Suvestinė redakcija nuo 2004-04-07

 

Įsakymas paskelbtas: Žin. 2003, Nr. 56-2500, i. k. 1032330ISAK003D-179

 

LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO

 

ĮSAKYMAS

DĖL VITAMINO A, VITAMINO E IR TRIFTOFANO KIEKIO NUSTATYMO PAŠARINIUOSE PRODUKTUOSE BEI LASALOCIDO NATRIO DRUSKOS KIEKIO NUSTATYMO PAŠARINIUOSE PRODUKTUOSE TECHNINIŲ REGLAMENTŲ PATVIRTINIMO

 

2003 m. balandžio 29 d. Nr. 3D-179

Vilnius

 

 

Įgyvendindamas Teisės derinimo priemonių 2003 metų planą, patvirtintą Lietuvos Respublikos Vyriausybės 2003 m. kovo 5 d. nutarimu Nr. 292 (Žin., 2003, Nr. 25-1019) (priemonių kodai 3.7.4.2.3-T34 ir 3.7.4.2.3-T39) bei siekdamas perimti ES teisės aktų, reglamentuojančių vitamino A, vitamino E ir triptofano kiekio nustatymo pašariniuose produktuose bei lasalocido natrio druskos kiekio nustatymo pašariniuose produktuose nuostatas:

1. Tvirtinu pridedamus:

1.1. Vitamino A, vitamino E ir triptofano kiekio nustatymo pašariniuose produktuose techninį reglamentą.

1.2. Lasalocido natrio druskos kiekio nustatymo pašariniuose produktuose techninį reglamentą.

2. Šis įsakymas įsigalioja nuo 2003 m. rugsėjo 30 d.

 

 

 

ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS                                                                   JERONIMAS KRAUJELIS

 

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro

2003 m. balandžio 29 d. įsakymu Nr. 3D-179

 

vitamino A, vitamino E ir triptofano kiekio nustatymo pašariniuose produktuose techninis reglamentas

 

Šis reglamentas parengtas remiantis 2000 m. liepos 6 d. Europos Komisijos direktyva 2000/45/EB dėl Bendrijos cheminės analizės metodų, kuriuos valstybės institucijos taiko vitaminui A, vitaminui E ir triptofanui nustatyti pašaruose, ir 1981 m. liepos 30 d. Europos Komisijos direktyva 81/680/EEB, pataisančia direktyvas 71/250/EEB, 71/393/EEB, 72/199/EEB, 73/46/EEB, 74/203/EEB, 75/84/EEB, 76/372/EEB ir 78/633/EEB bei nustatančia cheminės analizės metodus oficialiai pašarų kontrolei.

 

I. Bendrosios nuostatos

 

1. Šis techninis reglamentas nustato cheminės analizės metodus vitamino A, vitamino E ir triptofano kiekiui nustatyti pašarinėse žaliavose, kombinuotuosiuose pašaruose ir premiksuose (toliau – pašariniai produktai), vykdant pašarų kokybės valstybinę kontrolę.

2. Jei pašarų analitei nustatyti taikomi du ar daugiau metodų, taikomą metodą, jei nenurodyta kitaip, pasirenka cheminę analizę atliekanti laboratorija, tačiau šis metodas turi būti nurodomas analizės sertifikate.

3. Šio techninio reglamento reikalavimai privalomi visiems pašarus gaminantiems, laikantiems, gabenantiems, naudojantiems, tarpininkaujantiems juos parduodant ir jais prekiaujantiems ūkio subjektams bei institucijai, atsakingai už pašarų kokybės valstybinę kontrolę.

4. Šio techninio reglamento reikalavimai netaikomi pašarams, skirtiems eksportuoti ne į Europos Bendrijos valstybes nares bei gabenamiems uždarose transporto priemonėse arba uždarose pakuotėse tranzitu per Lietuvos Respublikos teritoriją.

 

II. Sąvokos, terminai ir sutrumpinimai

 

5. Šiame techniniame reglamente vartojamos sąvokos:

Drėgnis – laisvo vandens procentinis kiekis medžiagoje.

Radimo riba – kokybiškai nustatomo komponento mažiausias kiekis arba koncentracija, dar duodantys analizinį signalą.

Nustatymo riba – kiekybinės analizės metodu ieškomo komponento mažiausias kiekis arba koncentracija, dar duodantys išmatuojamą signalą.

Pašariniai produktai – pašarinės žaliavos, kombinuotieji pašarai, premiksai ir pašarų priedai, naudojami gyvūnų mitybai.

Kitos šiame reglamente vartojamos sąvokos turi tą pačią reikšmę kaip Lietuvos Respublikos pašarų įstatyme (Žin., 2000, Nr. 34-952) ir Pašarų klasifikatoriuje, patvirtintame Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 205 (Žin., 2000, Nr. 69-2064).

6. Metodų aprašymuose vartojami cheminių junginių trivialieji pavadinimai ir juos atitinkantys IUPAC terminai:

1, 1, 1-trichloro-2-metil-2-propanolis – C4H7Cl3O;

2,6-di-tert-butil-4-metilfenolis, BHT – C15H24O;

2-propanolis – C3H8O;

acto rūgštis – etano rūgštis, CH3COOH;

askorbo rūgštis – C6H8O6;

azotas – diazotas, N2;

bario hidroksido oktahidratas – bario dihidroksidas oktahidratas, Ba(OH)2×8H2O;

bario karbonatas – bario trioksokarbonatas, BaCO3;

2,6-Di-tert-butil-4-metilfenolis –;

druskos rūgštis – vandenilio chloridas, HCl;

EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis, C10H16N2O8;

etanolaminas – 2-aminoetanolis, H2NCH2CH2OH;

etanolis – C2H5OH;

fenolftaleinas – 3,3-bis[4-hidroksifenil]-1[3H]-izobenzofenonas, C20H14O4;

fosforo pentoksidas – difosforopentoksidas, P2O5;

glicerolis – 1,2,3-propantriolis, C3H8O3;

hidrochinonas – 1,4-benzendiolis, C6H6O2;

kalio dihidrofosfatas – kalio-divandenilio tetraoksofosfatas, KH2PO4;

kalio hidroksidas – KOH;

metanolis – CH3OH;

natrio askorbatas – C6H7O6Na;

natrio hidroksidas – NaOH;

natrio sulfidas – dinatrio sulfidas, Na2S;

orto-fosforo rūgštis – trivandenilio tetraokso fosfatas, H3PO4;

petroleteris – lengvoji benzino frakcija;

trans-retinolio acetatas – C22H32O2;

trans-retinolio palmitatas – C36H60O2;

triptofanas – 2-amino-3-(3-indolil)propano rūgštis, C11H12N2O2;

vitaminas A – trans-retinolis, 3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetil-1-cikloheksenil)-2,4,6,8-nonatetraen-1-olis, C20H30O

vitaminas E – α-tocoferolis, [2,5,7,8-tetrametil-2-(4‘,8‘,12‘-trimetiltridecil)-6-chromanolis, C29H50O2;

vitamino E acetatas – DL – α-tocoferolio acetatas, C31H52O3;

α-metil-triptofanas – 2-amino-2-metil-3-(3-indolil)propano rūgštis, C12H14N2O2.

7. Metodų aprašymuose vartojamos santrumpos:

BHT – 2,6-Di-tert-butil-4-metilfenolis;

c – koncentracija;

Em – fluorescencijos emisijos bangos ilgis;

ESCh – efektyvioji skysčių cromatografija;

Ex – fluorescencijos sužadinimo spinduliuotės bangos ilgis;

HPLC – efektyvioji skysčių chromatografija;

SPM – sertifikuota palyginamoji medžiaga;

T. V. – tarptautinis vienetas;

tvir – virimo temperatūra;

UV – ultravioletinė spinduliuotė;

v/v – tūrių santykis.

 

III. Mėginių paruošimas cheminei analizei

 

8. Pašarų cheminių analizių metodų bendrosios nuostatos:

8.1. Mėginių paruošimas cheminėms analizėms:

8.1.1. aprašyti veiksmai toliau taikomi galutiniams mėginiams (toliau – mėginiai), atsiųstiems į bandymo laboratorijas po mėginių paėmimo pagal Pašarų mėginių paėmimo ir paruošimo techninį reglamentą, patvirtintą Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 208 (Žin., 2000, Nr. 60-1786);

8.1.2. galutiniai mėginiai turi būti paruošti tokiu būdu, kad pasverti kiekiai, numatyti analizių metoduose, būtų homogeniniai ir atitiktų galutinį mėginį.

8.2. Būtinos atsargumo priemonės mėginių paruošimo metu:

8.2.1. visi būtini veiksmai turi būti atliekami išvengiant mėginio užteršimo ir jo sudėties pokyčio. Malimas, maišymas ir sijojimas turi būti atliekami kaip galima greičiau, kuo trumpiau mėginį veikiant oru ir šviesa. Neturi būti naudojami malūnai ir smulkintuvai, akivaizdžiai įšildantys mėginį. Pašarus, kurie yra ypač jautrūs šilumai, rekomenduojama smulkinti rankomis. Reikėtų įsitikinti, kad patys prietaisai nėra mikroelementų taršos šaltinis;

8.2.2. jei mėginys negali būti paruoštas be mėginio drėgnio pokyčio, prieš paruošimą ir po jo nustatomas drėgnio kiekis pagal Drėgnio, lakiųjų azoto bazių, suminio fosforo, žalio aliejaus ir riebalų kiekio nustatymo pašaruose techninį reglamentą, patvirtintą Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 206 (Žin., 2000, Nr. 60-1784);

8.3. Galutinio mėginio paruošimo eiga:

8.3.1. galutinis mėginys kruopščiai sumaišomas maišytuvu arba rankomis. Mėginys padalijamas į dvi lygias dalis (jei tinka, turi būti naudojamas ketvirčiavimo metodas). Viena dalis saugoma tinkamoje švarioje, sausoje talpykloje, su oro nepraleidžiančiu kamščiu, antroji dalis (arba jai būdinga mažiausiai 100 g dalis) paruošiama, kaip nurodyta toliau:

8.3.1.1. pašarai gali būti malami iš karto, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip. Visas sumaltas mėginys persijojamas per sietą su kvadratinėmis akutėmis, kurios kraštinės ilgis 1 mm (pagal rekomendaciją ISO R565). Vengiama per smulkaus sumalimo. Persijotas mėginys išmaišomas ir surenkamas į tinkamą švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys vėl išmaišomas;

8.3.1.2. pašarai gali būti sumalami juos išdžiovinus, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip; mėginys džiovinamas, siekiant sumažinti drėgnį iki 8%–12%, pagal parengtinio džiovinimo procedūrą, nurodytą drėgnio nustatymo metodo 4.3 punkte. Toliau dirbama, kaip nurodyta šio techninio reglamento 8.3.1.1 punkte;

8.3.1.3. skysto ir pusiau skysto pašaro mėginys surenkamas į tinkamą švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys kruopščiai išmaišomas;

8.3.1.4. kitų pašarų mėginiai, kurie negali būti paruošti vienu iš nurodytų būdų, turi būti paruošiami bet kokiu kitu būdu, garantuojančiu, kad cheminei analizei pasvertas mėginys yra homogeninis ir būdingas galutiniam mėginiui.

8.4. Mėginiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Mėginiai, kuriuose numatyta analizuoti vitaminus ar kitas iš dalies šviesai jautrias medžiagas, turi būti laikomi rudo stiklo induose.

8.5. Reikalavimai reagentams ir prietaisams, naudojamiems cheminės analizės metoduose:

8.5.1. visi analiziniai reagentai turi būti analiziškai gryni (a. p.), jei cheminės analizės metoduose nenurodyta kitaip. Nustatant mikroelementus, reagentų grynumas turi būti tikrinamas „tuščiuoju“ bandymu. Atsižvelgiant į gautą rezultatą, gali būti reikalingas tolesnis reagentų gryninimas;

8.5.2. jei analizės metodų veiksmuose, susietuose su tirpalų ruošimu, skiedimu, skalavimu ar plovimu, nenurodoma naudojamo tirpiklio ar skiediklio prigimtis, suprantama, kad turi būti naudojamas vanduo. Vanduo turi būti tik demineralizuotas ar distiliuotas. Kai kuriais analizių metoduose nurodytais atvejais jis turi būti gryninamas specialiomis priemonėmis;

8.5.3. atsižvelgiant į kontrolės laboratorijose esančią įrangą, cheminės analizės metoduose leidžiama naudoti tik specialius ar specifinio naudojimo reikalaujančius instrumentus ir prietaisus. Jie turi būti ypač švarūs, nustatant labai mažus medžiagų kiekius.

8.6. Cheminės analizės metodų taikymas ir rezultatų išraiška:

8.6.1. kiekviena medžiaga pašaruose paprastai nustatoma atskiru metodu. Jei yra pateikta keletas metodų, kontrolės laboratorijoje naudotas metodas turi būti nurodomas analizės ataskaitoje;

8.6.2. analizės ataskaitoje pateikiamas rezultatas išreiškiamas mažiausiai dviejų matavimų, atliktų su atskiromis mėginio dalimis, vidurkiu, esant patenkinamam šių matavimų pakartojamumui. Šis rezultatas išreiškiamas reikšmingų skaitmenų skaičiumi analizės metoduose nurodytu būdu ir, jei reikia, koreguojamas pagal drėgnio kiekį, esantį galutiniame mėginyje prieš jo paruošimą.

 

IV. Mėginių cheminė analizė

9. Vitamino A kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento 1 priede nurodytą metodą.

10. Vitamino E kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento 2 priede nurodytą metodą.

11. Triptofano kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento 3 priede nurodytą metodą.

______________

 

Vitamino A, vitamino E ir  triptofano kiekio nustatymo pašaruose techninio reglamento

1 priedas

 

vitamino A nustatymas

 

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatomas vitamino A (retinolio) kiekis pašaruose ir premiksuose. Šiame techniniame reglamente sąvoka „vitaminas A“ apima trans- retinolį ir visus jo cis izomerus, nustatomus šiuo metodu. Vitamino A kiekis išreiškiamas tarptautiniais vienetais (T. V.) kilograme. Vienas T. V. atitinka 0,300 µg trans-vitamino A alkoholio, 0,344 µg trans-vitamino A acetato arba 0,550 µg trans-vitamino A palmitato aktyvumui. Vitamino A nustatymo riba – 2000 T. V./kg.

2. Metodo esmė

Mėginys hidrolizuojamas etanoliniu kalio hidroksido tirpalu, vitaminas A ekstrahuojamas petroleteriu. Tirpiklis pašalinamas nugarinant, likutis tirpinamas metanolyje ir, jei reikia, skiedžiamas iki reikiamos koncentracijos. Vitamino A kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviąja skysčių chromatografija (ESCh) su UV arba fluorescenciniu detektoriumi. Parenkamos tokios chromatografavimo sąlygos, kurioms esant nevyktų trans-vitamino A alkoholio ir jo cis izomerų atskyrimas.

3. Reagentai:

3.1. etanolis;

3.2. petroleteris, tvir= 40oC – 60oC;

3.3. metanolis;

3.4. kalio hidroksido tirpalas, c = 50 g/100 ml;

3.5. natrio askorbato tirpalas, c = 10 g/100 ml (žr. 7 pastabą);

3.6. natrio sulfidas, Na2S×nH2O, (n = 7 – 9);

3.6.1. natrio sulfido tirpalas glicerolyje, c = 0,5 mol/l, c = 120 g/l, kai n = 9 (žr. 8 pastabą);

3.7. fenolftaleino tirpalas etanolyje (3.1 punktas), c = 2g/100 ml;

3.8. 2-propanolis;

3.9. ESCh judančioji fazė: metanolio (3.3 punktas) ir vandens mišinys santykiu 980/20 (v/v). Tikslus santykis turi būti nustatomas vadovaujantis naudojamos chromatografinės kolonėlės charakteristikomis;

3.10. azotas, be deguonies;

3.11. trans-vitamino A acetatas, ypač švarus, sertifikuotas aktyvumas 2,80×106 T. V./g;

3.11.1. trans-vitamino A acetato pradinis standartinis tirpalas: į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 50 mg trans-vitamino A acetato (3.11 punktas), ištirpinama 2-propanolyje (3.8 punktas) ir tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės. Apytikrė vitamino A koncentracija tirpale yra 1400 T. V./ml. Tikslus kiekis nustatomas pagal 5.6.3.1 punktą;

3.12. trans-vitamino A palmitatas, ypač švarus, sertifikuotas aktyvumas 1,80×106 T. V./g;

3.12.1. trans-vitamino A palmitato pradinis standartinis tirpalas: į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 80 mg trans-vitamino A palmitato (3.12 punktas), ištirpinama 2-propanolyje (3.8 punktas) ir tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės. Apytikrė vitamino A koncentracija tirpale yra 1400 T. V./ml. Tikslus kiekis nustatomas pagal 5.6.3.1 punktą;

3.13. 2,6-Di-tert-butil-4-metilfenolis (BHT) (žr. 5 pastabą).

4. Įranga:

4.1. vakuuminis sukamasis garintuvas;

4.2. rudo stiklo indai:

4.2.1. plokščiadugnės arba konusinės kolbos, 500 ml, su šlifuoto stiklo jungtimi;

4.2.2. matavimo kolbos su šlifuoto stiklo kamšteliais, siauru kakleliu, 10 ml, 25 ml, 100 ml ir 500 ml;

4.2.3. dalomieji piltuvai, konusiniai, 1000 ml, su šlifuoto stiklo kamščiais;

4.2.4. kriaušės formos kolbos, 250 ml, su šlifuoto stiklo jungtimi;

4.3. Allihn kondensatorius, apvalkalo ilgis 300 mm, su šlifuoto stiklo jungtimi, su adapteriu dujų tiekimo vamzdeliui;

4.4. lankstytas popierinis filtras, skirtas fazių atskyrimui, skersmuo 185 mm (pvz.: Schleicher&Schuell 597 HY½);

4.5. ESCh įranga su įleidimo sistema:

4.5.1. skysčių chromatografijos kolonėlė, 250 mm×4 mm, C18, 5 µm arba 10 µm įkrova, ar panaši (efektyvumo kriterijus: tik viena smailė visiems retinolio izomerams nustatytomis chromatografavimo sąlygomis);

4.5.2. kintamo bangos ilgio UV arba fluorescencinis detektorius;

4.6. spektrofotometras su 10 mm kvarcinėmis kiuvetėmis;

4.7. vandens vonelė su magnetiniu maišikliu;

4.8. ekstrahavimo įrenginys (žr. 1 paveikslą):

4.8.1. 1 l talpos cilindras su šlifuoto stiklo kaklu ir kamščiu;

4.8.2. šlifuoto stiklo įvorė su įrengta šonine atšaka ir reguliuojamu vamzdeliu, išvestu per įvorės centrą. Apatinis vamzdelio galas turi būti U formos, viršutiniame šio vamzdelio gale įtaisytas purkštukas, leidžiantis viršutinį skysčio, esančio cilindre, sluoksnį perpilti į dalomąjį piltuvą.

5. Procedūra

Pastaba. Vitaminas A jautrus šviesai (UV) ir oksidacijai. Visi veiksmai turi būti atliekami vengiant šviesos (naudojant rudo stiklo indus arba stiklinius indus, apvyniotus aliuminio folija) ir deguonies (išpučiant azotu). Ekstrahuojant oras virš skysčio turi būti pakeistas azotu (papildomo slėgio išvengiama kartais atpalaiduojant kamštį).

5.1. Mėginio paruošimas

Mėginys malamas taip, kad neįšiltų ir persisijotų per sietą su 1 mm dydžio akutėmis. Malama prieš pat svėrimą ir muilinimą, priešingu atveju galimi vitamino A nuostoliai.

5.2. Muilinimas

Priklausomai nuo vitamino A kiekio į 500 ml plokščiadugnę ar konusinę kolbą (4.2.1 punktas) 0,01g tikslumu pasveriama nuo 2 g iki 25 g mėginio. Į kolbą vienas paskui kitą supilami 130 ml etanolio (3.1 punktas), apytiksliai 100 mg BHT (3.13 punktas), 2 ml natrio askorbato tirpalo (3.5 punktas) ir 2 ml natrio sulfito tirpalo (3.6 punktas). Prie kolbos prijungiamas kondensatorius (4.3 punktas), kolba įmerkiama į vandens vonelę su magnetiniu maišikliu (4.7 punktas). Kolbos turinys užvirinamas ir 5 min. virinamas su prijungtu Allihn kondensatoriumi. Po to į kolbą per kondensatorių (4.3 punktas) supilami 25 ml kalio hidroksido tirpalo (3.4 punktas) ir toliau 25 min. virinamas su prijungtu Allihn kondensatoriumi maišant silpname azoto sraute. Kondensatorius skalaujamas apytiksliai 20 ml vandens, kolbos turinys atvėsinamas iki kambario temperatūros.

5.3. Ekstrahavimas

Muilintas tirpalas dekantuojant kiekybiškai pernešamas į 1000 ml dalomąjį piltuvą (4.2.3 punktas) arba į ekstrahavimo įrenginį (4.8 punktas). Nuosėdos skalaujamos vandeniu, kurio suminis sunaudotas kiekis sudarytų 250 ml. Muilinimo kolba skalaujama 25 ml etanolio (3.1 punktas), po to 100 ml petroleterio (3.2 punktas). Pastarieji tirpikliai supilami į tą patį dalomąjį piltuvą arba ekstrahavimo įrenginį. Vandens ir etanolio santykis jungtiniame tirpale turėtų būti apie 2:1. 2 min. energingai purtoma, 2 min. paliekama nusistovėti.

5.3.1. Ekstrahavimas naudojant dalomąjį piltuvą (4.2.3 punktas)

Atsiskyrus sluoksniams (žr. 3 pastabą) petroleterio sluoksnis perpilamas į kitą dalomąjį piltuvą (4.2.3 punktas). Ekstrahavimas kartojamas du kartus su 100 ml petroleterio (3.2 punktas) ir du kartus su 50 ml petroleterio (3.2 punktas). Dalomajame piltuve jungtinis ekstraktas du kartus, lengvai sukant (siekiant išvengti emulsijų susidarymo), plaunamas 100 ml vandens. Po to, toliau purtant, plaunamas 100 ml vandens porcijomis, kol vanduo, pridėjus fenolftaleino tirpalo (3.7 punktas), išlieka bespalvis (paprastai tam pakanka 4 kartų). Siekiant pašalinti suspenduotą vandenį išplautas ekstraktas filtruojamas per fazių atskyrimui skirtą lankstytą sausą popierinį filtrą į 500 ml matavimo kolbą (4.2.2 punktas). Dalomasis piltuvas ir filtras skalaujami 50 ml petroleterio (3.2 punktas). Iki žymės skiedžiama petroleteriu (3.2 punktas) ir gerai išmaišoma.

5.3.2. Ekstrahavimas naudojant ekstrahavimo įrenginį (4.8 punktas)

Atsiskyrus sluoksniams (žr. 3 pastabą) stiklinio cilindro (4.8.1 punktas) kamštis pakeičiamas šlifuoto stiklo įvore (4.8.2 punktas). Vamzdelio U formos galas turi būti truputį aukščiau sluoksnių sandūros lygio. Prijungus azotą per šoninę įvorės atšaką dėl padidėjusio slėgio viršutinis petroleterio sluoksnis perpilamas į 1000 ml dalomąjį piltuvą (4.2.3 punktas). Į stiklinį cilindrą įpilama 100 ml petroleterio (3.2 punktas), užkemšama ir stipriai papurtoma. Sluoksniams atsiskyrus viršutinis sluoksnis kaip ir prieš tai perpilamas į dalomąjį piltuvą. Ekstrahavimas kartojamas du kartus su 100 ml petroleterio (3.2 punktas) ir du kartus su 50 ml petroleterio (3.2 punktas). Petroleterio sluoksniai supilami į dalomąjį piltuvą. Jungtinis petroleterio ekstraktas plaunamas, kaip aprašyta 5.3.1 punkte.

5.4. Mėginio ekstrakto paruošimas ESCh analizei

Į 250 ml kriaušės formos kolbą (4.2.4 punktas) pipete įpilamas atitinkamas petroleterio tirpalo (5.3.1 arba 5.3.2 punktas) kiekis. Tirpiklis išgarinamas vakuuminiu sukamuoju garintuvu (4.1 punktas) neviršijant 40oC temperatūros. Atmosferos slėgis garintuve atstatomas įleidžiant į jį azoto (3.10 punktas). Kolba nuimama nuo garintuvo. Tirpiklio likutis kolboje pašalinamas nupučiant jį azotu (3.10 punktas). Sausa liekana tirpinama žinomame metanolio (3.3 punktas) kiekyje (10 ml–100 ml) (vitamino A koncentracija turi būti 5 T. V./ml–30 T. V./ml intervale).

5.5. Nustatymas su ESCh

Vitaminas A atskiriamas atvirkštinių fazių C18 chromatografinėje kolonėlėje (4.5.1 punktas), o koncentracija matuojama UV (325 nm) arba florescenciniu (Ex: 325 nm, Em: 475 nm) detektoriumi (4.5.2 punktas).

Įleidžiama, pvz.: 20µl pagal 5.4 punkto paruošto metanolinio tirpalo ir eliuojama judančia faze (3.9 punktas). Apskaičiuojamas kelių to paties mėginio ekstrakto chromatogramų smailių aukščių (plotų) vidurkis ir kelių kalibracinių tirpalų (5.6.2 punktas) chromatogramų smailių aukščių (plotų) vidurkis.

 

ESCh parametrai:

Siūloma taikyti šias arba kitas sąlygas, jei jos duoda panašius rezultatus:

skysčių chromatografijos              kolonėlė (4.5.1 punktas):

 

judančioji fazė (3.9 punktas):

 

debitas:

detektorius (4.5.2 punktas):

 

įleidimo tūris:

 

250 mm×4 mm, C18, 5 µm arba 10 µm įkrova; ar panaši;

 

 

metanolio (3.3 punktas) ir vandens mišinys santykiu

980/20 (v/v);

1 ml/min. – 2 ml/min.;

UV (325 nm) arba florescencinis (Ex: 325 nm, Em: 475 nm) detektorius;

20 ml.

 

5.6. Kalibravimas

5.6.1. Darbinių standartinių tirpalų ruošimas

Į 500 ml plokščiadugnę arba konusinę kolbą (4.2.1 punktas) pipete įpilama 20 ml vitamino A acetato pradinio standartinio tirpalo (3.11.1 punktas) arba 20 ml vitamino A palmitato pradinio standartinio tirpalo (3.12.1 punktas). Hidrolizuojama, kaip aprašyta 5.2 punkte, nededant BHT. Ekstrahuojama petroleteriu (3.2 punktas), kaip nurodyta 5.3 punkte, skiedžiama petroleteriu (3.2 punktas) iki 500 ml. 100 ml šio ekstrakto išgarinama sukamuoju garintuvu (5.4 punktas), tirpiklio likutis nupučiamas azotu (3.10 punktas). Sausa liekana tirpinama 10,0 ml metanolio (3.3 punktas). Apytikslė vitamino A koncentracija šiame tirpale – 560 T. V./ml. Tiksli koncentracija nustatoma pagal 5.6.3.3 punktą. Darbinis standartinis tirpalas gaminamas analizės dieną.

2,0 ml šio darbinio standartinio tirpalo pipete įpilami į 20 ml matavimo kolbą, iki žymės skiedžiama metanoliu (3.3 punktas) ir išmaišoma. Apytikslė vitamino A koncentracija šiame tirpale – 56 T. V./ml.

5.6.2. Kalibracinių tirpalų ir kalibracinės kreivės ruošimas

Į 20 ml matavimo kolbas įpilama 1,0 ml, 2,0 ml, 5,0 ml ir 10,0 ml skiesto darbinio standartinio tirpalo. Iki žymės skiedžiama metanoliu (3.3 punktas) ir išmaišoma. Apytikslė vitamino A koncentracija šiuose tirpaluose yra 2,8 T. V./ml, 5,6 T. V./ml, 14,0 T. V./ml ir 28,0 T. V./ml.

Keletą kartų įleidžiama 20 µl kiekvieno kalibracinio tirpalo į chromatografą ir apskaičiuojamas smailių aukščių (plotų) vidurkis. Panaudojant smailių aukščių (plotų) vidurkius ir atsižvelgiant į patikrinimą UV srityje (5.6.3.3 punktas), brėžiama kalibracinė kreivė.

5.6.3. Standartinių tirpalų patikrinimas UV srityje

5.6.3.1. Vitamino A acetato pradinis standartinis tirpalas

Į 50 ml matavimo kolbą (4.2.2 punktas) įpilami 2,0 ml vitamino A acetato pradinio standartinio tirpalo (3.11.1 punktas). Iki žymės skiedžiama 2-propanoliu (3.8 punktas). Apytikslė vitamino A koncentracija šiame tirpale yra 56 T. V./ml. 3,0 ml šio skiesto vitamino A acetato tirpalo įpilami į 25 ml matavimo kolbą, iki žymės skiedžiama 2-propanoliu (3.8 punktas). Apytikslė vitamino A koncentracija šiame tirpale yra 6,72 T. V./ml. Spektrofotometru (4.6 punktas) 300 nm–400 nm bangos ilgio intervale matuojamas šio tirpalo UV spektras. Lyginama su 2-propanoliu (3.8 punktas). Didžiausia ekstinkcija turėtų būti tarp 325 nm ir 327 nm.

Vitamino A kiekis skaičiuojamas:

Vitaminas A T. V./ml = E326 × 19,0

2-propanolyje vitamino A acetato E= 1530, esant 326 nm bangos ilgiui

5.6.3.1. Vitamino A palmitato pradinis standartinis tirpalas

Į 50 ml matavimo kolbą (4.2.2 punktas) įpilami 2,0 ml vitamino A palmitato pradinio standartinio tirpalo (3.12.1 punktas). Iki žymės skiedžiama 2-propanoliu (3.8 punktas). Apytikslė vitamino A koncentracija šiame tirpale yra 56 T. V./ml. 3,0 ml šio skiesto vitamino A palmitato tirpalo įpilami į 25 ml matavimo kolbą, iki žymės skiedžiama 2-propanoliu (3.8 punktas). Apytikslė vitamino A koncentracija šiame tirpale yra 6,72 T. V./ml. Spektrofotometru (4.6 punktas) 300 nm–400 nm bangos ilgio intervale matuojamas šio tirpalo UV spektras. Lyginama su 2-propanoliu (3.8 punktas). Didžiausia ekstinkcija turi būti tarp 325 nm ir 327 nm.

Vitamino A kiekis skaičiuojamas:

Vitaminas A T. V./ml = E326 × 19,0

2-propanolyje vitamino A palmitato E= 957, esant 326 nm bangos ilgiui

5.6.3.3. Vitamino A darbinis standartinis tirpalas

Į 50 ml matavimo kolbą (4.2.2 punktas) įpilami 3,0 ml neskiesto vitamino A darbinio standartinio tirpalo (5.6.1 punktas). Iki žymės skiedžiama 2-propanoliu (3.8 punktas). 5,0 ml šio tirpalo įpilami į 25 ml matavimo kolbą, iki žymės skiedžiama 2-propanoliu (3.8 punktas). Apytikslė vitamino A koncentracija šiame tirpale yra 6,72 T. V./ml. Spektrofotometru (4.6 punktas) 300 nm–400 nm bangos ilgio intervale matuojamas šio tirpalo UV spektras. Lyginama su 2-propanoliu (3.8 punktas). Didžiausia ekstinkcija turi būti tarp 325 nm ir 327 nm.

Vitamino A kiekis skaičiuojamas:

Vitaminas A T. V./ml = E325 × 18,3

2-propanolyje vitamino A alkoholio E= 1821, esant 325 nm bangos ilgiui

6. Rezultatų apskaičiavimas

Remiantis kalibracine kreive (5.6.2 punktas) pagal mėginio ekstrakte esančio vitamino A smailių aukščių (plotų) vidurkį nustatoma mėginio ekstrakto koncentracija T. V./ml.

Vitamino A kiekis w (T. V./kg) mėginyje apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

kurioje:

β – vitamino A koncentracija mėginio ekstrakte (5.4 punktas) T. V./ml;

V1 – mėginio ekstrakto tūris (5.4 punktas) ml;

V2 – alikvotinės dalies, paimtos iš ekstrakto (5.4 punktas), tūris ml;

m – mėginio masė g.

7. Pakartojamumas

Skirtumas tarp dviejų kartotinių to paties mėginio matavimų rezultatų neturi viršyti 15 % santykinai didesnės vertės.

8. Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai[1]

 

 

Premiksas

Pašarų priedas

Mineralinis koncentratas

Baltyminis pašaras

Pašaras paršeliams

L

n

Vidurkis (T. V./kg)

Sr (T. V./kg)

r (T. V./kg)

CVr (%)

SR (T. V./kg)

R (T. V./kg)

CVR (%)

13

48

17,02×106

0,51×106

1,43×106

3,0

1,36×106

3,81×106

8,0

12

45

1,21×106

0,039×106

0,109×106

3,5

0,069×106

0,193×106

6,2

13

47

537100

22080

61824

4,1

46300

129640

8,6

12

46

151800

12280

34384

8,1

23060

64568

15

13

49

18070

682

1910

3,8

3614

10119

20

L – laboratorijų skaičius;

n – vienetinių verčių skaičius;

Sr – pakartojamumo standartinis nuokrypis;

SR – atkartojamumo standartinis nuokrypis;

r – pakartojamumas;

R – atkartojamumas;

CVR – atkartojamumo variacijos koeficientas;

CVr – pakartojamumo variacijos koeficientas.

Pastabos:

1. Jei mėginiuose yra nedidelis vitamino A kiekis, ESCh matavimui būtų naudinga sujungti dviejų muilinimo įkrovų (po 25 g) petroleterio ekstraktus.

2. Analizei pasvertame mėginyje riebalai neturi viršyti 2 g.

3. Jei fazės neatsiskiria, įdedama apytiksliai 10 ml etanolio (3.1 punktas) emulsijai susilpninti.

4. Jei mėginyje yra žuvų taukų ar kitų grynų riebalų, muilinimo trukmė pratęsiama iki 45–60 min.

5. Vietoj BHT gali būti naudojamas hidrochinonas.

6. Retinolio izomerų atskyrimas yra įmanomas naudojant normalių fazių chromatografinę kolonėlę.

7. Vietoj natrio askorbato tirpalo gali būti naudojamas apytiksliai 150 mg askorbo rūgšties.

8. Vietoj natrio sulfido tirpalo gali būti naudojamas apytiksliai 50 mg EDTA.

 

______________

 

Vitamino A, vitamino E ir triptofano kiekio nustatymo pašaruose techninio reglamento

2 priedas

 

vitamino E nustatymas

 

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatomas vitamino E kiekis pašaruose ir premiksuose. Vitamino E kiekis išreiškiamas mg DL-α-tokoferolio kilograme mėginio. 1 mg DL-α-tokoferolio acetato atitinka 0,91 mg DL-α-tokoferolio (vitamino E). Vitamino E nustatymo riba – 2 mg/kg.

2. Metodo esmė

Mėginys hidrolizuojamas etanoliniu kalio hidroksido tirpalu, vitaminas E ekstrahuojamas petroleteriu. Tirpiklis pašalinamas nugarinant, likutis tirpinamas metanolyje ir, jei reikia, skiedžiamas iki reikiamos koncentracijos. Vitamino E kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviąja skysčių chromatografija (ESCh) su UV arba fluorescenciniu detektoriumi.

3. Reagentai:

3.1. etanolis;

3.2. petroleteris, tvir= 40oC – 60oC;

3.3. metanolis;

3.4. kalio hidroksido tirpalas, c = 50 g/100 ml;

3.5. natrio askorbato tirpalas, c = 10 g/100 ml (žr. 7 pastabą);

3.6. natrio sulfidas, Na2S×xH2O, (x=7 – 9);

3.6.1. natrio sulfido tirpalas glicerolyje, c = 0,5 mol/l, c = 120 g/l, kai x = 9 (žr. 8 pastabą);

3.7. fenolftaleino tirpalas etanolyje (3.1 punktas), c = 2g/100 ml;

3.8. ESCh judančioji fazė: metanolio (3.3 punktas) ir vandens mišinys santykiu 980/20 (v/v). Tikslus santykis turi būti nustatomas pagal naudojamos chromatografinės kolonėlės charakteristikas;

3.9. azotas, be deguonies;

3.10. DL-α-tokoferolio acetatas, ypač švarus, sertifikuoto aktyvumo;

3.10.1. DL-α-tokoferolio acetato pradinis standartinis tirpalas: į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 100 mg DL-α-tokoferolio acetato (3.10 punktas), ištirpinama etanolyje (3.1 punktas) ir tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės. Viename mililitre šio tirpalo yra 1 mg DL-α-tokoferolio acetato (apie patikrinimą UV srityje žr. 5.6.1.3 punktą; stabilizavimą žr. 4 pastaboje);

3.11. DL-α-tokoferolis, ypač švarus, sertifikuoto aktyvumo;

3.11.1. DL-α-tokoferolio pradinis standartinis tirpalas: į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 100 mg DL-α-tokoferolio (3.11 punktas), ištirpinama etanolyje (3.1 punktas) ir tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės. Viename mililitre šio tirpalo yra 1 mg DL-α-tokoferolio (apie patikrinimą UV srityje žr. 5.6.2.3 punktą; stabilizavimą žr. 4 pastaboje);

3.12. 2,6-Di-tert-butil-4-metilfenolis (BHT) (žr. 5 pastabą).

4. Įranga:

4.1. vakuuminis sukamasis garintuvas;

4.2. rudo stiklo indai:

4.2.1. plokščiadugnės arba konusinės kolbos, 500 ml, su šlifuoto stiklo jungtimi;

4.2.2. matavimo kolbos su šlifuoto stiklo kamšteliais, siauru kakleliu, 10 ml, 25 ml, 100 ml ir 500 ml;

4.2.3. dalomieji piltuvai, konusiniai, 1000 ml, su šlifuoto stiklo kamščiais;

4.2.4. kriaušės formos kolbos, 250 ml, su šlifuoto stiklo jungtimi;

4.3. Allihn kondensatorius, apvalkalo ilgis 300 mm, su šlifuoto stiklo jungtimi, su adapteriu dujų tiekimo vamzdeliui;

4.4. lankstytas popierinis filtras fazių atskyrimui, skersmuo 185 mm (pvz.: Schleicher&Schuell 597 HY ½);

4.5. ESCh įranga su įleidimo sistema:

4.5.1. skysčių chromatografijos kolonėlė, 250 mm × 4 mm, C18, 5 µm arba 10 µm įkrova, ar panaši;

4.5.2. kintamo bangos ilgio UV arba fluorescencinis detektorius;

4.6. spektrofotometras su 10 mm kvarcinėmis kiuvetėmis;

4.7. vandens vonelė su magnetiniu maišikliu;

4.8. ekstrahavimo įrenginys (žr. 1 paveikslą):

4.8.1. 1 l talpos cilindras su šlifuoto stiklo kaklu ir kamščiu;

4.8.2. šlifuoto stiklo įvorė su įrengta šonine atšaka ir reguliuojamu vamzdeliu, išvestu per įvorės centrą. Apatinis vamzdelio galas turi būti U formos, viršutiniame šio vamzdelio gale įtaisytas purkštukas, leidžiantis viršutinį skysčio, esančio cilindre, sluoksnį perpilti į dalomąjį piltuvą.

5. Procedūra

Pastaba. Vitaminas E jautrus šviesai (UV) ir oksidacijai. Visi veiksmai turi būti atliekami vengiant šviesos (naudojant rudo stiklo indus arba stiklinius indus, apvyniotus aliuminio folija) ir deguonies (išpučiant azotu). Ekstrahuojant oras virš skysčio turi būti pakeistas azotu (papildomo slėgio išvengiama kartais atpalaiduojant kamštį).

5.1. Mėginio paruošimas

Mėginys malamas taip, kad nesušiltų ir persisijotų per sietą su 1 mm dydžio akutėmis. Malama prieš pat svėrimą ir muilinimą, priešingu atveju galimi vitamino E nuostoliai.

5.2. Muilinimas

Priklausomai nuo vitamino E kiekio į 500 ml plokščiadugnę ar konusinę kolbą (4.2.1 punktas) 0,01g tikslumu pasveriama nuo 2g iki 25g mėginio. Į kolbą vienas paskui kitą supilami 130 ml etanolio (3.1 punktas), apytiksliai 100 mg BHT (3.12 punktas), 2 ml natrio askorbato tirpalo (3.5 punktas) ir 2 ml natrio sulfito tirpalo (3.6 punktas). Prie kolbos prijungiamas kondensatorius (4.3 punktas), kolba įmerkiama į vandens vonelę su magnetiniu maišikliu (4.7 punktas). Kolbos turinys užvirinamas ir 5 min. virinamas su prijungtu Allihn kondensatoriumi. Po to į kolbą per kondensatorių (4.3 punktas) supilami 25 ml kalio hidroksido tirpalo (3.4 punktas) ir toliau 25 min. virinamas su prijungtu Allihn kondensatorium įmaišant silpname azoto sraute. Kondensatorius skalaujamas apytiksliai 20 ml vandens, kolbos turinys atvėsinamas iki kambario temperatūros.

5.3. Ekstrahavimas

Muilintas tirpalas dekantuojant kiekybiškai pernešamas į 1000 ml dalomąjį piltuvą (4.2.3 punktas) arba į ekstrahavimo įrenginį (4.8 punktas). Nuosėdos skalaujamos vandeniu, kurio suminis sunaudotas kiekis sudarytų 250 ml. Muilinimo kolba skalaujama 25 ml etanolio (3.1 punktas), po to 100 ml petroleterio (3.2 punktas). Pastarieji tirpikliai supilami į tą patį dalomąjį piltuvą arba ekstrahavimo įrenginį. Vandens ir etanolio santykis jungtiniame tirpale turėtų būti apie 2:1. Energingai purtoma 2 min., po to paliekama 2 min. nusistovėti.

5.3.1. Ekstrahavimas naudojant dalomąjį piltuvą (4.2.3 punktas)

Atsiskyrus sluoksniams (žr. 3 pastabą) petroleterio sluoksnis perpilamas į kitą dalomąjį piltuvą (4.2.3 punktas). Ekstrahavimas kartojamas du kartus su 100 ml petroleterio (3.2 punktas) ir du kartus su 50 ml petroleterio (3.2 punktas). Dalomajame piltuve jungtinis ekstraktas du kartus, lengvai sukant (norint išvengti emulsijų susidarymo), plaunamas 100 ml vandens. Po to toliau purtant plaunama 100 ml vandens porcijomis, kol vanduo, pridėjus fenolftaleino tirpalo (3.7 punktas), išlieka bespalvis (paprastai tam pakanka 4 kartų). Siekiant pašalinti suspenduotą vandenį išplautas ekstraktas filtruojamas per fazių atskyrimui skirtą lankstytą sausą popierinį filtrą į 500 ml matavimo kolbą (4.2.2 punktas). Dalomasis piltuvas ir filtras skalaujami 50 ml petroleterio (3.2 punktas). Iki žymės skiedžiama petroleteriu (3.2 punktas) ir gerai išmaišoma.

5.3.2 ekstrahavimas naudojant ekstrahavimo įrenginį (4.8 punktas)

Atsiskyrus sluoksniams (žr. 3 pastabą) stiklinio cilindro (4.8.1 punktas) kamštis pakeičiamas šlifuoto stiklo įvore (4.8.2 punktas). Vamzdelio U formos galas turi būti truputį aukščiau sluoksnių sandūros lygio. Prijungus azotą per šoninę įvorės atšaką dėl padidėjusio slėgio viršutinis petroleterio sluoksnis perpilamas į 1000 ml dalomąjį piltuvą (4.2.3 punktas). Į stiklinį cilindrą įpilama 100 ml petroleterio (3.2 punktas), užkemšama ir stipriai papurtoma. Sluoksniams atsiskyrus viršutinis sluoksnis kaip ir prieš tai perpilamas į dalomąjį piltuvą. Ekstrahavimas kartojamas su 100 ml petroleterio (3.2 punktas) ir du kartus su 50 ml petroleterio (3.2 punktas). Petroleterio sluoksniai supilami į dalomąjį piltuvą. Jungtinis petroleterio ekstraktas plaunamas, kaip aprašyta 5.3.1 punkte.

5.4. Mėginio ekstrakto paruošimas ESCh analizei

Į 250 ml kriaušės formos kolbą (4.2.4 punktas) pipete įpilamas atitinkamas petroleterio tirpalo (5.3.1. arba 5.3.2 punktas) kiekis. Tirpiklis išgarinamas vakuuminiu sukamuoju garintuvu (4.1 punktas) neviršijant 40oC temperatūros. Atmosferos slėgis garintuve atstatomas įleidžiant į jį azoto (3.9 punktas). Kolba nuimama nuo garintuvo. Tirpiklio likutis kolboje pašalinamas nupučiant jį azotu (3.9 punktas). Sausa liekana tirpinama žinomame metanolio (3.3 punktas) kiekyje (10 ml–100 ml) (DL-α-tokoferolio koncentracija turi būti 5 µg/ml–30 µg/ml intervale).

5.5. Nustatymas su ESCh

Vitaminas E atskiriamas atvirkštinių fazių C18 chromatografinėje kolonėlėje (4.5.1 punktas), o koncentracija matuojama UV (292 nm) arba florescenciniu (Ex: 295 nm, Em: 330 nm) detektoriumi (4.5.2 punktas).

Įleidžiama, pvz.: 20µl pagal 5.4 punkto paruošto metanolinio tirpalo ir eliuojama judančiąja faze (3.8 punktas). Apskaičiuojamas kelių to paties mėginio ekstrakto chromatogramų smailių aukščių (plotų) vidurkis ir kelių kalibracinių tirpalų (5.6.2 punktas) chromatogramų smailių aukščių (plotų) vidurkis.

HPLC parametrai:

Siūloma taikyti šias arba kitas sąlygas, jei jos duoda panašius rezultatus:

skysčių chromatografijos kolonėlė             (4.5.1 punktas):

judančioji fazė (3.8 punktas):

 

debitas:

detektorius (4.5.2 punktas):

 

įleidimo tūris:

250 mm×4 mm, C18, 5 µm arba 10 µm įkrova;

ar panaši

metanolio (3.3 punktas) ir vandens mišinys santykiu 980/20 (v/v).

1 ml/min.–2 ml/min.;

UV (292 nm) arba florescencinis (Ex: 295 nm,

Em: 330 nm) detektorius;

20 ml.

 

5.6. Kalibravimas (DL-α-tokoferolio acetatas arba DL-α-tokoferolis)

5.6.1. DL-α-tokoferolio acetato standartinis tirpalas

5.6.1.1. Darbinio standartinio tirpalo ruošimas

Į 500 ml plokščiadugnę arba konusinę kolbą (4.2.1 punktas) pipete įpilama 25 ml DL-α-tokoferolio acetato pradinio standartinio tirpalo (3.10.1 punktas). Hidrolizuojama, kaip aprašyta 5.2 punkte. Ekstrahuojama petroleteriu (3.2 punktas), kaip nurodyta 5.3 punkte, skiedžiama petroleteriu (3.2 punktas) iki 500 ml. 25 ml šio ekstrakto išgarinama sukamuoju garintuvu (5.4 punktas), tirpiklio likutis nupučiamas azotu (3.9 punktas). Sausa liekana tirpinama 25,0 ml metanolio (3.3 punktas). Apytikslė DL-α-tokoferolio koncentracija šiame tirpale – 45,5 µg/ml, ekvivalentinė 50 µg/ml DL-α-tokoferolio acetato. Darbinis standartinis tirpalas gaminamas analizės dieną.

5.6.1.2. Kalibracinių tirpalų ir kalibracinės kreivės ruošimas

Į 20 ml matavimo kolbas įpilama 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml ir 10,0 ml darbinio standartinio tirpalo. Iki žymės skiedžiama metanoliu (3.3 punktas) ir išmaišoma. Apytikslė DL-α-tokoferolio acetato koncentracija šiuose tirpaluose yra 2,5 µg/ml, 5,0 µg/ml, 10,0 µg/ml ir 25,0 µg/ml arba 2,28 µg/ml, 4,55 µg/ml, 9,10 µg/ml ir 22,8 µg/ml DL-α-tokoferolio.

Keletą kartų įleidžiama 20 µl kiekvieno kalibracinio tirpalo ir apskaičiuojamas smailių aukščių (plotų) vidurkis. Remiantis smailių aukščių (plotų) vidurkiais brėžiama kalibracinė kreivė.

5.6.1.3. Pradinio standartinio DL-α-tokoferolio acetato tirpalo (3.10.1 punktas) patikrinimas UV srityje.

Į 25 ml matavimo kolbą (4.2.2 punktas) įpilami 5,0 ml DL-α-tokoferolio acetato pradinio standartinio tirpalo (3.10.1 punktas). Iki žymės skiedžiama etanoliu (3.1 punktas). Spektrofotometru (4.6) 250 nm–320 nm intervale matuojamas šio tirpalo UV spektras. Lyginama su etanoliu (3.1 punktas). Didžiausia absorbcija turėtų būti esant 284 nm bangos ilgiui:

Etanolyje DL-α-tokoferolio acetato E= 43,6 esant 284 nm bangos ilgiui

Šio tirpalo ekstinkcija turėtų siekti 0,84–0,88.

5.6.2. DL-α-tokoferolio standartinis tirpalas

5.6.2.1. Darbinio standartinio tirpalo ruošimas

Į 50 ml matavimo kolbą pipete įpilami 2,0 ml DL-α-tokoferolio pradinio standartinio tirpalo (3.11.1 punktas). Iki žymės skiedžiama metanoliu (3.3 punktas) ir išmaišoma. Apytikslė DL-α-tokoferolio koncentracija šiame tirpale – 40 µg/ml, ekvivalentinė 44,0 µg/ml DL-α-tokoferolio acetato. Darbinis standartinis tirpalas gaminamas analizės dieną.

5.6.2.2. Kalibracinių tirpalų ir kalibracinės kreivės ruošimas.

Į 20 ml matavimo kolbas įpilama 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml ir 10,0 ml darbinio standartinio tirpalo. Iki žymės skiedžiama metanoliu (3.3 punktas) ir išmaišoma. Apytikslė DL-α-tokoferolio koncentracija šiuose tirpaluose yra 2,0 µg/ml, 4,0 µg/ml, 8,0 µg/ml ir 20,0 µg/ml arba 2,20 µg/ml, 4,40 µg/ml, 8,79 µg/ml ir 22,0 µg/ml DL-α-tokoferolio acetato.

Keletą kartų įleidžiama 20 µl kiekvieno kalibracinio tirpalo ir apskaičiuojamas smailių aukščių (plotų) vidurkis. Remiantis smailių aukščių (plotų) vidurkiais brėžiama kalibracinė kreivė.

5.6.2.3. Pradinio standartinio DL-α-tokoferolio tirpalo (3.11.1 punktas) patikrinimas UV srityje

Į 25 ml matavimo kolbą (4.2.2 punktas) įpilami 2,0 ml DL-α-tokoferolio pradinio standartinio tirpalo (3.11.1 punktas). Iki žymės skiedžiama etanoliu (3.1 punktas). Spektrofotometru (4.6 punktas) 250 nm–320 nm intervale matuojamas šio tirpalo UV spektras. Lyginama su etanoliu (3.1 punktas). Didžiausia absorbcija turėtų būti 292 nm bangos ilgyje:

Etanolyje DL-α-tokoferolio E= 75,8 esant 292 nm bangos ilgiui

Šio tirpalo ekstinkcija turėtų siekti 0,6.

 

6. Rezultatų apskaičiavimas

Remiantis kalibracine kreive (5.6.1.2 ar 5.6.2.2 punktas), pagal mėginio ekstrakte esančio vitamino E smailių aukščių (plotų) vidurkį nustatoma mėginio ekstrakto koncentracija µg/ml (skaičiuojama kaip DL-α-tokoferolio acetatas).

Vitamino E kiekis w (mg/kg) mėginyje apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

 

500 × β × V2

w = –––––––––––

             V1 × m

 

kurioje:

β – vitamino E koncentracija mėginio ekstrakte (5.4 punktas) µg/ml;

V1 – mėginio ekstrakto tūris (5.4 punktas) ml;

V2 – alikvotinės dalies, paimtos iš ekstrakto (5.4 punktas), tūris ml;

m – mėginio masė g.

Punkto pakeitimai:

Nr. 3D-134, 2004-03-30, Žin., 2004, Nr. 50-1662 (2004-04-06), i. k. 1042330ISAK003D-134

 

7. Pakartojamumas

Skirtumas tarp dviejų kartotinių to paties mėginio matavimų rezultatų neturi viršyti 15 % santykinai didesnės vertės.

8. Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai[2]

 

 

Premiksas

Pašarų priedas

Mineralinis papildas

Baltyminis papildas

Pašaras paršeliams

L

n

Vidurkis (mg/kg)

Sr (mg/kg)

r (mg/kg)

CVr (%)

SR (mg/kg)

R (mg/kg)

CVR (%)

12

48

17380

384

1075

2,2

830

2324

4,8

12

48

1187

45,3

126,8

3,8

65,0

128,0

5,5

12

48

926

25,2

70,6

2,7

55,5

155,4

6,0

12

448

315

13,0

36,4

4,1

18,9

52,9

6,0

12

48

61,3

2,3

6,4

3,8

7,8

21,8

12,7

 

L – laboratorijų skaičius;

n – vienetinių verčių skaičius;

Sr – pakartojamumo standartinis nuokrypis;

SR – atkartojamumo standartinis nuokrypis;

r – pakartojamumas;

R – atkartojamumas;

CVR – atkartojamumo variacijos koeficientas;

CVr – pakartojamumo variacijos koeficientas.

 

 

 

Pastabos:

1. Jei mėginiuose yra nedidelis vitamino E kiekis, HPLC matavimui būtų naudinga sujungti dviejų muilinimo įkrovų (po 25 g) petroleterio ekstraktus.

2. Analizei pasvertame mėginyje riebalai neturi viršyti 2 g.

3. Jei fazės neatsiskiria, įdedama apytiksliai 10 ml etanolio (3.1 punktas) emulsijai susilpninti.

4. Po DL-α-tokoferolio acetato ar DL-α-tokoferolio tirpalų spektrofotometrinio matavimo (atitinkamai 5.6.1.3 ar 5.6.2.3 punktas) į tirpalus (3.10.1 ir 3.11.1 punktas) pridedama apytiksliai 10 mg BHT (3.12 punktas). Tirpalai šaldytuve gali būti laikomi 4 savaites.

5. Vietoj BHT gali būti naudojamas hidrochinonas.

6. Naudojant normalių fazių chromatografinę kolonėlę yra galimas α-, β-, χ- ir δ-tokoferolio atskyrimas.

7. Vietoj natrio askorbato tirpalo gali būti naudojamas apytiksliai 150 mg askorbo rūgšties.

8. Vietoj natrio sulfido tirpalo gali būti naudojamas apytiksliai 50 mg EDTA.

______________

Vitamino A, vitamino E ir triptofano kiekio nustatymo pašaruose techninio reglamento

3 priedas

 

triptofano nustatymas

 

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatomas suminio ir laisvo triptofano kiekis pašaruose. Šis metodas netinkamas D- ir L- formų atskyrimui.

2. Metodo esmė

Nustatant suminį triptofaną kiekį mėginys hidrolizuojamas šarminėje terpėje prisotintu bario hidroksido tirpalu kaitinant 20 valandų 110 oC temperatūroje. Po hidrolizės pridedamas vidinis standartas.

Nustatant laisvą triptofaną mėginys kartu su vidiniu standartu ekstrahuojamas parūgštintoje terpėje.

Triptofano ir vidinio standarto kiekis nustatomas efektyviąja skysčių chromatografija (ESCh) su fluorescenciniu detektoriumi.

3. Reagentai:

3.1. turi būti naudojamas du kartus distiliuotas arba panašios kokybės vanduo (laidumas < 10 µS/cm);

3.2. standartinė medžiaga: triptofanas (grynumas ne mažesnis kaip 99%), išdžiovintas vakuume su fosforo pentoksidu;

3.3. vidinė standartinė medžiaga: α-metil-triptofanas (grynumas ne mažesnis kaip 99%), džiovintas vakuume su fosforo pentoksidu;

3.4. bario hidroksidas oktahidratas (norint išvengti BaCO3 susidarymo, kuris gali trukdyti nustatymui, reikia vengti Ba(OH)2×8H2O sąveikos su oru) (žr. 3 pastabą);

3.5. natrio hidroksidas;

3.6. ortofosforo rūgštis, c = 85%;

3.7. druskos rūgštis, r20 = 1,19 g/ml;

3.8. metanolis, chromatografiškai grynas;

3.9. petroleteris, tvir= 40oC – 60oC;

3.10. natrio hidroksido tirpalas, c = 1 mol/l: vandenyje ištirpinama 40,0 g NaOH (3.5). Iki 1 litro skiedžiama vandeniu (3.1 punktas);

3.11. druskos rūgštis, c = 6 mol/l: 492 ml HCl (3.7 punktas) skiedžiami vandeniu iki 1 litro;

3.12. druskos rūgštis, c = 1 mol/l: 82 ml HCl (3.7 punktas) skiedžiami vandeniu iki 1 litro;

3.13. druskos rūgštis, c = 0,1 mol/l: 8,2 ml HCl (3.7 punktas) skiedžiami vandeniu iki 1 litro;

3.14. ortofosforo rūgštis, c = 0,5 mol/l: 34 ml orto fosforo rūgšties (3.6 punktas) skiedžiami vandeniu (3.1 punktas) iki 1 litro;

3.15. koncentruotas triptofano (3.2 punktas) tirpalas c = 2,50 µmol/ml: į 500 ml matavimo kolbą pasveriama 0,2553 g triptofano (3.2 punktas) ir tirpinama druskos rūgštyje (3.13 punktas). Iki žymės skiedžiama druskos rūgštimi (3.13 punktas). Laikant –18 oC temperatūroje tirpalą galima naudoti keturias savaites;

3.16. koncentruotas vidinio standarto tirpalas c = 2,50 µmol/ml: į 500 ml matavimo kolbą pasveriama 0,2728 g α-metil-triptofano (3.3 punktas) ir tirpinama druskos rūgštyje (3.13 punktas). Iki žymės skiedžiama druskos rūgštimi (3.13 punktas). Laikant –18 oC temperatūroje tirpalą galima naudoti keturias savaites;

3.17. triptofano ir vidinio standarto kalibracinis standartinis tirpalas: 2,00 ml koncentruoto triptofano tirpalo (3.15 punktas) ir 2,00 ml koncentruoto vidinio standarto (α-metil-triptofano) tirpalo (3.16 punktas) skiedžiami vandeniu (3.1 punktas) ir metanoliu (3.8 punktas) apytiksliai iki tokio pat tūrio ir apytiksliai tokios pat metanolio koncentracijos (10% – 30%), kaip ir galutinis hidrolizatas.

Šis tirpalas gaminamas analizės dieną. Gaminant tirpalą reikia vengti tiesioginių saulės spindulių;

3.18. acto rūgštis;

3.19. 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolis;

3.20. etanolaminas, grynumas didesnis nei 98%;

3.21. 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19 punktas) tirpalas metanolyje (3.8 punktas), c = 1 g/100 ml;

3.22. ESCh judančioji fazė: 3,00 g acto rūgšties (3.18 punktas) + 900 ml vandens (3.1 punktas) + 50,0 ml 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio tirpalo metanolyje (3.21 punktas) (c = 1 g/100 ml). Etanolaminu (3.20 punktas) pH sureguliuojamas iki 5,00. Skiedžiama vandeniu (3.1 punktas) iki 1000 ml.

4. Įranga:

4.1. efektyviosios skysčių chromatografijos (ESCh) įranga su spektrofluorimetriniu detektoriumi;

4.2. skysčių chromatografinė kolonėlė: 125 mm x 4 mm, C18, 3 mm įkrova, ar panaši;

4.3. pH-metras;

4.4. polipropileninės kolbos, 125 ml talpos, plačiu kakleliu, užsukamos;

4.5. membraniniai filtrai, 0,45 mm;

4.6. autoklavas, 110 oC ± 2 oC, 140 ± 10 kPa;

4.7. laboratorinė purtyklė arba magnetinė maišyklė;

4.8. Vortex purtyklė.

5. Procedūra:

5.1. Mėginio paruošimas

Mėginys malamas taip, kad persisijotų per sietą su 0,5 mm dydžio akutėmis. Drėgni mėginiai prieš juos sumalant turi būti džiovinami kaitinant ne aukštesnėje nei 50 oC temperatūroje arba šaldant. Mėginiai su dideliu riebalų kiekiu prieš malimą turi būti ekstrahuojami petroleteriu (3.9 punktas).

5.2. Laisvojo triptofano nustatymas ekstrakte

Į konusinę kolbą 1 mg tikslumu pasveriamas reikiamas (1 g–5 g) paruošto mėginio (5.1 punktas) kiekis. Į kolbą pilama 100 ml druskos rūgšties, c = 0,1 mol/l (3.13 punktas) ir 5,00 ml koncentruoto vidinio standarto tirpalo (3.16 punktas). Mechanine purtykle arba magnetine maišykle (4.7 punktas) 60 min. purtoma arba maišoma. 10 ml nusistovėjusio tirpalo perpilama į stiklinę. Įpilami 5 ml orto-fosforo rūgšties, c = 0,5 mol/l (3.14 punktas). Natrio hidroksido tirpalu, c = 1,0 mol/l (3.10 punktas), pH sureguliuojamas iki 3,0. Įpilama tiek metanolio (3.8 punktas), kad galutiniame tirpale butų gauta 10 %–30 % metanolio koncentracija. Gautas tirpalas perpilamas į reikiamos talpos matavimo kolbą ir skiedžiamas vandeniu iki chromatografavimui reikalingo tūrio (apytiksliai iki tokio pat tūrio, kaip ir standartinis kalibracinis tirpalas (3.17 punktas)).

Prieš injekciją į ESCh kolonėlę keli ml tirpalo filtruojami per 0,45 µm membraninį filtrą (4.5 punktas). Toliau dirbama pagal 5.4 punktą.

Standartiniai tirpalai ir ekstraktai turi būti saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei nėra galimybės išanalizuoti ekstraktų tą pačią dieną, jie tris dienas gali būti laikomi 5oC temperatūroje.

5.3. Suminio triptofano kiekio nustatymas hidrolizate

Į polipropileninę kolbą (4.4 punktas) 0,2 mg tikslumu pasveriamas reikiamas (0,1 g–1 g) paruošto mėginio (5.1 punktas) kiekis. Pasverto mėginio porcijoje turi būti apie 10 mg azoto. Pridedama 8,4 g bario hidroksido oktahidrato (3.4 punktas), įpilama 10 ml vandens. Maišoma Vortex maišykle (4.8 punktas) arba magnetine maišykle (4.7 punktas). Teflonu dengtas magnetas paliekamas mišinyje. Indo sienelės apiplaunamos 4 ml vandens. Uždedamas kamštelis, tačiau indas neužsandarinamas. Indas 30 min.–60 min. laikomas autoklave (4.6 punktas) su verdančiu vandeniu ir garais. Autoklavas uždaromas, autoklavuojama 20 val. 110 oC ± 2 oC temperatūroje.

Prieš atidarant autoklavą temperatūra jame sumažinama iki 100 oC. Siekiant išvengti Ba(OH)2 ´8H2O kristalizacijos, į šiltą mišinį įpilama 30 ml kambario temperatūros vandens. Lėtai purtoma arba maišoma. Įpilami 2,00 ml koncentruoto vidinio standarto (a-metiltriptofano) tirpalo (3.16 punktas). Indai 15 min. šaldomi vandens-ledo vonioje.

Įpilami 5 ml orto fosforo rūgšties, c = 0,5 mol/l (3.14 punktas). Indas laikomas šaldymo vonioje, mišinys neutralizuojamas su HCl, c = 6 mol/l (3.11 punktas), kartkartėmis pamaišant. Druskos rūgštimi, c = 1,0 mol/l (3.12 punktas), pH sureguliuojamas iki 3,0. Įpilama tiek metanolio (3.8 punktas), kad galutiniame tirpale butų gauta 10 %–30 % metanolio koncentracija. Gautas tirpalas perpilamas į reikiamos talpos matavimo kolbą ir skiedžiamas vandeniu iki chromatografijai reikalingo tūrio (pvz., 100 ml). Pripylus metanolio neturi susidaryti nuosėdos.

Prieš įleidžiant į ESCh kolonėlę keli mililitrai tirpalo filtruojami per 0,45 µm membraninį filtrą (4.5 punktas). Toliau dirbama pagal 5.4 punktą.

Standartiniai tirpalai ir hidrolizatai turi būti saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei nėra galimybės išanalizuoti hidrolizatų tą pačią dieną, jie tris dienas gali būti laikomi 5oC temperatūroje.

5.4. Matavimas su ESCh:

5.4.1. Parametrai:

Siūloma taikyti šias izokratinės eliuavimo sąlygas, gali būti naudojamos kitos sąlygos, jei jos duoda panašius rezultatus (žr. 1 ir 2 pastabas):

 

skysčių chromatografijos             kolonėlė

(4.2 punktas):

kolonėlės temperatūra:

judančioji fazė (3.22 punktas):

 

 

 

 

 

debitas:

chromatografavimo trukmė:

matavimo bangos ilgis:

įleidimo tūris:

125 mm x 4 mm, C18, 3 mm įkrova, ar panaši;

 

kambario temperatūra;

3,00 g acto rūgšties (3.18 punktas) + 900 ml vandens (3.1 punktas) + 50,0 ml 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio tirpalo metanolyje (3.21 punktas) (c = 1 g/100 ml). Etanolaminu (3.20 punktas) pH sureguliuojamas iki 5,00. Iki 1000 ml skiedžiama vandeniu (3.1 punktas);

1 ml/min.;

apytiksliai 34 min.;

Ex: 280 nm, Em: 356 nm;

20 ml.

 

6. Rezultatų apskaičiavimas

Triptofano kiekis (g/100 g) mėginyje apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

Triptofano g/100 g mėginio =  [g/100 g],

kurioje:

A – standartiniame kalibravimo tirpalo vidinio standarto smailės plotas (3.17 punktas),

B – ekstrakto (5.2 punktas) arba hidrolizato (5.3 punktas) triptofano smailės plotas,

C – koncentruoto triptofano tirpalo (3.15 punktas), įpilto į kalibravimo tirpalą (3.17 punktas), tūris ml (2 ml),

D – koncentruoto triptofano tirpalo (3.15 punktas), įpilto į kalibravimo tirpalą (3.17 punktas), koncentracija µmol/ml (2,50 µmol/ml),

E – koncentruoto vidinio standarto tirpalo (3.16 punktas), įpilto į ekstraktą (5.2 punktas) ar hidrolizatą (5.3 punktas), tūris ml (atitinkamai 5,00 ml ir 2,00 ml),

F – ekstrakto (5.2 punktas) arba hidrolizato (5.3 punktas) vidinio standarto smailės plotas,

G – standartinio kalibracinio tirpalo (3.17 punktas) triptofano smailės plotas,

H – koncentruoto vidinio standarto tirpalo (3.16 punktas), įpilto į kalibracinį tirpalą (3.17 punktas), tūris ml (2 ml),

W – pasverto mėginio masė g (koreguotas, jei mėginys buvo džiovintas ar nuriebalintas),

MW – triptofano molekulinės masė (204,23).

7. Pakartojamumas

Skirtumas tarp dviejų kartotinių to paties mėginio matavimų verčių neturi būti didesnis nei 10 % nuo santykinai didesnės vertės.

8. Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai

Siekdama patvirtinti hidrolizės metodą, Bendrija organizavo tarplaboratorinius tyrimus, kurių metu dvylikoje laboratorijų buvo išanalizuoti trys mėginiai. Kiekvienas mėginys buvo analizuotas penkis kartus. Rezultatai pateikiami lentelėje:

 

Pašaras kiaulėms

Pašaras kiaulėms, praturtintas L-triptofanu

Kombinuotasis pašaras kiaulėms

L

n

Vidurkis (g/kg)

Sr (g/kg)

r (g/kg)

CVr (%)

SR (g/kg)

R (g/kg)

CVR (%)

12

50

2,42

0,05

0,14

1,9

0,15

0,42

6,3

12

55

3,40

0,05

0,14

1,6

0,20

0,56

6,0

12

50

4,22

0,08

0,22

1,9

0,09

0,25

2,2

L – rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius;

n – vienetinių verčių skaičius, atmetus riktus (nustatytus pagal Cochran, Dixon testą);

Sr – pakartojamumo standartinis nuokrypis;

SR – atkartojamumo standartinis nuokrypis;

r – pakartojamumas;

R – atkartojamumas;

CVR – atkartojamumo variacijos koeficientas %;

CVr – pakartojamumo variacijos koeficientas %.

Siekdama patvirtinti laisvojo triptofano ekstrahavimo metodą, Bendrija organizavo kitus tarplaboratorinius tyrimus, kurių metu dvylikoje laboratorijų buvo išanalizuoti du mėginiai. Kiekvienas mėginys buvo analizuotas penkis kartus. Rezultatai pateikiami lentelėje:

 

Kviečių ir sojų mišinys

Kviečių ir sojų mišinys, praturtintas triptofanu (0,457 g/kg)

L

n

Vidurkis (g/kg)

Sr (g/kg)

r (g/kg)

CVr (%)

SR (g/kg)

R (g/kg)

CVR (%)

12

55

0,391

0,005

0,014

1,34

0,018

0,050

4,71

12

60

0,931

0,012

0,034

1,34

0,048

0,134

5,11

L – rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius;

n – vienetinių verčių skaičius, atmetus riktus (nustatytus pagal Cochran, Dixon testą);

Sr – pakartojamumo standartinis nuokrypis;

SR – atkartojamumo standartinis nuokrypis;

r – pakartojamumas;

R – atkartojamumas;

CVR – atkartojamumo variacijos koeficientas %;

CVr – pakartojamumo variacijos koeficientas %.

 

Atestuojant hidrolizei skirtą triptofaną, Bendrija organizavo tarplaboratorinius tyrimus, kurių metu septyniose laboratorijose buvo išanalizuoti keturi mėginiai. Kiekvienas mėginys buvo analizuotas penkis kartus. Rezultatai pateikiami lentelėje:

 

Maišytas pašaras kiaulėms

(SPM 117)

Neriebūs žuvų miltai

(SPM 118)

Sojų miltai

(SPM 119)

Nugriebto pieno miltai

(SPM 120)

L

n

Vidurkis (g/kg)

Sr (g/kg)

r (g/kg)

CVr (%)

SR (g/kg)

R (g/kg)

CVR (%)

7

25

2,064

0,021

0,059

1,04

0,031

0,087

1,048

7

30

8,801

0,101

0,283

1,15

0,413

1,156

4,69

7

30

6,882

0,089

0,249

1,30

0,283

0,792

4,11

7

30

5,236

0,040

0,112

0,76

0,221

0,619

4,22

L – rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius;

n – vienetinių verčių skaičius, atmetus riktus (nustatytus pagal Cochran, Dixon testą);

Sr – pakartojamumo standartinis nuokrypis;

SR – atkartojamumo standartinis nuokrypis;

r – pakartojamumas;

R – atkartojamumas;

CVR – atkartojamumo variacijos koeficientas %;

CVr – pakartojamumo variacijos koeficientas %.

 

Pastabos:

1. Šios specialios chromatografinės sąlygos gali pagerinti triptofano ir α-metiltriptofano atskyrimą.

Izokratinis eliuavimas ir po jo sekantis gradientinis kolonėlės plovimas:

 

Skysčių chromatografinė kolonėlė

125 mm × 4 mm, C18, 5µm įkrova, ar panaši

Kolonėlės temperatūra

32 oC

Judančioji fazė

A: 0,01 mol/l KH2PO4/ metanolis, 95 / 5 (v/v)

B: metanolis

Gradiento programa

0 min.

100 % A

0 % B

15 min.

100 % A

0 % B

17 min.

60 % A

40 % B

19 min.

60 % A

40 % B

21 min.

100 % A

0 % B

33 min.

100 % A

0 % B

Debitas

1,2 ml/min.

Chromatogramos laikas

Apie 33 min.

 

2. Chromatografavimo procedūra keičiama priklausomai nuo ESCh tipo ir kolonėlės įkrovai naudojamos medžiagos. Pasirinkta chromatografijos sistema turi užtikrinti triptofano ir vidinio standarto atskyrimą. Dar daugiau, labai svarbu, kad skilimo produktai butų gerai atskiriami nuo triptofano ir vidinio standarto. Siekiant patikrinti bazinę liniją vidinio standarto smailės srityje turi būti analizuojami hidrolizatai be vidinio standarto. Svarbu, kad chromatografijos laikas būtų pakankamas visų skilimo produktų eliuavimui, kitaip paskutinė eliuojama smailė gali trukdyti kitai analizei.

Veikianti chromatografinė sistema turi duoti tiesinį atsaką. Tiesinis atsakas turi būti matuojamas esant pastoviai vidinio standarto koncentracijai ir kintančioms triptofano koncentracijoms. Svarbu, kad tiek triptofano, tiek vidinio standarto smailių dydžiai neviršytų ESCh fluorescencinės sistemos tiesinio intervalo. Jei triptofano ir/ar vidinio standarto smailė(-ės) yra per maža(-os) ar per aukšta(-os), analizė turi būti kartojama su kitu mėginio kiekiu ar kitu galutiniu ekstrakto ar hidrolizato tūriu.

3. Kuo senesnis bario hidroksidas, tuo sunkiau ištirpinamas. Tai atsiliepia ESCh nustatymui, kadangi gaunami sumažinti triptofano matavimo rezultatai.

______________

 

Patvirtinta

Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro

2003 m. balandžio 29 d. įsakymu Nr. 3D-179

 

lasalocido natrio druskos kiekio nustatymo pašariniuose produktuose techninis reglamentas

 

Šis reglamentas parengtas remiantis 1999 m. liepos 23 d. Europos Komisijos direktyva 1999/76/EB dėl Bendrijos cheminės analizės metodų, kuriuos valstybės institucijos taiko lasalocido natrio druskai nustatyti pašaruose, ir 1981 m. liepos 30 d. Europos Komisijos direktyva 81/680/EEB, pataisančia direktyvas 71/250/EEB, 71/393/EEB, 72/199/EEB, 73/46/EEB, 74/203/EEB, 75/84/EEB, 76/372/EEB ir 78/633/EEB bei nustatančia cheminės analizės metodus oficialiai pašarų kontrolei.

 

I. Bendrosios nuostatos

 

1. Šis techninis reglamentas nustato cheminės analizės metodus lasalocido kiekiui nustatyti pašarinėse žaliavose, kombinuotuosiuose pašaruose, premiksuose (toliau – pašariniai produktai), vykdant pašarų kokybės valstybinę kontrolę.

2. Jei pašarų analitei nustatyti taikomi du ar daugiau metodų, taikomą metodą, jei nenurodyta kitaip, pasirenka cheminę analizę atliekanti laboratorija, tačiau šis metodas turi būti nurodomas analizės sertifikate.

3. Šio techninio reglamento reikalavimai privalomi visiems pašarus gaminantiems, laikantiems, gabenantiems, naudojantiems, tarpininkaujantiems juos parduodant ir jais prekiaujantiems ūkio subjektams bei institucijai, atsakingai už pašarų kokybės valstybinę kontrolę.

4. Šio techninio reglamento reikalavimai netaikomi pašarams, skirtiems eksportuoti ne į Europos Bendrijos valstybes nares bei gabenamiems uždarose transporto priemonėse arba uždarose pakuotėse tranzitu per Lietuvos Respublikos teritoriją.

 

II. Sąvokos, terminai ir sutrumpinimai

 

5. Šiame techniniame reglamente vartojamos sąvokos:

Drėgnis – laisvo vandens procentinis kiekis medžiagoje.

Radimo riba – kokybiškai nustatomo komponento mažiausias kiekis arba koncentracija, dar duodantys analizinį signalą.

Nustatymo riba – kiekybinės analizės metodu ieškomo komponento mažiausias kiekis arba koncentracija, dar duodantys išmatuojamą signalą.

„Tuščiasis“ pašaras – pašaras be analitės ir be kitų medžiagų, duodančių panašų į analitės analizinį signalą.

Pašariniai produktai – pašarinės žaliavos, kombinuotieji pašarai, premiksai ir pašarų priedai, naudojami gyvūnų mitybai.

Kitos šiame reglamente vartojamos sąvokos turi tą pačią reikšmę kaip Lietuvos Respublikos pašarų įstatyme (Žin., 2000, Nr. 34-952) ir Pašarų klasifikatoriuje, patvirtintame Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 205 (Žin., 2000, Nr. 69-2064).

6. Metodų aprašymuose vartojami cheminių junginių trivialieji pavadinimai ir juos atitinkantys IUPAC terminai:

6-metil-2-heptilaminas – 2-amino-6-metilheptanas, C8H19N;

druskos rūgštis – vandenilio chloridas, HCl;

kalio-divandenilio fosfatas – kalio-divandenilio tetraoksofosfatas, KH2PO4;

lasalocido natrio druska – C34H53O8Na;

metanolis – CH3OH;

ortofosforo rūgštis – trivandenilio tetraoksofosfatas, H3PO4.

7. Metodų aprašymuose vartojamos santrumpos:

ESCh – efektyvioji skysčių chromatografija;

c – koncentracija;

v/v – tūrių santykis.

 

III. Mėginių paruošimas cheminei analizei

 

8. Pašarų cheminių analizių metodų bendrosios nuostatos:

8.1. Mėginių paruošimas cheminėms analizėms:

8.1.1. aprašyti veiksmai toliau taikomi galutiniams mėginiams (toliau – mėginiai), atsiųstiems į kontrolės laboratorijas po mėginių paėmimo pagal Pašarų mėginių paėmimo ir paruošimo techninį reglamentą, patvirtintą Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 208 (Žin., 2000, Nr. 60-1786);

8.1.2. galutiniai mėginiai turi būti paruošti tokiu būdu, kad pasverti kiekiai, numatyti analizių metoduose, būtų homogeniniai ir atitiktų galutinį mėginį.

8.2. Būtinos atsargumo priemonės mėginių paruošimo metu:

8.2.1. visi būtini veiksmai turi būti atliekami išvengiant mėginio užteršimo ir jo sudėties pokyčio. Malimas, maišymas ir sijojimas turi būti atliekami kaip galima greičiau, kuo trumpiau mėginį veikiant oru ir šviesa. Neturi būti naudojami malūnai ir smulkintuvai, pastebimai įšildantys mėginį. Pašarus, kurie yra ypač jautrūs šilumai, rekomenduojama smulkinti rankomis. Reikėtų įsitikinti, kad patys prietaisai nėra mikroelementų taršos šaltinis;

8.2.2. jei mėginys negali būti paruoštas be mėginio drėgnio pokyčio, prieš paruošimą ir po jo nustatomas drėgnio kiekis pagal Drėgnio, lakiųjų azoto bazių, suminio fosforo, žalio aliejaus ir riebalų kiekio nustatymo pašaruose techninį reglamentą, patvirtintą Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 206 (Žin., 2000, Nr. 60-1784).

8.3. Galutinio mėginio paruošimo eiga:

8.3.1. galutinis mėginys kruopščiai sumaišomas maišytuvu arba rankomis. Mėginys padalijamas į dvi lygias dalis (jei tinka, turi būti naudojamas ketvirčiavimo metodas). Viena dalis saugoma tinkamoje švarioje, sausoje talpykloje, su oro nepraleidžiančiu kamščiu, antroji dalis (arba jai būdinga mažiausiai 100 g dalis) paruošiama, kaip nurodyta toliau:

8.3.1.1. pašarai gali būti malami iš karto, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip. Visas sumaltas mėginys persijojamas per sietą su kvadratinėmis akutėmis, kurios kraštinės ilgis 1 mm (pagal rekomendaciją ISO R565). Vengiama per smulkaus sumalimo. Persijotas mėginys išmaišomas ir surenkamas į tinkamą švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys vėl išmaišomas;

8.3.1.2. pašarai gali būti sumalami juos išdžiovinus, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip; mėginys džiovinamas, siekiant sumažinti drėgnį iki 8 %–12 %, pagal parengtinio džiovinimo procedūrą, nurodytą Drėgnio, lakiųjų azoto bazių, suminio fosforo, žalio aliejaus ir riebalų kiekio nustatymo pašaruose techninio reglamento, patvirtinto Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 206, drėgnio nustatymo metodo 4.3 punkte. Toliau dirbama, kaip nurodyta šio techninio reglamento 8.3.1.1 punkte;

8.3.1.3. skysto ir pusiau skysto pašaro mėginys surenkamas į tinkamą švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys kruopščiai išmaišomas;

8.3.1.4. kitų pašarų mėginiai, kurie negali būti paruošti vienu iš nurodytų būdų, turi būti paruošiami bet kokiu kitu būdu, garantuojančiu, kad cheminei analizei pasvertas mėginys yra homogeninis ir būdingas galutiniam mėginiui.

8.4. Mėginiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Mėginiai, kuriuose numatyta analizuoti vitaminus ar kitas iš dalies šviesai jautrias medžiagas, turi būti laikomi rudo stiklo induose.

8.5. Reikalavimai reagentams ir prietaisams, naudojamiems cheminės analizės metoduose:

8.5.1. visi analiziniai reagentai turi būti analiziškai gryni (a. p.), jei cheminės analizės metoduose nenurodyta kitaip. Nustatant mikroelementus, reagentų grynumas turi būti tikrinamas „tuščiuoju“ bandymu. Atsižvelgiant į gautą rezultatą, gali būti reikalingas tolesnis reagentų gryninimas;

8.5.2. jei analizės metodų veiksmuose, susietuose su tirpalų ruošimu, skiedimu, skalavimu ar plovimu, nenurodoma naudojamo tirpiklio ar skiediklio prigimtis, suprantama, kad turi būti naudojamas vanduo. Vanduo turi būti tik demineralizuotas ar distiliuotas. Kai kuriais analizių metoduose nurodytais atvejais jis turi būti gryninamas specialiomis priemonėmis;

8.5.3. atsižvelgiant į kontrolės laboratorijose esančią įrangą, cheminės analizės metoduose leidžiama naudoti tik specialius ar specifinio naudojimo reikalaujančius instrumentus ir prietaisus. Jie turi būti ypač švarūs, nustatant labai mažus medžiagų kiekius.

8.6. Cheminės analizės metodų taikymas ir rezultatų išraiška:

8.6.1. kiekviena medžiaga pašaruose paprastai nustatoma atskiru metodu. Jei yra pateikta keletas metodų, kontrolės laboratorijoje naudotas metodas turi būti nurodomas analizės ataskaitoje;

8.6.2. analizės ataskaitoje pateikiamas rezultatas išreiškiamas mažiausiai dviejų matavimų, atliktų su atskiromis mėginio dalimis, vidurkiu, esant patenkinamam šių matavimų pakartojamumui. Šis rezultatas išreiškiamas reikšmingų skaitmenų skaičiumi analizės metoduose nurodytu būdu ir, jei reikia, koreguojamas pagal drėgnio kiekį, esantį galutiniame mėginyje prieš jo paruošimą.

 

IV. Mėginių cheminė analizė

 

9. Lasalocido natrio druskos kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento priede nurodytą metodą.

______________

 

Lasalocido natrio druskos kiekio nustatymo

pašariniuose produktuose techninio reglamento

priedas

 

lasalocido natrio druskos nustatymas

 

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu nustatomas lasalocido natrio druskos kiekis pašariniuose produktuose. Radimo riba yra 5 mg/kg, nustatymo riba – 30 mg/kg.

2. Metodo esmė

Mėginys ekstrahuojamas parūgštintu metanoliu. Lasalocido natrio druskos kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviąja skysčių chromatografija (ESCh) su spektrofluorimetriniu detektoriumi.

3. Reagentai:

3.1. kalio-divandenilio fosfatas (KH2PO4);

3.2. ortofosforo rūgštis, c = 85%;

3.3. ortofosforo rūgšties tirpalas, c = 20%: 23,5 ml ortofosforo rūgšties (3.2 punktas) skiedžiama vandeniu iki 100 ml;

3.4. 6-metil-2-heptilaminas (1,5-dimetilheksilaminas), c = 85%;

3.5. metanolis, chromatografiškai grynas;

3.6. druskos rūgštis, r20 = 1,19 g/ml;

3.7. fosfatinis buferinis tirpalas, c = 0,01 mol/l: 500 ml vandens (3.11 punktas) ištirpinami 1,36 g KH2PO4 (3.1 punktas), įpilama 3,5 ml ortofosforo rūgšties (3.2 punktas) ir 10,0 ml 6-metil-2-heptilamino (3.4 punktas). Tirpalo pH sureguliuojamas iki 4,0 ortofosforo rūgštimi (3.3 punktas), vandeniu (3.11 punktas) skiedžiama iki 1000 ml;

3.8. parūgštintas metanolis: į 1000 ml matavimo kolbą įpilama 5,0 ml druskos rūgšties, iki žymės skiedžiama metanoliu (3.5 punktas) ir išmaišoma. Šis tirpalas gaminamas analizės dieną;

3.9. ESCh judančioji fazė, fosfatinis buferinis tirpalas/metanolis santykiu 5/95 (v/v): 5 ml fosfatinio buferinio tirpalo (3.7 punktas) sumaišoma su 95 ml metanolio (3.5 punktas);

3.10. standartinė medžiaga – gryna lasalocido natrio druska, C34H53O8Na (polieterio karboksirūgšties natrio druska gauta iš Streptomyces lasaliensis kultūros), E763:

3.10.1. lasalocido natrio druskos pradinis standartinis tirpalas, 500 µg/ml: į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 50 mg lasalocido natrio druskos (3.10 punktas), ištirpinama parūgštintame metanolyje (3.8 punktas), iki žymės skiedžiama tuo pačiu tirpikliu ir išmaišoma. Šis tirpalas gaminamas analizės dieną;

3.10.2. lasalocido natrio druskos tarpinis standartinis tirpalas, 50 µg/ml: į 100 ml matavimo kolbą pipete įpilama 10 ml lasalocido natrio druskos pradinio standartinio tirpalo (3.10.1 punktas), iki žymės skiedžiama parūgštintu metanoliu (3.8 punktas) ir išmaišoma. Šis tirpalas gaminamas analizės dieną;

3.10.3. kalibraciniai tirpalai: į 50 ml matavimo kolbas įpilama 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 ir 10,0 ml tarpinio standartinio tirpalo (3.10.2 punktas), iki žymės skiedžiama parūgštintu metanoliu (3.8 punktas) ir išmaišoma. Lasalocido natrio druskos koncentracija šiuose tirpaluose yra atitinkamai 1,0 µg/ml, 2,0 µg/ml, 4,0 µg/ml, 5,0 µg/ml ir 10,0 µg/ml. Šie tirpalai gaminami analizės dieną;

3.11. vanduo, chromatografiškai grynas.

4. Įranga:

4.1. ultragarso vonia (arba vandens vonia su purtykle) su reguliuojama temperatūra;

4.2. membraninis filtras, 0,45 mm;

4.3. efektyviosios skysčių chromatografijos įrenginys su įleidimo sistema, tinkama įleisti 20 ml tirpalo:

4.3.1. atvirkščių fazių skysčių chromatografinė kolonėlė 125 mm x 4 mm, C18, su 5 mm įkrova, ar panaši;

4.3.2. kintamo bangos ilgio spektrofluorimetrinis detektorius.

5. Procedūra

5.1. Bendrosios nuostatos:

5.1.1. „Tuščiasis“ pašaras

„Tuščiasis“ pašaras ištiriamas siekiant patikrinti, ar jame nėra lasalocido natrio druskos ar kitų trukdančių medžiagų. „Tuščiasis“ pašaras turi būti panašios rūšies kaip tiriamasis ir jame neturi būti nei lasalocido natrio druskos, nei trukdančių medžiagų. „Tuščiasis“ pašaras naudojamas išgavos testui (5.1.2 punktas).

5.1.2. Išgavos testas

Išgavos testą reiktų atlikti pridėjus į „tuščiąjį“ pašarą lasalocido natrio druskos kiekį, panašų į esantį mėginyje. Siekiant gauti koncentraciją 100 mg/kg, į 250 ml konusinę kolbą įpilama 10,0 ml pradinio standartinio tirpalo (3.10.1 punktas) ir tirpalas nugarinamas iki maždaug 0,5 ml. Pridedama 50 g „tuščiojo“ pašaro, gerai išmaišoma ir paliekama 10 min. Prieš ekstrahavimą (5.2 punktas) dar keletą kartų pamaišoma. Jei neįmanoma gauti „tuščiojo“ pašaro, panašaus į tiriamąjį (5.1.1 punktas), išgavos testas gali būti atliekamas standartinio priedo metodu. Šiuo atveju į tiriamąjį mėginį pridedama panašus lasalocido natrio druskos kiekis, koks jau yra mėginyje. Mėginys su lasalocido natrio druskos priedu ir nepakeistas mėginys ištiriami. Išgava gali būti apskaičiuojama atimties būdu.

5.2. Ekstrahavimas

5.2.1. Pašarai

Į 250 ml konusinę kolbą su kamščiu 0,01 g tikslumu pasveriami 5 g–10 g mėginio. Įpilama 100 ml parūgštinto metanolio (3.8 punktas). Kolba uždengiama kamščiu ir pasukama, kad vienodai pasklistų mėginys. Kolba 20 min. įdedama į ultragarso vonią (4.1 punktas), kurioje nustatyta 40 oC temperatūra. Iš ultragarso vonios išimta kolba atvėsinama iki kambario temperatūros. Kolba paliekama apytiksliai 1 val., kol nusistovės skenda. Alikvotinė ekstrakto dalis filtruojama per membraninį filtrą (4.2 punktas) į tinkamą indą ir chromatografuojama (5.3 punktas).

5.2.2. Premiksai

Į 250 ml matavimo kolbą 0,001 g tikslumu pasveriama apie 2 g nemalto premikso. Įpilama 100 ml parūgštinto metanolio (3.8 punktas). Kolba pasukama, kad vienodai pasklistų mėginys. Kolba 20 min. įdedama į ultragarso vonią (4.1 punktas), kurioje nustatyta 40 oC temperatūra. Iš ultragarso vonios išimta kolba atvėsinama iki kambario temperatūros. Iki žymės skiedžiama parūgštintu metanoliu (3.8 punktas) ir nuodugniai išmaišoma. Kolba paliekama apytiksliai 1 val., kol nusistovės skenda. Alikvotinė ekstrakto dalis filtruojama per membraninį filtrą (4.2 punktas). Tinkamas filtrato kiekis skiedžiamas parūgštintu metanoliu (3.8 punktas), kad lasalocido natrio druskos koncentracija galutiniame tirpale būtų apie 4 mg/ml, ir chromatografuojama (5.3 punktas).

5.3. ESCh matavimas:

5.3.1. Parametrai:

Siūloma taikyti šias arba kitas sąlygas, duodančias panašius rezultatus:

skysčių chromatografijos kolonėlė

(4.3.1 punktas):

judančioji fazė (3.9 punktas):

 

debitas:

matavimo bangos ilgis:

įleidžiamo mėginio tūris:

125 mm x 4 mm, atvirkštinių fazių, C18, 5 mm įkrova, ar panaši;

fosfatinio buferinio tirpalo (3.7 punktas) ir metanolio (3.5 punktas) mišinys 5/95 (v/v);

1,2 ml/min.;

Ex 310 nm, Em 419 nm;

20 ml.

Chromatografinės sistemos stabilumas patikrinamas keletą kartų įleidžiant 4,0 mg/ml kalibracinį tirpalą (3.10.3 punktas), kol smailės aukštis ir sulaikymo trukmė nesikeis.

5.3.2. Kalibracinė kreivė

Po keletą kartų įleidžiamas kiekvienas kalibracinis tirpalas (3.10.3 punktas) ir išmatuojami kiekvienos koncentracijos smailių aukščių (plotų) vidurkiai. Nubraižoma kalibracinė kreivė ant ordinačių ašies atidedant kalibracinių tirpalų smailių aukščių (plotų) vidurkius, ant abscisių – atitinkamų tirpalų koncentracijas mikrogramais mililitre.

5.3.3. Mėginio tirpalas

Mėginio ekstraktai (5.2.1 ar 5.2.2 punktas) tokio pat tūrio, kaip ir kalibracinių tirpalų tūriai, įleidžiami keletą kartų į chromatografą, bei išmatuojamas lasalocido natrio druskos smailių aukščių (plotų) vidurkis.

6. Rezultatų apskaičiavimas

Pagal mėginio tirpalo lasalocido natrio druskos smailių aukščių (plotų) vidurkį, remiantis kalibracine kreive, nustatoma mėginio tirpalo koncentracija mikromoliais mililitre.

6.1. Pašarai

Lasalocido kiekis w miligramais kilograme mėginio apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

w =  [mg/kg],

kurioje:

V1 – mėginio ekstrakto tūris mililitrais pagal 5.2.1 punktą (t. y. 100 ml);

β – lasalocido natrio druskos koncentracija mėginio tirpale (5.2.1 punktas) mikrogramais mililitre;

m – matavimui paimto mėginio dalies svoris gramais.

6.2. Premiksai

Lasalocido natrio druskos kiekis w miligramais kilograme mėginio apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

w =  [mg/kg],

kurioje:

V2 – mėginio ekstrakto tūris mililitrais pagal 5.2.2 punktą (t. y. 250 ml);

β – lasalocido natrio druskos koncentracija mėginio tirpale (5.2.2 punktas) mikrogramais mililitre;

f – praskiedimo faktorius pagal (5.2 punktas);

m – matavimui paimto mėginio dalies svoris gramais.

7. Rezultatų patvirtinimas

7.1. Tapatumas

Metodai, pagrįsti spektrofluorimetrija, yra mažiau priklausomi nuo trukdžių nei tie, kuriuose naudojama UV detekcija. Analitės tapatumas gali būti patvirtintas kochromatografijos pagalba.

7.1.1. Kochromatografija

Mėginio ekstraktas (5.2.1 ar 5.2.2 punktas) papildomas pridedant į jį tinkamą kalibracinio tirpalo (3.10.3 punktas) kiekį. Pridedamo lasalocido natrio druskos kiekis turėtų būti panašus į išmatuotą lasalocido natrio druskos kiekį mėginio ekstrakte.

Atsižvelgiant tiek į pridėtą kiekį, tiek į ekstrakto praskiedimą, padidėti turėtų tik lasalocido natrio druskos smailės aukštis. Smailės plotis pusėje jos aukščio turėtų būti ± 10 % nepapildyto mėginio ekstrakto lasalocido natrio druskos smailės pločio.

7.2. Pakartojamumas

Skirtumas tarp dviejų kartotinių to paties mėginio matavimų rezultatų neturi viršyti:

15 % santykinai didesnės vertės, kai lasalocido natrio druskos koncentracija yra nuo 30 mg/kg iki 100 mg/kg,

15 mg/kg, kai lasalocido natrio druskos yra nuo 100 mg/kg iki 200 mg/kg,

7,5 % santykinai didesnės vertės, kai lasalocido natrio druskos koncentracija yra per 200 mg/kg.

7.3. Išgava

Lasalocido natrio druskos išgava su „tuščiuoju“ papildytu pašaru turi būti ne mažesnė kaip 80 %. Išgava su „tuščiuoju“ papildytu premiksu turi būti ne mažesnė kaip 90 %.

8. Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai

Buvo organizuoti tarplaboratoriniai tyrimai (Analyst, 1995, 120, 2175 – 2180), kurių metu 12 laboratorijų išanalizuoti du premiksai ir penki pašarai. Kiekvienas mėginys ištirtas dviem pakartojimais. Rezultatai pateikiami lentelėje.

 

Premiksas viščiukams

Premiksas kalakutams

Granuliuotas lesalas kalakutams

Trupininis lesalas viščiukams

Lesalas kalakutams

Lesalas paukščiams

A

Lesalas paukščiams

B

L

n

Vidurkis (mg/kg)

Sr (mg/kg)

CVr (%)

SR (mg/kg)

CVR (%)

12

23

5050

107

2,12

286

5,66

12

23

16200

408

2,52

883

5,45

12

23

76,5

1,71

2,24

3,85

5,03

12

23

78,4

2,23

2,84

7,32

9,34

12

23

92,9

2,27

2,44

5,29

5,69

12

23

48,3

1,93

4,00

3,47

7,18

12

23

32,6

1,75

5,37

3,49

10,70

Nominalus kiekis (mg/kg)

5000*

16000*

80*

105*

120*

50+

35+

L – laboratorijų skaičius;

n – vienetinių verčių skaičius;

Sr – pakartojamumo standartinis nuokrypis;

CVr – pakartojamumo variacijos koeficientas %;

SR – atkartojamumo standartinis nuokrypis;

CVR – atkartojamumo variacijos koeficientas %.

* gamintojo deklaruotas lasalocido natrio druskos kiekis;

+ laboratorijoje pagamintas pašaras.

______________

 

 

 

Pakeitimai:

 

1.

Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministerija, Įsakymas

Nr. 3D-134, 2004-03-30, Žin., 2004, Nr. 50-1662 (2004-04-06), i. k. 1042330ISAK003D-134

Dėl žemės ūkio ministro 2003 m. balandžio 29 d. įsakymo Nr. 3D-179 „Dėl Vitamino A, vitamino E ir triptofano kiekio nustatymo pašariniuose produktuose bei Lasalocido natrio druskos kiekio nustatymo pašariniuose produktuose techninių reglamentų patvirtinimo" pakeitimo

 

 


[1] Parengta Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) pašarų darbo grupės.

[2] Parengta Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) ) pašarų darbo grupės.