Įsakymas netenka galios 2008-06-01:
Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministerija, Įsakymas
Nr. V-94, 2008-02-14, Žin., 2008, Nr. 22-818 (2008-02-23), i. k. 1082250ISAK0000V-94
Dėl kai kurių Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro įsakymų pripažinimo netekusiais galios
Suvestinė redakcija nuo 2006-02-08 iki 2008-05-31
Įsakymas paskelbtas: Žin. 2004, Nr. 70-2472, i. k. 1042250ISAK000V-284
LIETUVOS RESPUBLIKOS SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRO
Į S A K Y M A S
DĖL CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ IR PREPARATŲ TOKSIŠKUMO IR KITŲ POVEIKIŲ SVEIKATAI TYRIMO MEODŲ PATVIRTINIMO
2004 m. balandžio 28 d. Nr. V-284
Vilnius
Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų įstatymo (Žin., 2000, Nr. 36-987) 6 straipsnio 2 dalimi, Cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmogaus sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos, patvirtintos Lietuvos Respublikos aplinkos ministro 2000 m. gruodžio 29 d. įsakymu Nr. 762/556 „Dėl cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmonių sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos“ (Žin., 2001, Nr. 3-60) 11.1 punktu ir įgyvendindamas 1967 m. birželio 27 d. Tarybos direktyvos 67/548/EEB dėl šalių narių įstatymų, reglamentų ir administracinių nuostatų, susijusių su pavojingų medžiagų klasifikavimu, pakavimu ir ženklinimu, suvienodinimo, 1999 m. gegužės 31 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyvos 1999/45/EB dėl šalių narių įstatymų, reglamentų ir administracinių nuostatų, susijusių su pavojingų preparatų klasifikavimu, pakavimu ir ženklinimu, suvienodinimo reikalavimus:
1. Tvirtinu pridedamus:
1.1. Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrąjį įvadą.
1.2. Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodus:
1.2.1. Neteko galios nuo 2006-02-08
Punkto naikinimas:
Nr. V-11, 2006-01-04, Žin. 2006, Nr. 15-539 (2006-02-07), i. k. 1062250ISAK0000V-11
1.2.4. Neteko galios nuo 2006-02-08
Punkto naikinimas:
Nr. V-11, 2006-01-04, Žin. 2006, Nr. 15-539 (2006-02-07), i. k. 1062250ISAK0000V-11
1.2.5. Neteko galios nuo 2006-02-08
Punkto naikinimas:
Nr. V-11, 2006-01-04, Žin. 2006, Nr. 15-539 (2006-02-07), i. k. 1062250ISAK0000V-11
Patvirtinta
Lietuvos Respublikos
sveikatos apsaugos ministro
2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284
Cheminių medžiagų ir preparatų TOKSIŠKUMO IR KITŲ POVEIKIŲ SVEIKATAI tyrimo METODų bendrasis įvadas
Toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodai skirti užtikrinti 1967 m. liepos 27 d. Tarybos direktyvos 67/548/EB dėl įstatymų, reglamentų ir administracinių nuostatų, susijusių su pavojingų medžiagų klasifikavimu, pakavimu ir ženklinimu, suvienodinimo V priedo B dalies taikymą. Metodų numeracija atitinka minėtos direktyvos V priedo B dalies metodų numeraciją.
I. Bendrosios nuostatos
1. Dauguma toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimų metodų parengti pagal EBPO chemikalų tyrimo vadovą (OECD Guidelines for Testing of Chemicals). Siekiant užtikrinti kuo didesnį duomenų pripažinimą, tyrimai turi būti atliekami vadovaujantis Geros laboratorinės praktikos principais. Papildoma informacija ir pirminiai šaltiniai nurodyti EBPO chemikalų tyrimo vadove bei kitoje atitinkamoje literatūroje.
2. Taikant tyrimo metodus, kuriems naudojami gyvūnai, turi būti laikomasi humaniško elgesio principų; iš ekvivalentinių tyrimo metodų turi būti parenkami tie, kuriems naudojamas mažiausias eksperimentinių gyvūnų skaičius.
3. Vienas iš Europos Sąjungos mokslo siekių yra sukurti ir patvirtinti alternatyvius metodus, kurie teiktų panašią informaciją kaip ir įprasti gyvūnų tyrimai, tačiau naudotų mažiau gyvūnų, sukeltų jiems mažiau skausmo arba visiškai jų išvengtų. Kai tik tokie metodai patvirtinami, juos privaloma taikyti, kai reikia duomenų rizikai vertinti, klasifikuoti ir ženklinti tam tikrą medžiagą.
4. Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimų metodų aprašymuose vartojamos pagrindinės sąvokos ir jų apibrėžimai
4.2. Aiškus toksiškumas – tiriamosios medžiagos sukelti smarkaus organizmo apnuodijimo požymiai, rodantys, kad padidinus dozę gali pasireikšti sunkūs toksiniai pažeidimai ir žūtis. Jo turėtų pakakti rizikai įvertinti.
4.4. Didžiausia toleruojama dozė (DTD) – didžiausia nenužudanti dozė, sukelianti gyvūno apnuodijimo požymius.
4.5. Diskriminacinė dozė – didžiausia iš keturių fiksuotų dozių metodu nustatyta dozė, kuri nesukelia su medžiaga susijusios žūties (įskaitant žūtį dėl humaniškų principų taikymo).
4.6. Distribucija (pasiskirstymas) – procesas, kurio metu absorbuota medžiaga ir (arba) jos metabolitai pasiskirsto organizme.
4.8. Dozė – gautas tiriamosios medžiagos kiekis. Dozė yra išreiškiama mase (gramais ar miligramais) arba tiriamosios medžiagos mase tiriamojo gyvūno masės vienetui (pvz., miligramas kilogramui kūno masės), arba kaip koncentracija pašare (md – milijoninė dalis arba miligramas pašaro kilogramui).
4.9. Ekskrecija (pašalinimas) – procesas, kurio metu medžiaga ir (arba) jos metabolitai pasišalina iš organizmo.
4.10. Kartotinių dozių (poūmis) toksiškumas – neigiami poveikiai eksperimentiniams gyvūnams, kuriuos sukelia medžiagos kasdienė pakartotinė dozė arba medžiagos veikimas trumpą gyvūno amžiaus laikotarpį.
4.11. LC50 (median lethal concentration – vidutinė mirtina koncentracija) – statistiškai apskaičiuota medžiagos koncentracija, kuri poveikio metu arba po tam tikro laiko gali sukelti 50 % tiriamųjų gyvūnų žūtį.
4.12. LD50 (median lethal dose – vidutinė mirtina dozė) – statistiškai apskaičiuota vienkartinė medžiagos dozė, kuri gali sukelti 50 % tiriamųjų gyvūnų žūtį.
4.13. Metabolizmas – procesas, kurio metu medžiaga dėl fermentinių arba nefermentinių reakcijų organizme struktūriškai pakinta.
4.14. NOAEL (no observed adverse effect level – nesukeliantis pastebimo neigiamo poveikio lygis, NPNPL) – didžiausia dozė ar poveikio lygis, kuris nesukelia su poveikiu susijusių matomų pakitimų.
4.15. Odos ardymas – negrįžtamas odos audinio pažeidimas, kurį sukelia tiriamosios medžiagos odos 3 min. – 4 val. aplikacija.
4.17. Odos sensibilizacija (alerginis kontaktinis dermatitas) – imuninės kilmės odos reakcija į medžiagą.
4.18. Toksikokinetika – tiriamosios medžiagos absorbcijos, pasiskirstymo, metabolizmo ir ekskrecijos nustatymas.
II. tiriamosios medžiagos apibūdinimas
5. Prieš bet kokio toksikologinio tyrimo planavimą reikia žinoti tiriamosios medžiagos sudėtį, įskaitant pagrindines priemaišas, jos svarbiausias fizikines ir chemines savybes, įskaitant stabilumą.
6. Tiriamosios medžiagos fizikinės ir cheminės savybės nulemia medžiagos panaudojimo būdo pasirinkimą, kai kurių tyrimo detalių planavimą, medžiagos naudojimą ir laikymą.
III. GYVŪNŲ PRIEŽIŪRA
9. Eksperimentinių gyvūnų patalpų ar aptvarų aplinkos sąlygos turi būti tinkamos tiriamosioms rūšims. Žiurkėms, pelėms ir jūrų kiaulytėms patalpos temperatūra turėtų būti 22 ± 3 °C, santykinis oro drėgnis 30 – 70%; triušiams atitinkamai 20 ± 3 °C ir 30 – 70 %.
10. Kai eksperimentinė įranga yra ypač jautri temperatūros poveikiui, tiriamajame metode reikėtų aprašyti jai tinkamas sąlygas. Visuose toksinio poveikio tyrimuose temperatūra ir drėgnis turi būti stebimi, registruojami ir įtraukiami į tyrimo baigiamąją ataskaitą.
11. Apšvietimas turi būti dirbtinis, šviesos režimas – 12 valandų šviesos ir 12 valandų tamsos. Apšvietimo duomenys turi būti registruojami ir įtraukiami į baigiamąją tyrimo ataskaitą.
12. Jei metode kitaip nenurodoma, gyvūnai gali būti laikomi po vieną arba tos pačios lyties grupėmis, tačiau viename narve neturėtų būti daugiau negu penki gyvūnai. Eksperimentų su gyvūnais ataskaitose svarbu nurodyti gyvūnų laikymo sąlygas bei jų skaičių viename narve eksperimento bei vėlesniu stebėjimo periodu.
13. Tyrimo metu gyvūnams duodami pašarai turi atitikti visus tos gyvūnų rūšies mitybos reikalavimus. Tais atvejais, kai tiriamoji medžiaga dedama į pašarus, jų galiojimo laikas turėtų būti sutrumpinamas dėl tiriamosios medžiagos sąveikos su pašaro sudedamosiomis dalimis. Į tokios sąveikos galimybę turėtų būti atsižvelgiama, interpretuojant tyrimų rezultatus. Standartiniai laboratorinių gyvūnų pašarai turėtų būti duodami neribojant geriamo vandens kiekio. Pasirenkant minėtą medžiagos suleidimo būdą, pašaro turėtų būti duodama tiek, kad tai užtikrintų reikalingą tiriamosios medžiagos gaunamą kiekį.
IV. Humaniško elgesio su gyvūnais principai
15. Nustatant ūmų toksiškumą per virškinimo traktą, turi būti naudojamas B12 arba B13 metodas. B12 metodo galutinis tikslas nėra gyvūno žūtis, be to, taikant šį metodą, palyginti su klasikiniu, naudojama mažiau gyvūnų. B13 metode naudojama vidutiniškai 70 % mažiau gyvūnų, negu klasikiniame. Abu šie alternatyvūs metodai sukelia gyvūnams mažiau skausmo ir kančių, negu klasikinis.
16. Naudojamų gyvūnų skaičius yra sumažinamas iki moksliškai priimtino minimumo: tiriant vieną dozės lygį B3 metodu, naudojami tik 5 tos pačios lyties gyvūnai; B.6 metode, nustatant odos sensibilizaciją, naudojama tik 10 gyvūnų (ir tik 5 neigiamoje kontrolės grupėje); teigiamos kontrolės gyvūnų skaičius, tiriant mutageniškumą in vivo (B11 ir B12 metodai) taip pat yra sumažintas.
17. Gyvūnų skausmas ir kančia tyrimų metu yra minimalūs: gyvūnai, patiriantys nepakeliamas ir užsitęsusias kančias bei skausmą, turėtų būti humaniškai numarinami. Jeigu dėl tiriamosios medžiagos ardomųjų ir dirginamųjų savybių yra žinoma, kad tas metodas sukels gyvūnams didelį skausmą ir kančią, jis neturėtų būti atliekamas (B1, B2 ir B3 metodai).
18. Prieš tiriant ūmų toksiškumą (B1, B2 ir B3 metodai) bei mutageniškumą in vivo turi būti parengti kokybiniai ir kiekybiniai analitiniai tiriamosios medžiagos biologinėje terpėje nustatymo metodai.
19. Leidžiama netirti dirginamųjų medžiagos savybių arba ištirti tik vieną gyvūną, jeigu pateikiamas pakankamas mokslinis įrodymas apie šias savybes. Toks mokslinis įrodymas gali remtis medžiagos fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis, jau atliktų kitų tyrimų rezultatais arba patvirtintų in vitro tyrimų rezultatais. Pavyzdžiui, jeigu medžiagos ūmaus toksiškumo tyrime per odą, naudojant ribinio bandymo dozę (B3 metodas), nenustatytas odos dirginimas, tolesni odos dirginimo tyrimai (B4 metodas) nebūtini; medžiagos, kurioms B4 metodu nustatomos aiškios ardomosios ar nepakeliamos odos dirginamosios savybės, toliau yra netiriamos akies dirginimo metodu (B5 metodas).
V. ĮVERTINIMAS IR INTERPRETACIJA
20. Vertinant ir interpretuojant gyvūnų ir in vitro tyrimų rezultatus, reikia atsižvelgti į jų tiesioginės ekstrapoliacijos žmogui ribotumą, todėl gavus įrodymą apie medžiagos neigiamą poveikį žmonėms, tai turėtų patvirtinti gyvūnų tyrimų rezultatus.
21. Tyrimų rezultatai gali būti naudojami klasifikuojant ir ženklinant naujas ir esamas chemines medžiagas pagal poveikį žmonių sveikatai, remiantis jų būdingomis savybėmis, nustatytomis ir įvertintomis šiais metodais. Cheminių medžiagų ir preparatų klasifikavimo ir ženklinimo reikalavimai taip pat susiję su šių tyrimo baigiamųjų ataskaitų išvadomis. Tyrimų rezultatai taip pat naudojami naujų ir esamų cheminių medžiagų rizikai vertinti.
VI. METODŲ PARINKIMO IR TAIKYMO PRINCIPAI
22. Ūmus, kartotinių dozių (poūmis) ir lėtinis toksiškumas
22.1. Ūmūs medžiagos toksiniai poveikiai arba jos toksiškumas organui ar jų sistemai gali būti nustatyti, naudojant įvairius vienkartinės dozės tyrimus (B1-B5 metodai).
22.2. Atsižvelgiant į medžiagos toksiškumą, gali būti taikomas LD50 nustatymo ribinis metodas, tačiau jis netaikomas tyrimams per kvėpavimo takus, nes neįmanoma nustatyti vienkartinio poveikio per kvėpavimo takus ribinės vertės.
22.3. Antros gyvūnų rūšies tyrimus gali papildyti pradinių rūšių tyrimų išvados. Tokiais atvejais gali būti taikomi standartiniai tyrimo metodai arba šie metodai gali būti pritaikyti mažesniam gyvūnų skaičiui. Kartotinių dozių toksiškumo tyrimas (B7, B8 ir B9 metodai) įvertina toksinius poveikius, kai gyvūnas medžiagą gauna pakartotinai. Siekiant gauti kuo daugiau informacijos, būtini tikslūs gyvūnų klinikiniai stebėjimai. Šie tyrimai padeda nustatyti organus taikinius bei toksiškas ir netoksiškas dozes. Tolesnis ir gilesnis šių aspektų nagrinėjimas gali būti pratęstas ilgalaikiais tyrimais (B26-B30 ir B33 metodai).
23. Mutageniškumas ir genotoksiškumas
23.1. Mutageniškumas susijęs su ląstelių ar organizmų genetinės medžiagos kiekio ar struktūros negrįžtamais paveldimais pokyčiais. Šie pokyčiai arba mutacijos gali apimti vieną geną ar jo segmentą, kelis genus ar visą chromosomą. Poveikiai gali keisti visą chromosomų struktūrą ir/ar jų skaičių.
23.2. Medžiagos mutageninės savybės nustatomas bakterijų genų (taškinių) mutacijų (B13 ir B14 metodai) ir/ar žinduolių ląstelių chromosomų struktūrinių pokyčių, aberacijų (B10 metodas) in vitro bandymais.
23.3. Taip pat taikomos in vivo procedūros, pavyzdžiui, mikrobranduolių tyrimas (B12 metodas) arba kaulų čiulpų ląstelių metafazės tyrimas (B11 metodas). Nesant aiškaus poreikio taikyti in vivo, pirmenybė teikiama in vitro metodams.
23.4. Jeigu medžiaga gaminama dideliais kiekiais ir/ar reikia įvertinti riziką, keliamą žmonių sveikatai, tolesniam mutageniškumo tyrimui arba kancerogenų išankstinei atrankai gali būti reikalingi papildomi tyrimai. Jie skirti pagrindinių tyrimų rezultatams patvirtinti, dar netirtoms savybėms nustatyti bei pradėti ar tęsti in vivo tyrimus.
23.5. Metodai B15-B25 naudoja ir in vivo, ir in vitro eukariotines sistemas bei išplečia biologinių bandymo sistemų sritį. Šie tyrimai teikia informaciją apie taškines mutacijas bei kitus pokyčius, vykstančius daug sudėtingesniuose organizmuose negu bakterijos.
23.6. Tolesnė mutageniškumo tyrimų programa turi būti planuojama tokia, kad teiktų svarbios papildomos informacijos apie medžiagos mutagenines ir/ar kancerogenines savybes.
23.7. Kiekvienu konkrečiu atveju tyrimai priklauso nuo daugelio veiksnių, tarp jų nuo fizikinių ir cheminių medžiagos savybių, nuo bakterijų ir citogenetinių tyrimų pirminių rezultatų, nuo medžiagos metabolizmo ypatybių, kitų toksiškumo tyrimo rezultatų ir nuo medžiagos panaudojimo masto. Dėl daugybės veiksnių, į kuriuos būtina atsižvelgti, griežta tyrimų atrankos schema nenustatyta.
23.8. Teisės aktai, reglamentuojantys naujų cheminių medžiagų rizikos įvertinimą, nustato kai kuriuos bendruosius tyrimo strategijos principus; rizikos įvertinimo metodiniuose dokumentuose pateikiamos aiškios tyrimo strategijos, kurios yra lanksčios ir taikomos konkrečioms sąlygoms.
23.10. Chromosomų aberacijų tyrimai atliekami B22 ir B25 metodais. Jei nebuvo atlikti tyrimai B10 ir B11 metodais, juos reikia atlikti. Papildomai galima atlikti tyrimą B23 metodu.
23.11. Kadangi genotoksiškumas yra potencialiai žalingas poveikis genetinei medžiagai, nebūtinai susijęs su mutageniškumu, poveikio metu sukeliami DNR pažeidimai tiesiogiai neįrodo mutacijų buvimo. Tokie genotoksiniai poveikiai, poveikiai DNR nustatomi B16, B18 ir B19 metodais.
23.12. Kancerogeninio poveikio alternatyvių tyrimų pagrindą sudaro tai, kad žinduolių ląstelės transformacijos tyrimai įvertina medžiagos sugebėjimą sukelti ląstelių kultūrų morfologinius ar funkcinius pakitimus, susijusius su nepageidautina transformacija in vivo (B21 metodas). Šiuose tyrimuose gali būti panaudoti skirtingi ląstelių tipai bei jų transformacijos vertinimo kriterijai.
23.13. Paveldimų poveikių žinduoliams rizikos įvertinimui skirti tie tyrimai, kuriais galima nustatyti žinduolių paveldimus pakitimus, sukeliamus genų (taškinės) mutacijos, pavyzdžiui, pelių specifinio lokuso tyrimas, skirtas nustatyti pirmos generacijos gemalo ląstelės mutacijoms (neįtrauktas į šiuos tyrimo metodus), arba pelių paveldimos translokacijos tyrimas (B25 metodas), skirtas nustatyti chromosomų aberacijoms. Šie metodai taikomi tada, kai yra vertinama medžiagos savybė kelti genetinę riziką žmogui. Tačiau dėl šių tyrimų sudėtingumo ir dėl jiems būtino labai didelio gyvūnų skaičiaus, ypač specifiniam lokuso tyrimui, reikalingas labai aiškus šių tyrimų būtinumo pagrindimas.
24. Kancerogeniškumas
24.1. Pagal poveikio mechanizmą kancerogenai gali būti apibūdinami kaip genotoksiniai arba negenotoksiniai.
24.2. Pradinė informacija apie medžiagą kaip galimą genotoksinį kancerogeną gaunama iš mutageniškumo ir (arba) genotoksiškumo tyrimų. Papildoma informacija gaunama iš kartotinių dozių ir lėtinio toksiškumo tyrimų. B7 ir kiti ilgesnieji kartotinių dozių toksiškumo metodais atlikti tyrimai leidžia įvertinti rastus histopatologinius pakitimus, pavyzdžiui, kai kurių audinių hiperplaziją. Šie tyrimai bei toksikokinetinė informacija gali tik padėti nustatyti potencialius kancerogenus, todėl būtini išsamesni tyrimai B32 arba B33 metodais.
25. Toksiškumas reprodukcijai
25.1. Reprodukcinis toksiškumas gali būti nustatytas skirtingais būdais, pavyzdžiui, aptinkant patino ir patelės reprodukcinių funkcijų ir pajėgumo pažeidimą, apibūdinamą kaip „pakenkimas vaisingumui“, arba sukeliant nepaveldimus palikuonių sveikatos sutrikimus, apibūdinamus kaip „pakenkimas palikuonims“, kuris apima teratogeniškumą bei poveikius laktacijos periodu.
25.2. Teratogeniškumo tyrimai (B31 metodas), kaip pakenkimo palikuonims tyrimo dalis, visų pirma skirti medžiagos patekimui per virškinimo traktą. Pasirinktinai gali būti naudojami ir kiti medžiagos suleidimo būdai, atsižvelgiant į tiriamosios medžiagos fizikines savybes bei žmogui būdingus patekimo būdus. Tokiais atvejais metodas turi būti atitinkamai pakeistas pagal 28 dienų trukmės tyrimo metodo atitinkamas dalis.
26. Neurotoksiškumas
Neurotoksiškumas gali būti nustatytas įvairiais būdais, pavyzdžiui, nustatant centrinėje ir periferinėje nervų sistemoje funkcinius ir/ar struktūrinius ir biocheminius pakitimus. Pradinė informacija, kad medžiaga neurotoksiška, gali būti gauta ūmių toksiškumo tyrimų metu. B7 metodas įtraukia neurotoksiškumo požymių įvertinimą bei tikslius gyvūnų klinikinius stebėjimus, suteikiančius daug informacijos. Metodas turėtų padėti nustatyti potencialiai neurotoksinius chemikalus, tačiau vėliau reikalingi išsamesni tyrimai. Reikia atsižvelgti į tai, kad kai kurios medžiagos pasižymi specifiniu neurotoksiniu poveikiu, nenustatomu įprastais toksiškumo tyrimais. Pavyzdžiui, kai kurios fosfoorganinės medžiagos pasižymi uždelstu neurotoksiškumu, kuris gali būti įvertintas tik B37 ir B38 metodais.
27. Imunotoksiškumas
Imunotoksiškumas gali būti nustatytas įvairiais būdais, pavyzdžiui, nustatant imunosupresiją ir/ar padidėjusį imuninės sistemos jautrumą, kilusį dėl įjautrinimo arba dėl sukeltos autoimunizacijos. B7 metodas leidžia įvertinti ir imunotoksinius poveikius. Metodas turėtų padėti nustatant potencialiai imunotoksinius chemikalus, tačiau vėliau reikalingi išsamesni tyrimai.
28. Toksikokinetika
28.1. Toksikokinetiniai tyrimai padeda interpretuoti ir įvertinti gautus toksiškumo duomenis. Šie tyrimai paaiškina ypatingus chemikalo toksiškumo aspektus, o gauti tyrimo rezultatai gali padėti planuojant tolesnius toksiškumo tyrimus. Manoma, kad kiekvienu atveju nebūtina nustatyti visų rodiklių. Tik retais atvejais būtini visi toksikokinetiniai tyrimai (absorbcijos, ekskrecijos, pasiskirstymo ir metabolizmo). Kai kurioms medžiagoms galimi šios sekos pakeitimai arba gali pakakti tik vienkartinės dozės tyrimo (B36 metodas).
28.2. Duomenys apie medžiagos cheminę struktūrą, fizikines ir chemines savybes bei medžiagos patekimo būdą taip pat gali suteikti duomenų apie jos absorbcijos ypatybes, metabolizmo ir pasiskirstymo audiniuose galimybes. Papildomos informacijos apie toksikokinetinius rodiklius galima gauti ir iš ankstesnių toksiškumo ir toksikokinetinių tyrimų.
______________
Patvirtinta. Neteko galios nuo 2006-02-08
Priedo naikinimas:
Nr. V-11, 2006-01-04, Žin. 2006, Nr. 15-539 (2006-02-07), i. k. 1062250ISAK0000V-11
Patvirtinta
Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos
ministro 2004 m. balandžio 28 d.
įsakymu Nr. V-284
B2 metodas: ŪMUS TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS
1. Bendrosios nuostatos
1.1. Įvadas
1.1.1. Naudinga turėti išankstinę informaciją apie medžiagos pasiskirstymą pagal dalelių dydį, garų slėgį, lydymosi temperatūrą, virimo temperatūrą, pliūpsnio temperatūrą ir sprogstamumą.
1.2. Apibrėžimai
Šiame metode vartojamų sąvokų apibrėžimai pateikti Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade.
1.4. Bandymo metodo principas
1.4.1. Kelios eksperimentinių gyvūnų grupės yra veikiamos tiriamąja medžiaga nustatytą laiko tarpą tam tikra tvarka suskirstytomis koncentracijomis, viena koncentracija naudojama vienai grupei. Po to atliekami poveikių ir žūties atvejų stebėjimai. Gyvūnams, kurie žūva bandymo metu, ir likusiems gyviems po bandymo gyvūnams atliekama autopsija.
1.6. Bandymo metodo aprašymas
1.6.1. Pasiruošimas
1.6.1.1. Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki bandymo. Prieš bandymą sveiki jauni gyvuliukai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į reikalingą skaičių grupių. Jiems nereikia taikyti dirbtinio poveikio, jeigu tai nerekomenduojama naudojamos rūšies poveikio aparatui.
1.6.1.2. Kietąsias tiriamas medžiagas gali tekti susmulkinti, kad būtų gautos atitinkamo dydžio dalelės.
1.6.1.3. Jeigu reikia, į tiriamąją medžiagą gali būti dedama atitinkamo tirpiklio, kad būtų gaunama atitinkama tiriamos medžiagos koncentracija atmosferoje, tada kontrolinė gyvūnų grupė turėtų gauti tirpiklį. Jeigu tirpiklis ar kiti priedai yra naudojami dozavimui palengvinti, turėtų būti žinoma, kad jie nesukels toksiškų poveikių. Atitinkamais atvejais gali būti naudojamasi anksčiau gautais duomenimis.
1.6.2. Bandymo sąlygos
1.6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai
Jeigu nėra kontraindikacijų, pirmenybė teikiama žiurkėms. Dažniausia naudojamos įprastos laboratorinės veislės. Bandymo pradžioje kiekvienos naudojamų gyvūnų lyties kūno masės skirtumai neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamos vidutinės vertės.
1.6.2.2. Gyvūnų skaičius ir lytis
1.6.2.2.1. Ne mažiau kaip dešimt graužikų (penki patinėliai ir penkios patelės) yra naudojami kiekvienai koncentracijai. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos.
1.6.2.2.2. Ūmaus toksiškumo bandymuose su aukštesnio negu graužikai poklasio gyvūnais turėtų būti apsvarstoma galimybė naudoti mažesnį gyvūnų skaičių. Dozės turi būti atidžiai parenkamos ir dedamos visos pastangos neviršyti vidutiniškai toksiškų dozių. Tokiuose bandymuose turi būti vengiama įvesti mirtinas tiriamosios medžiagos dozes.
1.6.2.3. Koncentracijos
Koncentracijų turėtų būti ne mažiau kaip trys, ir jos taip paskirstytos, kad susidarytų bandymo grupės su tam tikru toksiškų poveikių diapazonu ir žuvimo procentu. Duomenų turi būti tiek, kad pakaktų sudaryti mirtį sukeliančių koncentracijų kreivę ir atitinkamais atvejais būtų galima tinkamai nustatyti LC50.
1.6.2.4. Ribinis bandymas
Jei penkios patelės ir penki patinėliai, kurie keturias valandas yra veikiami 20 mg/l dujomis arba 5 mg/l aerozoliu arba dalelėmis, nežūva per 14 dienų, taip pat ir tais atvejais tais atvejais, kai dėl medžiagos fizikinių arba cheminių, įskaitant sprogumą, savybių neįmanoma sudaryti maksimalios koncentracijos, tolesnis bandymas gali būti laikomas nebūtinu.
1.6.2.6. Įrenginiai
Gyvuliukai turėtų būti bandomi su inhaliaciniais įrenginiais, skirtais išlaikyti dinaminį oro srautą ne mažiau kaip 12 oro pasikeitimų per valandą, kad būtų užtikrintas pakankamas deguonies kiekis ir vienodai pasiskirstytų poveikio atmosfera. Jeigu naudojama kamera, ji turėtų būti taip sukonstruota, kad kaip galima labiau būtų sumažinamas gyvuliukų susigrūdimas ir kad jie įkvėptų kaip galima daugiau tiriamosios medžiagos. Paprastai, norint užtikrinti atmosferos pastovumą kameroje, visas bandomų gyvuliukų „tūris“ neturėtų viršyti 5 proc. bandymo kameros tūrio. Gali būti veikiamas tik snukis, tik galva arba visas kūnas; du pirmieji būdai padeda sumažinti tiriamos medžiagos patekimą kitais būdais.
1.6.2.7. Stebėjimo laikotarpis
Stebėjimo laikotarpis turi būti ne trumpesnis kaip 14 dienų. Tačiau stebėjimo trukmė neturėtų būti griežtai nustatoma. Ji turėtų būti nustatoma pagal toksines reakcijas, jų pasireiškimo dažnumą ir sveikimo trukmę; todėl trukmė gali būti pratęsiama, jeigu tai laikoma reikalinga. Svarbus yra laikas, kada toksiškumas pasireiškia ir išnyksta, taip pat žūties laikas, ypač jeigu yra toksiškumo požymių atsiradimo vėlavimo tendencija.
1.6.3. Darbo eiga
1.6.3.1. Prieš pat poveikį gyvuliukai yra sveriami ir po to paveikiami atitinkama koncentracija tam skirtame aparate keturias valandas po to, kai kameroje nusistovi tiriamosios medžiagos koncentracijos pusiausvyra. Koncentracijos pusiausvyra turi būti pasiekiama per trumpą laikotarpį. Temperatūra, kurioje vykdomas bandymas, turėtų būti išlaikoma 22 
3 0C. Geriausiai būtų, kad santykinis oro drėgnis būtų išlaikomas tarp 30 ir 70 %, bet tam tikrais atvejais (pvz., tam tikrų aerozolių tyrimuose) tai gali būti neįgyvendinama. Išlaikant nedidelį neigiamą slėgį kameros viduje (apie 5 mm vandens) išvengiama tiriamosios medžiagos patekimo į aplinką. Poveikio metu neduodama pašaro ir vandens. Turi būti naudojamos atitinkamos bandymo atmosferos generavimo ir monitoringo sistemos, užtikrinančios, kad kuo greičiau būtų pasiekiamos pastovios poveikio sąlygos. Kamera turi būti taip sukonstruota ir taip veikti, kad kameros viduje būtų palaikomas vienodas bandymo atmosferos pasiskirstymas.
1.6.3.2. Turi būti atliekami šie matavimai:
1.6.3.2.2. tikros tiriamosios medžiagos koncentracijos matuojamos kvėpavimo zonoje ne mažiau kaip tris kartus poveikio metu (esant tam tikrai atmosferai, pvz., didelės koncentracijos aerozolių, gali reikti matuoti dažniau). Poveikio metu koncentracija neturėtų keistis daugiau negu 15 proc. vidutinės vertės. Tačiau naudojant tam tikrus aerozolius, šio kontrolės lygio gali būti neįmanoma pasiekti, tuomet priimtinas didesnis kaitos intervalas. Aerozoliams dalelių dydžio analizė turi būti atliekama taip dažnai, kaip to reikia (ne rečiau kaip vieną kartą vienai bandomajai grupei),
1.6.3.3. Poveikio metu ir po jo stebėjimai sistemingai užrašomi. Kiekvienam gyvūnui turi būti daromi individualūs įrašai.
1.6.3.4. Pirmą dieną stebėjimai turėtų būti atliekami dažnai. Kruopštus klinikinis tyrimas turi būti atliekamas ne rečiau kaip vieną kartą kiekvieną darbo dieną, kiti stebėjimai turėtų būti atliekami kiekvieną dieną, imantis atitinkamų veiksmų, kad bandyme būtų sumažinamas prarandamų gyvūnų skaičius, pvz., rastų kritusių gyvūnų autopsija arba užšaldymas ir nusilpusių arba merdinčių gyvūnų izoliavimas arba humaniškas numarinimas.
1.6.3.5. Stebėti reikia odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, taip pat kvėpavimo, kraujo, periferinės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos ir elgsenos pasikeitimus. Ypatingas dėmesys turi būti skiriamas tremorui, konvulsijoms, seilėtekiui, diarėjai, apatiškumui, miegui ir komai. Žūties laikas turi būti užrašomas kaip galima tiksliau. Kiekvieno gyvūno masė turi būti nustatoma kiekvieną savaitę po poveikio ir iškart po žūties.
2. Duomenys
Duomenys turėtų būti apibendrinami lentelėse, kiekvienai bandomai grupei nurodant gyvūnų skaičių bandymo pradžioje, kiekvieno gyvūno žūties laiką, gyvūnų su toksiškumo požymius skaičių, pateikiant toksiškų poveikių ir autopsijos duomenų aprašymą. Turi būti apskaičiuojami ir užrašomi gyvūno masės pasikeitimai, jeigu jis išgyvena ilgiau negu vieną dieną. Gyvūnai, kurie humaniškai numarinami dėl cheminio junginio sukeliamų kančių ir skausmo, registruojami kaip žuvę dėl cheminės medžiagos poveikio. LC50 apskaičiuojamas pripažintu metodu. Į duomenų vertinimą turi įeiti sąryšis, jeigu toks yra, tarp gyvuliukų poveikio tiriamąja medžiaga ir visų patologijos rodiklių dažnumo ir stiprumo, taip pat ir elgsenos ir klinikinių simptomų, makroskopinių audinių pakitimų, kūno masės pasikeitimų, žuvimo ir kt.
3. Ataskaitos pateikimas
3.1. Bandymo protokolas
Bandymo protokole, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:
3.1.2. bandymo sąlygos: poveikio aparato apibūdinimas, įskaitant aparato konstrukciją, rūšį, matmenis, oro šaltinį, aerozolių generavimo sistemą, oro kondicionavimo metodą ir gyvūnų laikymo sąlygų bandymo kameroje užtikrinimo būdą. Apibūdinama temperatūros, drėgnio matavimo įranga, aerozolio koncentracijos ir dalelių pasiskirstymas pagal dydį.
3.1.3. Duomenys apie poveikį pateikiami lentelėse su vidutinėmis vertėmis ir kintamumo vienetais (pvz., standartinis nuokrypis), jei įmanoma, įtraukiant:
3.1.3. 2. oro temperatūrą ir drėgnį,
3.1.3.3. nominalias koncentracijas (visas tiriamos medžiagos kiekis, sudėtas į inhaliacijos įrenginį vienam oro tūriui),
3.1.3.6. dalelių masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAD) ir geometrinis standartinis nuokrypis (GSD),
3.1.4. duomenų lentelė apie atsaką pagal lytį ir poveikį (pvz., gyvūnų, kurie žuvo arba buvo numarinti bandymo metu, skaičius; gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičius; naudotų gyvūnų skaičius),
3.1.5. žūties laikas poveikio metu arba po jo, priežastys ir kriterijai, kuriais vadovautasi humaniškai numarinant gyvūnus,
3.1.7. LC50 vertė kiekvienai lyčiai, nustatyta stebėjimo laikotarpio pabaigoje (kartu su tiksliai nurodytu apskaičiavimo metodu),
3.1.12. rezultatų aptarimas. Ypatingas dėmesys turi būti skiriamas tam, kokį poveikį humaniškas gyvūnų numarinimas bandymo metu galėtų turėti apskaičiuojamai LC50 vertei,
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos
ministro 2004 m. balandžio 28 d.
įsakymu Nr. V-284
B3 metodas: ŪMUS TOKSIŠKUMAS PER ODĄ
1. Bendrosios nuostatos
1.1. Įvadas
Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade.
1.2. Apibrėžimai
Šiame metode vartojamų sąvokų apibrėžimai pateikti Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade.
1.4. Bandymo metodo principas
1.4.1. Kelių eksperimentinių gyvūnų grupių oda yra veikiama tiriamąja medžiaga tam tikra tvarka suskirstytomis koncentracijomis, viena koncentracija naudojama vienai grupei. Po to atliekami poveikių ir žūties atvejų stebėjimai. Gyvūnams, kurie žūva bandymo metu, ir likusiems gyviems po bandymo gyvūnams atliekama autopsija.
1.6. Bandymo metodo aprašymas
1.6.1. Pasiruošimas
Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki bandymo. Prieš bandymą sveiki jauni gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į reikalingą skaičių grupių. Apie 24 valandas iki bandymo nuo gyvūno nugaros liemens srityje nukerpama arba nuskutama vilna, nepažeidžiant odos, kad nepasikeistų jos pralaidumas. Tiriamosios medžiagos aplikacijai nukerpama (nuskutama) ne mažiau kaip 10 % kūno paviršiaus. Bandant kietas medžiagas, kurios gali būti ir užpurškiamos ant odos, tiriamoji medžiaga turi būti sudrėkinta vandeniu arba tinkamu tirpikliu, kad būtų užtikrintas geras medžiagos sąlytis su oda. Naudojant tirpiklį būtina atsižvelgti į jo poveikį tiriamosios medžiagos prasiskverbimui per odą. Skystos tiriamosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos.
1.6.2. Bandymo sąlygos
1.6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai
Galima naudoti subrendusias žiurkes arba triušius. Kitų rūšių naudojimą būtina pagrįsti. Dažniausiai naudojamos įprastos laboratorinės veislės. Bandymo pradžioje kiekvienos naudojamų gyvūnų lyties kūno masės skirtumai neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamos vidutinės vertės.
1.6.2.2. Gyvūnų skaičius ir lytis
Ne mažiau kaip penki gyvūnai yra naudojami kiekvienai koncentracijai. Visi gyvūnai turi būti tos pačios lyties. Jeigu naudojamos patelės, jos turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Turint duomenų, kad jautrumas priklauso nuo lyties, reikia naudoti jautresnės lyties gyvūnus. Ūmaus toksiškumo bandymuose su aukštesnio negu graužikai poklasio gyvūnais turėtų būti apsvarstoma galimybė naudoti mažesnį gyvūnų skaičių. Dozės turi būti parenkamos atidžiai, stengiantis neviršyti vidutiniškai toksiškų dozių. Tokiuose bandymuose turi būti vengiama naudoti mirtinas tiriamosios medžiagos dozes.
1.6.2.3. Koncentracijos
Koncentracijų turėtų būti ne mažiau kaip trys ir jos taip paskirstytos, kad susidarytų bandymo grupės su tam tikru toksiškų poveikių diapazonu ir žuvimo procentu. Parenkant koncentraciją būtina atsižvelgti į kiekvieną ėsdinantį ar dirginantį poveikį. Duomenų turi būti tiek, kad pakaktų sudaryti mirtį sukeliančių koncentracijų kreivę ir atitinkamais atvejais būtų galima tinkamai nustatyti LC50.
1.6.2.4. Ribinis bandymas
Ribinis bandymas atliekamas su penkiomis patelėmis ir penkiais patinais, naudojant 2000 mg/kg dozes. Jei gyvūnai žūva, būtina atlikti išsamų tyrimą.
1.6.2.5. Stebėjimo laikotarpis
Stebėjimo laikotarpis turi būti ne trumpesnis kaip 14 dienų, tačiau jo trukmė nėra griežtai nustatyta. Ji turėtų būti nustatoma pagal toksines reakcijas, jų pasireiškimo dažnumą ir sveikimo trukmę, todėl, jei reikia, gali būti pratęsiamas. Svarbus laikas, kada toksiškumas pasireiškia ir išnyksta, jo trukmė ir žūties laikas, ypač jeigu yra toksiškumo požymių atsiradimo vėlavimo tendencija.
1.6.3. Darbo eiga
1.6.3.1. Gyvūnai turi būti laikomi atskiruose narvuose. Tiriamoji medžiaga turi tolygiai dengti aplikacijos plotą, ne didesnį kaip 10 % viso kūno paviršiaus. Kai medžiaga labai toksiška, dengiamas paviršius gali būti mažesnis, bet visas plotas turi būti padengtas vienodu plonu sluoksniu. Tiriamosios medžiagos 24 valandų poveikio laiką užtikrina marlinis tvarstis, pritvirtintas nedirginančia lipnia juostele. Tiriamoji vieta turi būti tinkamai uždengta, kad gyvūnas negalėtų numesti marlinio tvarsčio ir praryti tiriamosios medžiagos. Galima iš dalies riboti gyvūno judesius, siekiant, kad gyvūnas neprarytų tiriamosios medžiagos, bet visiška imobilizacija nepatartina.
1.6.3.2. Pasibaigus ekspozicijai, tiriamosios medžiagos likučiai nuo odos pašalinami vandeniu arba tinkamu odos valikliu.
1.6.3.3. Visi stebėjimai turi būti sistemingai įrašomi į individualias kiekvienam gyvūnui skirtas ataskaitas. Pirmą dieną stebėjimai atliekami dažnai. Kruopštus klinikinis tyrimas turi būti atliekamas ne rečiau kaip vieną kartą kiekvieną darbo dieną, kiti stebėjimai turėtų būti atliekami kiekvieną dieną, imantis atitinkamų veiksmų, kad bandyme sumažėtų prarandamų gyvūnų skaičius, pvz., rastų kritusių gyvūnų autopsija arba užšaldymas, nusilpusių ar merdinčių gyvūnų izoliavimas arba humaniškas numarinimas.
1.6.3.4. Stebėti reikia odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, taip pat kvėpavimo, kraujo, periferinės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos bei elgsenos pasikeitimus. Ypatingas dėmesys turi būti skiriamas tremorui, konvulsijoms, seilėtekiui, diarėjai, apatiškumui, miegui ir komai. Žūties laikas turi būti užrašomas kaip galima tiksliau. Gyvūnams, kurie žuvo bandymo metu ir išliko gyvi iki bandymo pabaigos, yra atliekama autopsija. Registruojami kiekvieno gyvūno autopsijos metu nustatyti patologiniai pokyčiai. Jeigu reikia, turi būti paimami audiniai histopatologiniam tyrimui.
1.6.3.5. Baigus bandymą su vienos lyties gyvūnais, imama kitos lyties ne mažesnė kaip penkių gyvūnų grupė ir bandoma nustatyti jautrumo skirtumus atsižvelgiant į lytį. Mažesnio gyvūnų skaičiaus naudojimas turi būti pagrįstas. Turint duomenų, kad ištirtos lyties gyvūnai yra žymiai jautresni, tyrimo su kitos lyties gyvūnais galima neatlikti.
2. Duomenys
2.1. Duomenys turi būti apibendrinami lentelėse, kiekvienai bandomajai grupei nurodant gyvūnų skaičių bandymo pradžioje, kiekvieno gyvūno žūties laiką, gyvūnų su toksiškumo požymius skaičių, aprašant toksiškus poveikius ir autopsijos duomenis. Visi gyvūnai pasveriami prieš pat tiriamosios medžiagos aplikaciją, savaitę po aplikacijos ir žuvimo dieną, šie duomenys įrašomi į individualias ataskaitas; turi būti apskaičiuojami ir įrašomi masės pokyčiai, jeigu gyvūnas išgyvena ilgiau kaip vieną dieną. Gyvūnai, kurie humaniškai numarinami dėl kančių ir skausmo, registruojami kaip žuvę dėl cheminės medžiagos poveikio. LC50 apskaičiuojamas pripažintu metodu.
3. Ataskaitos pateikimas
3.1. Bandymo protokolas
3.1.1. Bandymo protokole, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:
3.1.1.2. bandymo sąlygos (odos paruošimo aplikacijai metodas ir tvarstymo būdas: uždaras ar atviras),
3.1.1.5. atsako, atsižvelgiant į lytį ir koncentraciją, duomenų lentelės (gyvūnų, žuvusių bandymo metu arba humaniškai numarintų, skaičius; gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičius; gyvūnų skaičius bandymo pradžioje),
3.1.1.14. duomenų aptarimas (ypatingas dėmesys skiriamas tam, kokį poveikį humaniškas gyvūnų numarinimas bandymo metu galėtų turėti LC50 vertei),
Patvirtinta. Neteko galios nuo 2006-02-08
Priedo naikinimas:
Nr. V-11, 2006-01-04, Žin. 2006, Nr. 15-539 (2006-02-07), i. k. 1062250ISAK0000V-11
Patvirtinta. Neteko galios nuo 2006-02-08
Priedo naikinimas:
Nr. V-11, 2006-01-04, Žin. 2006, Nr. 15-539 (2006-02-07), i. k. 1062250ISAK0000V-11
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos
Ministro 2004 m. balandžio 28 d.
įsakymu Nr. V-284
B6 METODAS: ODOS SENSIBILIZACIJA
1. Bendrosios nuostatos
1.1. Įvadas
1.1.1. Jautrūs ir nustatantys potencialius žmogaus odos alergenus tyrimai yra svarbūs nustatant cheminių medžiagų pavojingumą žmonių sveikatai. Nėra nei vieno visiškai tinkamo tyrimo metodo, kuriuo galima nustatyti visas sensibilizuojančias odą medžiagas. Pasirenkant metodą atsižvelgiama į cheminės medžiagos fizikines ir chemines savybes, sugebėjimą prasiskverbti per odą.
1.1.2. Taikomi dviejų tipų tyrimai naudojant jūrų kiaulytes: adjuvantinis tyrimas, kuriuo alerginės reakcijos sustiprinamos tiriamąją medžiagą ištirpinant Freundo pilname adjuvante (FPA), ir neadjuvantinis tyrimas.
1.1.3. Jūrų kiaulyčių maksimizacijos tyrimas (JKMT) yra plačiausiai naudojamas adjuvantinis tyrimas, tačiau gali būti taikomi ir kiti metodai, nustatantys odą sensibilizuojančias medžiagas.
1.1.4. Neadjuvantiniai tyrimai (plačiausiai taikomas Buehlerio tyrimas, BT) daugeliui medžiagų yra mažiau jautrūs.
1.1.5. Kartais dėl svarių priežasčių pasirenkamas BT, kuriame naudojamos odos aplikacijos, o ne JKMT, kuriame naudojamos įodinės injekcijos. BT pasirinkimą reikia moksliškai pagrįsti. Moksliškai pagrindus, galima taikyti ir kitus standartizuotus metodus.
1.1.6. Pripažintu atrankos tyrimu gavus teigiamą rezultatą, tiriamoji medžiaga apibūdinama kaip potencialus alergenas, ir tolesnis jūrų kiaulyčių tyrimas neatliekamas. Gavus neigiamą rezultatą, atliekamas jūrų kiaulyčių tyrimas pagal šiame metode aprašytą procedūrą.
1.2. Apibrėžimai
1.2.1. Odos sensibilizacija (alerginis kontaktinis dermatitas) – imuninės kilmės odos reakcija į medžiagą, žmonėms pasireiškianti odos niežėjimu, paraudimu, patinimu, spuogeliais, pūslėmis, pūslelėmis ar jų deriniais. Gyvūnų odos reakcija skiriasi, ji pasireiškia paraudimu ir patinimu.
1.2.2. Indukcinis poveikis – tiriamosios medžiagos poveikis, sukeliantis nuo silpno iki vidutinio stiprumo odos sudirginimą.
1.2.3. Indukcinis periodas – laikotarpis ne ilgesnis negu viena savaitė po indukcinio poveikio; jo metu gali išsivystyti organizmo padidėjusio jautrumo būklė.
1.2.4. Provokacinis poveikis – pakartotinis organizmo poveikis didžiausia nedirginančia odos tiriamosios medžiagos koncentracija po indukcinio periodo, siekiant nustatyti, ar padidėjęs organizmo jautrumas (alergiškas).
1.3. Pamatinės medžiagos
1.3.1. Taikomo metodo jautrumas ir rezultatų patikimumas įvertinamas kas šešis mėnesius naudojant medžiagas, kurios žinomos kaip silpno ar vidutinio stiprumo odos sensibilizatoriai.
1.3.2. Adjuvantiniame tyrime ne mažiau kaip 30%, o neadjuvantiniame tyrime ne mažiau kaip 15 % gyvūnų teigiamas atsakas rodo silpno ar vidutinio stiprumo sensibilizatorių (alergeną).
Naudojamos šios pamatinės medžiagos:
| CAS Nr. |
EINECS Nr. |
EINECS pavadinimas |
Įprastas pavadinimas |
| 101-86-0 |
202-983-3 |
Cinamono rūgšties heksialdehidas |
Cinamono rūgšties heksialdehidas |
| 149-30-4 |
205-736-8 |
Benztiazol-2-tiolis (2-merkaptobenztiazolas) |
Kaptaksas |
| 94-07-7 |
202-303-5 |
Benzokainas |
Nordkainas |
Atitinkamai pagrindus, galima naudoti ir kitas pamatines medžiagas.
1.4. Bandymo metodo principas
1.4.1. Bandomieji gyvūnai paveikiami tiriamosios medžiagos įodinėmis injekcijomis ir/ar aplikacijomis ant odos (indukcinis poveikis). Praėjus 10–14 dienų (indukciniam periodui), kurio metu gali pasireikšti imuninis atsakas, gyvūnai paveikiami provokacine doze. Tiriamųjų gyvūnų odos reakcijos į provokacinę dozę mastas lyginamas su kontrolinių gyvūnų, kuriems indukcinis ir provokacinis poveikis buvo tiriamas nesensibilizuojančia medžiaga.
1.5. Bandymo metodo aprašymas
Jeigu tiriamąją medžiagą būtina nuplauti, vanduo ar atitinkamas tirpiklis naudojamas taip, kad nepakistų odos reakcija ar odos vientisumas.
1.5.1. JKMT
1.5.1.1. Pasiruošimas
Sveikos jaunos ir suaugusios jūrų kiaulytės mažiausiai 5 dienas iki tyrimo aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Prieš bandymą gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į bandomąją ir kontrolinę grupes. Gyvūnams nugaros srityje pašalinama vilna, ją nukerpant žirklėmis, nuskutant arba naudojant cheminę depiliaciją ir stengiantis nepažeisti odos. Gyvūnai sveriami prieš tyrimo pradžią ir jo pabaigoje.
1.5.1.2. Bandymo sąlygos
1.5.1.2.2. Gyvūnų skaičius ir lytis
1.5.1.2.2.1. Bandymui naudojami 30 gyvūnų; patinai ir/ar patelės. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos.
1.5.1.2.2.2. Tiriamojoje grupėje turi būti ne mažiau kaip 10 gyvūnų, o kontrolinėje ne mažiau kaip 5 gyvūnai. Panaudojus mažiau negu 10 tiriamųjų ir mažiau negu 5 kontrolines jūrų kiaulytes, neįmanoma padaryti išvados, kad tiriamoji medžiaga yra alergenas; tiriant papildomą gyvūnų skaičių, griežtai rekomenduojamas bendras tiriamųjų gyvūnų skaičius turi būti ne mažesnis nei 20 gyvūnų, kontrolinių – ne mažesnis nei 10.
1.5.1.2.3. Dozės
Kiekvienam indukciniam poveikiui naudojama gerai organizmo toleruojama didžiausia tiriamosios medžiagos koncentracija, sukelianti nuo silpno iki vidutinio stiprumo odos sudirginimą. Provokaciniam poveikiui naudojama didžiausia nedirginanti odos tiriamosios medžiagos koncentracija. Jeigu būtina, tinkamos koncentracijos nustatomos parengtiniu tyrimu, naudojant du arba tris gyvūnus. Šiam tikslui galima panaudoti ir FPA paveiktus gyvūnus.
1.5.1.3. Procedūra
1.5.1.3.1. Indukcinis poveikis
1.5.1.3.1.1. Nulinė diena. Bandomoji grupė
Menčių srityje atliekamos trys poros įodinių injekcijų po 0,1 ml. Menčių srityje vilna pašalinama taip, kad kiekvienos injekcijos poros dalis būtų kitoje nugaros vidurio pusėje.
1-oji injekcijų pora: FPA ir vandens ar fiziologinio tirpalo mišinys santykiu 1:1.
2-oji injekcijų pora: tiriamosios medžiagos kiekis, nustatytas parengtinio bandymo metu, užtikrinantis numatytą poveikį odai, ištirpintas pasirinktame tirpiklyje.
3-oji injekcijų pora: tiriamosios medžiagos pasirinkta koncentracija, pagaminta panaudojant mišinį FPA ir vanduo ar fiziologinį tirpalą santykiu 1:1.
Ruošiant 3-iąją injekciją, vandenyje tirpios medžiagos tirpinamos vandenyje, po to maišomos su FPA. Kai medžiagos tirpios riebaluose ir netirpios vandenyje, pirmiausia padaromas jų su FPA mišinys, po to pridedama vandens ar fiziologinio tirpalo. Tiriamosios medžiagos koncentracija 3-ojoje injekcijų poroje turi būti tokia pati, kaip ir 2-ojoje.
1-oji ir 2-oji injekcijų pora suleidžiama arčiau galvos viena šalia kitos, 3-oji pora – arčiau uodegos esančiame tiriamajame plote.
1.5.1.3.1.2. Nulinė diena. Kontrolinė grupė
Tose pačiose vietose kaip ir bandomosios grupės gyvūnams atliekamos trys poros įodinių injekcijų po 0,1 ml.
1-oji injekcijų pora: FPA ir vandens ar fiziologinio tirpalo mišinys santykiu 1:1.
2-oji injekcijų pora: neskiestas tirpiklis.
3-oji injekcijų pora: tirpiklio 50 % tirpalas, pagamintas panaudojant mišinį FPA ir vandens arba fiziologinis tirpalas santykiu 1:1.
1.5.1.3.1.3. 5–7 diena. Bandomoji ir kontrolinė grupės
Jeigu tiriamoji medžiaga nedirgina odos, apytikriai 24 valandas iki indukcinių aplikacijų ant odos, ant tų pačių odos plotelių, kur atliktos injekcijos, nukirpus ir/ar nuskutus vilną, tepamas 0,5 ml 10 % natrio laurilsulfato ir vazelino tirpalas.
1.5.1.3.1.4. 6–8 diena. Bandomoji grupė
Nuo tiriamojo odos ploto pašalinama vilna. 2´4 cm filtravimo popieriaus gabalėlis sudrėkinamas (padengiamas) tiriamąja medžiaga, ištirpinta tirpiklyje, ir uždedamas ant tiriamojo ploto bei fiksuojamas okliuzine (nepralaidžia) tvarstomąja medžiaga 48 valandoms. Tirpiklio pasirinkimą reikia pagrįsti. Kietosios medžiagos yra susmulkinamos ir sumaišomos tirpiklyje. Skysčiai naudojami neskiesti.
1.5.1.3.2. Provokacinis poveikis
20-22 diena. Bandomoji ir kontrolinė grupės
Nuo bandomosios ir kontrolinės grupių gyvūnų šonų pašalinama vilna. Filtravimo popieriaus gabalėlis, sudrėkintas (padengtas) tiriamąja medžiaga, uždedamas ant vieno šono odos plotelio. Jeigu reikia, ant kito šono uždedamas filtravimo popieriaus gabalėlis, sudrėkintas tirpikliu. Filtravimo popieriaus gabalėlis fiksuojamos okliuzine tvarstomąja medžiaga 24 valandoms.
1.5.1.3.3. Bandomosios ir kontrolinės grupių gyvūnų reakcijos stebėjimas ir vertinimas:
1.5.1.3.3.1. praėjus maždaug 21 valandai po filtravimo popieriaus gabalėlio nuėmimo, odos plotas nuvalomas, nukerpamas ir/ar nuskutamas (kai reikia – depiliuojamas),
1.5.1.3.3.3. praėjus maždaug 24 valandoms po pirmojo vertinimo, odos reakcija antrą kartą įvertinama balais pagal Magnussono/Kligmano skalę:
| Reakcija |
Reakcijos įvertinimas, balais |
|
| Odos hiperemija |
Odos edema |
|
| Nėra Ribota arba nevienodo intensyvumo hiperemija Vidutinė ir susiliejanti hiperemija Intensyvi hiperemija |
Nėra Nėra Nėra Yra |
0 1 2 3 |
1.5.1.3.5. Jeigu būtina patikslinti pirmojo provokacinio poveikio duomenis, praėjus maždaug vienai savaitei, atliekamas pakartotinis provokacinis poveikis su ta pačia arba nauja kontroline grupe.
1.5.2. BT
1.5.2.1. Pasiruošimas
Sveikos jaunos ir suaugusios jūrų kiaulytės mažiausiai 5 dienas iki tyrimo aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Prieš bandymą gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į bandomąją ir kontrolinę grupes. Gyvūnams nugaros srityje pašalinama vilna, ją nukerpant žirklėmis, nuskutant arba naudojant cheminę depiliaciją ir stengiantis nepažeisti odos. Gyvūnai sveriami prieš tyrimo pradžią ir jo pabaigoje.
1.5.2.2. Bandymo sąlygos
1.5.2.2.2. Gyvūnų skaičius ir lytis
Bandymui naudojama 30 gyvūnų; patinai ir/ar patelės. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Ne mažiau kaip 20 gyvūnų naudojama bandomojoje ir ne mažiau kaip 10 – kontrolinėje grupėje.
1.5.2.2.3. Dozės
1.5.2.2.3.1. Kiekvienam indukciniam poveikiui naudojama didžiausia tiriamosios medžiagos koncentracija, sukelianti vidutinio stiprumo odos sudirginimą. Provokaciniam poveikiui naudojama didžiausia nedirginanti odos tiriamosios medžiagos koncentracija. Jeigu būtina, tinkamos koncentracijos nustatomos parengtiniu tyrimu, naudojant du arba tris gyvūnus.
1.5.2.3. Procedūra
1.5.2.3.1. Indukcinis poveikis
1.5.2.3.1.1. Nulinė diena. Bandomoji grupė
Nuo gyvūnų vieno šono pašalinama vilna. Tyrimui naudojamas filtravimo popieriaus gabalėlis turi būti prisigėręs tiriamosios medžiagos, ištirpintos tirpiklyje (tirpiklio pasirinkimą reikia pagrįsti, skystos tiriamosios medžiagos neskiedžiamos).
Tyrimui naudojamas filtravimo popieriaus gabalėlis fiksuojamas okliuzine tvarstomąja medžiaga 6 valandoms. Filtravimo popieriaus gabalėlis uždengiamas vatos tamponu, jis gali būti apvalus ar kvadratinis, maždaug 4–6 cm2. Nepralaidi medžiaga geriausiai užtikrina okliuziją. Naudojant kitokią medžiagą, filtravimo popieriaus gabalėlį reikia ilgiau laikyti.
1.5.2.3.1.2. Nulinė diena. Kontrolinė grupė
Nuo gyvūnų vieno šono pašalinama vilna. Viskas atliekama taip pat kaip ir bandomojoje grupėje, tik vietoje tiriamosios medžiagos naudojamas tirpiklis.
1.5.2.3.2. Provokacinis poveikis
27-29 dienos. Bandomoji ir kontrolinė grupės
Nuo aplikacijoms nenaudoto bandomųjų ir kontrolinių gyvūnų šono pašalinama vilna. Ant arčiau uodegos esančios odos plotelio dalies dedamas reikiamo tiriamosios medžiagos kiekio prisigėręs filtravimo popieriaus gabalėlis. Medžiaga turi būti didžiausios nedirginančios koncentracijos. Kai reikia, ant arčiau galvos esančios odos plotelio dalies dedamas filtravimo popieriaus gabalėlis, prisigėręs tik tirpiklio. Viskas fiksuojama tinkama tvarstomąja medžiaga 6 valandoms.
1.5.2.3.3. Bandomosios ir kontrolinės grupių gyvūnų reakcijos stebėjimas ir vertinimas:
1.5.2.3.3.1. praėjus maždaug 21 valandai po filtravimo popieriaus gabalėlio nuėmimo, nuo odos plotelio pašalinama vilna,
1.5.2.3.5. Jeigu būtina patikslinti pirmojo provokacinio poveikio duomenis, praėjus maždaug vienai savaitei, atliekamas pakartotinis provokacinis poveikis su ta pačia arba nauja kontroline grupe.
2. Duomenys
Duomenys pateikiami lentelėse, nurodant kiekvieno gyvūno odos reakciją kiekvieno stebėjimo metu.
3. Ataskaitos pateikimas
Jeigu iki jūrų kiaulyčių sensibilizacijos tyrimo buvo atliktas atrankos tyrimas, jo aprašymas ir nuorodos (pvz., periferinio limfmazgio tyrimas, pelės akies patinimo tyrimas) turi būti pateikiami kartu su tiriamosios ir kontrolinės medžiagų poveikio duomenimis.
3.1. Bandymo protokolas
3.1.1. Bandymo protokole, jeigu įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
3.1.1.1. Bandomieji gyvūnai:
3.1.1.2. Bandymo sąlygos:
3.1.1.2.3. atrankos tyrimo rezultatai su išvada apie indukcijai ir provokacijai naudotinas koncentracijas,
3.1.1.3. Rezultatai:
3.1.1.3.1. rezultatų suvestinė su paskutiniu jautrumo ir patikimumo patikrinimu, be to informacija apie panaudotą medžiagą, koncentraciją ir tirpiklį,
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos
ministro 2004 m. balandžio 28 d.
įsakymu Nr. V-284
B7 metodas: KARTOTINIŲ DOZIŲ (28 DIENŲ) TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINIMO TRAKTĄ
1. Bendrosios nuostatos
1.1. Įvadas
Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade.
1.2. Apibrėžimai
Šiame metode vartojamų sąvokų apibrėžimai pateikti Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade.
1.3. Bandymo metodo principas
1.3.1. Medžiaga nustatytomis dozėmis kasdien gyvūnams suleidžiama į virškinimo traktą zondu, viena koncentracija naudojama vienai grupei 28 dienas. Medžiagos poveikio laikotarpiu gyvūnai stebimi kiekvieną dieną toksiškumo požymiams nustatyti. Žuvusiems bandymo metu ir išgyvenusiems gyvūnams po bandymo atliekama autopsija.
1.3.2. Šiame metode ypatingas dėmesys skiriamas tiriamosios medžiagos neurologiniam poveikiui išaiškinti ir kruopščiam klinikiniam stebėjimui, norint gauti kuo daugiau informacijos. Šiuo metodu nustatomas galimas cheminės medžiagos neurotoksinis poveikis, o tai sudaro prielaidą planuoti išsamesnį medžiagos tyrimą. Be to, šiuo metodu galima gauti duomenų apie tiriamosios medžiagos poveikį imuninei sistemai ir reprodukcijai.
1.4. Bandymo metodo aprašymas
1.4.1. Pasiruošimas
1.4.1.1. Sveiki jauni suaugę gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į kontrolinę ir bandomąją grupes. Narvai turi būti išdėstyti taip, kad būtų sumažintas galimas poveikis bandymo rezultatams. Kiekvienas gyvūnas individualiai paženklinamas ir mažiausiai penkias dienas iki bandymo pradžios laikomas narve bandymo sąlygomis.
1.4.1.2. Tiriamoji medžiaga gyvūnams suleidžiama į virškinimo traktą zondu arba duodama šeriant arba girdant vandeniu. Medžiagos patekimo būdas į virškinimo traktą parenkamas atsižvelgiant į bandymo tikslą ir medžiagos fizines bei chemines savybes.
1.4.1.3. Jei reikia, tiriamoji medžiaga yra ištirpinama arba išmaišoma tinkamame tirpiklyje. Rekomenduojama naudoti vandeninį tirpalą, jei tai neįmanoma – aliejinį tirpalą, o jei ir tai neįmanoma – rinktis tirpalus kitokiuose tirpikliuose. Jeigu naudojamas nevandeninis tirpiklis, turi būti žinomos jo toksinės savybės ir tiriamosios medžiagos stabilumas šiame tirpiklyje.
1.4.2. Bandymo sąlygos
1.4.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai
1.4.2.1.1. Pirmenybė teikiama žiurkėms, nors gali būti naudojamos ir kitos graužikų rūšys. Dažniausiai naudojamos sveikų jaunų suaugusių gyvūnų įprastos laboratorinės veislės. Jeigu naudojamos patelės, jos turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Tiriamoji medžiaga gali būti suleidžiama tuoj po nujunkymo, bet ne vyriau nei gyvūnams sueina devynios savaitės.
1.4.2.1.2. Bandymo pradžioje gyvūnų masės skirtumai neturi viršyti ± 20 % atitinkamos vidutinės vertės kiekvienai lyčiai.
1.4.2.2. Skaičius ir lytis
Kiekvienai medžiagos koncentracijai naudojami ne mažiau kaip dešimt gyvūnų (penki patinai ir penkios patelės). Jeigu bandymo metu planuojama numarinti dalį gyvūnų, jų pradinis skaičius turi būti didesnis tiek, kiek planuojama gyvūnų numarinti prieš bandymo pradžią. Be to, gali būti naudojama 10 gyvūnų (penki patinai ir penkios patelės) papildoma grupė, kuri 28 dienas gauna dideles dozes siekiant nustatyti atsako grįžtamumą arba vėlavimą per 14 dienų po poveikio pabaigos. Taip pat naudojama kontrolinė 10 gyvūnų (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus).
1.4.2.3. Dozės
1.4.2.3.1. Iš viso naudojamos mažiausiai trys bandymo grupės ir viena kontrolinė. Kontrolinės grupės gyvūnai laikomi tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir bandomieji gyvūnai, išskyrus poveikį tiriamąja medžiaga. Jei tiriamajai medžiagai naudojamas tirpiklis, tai kontrolinės grupės gyvūnai turi gauti didžiausią tiriamajai grupei panaudotą tirpiklio tūrį. Jeigu įvertinus kitus duomenis, nesitikima jokio 1 000 mg/kg dozės poveikio, turi būti atliktas ribinis bandymas. Jeigu nėra tinkamų duomenų, turi būti atliktas įvadinis bandymas taikytinoms koncentracijoms parinkti.
1.4.2.3.2. Dozės turi būti parenkamos atsižvelgiant į turimus tiriamosios ar jai giminingos medžiagos toksiškumo ir toksikokinetikos duomenis. Didžiausia dozė parenkama atsižvelgiant į toksinio poveikio, bet ne į žūties ar stiprių kančių sukėlimo galimybę. Po to parenkama mažėjančių dozių eilė, kad būtų nustatytas atsakas į skirtingų dozių poveikį bei dozė, nesukelianti pastebimo žalingo poveikio (NOAEL). Dozės parenkamos taip, kad viena nuo kitos skirtųsi du keturis kartus. Kai didžiausia ir mažiausia dozė skiriasi daugiau kaip 10 kartų, patartina naudoti papildomą ketvirtąją bandomųjų gyvūnų grupę.
1.4.2.3.3. Kai tiriamoji medžiaga duodama šeriant ar girdant vandeniu, svarbu užtikinti, kad šie medžiagos kiekiai nesimaišytų su įprastu pašaru ar vandeniu. Kai tiriamoji medžiaga duodama šeriant, ji išreiškiama kaip pastovi koncentracija pašare (md) arba kaip koncentracija gyvūno masės vienetui; alternatyvi išraiška turi būti aprašyta atskirai. Medžiaga suleidžiama kasdien tuo pačiu laiku, parenkant kiekį pagal gyvūno kūno masę.
1.4.2.4. Ribinis bandymas
Jeigu bandymas su mažiausia 1000 mg/kg doze (suleidimas zondu, šėrimas, girdymas vandeniu) pagal aprašytą procedūrą nesukelia pastebimų toksinių poveikių ir jeigu pagal turimus duomenis apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, tai nebūtina atlikti viso bandymo su trimis dozėmis, išskyrus tuos atvejus, kai dėl numanomo poveikio žmogui reikia tirti didesnes dozes.
1.4.3. Darbo eiga
Gyvūnams tiriamoji medžiaga duodama 28 dienas kiekvieną savaitės dieną; penkių dienų per savaitę dozavimą būtina pagrįsti. Vienkartinė tiriamosios medžiagos koncentracija suleidžiama zondu. Maksimalus vienkartinis suleidžiamo skysčio tūris priklauso nuo tiriamo gyvūno dydžio. Tiriamosios medžiagos tirpalo tūris neturi viršyti 10 ml/kg, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių gali būti suleidžiama 20 ml/kg. Tiriamojo tūrio kitimas turi būti minimizuotas taikant tokią koncentraciją, kad būtų užtikrintas pastovus kiekis naudojant visas koncentracijas. Išimtį sudaro dirginančios ir ėsdinančios medžiagos, kurių įprastos koncentracijos sukelia sunkius poveikius.
1.4.4. Stebėjimai
1.4.4.1. Kruopšti klinikinė apžiūra turi būti atliekama mažiausiai kartą per dieną, geriausiai tuo pačiu metu, atsižvelgiant į laukiamų poveikių piką. Gyvūnų sveikatos būklė turi būti registruojama. Mažiausiai du kartus per dieną visi gyvūnai turi būti patikrinami, nustatant žuvimą ir apnuodijimą. Sergantys ir su akivaizdžiais skausmo ir išsekimo požymiais gyvūnai turi būti iškeliami iš narvų, pažymimi, humaniškai numarinami ir skrodžiami. Prieš pradedant bandymą ir mažiausiai kartą per savaitę atliekama visų gyvūnų kruopšti klinikinė apžiūra. Apžiūrima vienodomis sąlygomis išėmus iš narvo tuo pačiu laiku. Rezultatai tiksliai įrašomi į stebėjimo žurnalą, įvertinami balų sistema, naudojama bandymo laboratorijoje. Turi būti užtikrintas bandymo sąlygų pastovumas. Patartina, kad stebėjimus atliktų kiti tyrėjai, o ne tie, kurie suleidžia gyvūnams tiriamąją medžiagą. Stebimi ir užrašomi odos, kailio, akių, gleivinės pakitimai, išskyros, periferinės veiklos (pvz. ašarojimo, plaukų pašiaušimo, vyzdžio dydžio, neįprastų kvėpavimo pakitimų) pakitimai. Būtina registruoti eisenos, pozos, reakcijos į paėmimą rankomis pakitimus, kloninių ar toninių traukulių atsiradimą, elgsenos stereotipus (pvz., besaikį valymąsi, pasikartojantį sukimąsi ratu) bei keistą (pvz., savęs luošinimą, vaikščiojimą atbulomis) elgseną.
1.4.4.2. Ketvirtą poveikio savaitę turi būti įvertintas jautrumas skirtingų tipų dirgikliams (pvz., klausos, regėjimo ir proprioreceptoriniams), griebimo stiprumas bei motorinis aktyvumas. Detalesnį eigos aprašymą galima surasti literatūroje (žr. Bendrąjį įvadą).
1.4.4.3. Funkciniai stebėjimai ketvirtą savaitę gali būti neatliekami, jeigu bandymas yra įvadinis prieš tolesnį 90 dienų bandymą. Tokiu atveju funkciniai stebėjimai turi būti atliekami tolesnio bandymo metu. Kita vertus, funkciniai stebėjimai padidina galimybę geriau parinkti dozę tolesniam 90 dienų tyrimui.
1.4.5. Kūno masė ir pašarų bei vandens suvartojimas
Mažiausiai vieną kartą per savaitę visi gyvūnai sveriami, išmatuojamas pašarų suvartojimas. Jeigu tiriamoji medžiaga yra duodama su geriamuoju vandeniu, vandens suvartojimas taip pat turi būti matuojamas ne rečiau kaip kartą per savaitę.
1.4.6. Hematologija
1.4.6.1. Bandymo pabaigoje nustatomi šie hematologiniai rodikliai: hematokritas, hemoglobino koncentracija, eritrocitų kiekis, leukocitų formulė ir bendras kiekis, trombocitų kiekis ir kraujo krešėjimo trukmė.
1.4.7. Klinikinė biochemija
1.4.7.1. Biocheminiai tyrimai atliekami vertinant pagrindinius toksinius poveikius audiniams, o ypač inkstams ir kepenims. Rekomenduojama nešerti gyvūnų iš vakaro, jeigu ryte numatoma paimti kraujo bandinį. Kraujo plazmoje arba serume tiriami šie rodikliai: natris, kalis, gliukozė, bendrasis cholesterolis, karbamidas, kreatininas, bendrasis baltymas ir albuminas, mažiausiai du fermentai, rodantys poveikį kepenų ląstelėms (tokie kaip alaninaminotransferazė, šarminė fosfatazė, aspartataminotransferazė, gamaglutamiltranpeptidazė ir sorbitoldehidrogenazė). Tam tikromis aplinkybėmis papildomi fermentų (kepenų ar kitos kilmės) ir tulžies rūgščių tyrimai gali suteikti naudingos informacijos. Paskutinę tyrimų savaitę galima atlikti tokius šlapimo tyrimus: šlapimo tūris, surinktas per nurodytą laikotarpį, jo išvaizda, kvapas, lyginamasis svoris, pH, baltymai, gliukozė ir kraujo ląstelės; bet šis tyrimas nėra privalomas.
1.4.7.2. Galima atlikti papildomus serumo rodiklių, rodančių pagrindinių audinių pažeidimus, tyrimus. Jeigu žinomas ar įtariamas tiriamosios medžiagos poveikis organizmo medžiagų apykaitai, galima tirti kalcį, fosforą, trigliceridus, specifinius hormonus, methemoglobiną bei cholinesterazę. Šie rodikliai būtinai nustatomi tam tiriant tam tikras medžiagas arba esant indikacijoms.
1.4.7.3. Apskritai tirtini biocheminiai rodikliai parenkami atsižvelgiant į gyvūnų rūšis ir stebėjimų duomenis bei tiriamosios medžiagos laukiamą poveikį.
1.4.7.4. Jeigu turimi duomenys apie medžiagą yra prieštaringi, prieš pradedant bandymą reikia nuspręsti, kokie hematologiniai ir biocheminiai rodikliai bus tiriami.
1.4.7.5. Kai kuriems serumo ir plazmos tyrimams, ypač gliukozės, ypač svarbu gyvūnų šėrimas iš vakaro. Šėrimas prieš tyrimą veikia tiriamų rodiklių svyravimus ir apsunkina duomenų interpretavimą Kita vertus, šėrimas iš vakaro gali pakeisti gyvūnų bendrą medžiagų apykaitą, o ypač mitybos tyrimuose tai gali pakeisti tiriamosios medžiagos poveikį. Jei nuspręsta gyvūnus šerti iš vakaro, tai klinikiniai biocheminiai tyrimai turi būti atliekami tik ketvirtą tyrimų savaitę, atlikus funkcinius stebėjimus.
1.4.8. Skrodimas
1.4.8.1. Visi gyvūnai po bandymo turi būti skrodžiami. Registruojami kiekvieno gyvūno skrodimo metu nustatyti kūno paviršiaus, visų angų, kaukolės, krūtinės ląstos, pilvo ertmės ir jos turinio patologiniai pokyčiai. Visų gyvūnų kepenys, inkstai, antinksčiai, sėklidės ir jos prielipas, užkrūčio liauka, blužnis, smegenys bei širdis turi būti nuvalyti, kad neliktų pašalinių audinių, kuo greičiau pasverti ir tinkamai paruošti laikymui.
1.4.8.2. Organai laikomi terpėje, kuri tinka šiam organui laikyti ir nekeičia jo savybių histopatologinių tyrimų metu. Histopatologiškai tiriami: bendri pakitimai, smegenys (didieji pusrutuliai, smegenėlės ir kamienas), nugaros smegenys, skrandis, plonoji ir storoji žarna (įskaitant Peyerio plokšteles), kepenys, inkstai, antinksčiai, blužnis, širdis, užkrūčio liauka, skydliaukė, trachėja ir plaučiai (įleidžiant fiksuojamosios medžiagos, o po to panardinant), lytinės liaukos, gimda, prostata, šlapimo pūslė, limfiniai mazgai (vienas limfinis mazgas turi atspindėti medžiagos patekimo būdą, o kitas, esantis toliau, – sisteminius poveikius), esantis arčiau raumens periferinis nervas (sėdimasis arba blauzdikaulio) bei kaulų čiulpai (arba šviežiai paruošta kaulų čiulpų punkcija). Atsižvelgiant į gautus klinikinius ir kitus duomenis gali prireikti tirti papildomus organus. Be to, galimam tolesniam tyrimui turi būti laikomi visi organai, kurie gali būti tiriamosios medžiagos poveikio taikiniai atsižvelgiant į jos žinomas savybes.
1.4.9. Histopatologinis tyrimas
1.4.9.1. Visiems kontrolinės ir didžiausią dozę gavusios grupių gyvūnų organams ir audiniams turi būti atliktas visapusiškas histopatologinis įvertinimas. Jeigu didžiausią dozę gavusių gyvūnų grupėje dėl medžiagos poveikio atsirado pakitimai, histopatologiškai ištirti privalu ir kitų grupių gyvūnus.
2. Duomenys
2.1. Turi būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to, visi duomenys turi būti apibendrinti lentelėse, nurodant kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičių tyrimų pradžioje; gyvūnų, žuvusių bandymo metu ar humaniškai numarintų, skaičius; gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičius; kiekvieno gyvūno žūties ar numarinimo laikas; pastebėtų toksinio poveikio požymių apibūdinimas, įskaitant atsiradimo laiką, trukmę ir sunkumą; gyvūnų su pakenkimais skaičius, pakenkimų tipas ir gyvūnų su įvairių tipų pakenkimais procentas.
3. Ataskaitos pateikimas
3.2. Bandymo protokole, jeigu įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija:
3.2.1. Bandomieji gyvūnai:
3.2.2. Bandymo sąlygos:
3.2.2.3. detalūs duomenys apie tiriamosios medžiagos receptūrą, paruošimą maišant su pašaru, preparato koncentraciją, stabilumą ir homogeniškumą,
3.2.2.5. tiriamosios medžiagos koncentracijos pašare, vandenyje (md) perskaičiavimas į faktinę dozę (mg/kg/d), jeigu įmanoma,
3.2.3. Rezultatai:
PATVIRTINTA
Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos
ministro 2004 m. balandžio 28 d.
įsakymu Nr. V-284
B8 METODAS: KARTOTINIŲ DOZIŲ (28 DIENŲ) TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS
1. Bendrosios nuostatos
1.1. Įvadas
1.1.1. Naudinga turėti išankstinę informaciją apie medžiagos pasiskirstymą pagal dalelių dydį, garų slėgį, lydymosi temperatūrą, virimo temperatūrą, pliūpsnio temperatūrą ir sprogstamumą.
1.2. Apibrėžimai
Šiame metode vartojamų sąvokų apibrėžimai pateikti Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade.
1.4. Bandymo metodo principas
Kelios gyvūnų grupės kiekvieną dieną nustatytą laiką veikiamos įvairiomis tiriamosios medžiagos koncentracijomis, viena koncentracija naudojama vienai grupei 28 dienas. Jeigu tirpiklis naudojamas tam, kad būtų lengviau gaunama atitinkama tiriamosios medžiagos koncentracija aplinkoje, naudojama kontrolinė gyvūnų grupė, kuri veikiama tirpikliu. Medžiagos poveikio laikotarpiu gyvuliukai stebimi kiekvieną dieną toksiškumo požymiams nustatyti. Žuvusiems bandymo metu ir išgyvenusiems gyvūnams po bandymo atliekama autopsija.
1.6. Bandymo metodo aprašymas
1.6.1. Pasiruošimas
Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki bandymo. Prieš bandymą sveiki jauni gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į reikalingą skaičių grupių. Jeigu reikia, į tiriamąją medžiagą gali būti dedama atitinkamo tirpiklio, kad būtų gaunama atitinkama tiriamosios medžiagos koncentracija atmosferoje. Jeigu tirpiklis ar kiti priedai yra naudojami dozavimui palengvinti, turėtų būti žinoma, kad jie nesukels toksiškų poveikių. Atitinkamais atvejais gali būti naudojamasi anksčiau gautais duomenimis.
1.6.2. Bandymo sąlygos
1.6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai
Jeigu nėra kontraindikacijų, pirmenybė teikiama žiurkėms. Dažniausiai naudojami įprastų laboratorinių veislių jauni sveiki gyvūnai. Bandymo pradžioje kiekvienos naudojamų gyvūnų lyties kūno masės skirtumai neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamos vidutinės vertės.
1.6.2.2. Skaičius ir lytis
1.6.2.2.1. Ne mažiau kaip dešimt graužikų (penki patinėliai ir penkios patelės) yra naudojami kiekvienai koncentracijai. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos.
1.6.2.2.2. Jeigu planuojamos tarpinės autopsijos, gyvūnų skaičius atitinkamai didinamas. Papildoma 10 gyvūnų (po penkis kiekvienos lyties) grupė gali būti veikiama didele koncentracija 28 dienas ir po to 14 dienų stebimas poveikio grįžtamumas bei apnuodijimo simptomų vėlavimas. Taip pat naudojama kontrolinė 10 gyvūnų (po penkis kiekvienos lyties) grupė.
1.6.2.3. Koncentracijos
Koncentracijų turėtų būti ne mažiau kaip trys ir jos taip paskirstytos, kad didžiausia koncentracija sukeltų toksinį poveikį (bet ne mirties atvejus arba tik kelis), o mažiausia koncentracija nesukeltų toksiškumo požymių. Kai žinoma galinti veikti žmones koncentracija, mažiausia bandomoji koncentracija turi būti už ją didesnė. Tinkamiausia, kai tarpinė koncentracija sukelia nedidelį toksinį poveikį. Jeigu naudojamos kelios tarpinės koncentracijos, jos turėtų sukelti skirtingo intensyvumo toksinį poveikį. Mažiausios ir tarpinių koncentracijų bei kontrolinėje grupėse neturėtų žūti daugiau kaip po kelis gyvūnus, kad būtų galima tinkamai įvertinti gautus duomenis. Jei naudojamas tirpiklis, papildomai naudojama kontrolinė tirpiklio koncentracija, atitinkanti didžiausios dozės tirpiklio koncentraciją. Su kontrolinės grupės gyvūnais elgiamasi visiškai taip pat, kaip su bandomųjų grupių gyvūnais, bet bandomąja medžiaga jie neveikiami.
1.6.2.4. Poveikio trukmė
Kiekvienos dienos poveikio trukmė 6 valandos. Kai reikia, ji gali būti kitokia.
1.6.2.5. Įrenginiai
Gyvūnai turi būti bandomi su inhaliaciniais įrenginiais, skirtais išlaikyti dinaminį oro srautą ne mažiau kaip 12 oro pasikeitimų per valandą, kad būtų užtikrintas pakankamas deguonies kiekis ir vienodai pasiskirstytų poveikio atmosfera. Jeigu naudojama kamera, ji turėtų būti taip sukonstruota, kad gyvūnai nesusigrūstų ir galėtų įkvėpti kaip galima daugiau tiriamosios medžiagos. Paprastai, norint užtikrinti atmosferos pastovumą kameroje, visas bandomų gyvūnų „tūris“ neturėtų viršyti 5 % bandymo kameros tūrio. Gali būti veikiamas tik snukis, tik galva arba visas kūnas; du pirmieji būdai padeda sumažinti tiriamosios medžiagos patekimą kitais būdais.
1.6.3. Darbo eiga
1.6.3.1. Nuo penkių iki septynių dienų per savaitę 28 dienas gyvūnai kiekvieną dieną veikiami tiriamąja medžiaga. Papildomos (kontrolinės) grupės gyvūnai suskirstomi taip, kad jiems būtų galima atlikti stebėjimus 14 dienų po bandymo pabaigos ir nustatyti poveikio grįžtamumą.
1.6.3.2. Bandymas atliekamas palaikant 22 3 0C temperatūrą ir 30-70 % oro drėgnį, bet tam tikrais atvejais (pvz., tam tikrų aerozolių tyrimuose) tai gali būti neįgyvendinama. Išlaikant nedidelį neigiamą slėgį kameros viduje (apie 5 mm vandens) išvengiama tiriamosios medžiagos patekimo į aplinką. Poveikio metu gyvūnams neduodama pašaro ir vandens.
1.6.3.3. Turi būti naudojamos atitinkamos bandymo atmosferos generavimo ir monitoringo sistemos, užtikrinančios, kad kuo greičiau būtų pasiekiamos pastovios poveikio sąlygos. Kamera turi būti taip sukonstruota ir taip veikti, kad kameros viduje būtų palaikomas vienodas bandymo atmosferos pasiskirstymas.
1.6.3.4. Turi būti atliekami šie matavimai:
1.6.3.4.2. tikros tiriamosios medžiagos koncentracijos matuojamos kvėpavimo zonoje ne mažiau kaip tris kartus poveikio metu (esant tam tikrai atmosferai, pvz., didelės koncentracijos aerozolių, gali reikti matuoti dažniau). Poveikio metu koncentracija neturėtų keistis daugiau negu 15 proc. vidutinės vertės. Tačiau naudojant tam tikrus aerozolius, šio kontrolės lygio gali būti neįmanoma pasiekti, tuomet priimtinas didesnis kaitos intervalas. Aerozolių dalelių dydžio analizė turi būti atliekama taip dažnai, kaip to reikia (ne rečiau kaip vieną kartą vienai bandomajai grupei),
1.6.3.5. Poveikio metu ir po jo stebėjimai sistemingai užrašomi. Kiekvienam gyvūnui turi būti daromi individualūs įrašai. Visi gyvūnai stebimi kiekvieną dieną, o toksiškumo požymiai registruojami nurodant pasireiškimo laiką, intensyvumą ir trukmę. Stebėti reikia odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, taip pat kvėpavimo, kraujo, periferinės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos ir elgsenos pasikeitimus. Gyvūnai sveriami kiekvieną savaitę; rekomenduojama kas savaitę nustatyti suėsto pašaro kiekį.
1.6.3.6. Reguliarus gyvūnų stebėjimas yra reikalingas tam, kad būtų užtikrinta, jog kiek įmanoma mažiau gyvūnų bus prarasta dėl kanibalizmo, audinių autolizės ir kt. Po bandymo bandomųjų grupių gyvūnams atliekama autopsija. Merdintys ir kenčiantys gyvūnai humaniškai numarinami, jiems taip pat atliekama autopsija.
1.6.3.7. Visų grupių gyvūnams po bandymo atliekami šie tyrimai:
1.6.3.7.1. hematologiniai (kraujo formulė, hemoglobino koncentracija, eritrocitų skaičius, krešėjimas),
1.6.3.7.2. kraujo klinikiniai biocheminiai, įskaitant ne mažiau kaip vieną kepenų ir inkstų funkciją atspindintį rodiklį: alanino aminotransferazė ir aspartato aminotransferazės aktyvumas serume, šlapimo azotas, albumino kiekis, kraujo kreatininas, bendrasis bilirubino kiekis, bendrasis proteinų kiekis serume.
1.6.3.8. Kiti tyrimai, reikalingi kompetentingam toksikologiniam įvertinimui atlikti, apima kalcio, fosforo, chloro, natrio, kalio, gliukozės nustatymą, lipidų, hormonų, rūgščių/šarmų pusiausvyros, methemoglobino, cholinesterazės tyrimus.
1.6.3.9. Nustatyto toksiškumo mechanizmui išsiaiškinti gali būti atliekami papildomi klinikiniai biocheminiai tyrimai.
1.6.3.10. Autopsija
Visiems gyvūnams atliekama autopsija. Kepenys, inkstai, antinksčiai, plaučiai ir sėklidės pasveriami iškart po skrodimo, kol neišdžiuvę. Kvėpavimo organai, kepenys, inkstai, blužnis, sėklidės, antinksčiai, širdis ir kiti organai bei audiniai, kuriuose matomi dideli pažeidimai arba pasikeitęs jų dydis, konservuojami atitinkamoje terpėje galimam histopatologiniam ištyrimui. Plaučiai išimami sveiki, pasveriami ir fiksuojami atitinkamame tirpale užtikrinant, kad bus išsaugota jų struktūra.
1.6.3.11. Histopatologinis ištyrimas
Atliekamas didžiausią dozę gavusių ir kontrolinių grupių gyvūnų užkonservuotų organų ir audinių histopatologinis tyrimas. Jei tam tikruose organuose ir audiniuose nustatomi tiriamosios medžiagos sukelti pakenkimai, tiriami tokie patys mažesnes dozes gavusių gyvūnų organai ir audiniai. Papildomų grupių gyvūnų histologinis tyrimas atliekamas skiriant ypatingą dėmesį tiems organams ir audiniams, kurie nebuvo pakenkti kitose gyvūnų grupėse.
2. Duomenys
2.1. Duomenys apibendrinami lentelėse, kiekvienai grupei nurodant gyvūnų skaičių bandymo pradžioje ir gyvūnų, kuriems pasireiškė kiekvienos rūšies pakenkimai, skaičių.
3. Ataskaitos pateikimas
3.1. Bandymo protokolas
3.1.1. Bandymo protokole, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:
3.1.1.2. bandymo sąlygos: poveikio aparato apibūdinimas, įskaitant aparato konstrukciją, rūšį, matmenis, oro šaltinį, aerozolių generavimo sistemą, oro kondicionavimo metodą ir gyvūnų laikymo sąlygų bandymo kameroje užtikrinimo būdą. Apibūdinama temperatūros, drėgnio matavimo įranga, aerozolio koncentracijos ir dalelių pasiskirstymas pagal dydį.
3.1.2. Duomenys apie poveikį pateikiami lentelėse su vidutinėmis vertėmis ir kintamumo vienetais (pvz., standartinis nuokrypis), jei įmanoma, įtraukiant:
3.1.2.3. nominalias koncentracijas (visas tiriamos medžiagos kiekis, sudėtas į inhaliacijos įrenginį vienam oro tūriui),
3.1.2.6. dalelių masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAD) ir geometrinis standartinis nuokrypis (GSD),
4. Nuorodos
Šio metodo nuorodos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade.
______________
Pakeitimai:
1.
Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministerija, Įsakymas
Nr. V-11, 2006-01-04, Žin., 2006, Nr. 15-539 (2006-02-07), i. k. 1062250ISAK0000V-11
Dėl cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų sveikatai, toksiškumo tyrimo metodų aprašų patvirtinimo