LIETUVOS RESPUBLIKOS SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRO
Į S A K Y M A S
DĖL METODINIŲ REKOMENDACIJŲ „HISTAMINO KIEKIO NUSTATYMAS ŽUVIES PRODUKTUOSE“ PATVIRTINIMO
2001 m. sausio 5 d. Nr. 11
Vilnius
Vykdydamas Lietuvos Respublikos teritorijoje galiojančių teisės aktų, priimtų iki 1990 m. kovo 11 d., pripažinimo netekusiais galios įstatymą (Žin., 1997, Nr. 108-2729, Nr. 118-3045; 1998, Nr. 115-3245; 1999, Nr. 107-3100) ir vadovaudamasis Maisto įstatymo (Žin., 2000, Nr. 32-893) 9 straipsnio 2 dalimi,
PATVIRTINTA
sveikatos apsaugos ministro
2001 m. sausio 5 d. įsakymu Nr. 11
Histamino kiekio nustatymas žuvies produktuose
(Metodinės rekomendacijos)
I. Bandinių paruošimas
1. Bandinių atrinkimas ir jų laikymas.
Bandiniai atrenkami pagal GOST 7631-85 „Žuvys, jūrų žinduoliai, jūrų bestuburiai ir jų perdirbimo produktai. Priėmimo sąlygos, organoleptiniai kokybės įvertinimo metodai, bandinių atrinkimo laboratoriniams bandymams metodai“ ir GOST 87560-70 „Konservuoti maisto produktai. Bandinių atrinkimas ir paruošimas bandymams „ arba kitus galiojančius bandinių atrinkimo dokumentus.
Atrinkti bandiniai tuoj pat pristatomi į laboratoriją. Jei bandinio negalima pristatyti ilgiau kaip per 1 val., šviežios žuvys turi būti gabenamos atšaldytos, o šaldytos – užšaldytos. Bandiniai tiriami tą pačią dieną, pristačius juos į laboratoriją. Nesant tokios galimybės, bandiniai turi būti laikomi ne aukštesnėje kaip minus 8 oC temperatūroje ir ne ilgiau kaip tris paras.
Konservų bandiniai pristatomi ir laikomi, taip pat kiti bandiniai laikomi tik pagal galiojančius instrukcijas ir standartus.
2. Bandinio paruošimas bandymams.
Atrinktos bandymui žuvys atšildomos, nuvalomi mechaniniai nešvarumai, nuskutami žvynai. Žuvų plauti negalima.
Tiriant stambias žuvis imama tiktai mėsa be odos ir kaulų. Nupjaunama žuvies galva ir pelekai, skrodena perpjaunama per pilvaplėvę ir išimami viduriai; nugara perpjaunama išilgai ir išimamas stuburas ir, jeigu galima, visi šonkauliai, o mėsa kartu su poodiniais riebalais kruopščiai nugrandoma nuo odos. Smulki žuvis bandoma visa.
Jeigu neišdarinėta žuvis sveria daugiau kaip 500 g, tai po išdarinėjimo smulkinama tik viena išilginė žuvies pusė.
Jeigu išilginė žuvies pusė sveria daugiau kaip 1 kg, ji pjaustoma skersai į gabalus, kurių plotis 2-4 cm, ir bandymui imamas kas antras gabalas.
Smulki neišdarinėta žuvis arba stambios žuvies mėsa du kartus sumalama mėsmale kaip galima greičiau, kruopščiai išmaišoma ir iš įvairių vietų atrenkamas bandymui reikalingas kiekis.
Bandant žuvų ir jūros gyvūnų konservus, iš visų dėžučių atrinktų bandinių nustačius sudėtinių dalių (skystosios ir kietosios) santykį, ruošiamas vienas bendras bandinys. Prieskonius (svogūnus, pipirus ir kt.) reikia išimti. Konservų kietoji dalis greitai du kartus sumalama mėsmale, sumaišoma su skystąja dalimi ir dalimis ištrinama porceliano grūstuvėje iki vienalytės masės. Konservus su padažu, sūrymu galima smulkinti audinių smulkintuvu. Iš taip paruošto bandinio paimti mėginį tolesniems bandymams.
II. Fluorescencinis histamino kiekio nustatymas žuvies produktuose
3. Metodo pagrindą sudaro histamino darinio, gauto veikiant histaminą ortoftalio aldehidu, intensyvios fluorescencijos matavimas. Metodo nustatymo riba – 0,1mg/kg, santykinis standartinis nuokrypis – 0,20-0,30. Įdėto į bandinį histamino standarto išgava sudaro 65-85%.
Metodas susideda iš tokių etapų:
4. Įrenginiai ir medžiagos.
4.3. Techninės svarstyklės, 3 kl. tikslumo, maksimali svėrimo riba 1 kg, leidžiama svėrimo paklaida ± 0,1 g.
4.4. Analitinės svarstyklės, 2 kl. tikslumo, maksimali svėrimo riba 200 g, leidžiama svėrimo paklaida ± 0,001 g.
4.5. Spektrofotometras SPEKOL (Karl Ceiss JENA) su matavimo priedu fluorescencijai nustatyti (šviesos filtrai: pirminis λ = 365 nm, antrinis λ = 465 nm). Galima naudoti fluorimetrą BIAN-130 (šviesos filtrai: pirminis λ = 365 nm, antrinis λ = 470 nm).
4.17. Jonitinė derva anijonitas ARA-12p (Cl-forma; frakcija 0,25-0,10 mm) arba kita, analogiškas savybes turinti anijonitinė derva.
Dervos perėjimas į OH-formą: 100 g dervos dedama į cheminę stiklinę, užpilama 150 ml 2 N natrio šarmu, pamaišoma ir paliekama 30 minučių. Skystis nupilamas ir vėl pridedama šarmo. Plovimo procedūra kartojama du kartus. Derva kruopščiai praplaunama distiliuotu vandeniu iki pH 7-8. Derva laikoma vandenyje.
Atlikus bandymą derva regeneruojama: užpilama 1N druskos rūgštimi, palaikoma 10-15 min., tirpalas nupilamas. Dervos apdorojimas rūgštimi kartojamas du kartus. Praplaunama distiliuotu vandeniu iki neutralios reakcijos ir derva pervedama į OH – formą taip, kaip aprašyta aukščiau.
5. Ekstrakcija.
10 g (0,01 g tikslumu) paruošto bandinio mėginys įdedamas į audinių mikrosmulkintuvo indą, pridedama 25 cm3 metanolio ir maišomas 5 min. Gautas mišinys perdedamas į 100 cm3 plokščiadugnę kūginę kolbą, smulkintuvo indas praplaunamas 15 – 20 cm3 metanolio ir supilama į kolbą su deflegmatoriumi, kaitinama 15 minučių 60oC temperatūros vandens vonelėje; po to atšaldomas iki kambario temperatūros ir filtruojamas per filtravimo popierių į 50 cm3 matavimo kolbutę. Nuosėdos plaunamos metanoliu ir ekstraktas praskiedžiamas iki žymės. Metanolio ekstraktą galima laikyti šaldytuve kelias savaites.
6. Ekstrakto valymas.
Stiklinė chromatografinė kolonėlė (60 x 30 mm) užpildoma jonitine dervos suspensija anijonitas ARA – 12 p. taip, kad susidarytų 40 mm aukščio stulpelis ir plaunama 20 cm3 distiliuotu vandeniu. (Dervą vanduo turi apsemti visą laiką.)
Įdedama 5 cm3 metanolio ekstrakto, pridedama 5 cm3 1 N druskos rūgšties, praleidžiama per kolonėlę ir eliuojama distiliuotu vandeniu, kol gaunama 35 cm3 eliuato. Eliuatą reikia laikyti šaldytuve.
7. Kalibracinės kreivės paruošimas.
Ruošiant pradinį tirpalą, turintį 10 mg/cm3 histamino, 2,5 mg histamino tirpinama 0,1 N druskos rūgštyje 250 cm3 matavimo kolbutėje. 1, 2 ir 3 cm3 pradinio tirpalo įpilama į 100 cm3 matavimo kolbutes ir iki žymės praskiedžiama 0,1 N druskos rūgštimi. Taip gaunami 0,1 mg/cm3, 0,2 mg/cm3 ir 0,3 mg/cm3 koncentracijos darbiniai tirpalai. Pagrindinis tirpalas laikomas šaldytuve savaitę, o darbiniai tirpalai gaminami kiekvieną dieną.
10 cm3 kiekvieno darbinio tirpalo įpilama į 50 cm3 kolbas, pridedama 10 cm3 0,1 N druskos rūgšties, 3 cm3 1 N natrio šarmo ir sumaišoma. Maišant dedama 1 cm3 0,1% O – ftalio aldehido metanolio tirpalo, po 4 min. pridedama 3 cm3 3,47 N fosforo rūgšties ir paliekama 1,5 val. kambario temperatūroje.
Išmatuojamas histamino darbinių tirpalų fluorescencijos intensyvumas λsužadinimo = 365 nm, λsemisijos = 465 nm.
Pagal gautus rezultatus gaunama fluorescencijos intensyvumo priklausomybės nuo histamino tirpalo koncentracijos kalibracinė kreivė. Kiekviena abscisių ašies padala atitinka 0,02 mg histamino 1 cm3 tirpale.
8. Kiekybinis histamino nustatymas žuvų produktuose.
10 cm3 eliuato įdedama į 50 cm3 kolbą, pridedama 10 cm3 0,1 N druskos rūgšties ir išmaišoma. Paskui atliekama procedūra, aprašyta „7. Kalibracinės kreivės paruošimas“. Jeigu žuvies bandiniai turi histamino daugiau kaip 100 mg/kg, būtina paimti 1 ml eliuato, pridėti 10 cm3 0,1 N druskos rūgšties ir toliau pakartoti kiekybinio histamino nustatymo procedūrą.
Kiekybiniam histamino kiekio nustatymui naudojama kalibracinė kreivė.
Histamino kiekis žuvyse H (mg/kg) apskaičiuojamas pagal formulę:
| H = |
Co∙A∙V∙F |
|
| B∙R |
čia: Co – histamino mėginio tirpalo koncentracija, nustatyta pagal kalibracinę kreivę, mg/cm3;
R -mėginio kiekis, g (10 g) paimtas bandymui;
A – metanolio ekstrakto tūris, cm3 (50 cm3);
B – metanolio ekstrakto kiekis, cm3 (5 cm3), praleistas per kolonėlę;
V – eliuato tūris, cm3 (35 cm3);
F – praskiedimo faktorius:
III. Kolorimetrinis histamino nustatymo žuvies produktuose metodas
9. Kolorimetrinis histamino nustatymo pagrindas – histamino spalvinio darinio, gauto veikiant histaminą diazoreaktyvu, absorbcijos matavimas. Metodo nustatymo riba – 10 mg/kg, santykinis standartinis nuokrypis, nustatant histaminą 20-175 mg/kg koncentracijų intervalu, kinta nuo 0,08 iki 0,25. Įdėto į bandinį histamino standarto išgava sudaro 94 – 99%.
10. Įrenginiai ir medžiagos.
10.2. Analitinės svarstyklės, 2 kl. tikslumo, maksimali svėrimo riba 200 g, leidžiama svėrimo paklaida ± 0,001 g.
10.3. Techninės svarstyklės, 3 kl. tikslumo, maksimali svėrimo riba 1 kg, leidžiama svėrimo paklaida ± 0,1 g.
10.8. Fotoelektrokolorimetras, su bangos ilgiu λ=490±10 nm arba spektrofotometras SF-26 (arba analogiškas).
11. Paranitroanilino tirpalo paruošimas.
Paranitroanilinas valomas, perkristalinant jį vandenyje. Paranitroanilinas ištirpinamas karštame distiliuotame vandenyje ir tirpalas atšaldomas iki kambario temperatūros. Iškritę kristalai nufiltruojami ir džiovinami 10-15 min. 80 oC temperatūroje, 0,1 g paranitroanilino ištirpinama 100 cm3 0,1 N druskos rūgšties. Iki naudojimo tirpalas laikomas šaldytuve.
12. Diazoreaktyvo paruošimas.
Diazoreaktyvas ruošiamas prieš naudojimą, sumaišant 10 cm3 paranitroanilino (1 g/dm3) tirpalo 0,1 N druskos rūgštyje ir 1 cm3 50 g/dm3 natrio nitrito tirpalo ir atšaldant iki 0oC.
13. N- butanolio, prisotinto vandens, paruošimas.
N – butanolis, prisotintas vandens, paruošiamas dalijamajame piltuve purtant 50 cm3 n-butanolio ir 20 cm3 distiliuoto vandens, fazėms atsiskyrus, atskiriamas viršutinis n-butanolinio sluoksnis.
14. Ekstrakcija.
10 g (0,01g tikslumu) paruošto bandinio mėginys įdedamas į audinių smulkintuvo indą, pridedama 25 cm3 5% trichloracto rūgšties tirpalo ir maišoma 5 min. Gautas mišinys sudedamas į 100 cm3 plokščiadugnę kūginę kolbą, audinių smulkintuvo indas plaunamas 2 kartus 5 – 10 cm3 5% trichloracto rūgšties tirpalu; gauti tirpalai sujungiami. Prie kolbos prijungiamas oro šaldytuvas ir išlaikomas 15 min. 6 oC temperatūroje. Visas atšaldytas mišinys supilamas į cilindrą ir praskiedžiamas iki 50 cm3 žymos 5% trichloracto rūgšties tirpalu ir filtruojamas per sulankstytą filtravimo popierių (1 filtratas).
15. Kalibracinės kreivės paruošimas.
Paruošiami histamino etaloniniai tirpalai koncentracijos 5, 10, 20 ir 40 µg/cm3 5% trichloracto rūgšties tirpale. Ruošiant pradinį histamino tirpalą, kurio koncentracija 40 µg/cm3, 4,0 mg histamino pasveriama į 100 cm3 matavimo kolbą, ištirpinama 5% trichloracto rūgšties tirpale ir tūris didinamas iki žymės. Darbiniai histamino tirpalai, 20, 10, 5 µg/cm3 koncentracijų, paruošiami praskiedžiant pradinį tirpalą atitinkamai 2, 4, 8 kartus 5% trichloracto rūgšties tirpalu. Pradinį histamino tirpalą galima laikyti šaldytuve 1 savaitę, o darbinius tirpalus reikia ruošti bandymo dieną.
5 cm3 kiekvieno etaloninio tirpalo įpilama į mėgintuvėlius su šlifo kamščiais, pridedama 1 cm3 20% natrio šarmo tirpalo ir maišant pilama bevandenio natrio karbonato, kol susidarys sotusis tirpalas. Pridedama 5 cm3 n-butanolio, prisotinto vandens, ir mėgintuvėliai 30 sek. energingai purtomi. Atsiskyrus fazėms, pipete arba švirkštu paimamas 3 cm3 viršutinis butanolio sluoksnis ir įdedamas į kitą mėgintuvėlį su šlifo kamščiu, turintį 3 cm3 0,1N druskos rūgšties tirpalo. Mėgintuvėlis purtomas 30 sek. Atsiskyrus fazėms, 2 cm3 apatinis vandeninis sluoksnis, pernešamas į kitą mėgintuvėlį, pridedama 2 cm3 4% natrio karbonato tirpalo ir laikoma 5 min. 0 oC temperatūroje. Į atšaldytą tirpalą pripilama 2 cm3 šalto, šviežiai paruošto diazoreaktyvo, supurtoma ir laikoma 5 min. 0oC temperatūroje. Pridedama 4 cm3 etilacetato ir energingai purtoma 30 sek. Atsiskyrus fazėms, sausa pipete atskiriamas viršutinis sluoksnis ir pernešamas į kitą mėgintuvėlį, turintį bevandenio natrio sulfato (etilacetatinis spalvoto darinio tirpalas privalo būti skaidrus). Tirpalo absorbcija matuojama esant 495 nm 1 cm optinio kelio ilgio kiuvetėje. Kaip palyginamasis tirpalas yra naudojamas etilacetatas. Pagal gautus duomenis nubrėžiama absorbcijos dydžio priklausomybės nuo histamino koncentracijos tirpale kalibracinė kreivė.
16. Bandymų eiga.
5 cm3 1 filtrato (14 p.) įdedama į mėgintuvėlį ir atliekama procedūra, aprašyta 15 p., pradedant nuo natrio šarmo tirpalo pridėjimo.
Jeigu bandiniai turi daugiau negu 200 mg/kg, būtina praskiesti gautą filtratą 5% trichloracto rūgšties tirpalu.
Histamino koncentracijai ekstrakte nustatyti naudojama kalibracinė kreivė.
17. Duomenų apdorojimas.
Histamino kiekis produkte H (mg/kg) apskaičiuojamas pagal formulę:
| H = |
c∙V∙ |
F |
| m |
čia: c – histamino koncentracija, nustatyta pagal kalibracinę kreivę, µg/cm3;
V – ekstrakto tūris, cm3 (50 cm3);
m – paimto bandymui mėginio masė, g (10 g);
| F – skiedimo faktorius (F = |
V 1 filtratas + V 5% trichloracto r. |
). |
| V 1 filtrtas |
Apskaičiuojama iki vienetų. Galutinis rezultatas skaičiuojamas išvedant vidurkį iš trijų paralelinių bandymų rezultatų reikšmių. Skirtumas tarp paralelinių bandymų neturi viršyti 50% nuo aritmetinio vidurkio.
______________