimo (Sigma L-6876) ištirpinus 10 ml buferinio tirpalo (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Šį tirpalą galima saugoti, tačiau jį užšaldyti ir atitirpdyti galima tik vieną kartą. Į kiekvieną bandiniui skirtą plokštelės langelį įlašinama po 50 ml lizocimo tirpalo, ir plokštelė 10 minučių laikoma kambario temperatūroje. Plokštelės pamerkiamos į demineralizuotą vandenį tik vieną kartą ir džiovinamos filtriniu popieriumi.
Priešingu atveju vietoj lizocimo į kiekvieną langelį galima įpilti po 50 ml 40–400 mg ml-1 proteinazės K, ištirpintos buferiniame tirpale (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4), ir plokštelę 30 minučių inkubuoti 37 °C temperatūroje.
5.2.2. Vanduo pašalinamas iš ląstelių, kas minutę įpilant laipsniškai didėjančios koncentracijos – 50 %, 80 % ir 96 % – etanolio. Plokštelės džiovinamos oru, įdėjus jas į plokštelėms skirtą laikiklį.
5.2.3. Parengiama drėgna inkubavimo kamera, oro nepraleidžiančios dėžės dugną uždengus sugeriamuoju arba filtriniu popieriumi, išmirkytu lx hybmix (7 priedėlis). Dėžė mažiausiai 10 minučių paliekama hibridizavimui skirtoje krosnelėje 55 °C temperatūroje.
5.2.4. Paruošti hibridizacijos tirpalą (7 priedėlis), į vienos plokštelės langelius įpylus 45 ml ir 5 minutes atliekant išankstinį inkubavimą 55 °C temperatūroje.
5.2.5. Plokštelės padedamos ant karšto 45 °C temperatūros padėklo ir į kiekvienos plokštelės 4 langelius įpilama po 10 ml hibridizavimo tirpalo.
5.2.6. Kiekviena plokštelė uždengiama dviem dengiamaisiais stikleliais (24 x 24 mm), kad neprasiskverbtų oras. Plokštelės sudedamos į pašildytą drėgną kamerą ir per naktį krosnelėje 55 °C temperatūroje tamsoje atliekamas hibridizavimas.
5.2.7. Į tris laboratorines kolbas įpilama po 1 l ypač gryno vandens (YGV), 1 l l x hybmix tirpalo (334 ml 3x hybmix ir 666 ml YPV) ir 1 l l/2x hybmix (167 ml 3x hybmix ir 833 ml YGV). Kiekviena kolba pašildoma 55 °C temperatūros vandens vonioje.
5.2.9. Bandinio perteklius pašalinamas 15 minučių inkubuojant plokštelę laboratorinėje kolboje 55 °C temperatūroje, į kurią įpilama vienąkart koncentruoto hybmix tirpalo.
5.2.10. Plokštelių laikiklis pamerkiamas į 1/2 koncentracijos hybmix plovimo tirpalą ir dar 15 minučių inkubuojamas.
5.2.11. Plokštelės trumpam pamerkiamos į YGV ir padedamos ant filtrinio popieriaus. Perteklinis vanduo pašalinamas, paviršių padengiant filtriniu popieriumi. Į kiekvieną langelį pipete įlašinama po 5–10 ml priešblukinančiu aktyvumu pasižyminčio ryškinamojo tirpalo (pvz., Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA arba jam lygiaverčio) ir visa plokštelė uždengiama viena (24 x 60 mm) dengiamuoju stikleliu.
5.3. FISH testo rezultatų aiškinimas
5.3.1. Plokšteles, pamerktas į imersinį aliejų, nedelsiant stebėti mikroskopu, tinkančiu epifluorescencinei mikroskopijai ir padidinus 630 ir 1000 kartų. Bandinyje esančios eubakterinės ląstelės (įskaitant Gram(-) ląsteles), stebimos per fluoresceino izotiocianatui (FITC) tinkamą filtrą, atrodo fluorescuojančiai žaliai. Cy3 dažu dažytos C. m. subsp. sepedonicus ląstelės, stebimos per tetrametiliodamino-5-izotiocianatui skirtą filtrą, atrodo fluorescuojančiai raudonai. Palyginti tiriamųjų ir teigiamų kontrolinių ląstelių morfologiją. Ląstelės turi fluorescuoti šviesia spalva ir būti visiškai nusidažiusios. FISH testą (9.4 skirsnis) reikia pakartoti, jei dažymasis nepavyko. Langeliai stebimi per dvigubą skersmenį dešiniuosiuose kampuose ir aplink perimetrą. Jei bandiniai neturi ląstelių arba turi jų nedaug, stebima mažiausiai 40 laukelių.
5.3.2. Stebėti būdingos morfologijos šviesiai fluorescuojančias C. m. subsp. sepedonicus ląsteles tiriamųjų plokštelių tiriamuosiuose langeliuose (žr. tinklavietę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescencijos intensyvumas privalo būti lygiavertis arba net didesnis už teigiamo kontrolinio štamo fluorescencijos intensyvumą. Į ne visai nusidažiusias ląsteles ar silpnai fluorescuojančias ląsteles nekreipiama dėmesio.
5.3.3. Įtarus bet kokią taršą, testą privaloma pakartoti. Taip gali atsitikti tuo atveju, kai visose vienos partijos plokštelėse matomos teigiamos ląstelės dėl buferinio tirpalo taršos arba dėl to, kad stebimos teigiamos ląstelės (už plokštelės langelio ribų) ant plokštelės dangtelio.
5.3.4. Yra keletas budingų FISH testo specifiškumo problemų. Gali pasitaikyti foninių fluorescuojančių netipiškos morfologijos ląstelių populiacijų ir į C. m. subsp. sepedonicus savo dydžiu bei morfologija panašių kryžmiškai reaguojančių saprofitinių bakterijų, nors tokie atvejai gerokai retesni nei IF testo atveju tiriant bulvių stiebagumbių viršūnės gabaliukų segmentų nuosėdas.
5.3.6. FISH testo rezultato aiškinimas:
i) Teigiami FISH testo rezultatai gaunami tada, kai per FITC filtrą stebimos tipiško dydžio bei morfologijos šviesiai žaliai fluorescuojančios C. m. subsp. sepedonicus ląstelės, ir per rodamino filtrą stebimos visos teigiamos kontrolinės ląstelės fluorescuoja šviesiai raudona spalva, o tarp neigiamų kontrolinių ląstelių jokios fluorescencijos nėra. Jei randama šviesiai fluorescuojančių būdingos morfologijos ląstelių, apskaičiuojamas tipiškų ląstelių viename mikroskopiniame laukelyje vidurkis ir tipiškų ląstelių skaičius pakartotinai suspenduotų nuosėdų viename mililitre (4 priedėlis). Bandiniai, kurių 1 ml yra mažiausiai 5 x 103 tipiškų ląstelių, laikomi užkrėstais. Reikalaujama juos tirti toliau. Bandiniai, kurių pakartotinai suspenduotų nuosėdų 1 ml yra mažiau kaip 5 x 103 tipiškų ląstelių, laikomi neigiamais.
Principai
Kai PGR testas atliekamas kaip pagrindinis atrankos testas ir gaunami teigiami rezultatai, yra būtina atlikti IF testą kaip antrą privalomąjį atrankos testą. Kai PGR testas atliekamas kaip antras atrankos testas ir gaunami teigiami rezultatai, tai paskesnį testavimą reikia atlikti pagal vaizduojamąją diagramą tam, kad diagnozė būtų baigta.
Šio metodo, kaip pagrindinio atrankos testo, visas galimybes rekomenduojama panaudoti tik įgijus atitinkamos patirties.
Pastabos:
Šiuo metodu atliekant išankstinį testą, bandinių ekstraktuose, kurie anksčiau buvo neigiami, viename mililitre turėtų būti pakartotinai aptinkama mažiausiai 103–104 C. m. subsp. sepedonicus ląstelių. Gali būti reikalaujama atlikti optimizavimo eksperimentus, kad visose laboratorijose būtų pasiektas didžiausias nustatymo jautrumas ir specifiškumas.
Naudoti patvirtintus PGR reagentus ir metodikas. Pirmiausia pasirinkti metodą, kurį taikant naudojamas vidinis kontrolinis bandinys.
Imtis atitinkamų atsargumo priemonių, siekiant išvengti bandinio užteršimo tiriamąja DNR. PGR testą turėtų atlikti patyręs molekulinės biologijos laboratorijų techninis personalas, kad būtų sumažinta taršos tiriamąja DNR galimybė.
Neigiami kontroliniai bandiniai (DNR išskyrimo ir PGR procedūroms) turėtų visada būti laikomi galutiniais bandiniais, kuriais įrodoma, ar įvyko tarša DNR.
Atliekant PGR testą reikėtų naudoti šiuos neigiamus kontrolinius bandinius:
– bandinio ekstraktą, kuris atlikus ankstesnį tyrimą buvo laikomas neužkrėstas C. m. subsp. sepedonicus,
– buferinius kontrolinius tirpalus, naudojamus iš bandinio išskirti bakterijai ir DNR,
– PGR reakcinį mišinį.
Reikėtų naudoti šiuos teigiamus kontrolinius bandinius:
– pakartotinai suspenduotų nuosėdų, į kurias pridėta C. m. subsp. sepedonicus, alikvotines dalis (apie paruošimą žr. 2 priedėlyje),
– virulentiško C. m. subsp. sepedonicus izoliato (pvz., NCPPB 2140 arba NCPPB 4053) 106/ml ląstelių vandeninę suspensiją,
– jei įmanoma, atliekant PGR testą taip pat reikėtų naudoti iš teigiamų kontrolinių bandinių išskirtą DNR.
Siekiant išvengti galimos taršos, tiriamieji teigiami kontroliniai bandiniai paruošiami atskirai nuo tiriamųįų bandinių.
Reikėtų stengtis, kad bandinių ekstraktuose nebūtų dirvožemio. Todėl tam tikrais atvejais rekomenduotina ekstraktus paruošti naudojant plautas bulves, jei dirbama pagal PGR metodikas.
6.1. DNR gryninimo metodai
Naudoti teigiamus ir neigiamus kontrolinius bandinius, kaip aprašyta pirmiau. Kontrolinę medžiagą paruošti taip pat kaip ir bandinį.
Tiriamoji DNR iš sudėtingų bandinių substratų išskiriama įvairiais metodais, taigi PGR ir kitų fermentinių reakcijų inhibitoriai pašalinami ir tiriamoji DNR sukoncentruojama bandinio ekstrakte.
Paskesnis metodas buvo optimizuotas tam, kad būtų atliekama patvirtinta PGR, aprašyta 6 priedėlyje.
1. 220 ml lizės buferinio tirpalo (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) įlašinti į 1,5 ml tūrio Eppendorf mėgintuvėlį.
2. Įpilti 100 ml bandinio ekstrakto ir mėgintuvėlį 10 minučių laikyti termostate arba vandens vonelėje 95 °C temperatūroje.
4. Įpilti 80 ml lizocimo pradinio tirpalo (50 mg lizocimo/ml 10 mM Tris HC1, pH 8,0 buferiniame tirpale) ir 30 minučių inkubuoti 37 °C temperatūroje.
5. Įpilti 220 ml Easy DNA® tirpalo A (Invitrogen), gerai sukratyti ir 30 minučių inkubuoti 65 °C temperatūroje.
6. Įpilti 100 ml Easy DNA® tirpalo B (Invitrogen), intensyviai kratyti, kol nuosėdos išsisklaidys mėgintuvėlyje ir bandinys taps vienodai klampus.
8. 20 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje, kad būtų atskirtos fazės ir susidarytų interfazė.
13. 20 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje ir išsaugoti nuosėdas bei pašalinti etanolį.
15. Pakartotinai suspenduoti nuosėdas 100 ml steriliame ypač gryname vandenyje ir mažiausiai 20 minučių palikti kambario temperatūroje.
17. Centrifuguojant išsodinti bet kurį baltos spalvos precipitatą ir 5 ml supernatanto, turinčio DNR, panaudoti PGR atlikti.
6.1.(b) Kiti metodai
Kiti DNR išskyrimo metodai (pvz., naudojant bendrovės Qiagen DNeasy rinkinį, skirtą augalų DNR išskirti) galėtų būti taikomi, jei įrodoma, kad jie tokie pat efektyvūs išskiriant DNR iš kontrolinių bandinių, kurių 1 ml yra 103–104 patogeno ląstelių.
6.2. PGR
6.2.1. Tiriamosios ir kontrolinės matricos paruošiamos PGR pagal patvirtintą metodiką (6 priedėlis). Bandinio DNR ekstraktas praskiedžiamas ypač grynu vandeniu santykiu 1:10.
6.2.2. Pagal paskelbtą metodiką paruošiamas atitinkamas PGR reakcinis mišinys taršai atsparioje aplinkoje (6 priedėlis). Patvirtinta PGR yra daugybinė reakcija, kurią atliekant taip pat naudojamas vidinis PGR kontrolinis bandinys.
6.2.3. Į 25 ml PGR reakcinio mišinio, esančio steriliuose PGR skirtuose mėgintuvėliuose, įpilama 5 ml DNR ekstrakto.
6.2.4. Naudojamas neigiamas kontrolinis bandinys, sudarytas tik iš PGR reakcinio mišinio, ir vietoj bandinio į jį įpilama ypač gryno vandens, kuris naudojamas ir PGR mišinyje.
6.3. PGR produkto analizė
6.3.1. Padaugintos matricinės DNR bandiniai analizuojami elektroforezės agarozės gelyje metodu. Į gelį įnešama mažiausiai po 12 ml padauginto DNR reakcinio mišinio, sumaišyto su 3 ml įnešimo buferinio tirpalo (6 priedėlis). Naudojami 2 % (svoris/tūris) agarozės geliai, pagaminti taikant tris-acetato-EDTA (TAE) buferinį tirpalą (6 priedėlis), ir elektroforezė atliekama esant 5–8 V/cm. Naudojama atitinkamo ilgio DNR žymė, pvz., 100 bp ilgio fragmentas.
6.3.2. DNR juostelės išryškinamos 30–45 minutes dažant etidiumo bromido dažu (0,5 mg/l); dirbant su šiuo mutagenu yra imamasi atsargumo priemonių.
6.3.3. Gelis apžiūrimas apšvietus jį trumpųjų UV bangų peršvietėju (pvz., bangos ilgiui siekiant λ = 302 nm), stebimi numatomo ilgio padaugintos DNR fragmentai (6 priedėlis), ir stebėjimai užrašomi.
6.3.4. Gavus naujų duomenų arba esant naujiems atvejams, padaugintos DNR tapatybė nustatoma, atliekant likusios padaugintos DNR restrikcinę analizę, DNR inkubuojant atitinkamo fermento ir buferinio tirpalo mišinyje kambario temperatūroje (žr. 6 priedėlį). Suskaldyti fragmentai analizuojami agarozės gelio elektroforezės metodu ir stebimas būdingas restrikcijos fragmentas, gelį nudažius etidžio bromidu ir apšviečiant UV peršvietėju, bei palyginant su nesuskaldyta ir suskaldyta teigiama kontrole.
PGR testo rezultato aiškinimas:
PGR testas yra neigiamas, jei tiriamajame bandinyje nenustatomas numatomo dydžio padaugintos C. m. subsp. sepedonicus būdingos DNR fragmentas, bet jis nustatomas visuose teigiamuose kontroliniuose bandiniuose (kai daugybinė PGR atliekama naudojant augalui būdingus vidinius kontrolinius pradmenis, antrąjį numatomą PGR produktą reikia padauginti kartu su tiriamuoju bandiniu).
PGR testas yra teigiamas, jei aptinkamas numatomo dydžio padaugintos C. m. subsp. sepedonicus būdingos DNR fragmentas, suskaldytas restriktaze (kai reikalaujama), ir jei jis negaunamas iš bet kurio neigiamo kontrolinio bandinio. Patikimas teigiamo rezultato patvirtinimas gali būti gaunamas pakartojant testą ir naudojant antrąjį DNR pradmenų rinkinį (9.3 skirsnis).
Pastabos:
PGR inhibiciją galima įtarti, jei padaugintos matricinės DNR fragmetas gaunamas iš teigiamo kontrolinio bandinio, turinčio C. m. subsp. sepedonicus vandenyje, tačiau neigiami rezultatai gaunami naudojant teigiamą kontrolinį bandinį, turintį C. m. subsp. sepedonicus bulvių ekstrakte. Kai daugybinė PGR atliekama naudojant vidines PGR kontroles, reakcija nevyksta, jei negaunama nė viena iš dviejų padaugintos matricinės DNR fragmentų.
Užsikrėtimą galima įtarti, jei numatoma padauginta DNR gaunama iš vieno arba daugiau neigiamų kontrolinių bandinių.
7. BIOTESTAS
Pastabos:
Šiuo metodu išankstinį tyrimą atliekant bandinių ekstraktuose, kurie anksčiau buvo neigiami, 1 ml turėtų būti galima nustatyti 103–104 C. m. subsp. sepedonicus kolonijas sudarančių vienetų (apie paruošimą žr. 2 priedėlyje).
Didžiausio nustatymo jautrumo galima tikėtis, kai naudojamas šviežiai paruoštas bandinio ekstraktas ir laikomasi optimalių augimo sąlygų. Tačiau šį metodą galima sėkmingai taikyti tiriant ekstraktus, laikytus glicerine -68–86 °C temperatūroje.
Kai kurios baklažanų veislės yra puiki C. m. subsp. sepedonicus dauginimosi terpė net ir nesant simptomų ir yra puikus bakterijos šeimininko patvirtinimo testas.
Augimo sąlygas reikėtų optimizuoti, kad būtų sumažintas netikrų neigiamų rezultatų gavimo pavojus.
Dėl auginimo žr. 8 priedėlį.
7.1. Likusią pagal 3.1.6 arba 3.2.5 skirsnį pakartotinai suspenduotų nuosėdų alikvotinę dalį paskirstyti tarp baklažanų taikant vieną iš toliau pateikiamų metodų (7.3 arba 7.4 skirsnis).
Naudoti tik 2–3 lapelių stadijos augalus ir sudaryti sąlygas visiškai pasiekti trečiojo tikrojo lapelio stadiją. Kad būtų visiškai sunaudota pakartotinai suspenduotų nuosėdų likusi dalis ir būtų efektyviai atliktas toliau aprašytas inokuliavimas, reikia, kad vieną bandinį sudarytų 15–25 baklažanai.
7.2. Baklažanai 1–2 dienas prieš inokuliavimą nelaistomi, kad būtų sumažintas turgorinis lapų slėgis.
7.3. Inokuliavimas įpjovos vietoje
7.3.1. Laikant augalą dviem pirštais, suspenduotų nuosėdų lašas (apytiksliai 5–10 ml) užlašinamas ant stiebo tarp sėklaskilčių ir pirmojo lapelio.
7.3.2. Steriliu skalpeliu padaromas įstrižinis 1 cm ilgio ir 2/3 stiebo storio gylio pjūvis nuo tos vietos, kur buvo užlašintas suspenduotų nuosėdų lašas.
7.4. Inokuliavimas švirkštu
Baklažanų stiebai virš sėklaskilčių inokuliuojami, tam naudojant švirkštą su hipodermine adata (ne mažiau kaip 23G). Bandinys padalijamas po lygiai visuose baklažanuose.
7.5. Kaip teigiami kontroliniai augalai, 5 baklažanai inokuliuojami žinomos C. m. subsp. sepedonicus kultūros 105–106 ląstelių/ml vandenine suspensija ir, kai įmanoma, užkrėstu stiebagumbio audiniu (4 skirsnis), taikant tą patį inokuliavimo metodą (žr. 7.3 arba 7.4 skirsnį).
7.6. Kaip neigiami kontroliniai augalai, 5 baklažanai steriliu nuosėdų buferiniu tirpalu inokuliuojami taikant tą patį metodą (7.3 arba 7.4 skirsnis).
7.7. Augalai 4 savaites 18–24 °C temperatūroje laikomi karantino sąlygomis. Augalai auginami esant pakankamai šviesos ir drėgmės (70-80 %) ir vandens, kad nepermirktų ar nenuvystų dėl vandens trūkumo. C. m. sepedonicus ląstelės žūva esant aukštesnei kaip 30 °C temperatūrai, o jų optimali temperatūra yra 21 °C. Siekiant išvengti taršos, teigiami kontroliniai ir neigiami kontroliniai augalai auginami aiškiai atskirtuose loveliuose šiltnamyje arba auginimui skirtoje patalpoje, o jei trūksta erdvės, tai užtikrinama atskirtis. Jei skirtingais bandiniais inokuliuojamus augalus reikia auginti kartu, jie atskiriami skydeliais. Tręšimo, laistymo, patikrinimo ir kitų operacijų metu labai rūpinamasi, kad būtų išvengta kryžminio užsikrėtimo. Būtina užtikrinti, kad į šiltnamius ir auginimui skirtas patalpas nepatektų jokie vabzdžiai kenkėjai, nes jie perneša bakteriją nuo vieno bandinio prie kito.
7.8. Simptomai pradedami reguliariai stebėti po savaitės. Suskaičiuojami simptomų turintys augalai. C. m. subsp. sepedonicus sukelia baklažanų lapų vytimą, dėl kurio lapų pakraščiuose arba tarpgyslinėse vietose audinys ima nykti. Suvytęs audinys iš pradžių gali būti tamsiai žalias arba taškuotas, tačiau vėliau dėl vytimo, prieš virsdamas nekrotiniu audiniu, jis pabąla. Tarpgysliniai vyruliai atrodo taip, lyg būtų permirkę riebaluotu vandeniu. Nekrotinio audinio kraštai dažnai būna ryškiai geltoni. Augalai gali įveikti infekciją. Augalai nebūtinai sunyksta; kuo ilgiau simptomai vystosi, tuo didesnė išgyvenimo galimybė. Jauni baklažanai nedidelėms C. m. subsp. sepedonicus populiacijoms mažiau atsparūs nei senesni augalai, todėl būtina naudoti augalus, esančius trečioje lapelio stadijoje arba jos dar nepasiekusius.
Vyrulių atsiradimą gali sukelti ir kitos stiebagumbių audinyje esančios bakterijos ir grybai. Joms priklauso Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora ir E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, taip pat ir gausios saprofitinių bakterijų populiacijos. Ypač Erwinia chrysanthemi gali sukelti lapų vyturius, labai panašius į C. m. sepedonicus sukeliamus vyrulius. Vienintelis skirtumas yra stiebų patamsėjimas užkrėtimo Erwinia chrysanthemi atveju. Kitus vyrulius nuo C. m. subsp. sepedonicus sukeliamų vyrulių galima atskirti pagal tai, kad visi lapai ir augalas labai greitai vysta. Atskirti galima ir pagal dažymąsi Gramo būdu: šiuo testu užkrėtimą C. m. subsp. sepedonicus galima atskirti nuo užkrėtimo Erwinia spp.
7.9. Baklažanuose pastebėjus simptomų, reikėtų pakartoti išskyrimą, tam panaudojant augalų suvytusių lapų audinio arba stiebo audinio dalį (žr. 3.1.3 skirsnį apie audinio išmirkymą). Baklažanų lapų ir stiebų paviršiai suvilgomi 70 % etanoliu. Atliekamas IF arba PGR testas, jam naudojant baklažano sultis, ir atliekamas išskyrimas tinkamoje (selektyvioje) terpėje (žr. 8 skirsnį). Galima dažyti ir pagal Gramą (9 priedėlis). Identifikuojamos įtariamos išgrynintos C. m. subsp. sepedonicus ir patvirtinamas patogeniškumas (žr. 9 ir 10 skirsnius).
7.10. Tam tikromis sąlygomis, ypač kai augimo sąlygos nėra optimalios, yra galimybė, kad C. m. subsp. Sepedonicus baklažanuose sukels latentinę infekciją net praėjus 4 savaičių trukmės inkubaciniam laikotarpiui. Jei po 4 savaičių simptomai nėra stebimi, atliekamas 1 cm ilgio stiebo dalies sudėtinio bandinio, paimto iš aukščiau nei inokuliacijos vieta, IF/PGR testas. Jei testo rezultatai teigiami, reikėtų 8 skirsnyje nurodyta tvarka atlikti pakartotinį išskyrimą tinkamoje (selektyvioje) terpėje. Identifikuojamos įtariamos išgrynintos C. m. subsp. sepedonicus ir patvirtinamas patogeniškumas (žr. 9 ir 10 skirsnius).
Biotesto rezultatų aiškinimas
Biotesto tinkami rezultatai gaunami, kai teigiamuose kontroliniuose augaluose pasireiškia tipiški simptomai ir iš šių augalų galima pakartotinai išskirti bakterijas, o neigiamuose kontroliniuose augaluose simptomai nėra pastebimi.
Biotestas yra neigiamas, jei tiriamieji augalai nėra užkrėsti C. m. subsp. sepedonicus, ir laikomasi nuostatos, kad C. m. subsp. sepedonicus nustatomas teigiamuose kontroliniuose augaluose.
Biotestas yra teigiamas, jei tiriamieji augalai yra užkrėsti C. m. subsp. sepedonicus.
8. C. M. SUBSP. SEPEDONICUS IŠSKYRIMAS
Pastabos:
Diagnozė baigiama tik tuo atveju, jei C. m. subsp. sepedonicus išskiriamas ir vėliau yra identifikuojamas (žr. 9 skirsnį) ir patvirtinamas patogeniškumas (10 skirsnis). Nors C. m. subsp. sepedonicus yra išrankus organizmas, jį galima išskirti iš simptominio audinio.
Tačiau jo augimą gali užmaskuoti peraugusios saprofitinės bakterijos, todėl tiesioginis išskyrimas iš stiebagumbio arba stiebo audinio nuosėdų yra sudėtingas (žr. 3.1.6 arba 3.2.5 skirsnį). Naudojant atrankinę terpę ir atitinkamai praskiedžiant pakartotinai suspenduotas bulvių stiebagumbių viršūnės gabaliukų nuosėdas, galima atlikti tiesioginį C. m. subsp. sepedonicus išskyrimą.
Išskirti reikia iš visų simptominių bulvių stiebagumbių ar stiebo segmentų ir iš baklažanų, kuriuose simptomai nebuvo stebimi, tačiau sudėtinio bandinio IF/PGR testo rezultatai buvo teigiami (žr. 7.10 skirsnį). Kai būtina, baklažanų stiebai išmirkomi 3.1.3 skirsnyje aprašyta tvarka.
Ruošiant teigiamus kontrolinius bandinius, yra atliekami C. m. subsp. sepedonicus štamų (pvz., NCPPB 4053 arba PD 406) 106 ksv/ml ląstelių suspensijos praskiedimai 1:10. Siekiant išvengti taršos, teigiami kontroliniai bandiniai paruošiami atskirai nuo tiriamųjų bandinių.
Kiekvienos selektyvios terpės partija prieš pradedant įprastinių bandinių tyrimą patikrinama pagal patogeno gebėjimą augti joje.
Kontrolinė medžiaga tiriama taip pat kaip ir bandinys.
8.1. Selektyvus pasėjimas į lėkšteles
8.1.1. 100 ml tūrio pakartotinai suspenduotas bulvių nuosėdų bandinys arba baklažanų sultys nuosėdų buferiniame tirpale praskiedžiamos praskiedimo 1:10 principu. (3 priedėlis).
8.1.2. Išskyrimas iš nepraskiestų bulvių nuosėdų paprastai būna nesėkmingas dėl C. m. subsp. sepedonicus išrankaus augimo ir saprofitinių bakterijų konkurencijos. Kadangi užkrėstuose audiniuose bakterijos populiacija būna gausi, saprofitus galima pašalinti patogenui išliekant. Todėl rekomenduojama 100 ml kiekvieno bandinio praskiesti santykiu nuo 1:100 iki 1:10 000 MTNA arba NCP-88 terpėje (5 priedėlis) (jei naudojamos 90 mm skersmens Petri lėkštelės, tai tūris modifikuojamas, naudojant kitų dydžių plokšteles), naudojant skleistukus (L formos lazdeles) ir taikant paskleidimo lėkštelėje metodą.
Pastaba.
Kitas būdas yra 100 ml bulvių nuosėdų alikvotinės dalies pasėjimas paskleidimo būdu pirmoje agaru užpildytoje lėkštelėje, naudojant skleistuką, kuris vėliau perkeliamas į antrą lėkštelę, nuo jo pašalinant bet kokias nuosėdas ruožuojant; galiausiai ši operacija pakartojama trečioje lėkštelėje, sukuriant praskiedimo persėjimo į lėkšteles būdu efektą, tam naudojant skleistuką.
8.2. Įtariamų kolonijų gryninimas
Pastaba.
Į C m. subsp. sepedonicus panašių kolonijų persėjimą reikėtų atlikti MGT terpėje baklažano inokuliacijai ir (arba) paskesniam identifikavimui; tai turėtų būti atliekama prieš kolonijų peraugimą lėkštelėse, pvz., geriausia po 3-5 dienų.
8.2.1. Persėti į C. m. subsp. sepedonicus panašias kolonijas į vieną iš šių terpių: (jų sudėtis aprašyta 5 priedėlyje): mitybinės dekstrozės agarą (tik persėjimui), mielių peptono gliukozės agarą, mielių ekstrakto mineralinių druskų terpę. Inkubuoti 21-24 °C temperatūroje iki 10 dienų.
C. m. subsp. sepedonicus auga lėtai, dažnai per 10 dienų sudaro smeigtuko pavidalo kreminės spalvos skliautiškai išsidėsčiusias kolonijas (C. m. subsp. sepedonicus tipiškų kolonijų nuotraukų galima rasti tinklavietėje http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
8.2.2. Dar kartą persėti siekiant sukurti gryną kultūrą.
Augimo greitį galima padidinti persėjimu. Tipiškos kolonijos yra balto kremo arba dramblio kaulo spalvos, retkarčiais geltonos spalvos, apvalios, lygios, išsipūtusios, sudarančios skliautą, gleivėtos, turinčios lygius kraštus, jų skersmuo yra 1-3 mm.
Paskesniam testavimui kolonijos atrenkamos jas dažant Gramo būdu (9 priedėlis).
9. IDENTIFIKAVIMAS
Įtariamų C. m. subsp. sepedonicus izoliatų grynos kolonijos identifikuojamos taikant bent du testus, pagrįstus skirtingais biologiniais principais.
Atliekant kiekvieną testą, naudojami atitinkami etaloniniai štamai.
9.1. Mitybiniai ir fermentiniai identifikavimo testai
Fenotipinės savybės, kurios paprastai stebimos arba nėra stebimos C. m. subsp. sepedonicus atveju, nustatomos Lelliott ir Stead (1987), Klement et ai. (1990), Schaad (2001) ir anoniminio autoriaus (1987) aprašytais metodais.
Visos terpės turėtų būti inkubuojamos 21 °C temperatūroje ir praėjus šešioms dienoms tiriamos. Jei kolonijos neauga, terpės inkubuojamos dar 20 dienų.
Visi testai privalo būti atliekami naudojant žinomą C. m. subsp. sepedonicus kontrolinį bandinį. Atliekant mitybinius ir fiziologinius testus, naudojamas inokuliatas, persėtas į mitybinį agarą. Morfologinį palyginimą privaloma atlikti naudojant dekstrozės agare auginamas kolonijas.
| Testai |
Numatomas rezultatas: |
| Oksidacijos/fermentacijos(O/F) testas |
Inertiškas arba silpnai hidrolizuojasi |
| Oksidazės aktyvumas |
- |
| Augimas 37 °C temperatūroje |
- |
| Ureazės aktyvumas |
- |
| Aeskulino hidrolizė |
+ |
| Krakmolo hidrolizė |
- arba silpna hidrolizė |
| Tolerancija 7 % NaCl |
- |
| Indolo sintezė |
- |
| Katalazės aktyvumas |
+ |
| H2S sintezė |
- |
| Citrato sunaudojimas |
- |
| Želatinos suskystėjimas |
- |
| Rūgštis iš glicerino |
- |
| Rūgštis iš laktozės |
- arba silpnas |
| Rūgštis iš ramnozės |
- |
| Rūgštis iš salicino |
- |
| Dažymasis pagal Gramą (9 priedėlis) |
+ |
9.2. IF testas
9.3. PGR testas
b) 100 ml ląstelių suspensijos 4 minutes uždaruose mėgintuvėliuose termostate arba vandens vonelėje pakaitinti 100 °C temperatūroje. Jei reikia, pridėti šviežiai paruošto NaOH, kad būtų pasiekta 0,05M galutinė koncentracija ir įvyktų ląstelių lizė. Po to bandinius galima saugoti -16-24 °C temperatūroje tol, kol jų prireiks.
c) Atitinkamomis PGR procedūromis padauginami C. m. subsp. sepedonicus būdingi matricinės DNR fragmentai (pvz., Pastrik, 2000; žr. 4 priedėlį; Li ir de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik ir Rainey, 1999; Schaad etal., 1999).
9.3. FISH testas
9.4. Riebiųjų rūgščių tipo nustatymas (FAP)
c) Riebiųjų rūgščių tipo nustatymo testo teigiamas rezultatas gaunamas, jei įtariamos kultūros riebiųjų rūgščių tipas atitinka teigiamo kontrolinio bandinio riebiųjų rūgščių tipą. C. m. sepedonicus būdingos riebiosios rūgštys yra 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 ir 17:0. Kitos gentys, tokios kaip Curtobacterium,
Arthrobacter ir Micrococcus, taip pat turi keletą šių rūgščių, tačiau 15:1 Anteiso A yra retai tarp šių bakterijų pasitaikanti riebioji rūgštis, nors visose Clavibacter spp. pasitaiko apie 1–5 %. C. m. sepedonicus atveju ši rūgštis pasitaiko apie 5 %.
10. PATVIRTINIMO TESTAS
Patogeniškumo testą privaloma atlikti galiausiai diagnozuojant C. m. subsp. sepedonicus ir įvertinant kultūrų, identifikuojamų kaip C. m. subsp. sepedonicus, virulentiškumą.
10.1. Paruošti apytiksliai 106 ląstelių, paimtų po 3 dienų auginimo iš atitinkamo teigiamo C. m. subsp. sepedonicus bandinio tiriamojo izoliato kultūrų ir atitinkamo teigiamo kontrolinio C. m. subsp. sepedonicus štamo, inokuliatą.
10.2. Inokuliuoti 5-10 baklažanų daigų 3 lapelio stadijoje esančius stiebus (7.3 arba 7.4 skirsnis).
10.3. Inkubuoti 18–24 °C temperatūroje, esant pakankamai šviesos ir palyginti daug drėgmės, tinkamai laistant, stengiantis išvengti permirkimo arba sausros sukeliamo poveikio (7.7 skirsnis). Esant grynoms kultūroms, tipiškas vytimas turėtų įvykti po 2 savaičių, tačiau augalų simptomų nebus stebima (žr. 7.8 skirsnį). Pasibaigus šiam laikotarpiui, augalai dar 3 savaitėms inkubuojami esant baklažanų augimui palankiai temperatūrai, neviršijančiai 25 °C (8 priedėlis). Jei po 3 savaičių simptomai nėra stebimi, C. m. subsp. sepedonicus kultūros negalima laikyti patogenine.
10.4. Išskirti iš simptominių augalų, nupjaunant stiebo dalį 2 cm virš inokuliavimo vietos. Pašalinta dalis susmulkinama ir suspenduojama nedideliame sterilaus distiliuoto vandens tūryje arba 50 mM fosfatiniame buferiniame tirpale (3 priedėlis). Išskiriama iš suspensijos skiedimo būdu paskleidžiant arba ruožuojant į MTNA ir YPGA terpes (5 priedėlis), 3–5 dienas inkubuojama 21–23 °C temperatūroje ir stebimas C. m. subsp. sepedonicus tipiškų kolonijų susiformavimas.
______________
1 priedėlis
Metodikas optimizuojančios ir patvirtinančios laboratorijos
| Laboratorija (1) |
Buvimo vieta |
Šalis |
| Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit |
Viena ir Lincas |
Austrija |
| Departement Gewasbescherming |
Merelbekas |
Belgija |
| Plantedirektoratet |
Lingbis |
Danija |
| Central Science Laboratory |
Jorkas |
Anglija |
| Scottish Agricultural Science Agency |
Edinburgas |
Škotija |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie |
Anžeras |
Prancūzija |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre |
Le Rheu |
Prancūzija |
| Biologische Bundesanstalt |
Kleinmachnovas |
Vokietija |
| Pflanzenschutzamt Hannover |
Hanoveris |
Vokietija |
| State Laboratory |
Dublinas |
Airija |
| Plantenziektenkundige Dienst |
Vageningenas |
Nyderlandai |
| Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre |
Aas |
Norvegija |
| Direcção-Geral de Protecção das Culturas |
Lisabona |
Portugalija |
| Nacionalni institut za biologijo |
Liubliana |
Slovėnija |
| Centro de Diagnóstico de Aldearrubia |
Salamanka |
Ispanija |
(1) Mokslininkai ryšiams palaikyti: žr. tinklavietę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main
______________
2 priedėlis
Pagrindinių atrankos testų PGR/IF ir FISH teigiamų ir neigiamų kontrolinių bandinių paruošimas
C. m. subsp. sepedonicus virulentiškas štamas [NCPPB 4053 arba PD 406] 72 valandas auginamas MTNA pagrindinėje terpėje ir suspenduojamas 10 mM fosfatiniame buferiniame tirpale, kad ląstelių tankis siektų apie 1-2 x 108 kfv/ml. Paprastai gaunama šiek tiek drumsta suspensija, kurios optinis tankis, matuojamas 600 nm bangų ilgio spektre, yra 0,2.
Stiebagumbių viršūnės gabaliukai išpjaunami iš 200 baltą odelę turinčios veislės stiebagumbių, kurie, kaip žinoma, neužkrėsti C. m. subsp. sepedonicus.
Stiebagumbių viršūnės gabaliukai susmulkinami taip, kaip įprasta, o gautos nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 10 ml.
Į dešimt sterilių 1,5 ml tūrio miniatiūrinių mėgintuvėlių įpilama po 900 ml pakartotinai suspenduotų nuosėdų.
100 ml C. m. subsp. sepedonicus suspensijos įpilama į pirmąjį miniatiūrinį mėgintuvėlį. Suplakama. Penkiuose paskesniuose miniatiūriniuose mėgintuvėliuose atliekami užkrato praskiedimai 1/10.
Šeši miniatiūriniai mėgintuvėliai su užkratu bus naudojami kaip teigiami kontroliniai bandiniai. Keturi miniatiūriniai mėgintuvėliai be užkrato bus neigiami kontroliniai bandiniai. Šie mėgintuvėliai atitinkamai paženklinami.
Į sterilius 1,5 ml tūrio miniatiūrinius mėgintuvėlius įpilama po 100 ml alikvotinių dalių ir gaunama po 9 kiekvieno kontrolinio bandinio pakartojimus, kurie iki panaudojimo yra saugomi -16–24 °C temperatūroje.
Atliekant IF testą, C. m. subsp. sepedonicus buvimas ir kiekis pirmiausia nustatomi kontroliniuose bandiniuose.
Atliekant kiekvienos serijos tiriamųjų bandinių PGR testą, DNR išskiriama tiek iš teigiamų, tiek iš neigiamų kontrolinių bandinių.
Atliekant kiekvienos serijos tiriamųjų bandinių IF ir FISH testą, tiriami ir teigiami, ir neigiami kontroliniai bandiniai.
Atliekant IF, FISH ir PGR testus, C. m. subsp. sepedonicus būtina aptikti mažiausiai 106 ląstelių ir esant 104 ląstelių/ml tankiui tik teigiamuose kontroliniuose bandiniuose, o ne neigiamuose kontroliniuose bandiniuose.
______________
3 priedėlis
Buferiniai tirpalai tyrimui
BENDRA PASTABA. Neatidarytose steriliose talpyklose buferinius tirpalus galima saugoti iki vienerių metų.
1. Buferiniai tirpalai išskyrimui
1.1. Ekstrahavimo buferinis tirpalas (50 mM fosfatinis buferinis tirpalas, pH 7,0)
Šis buferinis tirpalas naudojamas bakterijai išskirti iš augalinės kilmės audinių homogenizacijos arba kratymo būdu.
Na2HPO4 (bevandenis) 4,26 g
KH2PO4 2,72 g
Distiliuotas vanduo 1,00 l
Ištirpinti ingredientus, patikrinti pH ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.
Galima panaudoti šias papildomas sudedamąsias dalis:
|
|
Naudojimo tikslas |
Kiekis 1 litre |
| Lubrolio dribsnius |
Deflokuliantas (*) |
0,5 g |
| DC (tiesioginio stingimo) silicio priešputis |
Priešputis (*) |
1,0 ml |
| Tetranatrio pirofosfatas |
Antioksidantas |
1,0g |
| Polivinilpirolidonas-40 000 (PVP-40) |
PGR inhibitorių surišėjas |
50 g |
| (*) Naudoti išskiriant homogenizacijos metodu. |
||
1.2. Nuosėdų buferinis tirpalas (10 mM fosfatinis buferinis tirpalas, pH 7,2)
Šis buferinis tirpalas naudojamas bulvių stiebagumbių viršūnių gabaliukų ekstraktų pakartotiniam suspendavimui ir praskiedimui baigus nuosėdų koncentravimą centrifuguojant.
Na2HPO4.12H2O 2,7 g
NaH2PO4.2H2O 0,4 g
Distiliuotas vanduo 1,00 l
Ištirpinti ingredientus, patikrinti pH ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.
2. Buferiniai tirpalai IF testui
2.1. IF-buferinis tirpalas (10 mM fosfatinis buferinis druskos tirpalas (PBS), pH 7,2)
Šis buferinis tirpalas naudojamas antikūnų praskiedimams atlikti.
Na2HPO4.12H2O 2,7 g
NaH2PO4.2H2O 0,4 g
NaCl 8,0 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ištirpinti ingredientus, patikrinti pH ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.
2.2. IF-buferinis tirpalas, turintis Tween
Šis buferinis tirpalas naudojamas plokštelėms plauti. Į IF buferinį tirpalą įpilti 0,1 % Tween-20.
2.3. Fosfatinis buferinis glicerino tirpalas, pH 7,6
Šis buferinis tirpalas naudojamas kaip sukibimo skystis IF plokštelių langeliuose fluorescencijai sustiprinti.
Na2HPO4.12H2O 3,2 g
NaH2PO4.2H2O 0,15 g
Glicerinas 50 ml
Distiliuotas vanduo 100 ml
Priešblukinančiu aktyvumu pasižyminčius sukibimą skatinančius tirpalus galima įsigyti prekyboje, pvz., komercinį tirpalą Vectashield® (Vector Laboratories) arba Citifluor® (Leica).
______________
4 priedėlis
Užkrėtimo laipsnio nustatymas IF ir FISH testais
2. Nustatyti tipiškų fluorescuojančių ląstelių viename mikroskopu stebimos plokštelės langelyje skaičių (C).
C = c x S/s,
čia S = daug langelių turinčios plokštelės langelio paviršiaus plotas ir
s = objektyvo laukelio paviršiaus plotas.
s = πi2/4G2K2, čia i = lauko koeficientas (kinta nuo 8 iki 24 priklausomai nuo okuliaro tipo),
K = vamzdelio koeficientas (1 arba 1,25),
G = objektyvo padidinimas (100 kartų, 40 kartų ir pan.).
5 priedėlis
C. m. subsp. sepedonicus išskyrimo ir auginimo terpė
a) Pagrindinė auginimo terpė
Mitybinis agaras (MA)
Mitybinis agaras (Difco) 23,0 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ingredientus ištirpinti ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.
Mitybinis dekstrozės agaras (MDA)
Difco bakterijų mitybinis agaras, turintis 1 % D(+) gliukozės (monohidrato). 20 minučių sterilizuoti autoklave 115 °C temperatūroje.
Mielių peptono gliukozės agaras (MPGA)
Mielių ekstraktas (Difco) 5,0 g
Baktopeptonas (Difco) 5,0 g
D(+) gliukozė (monohidratas) 10,0 g
Baktoagaras (Difco) 15,0 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ingredientus ištirpinti ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.
Mielių ekstrakto mineralinių druskų terpė (MGT)
Bacto – mielių ekstraktas (Difco) 2,0 g
D(+) Gliukozė (monohidratas) 2,5 g
K2HPO4 0,25 g
KH2PO4 0,25 g
MgSO4.7H2O 0,1 g
MnSO4. H2O 0,015 g
NaCl 0,05 g
FeSO4.7H2O 0,005 g
Baktoagaras (Difco) 18 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ingredientus ištirpinti 0,5 l terpės ir 20 minučių sterilizuoti autoklave 115 °C temperatūroje.
b) Patvirtintos selektyvios auginimo terpės
MTNA terpė
Visi terpės komponentai gauti iš bendrovės „BDH“, nebent nurodyta kitaip:
Mielių ekstraktas (Difco) 2,0 g
Manitolis 2,5 g
K2HPO4 0,25 g
KH2PO4 0,25 g
NaCl 0,05 g
MgSO4.7H2O 0,1 g
MnSO4. H2O 0,015 g
FeSO4.7H2O 0,005 g
Oxoid (Nr. 1) agaras 16,0 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ištirpinti ingredientus, nustatyti pH 7,2. Baigus sterilizavimą autoklave (15 minučių 121 °C temperatūroje) ir atvėsinus iki 50 °C temperatūros, pridedama antibiotikų: trimetoprimo – 0,06 g, nalidiksilo rūgšties – 0,002 g ir amfotericino B – 0,01 g.
Antibiotikų pradiniai tirpalai: trimetoprimą (Sigma) ir nalidiksilo rūgštį (Sigma) (abiejų koncentracijai esant 5 mg/ml) ištirpinti 96 % metanolio tirpale, amfotericiną B (Sigma) (1 mg/ml) – dimetilsulfoksido tirpale. Pradiniai tirpalai sterilizuojami filtruojant.
Pastaba.
Pagrindinės terpės galiojimo laikas – 3 mėnesiai. Pridėjus antibiotikų, terpės galiojimo laikas yra vienas mėnuo, jei laikoma šaltai.
NCP-88 terpė 23 g
Mitybinis agaras (Difco)
Mielių ekstraktas(Difco) 2 g
D-manitolis 5 g
K2HPO4 2 g
KH2PO4 0,5 g
MgSO4.7 H2O 0,25 g
Distiliuotas vanduo 1,0 l
Ištirpinti ingredientus, nustatyti pH 7,2. Baigus sterilizavimą autoklave ir atvėsinus iki 50 °C temperatūros pridedama antibiotikų: polimiksino B sulfato (Sigma) – 0,003 g, nalidiksilo rūgšties (Sigma) – 0,008 g ir cikloheksimido (Sigma) – 0,2 g.
Antibiotikai ištirpinami pradiniuose tirpaluose: nalidiksilo rūgštis – 0,01 M NaOH, cikloheksimidas – 50 % etanolyje ir polimiksinas B – distiliuotame vandenyje. Pradiniai tirpalai sterilizuojami filtruojant.
Pastaba.
Pagrindinės terpės galiojimo laikas – 3 mėnesiai. Pridėjus antibiotikų, terpės galiojimo laikas yra vienas mėnuo, jei laikoma šaltai.
______________
6 priedėlis
Patvirtinta PGR metodika ir reagentai
Pastaba.
Atliekant išankstinį testą viename bandinio ekstrakto mililitre turėtų būti pakartotinai aptinkama mažiausiai 103–104 C. m. sepedonicus ląstelių.
Atliekant išankstinį tyrimą, auginant pasirinktą bakterijų štamų rinkinį taip pat neturėtų būti gaunama netikrųjų teigiamų rezultatų.
1. Daugkartinės PGR naudojant vidinį PGR kontrolinį bandinį metodika (Pastrik, 2000)
1.1. Oligonukleotidiniai pradmenys
Priešakinis pradmuo PSA-l 5'- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3'
Atvirkštinis pradmuo PSA -R 5'- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3'
Priešakinis pradmuo NS-7-F 5'- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3'
Atvirkštinis pradmuo NS-8-R 5'- tcc gca ggt tca cct acg ga -3'
C. m. subsp. sepedonicus matricinės DNR numatomos padauginti kopijos dydis – apie 502 bp (PSA-pradmenų rinkinys).
Vidinio kontrolinio bandinio 18S rRNA numatomas padaugintos matricinės DNR kopijos dydis – 377 bp (NS-pradmenų rinkinys).
1.2. PGR reakcinis mišinys
| Reagentas |
Reakcinis kiekis |
Galutinė koncentracija |
| Sterilus YGV (ypač grynas vanduo) |
15,725ml |
|
| 10 x koncentruotas PGR buferinis tirpalas (1) (15 mM MgCl2) |
2,5 ml |
11 x (1,5 mM MgCl2) |
| GSA (V frakcija) (10%) |
0,25 ml |
0,1 % |
| d-nTP mišinys (20mM) |
0,125 ml |
0,1 mM |
| PSA-1 pradmuo (10mM) |
0,5 ml |
0,2 mM |
| PSA-R pradmuo (10mM) |
0,5 ml |
0,2 mM |
| NS-7-F pradmuo (10mM) (2) |
0,1 ml |
0,04 mM |
| NS-8-R pradmuo (10mM) (2) |
0,1 ml |
0,04 mM |
| Taq polimerazė (5U/ml) (1) |
0,2 ml |
1,0 U |
| Bandinio tūris |
5,0 ml |
|
| Bendras tūris |
25,0 ml |
|
(1) Metodai patvirtinti naudojant Taq polimerazę, gautą iš bendrovės „Perkin Elmer“ (AmpliTaq arba Gold) ir bendrovės „Gibco BRL“.
(2) Pradmenų NS-7 F ir NS-8-R koncentracijos buvo optimizuotos atsižvelgiant į bulvių stiebagumbių viršūnių kūgio formos gabaliukų išskyrimą homogenizacijos ir DNR gryninimo metodu pagal Pastriką (2000) (žr. 6.1. a ir 6.2 skirsnius). Pakartotinė reagentų koncentracijų optimizacija bus reikalinga, jei taikomas išskyrimo kratymo būdu metodas arba kiti DNR metodai.
_______________________________________________________________
1.3. PGR reakcijos sąlygos
Reakciją vykdyti pagal šią programą:
1 ciklas: i) 3 minutės 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija);
10 ciklų: ii) 1 minutė 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija);
iv) 1 minutė 72 °C temperatūroje (matricinės DNR kopijos liginimas);
25 ciklai: v)30 sekundžių 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija);
vii) 1 minutė 72 °C temperatūroje (matricinės DNR kopijos liginimas);
1 ciklas: viii) 5 minutės 72 °C temperatūroje (galutinis liginimas);
1.4. Padaugintos matricinės DNR restrikcijos fermentų analizė
Padauginus C. m. subsp. sepedonicus DNA, gauti PGR produktai buvo veikiami restriktaze Bgl II, 30 minučių inkubuojant 37 °C temperatūroje, ir buvo stebimas skirtingo ilgio restrikcinio fragmento polimorfizmas. Restrikcinių fragmentų, gautų iš C. m. subsp. sepedonicus būdingo fragmento, ilgis yra 282 bp ir 220 bp.
2. Įnešimo buferinio tirpalo paruošimas
2.1. Bromfenolio mėlynasis (10% pradinis tirpalas)
Bromfenolio mėlynasis 5 g
Distiliuotas vanduo (perdistiliuotas) 50 ml
3. 10X Tris acetato EDTA (TAE) buferinis tirpalas, pH 8,0
Tris buferinis tirpalas 48,4 g
Acto ledinė rūgštis 11,42 ml
EDTA (dinatrio druska) 3,72 g
Distiliuotas vanduo 1,00 l
Praskiesti 1 kartą prieš naudojimą.
Visi reagentai įsigyjami prekyboje (iš bendrovės „Invitrogen“ ar panašios bendrovės).
______________
7 priedėlis
FISH testui patvirtinti reagentai
1. Oligo-bandiniai
Cms-specifinis bandinys CMS-CY3-01 5'- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3'
Nespecifinis eubakterijų bandinys EUB-338-FITC 5'- gct gcc tcc cgt agg agt-3'
2. Fiksavimo tirpalas
(DĖMESIO! FIKSAVIMO TIRPALE YRA TOKSIŠKO PARAFORMALDEHIDO. DIRBDAMI MŪVĖKITE PIRŠTINES IR NEĮKVĖPKITE. REKOMENDUOJAMA DIRBTI TRAUKOS SPINTOJE.)
i) 9 ml molekulinės biologijos darbams skirto vandens (pvz., ypač gryno vandens (YGV) pakaitinti 60 °C temperatūroje ir pridėti 0,4 g paraformaldehido. Paraformaldehidas ištirpsta įdėjus 5 lašus 1N NaOH ir maišant magnetine maišykle.
ii) Nustatomas pH 7,0, įdėjus 1 ml 0,1 M fosfatinio buferinio tirpalo (FB; pH 7,0) ir 5 lašus 1N HC1. Indikatorinėmis juostelėmis patikrinti pH ir nustatyti pH, jei reikia, įdedant HCl arba NaOH.
(DĖMESIO! PH MATAVIMO PRIETAISO NENAUDOTI TIRPALUOSE SU PARAFORMALDEHIDU.)
iii) Tirpalą filtruoti 0,22 mM membraniniu filtru ir, kol bus toliau naudojamas, nuo dulkių saugoti 4 °C temperatūroje.
3. 3X Hybmix tirpalas
NaCl 2,7 M
Tris-HCl 60 mM (pH 7,4)
EDTA (filtruotas steriliu filtru ir sterilizuotas autoklave) 15 mM
Praskiesti 1 kartą, kaip reikalaujama.
1 kartą koncentruotas Hybmix
Natrio dodecilsulfatas (SDS) 0,01 %
bandinys EUB 338 5ng/ml
bandinys CMSCY301 5ng/ml
Paruošti hibridizavimo mišinio kiekius pagal 1 lentelėje pateikiamus apskaičiavimus. Kiekvienai plokštelei (į kurios langelius įpilama po 2 skirtingus bandinius ir jų kartotinius) reikia 90 ml hibridizavimo tirpalo.
Lentelė. Siūlomi kiekiai hibridizavimo mišiniui paruošti
|
|
2 plokštelės |
8 plokštelės |
|
| Sterilus YGV |
50,1 |
200,4 |
|
| 3x hybmix |
30,0 |
120,0 |
|
| 1 %SDS |
0,9 |
3,6 |
|
| Bandinys EUB 338 (100 ng/ml) |
4,5 |
18,0 |
|
| Bandinys CMSCY301 (100 ng/ml) |
4,5 |
18,0 |
|
|
|
Bendras tūris (ml) |
90,0 |
360,0 |
Pastaba. Visus tirpalus, turinčius šviesai jautrių oligonukleotidinių bandinių, saugoti tamsoje -20 °C temperatūroje. Naudojimo metu saugoti nuo tiesioginės saulės arba elektros šviesos.
8 priedėlis
Baklažano kultūra
Baklažano (Solanum melongena) sėklos pasodinamos pasterizuotame sėklų komposte. Daigai su visiškai išsiskleidusiomis sėklaskiltėmis (10–14 dienų) persodinami į vazonėlį su pasterizuotu kompostu.
Baklažanai turi būti auginami šiltnamyje esant tokioms aplinkos sąlygoms:
dienos ilgumas 14 valandų arba natūralus dienos ilgumas, jeigu diena ilgesnė;
temperatūra dieną 21–24 °C,
naktį 15 °C.
Jautrios baklažanų veislės: „Black Beauty“,
„LongTom“,
„Rima“,
„Balsas“.
Tiekėjas: žr. tinklavietę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main
______________
9 priedėlis
Dažymas Gramo būdu (Hukerio Modifikacija) (Doetsch, 1981 m.) (1)
___________
(1) Galima naudoti ir parduodamus tirpalus bei dažymo reikmenis.
Kristalvioleto tirpalas
2 g kristalvioleto ištirpinama 20 ml 95 % etanolio. 0,8 g amonio oksalato ištirpinama 80 ml distiliuoto vandens. Šie du tirpalai sumaišomi.
Liugolio jodas
Jodas 1 g
Kalio jodidas 2 g
Distiliuotas 300 ml
Kietosios medžiagos kartu sutrinamos grūstuve. Supilama į vandenį ir uždarame inde išmaišoma, kad ištirptų. Safranino kontradažymo tirpalas.
Pradinis tirpalas:
Safraninas 2,5 g
95% etanolis 100 ml
Sumaišoma ir laikoma.
Praskiedžiama 1:10 norint gauti darbinį tirpalą.
Dažymo tvarka
6. Išblukinama lašinant 95 % etanolį, kol spalva nebebluks, arba atsargiai maišant pamerkiama 30 sekundžių.
9. Nuplaunama vandeniu iš čiaupo ir sausai išdžiovinama.
Gram (+) bakterijos nusidažo violetine mėlyna spalva; Gram (-) bakterijos nusidažo rausvai raudona spalva.
Užkonservavimas
1. Kiekvienu įtariamu organizmo buvimo atveju, kai taikant anksčiau išdėstytus metodus buvo gautas teigiamas atrankos testo rezultatas, ir baigus šį tyrimą yra laukiama patvirtinimo arba paneigimo, reikia atskirti ir tinkamai užkonservuoti:
– visus atrinktus bandiniams stiebagumbius ir, jei įmanoma, visus atrinktus augalus,
– bet kurį likusį ekstraktą ir atrankos testui paruoštą papildomą medžiagą, pvz., imunofluorescencines skaidres
ir
– visus atitinkamus dokumentus,
kol tyrimas taikant minėtus metodus bus baigtas.
Atskyrus stiebagumbius, tam tikrais atvejais bus galima ištirti įvairias veisles.
2. Jeigu organizmo buvimas patvirtinamas, reikia atskirti ir tinkamai užkonservuoti:
– visą medžiagą, minėtą 1 dalyje,
ir
– užkrėstos baklažanų medžiagos bandinį, kuris buvo inokuliuotas stiebagumbio arba augalo ekstraktu,
ir
– išskirtą organizmo kultūrą,
mažiausiai per vieną mėnesį nuo pranešimo kitoms valstybės narėms ir Komisijai nurodyta tvarka.
______________
NUORODOS
1. Anonymous, 1987. Scheme of the detection and diagnosis of the ring rot bacterium Corynebacteriun sepedonicum in batches of potatoe tubers. Commission of the European Communities, Luxembourg. Publ EUR 11 288 EN, 21 pp.
2. Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213–218.
3. Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14 (2), 147–152.
4. Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. In: Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, 21–23.
5. Hugh, R. and Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24–26.
6. Janse, J. D., 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335–345.
7. Janse, J. D. and J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bull., No 17, 1987, pp. 1–10.
8. Jansing, H. and K. Rudolph, 1998. Physiological capabilities of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus and development of a semiselective medium. Journal of Plant Diseases and Protection, 105, 590–601.
9. Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, Lond., 178, 703.
10. Klement Z.; Rudolph, K and D. C Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.
12. Lelliott, R. A., E. Billing and A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470–489.
13. Lelliott, R. A. and P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101–106.
14. Li, X. and S. H. de Boer, 1995. Selection of Polymerase Chain Reaction primers from RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Phytopathology, 85, 837–842.
15. Mills, D., Russell, B., W. and J., W. Hanus, 1997. Specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus by amplification of three unique DNA sequences isolated by subtraction hybridization. Phytopathology, 87, 8, 853–861.
16. Pastrik, K. -H. and R. A. Rainey. 1999. Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques. J. Phytopathology 147; 687–693.
17. Pastrik, K.-H., 2000. Detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155–165.
18. Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp.
19. Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. and Knorr, D. (1999) Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated realtime fluorescence detection system. Plant Disease 83; 1095–1100.
20. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. – 3. ed.; St. Paul, Minnesota:, 373 pp.
21. Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.
22. Smith, N. C; Hennesy, J; Stead, D. E., 2001. Repetittive sequence-derived PCR profiling using the BOX-AlRalstoniasolanacearum primer for rapid identification of plant pathogen Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. European Journal of Plant Pathology, 107 (7), 739–748.
23. Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481–527.
24. Stead, D. E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281–295.