Įsakymas netenka galios 2008-06-01:

Lietuvos Respublikos aplinkos ministerija, Įsakymas

Nr. D1-232, 2008-04-30, Žin., 2008, Nr. 55-2106 (2008-05-15), i. k. 108301MISAK00D1-232

Dėl kai kurių Lietuvos Respublikos aplinkos ministro įsakymų pripažinimo netekusiais galios

Suvestinė redakcija nuo 2004-05-01 iki 2008-05-31

Įsakymas paskelbtas: Žin. 2002, Nr. 81-3493, i. k. 102301MISAK00000004

LIETUVOS RESPUBLIKOS APLINKOS MINISTRO

Į S A K Y M A S

DĖL APLINKOS APSAUGOS NORMATYVINIO DOKUMENTO LAND 45-2001 PATVIRTINIMO

2002 m. sausio 3 d. Nr. 4

Vilnius

Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų įstatymo (Žin., 2000, Nr. 36-987) trečiojo skirsnio 6 straipsniu „Cheminių medžiagų ir preparatų tyrimas“, Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų aplinkai, savybių tyrimo tvarka (Žin., 2001, Nr. 3-60):

1. Tvirtinu Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos normatyvinį dokumentą LAND 45-2001 „Cheminių medžiagų ir preparatų ekotoksiškumo tyrimo metodai“ (pridedama).

2. Pavedu Aplinkos apsaugos agentūrai, atsižvelgiant į Tarybos direktyvą 67/458/EC dėl pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą bei ženklinimą reglamentuojančių įstatymų ir kitų teisės aktų derinimo su Komisijos direktyvų 98/73/EC ir 2001/59/EC pakeitimais, parengti ir pateikti tvirtinimui Lietuvos aplinkos normatyvinio dokumento LAND 45-2001 papildymų projektus, perkeliant:

Komisijos Direktyvos 98/73/EC nuostatas – iki 2003-04-01:

(C13) Biokoncentravimas: Testas žuvims srovės pratekėjimo sąlygomis;

Komisijos Direktyvos 2001/59/EC nuostatas – iki 2003-04-01:

(C14) Žuvų jauniklių augimo testas;

(C15) Trumpalaikio toksiškumo testas žuvims embriono ir trynio maišelio stadijose;

(C20) Daphnia magna reprodukcijos testas;

Komisijos Direktyvos 2001/59/EC nuostatas – iki 2003-11-01:

(C16) Bitės – Oralinis toksiškumo testas;

(C17) Bitės – Ūmus kontaktinio toksiškumo testas;

(C18) Adsorbcijos/desorbcijos statinis pusiausvyros metodas;

(C19) Adsorbcijos koeficiento nustatymas (KOC) dirvožemyje ir aktyviajame dumble aukštos skyrimo galios skystine chromatografija.

Punkto pakeitimai:

Nr. 354, 2003-07-09, Žin., 2003, Nr. 71-3295 (2003-07-18), i. k. 103301MISAK00000354

3. Aplinkos ministerijos informacijos kompiuterinėje sistemoje vadovautis reikšminiais žodžiais „valdymo sistema“, „cheminės medžiagos“.

Aplinkos Ministras Arūnas Kundrotas

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos aplinkos ministro

2002 m. sausio 3 d. įsakymu Nr. 4

CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ IR PREPARATŲ EKOTOKSIŠKUMO TYRIMO METODAI

LAND 45-2001

BENDRASIS ĮVADAS

Šiame normatyviniame dokumente pateikiami metodai skirti cheminių medžiagų arba preparatų ekotoksikologinių savybių tyrimams atlikti.

Šių tyrimų tikslas:

– toksiškumo vandens ekosistemoms nustatymas;

– biologiškai skaidomų medžiagų savybių nustatymas;

– biocheminio deguonies suvartojimo nustatymas;

– cheminio deguonies suvartojimo nustatymas;

– toksiškumo dirvožemio ekosistemoms nustatymas.

Žemiau aprašyti cheminių medžiagų ir preparatų tyrimų metodai parengti vadovaujantis Europos Tarybos direktyva 67/548/EEC dėl pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą reglamentuojančių įstatymų, įstatymų papildomų aktų ir administracinių nuostatų derinimo (Council Directive of 27 June 1967 on the approximation of the laws reguliations and administrative provisions relating to the classification packaging and labelling of dangerous substances (67/548/EEC)).

Šiame normatyviniame dokumente pateikti ekotoksiškumo tyrimo metodai neapima:

– ilgalaikio toksiškumo tyrimo su Daphnia magna;

– ilgalaikio toksiškumo tyrimo su žuvimis;

– bandymų su aukštesniaisiais augalais.

Šių savybių nustatymui parengti metodai bus išleisti dokumentų, skirtų technikos pažangai, pavidalu. Iki to laiko turi būti taikomi atitinkami, tarptautiniu mastu pripažinti ir patvirtinti metodai.

ŪMINIS TOKSINIS POVEIKIS ŽUVIMS

1. metodas

1.1. ĮVADAS

Šio metodo tikslas yra nustatyti bandomosios medžiagos ūminį letalinį toksiškumą gėlavandenėms žuvims. Norint sėkmingiau pasirinkti tinkamiausią bandymo metodą (stacionarų, pusiau stacionarų ar pratekėjimo sąlygomis), kad visą bandymo laiką būtų užtikrinta pakankamai pastovi bandomosios medžiagos koncentracija, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, cheminį patvarumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą.

Planuojant bandymą ir interpretuojant jo rezultatus, turi būti atsižvelgta į papildomą informaciją (pvz., struktūrinę formulę, grynumo laipsnį, reikšmingesnių priemaišų prigimtį ir procentinį kiekį, priedų buvimą ir jų kiekį, pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą, Pow).

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI

Ūminis toksiškumas yra pastebimas neigiamo poveikio reiškinys, sukeltas bandomajai medžiagai veikiant trumpą laiką (kelias paras).

Šiame bandyme ūminis toksiškumas išreikiamas medianine letaline koncentracija (LC₅₀) – tokia medžiagos koncentracija vandenyje, kai per nuolatinio veikimo laikotarpį, kuris turi būti nurodytas, žūsta 50% bandyme naudotos žuvų populiacijos.

Kiekviena bandomosios medžiagos koncentracija yra išreiškiama mase tūrio vienetui (mg/litre) arba mase masės vienetui (mg/kg).

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymo sąlygomis naudotų rūšių atsakas žymiai nepakito, gali būti atliekamas bandymas su etalonine medžiaga.

Šiam bandymui etaloninės medžiagos nėra apibrėžtos.

1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ

Ribinis bandymas atliekamas su 100 mg/litre bandomosios medžiagos koncentracija, siekiant parodyti, kad LC₅₀ yra didesnė už šią koncentraciją.

Atliekant pilnos apimties bandymą, žuvys 96 valandas veikiamos bandomąja medžiaga, įdėta į vandenį tam tikrame koncentracijų intervale. Mirtingumo duomenys turi būti užrašomi ne mažiau kaip kas 24 valandas ir, jei įmanoma, kiekvienai stebėjimo laiko atkarpai skaičiuojama koncentracija, kuriai esant žūsta 50% žuvų (LC₅₀).

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

Kokybės kriterijai turi būti taikomi ir ribinio bandymo metodui, ir viso bandymo metodui.

Mirtingumas kontroliniuose bandymuose bandymo pabaigoje neturi būti didesnis kaip 10% (arba viena žuvis, jei naudojama mažiau kaip dešimt žuvų).

Ištirpusio deguonies koncentracija visą laiką turi būti ne mažesnė kaip 60% oro soties vertės.

Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti palaikoma 80% pradinės koncentracijos vertės ribose.

Medžiagų, kurios lengvai tirpsta bandomojoje terpėje ir kurių tirpalai patvarūs, t.y. kuriuose ištirpinta medžiaga žymiai negaruoja, nesuyra, nesihidrolizuoja ar neadsorbuojama, pradine koncentracija galima laikyti vardinę medžiagos koncentraciją. Turi būti pateikti įrodymai, kad koncentracijos buvo išlaikytos per visą bandymą ir kad kokybės kriterijai buvo įvykdyti.

Medžiagų, kurios:

(i) mažai tirpsta bandymo terpėje, arba

(ii) gali sudaryti patvarias emulsijas ar suspensijas, arba

(iii) yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose,

pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija, nustatyta tirpale (arba, jei techniškai tai neįmanoma, išmatuota vandens tūryje) bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra, tačiau prieš bandymams skirtų žuvų įleidimą.

Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti daromi tolesni matavimai.

pH vertė neturi keistis daugiau kaip 1 pH vienetu.

1.6. bandymų METODO aprašymas

Galima naudoti trijų tipų procedūras:

Statinis bandymas (stacionariomis sąlygomis):

Toksiškumo bandymas, kai bandomasis tirpalas neteka (tirpalai visą bandymą nėra atnaujinami, lieka tie patys).

Pusiau statinis bandymas (pusiau stacionariomis sąlygomis):

Bandymas, kai bandomasis tirpalas neteka, tačiau per ilgesnį laiko tarpą (pvz., kas 24 valandas) daromas reguliarus dozuojamasis bandomojo tirpalo atnaujinimas.

Bandymas pratekėjimo sąlygomis:

Toksiškumo bandymas, kai vanduo bandymo talpose atnaujinamas visą laiką, bandomąją medžiagą tiekiant su vandeniu, naudojamu bandymo terpei atnaujinti.

1.6.1. Reagentai

1.6.1.1. Bandomųjų medžiagų tirpalai

Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2.

Pasirinktų koncentracijų bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Jei bandomos didelės koncentracijos, medžiaga gali būti ištirpinama praskiedimo vandenyje tiesiogiai.

Paprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Norint kai kurioms medžiagoms (pvz., vandenyje mažai tirpioms medžiagoms arba kurių didelis Pow, arba toms, kurios labiau sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) labiau užtikrinti galimybę pasiekti soties/pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui ir t.t.).

Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba siekiant pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, kaip papildomas priemones galima panaudoti dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius arba dispergatorius. Kai naudojamos pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis, taip pat kontrolinės žuvys turi būti veikiamos pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti parinkta mažiausia įmanoma ir turi būti ne didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės.

Bandymas turi būti atliekamas nereguliuojant pH vertės. Jei yra įrodymų apie žymų pH vertės kitimą, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HC1 ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti atliekamas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei, reguliuojant pH, vyksta kokia nors cheminė reakcija ar bandomoji medžiaga fiziškai krenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje.

1.6.1.2. Laikymo ir skiedimo vanduo

Galima naudoti geriamąjį vandentiekio vandenį (neužterštą potencialiai kenksmingos koncentracijos chloru, sunkiaisiais metalais ar kitomis medžiagomis), geros kokybės gamtinį vandenį arba skiedimo vandenį (žr. 1 priedą). Geriausiai tinka vanduo, kurio bendrasis kietumas yra nuo 10 iki 250 mg/litre (skaičiuojant CaCO₃) ir kurio pH yra nuo 6,0 iki 8,5.

1.6.2. Aparatūra

Visa aparatūra turi būti pagaminta iš chemiškai inertiškų medžiagų:

– automatinio skiedimo sistema (bandymui pratekėjimo sąlygomis),

– deguonies matuoklis,

– įranga vandens kietumui nustatyti,

– atitinkama termostatavimo aparatūra,

– pH-metras.

1.6.3. Bandymams skirtos žuvys

Žuvys turi būti sveikos ir neturėti jokių matomų apsigimimo požymių.

Žuvų rūšį reikia rinktis remiantis praktiniais kriterijais, pvz., lengvumu žuvis gauti ištisus metus ir jas prižiūrėti, patogumu bandyti, santykiniu jautrumu cheminėms medžiagoms, bei kiek nors susijusiais ekonominiais, biologiniais ar ekologiniais faktoriais. Be to, renkantis žuvų rūšis, reikia nepamiršti apie gautų duomenų palyginamumo būtinybę ir esamą tarptautinį derinimą (1 nuoroda).

Žuvų, kurios rekomenduojamos naudoti šiame bandyme, sąrašas pateiktas 2 priede. Tinkamiausios rūšys yra danija ir vaivorykštinis upėtakis.

1.6.3.1. Laikymas

Geriausia, jei bandymų žuvys būtų vienos populiacijos ir panašaus ilgio bei amžiaus. Žuvys turi būti laikomos bent 12 parų tokiomis sąlygomis:

įkrova:

atitinkanti sistemą (su recirkuliavimu ar su pratekėjimu) ir žuvų rūšį,

vanduo:

žr. 1.6.1.2,

šviesa:

kasdienis apšvietimas nuo 12 iki 16 valandų,

ištirpusio deguonies koncentracija:

ne mažiau kaip 80% oro soties vertės,

maitinimas:

tris kartus per savaitę ar kasdieną, nutraukiant maitinimą prieš 24 valandas iki bandymo pradžios.

1.6.3.2. Mirtingumas

Po 48 valandų stabilizavimo laikotarpio užrašomi mirtingumo duomenys ir taikomi tokie kriterijai:

– populiacijos mirtingumas per septynias paras didesnis kaip 10%:

visa partija atmetama,

– populiacijos mirtingumas 5–10%:

papildomai laikoma dar septynias paras. Jei mirtingumas nedidėja, partija priimama, priešingu atveju turi būti atmesta,

– populiacijos mirtingumas mažesnis kaip 5%:

partija priimama.

1.6.4. Adaptavimas

Prieš naudojimą visas žuvis bent septynias paras būtina laikyti vandenyje, kurio kokybė ir temperatūra atitinka bandymo sąlygas.

1.6.5. Bandymo eiga

Prieš galutinį bandymą gali būti atliekamas koncentracijų intervalo nustatymo bandymas.

Atliekamas vienas kontrolinis bandymas be bandomosios medžiagos ir, jei reikia arba jei tai svarbu, bandymų serija papildoma dar vienu kontroliniu bandymu, kuriame naudojama pagalbinė medžiaga.

Pagal tai, kokios yra bandomosios medžiagos fizikinės ir cheminės savybės, turi būti pasirinktas statinis bandymas, pusiau statinis ar pratekėjimo sąlygomis, kad būtų įvykdyti kokybės kriterijai.

Žuvys veikiamos medžiaga, kaip tai aprašyta žemiau:

– trukmė: 96 valandos,

– gyvūnų skaičius: ne mažiau kaip 7 vienai koncentracijai,

– talpos (indai): tinkamo tūrio, atsižvelgiant į rekomenduotą įkrovą,

– įkrova: didžiausia rekomenduota bandymo statinėmis ir pusiau statinėmis sąlygomis įkrova – 1 g/litre; sistemoms su pratekėjimu priimtina didesnė įkrova,

– bandomoji koncentracija: ne mažiau kaip penkios koncentracijos, kurios skiriasi pastoviu daugikliu, ne didesniu kaip 2,2, bei, kiek įmanoma, apima mirtingumo intervalą nuo 0 iki 100%,

– vanduo: žr. 1.6.1.2,

– šviesa: kasdienis apšvietimas, kurio trukmė nuo 12 iki 16 valandų,

– temperatūra: tinkama rūšiai (2 priedas), tačiau konkrečiame bandyme palaikoma ± 1°C tikslumu,

– ištirpusio deguonies koncentracija: ne mažesnė kaip 60% oro soties vertės pasirinktos temperatūros sąlygomis,

– maitinimas: jokio.

Žuvys tikrinamos iš pradžių po 2–4 valandų, po to – ne rečiau kaip kas 24 valandas. Žuvis laikoma negyva, jei, liečiant uodeginį peleką (caudal peduncle), ji nereaguoja ir nesimato jokių kvėpavimo judesių. Po apžiūros negyvos žuvys pašalinamos ir užrašomas negyvų žuvų skaičius.

Užrašomi visi pastebimi pakitimai (pvz., pusiausvyros netekimas, plaukimo pobūdžio pasikeitimas, kvėpavimo funkcijos, pigmentacijos pokyčiai ir t.t.).

Ištirpęs deguonis, pH ir temperatūra turi būti matuojami kiekvieną dieną.

Ribinis bandymas

Ribinis bandymas atliekamas ta pačia tvarka kaip pilnos apimties bandymas, bet naudojant 100 mg/litre koncentraciją, siekiant įrodyti, kad LC₅₀ yra didesnė už šią koncentraciją.

Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos bandymui skirtame vandenyje pasiekti negalima, ribinis bandymas turi būti atliekamas su koncentracija, lygia medžiagos tirpumui (arba su didžiausia koncentracija, kurioje susidaro patvari suspensija) naudojamoje terpėje (taip pat žr. 1.6.1.1 punktą).

Ribinis bandymas turi būti atliekamas, naudojant 7–10 žuvų, toks pat žuvų skaičius turi būti naudojamas kontroliniame (-iuose) bandyme (-uose). Pagal binominę teoriją, jei bandyme su 10 žuvų mirtingumas yra nulinis, pasikliovimo tikimybė, kad LC₅₀ yra didesnė nei ribiniame bandyme naudota koncentracija, yra 99,9%. Mirtingumo nebuvimas, naudojant 7, 8 ar 9 žuvis, užtikrina bent 99% pasikliovimo tikimybę, kad LC₅₀ yra didesnė nei naudota koncentracija.

Jei mirtingumo atvejai pasitaiko, turi būti atliekamas pilnos apimties bandymas. Jei stebimi subletaliniai padariniai, tai turi būti užrašyta ataskaitoje.

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Kiekvienam laikotarpiui, kuriam buvo užrašyti rezultatai (24, 48, 72 ir 96 valandos), logaritminiame tikimybiniame popieriuje braižoma mirtingumo, nustatyto kiekvienam rekomenduotam veikimo laikotarpiui, procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivė.

Kai tai įmanoma ir kiekvienam matavimo laikotarpiui reikia įvertinti LC₅₀ ir pasikliovimo ribas (p = 0,05), taikant standartines metodikas, šios vertės turi būti apvalinamos iki vieno arba daugiausia iki dviejų reikšmingų skaitmenų (apvalinimo iki dviejų skaitmenų pavyzdys: 170 vietoj 173,5; 0,13 vietoj 0,127; 1,2 vietoj 1,21).

Tais atvejais, kai atsako procentinės vertės ir koncentracijos priklausomybės kreivės polinkis yra per status, kad būtų galima skaičiuoti LC₅₀, pakanka grafinio šios vertės įverčio.

Kai dviem gretimoms koncentracijoms, kurių santykis 2,2, gaunamos 0 ir 100% mirtingumo vertės, šių dviejų verčių pakanka nustatyti intervalui, į kurį patenka LC₅₀.

Jei pastebėta, kad bandomosios medžiagos patvarumo ar homogeniškumo užtikrinti neįmanoma, tai turi būti pateikta ataskaitoje, o rezultatus interpretuoti reikia atsargiai.

3. ATASKAITA

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– informacija apie bandymų žuvis (mokslinis pavadinimas, rūšis, tiekėjas, bet koks išankstinis apdorojimas, dydis ir kiekvienai bandomajai koncentracijai naudotų žuvų skaičius);

– skiedimo vandens šaltinis ir pagrindinės cheminės savybės (pH, kietumas, temperatūra);

– mažai vandenyje tirpios medžiagos atveju pradinio tirpalo ir bandomųjų tirpalų ruošimo metodas;

– visų pagalbinių medžiagų koncentracijos;

– naudotų koncentracijų sąrašas ir visa turima informacija apie bandomosios medžiagos patvarumą naudotos koncentracijos bandomajame tirpale;

– jei daroma cheminė analizė, taikyti metodai ir gauti rezultatai;

– ribinio bandymo, jei jis buvo daromas, rezultatai;

– taikytos bandymo metodikos pasirinkimo priežastys ir detalės (pvz., stacionariomis sąlygomis, pusiau stacionariomis sąlygomis, dozavimo srautas, pratekėjimo srautas, ar buvo naudojamas aeravimas, žuvų įkrova ir t.t.);

– bandymų įrangos aprašymas;

– apšvietimo režimas;

– ištirpusio deguonies koncentracija bandomuosiuose tirpaluose, jų pH vertė ir temperatūra kas 24 valandas;

– įrodymas, kad kokybės kriterijai įvykdyti;

– lentelė, kurioje kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui pateiktas bendras mirtingumas kiekvienai koncentracijai ir kontroliniame bandyme (ir kontroliniame bandyme su pagalbine medžiaga, jei reikia);

– atsako procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivės grafikas bandymo pabaigoje;

– jei įmanoma, LC₅₀ vertes kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui (su 95% pasikliovimo ribomis);

– statistinės metodikos, taikytos LC₅₀ vertėms nustatyti;

– gauti rezultatai, jei naudota etaloninė medžiaga;

– didžiausia bandomoji koncentracija, kurią naudojant mirtingumas bandymo laikotarpiu yra nulinis;

mažiausia bandomoji koncentracija, bandymo laikotarpiu sukelianti 100% mirtingumą.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

(2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio – Static and Flow Through methods – NFT 90-303 June 1985.

(3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri – Static and Flow – Through methods – NFT 90-305 June 1985.

(4) ISO 7346/1, /2 and /3 – Water Quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan – Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.

(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden – Part II 1974.

(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15).

(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.

(8) NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.

(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.

(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.

(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Pan IV, 16 March 1979.

(12) Standard methods for the examination of water and wastewater, fourteen edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.

(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.

(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph. P. und Boje. R. Ökotoxikologie Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(15) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm. Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.

(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978.

(17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.

(18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32.

(19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.

(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.

1 priedas

Atkurtasis vanduo (Skiedimo vanduo)

Skiedimui tinkamo vandens pavyzdys

Visos cheminės medžiagos turi būti analiziškai grynos.

Vanduo turi būti geros kokybės distiliuotas arba dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų ne didesnis kaip 5mScm^-1.

Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių.

Pradiniai tirpalai

CaCl₂×2H₂O (kalcio chloridas, dihidratas):	11,76 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
MgSO₄×7H₂O (magnio sulfatas, heptahidratas):	4,93 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
NaHCO₃ (natrio hidrokarbonatas):	2,59 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
KCl (kalio chloridas):	0,23 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

Atkurtasis skiedimo vanduo

Sumaišoma po 25 ml kiekvieno iš šių keturių tirpalų ir praskiedžiama vandeniu iki 1 litro.

Aeruojama tol, kol ištirpusio deguonies koncentracija pasiekia oro soties vertę (OSV).

pH turi būti 7,8 ± 0,2.

Prireikus pH reguliuojamas NaOH (natrio hidroksidu) arba HC1 (druskos rūgštimi).

Taip paruoštas skiedimo vanduo laikomas padėtas 12 valandų, jo nereikia daugiau aeruoti.

Ca ir Mg jonų koncentracijų suma šiame tirpale yra lygi 2,5 mmol/litre (5 mgekv/l). Ca ir Mg jonų santykis lygus 4:1, o Na ir K jonų santykis – 10:1. Bendrasis šio tirpalo šarmingumas lygus 0,8 mmol/litre.

Joks nukrypimas nuo skiedimo vandens ruošimo būdo neturi keisti vandens sudėties arba savybių.

2 priedas

Žuvų rūšys, kurias rekomenduojama naudoti bandymuose:

Rekomenduojamos rūšys	Rekomenduojamas bandymų temperatūros intervalas, °C	Rekomenduojamas bandymų gyvūno bendras kūno ilgis, cm

Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan)	nuo 20 iki 24	3,0 ± 0,5
Dryžuotasis danio
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Rainė	nuo 20 iki 24	5,0 ± 2,0
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758)	nuo 20 iki 24	6,0 ± 2,0
Paprastasis karpis
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) Cyprinodontidae	nuo 20 iki 24	3,0 ± 1,0
(Tomminck and Schlegel 1850) Red killifish
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae (Peters 1859) Gupi	nuo 20 iki 24	3,0 ± 1,0
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)	nuo 20 iki 24	5,0 ± 2,0
(Rafinesque Linneaus 1758) Bluegill
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae)	nuo 12 iki 17	6,0 ± 2,0
(Walbaum 1988) Margasis upėtakis
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758)	nuo 20 iki 24	6,0 ± 2,0
Golden orfe

Lentelėje nurodytas žuvis lengva auginti ir (arba) jų galima gauti ištisus metus. Žuvis galima auginti ir veisti žuvų fermose arba laboratorijoje ligų ir parazitų kontrolės sąlygomis, kad bandymams skirti gyvūnai būtų sveiki ir būtų žinoma jų kilmė. Šių žuvų yra daugelyje pasaulio kraštų.

3 priedas

Koncentracija: mirtingumo dalis procentais

LC₅₀ nustatymo pavyzdys, naudojant logaritminį-tikimybinį popierių

ŪMINIS TOKSINIS POVEIKIS DAFNIJOMS

1. metodas

1.1. ĮVADAS

Šio bandymo tikslas yra nustatyti tiriamosios medžiagos medianinę efektyvią koncentraciją (EC₅₀) sukeliančią pusės Daphnia magna individų nejudrumą gėlame vandenyje. Prieš pradedant bandymą, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, stabilumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI

Direktyvos reikalavimas dėl dafnijas veikiančios LC₅₀ laikomas įvykdytu, jei EC₅₀ nustatoma tiksliai šiame bandymo metode aprašytomis sąlygomis.

Šiame bandyme ūminis toksinis poveikis išreikiamas medianine efektyvia judrumo slopinimo (imobilizavimo) koncentracija (EC₅₀). Tai koncentracija, išreikšta pradine koncentracijos verte, kurią naudojant per nuolatinio veikimo laikotarpį, kuris turi būti nurodytas, slopinamas 50% bandyme naudotų Daphnia organizmų judrumas.

Imobilizavimas:

Imobilizuotais laikomi tie gyvūnai, kurie negali plaukti 15 sekundžių laikotarpiu po švelnaus bandymų indo pajudinimo.

Visos bandomosios medžiagos koncentracijos yra pateikiamos mase tūrio vienetui (mg/litre) arba mase masės vienetui (mg/kg).

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymų sąlygomis naudojamų rūšių jautrumas žymiai nepakito, gali būti atliekamas bandymas su etalonine medžiaga.

EEC tarplaboratorinio lyginimo bandymo rezultatų, gautų keturioms medžiagoms, suvestinė pateikta 2 priede.

1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ

Galima atlikti ribinį bandymą su 100 mg/litre koncentracija, norint parodyti, kad EC₅₀ yra didesnė nei ši koncentracija.

Dafnijos 48 valandas veikiamos bandomąja medžiaga (įdėta į vandenį) tam tikrame koncentracijų intervale. Jei bandymo trukmė mažesnė, tai turi būti patvirtinta bandymų ataskaitoje.

Kai kitos bandymų sąlygos yra identiškos ir kai bandomoji medžiaga naudojama atitinkamame koncentracijų intervale, vidutinis poveikio į dafnijos gebėjimą plaukti laipsnis dėl skirtingos bandomosios medžiagos koncentracijos yra taip pat nevienodas. Bandymo pabaigoje negalinčių plaukti dafnijų procentinė dalis, esant skirtingoms koncentracijoms, bus nevienoda.

Koncentracijos, kurias naudojant imobilizavimas nulinis arba 100%, gaunamos tiesiogiai, remiantis bandymo metu darytais stebėjimais, tuo tarpu 48 valandų EC₅₀ skaičiuojama, jei tai įmanoma.

Šiame metode naudojama statinė sistema, veikimo laikotarpiu bandomieji tirpalai neatnaujinami.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

Kokybės kriterijai turi būti taikomi ir ribinio bandymo metodui, ir pilnos apimties bandymo metodui.

Bandymo pabaigoje imobilizavimas kontroliniuose bandymuose neturi būti didesnis kaip 10%.

Kontrolinėse grupėse bandymams panaudoti Daphnia gyvūnai neturi būti pakibę vandens paviršiuje.

Pageidautina, kad ištirpusio deguonies koncentracija bandymų induose visą bandymo laiką turi būti ne mažesnė kaip 3 mg/l. Tačiau jokiomis aplinkybėmis ištirpusio deguonies koncentracija neturi būti mažesnė kaip 2 mg/l.

Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti palaikoma 80% pradinės koncentracijos vertės ribose.

Medžiagų, kurios:

(i) mažai tirpsta bandymo terpėje, arba

(ii) gali sudaryti patvarias emulsijas ar suspensijas, arba

(iii) yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose,

pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija, išmatuota tirpale (ar, jei techniškai tai neįmanoma, išmatuota vandens tūryje) bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra, tačiau prieš bandymų organizmų įleidimą.

Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti atliekami tolesni matavimai.

pH vertė neturi keistis daugiau kaip 1 pH vienetu.

1.6. bandymų METODO aprašymas

1.6.1. Reagentai

1.6.1.1. Bandomųjų medžiagų tirpalai

Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2.

Pasirinktos bandymo koncentracijos tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Jei bandomos didelės koncentracijos, medžiaga gali būti ištirpinta praskiedimo vandenyje tiesiogiai.

Paprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Siekiant kai kurioms medžiagoms (pvz., vandenyje mažai tirpioms medžiagoms ar kurių didelis Pow, ar toms, kurios sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) užtikrinti sąlygas pasiekti soties arba pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., kad vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui, ir t.t.).

Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba siekiant pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, kaip papildomas priemones galima panaudoti dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius arba dispergatorius. Kai naudojamos tokios pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis, ir papildomai kontrolinės dafnijos turi būti veikiamos pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti kuo mažesnė ir jokiu būdu neturi būti didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės.

Bandymas turi būti atliekamas nereguliuojant pH vertės. Jei pH vertė turi polinkį žymiai pasikeisti, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HCl ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti atliekamas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei, reguliuojant pH, vyksta kokia nors cheminė reakcija arba bandomoji medžiaga fiziškai krenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje.

1.6.1.2. Bandymų vanduo

Šiame bandyme naudojamas atkurtasis vanduo (žr. 1 priedą ir 2 nuorodą: ISO 6341). Daphnia veisimui rekomenduojama naudoti vandenį, kurio kokybė (pH, kietumas) būtų panaši į bandyme naudojamo vandens kokybę, kad prieš bandymą nereikėtų aklimatizuoti.

1.6.2. Aparatūra

Turi būti naudojama įprasta laboratorinė aparatūra ir įranga.

Pageidautina, kad su bandomaisiais tirpalais kontaktuojanti įranga būtų pagaminta vien tik iš stiklo:

– deguonies matuoklis (su mikroelektrodu ar kitokiu įtaisu, tinkamu matuoti ištirpusį deguonį mažo tūrio bandiniuose),

– atitinkama termostatavimo aparatūra,

– pH-metras,

– vandens kietumo nustatymo įranga.

1.6.3. Bandomieji organizmai

Daphnia magna yra labiausiai bandymui naudotina rūšis, nors leidžiama naudoti ir Daphnia pulex. Bandymų gyvūnų amžius bandymo pradžioje turi būti ne didesnis kaip 24 valandos, jie turi būti užauginti laboratorijoje, nesirgti akivaizdžiomis ligomis ir būti žinomos kilmės (pvz., veisimo sąlygos, bet koks pradinis apdorojimas ir t.t.).

1.6.4. Bandymų procedūra

Siekiant gauti informacijos apie koncentracijų, kurias reikia naudoti pagrindiniame bandyme, intervalą, prieš galutinį bandymą gali būti daromas intervalo nustatymo bandymas.

Daromas vienas kontrolinis bandymas be bandomosios medžiagos ir, jei reikia, bandymų serija papildoma dar vienu kontroliniu bandymu, kuriame naudojama pagalbinė medžiaga.

Dafnijos veikiamos medžiaga, kaip tai aprašyta toliau:

– trukmė: geriau 48 valandos,

– gyvūnų skaičius: ne mažiau kaip 20 gyvūnų kiekvienai bandomajai koncentracijai, pageidautina, kad jie būtų padalyti į keturias grupes po penkis gyvūnus ar į dvi grupes po dešimt gyvūnų,

– įkrova: kiekvienam gyvūnui turi tekti ne mažiau kaip 2 ml bandomojo tirpalo,

– bandomoji koncentracija: bandomasis tirpalas turi būti ruošiamas prieš pat dafnijų įleidimą, ir geriau būtų nenaudoti jokio tirpiklio, išskyrus vandenį. Koncentracija parenkama pagal geometrinę progresiją, santykis tarp gretimų koncentracijų turi būti ne didesnis kaip 2,2. Kartu su kontroliniais bandiniais turi būti išbandytos koncentracijos, kuriose imobilizacija po 48 valandų yra 0 ir 100%, ir intervalas tarpinius imobilizacijos laipsnius atitinkančių koncentracijų, leidžiančių skaičiuoti 48 valandų EC50,

– vanduo: žr. 1.6.1.2,

– šviesa: šviesos ir tamsos ciklas pasirenkamas laisvai,

– temperatūra: bandymų temperatūra turi būti nuo 18 iki 22°C, tačiau kiekviename atskirame bandyme ji turi būti palaikoma ± 1°C ribose,

– aeravimas: bandomieji tirpalai neturi būti aeruojami burbulais,

– šėrimas: šerti neleidžiama.

Kontrolinių ir bandomųjų tirpalų pH ir deguonies koncentracija turi būti matuojama bandymo pabaigoje; bandomųjų tirpalų pH vertė turi būti nekeičiama.

Lakios medžiagos turi būti bandomos visiškai užpildytuose uždaruose induose, kurie būtų pakankamai dideli, kad juose negalėtų pritrūkti deguonies.

Dafnijos tikrinamos ne vėliau kaip po 24 veikimo valandų ir dar kartą po 48 valandų.

Ribinis bandymas

Taikant šiame bandymo metode aprašytas procedūras, galima atlikti ribinį bandymą, esant 100 mg/litre koncentracijai, siekiant parodyti, kad EC₅₀ yra didesnė nei ši koncentracija.

Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos pasiekti bandymų vandenyje negalima, ribinis bandymas turi būti atliekamas esant koncentracijai, lygiai medžiagos tirpumui (arba esant didžiausiai koncentracijai, kurioje dar gali susidaryti patvari suspensija) naudojamoje terpėje (taip pat žr. 1.6.1.1 punktą).

Ribinis bandymas turi būti atliekamas, naudojant 20 dafnijų, padalytų į dvi ar keturias grupes, tas pat dafnijų skaičius turi būti naudojamas kontroliniame (-iuose) bandyme (-uose). Jei pasitaiko imobilizacijos atvejų, turi būti atliekamas pilnos apimties bandymas.

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Kiekvienam laikotarpiui, kuriam rezultatai buvo užrašyti (24 ir 48), logaritminiame-tikimybiniame popieriuje braižoma mirtingumo procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivė.

Kai tai įmanoma ir kiekvienam matavimo laikotarpiui reikia įvertinti EC₅₀ ir pasikliovimo ribas (p = 0,05), taikant standartines metodikas; šios vertės turi būti apvalinamos iki vieno ar daugiausia iki dviejų reikšminių skaitmenų (apvalinimo iki dviejų skaitmenų pavyzdys: 170 vietoj 173,5; 0,13 vietoj 0,127; 1,2 vietoj 1,21).

Tais atvejais, kai atsako procentinės vertės ir koncentracijos priklausomybės kreivės nuožulnumas yra per status, kad būtų galima skaičiuoti EC₅₀, pakanka grafinio šios vertės įverčio.

Kai dviem gretimoms koncentracijoms, kurių santykis 2,2, gaunamos 0 ir 100% imobilizavimo vertės, šių dviejų verčių pakanka pažymėti intervalui, į kurį patenka EC₅₀.

Jei pastebėta, kad bandomosios medžiagos patvarumo ar homogeniškumo užtikrinti neįmanoma, tai turi būti pateikta ataskaitoje, o rezultatai turi būti interpretuojami atsargiai.

3. ATASKAITA

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– informacija apie bandymui panaudotą organizmą (mokslinis pavadinimas, rūšis, tiekėjas ar šaltinis, bet koks išankstinis apdorojimas, auginimo metodas, įskaitant maisto šaltinį, rūšį ir kiekį, maitinimo dažnį);

– skiedimo vandens šaltinis ir pagrindinės cheminės savybės (pH, temperatūra, kietumas);

– mažai vandenyje tirpios medžiagos atveju pradinio tirpalo ir bandomųjų tirpalų ruošimo metodas;

– visų pagalbinių medžiagų koncentracija;

– naudotų koncentracijų sąrašas ir visa turima informacija apie bandomosios medžiagos patvarumą bandomajame tirpale;

– jei atlikta cheminė analizė, taikyti metodai ir gauti rezultatai;

– ribinio bandymo, jei jis buvo atliktas, rezultatai;

– bandymų įrangos aprašymas;

– apšvietimo režimas;

– ištirpusio deguonies koncentracija bandomuosiuose tirpaluose, jų pH vertė ir temperatūra;

– įrodymai, kad kokybės kriterijai įvykdyti;

– lentelė, kurioje kiekvienam rekomenduotam nustatymo laikotarpiui (24 ar 48 valandos) pateiktas bendras imobilizuotų dafnijų skaičius kiekvienai koncentracijai ir kontroliniame bandyme (ir kontroliniame bandyme su pagalbine medžiaga, jei reikia);

– atsako procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivės grafikas bandymo pabaigoje;

– jei įmanoma, EC₅₀ vertes kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui (su 95% pasikliovimo riba);

– statistinės metodikos, taikytos EC₅₀ vertėms nustatyti;

– jei panaudota etaloninė medžiaga, gauti rezultatai;

– didžiausia bandomoji koncentracija, kurią naudojant imobilizavimas bandymo laikotarpiu yra nulinis;

– mažiausia bandomoji koncentracija, bandymo laikotarpiu sukelianti 100% imobilizavimą.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

(2) International Standard ISO, Water Quality – Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989.

(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera – crusiacea) NFT 90 301 (January 1983).

(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (LII).

(6) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978.

(7) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. and Exper. Ther., 1949, vol. 96, 99-113.

(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.

(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32.

(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1977, STP 634, 65-84.

(11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50 US EPA.

1 priedas

Atkurtasis vanduo

Skiedimui tinkamo vandens pavyzdys (pagal ISO 6341)

Visos cheminės medžiagos turi būti analiziškai grynos.

Vanduo turi būti geros kokybės, distiliuotas vanduo ar dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų ne didesnis kaip 5mScm-^1.

Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių.

Pradiniai tirpalai

CaCl2 2H2O (kalcio chloridas, dihidratas):	11,76 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
MgSO4 7H2O (magnio sulfatas, heptahidratas):	4,93 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
NaHCO3 (natrio hidrokarbonatas):	2,59 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
KC1 (kalio chloridas):	0,23 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

Atkurtasis skiedimo vanduo

Sumaišoma po 25 ml kiekvieno iš šių keturių tirpalų ir bendras tūris papildomas vandeniu iki 1 litro.

Skiedimo vanduo aeruojamas, kol ištirpusio deguonies koncentracija pasiekia oro soties lygį.

Paruošto skiedimo vandens pH turi būti 7,8 ± 0,2.

Jeigu yra būtina, pH vertė koreguojama NaOH (natrio hidroksidu) arba HC1 (druskos rūgštimi).

Taip paruoštas skiedimo vanduo paliekamas stovėti 12 valandų, jo nereikia daugiau aeruoti.

Ca ir Mg jonų koncentracijų suma šiame tirpale yra lygi 2,5 mmol/litre. Ca ir Mg jonų santykis lygus 4:1, o Na ir K jonų santykis lygus 10:1. Bendrasis šio tirpalo šarmingumas lygus 0,8 mmol/litre.

Joks nukrypimas nuo skiedimo vandens ruošimo būdo neturi keisti vandens sudėties arba savybių.

2 priedas

EEC tarplaboratorinio palyginamojo bandymo (ring test), atlikto 1978 (taip pat cituojamo 2 nuorodoje), rezultatų suvestinė

Įspėjimas: šio tarplaboratorinio palyginamojo bandymo tikslas buvo nustatyti 24 valandų EC_50.

Naudota medžiaga:

1) Kalio bichromatas

2) Tetrapropilbenzeno sulfoninė rūgštis

3) Tetrapropilbenzeno natrio sulfonatas

4) Kalio 2,4,5-trichlorfenoksiacetatas

Medžiaga	Dalyvavusių laboratorijų skaičius	Skaičiavimams naudotų rezultatų skaičius	24 h EC₅₀, mg/l,vidutinė vertė

1	46	129	1,5
2	36	108	27
3	31	84	27
4	32	72	770

3 priedas

Koncentracijos pavyzdys: imobilizavimo procentinė dalis

EC₅₀ nustatymo pavyzdys, naudojant logaritminį-tikimybinį popierių

Imobilizacija,%

DUMBLIŲ SLOPINIMO BANDYMAS

1. metodas

1.1. ĮVADAS

Šio bandymo tikslas yra nustatyti pasekmes, tiriamajai medžiagai veikiant vienaląsčių žaliųjų dumblių rūšių augimą. Per palyginti trumpai (72 valandas) trunkančius bandymus galima įvertinti poveikį kelioms kartoms. Šį metodą galima pritaikyti įvairioms vienaląsčių dumblių rūšims, tokiu atveju su bandymo ataskaita turi būti pateiktas metodo aprašymas.

Šį metodą lengviausia taikyti vandenyje tirpioms medžiagoms, kai tikimasi, kad bandymo sąlygomis jos išlieka vandenyje.

Metodą galima taikyti medžiagoms, kurios tiesiogiai netrukdo matuoti dumblių augimo.

Prieš pradedant bandymą, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, cheminį patvarumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą.

1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI

Ląstelių tankis: ląstelių skaičius viename mililitre.

Augimas: ląstelių tankio padidėjimas per bandymo laiką.

Augimo greitis: ląstelių tankio didėjimas per laiko vienetą.

EC₅₀: šiame metode – tai tokia bandomosios medžiagos koncentracija, kurioje 50% sumažėja augimas (E_bC₅₀) arba augimo greitis (E_rC₅₀), lyginant su kontroliniu bandymu.

NOEC (maksimali neveikianti koncentracija): šiame metode – tai didžiausia bandomoji koncentracija, kurioje nėra statistiškai patikimo augimo arba augimo greičio sumažėjimo, lyginant su kontroliniu bandymu.

Kiekviena bandomosios medžiagos koncentracija yra skaičiuojama mase tūrio vienetui (mg/litre) arba mase masės vienetui (mg/kg).

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymų sąlygomis naudojamų rūšių jautrumas žymiai nepakito, gali būti atliekamas bandymas su etalonine medžiaga.

Jei panaudota etaloninė medžiaga, rezultatai turi būti pateikti ataskaitoje. Etalonine medžiaga galima naudoti kalio bichromatą, tačiau jo spalva gali turėti įtakos šviesos, kurią gauna ląstelės, kokybei ir intensyvumui bei spektrofotometrinių nustatymų, jei jie daromi, rezultatams. Kalio bichromatas buvo naudojamas tarptautiniame tarplaboratoriniame bandyme (žr. 3 nuorodą ir 2 priedą).

1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ

Galima atlikti ribinį bandymą su 100 mg/litre koncentracija, norint parodyti, kad EC₅₀ yra didesnė nei ši koncentracija.

Eksponentiškai augančios atrinktų žaliųjų dumblių kultūros apibrėžtomis sąlygomis per kelias kartas yra veikiamos įvairių koncentracijų bandomosios medžiagos tirpaluose.

Bandomieji tirpalai inkubuojami 72 valandoms; per tą laiką ne mažiau kaip kas 24 valandas kiekviename tirpale matuojamas ląstelių tankis. Nustatomas augimo slopinimas, lyginant su kultūros augimu kontroliniame bandyme.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

Kokybės kriterijai turi būti taikomi tiek ribinio bandymo metodui, tiek ir pilnos apimties bandymo metodui.

Ląstelių tankis kontrolinių bandymų kultūrose per tris paras turi būti padidėjęs bent 16 kartų.

Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti laikoma 80% pradinės koncentracijos vertės ribose.

Medžiagų, kurios lengvai tirpsta bandomojoje terpėje ir kurių tirpalai patvarūs, t.y. kuriuose ištirpinta medžiaga žymiai negaruoja, nesuyra, nesihidrolizuoja ar neadsorbuojama, pradine koncentracija galima laikyti vardinę medžiagos koncentraciją. Turi būti pateikti įrodymai, kad bandomosios koncentracijos buvo išlaikytos per visą bandymą ir kad kokybės kriterijai buvo įvykdyti.

Medžiagų, kurios:

(i) mažai tirpsta bandymo terpėje, arba

(ii) gali sudaryti patvarias emulsijas ar suspensijas, arba

(iii) yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose,

pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija, nustatyta bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra.

Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti daromi tolesni matavimai.

Yra pripažįstama, kad per tą laiką, kol vyksta bandymas, žymus bandomosios medžiagos kiekis gali būti sulaikytas dumblių biomasėje. Taigi, siekiant parodyti, kad vykdomi aukščiau minėti kokybės kriterijai, turi būti atsižvelgta ir į medžiagos kiekį, kuris patenka į dumblių biomasę, ir į medžiagos kiekį tirpale (arba, jei tai techniškai neįmanoma, į vandens tūryje nustatytą medžiagos kiekį). Tačiau, kadangi medžiagos koncentracijos dumblių biomasėje nustatymas gali kelti esminių techninių problemų, atitikimas kokybės kriterijams gali būti parodytas atliekant bandymą su didžiausia medžiagos koncentracija, bet be dumblių, ir išmatuojant jos koncentraciją tirpale (arba, jei tai techniškai neįmanoma, vandens tūryje) bandymo pradžioje ir pabaigoje.

1.6. bandymų PROCEDŪROS aprašymas

1.6.1. Reagentai

1.6.1.1. Bandomųjų medžiagų tirpalai

Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant tiriamąją medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2.

Pasirinktų bandymo koncentracijų tirpalai ruošiami kartotines pradinio tirpalo dalis įpilant į dumblių pradinę kultūrą (žr. 1 priedą). Įprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Siekiant užtikrinti kai kurių medžiagų (pvz., vandenyje mažai tirpių medžiagų ar kurių didelis Pow, arba tų, kurios sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) sąlygas pasiekti soties arba pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., kad vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui, ir t. t.).

Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba siekiant pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, galima panaudoti kaip papildomas priemones dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius ar dispergatorius. Kai naudojamos tokios pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis ir papildomi kontroliniai bandiniai turi būti veikiami pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti kuo mažesnė ir jokiu atveju neturi būti didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės.

Bandymas turi būti atliekamas nereguliuojant pH vertės. Jei yra įrodymų apie žymų pH vertės kitimą, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HC1 ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti daromas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei, reguliuojant pH, vyksta kokia nors cheminė reakcija ar bandomoji medžiaga fiziškai krenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje.

1.6.1.2. Bandymų terpė

Vanduo turi būti geros kokybės distiliuotas vanduo arba dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų mažesnis kaip 5mScm-1. Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių.

Rekomenduojama terpė:

Pagal žemiau pateiktą lentelę ruošiami keturi pradiniai tirpalai. Pradiniai tirpalai sterilizuojami membraninės filtracijos arba autoklavavimo būdu ir laikomi tamsoje 4°C temperatūroje. Pradinis tirpalas Nr. 4 turi būti sterilizuojamas, tik filtruojant pro membraną. Šie pradiniai tirpalai skiedžiami, kad bandomuosiuose tirpaluose būtų gautos galutinės mitybinių medžiagų koncentracijos.

Mitybinė terpė	Koncentracija pradiniame tirpale		Galutinė koncentracija bandomajame tirpale
1 pradinis tirpalas: mitybiniai makroelementai
NH₄C₁	1,5	g/l	15	mg/l
MgCl₂ 6H₂O	1,2	g/l	12	mg/l
CaCl₂ 2H₂O	1,8	g/l	18	mg/l
MgSO₄ 7H_2O	1,5	g/l	15	mg/l
KH₂PO₄	0,16	g/l	1,6	mg/l

2 pradinis tirpalas: Fe-EDTA
FeCl₃·6H₂O	80	mg/l	0,08	mg/l
Na₂EDTA 2H₂O	100	mg/l	0,1	mg/l
3 pradinis tirpalas: mikroelementai
H3BO3	185	mg/l	0,185	mg/l
MnCl₂ 4H₂O	415	mg/l	0,415	mg/l
ZnCl₂	3	mg/l	3 × 10-3	mg/l
CoCl₂ 6H₂O	1,5	mg/l	1,5 × 10-3	mg/l
CuCl₂ 2H₂O	0,01	mg/l	10-5	mg/l
Na₂MoO₄ 2H₂O	7	mg/l	7 × 10-3	mg/l

4 pradinis tirpalas: NaHCO₃	50	g/l	50	mg/l
NaHCO₃

Kai nusistovi pusiausvyra su oru, terpės pH vertė yra lygi maždaug 8.

1.6.2. Aparatūra

– Įprastoji laboratorijos įranga.

– Atitinkamo tūrio bandymų kolbos (pvz., jei bandomojo tirpalo tūris 100 ml, tinka 250 ml tūrio kūginės kolbos). Visos kolbos turi būti vienodos medžiagos ir matmenų atžvilgiu.

– Kultūros auginimo aparatūra: spinta ar kamera, kurioje temperatūrą būtų galima palaikyti intervale nuo 21°C iki 25°C ± 2oC tikslumu ir kurioje būtų nuolatinis tolygus apšvietimas intervale nuo 400 iki 700 nm. Jei dumblių kontrolinės kultūros pasiekė rekomenduotą augimo greitį, galima daryti prielaidą, kad augimo sąlygos, įskaitant šviesos intensyvumą, buvo tinkamos.

– Rekomenduojama, kad šviesos intensyvumas bandomųjų tirpalų viduriniame lygyje būtų intervale nuo 60 iki 120 μE m-2 s-1 (nuo 35 iki 70 × 1018 fotonų m-2 s-l), kai matuojama intervale nuo 400 iki 700 nm, naudojant tinkamą jutiklį. Jei naudojami apšvietos matavimo prietaisai kalibruoti liuksais, yra priimtinas lygiavertis intervalas nuo 6 000 iki 10 000 lx. Tokį šviesos intensyvumą galima pasiekti, jei 0,35 m atstumu nuo dumblių kultūros pastatomos nuo keturių iki septynių 30 W universalaus tipo baltų dienos šviesos lempų (spalvos temperatūra maždaug 4300 K).

– Ląstelių tankio matavimai turi būti atliekami naudojant tiesioginį gyvų ląstelių skaičiavimo metodą, pvz., mikroskopą su skaičiavimo kamera. Tačiau gali būti naudojami kiti metodai (fotometrija, turbidimetrija,…), jei jie yra pakankamai jautrūs ir jei būtų parodyta, kad jų rezultatai pakankamai gerai koreliuoja su ląstelių tankiu.

1.6.3. Bandomieji organizmai

Patariama naudoti greitai augančių žaliųjų dumblių rūšis, nes jas patogu auginti ir bandyti. Geriausia naudoti šias rūšis:

Selenastrum capricornutum, pvz., ATCC 22662 arba CCAP 278/4,

Scenedesmus subspicatus, pvz., 86.81 SAG,

Pastaba:

ATCC = American Type Culture Collection (U. S. A.)

CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (U. K.)

SAG = Collection of algal culture (Göttingen, F. R. G.)

Jei naudojamos kitos rūšys, turi būti nurodyta padermė.

1.6.4. Bandymų procedūra

Koncentracijos intervalas, kuriame tiriamosios medžiagos veikimas būtų pamatuojamas, nustatomas remiantis intervalo nustatymo bandymų rezultatais.

Du augimo matavimo būdai (biomasės kiekio ir augimo greičio nustatymas) gali duoti nesulyginamus augimo inhibavimo rezultatus; abu turi būti taikomi intervalo nustatymo bandyme, siekiant užtikrinti, kad geometrine progresija parinktos koncentracijos leistų įvertinti E_bC₅₀ ir E_rC₅₀.

Pradinis ląstelių tankis

Rekomenduojama, kad pradinis bandymo kultūrų Selenastrum capricornutum ir Scenedesmus subspicatus ląstelių tankis būtų apie 10⁴ ląstelių/ml. Kai naudojamos kitos rūšys, biomasė turi būti panaši.

Bandomosios medžiagos koncentracija

Bandymui imamos bent penkios geometrine progresija didėjančios koncentracijos, kad santykis tarp gretimų būtų ne didesnis kaip 2,2. Mažiausios koncentracijos bandomoji medžiaga turi neveikti dumblių augimo. Didžiausios koncentracijos bandomoji medžiaga turi inhibuoti augimą bent 50%, lyginant su kontroliniu bandymu, ir būtų geriausia, jei augimas būtų visiškai sustabdytas.

Lygiagrečių bandymų skaičius ir kontroliniai bandymai

Pagal bandymo schemą su kiekviena bandomąja koncentracija turi būti atliekami trys lygiagretūs bandymai. Daromi trys kontroliniai bandymai be bandomosios medžiagos, ir, jei reikia, dar daromi trys kontroliniai bandymai su pagalbine medžiaga. Jei pasiteisina, bandymo schemą galima keisti, didinant koncentracijų skaičių ir mažinant kartotinių bandymų vienai koncentracijai skaičių.

Bandymų eiga

Bandymų kultūros su reikiama bandomosios medžiagos koncentracija ir reikiamu dumblių kiekiu ruošiamos į reikiamą kiekį iš anksto paruoštos dumblių kultūros pilant kartotinius bandomosios medžiagos pradinių tirpalų tūrius (žr. 1 priedą).

Kolbos su kultūra supurtomos ir statomos į kultūros auginimo aparatą. Siekiant bandomuosiuose tirpaluose pagerinti dujų apykaitą ir sumažinti pH kitimą, dumblių ląstelės suspenduojamos, tirpalus purtant, maišant ar barbotuojant per juos orą. Kultūros turi būti laikomos temperatūrų intervale nuo 21 iki 25°C, reguliuojant ± 2°C tikslumu.

Kiekvienoje kolboje ląstelių tankis nustatomas bent po 24, 48 ir 72 valandų nuo bandymo pradžios. Kai ląstelių tankis matuojamas kitu nei tiesioginis skaičiavimas metodu, fonui nustatyti naudojama filtruota dumblių terpė su atitinkama bandomosios medžiagos koncentracija.

pH vertė nustatoma bandymo pradžioje ir po 72 valandų. pH vertė kontroliniuose bandymuose per visą bandymo laiką neturi pasikeisti daugiau kaip 1,5 vieneto.

Lakių tiriamųjų medžiagų bandymas

Iki šiol nėra visuotinai priimto būdo lakių medžiagų išbandymui. Jei žinoma, kad medžiaga turi polinkį garuoti, galima naudoti uždaras bandymų kolbas su padidintu laisvu tūriu virš tirpalo. Skaičiuojant uždarų kolbų laisvąjį tūrį, turi būti atsižvelgta į CO₂ trūkumo galimybę. Buvo pasiūlyti šio metodo variantai (žr. 4 nuorodą).

Reikia stengtis nustatyti tirpale likusios medžiagos kiekį, ir patariama ypač atsargiai interpretuoti bandymų rezultatus, gautus su lakiomis medžiagomis uždaroje sistemoje.

Ribinis bandymas

Taikant šiame bandymo metode aprašytas procedūras, galima atlikti ribinį bandymą su koncentracija 100 mg/litre, kai siekiama įrodyti, kad EC₅₀ yra didesnė nei ši koncentracija.

Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos bandymų vandenyje pasiekti negalima, ribinis bandymas turi būti atliekamas su koncentracija, lygia medžiagos tirpumui (ar su didžiausia koncentracija, kurioje dar susidaro patvari suspensija) naudojamoje terpėje (taip pat žr. 1.6.1.1 punktą).

Turi būti atliekama ne mažiau kaip trys ribiniai bandymai, toks pat turi būti ir kontrolinių bandymų skaičius. Ribiniame bandyme turi būti naudojami du augimo matavimo būdai (biomasės kiekis ir augimo greitis).

Jei ribiniame bandyme, lyginant su kontroliniu bandymu, nustatomas 25% arba didesnis vidutinis biomasės kiekio arba augimo greičio mažėjimas, turi būti atliekamas pilnos apimties bandymas.

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Išmatuotas ląstelių tankis bandomosiose kultūrose ir kontroliniuose bandiniuose kartu su bandomosios medžiagos koncentracijomis ir matavimo laikais pateikiamas lentelėje. Norint gauti augimo kreives, vidutinė ląstelių tankio vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai ir kontroliniuose bandiniuose vaizduojama grafiškai laiko atžvilgiu (0–72 h).

Turi būti taikomi du žemiau pateikti būdai, kad būtų galima įvertinti koncentracijos ir jos poveikio priklausomybę. Kai kurios medžiagos, būdamos mažos koncentracijos, gali skatinti augimą. Turi būti įskaitomi tik tie duomenų taškai, kuriuose inhibavimas kinta nuo 0 iki 100%.

2.1. Plotų po augimo kreivėmis lyginimas

Plotas tarp augimo kreivės ir horizontaliosios tiesės N = N₀ gali būti apskaičiuotas taikant formulę:

čia:

A = plotas,

N₀ = ląstelių skaičius laiku t0 (bandymo pradžia),

N₁ = išmatuotas ląstelių skaičius/ml laiku t1,

N_n = išmatuotas ląstelių skaičius/ml laiku tn,

t₁ = pirmojo matavimo laikas nuo bandymo pradžios,

t_n = n-ojo matavimo laikas nuo bandymo pradžios,

_n = nuo bandymo pradžios darytų matavimų skaičius.

Ląstelių augimo inhibavimo procentinė vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai (I_A) apskaičiuojama taikant formulę:

čia:

A_c = plotas tarp augimo kreivės, gautos kontroliniame bandyme, ir horizontaliosios tiesės N = N₀,

A_t = plotas tarp augimo kreivės, gautos koncentracijai t, ir horizontaliosios tiesės N = N₀.

I_A vertės atitinkamų koncentracijų atžvilgiu atidedamos pusiau logaritminiame ar pusiau logaritminiame tikimybiniame popieriuje. Jei vertės atidedamos tikimybiniame popieriuje, per taškus vedama tiesė arba iš akies, arba skaičiuojant iš regresijos lygties.

EC₅₀ įvertinama iš regresijos tiesės, randant joje koncentracijos vertę, kuri atitinka 50% inhibavimą (I_A = 50%). Norint šią vertę pažymėti vienareikšmiai, kaip gautą būtent šiuo skaičiavimo metodu, pasiūlyta vartoti simbolį E_bC₅₀. Svarbu, kad E_bC₅₀ būtų kiekybiškai nustatomas ir pateikiamas kartu su atitinkamu veikimo laikotarpiu, pvz., E_bC₅₀ (0–72 h).

2.2. Augimo greičių lyginimas

Vidutinis eksponentiškai augančių kultūrų savitasis augimo greitis (μ) gali būti apskaičiuotas pagal formulę:

čia: t₀ – bandymo pradžios laikas.

Kitaip augimo vidutinio savitojo greičio vertė gali būti gauta iš regresijos tiesės kampinio koeficiento ln N priklausomybės nuo laiko grafike.

Savitojo augimo greičio mažėjimo procentinė vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai (Iμt) skaičiuojama pagal formulę:

čia:

μc= vidutinis savitasis augimo greitis kontroliniame bandyme,

μt = vidutinis savitasis augimo greitis, kai bandomoji koncentracija t.

Kiekvienai koncentracijai gautos savitojo augimo greičio mažėjimo vertės ir kontrolinės greičio vertės santykio procentinė vertė brėžiama koncentracijos logaritmo atžvilgiu. Iš gauto grafiko galima gauti EC₅₀ vertę. Norint vienareikšmiai pažymėti šiuo metodu gautą EC₅₀, pasiūlyta naudoti simbolį E_rC₅₀. Turi būti nurodytos matavimo laiko ribos, pvz., jei vertė gauta 0 ir 72 valandų laikotarpiui, simbolis užrašomas E_rC₅₀ (0–72 h).

Pastaba: savitasis augimo greitis yra logaritminis dydis, ir nedideli augimo greičio pokyčiai gali būti didelių biomasės pokyčių priežastimi. Taigi E_bC ir E_rC skaitmeninės vertės nėra palyginamos.

2.3. NOEC skaičiavimas

NOEC (maksimali neveikianti koncentracija) nustatoma taikant didelio skaičiaus bandinių lyginimo statistinę procedūrą (pvz., dispersinė analizė ir Dunnett’o testas), naudojant individualias kartotines vertes A (žr. 2.1 poskyrį) arba μ (žr. 2.2 poskyrį) reikšmes.

3. ATASKAITA

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– bandomoji medžiaga: cheminio identifikavimo duomenys;

bandomieji organizmai: kilmė, laboratorinė kultūra, padermės numeris, ir auginimo metodas;

– bandymų sąlygos:

– bandymo pradžios ir pabaigos data bei jo trukmė,

– temperatūra,

– terpės sudėtis;

– auginimo aparatūra;

– tirpalų pH bandymo pradžioje ir pabaigoje (turi būti pateiktas aiškinimas, jei stebimas pH vertės nukrypimas yra didesnis nei 1,5 vieneto);

– nešiklis ir metodas, taikytas soliubilizuoti bandomąją medžiagą, bei nešiklio koncentracija bandomuosiuose tirpaluose;

– šviesos intensyvumas ir kokybė;

– bandomosios koncentracijos (matuotos ar vardinės);

– rezultatai:

– ląstelių tankis kiekvienoje kolboje bei kiekviename matavimo taške, taip pat ląstelių tankio nustatymo metodas,

– ląstelių tankio vidutinės vertės,

– augimo kreivės,

– koncentracijos poveikio priklausomybių grafinis vaizdavimas,

– EC vertės ir skaičiavimo metodas,

– NOEC,

– kiti pastebėti reiškiniai.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.

(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag ‘Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus, in: Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

(3) ISO 8692 – Water quality – Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.

(4) S. Galassi and M. Vighi – Chemosphere, 1981, vol. 10, 1123-1126.

1 priedas

Dumblių auginimo metodikos pavyzdys

Bendrosios pastabos

Šio kultūros auginimo pagal pateikiamą metodiką tikslas yra gauti dumblių kultūras toksiškumo bandymams.

Norint užtikrinti, kad dumblių kultūros nebūtų užkrėstos bakterijomis, turi būti naudojami tinkami metodai (ISO 4833). Pageidautina naudoti akseniškas kultūras, tačiau pagrindinės yra vienaląsčių dumblių kultūros.

Visi veiksmai turi būti daromi steriliomis sąlygomis, kad nebūtų užkrėsta bakterijomis ir kitais dumbliais. Užkrėstos kultūros turi būti atmestos.

Dumblių kultūros paruošimo eiga

Mitybinių tirpalų (terpės) ruošimas:

Terpė gali būti paruošta, skiedžiant pradinius mitybinių medžiagų koncentruotus tirpalus. Standžiai terpei gauti dedama 0,8% agaro. Naudojama terpė turi būti sterili. Sterilizuojant autoklave, galima prarasti NH₃.

Pradinė kultūra:

Pradinės kultūros yra mažos apimties dumblių kultūros, kurios reguliariai pernešamos į šviežią terpę, kad jas būtų galima naudoti kaip pradinę bandymams skirtą medžiagą. Jei kultūros reguliariai nenaudojamos, jos laikomos ant nuožulnaus agaro, mėgintuvėliuose. Šios kultūros pernešamos į šviežią terpę bent kartą per du mėnesius.

Pradinės kultūros auginamos kūginėse kolbose su atitinkama terpe (tūris apie 100 ml). Kai dumbliai inkubuojami 20°C temperatūroje su nuolatiniu apšvietimu, pernešti reikia kas savaitę.

Į kolbą su šviežia terpe sterilia pipete reikia pernešti tokį „senos“ kultūros kiekį, kad greitai augančių rūšių atveju pradinė koncentracija būtų maždaug 100 kartų mažesnė nei „senos“ kultūros.

Rūšių augimo greitis gali būti nustatytas iš augimo kreivės. Jei greitis žinomas, galima įvertinti, koks turi būti į naują terpę pernešamos kultūros tankis. Tai turi būti daroma prieš tai, kai kultūra pasiekia žūties tarpsnį.

Iš anksto paruošta kultūra:

Iš anksto paruošta kultūra skirta tam, kad būtų gautas bandomosioms kultūroms sėti reikalingas dumblių kiekis. Iš anksto paruošta kultūra inkubuojama bandymo sąlygomis ir naudojama tuomet, kai dar auga eksponentiškai, paprastai maždaug po trijų inkubavimo parų. Jei dumblių kultūrose randama deformuotų ar nenormalių ląstelių, tokios kultūros turi būti pašalintos.

2 priedas

ISO 8692 – Vandens kokybė – Gėlojo vandens dumblių augimo inhibavimo bandymas su Scenedesmus subspicatus ir Selenastrum capricornutum pateikia šiuos tarplaboratorinio palyginamojo bandymo rezultatus, gautus 16-oje laboratorijų, tyrusių kalio bichromatą:

	Vidutinė vertė, mg/l	Intervalas, mg/l
E_rC₅₀ (0–72 h)	0,84	nuo 0,60 iki 1,03
E_bC₅₀ (0–72 h)	0,53	nuo 0,20 iki 0,75

„LENGVO“ BIOLOGINIO SKAIDOMUMO NUSTATYMAS

I dalis. BENDRieji klausimai

I.1. ĮVADAS

Aprašyti šeši metodai, kurie leidžia chemines medžiagas rūšiuoti pagal jų biologinio skaidomumo aerobinėje vandeninėje terpėje lengvumą:

a) Ištirpusios organinės anglies (IOA) išnykimo (Die-Away) metodas (A metodas).

b) Modifikuotas OECD (Organization for Economic Cooperation and Development – Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacija) atrankos bandymas – IOA išnykimas (B metodas).

c) Anglies dioksido (CO₂) susidarymas (modifikuotas Sturm bandymas) (C metodas).

d) Manometrinė respirometrija (D metodas).

e) Uždarytos kolbos (Closed bottle) metodas (E metodas).

f) MITI [Ministry of International Trade and Industry (Tarptautinės prekybos ir pramonės ministerija) – Japonija] (F metodas).

Visų šešių bandymų atlikimo sąlygos, bendros ir įprastos, pateiktos metodų I dalyje. Atskiriems metodams specifiniai teiginiai pateikti II–VII dalyse. Prieduose pateikiami apibrėžimai, formulės ir rekomendacijos.

OECD tarplaboratoriniai palyginamieji bandymai, atlikti 1988 m., parodė, kad šiais metodais gauti rezultatai yra tarpusavyje suderinami. Tačiau priklausomai nuo fizikinių bandomosios medžiagos savybių pirmenybė gali būti teikiama vienam arba kitam metodui.

I.2. TINKAMO METODO PARINKIMAS

Tinkamiausio metodo parinkimą nulemia informacija apie cheminės medžiagos tirpumą, garų slėgį ir adsorbcijos charakteristikas. Teorinių verčių skaičiavimui ir (arba) parametrų išmatuotų verčių patikrinimui, pvz., TDS, TCO2, IOA, BOA, ChDS (žr. I ir II priedus), turi būti žinoma cheminė medžiagos formulė.

Bandomosios cheminės medžiagos, kurių tirpumas vandenyje yra bent 100 mg/l, ir jei jos nėra lakios ir neadsorbuojamos, gali būti įvertintos visais metodais. Toms cheminėms medžiagoms, kurios mažai tirpsta vandenyje, yra lakios arba yra adsorbuojamos, tinkami metodai nurodyti 1 lentelėje. Būdas, kaip reikia elgtis su mažai vandenyje tirpiomis ir lakiomis medžiagomis, yra aprašytas III priede. Vidutiniškai lakios cheminės medžiagos gali būti bandomos IOA išnykimo metodu, jei bandymų induose (kurie turi būti tinkamai užkimšti) dujoms yra pakankamai ertmės. Šiuo atveju turi būti įdiegta abiotinė kontrolė, kad būtų galima atsižvelgti į bet kokius fizinius nuostolius.

Gautų rezultatų interpretavimui, ypač kai rezultatų kiekybinės vertės yra mažos arba nežymios, reikalinga informacija apie bandomosios medžiagos grynumą arba apie pagrindinių komponentų santykinę dalį.

Informacija apie bandomųjų medžiagų toksiškumą bakterijoms (IV priedas) gali būti labai naudinga, kai reikia pasirinkti tinkamas bandomąsias koncentracijas, ir gali būti esminė, kai reikia teisingai paaiškinti, kodėl biologinio skaidymo vertės yra mažos.

1 lentelė. Bandymų metodų tinkamumas

Bandymas	Analizės metodas	Tinkamumas medžiagoms, kurios yra:
		mažai tirpios	lakios	adsorbuojamos
IOA išnykimas	Ištirpusi organinė anglis	–	–	+/-
Modifikuotas OECD atrankos	Ištirpusi organinė anglis	–	–	+/-
bandymas – IOA išnykimas
CO₂ susidarymas	Respirometrija: CO₂ susidarymas	+	–	+
Manometrinė respirometrija	Manometrinė respirometrija: deguonies suvartojimas	+	+/-	+
Uždarytos kolbos	Respirometrija: ištirpęs deguonis	+/-	+	+
MITI	Respirometrija: deguonies suvartojimas	+	+/-	+

I.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Siekiant patikrinti procedūrą, lygiagrečiai įprastiems bandymams tinkamai paruoštoje kolboje bandomos etaloninės medžiagos, kurios atitinka lengvo biologinio skaidomumo kriterijus.

Tinkamos cheminės medžiagos yra anilinas (šviežiai distiliuotas), natrio acetatas ir natrio benzoatas. Visos šios etaloninės medžiagos skaidomos šių bandymų sąlygomis, net jei užkratas ir nėra specialiai įdėtas.

Buvo padaryta prielaida, kad reikėtų rasti etaloninę medžiagą, kuri būtų lengvai biologiškai skaidoma, tačiau tik kai yra įdėta užkrato. Buvo pasiūlytas kalio hidroftalatas, tačiau prieš priimant jį kaip etaloninę medžiagą, reikia apie ją surinkti daugiau duomenų.

Respirometriniuose bandymuose junginiai, savo sudėtyje turintys azoto, gali turėti įtakos deguonies vartojimui dėl nitrifikavimo (žr. II ir V priedus).

I.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ

Į bandomosios medžiagos tirpalą arba suspensiją mineralinėje terpėje dedamas užkratas ir tirpalas inkubuojamas aerobinėmis sąlygomis tamsoje arba išsklaidytoje šviesoje. IOA kiekis bandomosios medžiagos tirpale, įterptas su užkratu, turi būti kiek įmanoma mažesnis, lyginant su bandomosios medžiagos IOA kiekiu. Reikia atsižvelgti į užkrato endogeninį aktyvumą, lygiagrečiai darant tuščiuosius bandymus su užkratu, bet be bandomosios medžiagos, nors ląstelių endogeninis aktyvumas, kai yra bandomosios medžiagos, ne visiškai tiksliai atitinka aktyvumą endogeninio aktyvumo kontroliniame bandyme. Atlikimo eigai patikrinti lygiagrečiai daromas bandymas su etalonine medžiaga.

Bendruoju atveju skaidymo eiga sekama nustatinėjant parametrus, pvz., IOA, CO2 susidarymą ir deguonies suvartojimą; matavimai daromi pakankamai dažnai, kad galima būtų nustatyti biologinio skaidymo pradžią ir pabaigą. Jei naudojami automatiniai respirometrai, matavimas yra nuolatinis. Kai matuojamas kitas parametras, kartais papildomai matuojama IOA, tačiau tai paprastai daroma tik bandymo pradžioje ir pabaigoje. Galima naudoti specifinę cheminę analizę, kai norima įvertinti pradinį bandomosios medžiagos suskaidymą ir nustatyti bet kurios susidariusios tarpinės medžiagos koncentraciją (privaloma MITI bandyme).

Paprastai bandymas tęsiamas 28 paras. Tačiau bandymą galima baigti anksčiau nei po 28 parų, t. y. kai biologinio skaidymo kreivė pasiekia gulsčiąją dalį sprendžiant ne mažiau kaip iš trijų iš eilės matavimų. Bandymai gali būti pratęsti ir daromi ilgiau nei 28 paras, jei kreivė rodo, kad biologinis skaidymas prasidėjo, tačiau 28 parą gulsčioji dalis dar nepasiekta.

I.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

I.5.1. Atkuriamumas

Dėl biologinio skaidymo prigimties ir dėl užkrato bakterijų populiacijos mišrios sudėties matavimai turi būti daromi bent du kartus.

Bendra patirtis rodo, kad kuo didesnė bandymo pradžioje į bandomąją terpę įneštų mikroorganizmų koncentracija, tuo mažesnė bus lygiagrečių bandymų sklaida. Tarplaboratoriniai palyginamieji bandymai taip pat parodė, kad gali būti didelė sklaida tarp rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose, tačiau lengvai biologiškai skaidomų junginių atveju paprastai gaunamas geras sutapimas.

I.5.2. Bandymų validumas (teisėtumas)

Bandymas yra validus (teisėtas), jei skirtumas tarp bandomosios medžiagos šalinimo pakartotinai gautų kraštinių verčių gulsčioje kreivės dalyje bandymo pabaigoje arba 10 parų lango pabaigoje yra mažesnis kaip 20% ir jei etaloninės medžiagos skaidymo procentinė vertė iki 14 paros pasiekė lengvojo biologinio skaidomumo lygį. Jei bet kuri iš šių sąlygų neįvykdyta, bandymas turi būti pakartotas. Mažos apimties vertės dėl metodų tikslumo nebūtinai reiškia, kad bandomoji medžiaga aplinkos sąlygomis biologiškai neskaidoma, tačiau jos rodo, kad biologiniam skaidomumui nustatyti būtinas didesnės apimties darbas.

2 lentelė. Bandymų sąlygos

Bandymas	IOA išnykimas	CO₂ susidarymas		Manometrinė respirometrija	Modifikuotas OECD atrankos bandymas		Uždarytos kolbos bandymas	MITI (I)
Bandomosios medžiagos koncentracija mg/l mg IOA/l mg TDS/l	10–40	10–20		100 50–100	10–40		2–10 5–10	100
koncentracija (ląstelių/l, apytikriai)	≤ 30 mg/l SD ar ≤ 100 ml ištakio/l (10⁷–10⁸)				0,5 ml antrinio ištakio/l (10⁵)		≤ 5 ml antrinio ištakio/l (10⁴–10⁶)	30 mg/l SD (10⁷–10⁸)
Elementų koncentracija mineralinėje terpėje (mg/l) P N Na K Mg Ca Fe	116 1,3 86 122 2,2 9,9 0,05–0,1						11,6 0,13 8,6 12,2 2,2 9,9 0,05–0,1	29 1,3 17,2 36,5 6,6 29,7 0,15
pH	7,4 ± 0,2							geriau 7,0
Temperatūra	22 ± 2oC							25 ± 1°C
IOA = ištirpusi organinė anglis			TDS = teorinis deguonies suvartojimas			SD = suspenduotos kietosios dalelės

Jei toksiškumo bandyme, kuriame yra ir bandomoji medžiaga, ir etaloninė cheminė medžiaga, skaidymas po 14 parų yra mažesnis kaip 35% (pagal IOA) arba mažesnis kaip 25% (pagal TDS arba TCO₂), bandomosios cheminės medžiagos gali būti laikomos inhibuojančiomis (dar žr. IV priedą). Bandymų serijos turi būti pakartotos, jei tai įmanoma, naudojant mažesnę bandomosios medžiagos koncentraciją ir (arba) didesnę užkrato koncentraciją, tačiau ne didesnę kaip 30 mg kietųjų dalelių/litre.

I.6. BENDROSIOS PROCEDŪROS IR PREPARATAI

Bendrosios bandymų sąlygos apibendrintos 2 lentelėje. Prietaisai ir kitos bandymo atlikimo sąlygos, specifiškai susijusios su kiekvienu atskiru bandymu, aprašytos toliau to bandymo aprašyme.

I.6.1. Skiedimo vanduo

Naudojamas dejonizuotas ar distiliuotas vanduo, kuriame nėra inhibuojančios nuodingųjų medžiagų (pvz., Cu²⁺ jonų) koncentracijos. Vandenyje organinės anglies neturi būti daugiau kaip 10% to kiekio, kuris yra bandomojoje medžiagoje. Didelis bandymams skirto vandens grynumas reikalingas tam, kad nesusidarytų didelės tuščiųjų bandinių vertės. Užterštumas gali atsirasti dėl vandeniui būdingų priemaišų ir dėl jonitinių dervų bei bakterijų ir dumblių irimo produktų. Kiekvienai bandymų serijai reikia naudoti tik vienos partijos vandenį, iš anksto patikrintą atliekant IOA analizę. Toks tikrinimas nėra būtinas uždarytos kolbos bandymams, tačiau deguonies suvartojimas vandeniu turi būti mažas.

I.6.2. Pradiniai mineralinių komponentų tirpalai

Paruošiant bandomuosius tirpalus, ruošiami atitinkamų koncentracijų mineralinių komponentų pradiniai tirpalai. IOA išnykimo, modifikuotos OECD atrankos, CO₂ susidarymo, manometrinės respirometrijos, uždarytos kolbos bandymuose galima naudoti tokius pradinius (su skirtingais skiedimo faktoriais) tirpalus.

Skiedimo faktoriai ir specialios mineralinės terpės ruošimas MITI bandymui pateikti konkrečių metodų aprašymuose.

Pradiniai tirpalai:

Paruošiami šie pradiniai tirpalai, naudojamos analiziškai grynos medžiagos.

a) Kalio dihidrofosfatas, KH₂PO₄	8,50 g
kalio hidrofosfatas, K₂HP0₄	21,75 g
natrio hidrofosfatas, dihidratas, Na₂HPO₄ 2H₂O	33,40 g
amonio chloridas, NH₄Cl	0,50 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. Tirpalo pH turi būti 7,4.
b) Kalcio chloridas, bevandenis, CaCl₂	27,50 g
ar kalcio chloridas, dihidratas, CaCl₂ 2 H₂O	36,40 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
c) Magnio sulfatas, heptahidratas, MgSO₄ 7H₂O	22,50 g
Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
d) Geležies (III) chloridas, heksahidratas, FeCl₃ 6 H₂O	0,25 g

Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

Pastaba: jei nenorite ruošti šį tirpalą prieš patį bandymą, vienam tirpalo litrui įlašinkite vieną lašą konc. HCl arba įdėkite 0,4 g etilendiamintetraacto rūgšties (EDTA) dinatrio druskos.

I.6.3. Cheminių medžiagų pradiniai tirpalai

Pavyzdys: dejonizuotame vandenyje ištirpinama 1–10 g, kiek reikia, bandomosios arba etaloninės medžiagos ir skiedžiama iki 1 litro, jei tirpumas didesnis kaip 1 g/l. Kitu būdu pradiniai tirpalai ruošiami mineralinėje terpėje arba cheminė medžiaga dedama tiesiai į mineralinę terpę. Kaip ruošti mažiau tirpias chemines medžiagas, žr. III priedą, tačiau MITI bandyme (F metodas) nei tirpikliai, nei emulsikliai neturi būti naudojami.

I.6.4. Užkratai

Užkratus galima gauti iš įvairių šaltinių: aktyviojo dumblo, nuotekų ištakių (nechloruotų), paviršinio vandens ir dirvožemio ar mišinių iš šių šaltinių. Jei IOA išnykimo, CO₂ susidarymo ir manometrinės respirometrijos bandymams naudojamas aktyvusis dumblas, jis turi būti imamas iš nuotekų valymo įrenginių ar laboratorinių valymo įrenginių, į kuriuos daugiausia patenka buitinės nuotekos. Buvo nustatyta, kad, naudojant užkratus iš kitų šaltinių, rezultatų sklaida didesnė. Modifikuotam OECD atrankos ir uždarytos kolbos bandymui reikia labiau praskiesto užkrato be dumblo dribsnių, todėl labiau pageidautinas šaltinis yra antrinis ištakis iš buitinių nuotekų valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio. MITI bandymui užkratas ruošiamas iš mišinio, sudaryto iš įvairių šaltinių. Jis aprašytas šio specialaus bandymo skyriuje.

I.6.4.1. Užkratas iš aktyviojo dumblo

Iš buitines nuotekas valančio valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio aeravimo tanko surenkamas šviežias aktyviojo dumblo bandinys. Prireikus stambios dalelės pašalinamos, filtruojant per tankų tinklinį filtrą. Toliau dumblas laikomas aerobinėmis sąlygomis.

Arba pašalinamos visos stambios dalelės, leidžiama dumblui nusistoti, arba centrifuguojama (pvz., 10 min veikiant 1100 g). Skystis nuo dumblo nupilamas. Dumblas gali būti plaunamas mineraline terpe. Koncentruotas dumblas suspenduojamas mineralinėje terpėje taip, kad suspenduotų standžių dalelių koncentracija būtų 3–5 g/l, ir aeruojamas iki jo panaudojimo.

Dumblas turi būti imamas iš gerai veikiančio įprastinės technologijos įrenginio. Jei dumblas imamas iš didelio intensyvumo technologijos valymo įrenginio arba jei manoma, kad dumble yra inhibitorių, jis turi būti plaunamas. Gerai sumaišytas, pakartotinai suspenduotas dumblas paliekamas nusistoti arba centrifuguojamas, nuo jo nupilamas skystis ir išplautas dumblas dar kartą suspenduojamas kitame mineralinės terpės tūryje. Šiuos veiksmus reikia kartoti tol, kol bus galima manyti, kad substrato pertekliaus arba inhibitorių neliko.

Prieš pat dumblo panaudojimą paimamas pilnai suspenduoto ar neapdoroto dumblo bandinys suspenduotų standžiųjų dalelių sausai masei nustatyti.

Atliekant kitu būdu, aktyvusis dumblas homogenizuojamas (3–5 g/l suspenduotų kietųjų dalelių). Dumblas maišomas 2 min vidutiniu greičiu mechaniniu maišikliu. Sumaišytas dumblas paliekamas 30 min arba ilgiau, jei to reikia. Dekantuotas skystis bus naudojamas kaip užkratas pagal normą 10 ml/l mineralinės terpės.

I.6.4.2. Kiti užkrato šaltiniai

Užkratą galima gauti iš valymo įrenginio ar laboratorinio valymo įrenginio, apdorojančių daugiausia buitines nuotekas, antrinio ištakio. Paimamas šviežias bandinys ir gabenimo metu laikomas aerobinėmis sąlygomis. Paliekamas nusistoti vieną valandą arba filtruojamas per stambų filtrinį popierių. Dekantuotas ištakis arba filtratas laikomi aerobinėmis sąlygomis, kol bus panaudoti. Vienam litrui mineralinės terpės galima naudoti iki 100 ml šios rūšies užkrato.

Kitas užkrato šaltinis yra paviršinis vanduo. Šiuo atveju paimamas tinkamo paviršinio vandens, pvz., upės, ežero, bandinys ir laikomas aerobinėmis sąlygomis, kol bus panaudotas. Prireikus užkratas koncentruojamas filtravimo arba centrifugavimo būdu.

I.6.5. Užkratų pradinis kondicionavimas

Užkratai gali būti iš anksto kondicionuojami eksperimento sąlygoms, tačiau iš anksto prie bandomosios cheminės medžiagos neadaptuojami. Pradinis kondicionavimas susideda iš aktyviojo dumblo tirpalo mineralinėje terpėje arba antrinio ištakio 5–7 parų trukmės aeravimo bandymo temperatūroje. Kartais pradinis kondicionavimas gerina bandymo metodų tikslumą, nes sumažina tuščiųjų bandinių vertes. Laikoma, kad MITI bandymo užkrato išankstinis kondicionavimas yra būtinas.

I.6.6. Abiotinio skaidymo kontroliniai bandymai

Kai reikia, nustatomas galimas bandomosios medžiagos abiotinis skaidymas, matuojant IOA pašalinimą, deguonies suvartojimą arba anglies dioksido susidarimą steriliuose kontroliniuose bandiniuose be užkrato. Sterilizuojama filtravimu per membraną (0,2–0,45 μm) arba pridedant tinkamos reikiamos koncentracijos nuodingos medžiagos (sterilizavimo agento). Jei naudojamas filtravimas per membraną, sterilumui užtikrinti bandiniai imami steriliai. Jei bandomosios medžiagos adsorbcija nebuvo iš anksto pašalinta, bandymai, kuriuose skaidymas nustatomas, matuojant IOA šalinimą, ypač jei užkratas iš aktyviojo dumblo, turi būti atliekami kartu su abiotinio skaidymo kontroliniu bandymu, į kurį dedamas užkratas ir nuodas (nuodytojas).

I.6.7. Kolbų skaičius

Kolbų skaičius tipiškame bandyme yra nurodytas kiekviename skyriuje su atitinkamo metodo aprašymu.

Galima naudoti tokio tipo kolbas:

bandomoji suspensija: su bandomąja medžiaga ir užkratu;

užkrato tuščiasis bandymas: tik su užkratu;

atlikimo eigos tikrinimo bandymas: su etalonine medžiaga ir užkratu;

abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandymas: sterilus, su bandomąja medžiaga (žr. I.6.6);

adsorbcijos kontrolinis bandymas: su bandomąja medžiaga, užkratu ir sterilizavimo agentu;

toksiškumo kontrolinis bandymas: su bandomąja medžiaga, etalonine medžiaga ir užkratu.

Būtina, kad matavimai bandomojoje suspensijoje ir užkrato tuščiajame bandyme būtų daromi lygiagrečiai. Patartina matavimus ir kitose kolbose taip pat daryti lygiagrečiai.

Tačiau tai ne visuomet įmanoma. Reikia užtikrinti, kad būtų paimtas pakankamas skaičius bandinių arba padaryta matavimų, norint įvertinti pašalinimo procentinę vertę po 10 parų lango.

I.7. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Skaičiuojant skaidymo procentinę vertę, Dt, naudojamos dviejų parametro matavimų vidutinės vertės bandymo ir tuščiojo bandymo su užkratu kolboje. Formulės pateiktos kituose konkrečius bandymus aprašančiuose skyriuose. Skaidymo eiga vaizduojama grafiškai ir pažymimas 10 parų langas. Apskaičiuojama ir pateikiama medžiagos šalinimo, baigiantis 10 parų langui, procentinė vertė ir gulsčiąją kreivės dalį atitinkanti vertė arba bandymo pabaigos vertė, kuri tinka.

Respirometriniuose bandymuose junginiai, savo sudėtyje turintys azoto, gali veikti deguonies suvartojimą dėl nitrifikavimo (žr. II ir V priedus).

I.7.1. Skaidymo nustatymas pagal IOA kiekio matavimą

Skaidymo procentinė vertė, Dt, kiekvieną kartą, kai buvo paimtas bandinys, turi būti skaičiuojama atskirai kolboms su bandomąja medžiaga, naudojant dviejų IOA matavimų vidutines vertes, kad būtų galima įvertinti bandymo validumą (teisėtumą) (žr. I.5.2). Skaidymas skaičiuojamas pagal lygtį:

čia:

Dt = skaidymo% laiku t,

C₀ = vidutinė pradinė DOC koncentracija terpėje su bandomąja medžiaga ir užsėtu užkratu (IOA mg/l),

C_t = vidutinė IOA koncentracija terpėje su bandomąja medžiaga ir užsėtu užkratu laiku t (IOA mg/l),

C_b0 = vidutinė pradinė IOA koncentracija tuščiojo bandinio terpėje su užsėtu užkratu (IOA mg/l),

C_bt = vidutinė IOA koncentracija tuščiojo bandinio terpėje su užsėtu užkratu (IOA mg/l).

Visos koncentracijos nustatomos eksperimentiškai.

I.7.2. Skaidymo nustatymas, darant specifinę analizę

Kai yra specifinės analizės duomenys, pradinis biologinis skaidymas skaičiuojamas pagal formulę:

čia:

D_t = skaidymo% laiku t, paprastai 28 paros,

S_a= likutinis bandomosios medžiagos kiekis terpėje su užkratu bandymo pabaigoje (mg),

S_b = likutinis bandomosios medžiagos kiekis tuščiajame bandinyje su vandeniu (terpe), į kurį buvo įdėta tik bandomoji medžiaga (mg).

I.7.3. Abiotinis skaidymas

Naudojant sterilų kontrolinį bandymą abiotiniam skaidymui nustatyti, abiotinio skaidymo procentinė vertė skaičiuojama pagal formulę:

čia:

C_a(0)= IOA koncentracija steriliame kontroliniame bandyme 0 parą,

C_s(t)= IOA koncentracija steriliame kontroliniame bandyme t parą.

I.8. ATASKAITA

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– bandomoji ir etaloninė cheminė medžiaga, jų grynumas;

– bandymų sąlygos;

– užkratas: prigimtis ir ėmimo vieta (-os), koncentracija ir bet koks pradinis kondicionavimas;

– nuotekose esančių pramoninių nuotekų dalis ir kiekis, jei tai žinoma;

– bandymo trukmė ir temperatūra;

– apdorojimo būdas mažai tirpių cheminių medžiagų atveju;

– taikytas bandymų metodas; būtina moksliškai pagrįsti ir paaiškinti bet kokį metodikos keitimą;

– specifikacija;

– visi pastebėti inhibavimo reiškiniai;

– bet koks pastebėtas abiotinis skaidymas;

– specifinės cheminės analizės duomenys, jei yra;

– analiziniai duomenys apie tarpinius produktus, jei yra;

– bandomosios medžiagos ir etaloninės medžiagos skaidymo procentinės dalies kitimo laike grafikas; turi būti aiškiai nurodyta lag (vėlavimo) fazė, skaidymo fazė, 10 parų langas ir kreivės krypties koeficientas (I priedas). Jei bandymas atitinka validumo kriterijus, grafikui sudaryti galima naudoti skaidymo procentinių verčių vidutines vertes, gautas kolbose su bandomąja medžiaga;

– šalinimo procentinė dalis po 10 parų lango arba kreivės gulsčioje dalyje, arba bandymo pabaigoje.

II dalis. IOA išnykimo bandymas (A metodas)

II.1. metodo esmė

Išmatuotas mineralinės terpės su užkratu ir žinomos koncentracijos bandomąja medžiaga (nuo 10 iki 40 mg/l IOA), kuri nominaliai yra vienintelis organinės anglies šaltinis, tūris yra aeruojamas tamsoje ar išsklaidytoje šviesoje 22 ± 2°C temperatūroje.

Skaidymas sekamas 28 paras, trumpais intervalais atliekant IOA analizę. Biologinio skaidymo laipsnis skaičiuojamas pašalintos IOA koncentraciją (pataisyta dėl IOA koncentracijos užkrato tuščiajame kontroliniame bandinyje) reiškiant pradinės koncentracijos procentine dalimi. Pradinio biologinio skaidymo laipsnį galima skaičiuoti pagal papildomą cheminę analizę, daromą inkubavimo pradžioje ir pabaigoje.

II.2. METODO APRAŠYMAS

II.2.1. Prietaisai

a) Kūginės kolbos, pvz., nuo 250 ml iki 2 litrų, talpa parenkama priklausomai nuo IOA analizei reikalingo tūrio.

b) Mechaninė purtyklė, skirta kūginėms kolboms įstatyti arba su automatiniu termostatavimu, arba naudojama patalpoje su pastovia temperatūra ir pakankamo galingumo, kad visose kolbose galima būtų palaikyti aerobines sąlygas.

c) Filtravimo aparatas su tinkamomis membranomis.

d) IOA analizatorius.

e) Ištirpusio deguonies nustatymo prietaisas.

f) Centrifuga.

II.2.2. Mineralinės terpės ruošimas

Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2.

Sumaišoma 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilama po 1 ml (b)–(d) tirpalų ir skiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro.

II.2.3. Užkrato ruošimas ir pradinis kondicionavimas

Užkratą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyviojo dumblo; nuotekų ištakių; paviršinio vandens; dirvožemio arba mišinių iš šių šaltinių.

Žr. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ir I.6.5.

II.2.4. Kolbų ruošimas

Pavyzdžiui, į atskiras 2 l kūgines kolbas įpilama po 800 ml mineralinės terpės ir pakankamą tūrį bandomosios ir etaloninės medžiagos pradinių tirpalų, kad ekvivalentinė IOA koncentracija būtų 10–40 mg/l. Patikrinama pH vertė ir prireikus nustatoma lygi 7,4. Įdedama į kolbas užkrato iš aktyviojo dumblo arba kito šaltinio (žr. I.6.4), kad galutinė suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija būtų ne didesnė kaip 30 mg/l. Taip pat paruošiamas užkrato tirpalo mineralinėje terpėje kontrolinis bandinys, kuriame nebūtų bandomosios arba etaloninės medžiagos.

Jei reikia, vienas indas naudojamas patikrinti galimam bandomosios medžiagos inhibuojamajam poveikiui, į panašios koncentracijos bandomosios ir etaloninės medžiagų tirpalą mineralinėje terpėje įdėjus užkrato.

Be to, jei reikia, paruošiama dar viena sterili kolba su bandomąja medžiaga be užkrato, kad galėtumėte nustatyti, ar vyksta bandomosios medžiagos abiotinis skaidymas (žr. I.6.6).

Papildomai, jei kyla įtarimas, kad bandomąją medžiagą žymiai adsorbuoja stiklas, dumblas ir t. t., atliekamas parengiamasis įvertinimas galimam adsorbcijos laipsniui nustatyti ir kartu bandymo tinkamumui šiai bandomajai medžiagai (žr. 1 lentelę). Paruošiama kolba su bandomąja medžiaga, užkratu ir sterilizavimo agentu.

Visi tirpalai kolbose skiedžiami mineraline terpe iki 1 l ir, tirpalus sumaišius, iš kiekvienos kolbos paimamas bandinys IOA pradinei koncentracijai nustatyti (žr. II.4 priedą). Kolbų angos uždengiamos, pvz., aliuminio folija, taip, kad tarp kolbos ir ją supančios aplinkos būtų laisvo oro apykaita. Bandymas prasideda įstačius kolbas į purtyklę.

II.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle

1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija

3 ir 4 kolba: užkrato tuščiasis bandymas

5 kolba: procedūros (atlikimo eigos) tikrinimo bandymas

ir pageidautina, kai būtina:

6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandymas

7 kolba: adsorbcijos kontrolinis bandymas

8 kolba: toksiškumo kontrolinis bandymas

Žr. taip pat I.6.7.

II.2.6. Bandymų eiga

Visą bandymo laiką, žinomais laiko tarpais, bet pakankamai dažnai, kad galima būtų nustatyti 10 parų lango pradžią ir šalinimo procentinę vertę 10 parų lango pabaigoje, kiekvienoje kolboje po du kartus nustatoma IOA koncentracija. Imamas tik mažiausias bandomosios suspensijos tūris, būtinas kiekvienam nustatymui.

Jei būtina, prieš imant bandinį, kompensuojami garavimo iš kolbų nuostoliai, įpilant reikiamą kiekį skiedimo vandens (I.6.1). Prieš imant bandinį, reikia gerai sumaišyti kultivuojamą terpę ir užtikrinti, kad prieš bandinio ėmimą ant kolbos sienelių prilipusi medžiaga būtų ištirpinta ar suspenduota. Paėmus bandinį, jis iš karto filtruojamas pro membraninį filtrą arba centrifuguojamas (žr. II.4 priedą). Nufiltruoti arba centrifuguoti bandiniai analizuojami tą pačią dieną arba laikomi 2–4°C temperatūroje ne ilgiau kaip 48 h, jei ilgiau – žemesnėje kaip -18°C temperatūroje.

II.3. DUOMENYS IR ATASKAITA

II.3.1. Rezultatų apdorojimas

Apskaičiuojama skaidymo procentinė vertė laiku t, kaip nurodyta I.7.1 (IOA nustatymas), ir neprivalomai – kaip I.7.2 (specifinė analizė).

Visi rezultatai užrašomi pateiktose specifikacijose.

II.3.2. Rezultatų tinkamumas

Žr. I.5.2.

II.3.3. Ataskaita

Žr. I.8.

II.4. SPECIFIKACIJA

Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.

IOA IŠNYKIMO BANDYMAS

1. LABORATORIJA

2. BANDYMŲ PRADŽIOS DATA

3. BANDOMOJI MEDŽIAGA

Pavadinimas:

Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l, kaip cheminės medžiagos

Pradinė koncentracija terpėje, t0: mg/l, kaip cheminės medžiagos

4. UŽKRATAS

Šaltinis:

Kaip apdorota:

Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:

Suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l

5. ANGLIES NUSTATYMAS

Anglies analizatorius:

3493-28

8. SPECIFINĖ CHEMINĖ ANALIZĖ (neprivaloma)

Bandomosios medžiagos likutinis kiekis bandymo pabaigoje, mg/l

% pirminio skaidymo

Sterilus kontrolinis bandymas

S_b

Bandymo terpė su užkratu

S_a

S^b-S^a

S^b

= Í 100

III dalis. MODIFIkuotas OECD atrankos bandymas (B metodas)

III.1. metodo esmė

Į išmatuotą mineralinės terpės tūrį su žinoma bandomosios medžiagos koncentracija (nuo 10 iki 40 mg/l IOA), kuri nominaliai yra vienintelis organinės anglies šaltinis, įpilama užkrato 0,5 ml 1 l terpės. Mišinys yra aeruojamas tamsoje ar išsklaidytoje šviesoje 22 ± 2°C temperatūroje.

Skaidymas sekamas 28 paras, trumpais intervalais atliekant IOA analizę. Biologinio skaidymo laipsnis skaičiuojamas pašalintos IOA koncentraciją (pataisyta dėl IOA koncentracijos užkrato tuščiajame kontroliniame bandinyje) išreiškiant pradinės koncentracijos procentine dalimi. Pradinio biologinio skaidymo laipsnį galima skaičiuoti pagal papildomą cheminę analizę, daromą inkubavimo pradžioje ir pabaigoje.

III.2. METODO APRAŠYMAS

III.2.1. Prietaisai

a) Kūginės kolbos, pvz., nuo 250 ml iki 2 litrų, talpa parenkama priklausomai nuo IOA analizei reikalingo tūrio.

b) Mechaninė purtyklė skirta kūginėms kolboms įstatyti, kuri būtų arba su automatiniu termostatavimu, arba naudojama patalpoje su pastovia temperatūra, ir pakankamo galingumo, kad visose kolbose galima būtų palaikyti aerobines sąlygas.

c) Filtravimo aparatas su tinkamomis membranomis.

d) IOA analizatorius.

e) Ištirpusio deguonies nustatymo aparatas.

f) Centrifuga.

III.2.2. Mineralinės terpės ruošimas

Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2.

Sumaišoma 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilama po 1 ml (b)–(d) tirpalų ir skiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro.

Šiame metode užkratu naudojama tik 0,5 ml ištakio/litre, ir todėl gali tekti didinti terpės mikroelementų ir augimo faktorių koncentraciją. Tai daroma įpilant po 1 ml kiekvieno šių tirpalų vienam terpės tūrio litrui.

Mikroelementų tirpalas:

Mangano sulfatas, tetrahidratas, MnSO₄ 4H₂O	39,9 mg
Boro rūgštis, H₃BO₃	57,2 mg
Zinko sulfatas, heptahidratas, ZnSO₄ 7H₂O	42,8 mg
Amonio heptamolibdatas (NH₄)₆Mo₇O₂₄	34,7 mg
Fe-chelatas (FeCl₃ ir etilendiamintetraacto rūgštis)	100,0 mg
Ištirpinkite skiedimo vandenyje ir praskieskite juo iki 1000 ml.
Vitaminų tirpalas:
Mielių ekstraktas	15,0 mg

Mielių ekstraktas ištirpinamas 100 ml vandens. Sterilizuojamas filtruojant pro 0,2 μm membraną arba pagaminamas šviežiai.

III.2.3. Užkrato ruošimas ir pradinis kondicionavimas

Užkratas ruošiamas iš nuotekų valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio, valančio daugiausia buitines nuotekas, antrinio ištakio, žr. I.6.4.2 ir I.6.5.

Naudojama 0,5 ml vienam litrui mineralinės terpės.

III.2.4. Kolbų ruošimas

Pavyzdžiui, į atskiras 2 l talpos kūgines kolbas įpilama po 800 ml mineralinės terpės ir toks tūris bandomosios ir etaloninės medžiagos pradinių tirpalų, kad ekvivalentinė IOA koncentracija būtų 10–40 mg/l. Patikrinama pH vertė ir prireikus nustatoma lygi 7,4. Įdedama į kolbas po 0,5 ml/l užkrato iš nuotekų ištakio (žr. I.6.4.2). Taip pat paruošiamas užkrato mineralinėje terpėje kontrolinis tirpalas, kuriame nebūtų bandomosios arba etaloninės medžiagos.

Jei reikia, vienas indas naudojamas patikrinti galimam bandomosios medžiagos inhibuojamajam veikimui, į panašios koncentracijos bandomosios ir etaloninės medžiagų tirpalą mineralinėje terpėje įdedamas užkratas.

Be to, jei reikia, paruošiama dar viena sterili kolba su bandomąja medžiaga be užkrato, kad galima būtų nustatyti, ar vyksta bandomosios medžiagos abiotinis skaidymas (žr. I.6.6).

Visi tirpalai kolbose skiedžiami mineraline terpe iki 1 l, išmaišomi ir iš kiekvienos kolbos paimamas bandinys IOA pradinei koncentracijai nustatyti (žr. II.4 priedą). Kolbų angos uždengiamos, pvz., aliuminio folija, taip, kad tarp kolbos ir ją supančios aplinkos būtų laisvo oro apykaita. Tuomet bandymui pradėti kolbos įstatomos į purtyklę.

III.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle

1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija

3 ir 4 kolba: sėjimo kultūros tuščiasis bandymas

5 kolba: procedūros tikrinimo bandymas

ir, pageidautina, kai būtina:

6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandymas

7 kolba: adsorbcijos kontrolinis bandymas

8 kolba: toksiškumo kontrolinis bandymas

Žr. taip pat I.6.7.

III.2.6. Bandymų eiga

Visą bandymą žinomais laiko intervalais, bet pakankamai dažnai, kad galima būtų nustatyti 10 parų lango pradžią ir procentinę šalinimo vertę 10 parų lango pabaigoje, nustatoma IOA koncentracija kiekvienoje kolboje po du kartus. Imamas tik minimalus kiekvienam nustatymui būtinas bandomosios suspensijos tūris.

Jei būtina, prieš imant bandinį, kompensuojami garavimo iš kolbų nuostoliai, įpilant reikiamą kiekį skiedimo vandens (I.6.1). Prieš imant bandinį, gerai sumaišoma kultūros terpė ir užtikrinama, kad prieš bandinio ėmimą ant kolbos sienelių prilipusi medžiaga būtų ištirpinta ar suspenduota. Paėmus bandinį, jis iš karto filtruojamas pro membraninį filtrą ar centrifuguojamas (žr. II.4 priedą). Nufiltruoti ar centrifuguoti bandiniai analizuojami tą pačią dieną arba laikomi 2–4°C temperatūroje ne ilgiau kaip 48 h, jei ilgiau – žemesnėje kaip -18°C temperatūroje.

III.3. DUOMENYS IR ATASKAITA

III.3.1. Rezultatų apdorojimas

Apskaičiuojama skaidymo procentinė vertė laiku t, kaip nurodyta I.7.1 (IOA nustatymas), ir neprivalomai, kaip nurodyta I.7.2 (specifinė analizė).

Visi rezultatai užrašomi pateiktose specifikacijose.

III.3.2. Rezultatų validumas (teisėtumas)

Žr. I.5.2.

III.3.3. Ataskaita

Žr. I.8.

III.4. SPECIFIKACIJA

Žemiau pateiktas specifikacijos pavyzdys.

MODIFIKUOTAS OECD ATRANKOS BANDYMAS

1. LABORATORIJA

2. BANDYMO PRADŽIOS DATA

3. BANDOMOJI MEDŽIAGA

Pavadinimas:

Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l, kaip cheminės medžiagos

Pradinė koncentracija terpėje, t0: mg/l, kaip cheminės medžiagos

4. UŽKRATAS

Šaltinis:

Kaip apdorota:

Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:

Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l

5. ANGLIES NUSTATYMAS

Anglies analizatorius:

7. ABIOTINIO SKAIDYMO KONTROLINIS BANDYMAS (neprivalomas)

	Trukmė (paros)
	0	t
Sterilus kontrolinis bandymas, IOA koncentracija (mg/l)	C_s(0)	C_s(t)

8. SPECIFINĖ CHEMINĖ ANALIZĖ (neprivaloma)

Bandomosios medžiagos likutinis kiekis bandymo pabaigoje, mg/l

% pirminio skaidymo

Sterilus kontrolinis bandymas

S_b

Bandymo terpė su užkratu

S_a

S^b-S^a

S^b

= Í 100

IV dalis. CO₂ SUSiDArymo bandymas (C metodas)

IV.1. metodo esmė

Žinomas mineralinės terpės su užkratu tūris, kuriame kaip vienintelis nominalus organinės anglies šaltinis yra žinomos koncentracijos bandomoji cheminė medžiaga (10–20 mg IOA/l arba BOA/l), tamsoje ar išsklaidytoje šviesoje yra aeruojamas, reguliuojamu greičiu barbotuojant anglies dioksido neturintį orą. Skaidymas stebimas 28 paras, nustatant susidariusio anglies dioksido kiekį, sugeriamo bario arba natrio hidroksidu, kuris matuojamas titruojant likusį hidroksido kiekį arba kaip neorganinė anglis. Iš bandomosios cheminės medžiagos susidariusio anglies dioksido kiekis (pataisytas atimant anglies dioksido, susidariusio tuščiajame bandinyje su sėjimo kultūra, kiekį) yra skaičiuojamas kaip procentinė TCO₂ vertė. Kitu būdu biologinio skaidymo laipsnį galima skaičiuoti nustatant papildomą IOA kiekį inkubavimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje.

IV.2. METODO APRAŠYMAS

IV.2.1. Aparatūra

a) 2–5 litrų talpos kolbos, kiekviena su aeravimo vamzdeliu, siekiančiu beveik indo dugną, ir išleidimo anga.

b) Magnetiniai maišikliai, kai vertinamos mažai tirpios cheminės medžiagos.

c) Dujų sugėrimo kolbos.

d) Įtaisas reguliuoti ir matuoti oro srautą.

e) Prietaisas anglies dioksidui išplauti, kuriuo ruošiamas oras, neturintis anglies dioksido; pagal kitą būdą galima naudoti iš balionų tiekiamu CO₂ neturinčio deguonies ir CO₂ neturinčio azoto mišinį, dujas maišant teisingu santykiu (20% O₂: 80% N₂).

f) Įtaisas anglies dioksidui nustatyti titravimo būdu arba kokio nors tipo neorganinės anglies analizatorius.

g) Membraninio filtravimo įtaisas (neprivalomas).

f) IOA analizatorius (neprivalomas).

IV.2.2. Mineralinės terpės ruošimas

Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2.

Sumaišoma 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilama po 1 ml (b)–(d) tirpalų ir skiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro.

IV.2.3. Užkrato ruošimas ir pradinis kondicionavimas

Užkratą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyviojo dumblo; nuotekų ištakių; paviršinio vandens; dirvožemio ar mišinių iš šių šaltinių.

Žr. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ir I.6.5.

IV.2.4. Kolbų ruošimas

Kaip pavyzdys, žemiau nurodomi tūriai ir masės 5 litrų kolboms su 3 l suspensijos. Jei naudojami mažesni tūriai, atitinkamai keičiami kiekiai, tačiau reikia užtikrinti, kad būtų galima tiksliai išmatuoti susidariusio anglies dioksido kiekį.

Į kiekvieną 5 litrų kolbą įpilama 2400 ml mineralinės terpės. Įpilamas atitinkamas tūris paruošto aktyviojo dumblo (žr. I.6.4.1 ir I.6.5), kad suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija mišinio su užkratu galutiniame 3 l tūryje būtų ne didesnė kaip 30 mg/l. Kitas būdas, kai paruoštas dumblas iš pradžių skiedžiamas mineralinėje terpėje, paruošiant 500–1000 mg/l suspensiją, po to kartotinis šios suspensijos tūris pilamas į 5 litrų kolbos turinį, kad koncentracija būtų 30 mg/l; tai užtikrina didesnį preciziškumą. Galima naudoti kitus užkrato šaltinius (žr. I.6.4.2).

Per naktį šie mišiniai su užkratu aeruojami CO₂ neturinčiu oru, kad iš sistemos būtų išvalytas anglies dioksidas.

Į vienas lygiagrečiam bandymui skirtas kolbas atskirai įpilami bandomosios ir etaloninės medžiagų žinomi pradinių tirpalų tūriai taip, kad, įdėjus šių medžiagų, būtų gautos nuo 10 iki 20 mg IOA/l arba BOA/l koncentracijos; į kitas kolbas šių medžiagų nededama ir šios kolbos naudojamos kaip užkrato kontroliniai bandymai. Mažai tirpios medžiagos dedamos tiesiai į kolbas pagal masę arba tūrį arba daroma, kaip aprašyta III priede.

Jei reikia, viena kolba naudojama bandomosios medžiagos galimam inhibuojamajam veikimui tikrinti, į ją įdedama ir bandomosios, ir etaloninės medžiagų, kurių koncentracija turi būti tokia pat, kaip ir kitose kolbose.

Be to, jei reikia patikrinti, ar nevyksta bandomosios cheminės medžiagos abiotinis skaidymas, reikia turėti sterilią kolbą su bandomąja chemine medžiaga be užkrato (žr. I.6.6). Sterilizuojama įdėjus atitinkamos koncentracijos nuodingos medžiagos (sterilizavimo agento).

Suspensijos visose kolbose skiedžiamos iki 3 l. Įpilama mineralinės terpės, kuri prieš tai buvo aeruojama CO2 neturinčiu oru. Neprivaloma, bet galima paimti bandinius IOA analizei (žr. II.4 priedą) ir specifinei analizei. Prie kolbų oro išleidimo angų prijungiamos dujų sugėrimo kolbos.

Jei naudojamas bario hidroksidas, prie kiekvienos 5 l kolbos nuosekliai prijungiama po tris dujų sugėrimo kolbas, kurių kiekvienoje turi būti 100 ml 0,0125 M bario hidroksido tirpalo. Tirpale neturi būti sulfato ir karbonato nuosėdų ir jo koncentracija turi būti nustatyta prieš pat tirpalo naudojimą. Jei naudojamas natrio hidroksidas, jungiamos dvi gaudyklės, antroji turi būti kontrolinė, siekiant parodyti, kad visas anglies dioksidas buvo absorbuotas pirmoje gaudyklėje. Tinka dujų sugėrimo kolbos, uždarytos serumo butelių kamščiais. Į kiekvieną kolbą įpilama 200 ml 0,05 M natrio hidroksido tirpalo, kurio pakanka sugerti visą kiekį anglies dioksido, susidariusio visiškai suskaidant bandomąją medžiagą. Natrio hidroksido tirpalas, net šviežiai paruoštas, turi karbonatų pėdsakų; pataisa padaroma, atimant tuščiajame bandinyje susidariusio karbonato kiekį.

IV.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle

1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija

3 ir 4 kolba: užkrato tuščiasis bandymas

5 kolba: procedūros (atlikimo eigos) tikrinimo bandymas

ir, pageidautina, kai būtina:

6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandymas

7 kolba: toksiškumo kontrolinis bandymas

Žr. taip pat I.6.7.

IV.2.6. Bandymų eiga

Bandymas pradedamas pro suspensiją barbotuojant 30–100 ml/min oro srautą be CO₂. CO₂ nustatyti periodiškai imami anglies dioksido absorbento bandiniai. Norint identifikuoti 10 parų lango periodą, rekomenduojama pirmąsias dešimt dienų analizę daryti kas antrą arba trečią dieną, o po to iki 28 paros – kas penktą dieną.

28 parą imami bandiniai (neprivalomai) IOA ir (arba) specifinei analizei, išmatuojamos suspensijų pH vertės ir į kiekvieną kolbą įpilama po 1 ml koncentruotos druskos rūgšties; aeruojama per naktį, kad iš bandomųjų suspensijų būtų pašalintas anglies dioksidas. 29 parą atliekama paskutinė išsiskyrusio anglies dioksido analizė.

CO2 matavimo dieną atjungiamas arčiausiai kolbos prijungtas absorberis su bario hidroksidu, ir bario hidroksido tirpalas titruojamas 0,05 M HCl tirpalu, indikatoriumi naudojamas fenolftaleinas. Likusieji absorberiai perkeliami per vieną vietą arčiau kolbos ir kitame nuosekliai sujungtų absorberių gale prijungiamas naujas absorberis su 100 ml šviežio 0,0125 M bario hidroksido. Titruojama, kai tai būtina, pvz., kai pirmojoje gaudyklėje matyti daug nuosėdų, bet jų dar nėra antroje, arba bent kartą per savaitę. Iš kitos pusės, jei absorbentu naudojamas NaOH, švirkštu iš arčiau kolbos stovinčio absorberio paimamas nedidelis natrio hidroksido tirpalo bandinys (tai priklauso nuo naudojamo anglies analizatoriaus charakteristikų). Bandinys turi būti purškiamas inžektoriumi į anglies analizatoriaus neorganinės anglies reakcinį indą (NA dalį), kad galima būtų tiesiogiai nustatyti išsiskyrusį anglies dioksidą.

Antrosios gaudyklės turinys analizuojamas tik bandymo pabaigoje, kad būtų galima padaryti pataisą dėl galimo anglies dioksido išnešimo.

IV.3. DUOMENYS IR ATASKAITA

IV.3.1. Rezultatų apdorojimas

Absorberyje sugerto CO₂ kiekis nustatomas pagal tokią titravimo formulę:

mg CO₂ = (100 × C_B – 0,5 × V × C_A) × 44

čia:

V = 100 ml absorberio turinio titruoti sunaudotos HC1 tūris (ml),

C_B = bario hidroksido tirpalo koncentracija (M),

C_A = druskos rūgšties tirpalo koncentracija (M),

jei C_B lygi 0,0125 M ir C_A lygi 0,05 M, 100 ml bario hidroksido tirpalui titruoti reikia 50 ml, ir CO₂ masė nustatoma pagal lygtį:

× 44 × ml HC1 sunaudoto titravimui = 1,1 × ml HC1

Taigi šiuo atveju titravimui sunaudoto HC1 tūrio perskaičiavimo į susidariusio CO₂ mg daugiklis yra 1,1.

Naudojant atitinkamas titravimo vertes, apskaičiuojamos vien iš užkrato bei iš užkrato ir bandomosios cheminės medžiagos gautos CO₂ masės, ir šių masių skirtumas yra masė CO₂, susidariusio vien tik iš bandomosios cheminės medžiagos.

Pavyzdžiui, jei užkrato bandinio titravimas duoda 48 ml, o užkrato ir bandomosios cheminės medžiagos bandinio titravimas duoda 45 ml,

CO₂ iš užkrato = 1,1 × (50-48) = 2,2 mg

CO₂ iš užkrato ir bandomosios cheminės medžiagos = 1,1 x (50-45) = 5,5 mg

taigi iš bandomosios cheminės medžiagos susidariusio CO₂ masė lygi 3,3 mg.

Procentinė biologinio skaidymo vertė skaičiuojama pagal formulę:

arba

3,67 yra anglies masės perskaičiavimo į anglies dvideginio masę (44/12) daugiklis.

Skaidymo po bet kurio laiko intervalo procentinė vertė gaunama pridedant procentines TCO2 vertes, apskaičiuotas kiekvienai parai, iki to laiko, kuriuo jis buvo išmatuotas.

Absorberiams su natrio hidroksidu susidariusio anglies dioksido kiekis, išreikštas NA(mg), skaičiuojamas dauginant NA koncentraciją absorbente iš absorbento tūrio.

Procentinė skaidymo vertė skaičiuojama pagal:

NA kolboje su bandomąja medžiaga (mg) – NA kolboje su tuščiuoju bandiniu (mg)

Apskaičiuojamas IOA šalinimas (neprivaloma), kaip aprašyta I.7. Užrašomi šie ir visi kiti rezultatai pridėtose specifikacijose.

IV.3.2. Rezultatų validumas (teisėtumas)

Bandomosios cheminės medžiagos suspensijos mineralinėje terpėje NA kiekis bandymo pradžioje turi būti mažesnis kaip 5% BA, ir tuščiajame bandinyje bandymo pabaigoje viso išsiskyrusio CO₂ kiekis paprastai neturi būti didesnis kaip 40 mg/l terpės. Jei gaunamos didesnės kaip 70 mg CO₂/litre vertės, duomenys ir eksperimento atlikimo eiga turi būti kritiškai ištirti.

Žr. taip pat I.5.2.

IV.3.3. Ataskaita

Žr. I.8.

IV.4. SPECIFIKACIJA

Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.

ANGLIES DIOKSIDO SUSIDARYMO BANDYMAS

1. LABORATORIJA

2. BANDYMO PRADŽIOS DATA

3. BANDOMOJI MEDŽIAGA

Pavadinimas:

Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l, kaip cheminės medžiagos

Pradinė koncentracija terpėje: mg/l, kaip cheminės medžiagos

Bendrasis į kolbą įdėtos C kiekis: mg C

TCO₂: mg CO₂

4. UŽKRATAS

Šaltinis:

Kaip apdorota:

Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:

Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l

5. ANGLIES DIOKSIDO SUSIDARYMAS IR SKAIDOMUMAS

Metodas: Ba(OH)₂/NaOH/kitas

6. ANGLIES ANALIZĖ (neprivaloma)

Anglies analizatorius:

Laikas (paros)	Tuščiasis bandinys, mg/l	Bandomoji cheminė medžiaga, mg/l
0	C_b(0)	C₀
28*	C_b(t)	C₁
* ar inkubavimo pabaigoje

7. ABIOTINIS SKAIDYMAS (neprivalomas)

v dalis. MANOMETRInis RESPIROMETRinis bandymas (D metodas)

V. I. METODO ESMĖ

Išmatuotas mineralinės terpės su užkratu tūris, turintis žinomos koncentracijos bandomąją cheminę medžiagą (100 mg/litre bandomosios medžiagos, duodančios ne mažiau kaip 50–100 mg TDS/litre), kuri nominaliai yra vienintelis organinės anglies šaltinis, pastovioje temperatūroje (± 1oC ar tiksliau) maišomas graduotoje kolboje iki 28 parų. Deguonies suvartojimas nustatomas arba matuojant deguonies (elektrolitiškai pagaminto) kiekį, kurio reikia pastoviam dujų tūriui respirometro kolboje palaikyti, arba pagal tūrio arba slėgio (arba abiejų kartu) kitimą aparate. Išsiskyręs anglies dioksidas sugeriamas kalio hidroksido tirpalu ar kitu tinkamu absorbentu. Bandomąja chemine medžiaga suvartoto deguonies kiekis (darant pataisą deguonies kiekiui, suvartotam lygiagrečiai daromame tuščiajame bandyme su užkratu) yra reiškiamas procentine TDS arba ChDS verte. Neprivalomai iš papildomos specifinės analizės, kuri atliekama bandymo pradžioje ir pabaigoje, duomenų galima apskaičiuoti pirminį biologinį skaidymą, o darant IOA analizę, – biologinį suskaidymą.

V.2. METODO APRAŠYMAS

V.2.1. Aparatūra

a) tinkamas respirometras;

b) termostatas, palaikantis temperatūrą ± 1°C tikslumu;

c) membraninio filtravimo įrenginys (neprivalomas);

d) anglies analizatorius (neprivalomas).

V.2.2. Mineralinės terpės ruošimas

Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2.

Sumaišoma 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilama po 1 ml (b)–(d) tirpalų ir praskiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro.

V.2.3. Užkrato ruošimas ir pradinis kondicionavimas

Užkratą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyviojo dumblo; nuotekų ištakių; paviršinio vandens; dirvožemio ar mišinių iš šių šaltinių.

Žr. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ir I.6.5.

V.2.4. Kolbų ruošimas

Pradinius tirpalus skiedžiant mineraline terpe, paruošiamos atskiros serijos bandomosios ir etaloninės cheminių medžiagų tirpalų, kuriuose šių medžiagų koncentracija turėtų būti 100 mg/litre (kad TDS būtų ne mažiau kaip 50–100 mg/litre).

TDS skaičiuojamas pagal amonio druskų susidarymą, jei nesitikima nitrifikavimo, kada skaičiuoti reikia pagal nitratų susidarymą (žr. II.2 priedą).

Pamatuojamos pH vertės ir prireikus nustatoma 7,4 ± 0,2 vertė.

Mažai tirpios medžiagos turi būti pridedamos vėlesniame etape (žr. žemiau).

Jei reikia nustatyti bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą, ruošiamas dar vienas tirpalas mineralinėje terpėje, kuriame būtų ir bandomoji, ir etaloninė medžiaga tokios koncentracijos, kokios yra atskiruose tirpaluose.

Jei reikia matuoti fizikocheminį deguonies suvartojimą, ruošiamas bandomosios cheminės medžiagos tirpalas, paprastai 100 mg TDS/litre, kuris buvo sterilizuotas pridedant tinkamos nuodingos medžiagos (sterilizavimo agento) (žr. I.6.6.).

Bandomosios ir etaloninės medžiagų reikiami tirpalų tūriai įpilami atitinkamai bent į dvi kolbas. Į kitas kolbas įpilama tik mineralinės terpės (užkrato kontroliniai bandymai) ir, jei reikia, maišyto bandomosios ir etaloninės cheminių medžiagų tirpalo ir sterilaus tirpalo.

Jei bandomoji medžiaga mažai tirpi, dėkite jos pagal masę arba tūrį tiesiai šioje pakopoje arba apdorokite, kaip aprašyta III priede. Į CO₂ – absorberio sekcijas įpilkite kalio hidroksido, natrio kalkių granulių ar kito absorbento.

V.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle

1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija

3 ir 4 kolba: užkrato tuščiasis bandymas

5 kolba: procedūros (atlikimo eigos) tikrinimo bandymas

ir, pageidautina, kai būtina:

6 kolba: sterilus kontrolinis bandymas

7 kolba: toksiškumo kontrolinis bandymas

Žr. taip pat I.6.7.

V.2.6. Bandymų eiga

Leidžiama kolboms pasiekti tinkamą temperatūrą ir į atitinkamas kolbas įdedama tiek užkrato iš paruošto aktyviojo dumblo arba kitokio jo šaltinio, kad suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija būtų ne didesnė kaip 30 mg/litre. Surenkama įranga, įjungiamas maišiklis, patikrinamas hermetiškumas ir pradedama matuoti deguonies suvartojimą. Paprastai toliau prižiūrėti nereikia, išskyrus tai, kad užrašomi būtini rodmenys ir daromi kasdieniniai patikrinimai, ar teisinga temperatūra ir atitinkamas maišymas.

Pagal dažnai ir reguliariais tarpais užrašomus rodmenis skaičiuojamas deguonies suvartojimas (taikomi įrangos gamintojo nurodyti metodai). Inkubavimo pabaigoje, paprastai po 28 parų, matuojamas kolbų tūrinio pH, ypač jei deguonies suvartojimas yra mažas arba didesnis nei TDSNH (azoto turintiems junginiams).

Jei reikia, bandymo pradžioje ir pabaigoje iš respirometrinių kolbų imami bandiniai IOA analizei arba specifinei cheminei analizei (žr. II.4 priedą). Imant bandymo pradžioje, reikia užtikrinti, kad kolboje likusios bandomosios suspensijos tūris būtų žinomas. Kai deguonį vartoja azoto turinti bandomoji medžiaga, nustatomas nitrito ir nitrato koncentracijų didėjimas per 28 paras ir apskaičiuojama pataisa dėl deguonies, suvartoto nitrifikavimui (V priedas).

V.3. DUOMENYS IR ATASKAITA

V.3.1. Rezultatų apdorojimas

Padalijamas kiekis (mg) deguonies, suvartoto bandomajai cheminei medžiagai per tam tikrą laiką (pataisytą kiekiu deguonies, suvartoto per tą patį laiką tuščiajame užkrato bandinyje) iš paimtos bandomosios cheminės medžiagos masės. Taip gaunamas BDS, skaičiuojamas mg deguonies/mg bandomosios cheminės medžiagos, taigi:

biologinio skaidymo procentinė vertė skaičiuojama pagal:

arba pagal:

Reikia pažymėti, kad šie du metodai nebūtinai duoda tą pačią vertę; geriau naudoti pirmąjį metodą.

Azoto turinčioms medžiagoms naudojamos atitinkamos TDS vertės (NH ar NO pagal tai, kas yra žinoma apie nitrifikavimo galimybę ar ko iš jo laukiama (II.2 priedas). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisos nitrifikuoti suvartotam deguoniui turi būti skaičiuojamos pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (V priedas).

Kai atliekama neprivaloma organinės anglies ir (arba) specifinė analizė, apskaičiuojama skaidymo procentinė vertė, kaip tai aprašyta I.7.

Visi rezultatai užrašomi į pridedamas specifikacijas.

V.3.2. Rezultatų validumas (teisėtumas)

Paprastai deguonies suvartojimas sėjimo kultūros tuščiajame bandinyje per 28 paras yra 20–30 mg O2/litre ir neturi būti didesnis kaip 60 mg/litre. Jei vertės didesnės kaip 60 mg/litre, būtina kritiškai ištirti duomenis ir eksperimento atlikimo eigą. Jei pH vertė nepatenka į 6–8,5 intervalą, o bandomoji medžiaga deguonies suvartoja mažiau kaip 60%, bandymas turi būti pakartotas su mažesne bandomosios medžiagos koncentracija.

Žr. I.5.2.

V.3.3. Ataskaita

Žr. I.8.

V.4. SPECIFIKACIJA

Toliau pateikiamas specifikacijos pavyzdys.

MANOMETRINĖS RESPIROMETRIJOS BANDYMAS

1. LABORATORIJA

2. BANDYMO PRADŽIOS DATA

3. BANDOMOJI MEDŽIAGA

Pavadinimas:

Pradinio tirpalo koncentracija: mg/litre

Pradinė koncentracija terpėje, C0: mg/litre

Tūris bandymų kolboje (V): ml

TDS arba ChDS: mg O2/mg bandomosios medžiagos (NH ar NO)

4. UŽKRATAS

Šaltinis:

Kaip apdorota:

Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:

Suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l

5. DEGUONIES SUVARTOJIMAS: BIOLOGINIS SKAIDOMUMAS

3493-38

6. PATAISA DĖL NITRIFIKAVIMO (žr. V priedą)

	Para	0	28	Skirtumas
(i)	Nitrato koncentracija (mg N/litre)			(N)
(ii)	Deguonies ekvivalentas (4,57 × N × V) (mg)	–	–
(iii)	Nitrito koncentracija (mg N/litre)			(N)
(iv)	Deguonies ekvivalentas (3,43 × N × V) (mg)	–	–
(ii + iv)	Bendrasis deguonies ekvivalentas	–	–

7. ANGLIES ANALIZĖ (neprivaloma)

Anglies analizatorius:

Laikas (paros)	Tuščiasis bandinys, mg/l	Bandomoji cheminė medžiaga, mg/l
0	C_b(0)	C₀
28*	C_b(t)	C₁
* ar inkubavimo pabaigoje

8. SPECIFINĖ CHEMINĖ ANALIZĖ (neprivaloma)

Bandomosios medžiagos likutinis kiekis bandymo pabaigoje, mg/l

% pirminio skaidymo

Sterilus kontrolinis bandymas

Bandymo terpė su užkratu

S^b-S^a

S^b

= Í 100

Sb = koncentracija po fizikocheminių pakitimų (steriliame) kontroliniame bandyme po 28 parų.

Sa = koncentracija kolboje su užkratu po 28 parų.

9. ABIOTInis skaidymas (neprivalomas)

a = deguonies suvartojimas steriliose kolbose po 28 parų, (mg)

deguonies suvartojimas mg bandomosios cheminės medžiagos =. (žr. 1 ir 3 skyrius)

VI dalis. uždarytos kolbos bandymas (E metodas)

VI.1. BANDYMŲ METODO ESMĖ

Į bandomosios cheminės medžiagos tirpalą mineralinėje terpėje, paprastai 2–5 mg/litre, įnešamas užkratas, turintis palyginti mažai mikroorganizmų iš mišrios populiacijos, ir laikomas tamsoje, visiškai pilnose ir uždarytose kolbose pastovios temperatūros sąlygomis. Skaidymas sekamas 28 paras, analizuojant ištirpusį deguonį. Bandomąja medžiaga suvartotas deguonies kiekis, padarius pataisą deguoniui, suvartotam lygiagrečiai daromame tuščiajame bandyme tik su užkratu, yra išreiškiamas procentine TDS arba ChDS verte.

VI.2. METODO APRAŠYMAS

Vl.2.1. Aparatūra

a) BDS kolbos, su šlifo kamščiais, pvz., 250–300 ml.

b) Vandens vonia arba inkubatorius kolboms laikyti pastovioje temperatūroje (± 1°C) ir be apšvietimo.

c) Didelės stiklinės kolbos (2–5 litrų) terpei ruošti ir BDS kolboms pildyti.

d) Deguonies elektrodas ir matuoklis arba įranga ir reagentai titruoti Winkler’io metodu.

VI.2.2. Mineralinės terpės ruošimas

Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2.

Sumaišoma po 1 (vieną) ml (a)–(d) tirpalų ir praskiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro.

VI.2.3. Užkrato ruošimas

Užkratas paprastai gaunamas iš nuotekų valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio, į kuriuos daugiausia patenka buitinės nuotekos, antrinio ištakio. Alternatyvus užkrato šaltinis yra paviršinis vanduo. Paprastai 1 litrui terpės naudojama nuo vieno lašo (0,05 ml) iki 5 ml filtrato; gali tekti daryti bandymus, kad būtų nustatytas tam tikram ištakiui optimalus tūris (žr. I.6.4.2 ir I.6.5).

VI.2.4. Kolbų ruošimas

Mineralinė terpė stipriai aeruojama ne mažiau kaip 20 min. Kiekviena bandymų serija daroma su mineraline terpe, pagaminta vienoje partijoje. Paprastai terpė yra tinkama naudoti po 20 h laikymo bandymo temperatūroje. Kontrolės tikslams nustatoma ištirpusio deguonies koncentracija; jo vertė 20°C temperatūroje turi būti apie 9 mg/litre. Visi oru prisotintos terpės pernešimo ir užpildymo veiksmai turi būti daromi taip, kad nesusidarytų oro burbuliukai, pvz., naudojami sifonai.

Lygiagrečiai paruošiamos BDS kolbų grupės bandomajai ir etaloninei cheminei medžiagai nustatyti, tuo pat metu daromų bandymų serijose. Paruošiamas būtinas skaičius BDS kolbų, įskaitant kolbas tuščiajam bandymui su užkratu, kad galima būtų atlikti ne mažiau kaip po du deguonies suvartojimo matavimus tinkamais laiko tarpais, pvz., po 0, 7, 14, 21 ir 28 parų. Norint užtikrinti galimybę identifikuoti 10 parų langą, kolbų gali reikėti ir daugiau.

Į dideles kolbas įpilama visiškai aeruotos mineralinės terpės, kad ji užimtų maždaug trečdalį kolbos tūrio. Tuomet į atskiras dideles kolbas įpilamas reikiamas kiekis bandomosios ir etaloninės cheminių medžiagų pradinių tirpalų taip, kad galutinė cheminių medžiagų koncentracija būtų ne didesnė kaip 10 mg/litre. Į kolbą su tuščiojo kontrolinio bandinio terpe cheminių medžiagų nededama.

Norint užtikrinti, kad užkrato aktyvumas nebūtų ribojamas, deguonies koncentracija BDS kolbose neturi sumažėti daugiau kaip iki 0,5 mg/litre. Tai nustato maždaug 2 mg/litre bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos ribą. Tačiau sunkiai skaidomų junginių ir tų junginių, kurių TDS mažas, koncentracija gali būti 5–10 mg/litre. Kai kuriais atvejais reikia daryti lygiagrečias bandymų serijas su dviem bandomosios cheminės medžiagos koncentracijomis, pvz., 2 ir 5 mg/litre. Paprastai TDS skaičiuojama remiantis amonio druskų susidarymu, tačiau, jei manoma arba žinoma, kad gali vykti nitrifikavimas, skaičiuojama remiantis nitrato susidarymu (TDSNO3: žr. II.2 priedą). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisos nitrifikuoti suvartotam deguoniui skaičiuojamos pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (V priedas).

Jei turi būti ištirtas bandomosios medžiagos toksiškumas (pvz., jei anksčiau buvo nustatytos mažos biologinio skaidomumo vertės), reikia turėti dar vieną kolbų seriją.

Paruošiama dar viena didelė kolba, kurioje būtų aeruota mineralinė terpė (maždaug trečdalis kolbos tūrio) ir bandomoji bei etaloninė cheminės medžiagos, kurių galutinė koncentracija būtų tokia pati, kaip ir kitose didelėse kolbose.

Į tirpalus didelėse kolbose įpilama užkrato iš antrinio ištakio (nuo vieno lašo arba apie 0,05 ml iki 5 ml/litre) arba iš kito šaltinio, pvz., upės vandens (žr. I.6.4.2). Pabaigoje tirpalai skiedžiami aeruota mineraline terpe iki žymės ant kolbos, naudojant į jos dugną nuleistą žarną, kad būtų pasiektas pakankamas maišymas.

VI.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle

Tipiškame bandyme naudojamos tokios kolbos:

ne mažiau kaip 10 su bandomąja chemine medžiaga ir užkratu (bandomoji suspensija),

ne mažiau kaip 10 tik su užkratu (tuščiasis užkrato bandymas),

ne mažiau kaip 10 su etalonine chemine medžiaga ir užkratu (procedūros tikrinimo bandymas),

ir, jei būtina,

6 kolbos su bandomąja chemine medžiaga, etalonine chemine medžiaga ir užkratu (toksiškumo kontrolinis bandymas).

Tačiau, norint užtikrinti galimybę įdentifikuoti 10 parų langą, kolbų reikėtų maždaug du kartus daugiau.

VI.2.6. Bandymų eiga

Naudojant žarną, nuleistą į apatinį atitinkamos didelės kolbos ketvirtį (ne į dugną), iš karto išpilstomas kiekvienas paruoštas tirpalas į atitinkamą BDS kolbų grupę, taip kad visos BDS kolbos būtų visiškai užpildytos. Kolbos švelniai patapšnojamos, kad būtų pašalinti visi oro burbuliukai. Taikant Winkler’io arba elektrometrinį metodą, kolbose nustatoma pradinė deguonies koncentracija. Kolbų turinį galima išsaugoti vėlesnei analizei Winkler’io metodu, pridedant mangano (II) sulfato ir natrio hidroksido (pirmasis Winkler’io reagentas). Gerai užkimštos kolbos su deguonimi, surištu į rudą mangano (III) hidratuotą oksidą, laikomos tamsoje 10–20°C temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas, prieš darant likusius veiksmus pagal Winkler’io metodą. Likusios lygiagrečiai paruoštos kolbos užkemšamos taip, kad į jas nepatektų oro burbuliukų, ir inkubuojamos tamsoje 20°C temperatūroje. Kiekvieną seriją turi lydėti pilna lygiagreti serija, skirta tuščiojo bandinio terpės su užkratu analizei. Paimama iš kiekvienos serijos ne mažiau kaip po dvi kolbas ištirpusio deguonies analizei tam tikrais laiko tarpais (bent kas savaitę) per 28 inkubavimo paras.

Savaitiniai bandiniai turi leisti įvertinti šalinimo procentinę vertę 14 parų lange, tuo tarpu bandinių analizė kas 3–4 paras turi leisti identifikuoti 10 parų langą, o tam reikėtų maždaug du kartus daugiau kolbų.

Azoto turinčioms medžiagoms turi būti daroma pataisa dėl deguonies suvartojimo bet kokiame nitrifikavimo procese. Tai padaryti taikomas O₂ – elektrodo metodas ištirpusio deguonies koncentracijai nustatyti, o po to iš BDS kolbos paimamas bandinys nitrito ir nitrato analizei. Pagal nitrito ir nitrato koncentracijos padidėjimą apskaičiuojamas suvartotas deguonis (žr. V priedą).

VI.3. DUOMENYS IR ATASKAITA

VI.3.1. Rezultatų apdorojimas

Iš pradžių apskaičiuojamas BDS, kuris susikaupia po kiekvieno laiko periodo, atimant deguonies suvartojimo tuščiajame bandinyje vertę (mg O2/litre) iš deguonies suvartojimo bandomajai medžiagai. Atstojamoji BDS vertė gaunama pataisytą suvartojimo vertę padalijus iš bandomosios medžiagos koncentracijos (mg/litre) ir kuri skaičiuojama mg deguonies vienam mg bandomosios cheminės medžiagos. Biologinio skaidomumo procentinė vertė skaičiuojama dalinant atstojamąjį BDS iš TDS atstojamosios (apskaičiuoto pagal II.2 priedą) arba ChDS (nustatyto analizės būdu, žr. II.3 priedą), taigi:

Reikia pažymėti, kad šie du metodai nebūtinai duoda tą pačią vertę; geriau naudoti pirmąjį metodą.

Azoto turinčioms medžiagoms naudojamos atitinkamos TDS vertės (NH ar NO) pagal tai, kas yra žinoma apie nitrifikavimo galimybę arba ko iš jo laukiama (II.2 priedas). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisos nitrifikavimui suvartotam deguoniui skaičiuojamos pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (V priedas).

VI.3.2. Rezultatų validumas (teisėtumas)

Deguonies suvartojimas tuščiajame bandinyje su užkratu po 28 parų turi būti ne didesnis kaip 1,5 mg/litre ištirpusio deguonies. Jei vertės didesnės, reikia tikrinti bandymo atlikimo eigą. Likutinė deguonies koncentracija bet kuriuo momentu bandymo kolbose neturi sumažėti iki mažesnio nei 0,5 mg/litre lygio. Tokių mažų deguonies lygių nustatymas yra validus tik tokiu atveju, jei ištirpusio deguonies nustatymo metodu įmanoma tiksliai juos matuoti.

Žr. taip pat I.5.2.

Vl.3.3. Ataskaita

Žr. I.8.

VI.4. SPECIFIKACIJA

Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.

UŽDARYTOS KOLBOS BANDYMAS

1. LABORATORIJA

2. BANDYMO PRADŽIOS DATA

3. BANDOMOJI MEDŽIAGA

Pavadinimas:

Pradinio tirpalo koncentracija: mg/litre

Pradinė koncentracija kolboje: mg/litre

TDS ar ChDS: mg O2/mg bandomosios medžiagos

4. UŽKRATAS

Šaltinis:

Kaip apdorota:

Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:

Koncentracija reakcijos mišinyje: mg/litre

5. ID NUSTATYMAS

Metodas: Winkler’io arba elektrometrinis

Kolbų turinio analizė

3493-42

6. PATAISA DĖL NITRIFIKAVIMO (žr. V priedą)

Inkubavimo trukmė (paros)		n₁	n₂	n₃
(i)	Nitrato koncentracija (mg N/litre)
(ii)	Nitrato koncentracijos pokytis (mg N/litre)
(iii)	Deguonies ekvivalentas (mg/litre)
(iv)	Nitrito koncentracija (mg N/litre)
(v)	Nitrito koncentracijos pokytis (mg N/litre)
(vi)	Deguonies ekvivalentas (mg/litre)
(iii + vi)	Bendrasis deguonies ekvivalentas (mg/litre)

7. ID SuVARTOJiMAS% SKAIDYMO

3493-43

* Jei tarp lygiagrečių nustatymų yra didelis skirtumas, vidutinės vertės neskaičiuokite.

m_t0 = vertė bandymo kolboje laiku 0

m_tx= vertė bandymo kolboje laiku x

m_b0= tuščiojo bandymo vidutinė vertė laiku 0

m_bx = tuščiojo bandymo vidutinė vertė laiku x

Taip pat darykite pataisą dėl nitrifikavimo, naudodami 6 skyriaus iii + vi.

8. IŠTIRPUSIO DEGUONIES (ID) sUVARTOJIMAS TUŠČIAME BANDINYJE

Deguonies suvartojimas tuščiajame bandyme: (m_b0 – m_b28) mg/litre. Šis suvartojimas svarbus bandymo validumui. Suvartojimas turi būti mažesnis kaip 1,5 mg/litre.

VII dalis. M. I. T. I. bandymas (F metodas)

VII.1. metodo esmė

Deguonies suvartojimas maišomu bandomosios medžiagos tirpalu ar suspensija mineralinėje terpėje, į kurį dedama specialiai auginta neadaptuotų mikroorganizmų kultūra, 28 paras automatiškai matuojamas tamsoje ir 25 ± 1°C temperatūroje laikomame uždarame respirometre. Išsiskyręs anglies dioksidas absorbuojamas natrio kalkėmis. Biologinis skaidomumas reiškiamas deguonies suvartojimo (pataisyto dėl suvartojimo tuščiajame bandinyje) procentine teorinio suvartojimo (TDS) dalimi. Be to, pirminio biologinio skaidomumo procentinė vertė skaičiuojama pagal papildomos specifinės cheminės analizės, daromos inkubavimo pradžioje ir pabaigoje, duomenis ir neprivalomai pagal IOA analizės duomenis.

VII.2. METODO APRAŠYMAS

VII.2.1. Aparatūra

a) Automatinis elektrolitinis BDS matuoklis ar respirometras. paprastai su 6 kolbomis, kurių kiekvienos tūris 300 ml, ir su indu CO2 absorbentui laikyti.

b) Patalpa su pastovia temperatūra ir (arba) vandens vonia 25°C ± 1°C ar geriau.

c) Membraninio filtravimo įrenginys (neprivalomas).

d) Anglies analizatorius (neprivalomas).

VII.2.2. Mineralinės terpės ruošimas

Paruošiami šie pradiniai tirpalai, naudojant analiziškai grynus reagentus ir vandenį (I.6.1):

a) Kalio dihidrofosfatas, KH₂PO₄	8,50 g
Kalio hidrofosfatas, K₂HPO₄	21,75 g
Natrio hidrofosfatas, dodekahidratas, Na₂HPO₄ 12H₂O	44,60 g
Amonio chloridas, NH4Cl	0,50 g
Ištirpinami vandenyje ir praskiedžiami iki 1 litro.
Tirpalo pH turi būti 7,2.
b) Magnio sulfatas, heptahidratas, MgSO₄ 7H₂O	22,50 g
Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro.
c) Kalcio chloridas, bevandenis, CaCl₂	27,50 g
Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro.
d) Geležies (III) chloridas, heksahidratas, FeCl₃ 6H₂O	0,25 g

Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro.

Imama po 3 ml kiekvieno (a), (b), (c) ir (d) tirpalų ir praskiedžiama iki 1 litro.

VII.2.3. Užkrato ruošimas

Surenkami švieži bandiniai ne mažiau kaip iš dešimties vietų, daugiausia iš tokių, kuriose naudojamos ir šalinamos įvairios cheminės medžiagos. Iš įvairiausių vietų, pvz., nuotekų valymo įrenginių, pramoninių nuotekų valymo įrenginių, upių, ežerų, jūrų, surenkama po 1 l dumblo, paviršiaus dirvožemio, vandens ir t. t. bandinių ir po to jie supilami į vieną bendrą indą ir gerai sumaišomi. Pašalinamos paviršiuje plaukiojančios medžiagos ir paliekama nusistoti, po to natrio hidroksidu ar fosforo rūgštimi nustatoma skysčio virš nuosėdų pH vertė 7 ± 1.

Atitinkamas filtruoto skysčio virš nuosėdų tūris naudojamas užpildyti aktyviojo dumblo užpildymo ir išleidimo (fill-and-draw) indą ir aeruojamas skystis maždaug 23½ h. Trisdešimt minučių po aeravimo pabaigos maždaug trečdalis viso skysčio virš nuosėdų išpilamas lauk ir ant nusodintos medžiagos užpilamas toks pat tūris tirpalo (pH 7), kuriame būtų po 0,1% gliukozės, peptono ir kalio dihidrofosfato, ir vėl aeruojama. Kartojama ši procedūra kartą per dieną. Dumblo įrenginys turi būti eksploatuojamas laikantis geros praktikos rodiklių: ištakiai turi būti skaidrūs, turi būti palaikoma 25 ± 2°C temperatūra, pH turi būti 7 ± 1, dumblas turi gerai nusistoti, turi būti pakankamas aeravimas, kad mišinys visą laiką būtų aerobinis, pirmuonių ir dumblo aktyvumas turi būti tikrinamas pagal etaloninę medžiagą bent kas tris mėnesius. Dumblo kaip sėjamos kultūros negalima naudoti anksčiau kaip po mėnesio nuo proceso pradžios, bet ne vėliau kaip po keturių mėnesių. Po to reikia imti bandinius bent iš 10 vietų reguliariais laiko tarpais, kartą per tris mėnesius.

Norint, kad senojo ir naujojo dumblo aktyvumas būtų toks pat, reikia sumaišyti vienodus tūrius filtruoto skysčio virš naudojamo aktyviojo dumblo ir filtruoto skysčio virš šviežiai surinkto dešimties šaltinių mišinio ir auginti mikroorganizmus supiltuose skysčiuose, kaip tai aprašyta aukščiau. Reikia dumblą naudoti kaip užkrato kultūrą 18–24 h po to, kai įrenginys buvo įkrautas.

VII.2.4. Kolbų ruošimas

Paruošiamos šešios kolbos:

Nr. 1: bandomosios cheminės medžiagos tirpalas skiedimo vandenyje, 100 mg/l

Nr. 2, 3 ir 4: bandomosios cheminės medžiagos tirpalas mineralinėje terpėje, 100 mg/l

Nr. 5: etaloninės cheminės medžiagos (pvz., anilino) tirpalas mineralinėje terpėje, 100 mg/l

Nr. 6: tik mineralinė terpė

Mažai tirpios medžiagos dedamos pagal masę, pagal tūrį arba apdorotos, kaip aprašyta III priede, išskyrus tai, kad neturi būti naudojami nei tirpikliai, nei emulsikliai. Į visas kolbas įleidžiama specialiuose induose įdėto CO₂ absorbento. Kolbose Nr. 2, 3 ir 4 nustatoma pH vertė 7,0.

VII.2.5. Bandymų eiga

Į kolbas Nr. 2, 3 ir 4 (bandomosios suspensijos), Nr. 5 (aktyvumo kontrolinis bandinys) ir Nr. 6 (tuščiasis bandinys su užkrato kultūra) įpilama po mažą tūrį užkrato kultūros, kad suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija būtų 30 mg/l. Užkrato kultūros nededama į kolbą Nr. 1, kurioje yra abiotinio skaidymo kontrolinis bandinys. Surinkus įrangą, patikrinus hermetiškumą, įjungiamos maišyklės ir matuojamas deguonies suvartojimas tamsoje. Kiekvieną dieną tikrinama temperatūra, maišyklė ir kulonometrinis deguonies suvartojimo registravimo įrenginys bei stebimi bet kokie kolbų turinio spalvos pakitimai. Deguonies suvartojimo rodmenys šešioms kolboms registruojami tiesiogiai tinkamu metodu, pvz., šešių taškų savirašiu, rašančiu BDS kreivę. Inkubavimo pabaigoje, kuris paprastai tęsiamas 28 paras, išmatuojamas kolbų turinio pH ir nustatoma likusios bandomosios medžiagos ir kiekvieno tarpinio produkto koncentracija, o vandenyje tirpios medžiagos – IOA koncentracija (II.4 priedas). Reikia imtis ypatingų priemonių lakiųjų cheminių medžiagų atveju. Jei gali vykti nitrifikavimas, reikia nustatyti nitrito ir nitrato koncentraciją, jei tai įmanoma.

VII.3. DUOMENYS IR ATASKAITA

VII.3.1. Rezultatų apdorojimas

Deguonies kiekį (mg), suvartotą bandomajai cheminei medžiagai per tam tikrą laiką ir pataisytą kiekiu deguonies, suvartoto per tą patį laiką tuščiajame sėjimo kultūros bandinyje, padalijus iš paimtos bandomosios cheminės medžiagos masės, skaičiuojamas BDS, mg deguonies/mg bandomosios medžiagos, taigi:

Mišiniams TDS skaičiuojama pagal elementinę analizę, kaip paprastam junginiui, naudojant atitinkamas TDS (TDSNH ar TDSNO) vertes pagal tai, ar nitrifikavimas nevyksta, ar jis yra visiškas (II.2 priedas). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisos nitrifikuoti suvartotam deguoniui skaičiuojamos pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (V priedas).

Pirminio biologinio skaidymo procentinė vertė skaičiuojama pagal specifinės (pradinės) cheminės medžiagos kiekio mažėjimą (žr. I.7.2).

Ataskaitoje reikia nurodyti, jei sumažėjo bandomosios medžiagos koncentracija kolboje Nr. 1, kurioje matuojamas fizikocheminis pašalinimas. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija (S_b) šioje kolboje po 28 parų naudojama apskaičiuoti biologinio skaidymo procentinę vertę.

Kai nustatoma IOA (neprivaloma), biologinio suskaidymo procentinė vertė apskaičiuojama pagal,

Dt =

kaip aprašyta I.7.1 punkte. Jei kolboje Nr. 1, kurioje matuojamas fizikocheminis IOA šalinimas, IOA kiekis sumažėjo, IOA koncentracija šioje kolboje naudojama apskaičiuoti biologinio skaidymo procentinę vertę.

Visi rezultatai užrašomi pateiktose specifikacijose.

VII.3.2. Rezultatų validumas (teisėtumas)

Paprastai deguonies suvartojimas užkrato tuščiajame bandinyje per 28 paras yra 20–30 mg O2/litre ir neturi būti didesnis kaip 60 mg/litre. Jei vertės didesnės kaip 60 mg/litre, būtina kritiškai ištirti duomenis ir bandymo atlikimo eigą. Jei pH vertė nepatenka į 6–8,5 intervalą, o bandomoji medžiaga deguonies suvartoja mažiau kaip 60%, bandymas turi būti pakartotas su mažesne bandomosios medžiagos koncentracija.

Žr. taip pat I.5.2.

Jei anilino skaidymo procentinė vertė, apskaičiuota pagal deguonies suvartojimą, po 7 parų ne didesnė kaip 40% ir po 14 parų ne didesnė kaip 65%, laikoma, kad bandymas nevalidus.

VII.3.3. Ataskaita

Žr. I.8.

VII.4. SPECIFIKACIJA

Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.

MITI (I) BANDYMAS

1. LABORATORIJA

2. BANDYMO PRADŽIOS DATA

3. BANDOMOJI MEDŽIAGA

Pavadinimas:

Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l kaip cheminės medžiagos

Pradinė koncentracija terpėje, C₀: mg/l kaip cheminės medžiagos

Reakcijos mišinio tūris, V: ml

TDS: mg O₂/l

4. UŽKRATO KULTŪRA

Dumblo bandinių ėmimo vietos:

1)...	6)...
2)...	7)...
3)...	8)...
4)...	9)...
5)...	10)...

Suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija aktyviajame dumble po aklimatizavimo sintetinėmis nuotekomis =... mg/l

Aktyviojo dumblo tūris vienam litrui galutinai paruoštos terpės =... ml

Dumblo koncentracija galutinai paruoštoje terpėje =... mg/l

5. DEGUONIES SUVARTOJIMAS: BIOLOGINIS SKAIDOMUMAS

Naudoto respirometro tipas:

3493-46

6. ANGLIES ANALIZĖ (neprivaloma):

Anglies analizatorius:

Kolba		IOA				Pašalintos IOA%		Vidutinė vertė
		Matuota		Pataisyta
	Vanduo + bandomoji medžiaga		a				–		–
	Dumblas + bandomoji medžiaga		b₁		b₁-c
	Dumblas + bandomoji medžiaga		b₂		b₂-c
	Dumblas + bandomoji medžiaga		b₃		b₃-c
	Kontrolinis tuščiasis bandymas		c		–		–		–

7. SPECIFINĖS CHEMINĖS ANALIZĖS DUOMENYS

	Likutinis bandomosios medžiagos kiekis bandymo pabaigoje	Skaidymo%
Tuščiasis bandymas su vandeniu	S_b
Terpė su užkrato kultūra	S_a1
	S_a2
	S_a3

skaidymo%



Apskaičiuojamas skaidymo %, atitinkamai, kolbose a1, a2 ir a3.

8. PASTABa

Turi būti pridedama BDS kitimo laike kreivė, jei yra.

I priedas

SANTRUMPOS IR APIBRĖŽIMAI

ID: Ištirpęs deguonis (mg/l) yra vandeniniame bandinyje ištirpusio deguonies koncentracija.

BDS: Biocheminis deguonies suvartojimas (g) yra deguonies kiekis, kurį suvartoja mikroorganizmai, įsisavindami bandomąją medžiagą; taip pat skaičiuojamas g suvartoto deguonies 1g bandomosios medžiagos (žr. BDS metodą).

ChDS: Cheminis deguonies suvartojimas (g) yra deguonies kiekis, suvartotas bandomąją medžiagą oksiduojant karštu, rūgščiu bichromato tirpalu; ChDS yra turimo oksiduojamos medžiagos kiekio matas; taip pat skaičiuojamas g deguonies, suvartoto 1g bandomosios medžiagos (žr. ChDS metodą).

IOA: Ištirpusi organinė anglis yra organinė anglis tirpale arba organinė anglis, kuri praeina per 0,45 μm filtrą arba lieka skystyje virš nuosėdų po 15 min centrifugavimo 40000 m·s² (apie 4000 g) pagreičiu.

TDS: Teorinis deguonies suvartojimas (mg) yra bendras deguonies kiekis, kurio reikia visiškai oksiduoti cheminę medžiagą; jis skaičiuojamas pagal molekulinę formulę (žr. II.2 priedą), dar kitaip skaičiuojamas mg deguonies, suvartojamo oksiduoti 1 mg bandomosios medžiagos.

TCO₂: Teorinis anglies dioksido kiekis (mg) yra apskaičiuotas anglies dioksido, kuris susidaro iš žinomo ar išmatuoto anglies kiekio bandomojoje medžiagoje, kai ji visiškai mineralizuojama, kiekis; taip pat skaičiuojamas mg anglies dioksido, kuris susidaro iš 1 mg bandomosios medžiagos.

BOA: Bendroji bandinio organinė anglis yra ištirpusios ir suspenduotos organinės anglies kiekių suma.

NA: Neorganinės anglies kiekis.

BA: Bendrasis anglies kiekis yra bandinio organinės ir neorganinės anglies bendras kiekis.

Pirminis biologinis skaidymas:

yra biologiškai veikiamos medžiagos cheminės sandaros pokytis, kai ji netenka tai medžiagai būdingų savybių.

Biologinis suskaidymas (aerobinis):

tai pasiektas skaidymo lygis, kai mikroorganizmai bandomąją medžiagą visiškai suvartoja, susidarant anglies dioksidui, vandeniui, mineralinėms druskoms ir naujoms mikrobiologinėms ląstelinėms sudedamosioms dalims (biomasei).

Lengvai biologiškai skaidomas:

cheminių medžiagų, kurioms buvo daromi kai kurie apibrėžti atrankos pagal biologinį skaidymą bandymai, sutartinis klasifikavimas; šie bandymai yra tokie tikslūs, kad laikoma, kad vandens terpėse aerobinėmis sąlygomis tokie junginiai greitai ir visiškai biologiškai suyra.

Natūraliai biologiškai skaidomas:

cheminių medžiagų, apie kurių biologinį suskaidymą (pirminį ar visišką) bet kokiame pripažintame biologinio skaidomumo bandyme yra neabejotinų duomenų, klasifikavimas.

Apdorojamumas:

yra galimybė medžiagas paversti šalinamais junginiais biologinio nuotekų valymo metu, neigiamai neveikiant normalios valymo procesų eigos. Dažniausiai lengvai biologiškai skaidomos medžiagos yra tinkamos apdoroti, bet ne visi junginiai iš prigimties yra biologiškai skaidomi. Gali vykti ir abiotiniai procesai.

Vėlavimo trukmė – Lag laikas:

yra laikas nuo sėjimo kultūros įdėjimo IOA išnykimo bandyme iki skaidymo procentinė vertė pasiekia bent 10%. Vėlavimo trukmė dažnai yra labai kintamas dydis ir jo atkuriamumas blogas.

Skaidymo trukmė:

yra laikas nuo vėlavimo Lag laikotarpio pabaigos iki to laiko, kai skaidymas pasiekia 90% didžiausios vertės lygį.

10-parų langas:

10 parų iš karto po to, kai skaidymo vertė pasiekė 10%.

II priedas

atitinkamų BENDRŲJŲ PARAMETRŲ SKAIČIAVIMAS IR NUSTATYMAS

Nuo pasirinkto metodo priklauso, kokie bus reikalingi bendrieji parametrai. Šiame skyriuje aprašomas šių dydžių išvedimas. Šių parametrų taikymas aprašomas atskirai kiekviename metode.

1. Anglies kiekis

Anglies kiekis skaičiuojamas pagal žinomą cheminę sudėtį arba nustatomas bandomosios medžiagos elementine analize.

2. Teorinis deguonies suvartojimas (TDS)

Teorinis deguonies suvartojimas (TDS) gali būti apskaičiuotas, jei žinoma elementinė sudėtis, arba jis gali būti nustatytas, atliekant elementinę analizę. Junginio:

C_cH_hCl_ClN_nNa_naO_oP_pS_s,

jei nitrifikavimas nevyksta,

arba

kai nitrifikavimas vyksta.

3. Cheminis deguonies suvartojimas (ChDS)

Cheminis deguonies suvartojimas (ChDS) nustatomas pagal „Cheminis deguonies suvartojimas“ metodą.

4. Ištirpusi organinė anglis (IOA)

Ištirpusi organinė anglis (IOA) pagal apibrėžimą yra bet kurios cheminės medžiagos arba medžiagų mišinio vandenyje organinė anglis, praeinanti per 0,45 μm filtrą.

Bandiniai iš bandymo indų siurbiami ir iš karto filtruojami filtravimo įtaisu, naudojant atitinkamą membraninį filtrą. Pirmieji 20 ml (kiekis gali būti mažesnis, kai naudojami maži filtrai) filtrato pilami lauk. 10–20 ml tūrio arba mažesni bandiniai, jei jie įpurškiami (tūris priklauso nuo anglies analizatoriui reikalingo tūrio) paliekama anglies kiekiui analizuoti. IOA koncentracija nustatoma organinės anglies analizatoriumi, kuriuo būtų galima tiksliai nustatyti anglies koncentraciją, atitinkančią 10% bandyme naudotos pradinės IOA koncentracijos arba mažesnę.

Filtruotus bandinius, kurių negalima analizuoti tą pačią darbo dieną, 48 h galima laikyti šaldytuve 2–4°C temperatūroje arba žemiau -18oC, jei laikoma ilgiau.

Pastabos:

Membraniniai filtrai, kad būtų hidrofiliški, dažnai impregnuojami paviršinio aktyvumo medžiagomis. Todėl filtre gali būti iki kelių mg ištirpusios organinės anglies, kuri trukdytų biologinio skaidomumo nustatymams. Paviršinio aktyvumo medžiagos ir kitos tirpios organinės medžiagos iš filtrų šalinamos, juos virinant tris kartus po vieną valandą dejonizuotame vandenyje. Filtrai toliau gali būti savaitę laikomi vandenyje. Jei naudojamos vienkartinės filtravimo tūtos, kiekviena partija turi būti patikrinta, norint įsitikinti, kad nesusidaro ištirpusi organinė anglis.

Atsižvelgiant į membraninio filtro tipą, bandomoji cheminė medžiaga gali būti sulaikyta dėl jos adsorbavimo. Todėl būtų patartina tikrinti, ar filtras neadsorbuoja cheminės medžiagos.

Kai norima lyginti BOA ir IOA, vietoj filtravimo gali būti taikomas 15 min. centrifugavimas 40000 m·sec-2 (4000 g) pagreičiu. Metodas nepatikimas, jei IOA pradinė koncentracija yra < 10 mg/l, nes arba pašalinamos ne visos bakterijos arba anglis vėl ištirpsta kaip bakterijų plazmos dalis.

NUORODOS

– Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, P 65.

– Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139.

– DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 – Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser– und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs– und Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Nonnenausschuß Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e. V.

– Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol 13 (1), 169.

III priedas

MAŽAI TIRPIŲ MEDŽIAGŲ BIOLOGINIO SKAIDOMUMO VERTINIMAS

Mažai tirpių medžiagų biologinio skaidomumo bandymuose ypatingas dėmesys turi būti kreipiamas į šiuos aspektus.

Jei homogeniniai skysčiai retai kelia bandinio ėmimo problemų, tai kietąsias medžiagas rekomenduojama homogenizuoti tinkamu būdu, kad būtų išvengta paklaidų dėl nehomogeniškumo. Reikalingos specialios atsargumo priemonės, kai reikia paimti kelių miligramų reprezentatyvius cheminių medžiagų mišinių ar daug priemaišų turinčių medžiagų bandinius.

Bandymuose galima taikyti įvairius maišymo būdus. Reikia stengtis užtikrinti tik tokį maišymą, kad medžiaga būtų disperguotos būsenos, ir vengti perkaitinimo, per didelio putojimo ir per didelių šlyties jėgų.

Galima naudoti emulsiklį, su kuriuo gaunama patvari cheminės medžiagos dispersija. Jis neturi būti nuodingas bakterijoms ir neturi būti biologiškai skaidomas ar bandymo sąlygomis sukelti putas.

Emulsikliams taikomi kriterijai tinka ir tirpikliams.

Kietosioms bandomosioms medžiagoms nerekomenduojama naudoti kietuosius nešiklius, tačiau jie gali tikti aliejingoms medžiagoms.

Kai naudojamos pagalbinės medžiagos, pvz., emulsikliai, tirpikliai ir nešikliai, turi būti atliekamas tuščiasis bandymas, kuriame būtų pagalbinė medžiaga.

Bet kuris iš trijų respirometrinių bandymų, CO₂, BDS, MITI, gali būti taikomas tirti mažai tirpių junginių biologinį skaidomumą.

NUORODOS

– de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, vol. 16, 833.

– Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water-soluble compounds. Chemosphere. 1984, vol. 13, 169.

IV priedas

CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ, KURIOS GALI BŪTI NUODINGOS UŽKRATUI, BIOLOGINIO SKAIDOMUMO VERTINIMAS

Kai tiriant cheminę medžiagą lengvo biologinio skaidomumo bandymuose paaiškėja, kad ji biologiškai neskaidoma, tai, jei norima atskirti, ar tai inhibuojamasis veikimas, ar medžiagos inertiškumas, rekomenduojama toliau aprašyta procedūra (Reynolds et al., 1987).

Toksiškumo ir biologinio skaidomumo bandymuose turi būti naudojamas panašus ar identiškas užkratas.

Norint įvertinti toksiškumą cheminių medžiagų, tiriamų lengvo biologinio skaidomumo bandymuose, tiktų, kaip manoma, atskirai ar kartu taikyti dumblo kvėpavimo intensyvumo inhibavimo (aktyviojo dumblo kvėpavimo inhibavimo bandymas – direktyva 88/302/EEC), BDS ir (arba) augimo inhibavimo metodus.

Manoma, kad, jei reikia išvengti inhibavimo dėl medžiagos toksiškumo, bandomųjų medžiagų, naudojamų lengvo biologinio skaidomumo bandymuose, koncentracija turėtų būti mažesnė nei 1/10 EC₅₀ vertės (ar mažesnė nei EC20 vertė), gautos toksiškumo bandymuose. Nepanašu, kad junginiai, kurių EC₅₀ vertė yra didesnė kaip 300 mg/l, būtų toksiški biologinio skaidomumo bandymuose.

Mažesnės kaip 20 mg/l EC₅₀ vertės greičiausiai turėtų kelti problemų toliau atliekamiems bandymams. Turi būti naudojamos mažos bandomosios koncentracijos, dėl to reikia taikyti tikslų ir jautrų uždarytos kolbos metodą arba naudoti ¹⁴C žymėtas mežiagas. Kitaip dar būtų galima naudoti aklimatizuotą užkratą, kuris galbūt leistų naudoti didesnės koncentracijos bandomąją medžiagą. Tačiau šiuo atveju prarandamas specifiškas lengvo biologinio skaidomumo bandymo kriterijus.

NUORODOS

– Reynolds, L. et al.. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 225.

V priedas

DEGUONIES SUVARTOJIMO PATAISA DĖL NITRIFIKAVIMO KELIAMŲ TRUKDŽIŲ

Jei nekreipiamas dėmesys į nitrifikavimą, kai biologinis skaidomumas vertinamas pagal deguonies suvartojimą bandomosiomis medžiagomis, tai paklaidos medžiagoms, kuriose nėra azoto, yra nežymios (ne didesnės kaip 5%), net jei terpės amonio azoto oksidavimas bandomojo ir tuščiojo bandymo induose vyksta nevienodai. Tačiau, jei bandomosios medžiagos turi azoto, paklaidos gali būti didelės.

Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau nevisiškas, stebimas deguonies suvartojimas reakcijos mišinyje gali būti pataisytas deguonies kiekiu, suvartotu amonio jonui oksiduoti į nitritą ir nitratą, jei nitrito ir nitrato koncentracijų pokytis inkubavimo metu nustatomas atsižvelgiant į tokias reakcijų lygtis:

2NH₄C1 + 3O₂ = 2HNO₂ + 2HC1 + 2H₂O	(1)
2HNO₂ + O₂= 2HNO₃	(2)

Suminė reakcija:
2NH4C1 + 4 O2 = 2HNO3 + 2HC1 + 2H2O	(3)

Pagal (1) lygtį 28 g azoto, kuris yra amonio chloride (NH₄Cl), oksiduoti į nitritą, reikia 96 g deguonies, t. y. daugiklis lygus 3,43 (96/28). Tokiu pat būdu pagal (3) lygtį 28 g azoto, kai jis oksiduojamas į nitratą, suvartoja 128 g deguonies, t. y. daugiklis lygus 4,57 (128/28).

Kadangi reakcijos yra nuoseklios ir vyksta dėl tam tikrų ir skirtingų bakterijų rūšių veiklos, įmanomas dalykas, kad nitrito koncentracija gali kaip didėti, taip ir mažėti; pastaruoju atveju susidarytų ekvivalentiškas kiekis nitrato. Taigi deguonies, suvartoto nitratui susidaryti, kiekis lygus 4,57 ir nitrato koncentracijos padidėjimo sandaugai, o deguonies kiekis nitritui susidaryti lygus 3,43 ir nitrito koncentracijos padidėjimo sandaugai arba -3,43 ir nitrito koncentracijos sumažėjimo sandaugai, kai nitrito koncentracija mažėja.

T. y.:

O₂ suvartotas nitratui susidaryti = 4,57 × nitrato koncentracijos padidėjimo	(4)
ir
O₂ suvartota nitritui susidaryti = 3,43 × nitrito koncentracijos padidėjimo	(5)
ir
O₂ netenkama dėl nitrito išnykimo = -3,43 × nitrito koncentracijos padidėjimo	(6)
Taigi
O₂ suvartojimas dėl nitrifikavimo = ± 3,43 × nitrito konc. pokyčio. + 4,57 × nitrato konc. padidėjimo	(7)
ir todėl
O₂, suvartotas C oksiduoti = bendrasis stebėtas suvartotas kiekis – nitrifikavimui suvartotas kiekis	(8)

Kitaip, jei nustatytas tik bendrasis oksiduoto azoto kiekis, tai kaip pirminė aproksimacija galima laikyti, kad deguonies suvartojimas dėl nitrifikavimo lygus 4,57 × oksiduoto N koncentracijos padidėjimo.

Toliau angliai oksiduoti suvartoto deguonies kiekio pataisyta vertė lyginama su TDS NH3 verte, kuri skaičiuojama II priede.

SKAIDYMAS – BIOCHEMINIS DEGUONIES SUVARTOJIMAS

1. METODAS

1.1. Įvadas

Šio metodo tikslas yra išmatuoti kietųjų arba skystųjų organinių medžiagų biocheminį deguonies suvartojimą (BDS).

Šiame bandyme gauti duomenys taikomi vandenyje tirpioms medžiagoms; tačiau taip pat galima bandyti bent iš esmės lakiąsias medžiagas arba medžiagas, kurios mažai tirpsta vandenyje.

Metodas tinka tik toms bandomosioms organinėms medžiagoms, kurios bandyme naudojamos koncentracijos, neinhibuotų bakterijų veiklos. Jei bandomoji medžiaga nėra tiek tirpi, kad galima būtų pasiekti bandymo koncentraciją, gerai bandomosios medžiagos dispersijai gauti galima taikyti specialias priemones, pvz., dispergavimą ultragarsu.

Kai reikia aiškinti mažas rezultatų vertes ir parinkti tinkamas bandomąsias koncentracijas, gali būti naudinga informacija apie cheminės medžiagos toksiškumą.

1.2. Apibrėžimas ir vienetai

BDS apibrėžiamas kaip kiekis vandenyje ištirpusio deguonies, suvartoto biocheminio oksidavimo procesui nustatytame tirpalo tūryje vykti apibrėžtomis sąlygomis.

Rezultatai skaičiuojami BDS gramais vienam gramui bandomosios medžiagos.

1.3. Etaloninės medžiagos

Pageidautina naudoti atitinkamą etaloninę medžiagą, skirtą tikrinti sėjimo kultūros aktyvumą.

1.4. Bandymų metodo esmė

Gerai aeruojamoje tinkamoje terpėje ištirpinta ar disperguota medžiaga, kurios kiekis žinomas, užkrečiama mikroorganizmų užkratu ir tamsoje inkubuojama apibrėžtos pastovios temperatūros sąlygomis.

BDS yra nustatomas pagal ištirpusio deguonies kiekio skirtumą bandymo pradžioje ir pabaigoje. Bandymo trukmė turi būti ne mažesnė kaip penkios paros ir ne didesnė kaip 28 paros.

Lygiagrečiai turi būti daromas nustatymas tuščiajame bandyme, kuriame nebūtų bandomosios medžiagos.

1.5. Kokybės kriterijai

Negalima laikyti, kad BDS nustatymas yra validus medžiagos biologinio skaidomumo nustatymas. Į šį bandymą galima žiūrėti tik kaip į atrankos bandymą.

1.6. Bandymų metodo aprašymas

Ruošiamas pradinis medžiagos tirpalas arba dispersija gauti BDS koncentracijai, atitinkančiai taikomą metodą. Tuomet pagal bet kurį atitinkamą nacionalinį arba tarptautinį standartizuotą metodą nustatomas BDS (LST EN 1899-2 nuoroda).

2. DUOMENYS IR ĮVERTINIMAS

BDS pradiniame tirpale skaičiuojamas pagal parinktą standartinį metodą ir verčiamas į BDS gramus vienam gramui bandomosios medžiagos.

3. ATASKAITA

Turi būti nurodytas taikytas metodas.

Biocheminis deguonies suvartojimas turi būti vidurkis bent trijų validžių matavimų.

Turi būti pateikta visa rezultatams aiškinti reikalinga informacija ir pastabos, ypač apie priemaišas, fizinę būseną, toksiškumo įtaką ir medžiagai būdingą sudėtį, kuri turėtų įtakos rezultatams.

Turi būti nurodyta, ar buvo naudotas priedas biologinio nitrifikavimo inhibavimui.

4. NUORODOS

Standartizuotų metodų sąrašas, pavyzdžiui:

– NF T 90 – 103: Determination of the biochemical oxygen demand.

– NBN 407: Biochemical oxygen demand.

– NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV).

– The determination of biochemical oxygen demand. Methods for the examination of water and associated materials, HMSO, London.

– LST EN 1899-2 Vandens kokybė. Biocheminio deguonies suvartojimo per n parų (BDSn) nustatymas. 2 dalis. Neskiestų mėginių metodas (ISO 5815: 1989, modifikuotas).

– ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.

SKAIDYMAS – CHEMINIS DEGUONIES SUVARTOJIMAS

1. METODAS

1.1. Įvadas

Šio metodo tikslas yra standartiniu, sutartu būdu išmatuoti kietųjų arba skystųjų organinių medžiagų cheminį deguonies suvartojimą (ChDS) nustatytomis laboratorinėmis sąlygomis.

Atliekant šį bandymą ir aiškinant gautus rezultatus, bus naudinga informacija apie bandomosios medžiagos sudėtį (pvz., halogenų druskos, organinių junginių geležies (II) druskos, chloro organiniai junginiai).

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

Cheminis deguonies suvartojimas yra medžiagos oksiduojamumo matas, reiškiamas oksidavimo agento, kurį suvartoja medžiaga nustatytomis laboratorinėmis sąlygomis, kiekiui ekvivalentiniu deguonies kiekiu.

Rezultatas skaičiuojamas ChDS gramais vienam gramui bandomosios medžiagos.

1.3. Etaloninės medžiagos

Nebūtina kiekvienu atveju, kai tiriama nauja medžiaga, naudoti etalonines medžiagas. Jos naudojamos, kai daroma metodo veiksmingumo patikra, ir, norint palyginti rezultatus, kurie buvo gauti, taikant kitus metodus.

1.4. Bandymų metodo esmė

Iš anksto nustatytas vandenyje ištirpintos arba disperguotos medžiagos kiekis dvi valandas oksiduojamas, virinant kalio bichromatu stipriai rūgščioje sieros rūgšties terpėje su sidabro sulfato katalizatoriumi, grįžtamuoju šaldytuvu. Likusio bichromato kiekis nustatomas, titruojant standartizuotu geležies (II) amonio sulfato tirpalu.

Jei medžiaga turi chloro, chlorido įtakai sumažinti dedama gyvsidabrio (II) sulfato^*.

1.5. Kokybės kriterijai

Dėl to, kad tai sutartinis nustatymo būdas, ChDS yra „oksiduojamumo indikatorius“ ir naudojamas kaip praktinis organinės medžiagos kiekio nustatymo metodas.

Bandyme gali trukdyti chloridas; taip pat, nustatant ChDS, gali trukdyti neorganinės redukuojančios ar oksiduojančios medžiagos.

Kai kurie cikliniai junginiai ir didelis skaičius lakiųjų medžiagų (pvz., mažesnės molekulinės masės sočiosios rūgštys) šiame bandyme nėra visiškai suoksiduojamos.

1.6. Bandymų metodo aprašymas

Ruošiamas preliminarusis medžiagos tirpalas arba suspensija ChDS vertei nuo 250 mg iki 600 mg litre gauti.

Pastabos:

Mažai tirpių ir nedisperguojamų medžiagų atveju galima pasverti tam tikrą kiekį į labai smulkius miltelius sumaltos medžiagos ar skystos medžiagos, atitinkančios maždaug 5 mg ChDS, ir įdėti ją į eksperimento indą su vandeniu.

Dažnai, ir ypač mažai tirpių medžiagų atveju, cheminį deguonies poreikį (ChDS) geriau nustatyti taikant metodo pakeitimą, t. y., uždaroje sistemoje su slėgio lygintuvu (H. Kelkenberg, 1975). Taikant šį metodo keitimą, galima sėkmingai kiekybiškai nustatyti kai kurias medžiagas, pvz., acto rūgštį, kurias standartiniu metodu nustatyti sunku. Tačiau ir šiuo metodu nepasiseka nustatyti piridino. Jei kalio bichromato koncentracija, kaip nurodyta (1) nuorodoje, padidinama iki 0,25 N (0,0416 M), palengvėja tiesioginis 5–10 mg medžiagos svėrimas, kas yra svarbu nustatant mažai vandenyje tirpių medžiagų ChDS ((2) nuoroda).

Paprastai ChDS nustatomas pagal bet kurį atitinkamą nacionalinį arba tarptautinį standartizuotą metodą (LST ISO 6060, nuoroda).

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Bandymų kolboje turimas ChDS skaičiuojamas pagal pasirinktą standartizuotą metodą ir verčiamas į ChDS gramus vienam gramui bandomosios medžiagos.

3. ATASKAITA

Turi būti nurodytas taikytas metodas.

Cheminis deguonies poreikis turi būti vidurkis bent trijų validžių matavimų. Turi būti pateikta visa rezultatams aiškinti reikalinga informacija ir pastabos, ypač apie priemaišas, fizinę būseną ir medžiagai būdingas savybes (jei žinomos), kurios turėtų įtakos rezultatams.

Ataskaitoje turi būti nurodyta apie gyvsidabrio (II) sulfato panaudojimą chlorido įtakai mažinti.

4. NUORODOS

(1) Kelkenberg, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, vol. 8, 146.

(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.

Sąrašas standartizuotų metodų, pavyzdžiui:

– NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen demand.

– ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate value) of polluted and waste waters.

– NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.

– DS 217 Water analysis: Determination of the chemical oxygen demand.

– DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg per litre.

– NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.

– LST ISO 6060 Vandens kokybė. Cheminio deguonies suvartojimo nustatymas (ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichromate methods).

SKAIDYMAS – ABIOTINIO HIDROLIZINIO SKAIDYMO KAIP pH FUNKCIJOS NUSTATYMAS

1. METODAS

Šis metodas remiasi OECD bandymo rekomendacijomis (1).

1.1. Įvadas

Hidrolizė yra svarbi reakcija, kuri reguliuoja (valdo) abiotinį skaidymą. Ši reakcija yra ypač svarbi medžiagoms, kurių biologinis skaidomumas yra mažas; ši reakcija gali turėti įtakos medžiagos išsilaikymui aplinkoje.

Daugiausia hidrolizės reakcijų yra pseudo pirmojo laipsnio, taigi jų puslaikio trukmė nepriklauso nuo koncentracijos. Todėl rezultatus, gautus su laboratorijoje naudojamomis koncentracijomis, paprastai galima ekstrapoliuoti į aplinkos sąlygas.

Be to, buvo paskelbta keletas pavyzdžių (2), kuriuose nurodoma, kad keliems cheminių medžiagų tipams sutapimas tarp rezultatų, gautų gryname vandenyje ir gamtiniuose vandenyse, yra pakankamai geras.

Bandymui atlikti yra naudinga turėti išankstinę informaciją apie cheminės medžiagos garų slėgį. Šis metodas taikytinas tik vandenyje tirpioms medžiagoms. Įtakos rezultatams gali turėti priemaišos.

Cheminių medžiagų elgesys hidrolizės reakcijoje turi būti tiriamas pH verčių sąlygomis, kurios atitiktų aplinkoje dažniausiai pasitaikančias sąlygas (pH nuo 4 iki 9).

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

Hidrolizės reakcija vadinama cheminės medžiagos RX reakcija su vandeniu. Šią reakciją galima pavaizduoti sumine X grupės mainų su OH grupe lygtimi:

RX + HOH " ROH + HX [1]

Greitis, kuriuo mažėja RX koncentracija, aprašomas lygtimi:

greitis = k × [H2O] × [RX] [2]

Kadangi vandens perteklius, lyginant su cheminės medžiagos kiekiu, yra labai didelis, šio tipo reakcija paprastai aprašoma kaip pseudo pirmojo laipsnio reakcija, kurioje stebimoji greičio konstanta išreiškiama lygtimi:

kobs = k × [H₂O] [3]

Ši konstanta vienai pH vertei ir vienai temperatūrai T gali būti rasta pagal lygtį:

[4]

čia:

t = laikas,

C₀= medžiagos koncentracija laike 0,

C_t = medžiagos koncentracija laike t, ir

2,303 = perėjimo nuo natūraliųjų prie dešimtainių logaritmų daugiklis.

Koncentracijos skaičiuojamos gramais litre arba moliais litre.

Šios konstantos kobs dimensija yra (laikas)-1.

Puslaikio trukmė t½ yra apibrėžiama kaip laikas, per kurį bandomosios medžiagos koncentracija sumažėja 50%, būtent:

C_t = ½ C₀ [5]

Taikant lygtis (4) ir (5), galima parodyti, kad:

t½ = 0,693/_kobs [6]

1.3. Etaloninės medžiagos

Nebūtina kiekvienu atveju, kai tiriama nauja medžiaga, naudoti etalonines medžiagas. Jas daugiausia reikia naudoti tuomet, kai daroma metodo veiksmingumo patikra, ir, lyginant rezultatus, kai taikomas kitas metodas.

Etaloninėmis medžiagomis buvo naudotos šios medžiagos (1):

Acetilsalicilo rūgštis (aspirinas).

Fosforotioninės rūgšties O, O-dietil O-(6-metil-2-(1-metiletil) 4-pirimidinil) esteris (Dimpilatas, diazinonas).

1.4. Bandymų metodo esmė

Ruošiamas nedidelės koncentracijos medžiagos tirpalas vandenyje; pH ir temperatūra kontroliuojami.

Medžiagos koncentracijos mažėjimas laike nustatomas taikant bet kokią tinkamą analizės metodiką.

Brėžiamas koncentracijos logaritmo kitimo laike grafikas ir, jei šis grafikas yra tiesė, pirmojo laipsnio reakcijos greičio konstantą galima apskaičiuoti pagal tiesės nuožulnumo koeficientą (žr. 1.2 punktą).

Jei konkrečiai temperatūrai greičio konstantos nustatyti tiesiogiai nėra galimybės, paprastai būna įmanoma greičio konstantą įvertinti taikant Arrhenius lygtį, kuri aprašo greičio konstantos priklausomybę nuo temperatūros. Tiesinę reakcijos greičio konstantos nuo atvirkštinės absoliučios temperatūros, K, priklausomybę galima ekstrapoliuoti į greičio konstantos vertę, kurios tiesiogiai išmatuoti neįmanoma.

1.5. Kokybės kriterijai

Nuorodoje (2) pranešama, kad 13 klasių organinių junginių hidrolizės greičio konstantas galima matuoti dideliu tikslumu.

Atkartojamumas ypač priklauso nuo pH ir temperatūros reguliavimo ir gali būti veikiamas mikroorganizmų buvimo bei tam tikrais atvejais – ištirpusio deguonies koncentracijos.

1.6. Bandymų metodo aprašymas

1.6.1. Reagentai

1.6.1.1. Buferiniai tirpalai

Bandymas daromas trijų pH verčių sąlygomis: 4,0, 7,0 ir 9,0.

Šiam tikslui turi būti ruošiami buferiniai tirpalai, naudojant analiziškai grynas chemines medžiagas ir distiliuotą arba dejonizuotą vandenį. Kai kurios buferinių tirpalų sistemos pateiktos priede.

Naudojama buferinė sistema gali turėti įtakos hidrolizės greičiui; jei tai yra akivaizdu, reikia naudoti kitą buferinę sistemą. Vietoje fosfatinio buferio (2) nuorodoje rekomenduojama naudoti borato ar acetato buferinį tirpalą.

Jei buferinių tirpalų pH vertė bandymų temperatūroje nėra žinoma, ji pasirinktoje temperatūroje gali būti išmatuota kalibruotu pH-metru ± 0,1 pH vieneto tikslumu.

1.6.1.2. Bandomieji tirpalai

Bandomoji medžiaga turi būti ištirpinta parinktame buferiniame tirpale ir jos koncentracija neturi būti didesnė kaip 0,01 M arba pusė sočiojo tirpalo koncentracijos priklausomai nuo to, kuri koncentracija yra mažesnė.

Naudoti su vandeniu susimaišančius organinius tirpiklius rekomenduojama tik mažai vandenyje tirpioms medžiagoms.

Tirpiklio kiekis turi būti mažesnis kaip 1% ir neturi trukdyti hidrolizės procesui.

1.6.2. Aparatūra

Turi būti naudojamos stiklinės kolbos su šlifo kamščiais, tačiau ant šlifo neturi būti tepalo.

Jei cheminė medžiaga arba buferinė sistema yra lakios arba jei bandymas daromas aukštesnėje temperatūroje, geriau naudoti užlydytus arba pertvara uždarytus mėgintuvėlius ir virš tirpalo reikia vengti tuščios erdvės.

1.6.3. Analitinis metodas

Metodas turi būti specifinis, kad būtų galima nustatyti bandomąją medžiagą bandyme naudojamos koncentracijos, ir jis gali būti tam tikras analitinių metodikų derinys.

Taikomas analitinis metodas priklauso nuo medžiagos prigimties ir turi būti pakankamai tikslus ir jautrus, kad būtų galima nustatyti pradinės koncentracijos mažėjimą 10%.

1.6.4. Bandymų sąlygos

Bandymai turi būti atliekami naudojat termostatuojamą kamerą arba vonią su pasirinkta pastovia temperatūra, nustatytą ± 0,5°C tikslumu. Temperatūra turi būti palaikoma ir matuojama ± 0,1°C tikslumu. Fotolizės trukdančios įtakos reikia vengti naudojant atitinkamas priemones.

Jei medžiagos lengvai oksiduojamos, būtina šalinti ištirpusį deguonį (pvz., prieš ruošiant tirpalą, 5 minutes barbotuoti azotą arba argoną).

1.6.5. Procedūra

1.6.5.1. Parengiamasis bandymas

Visoms medžiagoms 50 ± 0,5°C temperatūroje ir trims pH vertėms: 4,0, 7,0 ir 9,0 – turi būti atliekamas parengiamasis bandymas. Daroma pakankamai matavimų, kad 50°C temperatūroje kiekvienai pH vertei būtų galima įvertinti, ar puslaikio trukmė (t½) yra mažesnė kaip 2,4 valandos, ar po penkių parų išmatuotos hidrolizės laipsnis yra mažesnis kaip 10%. (Galima apytikriai apskaičiuoti, kad sąlygomis, labiau panašiomis į aplinkos sąlygas (25°C), šios vertės prilygtų puslaikio trukmei, atitinkamai, mažesnei nei vieną para arba didesnei nei vieneri metai.) Jei parengiamasis bandymas rodo, kad visų trijų pH verčių (4, 7 ir 9) ir 50°C temperatūros sąlygomis per 2,4 valandas hidrolizuojasi 50% bandomosios medžiagos ar daugiau arba per penkias paras medžiagos hidrolizės laipsnis mažesnis kaip 10%, toliau bandyti nebūtina.

Kitais atvejais ir atskiroms pH vertėms, kurioms ši sąlyga nebuvo įvykdyta, daromas 1 bandymas.

1.6.5.2. 1 bandymas

1 bandymas daromas vienoje temperatūroje; geriau 50 ± 0,5°C, ir, jei įmanoma, steriliomis sąlygomis bei esant tokioms pH vertėms, kurioms parengiamasis bandymas parodė, kad būtina bandyti toliau.

Norint patikrinti, ar hidrolizę nustatytų pH verčių sąlygomis yra pseudo pirmojo laipsnio, turi būti pasirinktas pakankamas skaičius bandinių (ne mažiau kaip keturi), kad būtų apimtas hidrolizės intervalas nuo 20% iki 70%.

Kiekvienai pH vertei, kurioje daromas 1 bandymas, nustatomas reakcijos laipsnis.

Greičio konstantos 25oC temperatūroje įvertis:

Sprendimas, kaip tęsti eksperimentą, priklausys nuo to, ar iš 1 bandymo rezultatų galima daryti išvadą, kad reakcija yra pseudo pirmojo laipsnio arba taip nėra.

Jei po 1 bandymo negalima daryti neabejotinos išvados, kad reakcija yra pseudo pirmojo laipsnio, eksperimentai turi būti daromi toliau, kaip aprašyta 2 bandyme.

Jei pagal 1 bandymo rezultatus galima užtikrintai tvirtinti, kad reakcija yra pseudo pirmojo laipsnio, tolesni eksperimentai turi būti daromi, kaip aprašyta 3 bandyme. (Antraip, tam tikromis aplinkybėmis pagal greičio konstantas 50°C temperatūroje, apskaičiuotas naudojant 1 bandymo rezultatus (žr. 3.2), gali būti įmanoma apskaičiuoti greičio konstantas 25°C temperatūroje.)

1.6.5.3. 2 bandymas

Šis bandymas daromas kiekvienai pH vertei, kuriai 1 bandymo rezultatai parodė, kad tai būtina daryti:

– arba vienoje temperatūroje, mažesnėje kaip 40°C,

– arba dviejose temperatūrose, didesnėse kaip 50°C, kurios tarpusavyje skiriasi bent 10°C.

Kiekvienai pH vertei ir temperatūrai, kuriose daromas 2 bandymas, turi būti nustatyti bent šeši atitinkamai išdėstyti duomenų taškai taip, kad hidrolizės laipsnis būtų išmatuotas intervale nuo 20% iki 70%.

Vienai pH vertei ir vienai temperatūrai matavimas daromas du kartus. Kai 2 bandymas daromas dviejose temperatūrose virš 50°C, kartoti bandymą geriau mažesnėje iš tų dviejų temperatūroje.

Kiekvienai pH vertei ir temperatūrai, kuriose daromas 2 bandymas, pateikiamas grafinis puslaikio trukmės (t½) įvertinimas, kai tai yra įmanoma.

1.6.5.4. 3 bandymas

Šis bandymas daromas kiekvienai pH vertei, kuriai 1 bandymo rezultatai rodo, kad tai daryti būtina:

– arba vienoje temperatūroje, mažesnėje kaip 40°C,

– arba dviejose temperatūrose, didesnėse kaip 50°C, kurios tarpusavyje skiriasi bent 10°C.

Kiekvienai pH ir temperatūros vertei, kuriose daromas 3 bandymas, parenkami trys duomenų taškai, pirmasis laike 0, o antrasis ir trečiasis – kai hidrolizės laipsnis yra didesnis kaip 30%; turi būti apskaičiuoti k_obs ir t_½.

2. Duomenys

Pseudo pirmojo laipsnio reakcijai kobs vertės, kiekvienai bandymuose naudotai pH vertei ir kiekvienai temperatūrai, gali būti gautos iš koncentracijos logaritmo kitimo laike grafiko pagal tokią lygtį:

k_obs = – krypties koeficientas × 2,303 [7]

Be to, t_½ gali būti apskaičiuotas pagal [6] lygtį.

Jei tinka, gaunamas k_25oC įvertis, taikant Arėnijaus (Arrhenius) lygtį.

Jei reakcija yra ne pseudo pirmojo laipsnio, žr. 3.1.

3. ataskaita

3.1. Ataskaitos duomenys

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– medžiagos specifikacija;

– visi rezultatai, gauti etaloninėms medžiagoms;

– taikyto analizės metodo esmė ir detalės;

– kiekvieno bandymo: temperatūra, pH vertė, buferinio tirpalo sudėtis ir duomenų lentelė su visais koncentracijos kitimo laike taškais;

– pseudo pirmojo laipsnio reakcijai: k_obs ir t_½ vertės bei jų skaičiavimo procedūra;

– ne pseudo pirmojo laipsnio reakcijai rezultatai pateikiami brėžiant koncentracijos logaritmo priklausomybės nuo laiko grafiką;

– visa informacija ir pastabos, kurių reikia rezultatams interpretuoti.

3.2. Duomenų interpretavimas

Gali būti įmanoma apskaičiuoti priimtinas cheminių medžiagų hidrolizės reakcijos greičio konstantos vertes (25°C temperatūroje), jei yra žinomos bandomosios medžiagos homologų aktyvacijos energijos eksperimentinės vertės ir jei galima pagrįstai daryti prielaidą, kad bandomosios medžiagos aktyvacijos energija yra tos pačios eilės dydis.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 111, Decision of the Council C(81) 30 final.

(1) W. Mabey and T. Mill, ‘Critical Review of Hydrolysis of Organic Compounds in Water Under Environmental Conditions’, J. Phys. Chem. Ref. Data, 1978, vol. 7 (2), 383-415.

Priedas

BUFERINIAI MIŠINIAI

A. CLARK ir LUBS

Šiose lentelėse pateiktos pH vertės buvo apskaičiuotos pagal potencialo matavimus taikant standartines lygtis pagal Sörensen’ą. Tikroji pH vertė yra 0,04 vieneto didesnė nei nurodyta lentelėje.

Sudėtis	pH
0,1 M kalio hidroftalatas + 0,1 N HC1 20°C temperatūroje
2,63 ml 0,1 N HC1 + 50 ml ftalato iki 100 ml	3,8
0,1 M kalio hidroftalatas + 0,1 N NaOH 20 oC temperatūroje
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato iki 100 ml	4,0
3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalato iki 100 ml	4,2
0,1 M kalio dihidrofosfatas + 0,1 N NaOH 20°C temperatūroje
23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml	6,8
29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki o 100 ml	7,0
35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml	7,2
0,1 M H3BO3 tirpalas 0,1 M KCI + 0,1 N NaOH 20°C temperatūroje
16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml	8,8
21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml	9,0
26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml	9,2

B. KOLTHOFF ir VLEESHOUWER

Sudėtis	pH
0,1 M kalio dihidrocitratas ir 0,1 N NaOH 18°C temperatūroje
(norėdami apsaugoti tirpalą nuo pelėsių, įdėkite nedidelį kristaliuką timolo)
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml	3,8
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml	4,0
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml	4,2

C. SÖRENSEN

0,05 M borakso + 0,1 N HC1

Sudėtis		pH
ml borakso	ml HCl	Sörensen 18oC	Intervalas
ml borakso	ml HCl	Sörensen 18oC	10°C	40°C	70°C
8,0	2,0	8,91	8,96	8,77	8,59
8,5	1,5	9,01	9,06	8,86	8,67
9,0	1,0	9,09	9,14	8,94	8,74
9,5	0,5	9,17	9,22	9,01	8,80
10,0	0,0	9,24	9,30	9,08	8,86

0,05 M borakso + 0,1 N NaOH

Sudėtis		pH
ml borakso	ml NaOH	Sörensen 18oC	Intervalas
ml borakso	ml NaOH	Sörensen 18oC	10°C	40°C	70°C
10,0	0,0	9,24	9.30	9,08	8,86
9,0	1,0	9,36	9,42	9,18	8,94
8.0	2,0	9,50	9,57	9,30	9,02
7,0	3,0	9,68	9,76	9,44	9,12

TOKSIŠKUMO SLIEKAMS NUSTATYMAS

Dirbtinio dirvožemio bandymas

1. METODAS

1.1. Įvadas

Šiame laboratoriniame bandyme bandomoji medžiaga maišoma su dirbtiniu dirvožemiu, į kurį 14 parų laikotarpiui dedami sliekai. Kai baigiasi šis laikas (ir neprivalomai po septynių parų), tiriama medžiagos įtaka sliekų mirtingumui. Bandyme pateiktas metodas, kaip atlikti palyginti greitą atranką medžiagų, kurios per odą ir virškinimo traktą veikia sliekus.

1.2. Apibrėžimas ir vienetas

LC₅₀: apytikriai apskaičiuota koncentracija medžiagos, kurią naudojant per bandymų laiką žūsta 50% bandomųjų gyvūnų.

1.3. Etaloninė medžiaga

Periodiškai naudojama etaloninė medžiaga, kaip priemonė parodyti, kad bandymų sistemos jautrumas žymiai nepakito.

Etalonine medžiaga rekomenduojama naudoti analiziškai gryną chloracetamidą.

1.4. Bandymo esmė

Dirvožemis yra nepastovi terpė, todėl šiame bandyme naudojamas tiksliai apibrėžtas dirbtinis priemolio dirvožemis. Suaugę Eisenia foetida rūšies sliekai (žr. priedo pastabą) laikomi apibrėžtos sudėties dirbtiniame dirvožemyje, prisodrintame įvairių koncentracijų bandomosios medžiagos. Indų turinys po 14 parų (ir neprivalomai po septynių parų) nuo bandymo pradžios yra pasklaidomas ant padėklo, ir kiekvienai naudotai koncentracijai skaičiuojami likę gyvi sliekai.

1.5. Kokybės kriterijai

Bandymas parengtas taip, kad atkuriamumas bandymo substrato ir organizmo atžvilgiu būtų kiek įmanoma geresnis. Mirtingumas kontroliniuose bandiniuose bandymo pabaigoje turi būti ne didesnis kaip 10%, kitaip bandymas yra nevalidus.

1.6. Bandymų metodo aprašymas

1.6.1. Medžiagos

1.6.1.1. Bandymų substratas

Kaip pagrindinis bandymų substratas naudojamas apibrėžtos sudėties dirbtinis dirvožemis.

(a) Pagrindinis substratas (procentinė sudėtis skaičiuojama sausos medžiagos masei)

– 10% samanų durpių (pH reikšmė kiek įmanoma arčiau 5,5–6,0, be matomų augalų liekanų ir smulkiai maltų),

– 20% kaolinito molio; pageidautina, kad kaolinito jame būtų daugiau kaip 50%,

– apie 69% pramoninio kvarco smėlio (daugiausia tai turi būti smulkus smėlis, kurio daugiau kaip 50% dalelių dydis būtų nuo 0,05 iki 0,2 mm). Jei medžiagos dispergavimas vandenyje nepakankamas, kiekvienam bandymų indui reikia turėti 10 g smėlio, kurį vėliau būtų galima maišyti su bandomąja medžiaga,

– apie 1% kalcio karbonato (CaCO3), smulkiai malto, chemiškai gryno, dedamo padidinti pH vertę iki 6,0 ± 0,5.

(b) Bandymų substratas

Bandymų substratas susideda iš pagrindinio substrato, bandomosios medžiagos ir dejonizuoto vandens.

Vanduo jame sudaro maždaug nuo 25% iki 42% sauso pagrindinio substrato masės. Vandens kiekis substrate nustatomas džiovinant bandinį 105°C temperatūroje iki pastoviosios masės. Pagrindinis vertinimas, drėkinant dirbtinį dirvožemį, yra nesugerto vandens nebuvimas. Būtina rūpestingai maišyti, kad bandomoji medžiaga tolygiai būtų pasiskirstyta substrate. Bandomosios medžiagos įterpimo į substratą būdas turi būti nurodytas ataskaitoje.

c) Kontrolinis substratas

Kontrolinį substratą sudaro pagrindinis substratas ir vanduo. Jei naudojamas priedas, papildomame kontroliniame bandinyje turi būti toks pat priedo kiekis.

1.6.1.2. Bandymų indai

Maždaug vieno litro talpos stiklinis indas (tinkamai uždengtas plastiko dangčiu, lėkštele ar plastiko plėvele su ventiliacijos angomis), užpildytas tokiu kiekiu drėgno bandymų substrato ar kontrolinio substrato, kuris atitiktų 500 g sauso substrato masę.

1.6.2. Bandymų sąlygos

Indai turi būti laikomi kamerose su nuolatiniu apšvietimu (20 ± 2°C) temperatūroje. Apšvieta turi būti nuo 400 iki 800 liuksų.

Bandymo trukmė 14 parų, tačiau mirtingumą neprivalomai galima vertinti ir po septynių parų nuo bandymo pradžios.

1.6.3. Procedūra

Bandomosios medžiagos koncentracija

Bandomosios medžiagos koncentracija skaičiuojama medžiagos mase sauso pagrindinio substrato masei (mg/kg).

Intervalo nustatymo bandymas

Siekiant gauti duomenų, kokias koncentracijas reikėtų naudoti galutiniame bandyme, intervalo nustatymo bandyme gali būti nustatytos koncentracijos, kurioms esant mirtingumas kinta nuo 0 iki 100%.

Medžiaga turi būti išbandyta tokių koncentracijų intervale: 1000; 100; 10; 1; 0,1 mg medžiagos/kilogramui bandymų substrato (sausos masės).

Jei turi būti atliekamas pilnos apimties galutinis bandymas, tai intervalo nustatymo bandyme kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam bandymui be medžiagos pakanka po vieną bandymų indą, kuriame būtų 10 sliekų.

Galutinis bandymas

Intervalo nustatymo rezultatai naudojami parinkti bent penkias geometrinę progresiją sudarančias koncentracijas, kurios apimtų tik mirtingumo intervalą nuo 0 iki 100% ir skirtųsi pastoviu daugikliu, ne didesniu kaip 1,8.

Bandymai, naudojant tokią koncentracijų seriją, turi leisti kiek įmanoma tiksliau įvertinti LC50 vertę ir jos pasikliovimo ribas.

Galutiniame bandyme kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam bandymui be medžiagos imama ne mažiau kaip po keturis bandymų indus, kurių kiekviename būtų po 10 sliekų. Šių lygiagrečių bandymų rezultatai pateikiami vidutinės vertės ir standartinio nuokrypio pavidalu.

Kai dvi gretimos koncentracijos, kurių santykis 1,8, duoda tik 0% ir tik 100% mirtingumą, šių dviejų verčių pakanka pažymėti intervalą, į kurį patenka LC₅₀.

Pagrindinio bandymų substrato ir bandomosios medžiagos mišinys

Bandymų substratas turi būti gaminamas, jei tai įmanoma, be jokių priedų, išskyrus vandenį. Prieš pat bandymo pradžią bandomosios medžiagos emulsija arba dispersija dejonizuotame vandenyje arba kitame tirpiklyje sumaišoma su pagrindiniu bandymo substratu arba tolygiai ant jo užpurškiama plonu chromatografiniu ar panašios rūšies purkštuvu.

Jei medžiaga netirpsta vandenyje, ji gali būti ištirpinta kiek įmanoma mažesniame tinkamo organinio tirpiklio (pvz., heksano, acetono arba chloroformo) tūryje.

Bandomajai medžiagai soliubilizuoti, disperguoti arba emulguoti galima naudoti tik lengvai garuojančias medžiagas. Prieš naudojant bandymų substratas turi būti vėdinamas. Išgaravusio vandens kiekis turi būti papildytas. Kontroliniame bandyme turi būti toks pat visų naudotų priedų kiekis.

Jei bandomoji medžiaga netirpsta ir negali būti disperguota arba emulguota organiniuose tirpikliuose, 10 g smulkaus malto kvarco ir bandomosios medžiagos mišinys vienodais kiekiais, kiek jos reikia 500 g sauso dirbtinio dirvožemio įsodrinimui, sumaišomas su 490 g sauso bandomojo substrato.

Į kiekvieną stiklinį bandymų indą dedama šlapio bandymų substrato, atitinkančio 500 g sauso substrato, ir ant bandymų substrato viršaus dedama 10 sliekų, kurie prieš tai 24 valandas buvo kondicionuoti panašiame šlapiame pagrindiniame substrate, po to greitai nuplauti vandeniu, vandens perteklių sugeriant filtriniu popieriumi.

Indai uždengiami perforuotu plastikiniu dangčiu, lėkštele arba plėvele, kad substratas nedžiūtų, ir 14 parų laikomi bandymų sąlygomis.

Vertinimas turi būti atliekamas po 14 parų (ir neprivalomai po septynių parų) nuo bandymo pradžios. Substratas paskleidžiamas ant stiklinės ar nerūdijančio plieno plokštės. Sliekai apžiūrimi ir nustatomas gyvųjų sliekų skaičius. Sliekai laikomi negyvais, jei jie nereaguoja į švelnų mechaninį priekinio galo dirginimą.

Kai tikrinimas daromas po septynių parų, indas vėl užpildomas substratu, ir likę gyvi sliekai dedami ant to paties bandymų substrato viršaus.

1.6.4. Bandomieji organizmai

Bandomieji organizmai turi būti suaugę Eisenia foetida (žr. priedo pastabą) (bent dviejų mėnesių amžiaus su clitellum), drėgna sliekų masė yra nuo 300 iki 600 mg. (Apie auginimo metodą žr. priedą.)

2. Duomenys

2.1. Rezultatų apdorojimas ir vertinimas

Ataskaitoje pateikiamos bandomosios medžiagos koncentracijos, kartu nuorodant atitinkamą procentinį žuvusių sliekų kiekį.

Jei duomenys yra tinkami skaičiuoti, LC50 vertė ir pasikliovimo ribos (p = 0,05) turi būti nustatyti taikant standartinius metodus (Litchfield and Wilcoxon, 1949, lygiaverčiam metodui). LC50 turi būti nurodyta mg bandomosios medžiagos vienam kilogramui (sauso) bandymų substrato.

Tais atvejais, kai koncentracijos kreivė yra per stati, kad būtų galima skaičiuoti LC₅₀, pakanka grafinio šios vertės įverčio.

Kai dvi gretimos koncentracijos, kurių santykis 1,8, duoda tik 0% ir tik 100% mirtingumą, šių dviejų verčių pakanka pažymėti intervalą, į kurį patenka LC₅₀.

3. ATASKAITA

3.1. Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– tvirtinimas, kad bandymas buvo atliktas pagal aukščiau minėtus kokybės kriterijus,

– atlikto bandymo pobūdis (intervalo nustatymo bandymas ir (arba) galutinis bandymas),

– tikslus bandymo sąlygų aprašymas arba tvirtinimas, kad bandymas buvo atliktas pagal metodą; turi būti nurodyti visi nukrypimai,

– tikslus aprašymas, kaip bandomoji medžiaga buvo įmaišyta į pagrindinį bandymų substratą,

– informacija apie bandymų organizmus (rūšis, amžius, masės vidutinė vertė ir intervalas, laikymo ir auginimo sąlygos, tiekėjas),

– metodas, taikytas LC50 nustatymui,

– bandymų rezultatai, įskaitant visus naudotus duomenis,

– bandymų organizmų pastebėtų simptomų ar elgesio pokyčių aprašymas,

– mirtingumas kontroliniuose bandymuose,

– LC50 arba didžiausia bandyta koncentracija, kurioje mirtingumas nulinis, ir mažiausia bandyta koncentracija, kurioje mirtingumas 100%, po 14 parų (ir neprivalomai po septynių parų) nuo bandymo pradžios,

– koncentracijos/atsako kreivės brėžinys,

– rezultatai, gauti su etalonine medžiaga, šiame bandyme arba iš ankstesniųjų kokybės kontrolės tyrimų.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207. Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) Edwards, C. A. and Lofty, J. R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and Hall, London, 331 pp.

(3) Bouche, M. B., 1972, Lombriciens de France, Écologie et Systématique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 pp.

(4) Litchfield. J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. J. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99.

(5) Commission of the European Communities, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.

(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land– und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag ‘Toxizitätstest am Regenwunn Eisenia foetida in künstlichem Boden’, in: Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

Priedas

Sliekų auginimas ir laikymas iki bandymų

Į auginimo dėžę su šviežiai paruoštu substratu dedama nuo 30 iki 50 suaugusių sliekų, kurie išimami po 14 parų. Šiuos gyvūnus galima naudoti kitoms auginimo partijoms. Iš kokonų išsiritę sliekai bandymuose naudojami, kai subręsta (nurodytomis sąlygomis po dviejų ar trijų mėnesių).

Laikymo ir auginimo sąlygos

Klimato kamera:

Temperatūra 20 ± 2°C, geriau, jei nuolat apšviesta (apšvieta nuo 400 iki 800 liuksų).

Auginimo dėžės:

Tinkami negilūs 10-20 l talpos indai.

Substratas:

Eisenia foetida gali būti veisiami įvairių gyvulių išmatose. Rekomenduojama kaip auginimo terpę naudoti mišinį, kurį sudaro 50% pagal tūrį durpės ir 50% karvių arba arklių mėšlas. Terpės pH vertė turi būti nuo 6 iki 7 (reguliuojama kalcio karbonatu), savitasis joninis laidumas mažas (mažesnis nei 6 mohm arba kaip 0,5% druskos tirpalo).

Substratas turi būti drėgnas, bet ne per šlapias.

Be aukščiau pateikto metodo, galima naudoti kitus sėkmingus būdus.

Pastaba: Eisenia foetida foetida ant segmentų turi tipiškus skersus dryžius arba juostas, o Eisenia foetida andrei to neturi ir yra margos rausvos spalvos. Jei įmanoma, turi būti naudojama Eisenia foetida andrei. Galima naudoti ir kitas rūšis, jei yra reikiamos metodikos.

BIOLOGINIS SKAIDYMAS ZAHN – WELLENS BANDYMAS

1. METODAS

1.1. Įvadas

Metodo tikslas yra įvertinti vandenyje tirpių, nelakių organinių medžiagų galimą suskaidymą statiniame bandyme, veikiant palyginti didelėms mikroorganizmų koncentracijoms.

Ant suspenduotų kietųjų dalelių gali vykti fizikocheminė adsorbcija, į tai turi būti atsižvelgta interpretuojant rezultatus (žr. 3.2).

Tiriamos medžiagos naudojamos tokios koncentracijos, kad ji atitiktų IOA vertes intervale nuo 100 iki 400 mg/litre arba ChDS vertes nuo 100 iki 1000 mg/litre (IOA – ištirpusi organinė anglis; ChDS – cheminis deguonies suvartojimas). Šios palyginti didelės koncentracijos turi analizinio patikimumo pranašumą. Junginiai, kurie turi toksiškų savybių, gali lėtinti arba inhibuoti skaidymo procesą.

Bandomosios medžiagos biologiniam suskaidymui įvertinti šiame bandyme taikomas ištirpusios organinės anglies koncentracijos arba cheminio deguonies suvartojimo nustatymas.

Lygiagrečiai, taikant specifinį analizės metodą, gali būti įmanoma įvertinti medžiagos pirminį biologinį skaidymą (pirminės cheminės sandaros išnykimas).

Metodas tinka tik toms organinėms bandomosioms medžiagoms, kurios bandyme naudojamos koncentracijos atveju yra:

– tirpios vandenyje bandymų sąlygomis,

– garų slėgis bandymo sąlygomis yra labai mažas,

– neinhibuoja bakterijų,

– bandymų sistemoje adsorbuojamos tik ribotu laipsniu,

– iš bandomojo tirpalo nepradingsta dėl putojimo.

Interpretuojant gautus rezultatus, ypač kai rezultatų vertės yra mažos arba nežymios, naudinga turėti informacijos apie bandomosios medžiagos pagrindinių komponentų santykinę dalį.

Kai reikia paaiškinti mažas rezultatų vertes ir pasirinkti tinkamas bandomąsias koncentracijas, pageidautina turėti informacijos apie medžiagos toksiškumą mikroorganizmams.

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

Bandymo pabaigoje pasiektas skaidymo lygis ataskaitoje pateikiamas kaip „Biologinis skaidomumas Zahn – Wellens’o bandyme“:

čia:

Dt = biologinis skaidymas (%) laiku T,

C_A = IOA (arba ChDS) vertės bandomajame mišinyje po trijų valandų nuo bandymo pradžios (mg/l) (IOA – ištirpusi organinė anglis, ChDS – cheminis deguonies suvartojimas),

C_T = IOA arba ChDS vertės bandomajame mišinyje bandinio ėmimo metu (mg/l),

C_B = IOA arba ChDS vertė tuščiajame bandinyje bandinio ėmimo metu (mg/l),

C_BA = IOA arba ChDS vertė tuščiajame bandinyje, išmatuota po trijų valandų nuo bandymo pradžios (mg/l).

Skaidymo laipsnis apvalinamas iki artimiausio sveikojo procentų skaičiaus.

Skaidymo procentinė vertė nurodoma kaip bandomosios medžiagos IOA (arba ChDS) pašalinimo procentinė vertė.

Skirtumas tarp skaidymo vertės, išmatuotos po trijų valandų, ir paskaičiuotos, bet geriau išmatuotos, pradinės vertės gali suteikti naudingos informacijos apie medžiagos šalinimą (žr. 3.2, Duomenų interpretavimas).

1.3. Etaloninės medžiagos

Kai kuriais atvejais, kai tiriamos naujos medžiagos, etaloninės medžiagos gali būti naudingos, tačiau specifinės etaloninės medžiagos dar negali būti rekomenduotos.

1.4. Bandymų metodo esmė

Aktyvusis dumblas, mineralinė mitybinė terpė ir bandomoji medžiaga, kaip vienintelis anglies šaltinis vandeniniame tirpale, dedami kartu į vieno keturių litrų tūrio stiklinį indą, turintį maišiklį ir aeratorių. Mišinys ne ilgiau kaip 28 paras maišomas ir aeruojamas 20–25°C temperatūroje išsklaidytoje šviesoje arba tamsioje patalpoje. Skaidymo procesas kontroliuojamas, nustatant IOA (arba ChDS) vertes filtruotame tirpale kiekvieną dieną arba per kitokį pasirinktą vienodą laiko tarpą. Po kiekvieno matavimo nustatytos IOA (arba ChDS) pašalinimo vertės santykis su verte, gauta po trijų valandų nuo bandymo pradžios, reiškiamas procentine biologinio skaidymo verte ir yra naudojamas kaip tam momentui nustatytas skaidymo laipsnio matas. Rezultatas atidedamas kaip kitimas laike ir gaunama biologinio skaidymo kreivė.

Kai taikomas specifinis analizės metodas, galima nustatyti pradinės medžiagos koncentracijos mažėjimą dėl jos molekulių biologinio skaidymo (pirminis biologinis skaidomumas).

1.5. Kokybės kriterijai

Tarplaboratoriniai palyginamieji bandymai parodė, kad šio metodo atkuriamumas yra patenkinamas.

Metodo jautrumą dideliu laipsniu lemia tuščiojo bandinio kintamumas ir kiek mažiau ištirpusios anglies nustatymo preciziškumas ir bandomosios medžiagos kiekis tirpale.

1.6. Procedūra

1.6.1. Pasirengimas

1.6.1.1. Reagentai

Bandymų vanduo: geriamasis vanduo, kuriame organinės anglies kiekis mažesnis nei 5 mg/litre. Bendra kalcio ir magnio jonų koncentracija neturi būti didesnė kaip 2,7 mol/litre (5,4 mgekv/l); priešingu atveju reikia atitinkamai skiesti dejonizuotu arba distiliuotu vandeniu.

Sieros rūgštis, analizinis reagentas (A. R.):	50 g/l,
Natrio hidroksido tirpalas A. R.:	40 g/l,
Mineralinis mitybinis tirpalas: viename litre dejonizuoto vandens ištirpinama:
amonio chlorido, NH4Cl, A. R.:	38,5 g,
natrio dihidrofosfato, NaH₂PO₄ 2H2O, A. R.:	33,4 g,
kalio dihidrofosfato, KH₂PO₄, A. R.:	8,5 g,
kalio hidrofosfato, K₂HPO₄, A. R.:	21,75 g.

Mišinys naudojamas ir kaip mitybinė, ir kaip buferinė terpė.

1.6.1.2. Aparatūra

Nuo vieno iki keturių litrų talpos stikliniai indai (pvz., cilindriniai indai).

Maišymo įtaisas su stikliniu ar metaliniu maišikliu ant tinkamo ilgio veleno (maišiklis turi suktis maždaug 5–10 cm virš indo dugno). Vietoj jo galima naudoti magnetinį maišiklį su 7–10 cm ilgio magnetu.

Stiklinis vamzdis, kurio vidinis skersmuo 2–4 mm, orui tiekti. Vamzdžio anga turi būti maždaug 1 cm aukštyje nuo indo dugno.

Centrifuga (apie 3550 g).

pH-metras.

Ištirpusio deguonies matuoklis.

Popieriniai filtrai.

Membraninio filtravimo aparatas.

Membraniniai filtrai, akučių dydis 0,45 μm. Membraniniai filtrai tinka, jei užtikrinama, kad filtravimo metu jie neišskiria anglies ir nesugeria medžiagos.

Analizės įranga organinės anglies kiekiui ir cheminiam deguonies poreikiui nustatyti.

1.6.1.3. Sėjimo kultūros ruošimas

Aktyvusis dumblas iš biologinio valymo įrenginio yra plaunamas (kelis kartus), centrifuguojant arba nusodinant iš bandymų vandens (aukščiau).

Aktyvusis dumblas turi būti atitinkamos būsenos. Tokio dumblo yra tinkamai veikiančiame nuotekų valymo įrenginyje. Siekiant gauti, kiek įmanoma, daugiau įvairių bakterijų rūšių arba štamų, geriau būtų maišyti skirtingų šaltinių bakterijų užkratus (pvz., skirtingų valymo įrenginių, dirvožemio ekstraktų, upės vandens ir t. t.). Mišinys turi būti apdorojamas, kaip aprašyta aukščiau.

Kaip tikrinti aktyviojo dumblo aktyvumą žr. „Funkcinė kontrolė“ toliau.

1.6.1.4. Bandomųjų tirpalų ruošimas

Į bandymo indą įpilama 500 ml bandymų vandens, 2,5 ml/litre mineralinio mitybinio tirpalo ir tiek aktyviojo dumblo, kad galutiniame mišinyje sausosios medžiagos būtų nuo 0,2 iki 1,0 g/litre. Įpilamas pakankamas kiekis pradinio bandomosios medžiagos tirpalo, kad IOA galutiniame mišinyje būtų nuo 50 iki 400 mg/litre. Atitinkamos ChDS vertės yra nuo 100 iki 1000 mg/litre. Bandymų vandeniu praskiedžiama iki bendrojo tūrio, nuo vieno iki keturių litrų. Bendrojo tūrio pasirinkimas priklauso nuo bandinių, kurie bus imami IOA arba ChDS nustatyti, skaičiaus ir nuo analizės procedūrai reikalingo tūrio.

Įprastai galima laikyti, kad pakanka dviejų litrų tūrio. Kiekvienai bandymų serijai lygiagrečiai ruošiamas mažiausiai vienas kontrolinis indas (su tuščiuoju bandiniu); jame yra tik aktyviojo dumblo ir mineralinio mitybinio tirpalo, praskiestų su bandymų vandeniu iki to paties tūrio, kaip ir induose su bandomąja medžiaga.

1.6.2. Bandymo eiga

Išsklaidytoje šviesoje arba tamsioje patalpoje 20–25°C temperatūroje laikomų bandymo indų turinys maišomas magnetinėmis maišyklėmis ar sraigtiniais maišytuvais. Aeruojama suslėgtu oru, valomu leidžiant per medvilnės filtrą ir, jei būtina, per plovimo kolbą. Reikia užtikrinti, kad dumblas nenusistotų, o deguonies koncentracija būtų ne mažesnė kaip 2 mg/litre.

pH vertė turi būti tikrinama vienodais laiko tarpais (pvz., kasdien) ir, jei būtina, pH vertė nustatoma nuo 7 iki 8.

Garavimo nuostoliai reikiamais kiekiais kompensuojami dejonizuotu ar distiliuotu vandeniu prieš kiekvieną bandinio ėmimą. Gerai būtų pažymėti skysčio lygį ant indo sienelės prieš bandymo pradžią. Naujos žymės daromos po kiekvieno bandinio ėmimo (neaeruojant ir nemaišant). Norint aptikti bandomosios medžiagos adsorbciją aktyviuoju dumblu, pirmieji bandiniai visuomet imami po trijų valandų nuo bandymo pradžios.

Bandomosios medžiagos šalinimas sekamas atliekant kiekvieną dieną arba pasirinktais vienodais laiko tarpais IOA arba ChDS nustatymą. Bandiniai iš bandymų ir tuščiojo bandymo indų filtruojami per kruopščiai išplautą popieriaus filtrą. Pirmieji bandomojo tirpalo filtrato 5 ml pilami į atliekas. Sunkiai filtruojamas dumblas gali būti pašalintas 10 minučių centrifuguojant. IOA ir ChDS nustatymas atliekamas ne mažiau kaip po du kartus. Bandymo trukmė – ne ilgesnė kaip 28 paros.

Pastaba: jei bandiniai lieka drumsti, jie filtruojami per membraninius filtrus. Membraniniai filtrai neturi išskirti ar adsorbuoti jokių organinių medžiagų.

Aktyviojo dumblo veikimo tikrinimas

Norint patikrinti funkcinę aktyviojo dumblo gebą, lygiagrečiai kiekvienai bandymų serijai turi būti atliekamas bandymas su žinoma medžiaga. Buvo nustatyta, kad šiam tikslui tinka dietilenglikolis.

Adaptavimas

Jei analizė atliekama palyginti dažnai (pvz., kiekvieną dieną), adaptavimą galima nustatyti iš skaidymo kreivės (žr. 2 paveikslą). Todėl bandymas neturi būti pradedamas prieš pat savaitgalį.

Jei adaptavimas įvyksta laikotarpio pabaigoje, bandymą galima pratęsti, kol skaidymas bus baigtas.

Pastaba: jei reikia daugiau duomenų apie adaptuoto dumblo elgesį, tas pats aktyvusis dumblas dar kartą naudojamas su ta pačia bandomąja medžiaga pagal tokią metodiką:

Išjungiami maišytuvas ir aeratorius ir leidžiama dumblui nusistoti. Skystis virš dumblo nusiurbiamas, įpilama ne daugiau kaip du litrai bandymų vandens, 15 minučių maišoma ir leidžiama vėl nusistoti. Skystis virš dumblo nusiurbiamas dar kartą, likęs dumblas naudojamas bandymui su ta pačia medžiaga pagal 1.6.1.4 ir 1.6.2 pakartoti. Vietoj nusodinimo aktyvųjį dumblą galima atskirti centrifugavimu.

Adaptuotas dumblas gali būti sumaišomas su šviežiu dumblu, kad sausos medžiagos koncentracija būtų nuo 0,2 iki 1 g/litre.

Analizės priemonės

Paprastai bandiniai filtruojami per kruopščiai išplautą filtrinį popierių (plaunamą dejonizuotu vandeniu).

Bandiniai, kurie lieka drumsti, filtruojami per membraninį filtrą (0,45 m).

IOA koncentracija bandinių filtratuose (pirmieji 5 ml pilami į atliekas) nustatomadu kartus naudojant BOA (bendros organinės anglies) nustatymo aparatūrą. Jei filtrato negalima analizuoti tą pačią dieną, iki kitos dienos jis turi būti laikomas šaldytuve. Ilgiau laikyti nerekomenduojama.

ChDS koncentracija bandinio filtratuose nustatoma su ChDS analizės įranga, taikant (2) nuorodoje aprašytą procedūrą.

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

IOA ir (arba) ChDS koncentracija bandiniuose, gautuose pagal 1.6.2, nustatoma ne mažiau kaip po du kartus. Skaidymas laiku T apskaičiuojamas pagal formulę (su apibrėžimais), pateiktą 1.2 aukščiau.

Skaidymo laipsnis apvalinamas iki artimiausio sveikojo procentų skaičiaus. Bandymo pabaigoje pasiekto skaidymo procentinė vertė ataskaitoje pateikiama kaip „Biologinis skaidomumas Zahn – Wellens bandyme“.

Pastaba: jei medžiaga visiškai suskaidoma, dar nesibaigus bandymui skirtam laikui ir rezultatą patvirtina kitą dieną atlikta dar viena analizė, bandymą galima baigti.

3. ATASKAITA

3.1. Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– pradinė medžiagos koncentracija,

– visa kita informacija ir bandymų rezultatai, susiję su bandomąja medžiaga, etalonine medžiaga, jei buvo naudota, ir tuščiuoju bandymu,

– koncentracija po trijų valandų,

– biologinio skaidymo kreivė su aprašymu,

– data ir vieta, kur buvo imti bandomieji organizmai, adaptavimo būsena, naudota koncentracija ir t. t.,

– mokslinis bet kokių bandymų procedūros pakeitimų pagrindimas.

3.2. Duomenų interpretavimas

Dienas ar savaites vykstantis laipsniškas IOA (ChDS) šalinimas rodo, kad medžiaga biologiškai skaidoma.

Tačiau kai kuriais atvejais gali vykti fizikocheminė adsorbcija ir tai matyti, kai nuo bandymo pradžios per pirmąsias tris valandas vyksta dalinis ar visiškas pašalinimas, o skirtumas tarp kontrolinio ir bandomojo skysčių virš dumblo išlieka netikėtai mažas.

Jei reikia išryškinti skirtumą tarp biologinio skaidymo (ar dalinio biologinio skaidymo) ir adsorbcijos, būtina daryti tolesnius bandymus.

Tai galima daryti įvairiais būdais, tačiau įtikinamiausias būdas yra pamatiniame bandyme (geriau, kad tai būtų respirometrinis bandymas) užkratu naudoti skystį virš dumblo arba dumblą.

Bandomosios medžiagos, kurių neadsorbcinio IOA (ChDS) šalinimo vertės bandyme yra didelės, turi būti laikomos potencialiai biologiškai skaidomomis. Dalinis neadsorbcinis šalinimas rodo, kad cheminė medžiaga bent kažkiek yra biologiškai skaidoma. Mažos ar nulinės IOA (ChDS) šalinimo vertės gali būti dėl mikroorganizmų inhibavimo bandomąja medžiaga, tai dar gali parodyti dumblo irimas ir jo praradimas, dėl ko skystis virš dumblo drumsčiasi. Bandymas turi būti pakartotas naudojant mažesnę bandomosios medžiagos koncentraciją.

Naudojant specifinį junginio analizės metodą arba bandomąsias medžiagas su žymėtais ¹⁴C atomais, gali būti pasiektas didesnis jautrumas. Jei bandomasis junginys turi ¹⁴C, tuomet ¹⁴CO₂ surinkimas patvirtintų, kad biologinis skilimas įvyko.

Kai duomenys pateikiami kaip pirminio biologinio skaidymo rezultatai, turi būti paaiškinta, jei tai įmanoma, kaip pakito cheminė sandara, kad neliko pradinės bandomosios medžiagos atsako.

Turi būti pateiktas analizės metodo galiojimo patvirtinimas ir tuščiojo bandinio terpėje nustatyta skaidymo vertė.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) C.6. Degradation: Chemical Oxygen Demand.

Priedas

VERTINIMO PAVYZDYS

Organinis junginys:	4-Etoksibenzenkarboninė rūgštis
Teorinė bandomoji koncentracija:	600 mg/l
Teorinis IOA kiekis:	390 mg/l
Užkratas	Nuotekų valymo įrenginys...
Koncentracija:	1 gramas sausos medžiagos/litre
Adaptavimo būsena:	Neadaptuotas
Analizės būdas:	IOA nustatymas
Bandinio kiekis:	3 ml
Kontrolinė medžiaga:	Dietilenglikolis
Junginio toksiškumas:	Nėra toksiškumo požymių, kai jo mažiau kaip 1000 mg/l Taikytas bandymas: Fermentavimo mėgintuvėlių bandymas

Bandymo trukmė	Kontrolinė medžiaga						Bandomoji medžiaga
	Tuščiojo bandinio IOA¹, mg/l	IOA¹ mg/l		IOA tikrasis kiekis, mg/l	Skaidymas, %	IOA, mg/l	IOAtikrasis kiekis, mg/l		Skaidymas, %
0	–	–	300,0		–	–		390,0		–
3 valandos	4,0	298,0	294,0		2	371,6		367,6		6
1 para	6,1	288,3	282,2		6	373,3		367,2		6
2 paros	5,0	281,2	276,2		8	360,0		355,0		9
5 paros	6,3	270,5	264,2		12	193,8		187,5		52
6 paros	7,4	253,3	245,9		18	143,9		136,5		65
7 paros	11,3	212,5	201,2		33	104,5		93,2		76
8 paros	7,8	142,5	134,7		55	58,9		51,1		87
9 paros	7,0	35,0	28,0		91	18,1		11,1		97
10 parų	18,0	37,0	19,0		94	20,0		2,0		99
¹ Trijų matavimų vidutinė vertė.

1 paveikslas

Biologinio skaidymo kreivių pavyzdžiai

2 paveikslas

Dumblo adaptavimo pavyzdžiai BIOloginis skaidymas Aktyviojo dumblo modeliavimo bandymas

BIOLOGINIS SKAIDYMAS AKTYVIOJO DUMBLO MODELIAVIMO BANDYMAS

1. METODAS

1.1. Įvadas

1.1.1. Bendrosios pastabos

Metodas tinka tik toms organinėms medžiagoms, kurios bandyme naudojamos koncentracijos:

– vandenyje yra tirpios tiek, kad pakanka ruošti bandomuosius tirpalus,

– garų slėgis bandymo sąlygomis yra labai mažas,

– neinhibuoja bakterijų.

Rezultatų interpretacijai, ypač kai rezultatų vertės yra mažos arba jų skirtumas nuo nulio nėra patikimas, naudinga turėti duomenų apie bandomosios medžiagos pagrindinių komponentų santykinę dalį.

Kai reikia paaiškinti gautas mažas vertes ir pasirinkti tinkamas bandomąsias koncentracijas, pageidautina turėti informacijos apie medžiagos toksiškumą mikroorganizmams.

1.1.2. Biologinio suskaidomumo nustatymas (IOA arba ChDS analizė)

Metodo tikslas yra nustatyti biologinį suskaidomumą, matuojant medžiagos ir bet kurių jos metabolitų šalinimą aktyviojo dumblo įrenginio modelyje, kai medžiagos koncentracija didesnė kaip > 12 mg IOA/litre (arba maždaug 40 mg ChDS/litre); manoma, kad 20 mg IOA/litre koncentracija yra optimali. (IOA – ištirpusi organinė anglis; ChDS – cheminis deguonies suvartojimas).

Turi būti nustatytas organinės anglies kiekis bandomojoje medžiagoje (arba cheminis deguonies suvartojimas).

1.1.3. Pirminio biologinio skaidomumo nustatymas (specifinė analizė)

Metodo tikslas yra nustatyti pirminį medžiagos biologinį skaidomumą aktyviojo dumblo įrenginio modelyje, taikant specifinį analizės metodą, kai medžiagos koncentracija yra apie 20 mg/litre (galima naudoti didesnę arba mažesnę koncentraciją, jei tai leidžia analizės metodas ir toksiškumo prielaida). Tai leidžia įvertinti medžiagos pirminį biologinį skaidomumą (pradinės cheminės sandaros junginio išnykimą).

Šio metodo tikslas nėra nustatyti bandomosios medžiagos mineralizavimą.

Būtina turėti atitinkamą analizės metodą bandomajai medžiagai nustatyti.

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

1.2.1. IOA arba ChDS analizė

Medžiagos šalinimo laipsnis reiškiamas lygtimi:

[1(a)],

čia:

DR = bandomosios medžiagos šalinimo laipsnis procentais IOA (arba ChDS) per duotą sulaikymo trukmę,

T = bandomosios medžiagos koncentracija intakyje, mg IOA/litre (arba mg ChDS/litre),

E = IOA (arba ChDS) koncentracija bandymų įrenginio ištakyje, mg IOA/litre (arba mg ChDS/litre),

E₀= be medžiagos veikiančio bandymo įrenginio ištakio IOA (arba ChDS) koncentracija, mg IOA/litre (arba mg ChDS/litre).

Skaidymas pateikiamas, nurodant bandomosios medžiagos IOA (arba ChDS) šalinimo per nustatytą sulaikymo trukmę procentinę vertę.

1.2.2. Specifinė analizė

Bandomosios medžiagos šalinimo iš vandeninės fazės procentinė vertė (RW) nustatytos vidutinės sulaikymo trukmės ribose skaičiuojama pagal lygtį:

R_W =

C₁-C₀

C₁

×100% [l(b)],

čia:

C₁ = medžiagos koncentracija bandymo įrenginio intakyje (medžiagos kiekis mg/litre, nustatant specifinės analizės metodu),

C₀ = medžiagos koncentracija bandymo įrenginio ištakyje (medžiagos kiekis mg/litre, nustatant specifinės analizės metodu).

1.3. Etaloninės medžiagos

Kai kuriais atvejais, kai tiriamos naujos medžiagos, gali būti naudingos etaloninės medžiagos, tačiau specifinės etaloninės medžiagos vis dar negali būti rekomenduotos.

1.4. Bandymų metodo esmė

Biologiniam suskaidomumui nustatyti lygiagrečiai atliekami bandymai dviejuose eksperimentiniuose aktyviojo dumblo įrenginiuose (OECD patvirtinamasis bandymas arba akytojo indo įrenginiai). Bandomoji medžiaga dedama į intakį vieno iš įrenginių (sintetinių ar buitinių nuotekų), tuo tarpu į antrąjį įrenginį tiekiamos tik nuotekos. Pirminiam biologiniam skaidymui nustatyti, darant specifinę medžiagos analizę intakyje ir ištakyje, naudojamas tik vienas įrenginys.

IOA (arba ChDS) koncentracijos matuojamos ištakiuose arba medžiagos koncentracija nustatoma atliekant specifinę analizę.

IOA atsiradusi dėl bandomosios medžiagos nematuojama, bet paprasčiausiai konstatuojamas jos kiekis.

Kai atliekami IOA (arba ChDS) matavimai, skirtumas vidutinių koncentracijų bandomajame ir kontroliniame ištakiuose priskiriamas nesuskaidytai bandomajai medžiagai.

Kai atliekamama specifinė analizė, galima išmatuoti pradinio junginio molekulių koncentracijos pokytį (pirminis biologinis skaidymas).

Įrenginiai gali būti eksploatuojami „sudvejintų įrenginių režimu“, atliekant persėjimą (transinokuliaciją).

1.5. Kokybės kriterijai

Pradinė tiriamos medžiagos koncentracija priklauso nuo taikomo analizės metodo ir jo apribojimų.

1.6. Bandymų metodo aprašymas

1.6.1. Pasirengimas

1.6.1.1. Aparatūra

Reikia dviejų to paties tipo įrenginių, išskyrus tą atvejį, kai atliekama specifinė analizė. Gali būti naudojami dviejų tipų įrenginiai:

OECD patvirtinamojo bandymo

Įrangą (1 priedas) sudaro indas sintetinėms nuotekoms laikyti (A), dozavimo siurblys (B), aeravimo indas C, nusodintuvas D, aeroliftinis siurblys E aktyviajam dumblui recirkuliuoti ir apdoroto ištakio rinktuvas F.

A ir F indai turi būti iš stiklo arba tinkamo plastiko ir jų talpa turi būti ne mažiau kaip 24 litrai. B siurblys turi užtikrinti nuolatinį sintetinių nuotekų srautą į aeravimo indą; galima naudoti bet kurį tinkamą įrenginį, svarbu, kad būtų užtikrintas tiekimo srautas ir koncentracija. Normalaus darbo metu nustatomas toks D nusodintuvo aukštis, kad maišomo skysčio tūris aeravimo inde būtų trys litrai. Sukepinto stiklo aeravimo kubas G yra pakabintas C indo kūginės dalies viršūnėje. Per aeratorių pučiamo oro kiekį galima kontroliuoti debitometru.

Aeroliftinis siurblys E reguliuojamas taip, kad aktyvusis dumblas iš nusodintuvo tolygiai ir nuolat grąžinamas į aeravimo indą C.

„Akytasis indas“

Akytasis indas yra pagamintas iš akyto polietileno lakštų (2 mm storio, didžiausias akučių dydis 95 μm), kurie susukami į 14 cm skersmens cilindrą su kūginiu 45° pagrindu (2 priedo 1 ir 2 paveikslai). Akytasis indas dedamas į iš tinkamo plastiko pagamintą 15 cm skersmens nepralaidų indą, cilindrinėje dalyje 17,2 cm aukštyje turintį išleidžiamąją angą, kuri nustato skysčio tūrį inde (3 litrai). Vidinio indo viršutinė dalis apjuosta standžiu laikančiuoju žiedu iš tinkamo plastiko taip, kad tarp vidinio ir išorinio indų būtų 0,5 cm ištakiui skirta erdvė.

Akytąjį indą galima įtaisyti ant termostatuojamos vandens vonios dugno. Pro vidinio indo dugną, ant kurio uždėti tinkami difuzoriai, tiekiamas oras.

A ir E indai turi būti iš stiklo ar tinkamo plastiko ir jų talpa turi būti ne mažiau kaip 24 litrai. B siurblys turi užtikrinti nuolatinį sintetinių nuotekų srautą į aeravimo indą; galima naudoti bet kurį tinkamą įrenginį, svarbu, kad būtų užtikrintas tiekimo srautas ir koncentracija.

Reikia turėti atsarginius vidinius akytuosius indus, kad būtų galima pakeisti bet kurį užkimštomis poromis indą; užkimšti indai plaunami 24 valandas, mirkant hipochlorito tirpale, po to gerai išplaunami vandentiekio vandeniu.

1.6.1.2. Filtravimas

Membraninio filtravimo įrenginys ir membraniniai filtrai, kurių akučių dydis 0,45 m. Tinka tokie membraniniai filtrai, kurie neišskiria tirpios anglies ir filtravimo etape neadsorbuoja medžiagos.

1.6.1.3. Nuotekos

Galima naudoti atitinkamą sintetinę mitybinę terpę arba buitines nuotekas.

Sintetinės mitybinės terpės pavyzdys:

Viename litre vandentiekio vandens ištirpinkite:

Peptono:	160 mg
Mėsos ekstrakto:	110 mg
Karbamido:	30 mg
NaCl:	7 mg
CaCl₂ 2H₂O:	4 mg
MgSO₄ 7H₂O:	2 mg
K₂HPO₄:	28 mg

Buitinės nuotekos

Buitinės nuotekos turi būti imamos kiekvieną dieną iš nuotekų valymo įrenginio, kuris daugiausia valo buitines nuotekas, pirminio nusodintuvo perpildos srauto.

1.6.1.4. Bandomosios medžiagos pradinis tirpalas

Bandymo įrenginiui papildyti bandomąja medžiaga turi būti ruošiamas jos tirpalas, pvz., 1%. Norint žinoti, kokį bandomosios medžiagos tirpalo tūrį reikia pilti į nuotekas arba tiesiai antruoju siurbliu į įrenginį, kad būtų gauta reikiama bandomoji koncentracija, turi būti nustatyta bandomosios medžiagos koncentracija.

1.6.1.5. Užkratas

Pastaba: naudojant buitines nuotekas, nėra prasmės naudoti užkrato su maža bakterijų koncentracija, bet galima naudoti aktyvųjį dumblą.

Galima naudoti įvairius užkratus.

Pateikiami trys užkratų pavyzdžiai:

a) užkratas iš antrinio ištakio

užkratas turi būti gautas iš geros kokybės antrinio ištakio, renkant jį iš valymo įrenginio, į kurį daugiausia patenka buitinės nuotekos. Nuo bandinio ėmimo iki naudojimo ištakis turi būti laikomas aerobinėmis sąlygomis. Ruošiant užkratą, bandinys filtruojamas per stambų filtrą ir pirmieji 200 ml filtrato išpilami į atliekas. Kol bus panaudotas, filtratas laikomas aerobinėmis sąlygomis. Užkratas turi būti panaudotas ėmimo dieną. Užkrato dedama ne mažiau kaip 3 ml.

b) sudėtinis užkratas

Užkratas iš antrinio ištakio:

žr. aprašymą aukščiau.

Užkratas iš dirvožemio:

100 g sodo dirvožemio (derlingo, nesterilaus) suspenduojama 1000 ml geriamo chloro neturinčio vandens. (Netinka dirvožemiai, kurių didelė dalis yra molis, smėlis arba humusas). Po sumaišymo suspensija 30 minučių paliekama nusistoti. Skystis virš nuosėdų filtruojamas per stambų filtrinį popierių, pirmuosius 200 ml pilant lauk. Filtratas aeruojamas iš karto ir visą laiką, kol bus panaudotas.

Užkratas turi būti panaudotas ėmimo dieną.

Užkratas iš paviršinio vandens:

Kita užkrato dalis imama iš mezosaprobinio paviršinio vandens. Bandinys filtruojamas per stambų filtrinį popierių, pirmuosius 200 ml pilant lauk. Kol bus panaudotas, filtratas laikomas aerobinėmis sąlygomis. Užkratas turi būti panaudotas ėmimo dieną.

Vienodi trijų atskirų užkratų bandinių tūriai sujungiami, gerai sumaišomi ir iš šio mišinio imamas galutinis užkratas. Užkrato dedama ne mažiau kaip 3 ml.

c) sėjimo kultūra iš aktyviojo dumblo

Užkratu galima naudoti aktyvųjį dumblą (suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija ne didesnė kaip 2,5 g/litre), kurio tam tikras tūris (ne didesnis kaip 3 litrai) imamas iš valymo įrenginio, kuris valo daugiausia buitines nuotekas, aeravimo tanko.

1.6.2. Procedūra

Bandymas atliekamas kambario temperatūroje, kuri turi būti nuo 18 iki 25°C.

Jei tinka, bandymą galima daryti žemesnėje temperatūroje (sumažintoje iki 10°C); jei medžiaga tokioje temperatūroje suiro, paprastai daugiau nereikia tęsti darbo. Tačiau jei medžiaga nesuiro, bandymas turi būti atliekamas įprastinėje, nusistovėjusioje temperatūroje nuo 18 iki 25°C.

1.6.2.1. Įdirbimo laikotarpis: dumblo formavimas/įrenginio stabilizavimas

Dumblo augimo/stabilizavimo laikotarpis, per kurį aktyviojo dumblo suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija ir įrenginio veikimas naudojamomis darbo sąlygomis artėja prie nusistovėjusios būsenos.

Įdirbimo laikotarpis tęsiasi nuo to momento, kai bandomoji medžiaga buvo įdėta pirmą kartą, iki tol, kol šalinimas pasiekia gulsčiąją kreivės dalį (palyginti pastovią vertę). Šio laikotarpio trukmė turi būti ne didesnė kaip šešios savaitės.

Vertinimo laikotarpis trunka tris savaites, tris savaites nuo to laiko, kai bandomosios medžiagos šalinimas pasiekia palyginti pastovią ir paprastai didelę vertę. Toms medžiagoms, kurių skaidymas per pirmąsias šešias savaites yra mažas arba visai nevyksta, vertinimo laikotarpiu laikomos dar trys po to einančios savaitės.

Iš pradžių vienam bandymui skirtą įrenginį (-ius) reikia užpildyti užkratu, sumaišytu su intakiu.

Tuomet įjungiamas aeratorius (ir aeroliftinis siurblys E OECD patvirtinamojo bandymo įrenginių atveju) bei dozavimo įtaisas (B).

Intakio be bandomosios medžiagos srautas per aeravimo indą C turi būti arba litras per valandą arba pusė litro per valandą; tuomet vidutinė sulaikymo trukmė bus lygi trims arba šešioms valandoms.

Aeravimo intensyvumas turi būti reguliuojamas taip, kad indo C turinys būtų visą laiką suspenduotas, o ištirpusio deguonies kiekis būtų ne mažesnis kaip 2 mg/litre.

Atitinkamomis priemonėmis būtina išvengti putojimo. Neturi būti naudojami putas slopinantys priedai, kurie inhibuotų aktyvųjį dumblą.

Dumblas, kuris kaupiasi aeravimo indo C viršuje (OECD patvirtinamojo bandymo įrenginių atveju ir nusodintuvo D apačioje bei cirkuliacijos sistemoje), turi būti grąžinamas į maišomą skystį ne mažiau kaip kartą per parą, nuvalant šepečiu arba kokiu nors kitu tinkamu būdu.

Jei dumblas nesėda, jo tankis gali būti padidintas pridedant, jei reikia, – ir pakartotinai,– 2 ml 5% geležies (III) chlorido tirpalo.

Nuotekos nuo 20 iki 24 valandų leidžiamos į rinktuvą (E arba F), tuomet, mišinį sumaišius, paimamas bandinys. Po to rinktuvas (E ar F) turi būti kruopščiai išplautas.

Proceso veiksmingumui tikrinti bent du kartus per savaitę sukaupto ištakio filtrate matuojamas cheminis deguonies suvartojimas (ChDS) arba ištirpusi organinė anglis (IOA), tai daroma ir intako filtrate (naudojama membrana, kurios akučių dydis 0,45 m, pirmieji 20 ml (maždaug) filtrato išpilami į atliekas).

ChDS arba IOA mažėjimas turi išsilyginti, kai gaunamas maždaug tolygios paros skaidymo vertės.

Sausos medžiagos kiekis aeravimo indo aktyviajame dumble turi būti nustatomas du kartus per savaitę (g/litre). Įrenginius galima eksploatuoti vienu iš dviejų būdų: sausos medžiagos kiekis aktyviajame dumble turi būti nustatomas du kartus per savaitę, ir, jei jis didesnis kaip 2,5 g/litre, perteklinis aktyvusis dumblas turi būti pašalintas arba iš kiekvieno indo kiekvieną dieną išpilama lauk 500 ml nuotekų ir aktyviojo dumblo mišinio, kad vidutinė dumblo sulaikymo trukmė būtų šešios paros.

Kai išmatuoti ir įvertinti dviejų įrenginių parametrai [(proceso veiksmingumas (ChDS arba IOA šalinimas), dumblo koncentracija, dumblo nusodinamumas, ištakių drumstumas ir t. t.] tampa gana stabilūs, į vieno iš įrenginių intaką galima dėti bandomosios medžiagos pagal 1.6.2.2.

Kitu būdu bandomąją medžiagą galima dėti dumblo augimo laikotarpio pradžioje (1.6.2.1), ypač kai dumblas yra dedamas kaip užkratas.

1.6.2.2. Procedūra

Palaikomos įdirbimo laikotarpio darbinės sąlygos ir į bandymo įrenginio intakį dedamas pakankamas kiekis (maždaug 1%) bandomosios medžiagos pradinio tirpalo, kad nuotekose būtų gauta norima bandomosios medžiagos koncentracija (maždaug nuo 10 iki 20 mg/litre DOC arba 40 mg/litre COD). Tai galima padaryti kiekvieną dieną maišant pradinį tirpalą į nuotekas arba naudojant atskirą pumpavimo įrenginį. Šią koncentraciją galima pasiekti laipsniškai. Jei bandomosios medžiagos toksiško poveikio aktyviajam dumblui nenustatyta, galima bandyti didesnes koncentracijas.

Į tuščiojo bandymo įrenginį tiekiamas tik intakis, nededant medžiagos. Analizei imami atitinkamo tūrio bandiniai, kurie filtruojami per membraninį filtrą (0,45 m), pirmuosius 20 ml (maždaug) filtrato pilant į atliekas.

Filtruoti bandiniai turi būti analizuojami tą pačią dieną, priešingu atveju jie turi būti konservuojami kokiu nors tinkamu būdu, pvz., 10 ml filtrato įpilti 0,05 ml 1% gyvsidabrio (II) chlorido (HgCl2) tirpalo arba laikyti bandinius 2–4°C temperatūroje, jei laikoma ne ilgiau kaip 24 valandas, arba mažesnėje nei -18°C temperatūroje, jei ilgesnį laiką.

Įdirbimo laikas, pridedant bandomosios medžiagos, neturi užtrukti ilgiau kaip šešias savaites, o įvertinimo laikotarpis neturi būti trumpesnis kaip trys savaitės, t. y. galutiniam rezultatui skaičiuoti reikia turėti maždaug nuo 14 iki 20 nustatymų.

Sudvejintų įrenginių režimas

Įrenginių sudvejinimas pasiekiamas kartą per dieną 1,5 litro nuotekų ir aktyviojo dumblo mišinio (įskaitant dumblą) iš aktyviojo dumblo aeravimo indų perpilant iš vieno į kitą. Jei bandomosios medžiagos yra labai absorbuojamos, iš nusodintuvų siurbiama po 1,5 litro skysčio virš dumblo ir supilama į kito įrenginio aktyviojo dumblo indą.

1.6.2.2. Analizė

Norint sekti medžiagos elgesį, galima daryti dviejų rūšių analizę:

IOA ir ChDS

IOA koncentracijų nustatymas anglies analizatoriumi daromas po du kartus, ir (arba) ChDS vertės nustatomos pagal (2) nuorodą.

Specifinė analizė

Bandomosios medžiagos koncentracija nustatoma atitinkamu analizės metodu. Tais atvejais, kai tai įmanoma, turi būti daroma ant dumblo absorbuotos medžiagos specifinė analizė.

2. DUOMENYS IR JŲ VERTINIMAS

2.1. Sudvejintų įrenginių režimas

Naudojant „sudvejintų įrenginių režimą“, kasdienis šalinimo laipsnis DR skaičiuojamas pagal 1.2.1.

Šioms kasdienio šalinimo laipsnio DR vertėms daroma pataisa dėl medžiagos pernešimo persėjimo (transinokuliavimo) procese į DRc vertes, taikant [2] lygtį trijų valandų arba [3] lygtį šešių valandų vidutinei sulaikymo trukmei.

DRc = [2]

[3]

Skaičiuojama DRc verčių sekos vidutinė vertė ir papildomai pagal [4] lygtį skaičiuojamas standartinis nuokrypis:

[4]

čia:

S_DR_c = DRc verčių sekos standartinis nuokrypis,

_DRc= vidutinė vertė,

n = nustatymų skaičius.

DRc sekos išskirtys (outliers) eliminuojamos naudojant atitinkamą statistinę metodiką, pvz., Nalimov (6), 95% pasikliovimo lygmeniui, ir DRc rinkinio be išskirčių vidutinė vertė ir standartinis nuokrypis skaičiuojami iš naujo.

Galutinis rezultatas skaičiuojamas pagal lygtį [5]:

[5]

čia:

tn-1;α = iš lentelės paimta t vertė n skaičiui E ir E₀ verčių porų ir statistinis pasikliovimo lygmuo P (P = 1– α), kai P užduotas 95% (1).

Rezultatas pateikiamas nurodant vidutinę vertę su nuokrypio ribomis 95% pasikliovimo lygmeniui, atitinkamą standartinį nuokrypį, DRc duomenų skaičių rinkinyje, atmetus išskirtis, ir išskirčių skaičių, pvz.:

DRc = 98,6 ± 2,3% IOA šalinimas,

s = 4,65% DOC šalinimas,

n = 18,

x = išskirčių skaičius.

2.1. Nesudvejintų įrenginių režimas

Įrenginių veikimas gali būti patikrintas tokiu būdu:

Šios kasdienio šalinimo vertės gali būti atidėtos grafiškai, kad būtų galima atskleisti bet kokias tendencijas, pvz,. aklimatizavimo.

2.2.1. Naudojant ChDS/IOA nustatymus

Kasdienis šalinimo laipsnis DR yra skaičiuojamas pagal 1.2.1.

Skaičiuojama DR verčių sekos vidutinė vertė; papildomai skaičiuojamas standartinis nuokrypis pagal:

[6]

čia:

S_DR = DRi verčių sekos standartinis nuokrypis,

= DR vidutinė vertė,

n = nustatymų skaičius.

DR sekos išskirtys eliminuojamos naudojant atitinkamą statistinę metodiką, pvz., Nalimov (6), 95% pasikliovimo lygmeniui, ir iš naujo skaičiuojami DR rinkinio be išskirties vidutinė vertė ir standartinis nuokrypis.

Rezultatas pateikiamas nurodant vidutinę vertę su nuokrypio ribomis 95% pasikliovimo lygmeniui, atitinkamą standartinį nuokrypį, DR duomenų skaičių rinkinyje, atmetus išskirtis, ir išskirčių skaičių, pvz.:

DR = (98,6 ± 2,3%) IOA šalinimo,

s = 4,65% IOA šalinimo,

n = 18,

x = išskirčių skaičius.

2.2.2. Naudojant specifinę analizę

Bandomosios medžiagos šalinimo iš vandeninės fazės procentinė vertė (R_W) yra skaičiuojama pagal 1.2.2.

3. ATASKAITA

3.1. Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– 3 priede pateiktas blankas, kuriame nurodytos eksploatavimo sąlygos,

– pasirinktasis aparatas (OECD patvirtinamojo bandymo arba akytasis indas),

– pasirinktas eksploatavimo režimas: sudvejintų įrenginių arba ne,

– nuotekos: sintetinės ar buitinės – buitinių nuotekų atveju nurodyti bandinio vietą ir ėmimo datą,

– užkratas su bandinio ėmimo vieta ir data,

– trumpas išdėstymas su analizės metodo aprašymu, jei buvo daroma specifinė analizė,

– ChDS arba IOA šalinimo kitimo laike grafikas, įskaitant įdirbimo ir įvertinimo laikotarpius,

– bandomosios medžiagos pradiniame tirpale analizinės vertės išgavimas ChDS arba IOA pavidalu,

– jei buvo darytos specifinės analizės, bandomosios medžiagos šalinimo iš vandeninės terpės procentinės vertės kitimo laike grafikas (įdirbimo ir įvertinimo laikotarpis),

– bandomosios medžiagos IOA ar ChDS šalinimo vidutinė vertė ir standartinis nuokrypis, skaičiuoti pagal įvertinimo laikotarpio rezultatus, t. y. kai vyksta pastovus bandomosios medžiagos šalinimas arba stabilaus veikimo laikotarpiu,

– aktyviojo dumblo koncentracijos kitimo laike grafikas,

– visos pastabos apie aktyvųjį dumblą (perteklinio dumblo šalinimas, tūrio didėjimas, FeCl3 ir t. t.),

– bandyme naudota bandomosios medžiagos koncentracija,

– visi rezultatai apie dumblo analizę,

– visa informacija ir eksperimentiniai rezultatai, susiję su bandomąja medžiaga ir etalonine medžiaga, jei ji buvo naudota,

– mokslinis bandymų metodikos bet kokių keitimų pagrindimas.

3.2. Duomenų interpretavimas

Mažų bandomosios medžiagos šalinimo iš vandeninės terpės verčių priežastimi gali būti mikroorganizmų inhibavimas veikiant bandomajai medžiagai. Tai galima nustatyti pagal dumblo irimą ir jo kiekio mažėjimą, dėl ko skystis virš dumblo pasidaro drumstas, ir pagal bandomojo įrenginio ChDS (arba IOA) šalinimo našumo mažėjimą.

Kartais įtakos gali turėti fizikocheminė adsorbcija. Skirtumai tarp biologinio poveikio molekulei ir fizikocheminės adsorbcijos gali būti nustatyti atliekant dumblo analizę po atitinkamos desorbcijos.

Siekiant išryškinti skirtumą tarp biologinio skaidymo (arba dalinio biologinio skaidymo) ir adsorbcijos, reikia atlikti tolesnius (papildomus) bandymus.

Tai galima daryti įvairiais būdais, tačiau patikimiausias būdas pamatiniame bandyme (geriau, kad tai būtų respirometrinis bandymas) užkratu naudoti skystį virš dumblo.

Jei stebimos didelės IOA arba ChDS šalinimo vertės, to priežastis yra biologinis skaidymas, tuo tarpu, jei šalinimo vertės mažos, biologinis skaidymas neatskiriamas nuo eliminavimo. Pvz., jei tirpus junginys turi didelę 98% adsorbcijos konstantą, o perteklinio dumblo nuostolių laipsnis yra 10% per parą, eliminavimas gali būti iki 40%; jei perteklinio dumblo nuostolių laipsnis yra 30%, eliminavimas dėl adsorbcijos ant perteklinio dumblo ir pašalinimo kartu su juo gali sudaryti iki 65% (4).

Taikant specifinę analizę, reikia kreipti dėmesį į ryšį tarp medžiagos sandaros ir taikomos specifinės analizės. Šiuo atveju stebimas reiškinys negali būti interpretuojamas kaip junginio mineralizacija.

2. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 303 A, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) EC.6. Degradation Test-Chemical Oxygen Demand.

(3) Painter, H. A., King, E. F., WRC Porous-Pot method for assessing biodegradability, Technical Report TR70, June 1978, Water Research Centre, United Kingdom.

(4) Wierich, P., Gerike, P., The fate of soluble, recalcitrant, and adsorbing compounds in activated sludge plants, Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 5, No 2, June 1981, pp. 161 to 171.

(5) Council Directives 82/242/EEC and 82/243/EEC, Official Journal of the European Communities, No L 109, 22.4.1982, amending Council Directives 73/404/EEC and 73/405/EEC on biodegradability of detergents, Official Journal of the European Communities, No L 347, 17.12.1973.

(6) Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreißetests, insbesondere bei Ringversuchen zur Überprüfung analytisch-chemischer Untersuchungsmetoden, Fresenius-Zeitschrift fur Analytiche Chemie, 303 (1980). pp. 406 to 408.

1 priedas

1 paveikslas

Detalizavimas:

A = indas nuotekoms laikyti;	E = aeroliftinis siurblys;
B = dozavimo įtaisas;	F = rinktuvas;
C = aeravimo kamera (3 l talpos);	G = aeratorius;
D = nusodintuvas;	H = oro debitmatis (neprivalomas).

2 paveikslas

2 priedas

1 paveikslas

Įranga, naudota įvertinant biologinį skaidymą

3493-74b

Detalizavimas:

A = indas nuotekoms laikyti;	E = ištakio rinktuvas;
B = dozavimo siurblys;	F = difuzinis aeratorius;
C = akytas aeravimo indas;	G = rotametras (neprivalomas).
D = išorinis indas su nelaidžiomis sienelėmis;

2 paveikslas

Trijų litrų talpos akyto indo tipo aeratoriaus detalės

3 priedas

Sąlygos vykdyti aktyviojo dumblo modeliavimo bandymą

Žymėti kiekvienoje grupėje

________________________________________________________________________________

Aparatūra

OECD patvirtinamasis bandymas

Akytojo indo bandymas

________________________________________________________________________________

Eksploatavimo režimas

Atskiras įrenginys

Sudvejinti įrenginiai

Nesudvejinti įrenginiai

________________________________________________________________________________

Persėjimas

Netaikomas

Aktyviojo dumblo

Skysčio virš dumblo

________________________________________________________________________________

Vidutinė sulaikymo trukmė

Trys valandos

Šešios valandos

________________________________________________________________________________

Pagrindinė mitybinė terpė

Buitinės nuotekos

Sintetinės nuotekos

Užkratas

Antrinis ištakis

Sudėtinė

Aktyvusis dumblas

________________________________________________________________________________

Bandomosios medžiagos dėjimas

Bandymo pradžioje

Laipsniškai didinant kiekį

Dumblui susidarius

________________________________________________________________________________

Analizė

Specifinė

ChDS

IOA

________________________________________________________________________________

BIOloginis skaidymas AKTYVIOJO DUMBLO KVĖPAVIMO INHIBAVIMO BANDYMAS

1. METODas

1.1. Įvadas

Aprašytas metodas įvertina bandomosios medžiagos poveikį mikroorganizmams, kai apibrėžtomis sąlygomis ir, naudojant skirtingas bandomosios medžiagos koncentracijas, matuojamas kvėpavimo intensyvumas.

Šio metodo tikslas yra duoti greitą atrankos metodą, kuriuo galima būtų identifikuoti medžiagas, galinčias neigiamai veikti aerobinius mikrobinio valymo įrenginius, ir nustatyti bandomųjų medžiagų koncentracijas, kurias naudojant nebūtų inhibavimo ir kurios būtų tinkamos naudoti biologinio skaidymo bandymuose.

Prieš galutinį bandymą gali būti atliekamas intervalo nustatymo bandymas. Jis suteikia informacijos apie koncentracijų, kurias reikia naudoti pagrindiniame bandyme, intervalą.

Į bandymo schemą įtraukti du kontroliniai bandymai be bandomosios medžiagos, vienas daromas bandymų serijos pradžioje, o kitas – pabaigoje. Be to, kiekviena aktyviojo dumblo partija turi būti patikrinta, naudojant etaloninę medžiagą.

Šį metodą lengviausia taikyti medžiagoms, kurios dėl jų tirpumo vandenyje ir mažo lakumo veikiausiai lieka vandenyje.

Medžiagoms, kurių tirpumas bandomojoje terpėje yra ribotas, gali būti neįmanoma nustatyti EC50.

Išvados, padarytos pagal rezultatus, kurie remiasi deguonies suvartojimu, gali būti klaidingos, kai bandomoji medžiaga turi polinkį perskirti oksidavimą ir fosforilinimą oksidacinio fosforilinimo procese.

Bandymui atlikti naudinga turėti tokią informaciją:

– tirpumas vandenyje,

– garų slėgis,

– struktūrinė formulė,

– bandomosios medžiagos grynumas.

Patarimas

Aktyviajame dumble gali būti potencialiai patogeninių organizmų, todėl elgtis su juo reikia atsargiai.

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

Kvėpavimo intensyvumas yra nuotekų aerobiniame dumble esančių mikroorganizmų deguonies suvartojimas, paprastai reiškiamas mg O2 vienam mg dumblo per valandą.

Norint skaičiuoti konkrečios koncentracijos bandomosios medžiagos inhibuojamąjį veikimą, kvėpavimo intensyvumas reiškiamas dviejų kontrolinių kvėpavimo intensyvumo verčių vidurkio procentine dalimi:

čia:

Rs = deguonies suvartojimo intensyvumas, bandant konkrečią bandomosios medžiagos koncentraciją,

= deguonies suvartojimo intensyvumas 1 kontroliniame bandyme,

= deguonies suvartojimo intensyvumas 2 kontroliniame bandyme.

EC₅₀ šiame metode yra bandomosios medžiagos koncentracija, kurią naudojant kvėpavimo intensyvumas sudaro 50% kvėpavimo intensyvumo kontroliniame kvėpavimo bandyme šiame metode aprašytomis sąlygomis.

1.3. Etaloninės medžiagos

Rekomenduojama kaip etaloninę medžiagą naudoti 3,5-dichlorfenolį, kuris yra žinomas kvėpavimo inhibitorius, ir naudoti jį kaip priemonę patikrinti, ar dumblo jautrumas nėra nenormalus, nustatant medžiagos EC₅₀ kiekvienai aktyviojo dumblo partijai.

1.4. Bandymų metodo esmė

Aktyvusis dumblas pamaitinamas standartiniu kiekiu mitybinės terpės, kurią sudaro sintetinės nuotekos, ir po 30 min arba 3 valandų sąlyčio arba abiem atvejais matuojamas dumblo kvėpavimo intensyvumas. Taip pat matuojamas to paties aktyviojo dumblo kvėpavimo intensyvumas, pridėjus skirtingų koncentracijų bandomosios medžiagos, kai kitos sąlygos yra identiškos. Bandomosios medžiagos inhibuojamasis veikimas, esant konkrečiai koncentracijai, išreiškiamas dviejuose kontroliniuose bandymuose gautų verčių vidurkio procentine dalimi. Pagal matavimus skirtingose koncentracijose apskaičiuojama EC₅₀ vertė.

1.5. Kokybės kriterijai

Bandymo rezultatai validūs, jei:

– kvėpavimo intensyvumo vertės abiejuose kontroliniuose bandymuose skiriasi mažiau kaip 15%,

– 3,5-dichlorfenolio EC₅₀ (30 minučių ir/arba trijų valandų) yra priimtiname intervale nuo 5 mg/litre iki 30 mg/litre.

1.6. Bandymų metodo aprašymas

1.6.1. Reagentai

1.6.1.1. Bandomosios medžiagos tirpalai

Bandomosios medžiagos tirpalai ruošiami iš pradinio tirpalo prieš pat tyrimo pradžią. Jei daroma pagal toliau aprašytą rekomenduojamą metodiką, tinka 0,5 g/litre koncentracijos pradinis tirpalas.

1.6.1.2. Etaloninės medžiagos tirpalas

3,5-dichlorfenolio tirpalą galima ruošti, pavyzdžiui taip: ištirpinama 0,5 g 3,5-dichlorfenolio 10 ml 1 M NaOH, praskiedžiama distiliuotu vandeniu maždaug iki 30 ml, maišant pilama 0,5 M H2SO4, kol pradeda kristi nuosėdos, tam reikia maždaug 8 ml 0,5 M H₂SO₄, ir galiausiai distiliuotu vandeniu mišinys praskiedžiamas iki vieno litro. pH vertė turi būti intervale nuo 7 iki 8.

1.6.1.3. Sintetinės nuotekos

Sintetinių nuotekų mitybinė terpė ruošiama tirpinant tokius šių medžiagų kiekius 1 litre vandens:

– 16 g peptono,

– 11 g mėsos ekstrakto,

– 3 g karbamido,

– 0,7 g NaCl,

– 0,4 g CaCl₂ 2H₂O,

– 0,2 g MgSO4 7H₂O,

– 2,8 g K₂HPO4.

1 pastaba: šios sintetinės nuotekos yra koncentratas, kurio koncentracija 100 kartų didesnė nei nuotekų, aprašytų OECD techninėje ataskaitoje „Proposed metod for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents“ (siūlomas paviršinio aktyvumo medžiagų, naudojamų sintetiniuose plovikliuose, biologinio skaidomumo nustatymo metodas) (1976 m. birželio 11 d.), ir pridedant kalio hidrofosfato.

2 pastaba: jei paruošta terpė naudojama ne iš karto, ji turi būti laikoma tamsoje nuo 0 iki 4°C ir ne ilgiau kaip vieną savaitę sąlygomis, kurios nekeistų nuotekų sudėties. Prieš dedant saugoti, terpę galima sterilizuoti, arba peptonas ir mėsos ekstraktas dedami prieš pat bandymo pradžią. Prieš naudojant terpė turi būti gerai sumaišoma ir nustatoma jos pH vertė.

1.6.2. Aparatūra

Matavimo aparatas: tiksli konstrukcija nėra svarbi. Tačiau turi būti talpa apie kakliuką skysčio pertekliui, o elektrodas turi būti priderintas sandariam įstatymui į matavimo butelio kakliuką.

Be įprastos laboratorijos įrangos, dar reikalinga tokia speciali įranga:

– matavimo aparatas,

– aeravimo įtaisas,

– pH-elektrodas ir pH matavimo įranga,

– O₂elektrodas.

1.6.3. Užkrato ruošimas

Bandymuose mikroorganizmų užkratu naudojamas aktyvusis dumblas iš valymo įrenginio, valančio daugiausia buitines nuotekas.

Jei būtina, grįžus į laboratoriją stambias daleles galima pašalinti, paliekant dumblą trumpą laiką, pvz., 15 minučių, nusistoti ir viršutinį smulkesnių dalelių sluoksnį dekantuoti bei toliau naudoti. Kitu būdu dumblą galima sumaišyti, kelioms sekundėms įjungus greitaeigį maišytuvą.

Be to, jei manoma, kad gali būti inhibuojančių medžiagų, dumblas turi būti išplautas vandentiekio vandeniu arba izotoniniu tirpalu. Po centrifugavimo skystis nuo nuosėdų dekantuojamas (taip plaunama tris kartus).

Nedidelis dumblo kiekis pasveriamas ir išdžiovinamas. Remiantis šiuo rezultatu, galima apskaičiuoti, kiek šlapio dumblo reikia suspenduoti vandenyje, kad gautame aktyviojo dumblo ir vandens mišinyje suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija būtų nuo 2 g/litre iki 4 g/litre. Toks kiekis atitinka koncentraciją bandomojoje terpėje nuo 0,8 iki 1,6 g/litre, jei būtų taikoma toliau rekomenduota metodika.

Jei nėra galimybės dumblą panaudoti rinkimo dieną, vienam litrui aktyviojo dumblo įpilama 50 ml sintetinių nuotekų mitybinės terpės, paruoštos, kaip aprašyta aukščiau; ir mišinys per naktį aeruojamas 20 ± 2°C temperatūroje. Dieną jis ir toliau aeruojamas, kol bus panaudotas. Prieš naudojant dumblą, tikrinama pH vertė ir prireikus nustatoma intervale nuo 6 iki 8. Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija aktyviojo dumblo ir nuotekų mišinio bandinyje turi būti nustatyta, kaip tai aprašyta ankstesnėje pastraipoje.

Jei ta pati dumblo partija turi būti naudojama kitomis dienomis (ne vėliau kaip po keturių parų), kiekvienos darbo dienos pabaigoje vienam litrui dumblo įpilama dar 50 ml sintetinių nuotekų mitybinės terpės.

1.6.4. Bandymo eiga

Trukmė/sąlyčio trukmė:	30 minučių ir (arba) trys valandos aeravimo sąlygomis
Vanduo:	Geriamasis vanduo (prireikus dechloruotas)
Oro tiekimas:	Švarus, be alyvos oras. Oro srautas – nuo 0,5 iki 1 l/min
Matavimo aparatūra:	Plokščiadugnė kolba, pvz., BDS kolba
Deguonies matuoklis:	Tinkamas deguonies elektrodas ir registravimo įrenginys (savirašis)
Mitybinis tirpalas:	Sintetinės nuotekos (žr. aukščiau)
Bandomoji medžiaga:	Bandomosios medžiagos tirpalas ruošiamas prieš bandymo pradžią
Etaloninė medžiaga:	Pvz., 3,5-dichlorfenolis (ne mažiau kaip trys koncentracijos)
Kontroliniai bandymai:	Užkrato bandinys be bandomosios medžiagos
Temperatūra:	20 ± 2°C.

Toliau pateikiama siūloma eksperimento procedūra, kurią galima taikyti ir bandomajai ir etaloninei medžiagai trijų valandų sąlyčio trukmės atvejui:

Naudojami keli indai (pvz., vieno trijų litrų talpos laboratorinės stiklinės). Turi būti naudojamos bent penkios koncentracijos, besiskiriančios pastoviu santykiu, geriausiai ne didesniu kaip 3,2.

Laiku „0“ 16 ml sintetinių nuotekų mitybinės terpės vandeniu skiedžiama iki 300 ml. Įpilama 200 ml mikrobinio užkrato ir visas mišinys (500 ml) supilamas į pirmąjį indą (pirmasis kontrolinis bandymas C1).

Bandymų indai turi būti visą laiką aeruojami tiek, kad ištirpusio O₂ kiekis būtų ne mažesnis kaip 2,5 mg/litre ir kad prieš pat kvėpavimo intensyvumo matavimą O₂ koncentracija būtų apie 6,5 mg/litre.

Laiku „15 minučių“ (15 minučių trukmė yra laisvai pasirenkama, tačiau tai patogus laiko tarpas) kartojama, kas padaryta anksčiau, tik prieš skiedžiant vandeniu iki 300 ml ir pilant mikrobinio užkrato iki 500 ml, į 16 ml sintetinių nuotekų įpilama 100 ml pradinio bandomosios medžiagos tirpalo. Šis mišinys supilamas į antrą indą ir aeruojamas, kaip nurodyta aukščiau. Kas 15 minučių veiksmų seka kartojama, imant skirtingus bandomosios medžiagos pradinio tirpalo tūrius, kad būtų gauta eilė indų su skirtingomis bandomosios medžiagos koncentracijomis. Paskutinis ruošiamas antrasis kontrolinis bandinys (C₂).

Po trijų valandų fiksuojama pH vertė, ir gerai sumaišytas pirmojo indo turinio bandinys supilamas į matavimo aparatą, kuriame ne ilgiau kaip 10 minučių matuojamas kvėpavimo intensyvumas.

Šis nustatymas kas 15 minučių kartojamas su kiekvieno indo turiniu tokiu būdu, kad sąlyčio trukmė visuose induose būtų trys valandos.

Tokiu pat būdu su kiekviena mikrobinio užkrato porcija bandoma etaloninė medžiaga.

Jei reikia matuoti 30 min sąlyčio sąlygomis, būtina taikyti kitokį matavimo režimą (pvz., turėti daugiau nei vieną deguonies matuoklį).

Jei reikia nustatyti cheminį deguonies suvartojimą, ruošiami papildomi indai su bandomąja medžiaga, sintetinių nuotekų mitybine terpe ir vandeniu, bet be aktyviojo dumblo. Deguonies suvartojimas matuojamas ir užrašomas po 30 minučių ir/ar trijų valandų aeravimo (sąlyčio trukmė).

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Kvėpavimo intensyvumas skaičiuojamas pagal savirašio užrašą apytikriai tarp 6,5 mg/litre O₂ ir 2,5 mg/litre O₂ arba 10 minučių tuo laikotarpiu, jei kvėpavimo intensyvumas yra mažas. Kvėpavimo kreivės dalis, kurioje matuojamas kvėpavimo intensyvumas, turi būti tiesiška.

Jei kvėpavimo intensyvumas dviejuose kontroliniuose bandymuose vienas nuo kito skiriasi daugiau kaip 15% arba etaloninės medžiagos EC₅₀ (30 minučių ir/arba trijų valandų) nėra priimtiname intervale (nuo 5 iki 30 mg/litre 3,5-dichlorfenoliui), bandymas yra nevalidus ir turi būti pakartotas.

Inhibavimo procentinė vertė skaičiuojama kiekvienai bandomajai koncentracijai (žr. 1.2). Procentinės inhibavimo vertės priklausomybė nuo koncentracijos brėžiama logaritminiame (arba logaritminiame-tikimybiniame) popieriuje, ir gaunama EC₅₀ vertė.

95% pasikliovimo intervalai EC₅₀ vertėms gali būti nustatyti, taikant standartines procedūras.

3. ATASKAITA

3.1. Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– bandomoji medžiaga: cheminio identifikavimo duomenys,

– bandymų sistema: aktyviojo dumblo šaltinis, koncentracija ir bet koks pradinis kondicionavimas,

– bandymų sąlygos:

– reakcijos mišinio pH vertė prieš kvėpavimo intensyvumo matavimą,

– bandymų temperatūra,

– bandymų trukmė,

– etaloninė medžiaga ir jos išmatuota EC₅₀vertė,

– abiotinis deguonies suvartojimas (jei tai vyko),

rezultatai:

– visi gauti duomenys,

– inhibavimo kreivė ir metodas EC₅₀ skaičiuoti,

– EC₅₀ ir, jei įmanoma, 95% pasikliovimo intervalus, EC₂₀ ir EC₈₀,

– visi pastebėjimai ir bet kokie nukrypimai nuo šio bandymo metodo, kurie galėtų turėti įtakos rezultatui.

3.2. Duomenų interpretavimas

Į EC₅₀ vertę turi būti žiūrima tiktai kaip į orientacinį bandomosios medžiagos toksiškumą nuotekų valymo aktyviuoju dumblu procesui arba nuotekų mikroorganizmams, kadangi aplinkos sudėtingų sąveikų laboratoriniame bandyme negalima tiksliai modeliuoti. Be to, bandomosios medžiagos, kurios gali inhibuoti amoniako oksidavimą, taip pat gali duoti netipiškas inhibavimo kreives. Taigi šios kreivės turi būti interpretuojamos atsargiai.

4. NUORODOS

(1) International Standard ISO 8192-1986.

(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, p. 165.

(3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer. L., Chemosphere 10, 1981, p. 245.

(4) ETAO (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries), Recommended Method No 103, dar aprašyti:

(5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, p. 80.

(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, p. 247.

(7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C(81) 30 final.

BIOloginis skaidymas

MODIFIkuotas SCAS bandymas

1. METODAS

1.1. Įvadas

Metodo tikslas yra įvertinti vandenyje tirpių, nelakių organinių medžiagų galimą biologinį suskaidymą, kai jas ilgą laiką veikia palyginti didelės mikroorganizmų koncentracijos. Mikroorganizmų gyvybingumas tuo laikotarpiu palaikomas kiekvieną dieną pridedant nusistojusių nuotekų mitybinės terpės. (Savaitgaliais nuotekas galima laikyti 4oC temperatūroje. Dar galima naudoti sintetines nuotekas, kurios naudojamos OECD patvirtinamajame bandyme).

Ant suspenduotų standžiųjų dalelių gali vykti fizikocheminė adsorbcija, todėl į tai turi būti atsižvelgta interpretuojant rezultatus (žr. 3.2).

Dėl skystosios fazės didelės sulaikymo trukmės (36 valandos) ir dėl nutrūkstamo mitybinių medžiagų pridėjimo bandymas nemodeliuoja nuotekų valymo įrenginio sąlygų. Rezultatai, gauti įvairioms bandymų medžiagoms, rodo, kad bandymas turi didelį biologinio skaidymo potencialą.

Bandyme sudarytos sąlygos yra labai palankios atrankai ir /arba adaptavimui mikroorganizmų, galinčių suskaidyti bandomąją medžiagą. (Procedūra gali būti taikoma ruošimui aklimatizuotų užkratų kitiems bandymams.)

Šiame metode bandomosios medžiagos biologiniam suskaidymui įvertinti naudojamas ištirpusios organinės anglies (IOA) kiekio matavimas. Pirmenybė teikiama atvejui, kai IOA nustatoma po parūgštinimo ir prapūtimo, o ne kaip skirtumas C_bendroji – C_neorganinė.

Lygiagrečiai taikant specifinį analizės metodą, gali būti įmanoma įvertinti medžiagos pirminį biologinį skaidymą (pirminės cheminės sandaros išnykimas).

Metodas tinka tik toms organinėms bandomosioms medžiagoms, kurios, esant bandyme naudojamai koncentracijai:

– tirpios vandenyje (ne mažiau kaip 20 mg/litre ištirpusios organinės anglies),

– garų slėgis yra labai mažas,

– neinhibuoja bakterijų,

– bandymų sistemoje adsorbuojamos tik nežymiu laipsniu,

– iš bandomojo tirpalo nepradingsta dėl putojimo.

Turi būti nustatytas organinės anglies kiekis bandomojoje medžiagoje.

Norint paaiškinti gautus rezultatus, ypač kai rezultatai yra maži arba nežymūs, naudinga būtų turėti informacijos apie bandomosios medžiagos pagrindinių komponentų santykinę dalį.

Mažų rezultatų verčių interpretavimui ir tinkamos bandomosios koncentracijos parinkimui pageidautina turėti informacijos apie medžiagos toksiškumą mikroorganizmams.

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

CT = bandomosios medžiagos koncentracija, skaičiuojama organinės anglies kiekiu, kuris yra nusistovėjusiose nuotekose ar pridedamas į jas aeravimo laikotarpio pradžioje (mg/litre),

Ct = ištirpusios organinės anglies koncentracija, nustatyta bandomajame skystyje virš nuosėdų aeravimo laikotarpio pabaigoje (mg/litre),

Cc = ištirpusios organinės anglies koncentracija, nustatyta kontrolinio bandinio skystyje virš nuosėdų aeravimo laikotarpio pabaigoje (mg/litre).

Šiame bandyme biologinis skaidymas nustatomas kaip organinės anglies išnykimas.

Biologinį skaidymą galima išreikšti:

1. Kiekvieną dieną įdedamos medžiagos šalinimo procentinė vertė D_ds:

[1]

čia D_ds = skaidymas/kasdienis pridėjimas.

2. Kiekvienos dienos pradžioje turimo medžiagos kiekio šalinimo procentinė vertė Dssd:

čia D_ssd = skaidymas/medžiagos kiekis dienos pradžioje;

indeksai i ir (i + 1) nurodo matavimo dieną.

2(a) lygtį rekomenduojama taikyti, jei ištakio IOA kinta diena po dienos, o 2(b) lygtis gali būti taikoma, kai ištakio IOA diena po dienos palyginti pastovi.

1.3. Etaloninės medžiagos

Kai kuriais atvejais, kai tiriamos naujos medžiagos, etaloninės medžiagos gali būti naudingos, tačiau nėra specifinės etaloninės medžiagos, kurią galima būtų rekomenduoti šiam bandymui.

Yra pateikti pirminiai duomenys apie kelis junginius, įvertintus tarplaboratorinio lyginimo bandymuose (žr. 1 papildymą), taigi retkarčiais metodą galima patikrinti ir rezultatus palyginti su rezultatais, gautais kitais metodais.

1.4. Bandymų metodo esmė

Aktyvusis dumblas iš nuotekų valymo įrenginio dedamas į pusiau nepertraukiamo veikimo aktyviojo dumblo įrenginį [Semi-Continuous Activated Sludge (SCAS)]. Įdedama bandomosios medžiagos ir nusistojusių buitinių nuotekų, mišinys aeruojamas 23 valandas. Paskui aeravimas stabdomas, dumblas paliekamas nusistoti ir skystis virš dumblo pašalinamas.

Aeravimo kameroje likęs dumblas maišomas su kita bandomosios medžiagos ir nuotekų dalimi ir ciklas kartojamas.

Biologinio skaidymo buvimas įrodomas nustatant ištirpusios organinės anglies kiekį skystyje virš dumblo. Ši vertė lyginama su verte, gauta skysčiui kontroliniame reaktoriaus vamzdyje, kuriame buvo tik nuotekos.

Taikant specifinį analizės metodą, galima nustatyti pradinės medžiagos koncentracijos mažėjimą dėl jos molekulių biologinio skaidymo (pirminį biologinį skaidomumą).

1.5. Kokybės kriterijai

Šio metodo, kuris remiasi ištirpusios organinės medžiagos šalinimu, atkuriamumas dar nėra nustatytas. (Kai tiriamas pirminis biologinis skaidymas, labai tikslūs duomenys yra gauti medžiagoms, kurios skaidomos dideliu laipsniu.)

Metodo jautrumą dideliu laipsniu lemia tuščiojo bandymo kintamumas ir kiek mažiau ištirpusios anglies nustatymo preciziškumas ir bandomosios medžiagos kiekis skystyje kiekvieno ciklo pradžioje.

1.6. Bandymų eigos aprašymas

1.6.1. Paruošiamieji darbai

Oro tiekimo vamzdeliai (1 paveikslas) jungiami prie reikiamo skaičiaus švarių aeravimo įrenginių, skirtų kiekvienai bandymo medžiagai ir kontroliniams bandymams, arba galima naudoti originalųjį 1,5 litro SCAS bandymo įrenginį. Į įrenginius per medvilnės filtrą tiekiamame suslėgtame ore neturi būti organinės anglies ir garavimo nuostoliams mažinti oras turi būti prisotintas vandens garų.

Aktyviojo dumblo ir nuotekų mišinio bandinys, kuriame būtų nuo 1 iki 4 g/litre suspenduotų standžiųjų dalelių, gaunamas iš daugiausia buitines nuotekas valančio aktyviojo dumblo įrenginio. Kiekvienam aeravimo įrenginiui reikia maždaug 150 ml aktyviojo dumblo ir nuotekų mišinio.

Pradiniams bandomosios medžiagos tirpalams ruošti naudojamas distiliuotas vanduo; paprastai reikia, kad organinės anglies koncentracija būtų 400 mg/litre, tokiu atveju bandomosios medžiagos koncentracija kiekvieno aeravimo ciklo pradžioje, kai nevyksta biologinis skaidymas, yra 20 mg/litre.

Galima naudoti didesnes koncentracijas, jei tai įmanoma, dėl medžiagos toksiškumo mikroorganizmams.

Nustatomas organinės anglies kiekis pradiniuose tirpaluose.

1.6.2. Bandymų sąlygos

Bandymas turi būti atliekamas 20–25°C temperatūroje.

Naudojama didelė aerobinių mikroorganizmų koncentracija (nuo 1 iki 4 g/litre suspenduotų standžiųjų dalelių), ir veiksmingoji sulaikymo trukmė yra 36 valandos. Anglingoji medžiaga nuotekų mitybinėje terpėje oksiduojama dideliu laipsniu, paprastai tai įvyksta per aštuonias valandas nuo kiekvieno aeravimo ciklo pradžios. Po to iki aeravimo laikotarpio pabaigos dumblas kvėpuoja endogeniškai, tuo metu vienintelis substratas yra bandomoji medžiaga, jei ji pati nebuvo lengvai įsisavinta. Šios savybės, kartu su užkrato kasdieniu keitimu, kada kaip terpė naudojamos buitinės nuotekos, užtikrina labai palankias aklimatizavimo sąlygas ir galimybę biologiškai skaidyti dideliu laipsniu.

1.6.3. Bandymų eiga

Iš tinkamo aktyviojo dumblo valymo įrenginio arba laboratorinio įrenginio, skirto valyti daugiausia buitines nuotekas, imamas nuotekų ir aktyviojo dumblo mišinys, kuris visą laiką, kol bus panaudotas laboratorijoje, laikomas aerobinėmis sąlygomis. Į kiekvieną aeravimo įrenginį ir į kontrolinį įrenginį įpilama po 150 ml šio mišinio (jei naudojamas originalus SCAS bandymo įtaisas, nurodytus tūrius reikia dauginti iš 10) ir pradedama aeruoti. Po 23 valandų aeravimas baigiamas ir dumblas 45 minutėms paliekamas nusistoti. Kiekvieno indo čiaupas paeiliui atidaromas, ir iš jo paimama po 100 ml skysčio virš dumblo. Prieš pat naudojimą paimamas nusistojusių buitinių nuotekų bandinys, ir 100 ml nuotekų įpilama į kiekvieną aeravimo įrenginį su likusiu jame dumblu. Vėl pradedama aeruoti. Šioje pakopoje bandomoji medžiaga nededama, ir į įrenginius kiekvieną dieną pilama buitinių nuotekų tol, kol skystis virš nusistojusio dumblo tampa skaidrus. Tai dažniausiai trunka ne ilgiau kaip dvi savaites, per tą laiką ištirpusios organinės anglies kiekis skystyje virš dumblo kiekvieno aeravimo ciklo pabaigoje pasiekia pastovią vertę.

Kai šis laikotarpis baigiasi, atskirieji nusistojusio dumblo bandiniai yra sumaišomi ir į kiekvieną įrenginį dedama po 50 ml gauto sudėtinio dumblo.

Į kontrolinius įrenginius įpilama 95 ml nusistojusių nuotekų ir 5 ml vandens, į bandomuosius įrenginius įpilama 95 ml nusistojusių nuotekų ir 5 ml atitinkamos bandomosios medžiagos pradinio tirpalo (400 mg/litre). Aeruoti pradedama iš naujo ir aeravimas tęsiamas 23 valandas. Po to dumblas paliekamas 45 minutėms nusistoti, skystis virš dumblo nusiurbiamas ir jame nustatomas ištirpusios organinės anglies kiekis.

Aukščiau aprašytas užpylimo ir siurbimo procesas kartojamas kasdien iki bandymo pabaigos.

Prieš paliekant dumblą nusistoti, gali tekti jį nuvalyti nuo įrenginio sienelių, kad kietosios dalelės nesikauptų virš skysčio. Norint išvengti kryžminio užkrėtimo, kiekvienas įrenginys turi turėti atskirą gremžtuką ar šepetį.

Geriausia būtų, kad ištirpusi organinė anglis skystyje virš dumblo būtų nustatoma kiekvieną dieną, nors analizę leidžiama daryti rečiau. Prieš analizę skysčiai filtruojami per išplautus 0,45 m membraninius filtrus arba centrifuguojami. Membraniniai filtrai tinka, jei užtikrinama, kad filtravimo pakopoje jie neišskiria anglies ir nesugeria medžiagos. Centrifuguojamo bandinio temperatūra neturi būti didesnė kaip 40°C.

Bandymo trukmė junginiams, kurie yra mažai skaidomi arba visiškai neskaidomi, nėra apibrėžta, tačiau patyrimas sako, kad dažniausiai tai turi trukti bent 12 savaičių, bet ne ilgiau kaip 26 savaites.

2. DUOMENYS IR VERTINIMAS

Ištirpusios anglies kiekio vertės, nustatytos bandomųjų ir kontrolinių įrenginių skysčiuose virš nuosėdų, atidedamos grafiškai kaip laiko funkcija.

Baigus biologinį skaidymą, bandomajame įrenginyje nustatytas lygis artėja prie kontroliniame bandinyje rasto lygio. Kai skirtumas tarp abiejų lygių trijuose iš eilės matavimuose nekinta, dar atliekama tiek matavimų, kiek jų pakanka duomenims statistiškai apdoroti, ir skaičiuojama bandomosios medžiagos biologinio skaidymo procentinė vertė (Dds ar Dssd, žr. 1.2).

3. ATASKAITA

3.1. Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:

– visa informacija apie nuotekų prigimtį, naudoto įrenginio tipą ir eksperimentiniai rezultatai, gauti bandomajai medžiagai, etaloninei medžiagai, jei buvo naudojama, ir tuščiajam bandymui,

– temperatūra,

– šalinimo kreivė su aprašymu, skaičiavimo būdu (žr. 1.2),

– data ir vieta, kur buvo imti aktyviojo dumblo ir nuotekų bandiniai, adaptavimo būsena, koncentracija ir t. t.,

– mokslinis bet kokių bandymų metodikos keitimų pagrindimas,

– parašas ir data.

3.1. Duomenų interpretavimas

Kadangi medžiaga, skirta šiuo metodu bandyti, biologiškai nėra lengvai skaidoma, bet koks IOA šalinimas vien tik dėl biologinio skaidymo paprastai vyksta laipsniškai dienas arba savaites, išskyrus tuos atvejus, kai įvyksta staigus aklimatizavimas, apie kurį rodo staigus išnykimas, įvykstantis po kelių savaičių.

Svarbų vaidmenį gali vaidinti fizikocheminė adsorbcija; ją rodo pridėtos IOA visiškas arba dalinis išnykimas bandymo pradžioje. Kas atsitinka vėliau, priklauso nuo kai kurių faktorių, pvz., adsorbcijos laipsnio, ir suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracijos išleidžiamajame ištakyje. Paprastai skirtumas tarp IOA koncentracijos kontrolinio bandymo ir bandomosios medžiagos skystyje virš nuosėdų laipsniškai didėja nuo pradinės mažos vertės ir toliau šis skirtumas pasiekęs naują vertę išlieka toks iki bandymo pabaigos, jei neįvyksta aklimatizavimas.

Jei reikia išryškinti skirtumą tarp biologinio skaidymo (ar dalinio biologinio skaidymo) ir adsorbcijos, būtina atlikti tolesnius bandymus. Tai galima daryti įvairiais būdais, tačiau įtikinamiausias būdas yra pamatiniame bandyme (geriau, kad tai būtų respirometrinis bandymas), kaip užkratą naudojant skystį virš dumblo arba dumblą.

Bandomosios medžiagos, kurių neadsorbcinio IOA šalinimo vertės bandyme yra didelės, turi būti laikomos potencialiai biologiškai skaidomomis. Dalinis neadsorbcinis šalinimas rodo, kad cheminė medžiaga bent kažkiek yra biologiškai skaidoma.

Mažos ar nulinės IOA (ChDS) šalinimo vertės gali būti dėl mikroorganizmų inhibavimo bandomąja medžiaga, tai dar gali parodyti dumblo irimas ir jo praradimas, dėl ko skystis virš dumblo drumsčiasi. Bandymas turi būti pakartotas, naudojant mažesnę bandomosios medžiagos koncentraciją.

Naudojant specifinį junginio analizės metodą ar bandomąsias medžiagas su žymėtais ¹⁴C atomais, gali būti pasiektas didesnis jautrumas. Jei bandomasis junginys turi ¹⁴C, ¹⁴CO₂ surinkimas patvirtintų, kad biologinis skilimas įvyko.

Kai duomenys pateikiami, kaip pirminio biologinio skaidymo rezultatai, turi būti paaiškinta, jei tai įmanoma, kaip pakito cheminė sandara, kad neliko pradinės bandomosios medžiagos atsako.

Turi būti pateiktas analizės metodo galiojimo patvirtinimas ir tuščiojo bandymo terpėje nustatyta skaidymo vertė.

4. NUORODOS

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 A. Decision of the Council C(81) 30 final.

1 priedas

SCAS bandymas: rezultatų pavyzdys

Medžiaga	C_T (mg/l)	C_t – C_c (mg/l)	Biologinio skaidymo procentinė vertė, Dds	Bandymo trukmė(paros)
4-acetilaminobenzensulfonatas	17,2	2,0	85	40
Tetrapropenbenzensulfonatas	17,3	8,4	51,4	40
4-nitrofenolis	16,9	0,8	95,3	40
Dietilenglikolis	16,5	0,2	98,8	40
Anilinas	16,9	1,7	95,9	40
Ciklopentantetrakarboksilatas	17,9	3,2	81,1	120

2 priedas

1 paveikslas

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos aplinkos ministro

2004 m. balandžio 19 d. įsakymu Nr. D1-193

CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ IR PREPARATŲ EKOTOKSIŠKUMO TYRIMO METODAI

LAND45-2003

(LAND 45 – 2001 papildymas)

BIOLOGINIS KONCENTRAVIMAS: BANDYMAS SU ŽUVIMIS,

ESANT PRATEKĖJIMO SĄLYGOMS (C 13 )

1 METODAS

Šis biologinio koncentravimo metodas yra OECD TG 305 (1996) kopija.

1.1 ĮVADAS

Šis metodas aprašo pratekėjimo sąlygomis vykstančio medžiagų biologinio koncentravimo gebos žuvyse apibūdinimo procedūrą. Nors tyrimams, atliekamiems pratekėjimo režimu, pabrėžtinai teikiama pirmenybė, leidžiama naudoti ir pusiau stacionarius režimus, jei jie atitinka patikimumo kriterijus.

Metodas pateikia pakankamai išsamių bandymą atlikti reikalingų detalių, palikdamas atitinkamą laisvę eksperimento schemą pritaikyti konkrečių laboratorijų esamoms sąlygoms ir skirtingoms bandomųjų medžiagų savybėms. Jis tinkamiausias patvarioms organinėms medžiagoms, kurių log P_owvertės yra nuo 1,5 iki 6,0 (1), tačiau gali būti taikomas ir ypač lipofilinėms medžiagoms (kurių log P_ow > 6,0). Tokių ypač lipofilinių medžiagų biokoncentravimo faktoriaus (BKF), kartais žymimo KB, išankstinis įvertis greičiausiai būtų didesnis, nei nuostoviosios būsenos biokoncentravimo faktoriaus (BKFnb) vertė, kurios reikėtų laukti iš laboratorinių bandymų. Medžiagų, kurių log P_ow vertės yra iki 9,0, išankstiniai biokoncentravimo faktoriaus įverčiai gali būti gauti, naudojant Bintein ir kt. lygtį (2). Parametrams, kurie apibūdina biokoncentravimo gebą, priklauso sugerties greičio konstanta (k₁), apsivalymo greičio konstanta (k₂) ir BKFmb.

Radioaktyvias žymenas turinčios bandomosios medžiagos gali palengvinti vandens ir žuvų bandinių analizę ir gali būti naudojamos, siekiant nustatyti, ar reikia atlikti irimo produktų identifikavimą ir kiekybinį nustatymą. Jei matuojamas bendras radioaktyviųjų likučių kiekis (pvz., deginant arba soliubilizuojant audinius), BKF turi būti pagrįstas duomenimis apie pradinio junginio, visų sulaikytų metabolitų, taip pat įsisavintos anglies kiekiu. Taigi BKF vertės, pagrįstos bendruoju radioaktyviųjų likučių kiekiu, negali būti tiesiogiai lyginamos su BKF vertėmis, gautomis atliekant tik pradinio junginio selektyviąją analizę.

Norint nustatyti BKF, pagrįstą tik pradinio junginio kiekiu, tyrimuose su radioaktyviomis žymenomis gali būti naudojami gryninimo būdai, ir gali būti apibūdinti pagrindiniai medžiagų apykaitos produktai, jei laikoma, kad tai yra būtina. Analizuojant ir identifikuojant likučius audiniuose, galima sujungti medžiagų apykaitos tyrimus žuvyse su biokoncentravimo tyrimais.

1.2 APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI

Biokoncentravimas ir bioakumuliacija – bandomosios medžiagos koncentracijos didėjimas organizme (tam tikruose audiniuose) arba organizmo paviršiuje, lyginant su bandomosios medžiagos koncentracija supančioje terpėje.

Biokoncentravimo faktorius (BKF arba K_b) – bandomosios medžiagos koncentracijos žuvies viduje ir paviršiuje arba jos apibrėžtuose audiniuose (C_f, μg/g (ppm)) ir cheminės medžiagos koncentracijos supančioje terpėje (C_w, μg/ml (ppm)) santykis per bet kurį šio koncentravimo bandymo sugerties etapą.

Nuostoviosios būsenos biokoncentravimo faktorius (BKF_mb arba K_b) ilgesnį laiko tarpą daug nekinta, jei bandomosios medžiagos koncentracija supančioje terpėje nekinta.

Horizontalioji dalis arba nuostovioji būsena pasiekiama tuomet, kai bandomosios medžiagos koncentracijos žuvyje (Cf) priklausomybės nuo laiko kreivė tampa lygiagreti laiko ašiai, o trys C_f vertės, gautos analizuojant mažiausiai kas dvi paras paeiliui paimtus bandinius, viena nuo kitos nesiskiria daugiau kaip ± 20 %, ir nėra didelių skirtumų tarp trijų bandinių ėmimo periodų. Kai analizuojami sujungti bandiniai, reikia ne mažiau kaip keturių paeiliui atliktų analizių. Lėtai sugeriamoms bandomosioms medžiagoms tinkamesni būtų septynių parų tarpai.

Kinetinis biokoncentravimo faktorius (BKF_k) – biologinio koncentravimo faktorius, apskaičiuotas tiesiog iš kinetinių greičio konstantų (k₁ ir k₂).

Pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas (P_ow) – cheminės medžiagos tirpumo n-oktanolyje ir vandenyje santykis, esant pusiausvirai (A. 8 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais), taip pat išreiškiamas kaip K“_w. Cheminės medžiagos biokoncentravimo vandens organizmuose gebos rodikliu taikomas P_ow logaritmas.

Poveikio arba sugerties etapas – laiko tarpas, per kurį žuvis yra veikiama bandoma chemine medžiaga.

Sugerties greičio konstanta (k₁) – skaitinė vertė, apibūdinanti bandymo medžiagos koncentracijos žuvyje arba jos paviršiuje (arba apibrėžtuose jos audiniuose) didėjimo greitį, kai žuvis veikiama chemine medžiaga (k₁ išreiškiama (para)^-1).

Etapas po veikimo, arba apsivalymo (išnykimo) etapas – laikas, kai bandymo žuvis perkelta iš terpės su bandomąja medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos nėra, ir per kurį tiriamas bandomosios medžiagos išsivalymas (arba tiesiog išnykimas) iš bandymo žuvies arba tam tikrų jos audinių.

Apsivalymo (išnykimo) greičio konstanta (k₂) – skaitinė vertė, apibūdinanti bandomosios medžiagos koncentracijos bandymo žuvyje (arba apibrėžtuose jos audiniuose) mažėjimo greitį po to, kai bandymo žuvis buvo pernešta iš terpės su bandomąja medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos nėra (k₂ išreiškiama (para)^-1).

1.3 BANDYMŲ METODO ESMĖ

Bandymą sudaro du etapai: poveikio (sugerties) etapas ir etapas po poveikio (apsivalymo). Per sugerties etapą vienos rūšies žuvų grupės veikiamos mažiausiai bent dviejų koncentracijų bandomąja medžiaga. Išsivalyti jos pernešamos į terpę be bandomosios medžiagos. Išsivalymo etapas yra būtinas, išskyrus tuos atvejus, kai medžiagos sugertis (pereiga) buvo nedidelė (pvz., BKF yra mažesnis kaip 10). Bandomosios medžiagos koncentracija žuvyje arba jos paviršiuje (arba apibrėžtuose jos audiniuose) nustatoma per abu bandymo etapus. Kontrolinė žuvų grupė laikoma tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir bandomųjų koncentracijų, bet be bandomosios medžiagos, kad biokoncentravimo bandyme galimas neigiamas pasekmes būtų galima palyginti su kontroline grupe ir gauti bandomosios medžiagos foninių koncentracijų.

Sugerties etapas tęsiamas 28 paras, jei neįrodoma, kad pusiausvyra yra pasiekta anksčiau. Sugerties etapo trukmės ir laiko, kai bus pasiekta nuostovioji būsena, laiko prognozė gali būti padaryta pagal 3 priedo lygtį. Pernešus žuvis į kitą švarų indą su ta pačia terpe, bet be bandomosios medžiagos, pradedamas apsivalymo periodas. Pageidautina, jei įmanoma, biologinio koncentravimo fektorių apskaičiuoti ir kaip santykį koncentracijos žuvyje (C_f) su koncentracija vandenyje (C_w) tariamosios nuostoviosios būsenos sąlygomis (BKF_mb), ir kaip kinetinį biologinio koncentravimo fektorių (BKF_k), išreiškiamą sugerties (k₁) ir taikomi sudėtingesni modeliai (5 priedas).

Jei nuostovioji būsena per 28 paras nepasiekiama, sugerties etapas turi būti pratęstas, kol ji bus pasiekta, arba iki 60 parų priklausomai nuo to, kas anksčiau; tuomet pradedamas apsivalymo etapas.

Sugerties greičio konstanta, apsivalymo (išnykimo) greičio konstanta (ar konstantos, jei naudojami sudėtingesni modeliai), biologinio koncentravimo faktorius, ir, jei įmanoma, kiekvieno šių parametrų pasikliovimo ribos apskaičiuojamos pagal modelį, kuris geriausiai aprašo žuvyse ir vandenyje išmatuotas bandymo medžiagos koncentracijas.

BKF yra išreiškiamas kaip žuvies bendrosios drėgnos masės funkcija. Specialiems tikslams, jei žuvis yra pakankamai didelė, gali būti naudojami atitinkami audiniai arba organai (pvz., raumuo, kepenys), arba žuvis gali būti padalinta į valgomą (filė) ir nevalgomą (viduriai) dalis. Yra aiški daugelio organinių medžiagų biologinio koncentravimo gebos ir lipofiliškumo priklausomybė, atitinkama priklausomybė yra ir tarp riebalų kiekio bandymų žuvyse ir stebimo tokių medžiagų biologinio koncentravimo. Tokiu būdu, norint sumažinti šį bandymo rezultatų kintamumo šaltinį, lipofilinių (t.y. kurių log P_ow> 3) medžiagų biologinis koncentravimas turi būti apskaičiuojamas ne tik viso kūno masei, bet ir riebalų kiekiui.

Kai tai įmanoma atlikti, riebalų kiekis turi būti nustatomas toje pačioje biologinėje medžiagoje, kurioje nustatoma bandomoji medžiaga.

1.4 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ

Prieš atliekant biologinio koncentravimo bandymą, apie bandomąją medžiagą turi būti žinoma tokia informacija:

a) tirpumas vandenyje;

b) pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas P_ow (taip pat išreikštas kaip K_ow nustatomas HPLC metodu – A. 8 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais);

c) hidrolizė;

d) fotocheminiai virsmai vandenyje, nustatyti saulės arba dirbtinės spinduliuotės sąlygomis ir biologinio koncentravimo bandyme naudotos spinduliuotės sąlygomis (3);

e) paviršiaus įtemptis (t. y. medžiagoms, kurioms log P_ow negali būti nustatytas);

f) garų slėgis;

g) biologinio skaidomumo lengvumas (jei reikia).

Kita reikalinga informacija yra toksiškumas bandyme naudojamoms žuvų rūšims, geriausiai – asimptotiška (t.y. nuo laiko nepriklausanti) LC₅₀ vertė. Reikia turėti tinkamą žinomo tikslumo ir jautrumo analizinį metodą bandomajai medžiagai bandymo tirpaluose ir biologinėje medžiagoje kiekybiškai nustatyti, kartu su bandinių ruošimo ir laikymo detalėmis. Tai pat turi būti žinoma bandymo medžiagos analizinio nustatymo vandenyje ir žuvies audiniuose riba. Kai naudojama ¹⁴C žymėta bandymo medžiaga, turi būti žinoma radioaktyvumo dėl priemaišų buvimo procentinė dalis.

1.5 BANDYMŲ PAGRĮSTUMAS (patikimumas)

Bandymai laikomi pagrįstais, jeigu laikomasi šių sąlygų:

- temperatūros svyravimas ne didesnis kaip ± 2 °C;

- ištirpusio deguonies koncentracija ne mažiau 60 % oro soties verties;

- per sugerties etapą bandymo medžiagos koncentracija bandymo induose palaikoma vidutinių išmatuotų verčių ribose, su ne didesniu kaip ± 20 % nuokrypiu;

- bandymo pabaigoje tiek kontrolinių, tiek ir veikiamų žuvų mirtingumas arba kiti neigiami veiksniai arba liga yra mažesni kaip 10 %; jei bandymas vyksta kelias savaites arba mėnesius, mirtingumas arba kiti neigiami veiksniai abiejose žuvų grupėse turi būti mažesnis kaip 5 %, o bendras mirtingumas ne didesnis kaip 30 %.

1.6 ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Tikrinant tyrimo metodiką, galima naudoti etalonines medžiagas su žinoma biokoncentravimo geba. Etaloninės medžiagos iki šiol nėra apibrėžtos.

1.7 BANDYMŲ METODO APRAŠAS

1.7.1 Aparatūra

Reikia žiūrėti, kad visų įrangos dalių gamybai nebūtų naudojamos medžiagos, kurios gali tirpti, sugerti arba išsiplauti ir turėti neigiamą poveikį žuvims. Gali būti naudojami stačiakampio arba ritinio formos standartiniai indai, kurie būtų pagaminti iš chemiškai inertiškų medžiagų ir kurių tūris atitiktų įkrovos dydį. Minkštų plastikinių vamzdžių turi būti naudojama kuo mažiau. Geriausiai naudoti vamzdžius iš teflono (R), nerūdijančio plieno arba stiklo. Patirtis parodė, kad medžiagoms su dideliu sugerties koeficientu, pvz., sintetiniams piretroidams, gali būti reikalingas silanizuotas stiklas. Tokiais atvejais įranga po naudojimo turėtų būti išmesta.

1.7.2 Vanduo

Bandymuose dažniausiai naudojamas gamtinis vanduo, jis turi būti imamas iš neužterštos ir vienodos kokybės gavimo vietos. Skiedimo vandens kokybė turi būti tokia, kad pasirinktų rūšių žuvys išgyventų per aklimatizavimo ir bandymo laiką ir jų išvaizdoje arba elgesyje neatsirastų ko nors neįprasto. Geriausiu atveju reikėtų parodyti, kad bandomosios rūšys skiedimo vandenyje gali išlikti, augti ir daugintis (pvz., laboratoriniame veisimo bandyme arba gyvenimo ciklo toksikologiniame bandyme). Apibūdinant vandenį, turi būti nurodyta pH vertė, kietumas, bendrasis kietųjų dalelių kiekis, bendroji organinė anglis, taip pat pageidautina nurodyti amonio ir nitritų jonų kiekį bei šarmingumą, o jūrinėms žuvų rūšims – druskingumą. Parametrai, kurie atitiktų optimalias žuvų gyvavimo sąlygas, yra žinomi, tačiau 1 priede pateiktos rekomenduojamos bandymuose naudojamų gėlo ir jūros vandens komponentų didžiausios koncentracijos.

Vandens kokybė visą bandymo laiką turi būti pastovi. Vandens pH turi būti nuo 6,0 iki 8,5, tačiau konkrečiame bandyme pH reikšmė turi būti ± 0,5 pH vieneto ribose. Norint užtikrinti, kad skiedimo vanduo neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pavyzdžiui, sudarydamas kompleksus su bandomąja medžiaga) arba neigiamai veiktų žuvų būrio elgesį, per tam tikrus laiko tarpus turi būti imami bandiniai analizei. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb. Zn, Hg. Cd. Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca, Mg, Na, K, Ci SO₄), pesticidų (pvz., bendrojo fosforoorganinių ir chlororganinių pesticidų kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti atliekama, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė yra gana pastovi. Jei būtų parodyta, kad vandens kokybė yra pastovi bent metus, analizė gali būti atliekama ne taip dažnai, o tarpai tarp jų didesni (pvz., kas šešis mėnesius).

Natūralus kietųjų dalelių kiekis, taip pat bendrosios organinės anglies (BOA) kiekis skiedimo vandenyje turi būti kuo mažesnis, kad būtų išvengta bandomosios medžiagos absorbcijos organinėse medžiagose, nes gali sumažėti bandomosios medžiagos biologinis prieinamumas (4). Didžiausias leistinas kietųjų dalelių kiekis yra 5 mg/l (skaičiuojant pagal medžiagas, sulaikomas 0,45 μm filtru), o bendrosios organinės anglies – 2 mg/l (žr. 1 priedą). Prireikus prieš naudojimą vanduo turi būti filtruojamas. Bandymų žuvų (ekskrementų) ir maisto likučių indėlis į bendrosios organinės anglies kiekį turi būti kiek įmanoma mažesnis. Organinės anglies koncentracija bandymo inde visą bandymo laiką neturi viršyti su bandomąja medžiaga patekusios organinės anglies koncentracijos ir, jei naudojama, soliubilizuojančioje medžiagoje, esančios organinės anglies koncentracijos daugiau kaip 10 mg/l (± 20 %).

1.7.3 Bandymų tirpalai

Ruošiamas reikiamos koncentracijos bandomosios medžiagos pradinis tirpalas. Pradinį tirpalą geriausiai būtų ruošti bandomąją medžiagą tiesiog maišant arba plakant skiedimo vandenyje. Naudoti tirpiklius arba disperguojančias (solubilizuojančias) medžiagas nerekomenduojama; tačiau kai kuriais atvejais, norint pagaminti pakankamai koncentruotą pradinį tirpalą, jų gali prireikti. Tirpikliai, kuriuos būtų galima naudoti, yra etanolis, metanolis, etilenglikolio monometilo eteris (etandiolio monometilo eteris), etilenglikolio dimetilo eteris (etandiolio dimetilo eteris), dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Disperguojančios medžiagos, kurias galima naudoti, yra Cremophor RH40, Tween 80, metilceliuliozės 0,01 % tirpalas ir HCO-40. Naudojant biologiškai lengvai suardomas medžiagas, reikia žiūrėti, kad neatsirastų problemų dėl bakterijų augimo bandymų pratekančiame vandenyje. Bandomoji medžiaga gali turėti radioaktyvius žymenis ir turi būti aukščiausio grynumo (pvz., geriausiai > 98 %).

Bandymuose su pratekančiu vandeniu bandomosioms koncentracijoms bandymų induose užtikrinti reikalinga sistema, kuri nuolat dozuotų ir skiestų bandomosios medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozuojantis siurblys, proporcinis skiestuvas, prisotinimo sistema). Geriausiai būtų daryti bent penkis vandens tūrio keitimus per dieną kiekvienoje bandymų talpoje. Geriau naudoti pratekėjimo režimą, tačiau, jei jis netinka (pvz., kai tai kenkia bandomiesiems organizmams), galima taikyti pusiau statinį metodą, jei jis atitinka pagrįstumo kriterijus. Pradinio tirpalo ir skiedimo vandens srautas turi būti tikrinamas 48 valandas prieš bandymą ir vėliau visą bandymo laiką, bent kasdieną. Šį kartą tikrinant nustatomas pratekėjimo srautas ir užtikrinama, kad jis inde arba tarp indų nesikeistų daugiau kaip 20 %.

1.7.4 Žuvų rūšies parinkimas

Pasirenkant žuvų rūšis, svarbu, ar lengva jas gauti, ar galima gauti tinkamų dydžių ir ar yra sąlygos jų priežiūrai laboratorijoje. Kiti žuvų rūšies pasirinkimo kriterijai apima rekreacinę, komercinę, ekologinę svarbą, taip pat palyginamąjį jautrumą, sėkmingą naudojimą praeityje ir t.t.

Rekomenduotos bandomosios rūšys pateiktos 2 priede. Galima naudoti kitas rūšis, tačiau tinkamoms bandymo sąlygoms užtikrinti gali tekti keisti bandymo sąlygas. Šiuo atveju ataskaitoje turi būti pateikta rūšies pasirinkimo priežastis ir bandymų metodas.

1.7.5 Žuvų laikymas

Žuvų populiacija bent dvi savaites aklimatizuojama vandenyje bandymo temperatūroje ir pakankamai šeriama tos pačios rūšies pašaru, kuris bus naudojamas atliekant bandymą.

Po 48 valandų stabilizacijos periodo registruojamas mirtingumas ir taikomi tokie kriterijai:

- jei populiacijos mirtingumas per septynias paras didesnis kaip 10%, visa partija atmetama;

- jei populiacijos mirtingumas per septynias paras 5-10%, aklimatizuojama dar septynias papildomas paras;

- jei populiacijos mirtingumas per septynias paras mažesnis kaip 5 %, partija priimama, jei mirtingumas per kitas septynias paras didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama.

Reikia žiūrėti, kad bandymams naudojamos žuvys neturėtų pastebimų ligų ir apsigimimų. Pašalinamos visos ligotos žuvys. Žuvys dvi savaites prieš pradedant bandymą arba atliekant bandymą neturi būti gydomos.

1.8 Bandymo atlikimas

1.8.1 Išankstinis bandymas

Gali praversti atlikti išankstinį bandymą, norint optimizuoti galutinio bandymo sąlygas, pvz., bandymo medžiagos koncentraciją (-as), sugerties ir apsivalymo etapų trukmę.

1.8.2 Veikimo sąlygos

1.8.2.1 Sugerties etapo trukmė

Sugerties etapo trukmės prognozavimas gali būti atliekamas remiantis praktiniu patyrimu (pvz., ankstesniu panašios cheminės medžiagos sugerties tyrimu) arba pagal tam tikras empirines priklausomybes, naudojant tirpumo vandenyje duomenis arba bandymo medžiagos pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą (žr. 3 priedą).

Sugerties etapas turi trukti 28 paras, jei negalima įrodyti, kad pusiausvyra pasiekta anksčiau. Jei nuostovioji būsena nepasiekiama per 28 paras, sugerties etapas turi būti pratęstas, atliekant tolesnius matavimus, kol pasiekiama nuostovioji būsena arba iki 60 parų, atsižvelgiant į tai, kas trumpiau.

1.8.2.2. Apsivalymo etapo trukmė

Pusės sugerties etapo laiko dažniausiai pakanka, kad į organizmą patekusios medžiagos kiekis sumažėtų iki atitinkamos vertės (pvz., 95 %) (dėl šio įverčio paaiškinimo žr. 3 priedą). Jei laikas, reikalingas 95 % išnykimo vertei pasiekti, yra neįvykdomai ilgas, pavyzdžiui, du kartus ilgesnis už normalią sugerties etapo trukmę (t.y. daugiau kaip 56 paros), galima naudoti trumpesnį periodą (pvz., kol bandomosios medžiagos koncentracija pasiekia mažiau nei 10 % nuostoviosios būsenos koncentracijos). Tačiau medžiagų, kurių sugerties ir apsivalymo modelis yra sudėtingesnis už tą, kurį vaizduoja žuvų vienoje talpoje modelis, atitinkantis pirmojo laipsnio kinetiką, išnykimo greičio konstantoms nustatyti naudojami ilgesni apsivalymo etapai. Tačiau šio periodo trukmę gali nusakyti laikas, kai bandymo medžiagos koncentracija žuvyje vis dar yra didesnė už analizinio aptikimo ribą.

1.8.2.3. Bandomųjų žuvų skaičius

Bandomajai medžiagos koncentracijai nustatyti parenkamas toks žuvų skaičius, kad per kiekvieną bandinio ėmimą kiekvienam bandiniui tektų ne mažiau kaip keturios žuvys. Jei reikia didesnio statistinio reikšmingumo, vienam bandiniui žuvų reikės daugiau.

Jei naudojamos suaugusios žuvys, reikia nurodyti, kurios vienos lyties ar abiejų lyčių žuvys buvo naudojamos bandyme. Jei naudojamos abiejų lyčių žuvys, prieš veikimo pradžią turi būti dokumentuota, kad lyčių riebalų kiekio skirtumas yra nereikšmingas; gali būti būtina suleisti visas vyriškosios ir moteriškosios lyties žuvis į vieną grupę.

Kiekvienam atskiram bandymui parenkamos panašios masės žuvys, kad mažiausių žuvų masė nebūtų mažesnė kaip du trečdaliai didžiausios žuvies masės. Visos žuvys turi būti to paties amžiaus ir iš to paties gavimo šaltinio. Kartais paaiškėja, kad žuvų masė ir amžius turi didelę įtaką BKF vertėms (1), todėl šios detalės turi būti tiksliai registruojamos. Norint įvertinti vidutinę masę, rekomenduojama iš turimų žuvų atsargų prieš bandymą pasverti po bandinį.

1.8.2.4. Įkrova

Norint mažinti C_w sumažėjimą dėl žuvų pridėjimo bandymo pradžioje ir išvengti ištirpusio deguonies koncentracijos mažėjimo, naudojami dideli vandens ir žuvų kiekio santykiai. Svarbu, kad įkrovos dydis atitiktų naudojamą bandymų rūšį. Bet kuriuo atveju dažniausiai rekomenduojamas įkrovos dydis yra 0,1 – 1,0 g žuvies (šlapios masės) litrui vandens parai. Dideles įkrovas galima taikyti, jei įrodoma, kad reikiamą bandymo medžiagos koncentraciją įmanoma palaikyti ± 20 % ribose ir kad ištirpusio deguonies koncentracija nesumažėja daugiau kaip iki 60 % soties koncentracijos.

Pasirenkant tinkamus įkrovos režimus, atsižvelgiama į žuvų rūšies įprastąsias gyvenimo aplinkos sąlygas. Pavyzdžiui, dugne gyvenančioms žuvims tam pačiam vandens tūriui gali būti reikalingas didesnis akvariumo dugno plotas nei jūros žuvų rūšims.

1.8.2.5. Šėrimas

Aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu žuvys maitinamos tinkamu pašaru, kurio yra žinomas riebalų ir baltymų bendrasis kiekis ir kurio pakanka, kad žuvys būtų sveikos ir būtų palaikoma jų kūno masė. Žuvys aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu maitinamos kiekvieną dieną, pašaro kiekis sudaro maždaug 1 – 2 % kūno masės per parą; taip per bandymą riebalų koncentracija daugumoje žuvų rūšių palaikoma santykinai pastovi. Norint palaikyti kūno masės ir riebalų kiekio atitikimą, pašaro kiekis turi būti perskaičiuojamas, pvz., kartą per savaitę. Šiam apskaičiavimui atlikti žuvų masė kiekviename inde gali būti įvertinta pagal neseniai iš šio indo bandiniui paimtų žuvų masę. Nesveriamos žuvys, liekančios bandymų inde.

Nesuėstas pašaras ir išmatos išsiurbiami iš indo kasdien netrukus po šėrimo (nuo 30 minučių iki vienos valandos). Indai visą bandymo laiką turi būti palaikomi kuo švaresni, kad būtų kuo mažesnė organinių medžiagų koncentracija, nes organinė anglis gali riboti bandomosios medžiagos biologinį prieinamumą (1).

Kadangi daugelis pašarų gaminami iš žuvų miltų, pašaras turi būti analizuojamas, norint aptikti bandomosios medžiagos. Taip pat pageidautina pašaro pesticidų ir sunkiųjų metalų analizė.

1.8.2.6. Šviesa ir temperatūra

Apšvietimo periodo trukmė dažniausiai būna 12-16 valandų, o temperatūra (± 2 °C) turi būti tinkama žuvų rūšims (žr. 2 priedą). Turi būti žinomas apšvietimo tipas ir jo ypatybės. Būtina imtis atsargumo priemonių dėl galimų bandomosios medžiagos fotocheminių virsmų tiriant, naudojant apšvietimą. Kai kuriais atvejais tikslinga naudoti filtrą, kuris nepraleistų trumpesnių nei 290 nm bangos ilgio UV spindulių.

1.8.2.7. Bandymuose naudojamos koncentracijos

Žuvys pratekėjimo sąlygomis veikiamos vandenyje bent dviejų koncentracijų bandomąja medžiaga. Dažniausiai didesnė (arba didžiausia) bandomosios medžiagos koncentracija parenkama taip, kad ji būtų lygi maždaug 1 % jos ūmios asimptotinės LC₅₀ ir būtų bent dešimt kartų didesnė už jos aptikimo ribą vandenyje naudojamu analizės metodu.

Didžiausią bandymo medžiagos koncentraciją taip pat galima nustatyti, padalinant ūmios 96 h LC₅o vertę iš atitinkamo ūmaus ir chroniško koncentracijų santykio (kai kurių cheminių medžiagų atitinkamas santykis gali kisti maždaug nuo 3 iki 100). Jei įmanoma, parenkama kitokia arba kitokios koncentracijos, kuri (arba kurios) būtų didesnė už nurodytąją 10 kartų. Jei tai neįmanoma dėl 1 % LC₅₀ sąlygos ir analizinio nustatymo ribos, galima taikyti mažesnį nei 10 daugiklį arba turi būti atsižvelgta į galimybę naudoti ¹⁴C žymėtą bandomąją medžiagą. Neturi būti naudojama koncentracija, kuri būtų didesnė už bandomosios medžiagos tirpumą.

Jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, jos koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1ml/l ir ji turi būti vienoda visuose bandymo induose. Turi būti žinoma, kokią bendrosios organinės anglies kiekio dalį bandymo vandenyje sudaro ši medžiaga ir bandomoji medžiaga kartu. Tačiau reikia stengtis, kad tokių medžiagų naudoti nereikėtų.

1.8.2.8. Kontroliniai bandymai

Papildomai turi būti tikrinamas skiedimo vanduo arba, jei tinka, vanduo su soliubilizuojančia medžiaga, jei buvo nustatyta, kad soliubilizuojanti medžiaga neveikia žuvų. Jei taip nėra, turi būti atliekami abu tikrinimai.

1.8.3 Vandens kokybės matavimų dažnis

Atliekant bandymą, visuose induose būtina matuoti ištirpusį deguonį, BOA, pH ir temperatūrą. Bendrasis kietumas ir druskingumas, jei reikia, turi būti nustatyti kontroliniuose bandymuose ir viename inde su didesne (arba didžiausia) koncentracija. Ištirpęs deguonis ir druskingumas, jei reikia, turi būti nustatomi mažiausiai tris kartus – sugerties etapo pradžioje, maždaug viduryje ir pabaigoje, o per apsivalymo etapą- kartą per savaitę. BOA turi būti nustatyta bandymo pradžioje (24 valandos ir 48 valandos prieš pradedant sugerties etapą) prieš žuvis suleidžiant ir bent kartą per savaitę sugerties ir apsivalymo etapų metu. Temperatūra turi būti matuojama kasdien, pH kiekvieno laikotarpio pradžioje ir pabaigoje, o kietumas – kartą, atliekant kiekvieną bandymą. Temperatūra bent viename inde turi būti stebima nuolat.

1.8.4 Bandinių ėmimas ir žuvų bei vandens analizė

1.8.4.1 Žuvų ir vandens bandinių ėmimo grafikas

Vanduo iš bandymo indų nustatyti bandomosios medžiagos koncentraciją imamas prieš suleidžiant žuvis ir sugerties bei išsivalymo etapų metu. Minimalus vandens bandinių skaičius imamas tuomet, kai imami žuvų bandiniai ir prieš šeriant. Sugerties laiką bandomosios medžiagos koncentracija nustatoma, norint kad būtų laikomasi pagrįstumo kriterijų.

Žuvų bandiniai imami bent penkis kartus per sugerties etapą ir bent keturis kartus per išsivalymo etapą. Remiantis tokiu bandinių skaičiumi, kai kuriais atvejais būna sunku gauti pakankamai tikslų BKF vertės įvertį, ypač kai pasirodo, kad išsivalymo kinetika yra kitokia nei pirmojo laipsnio, galima būtų patarti bandinius imti dažniau (žr. 4 priedą). Papildomi bandiniai saugomi ir analizuojami tik tuo atveju, jei pasirodo, kad pirmosios eilės analizės duomenų nepakanka BKF apskaičiuoti norimu tikslumu.

Tinkamo bandinių ėmimo grafiko pavyzdys pateiktas 4 priede. Naudojant kitas P_ow numanomas vertes poveikio trukmei, per kurią būtų pasiekta 95% sugertis, apskaičiuoti, gali būti lengvai sudaryti kiti grafikai.

Bandiniai imami per sugertį tol, kol pasiekiama nuostovioji būsena arba 28 paras priklausomai nuo to, kas trumpiau. Jei nuostovioji būsena nebuvo pasiekta per 28 paras, bandiniai imami tol, kol pasiekiama nuostovioji būsena, arba iki 60 parų priklausomai nuo to, kas trumpiau. Prieš pradedant išsivalymo etapą, žuvys perkeliamos į švarius indus.

1.8.4.2. Bandinių ėmimas ir bandinio ruošimas

Vandens bandiniai analizei gaunami, pvz., siurbiant (sifonuojant) juos iš inertiškos medžiagos pagamintais vamzdžiais, įstatytais į bandymo indo vidurį. Atrodo, jog nei filtravimu, nei centrifugavimu neįmanoma atskirti biologiškai neįsisavinamos bandomosios medžiagos dalies nuo tos dalies, kuri yra biologiškai prieinama (ypač labai lipofilinių cheminių medžiagų, t.y. tokių medžiagų, kurių log P_ow > 5) (1) (5), todėl bandinių tokiais būdais apdoroti nereikia.

Todėl reikia imtis priemonių, kad rezervuarai būtų kuo švaresni, o bendrosios organinės anglies kiekis per sugerties ir apsivalymo etapus turi būti nuolat kontroliuojamas.

Kiekvieną kartą imant bandinį iš bandymo indų paimamas atitinkamas žuvų skaičius (dažniausiai ne mažiau kaip keturios žuvys). Bandinio žuvys iš karto nuplaunamos vandeniu, „sausai“ nušluostomos, tuojau pat užmušamos pačiu tinkamiausiu būdu ir sveriamos.

Vanduo ir žuvys turi būti analizuojami iš karto po bandinio ėmimo, kad būtų išvengta irimo arba kitų nuostolių, ir apskaičiuojami apytikriai sugerties bei apsivalymo greičiai per bandymą. Iš karto atlikta analizė leidžia negaištant nustatyti, kada pasiekiama horizontalioji sugerties kreivės dalis.

Jei iš karto analizė neatliekama, bandiniai turi būti laikomi tinkamai. Prieš pradedant tyrimą, gaunama informacija apie tinkamą konkrečios bandymo medžiagos laikymo metodą, pvz., šaldymą, laikymą, esant 4 °C temperatūrai, laikymo trukmę, ekstrahavimą ir 1.1.

1.8.4.3. Analizės metodo kokybė

Kadangi visas bandymas iš esmės priklauso nuo bandomajai medžiagai nustatyti taikomo analizės metodo tikslumo, tikslumo ir jautrumo, reikia eksperimentiškai patikrinti, ar konkretaus metodo cheminės analizės tikslumas ir atkuriamumas, taip pat bandomosios medžiagos išgavimas iš vandens ir žuvies yra patenkinami. Taip pat reikia patikrinti, ar bandomoji medžiaga neaptinkama naudojamame skiedimo vandenyje.

Jei būtina, daromos C_w ir C_f gautų verčių pataisos, atsižvelgiant į išgavimo ir fono kontroliniuose bandiniuose gautas vertes. Su žuvies ir vandens bandiniais visą laiką elgiamasi taip, kad užteršimas ir nuostoliai (pvz., dėl bandinio ėmimo įtaiso sugerties) būtų kuo mažesni.

1.8.4.4. Žuvies bandinio analizė

Jei bandyme naudojama radioaktyvius žymenis turinčių medžiagų, galima nustatyti bendrą jų kiekį (t.y. pradinę medžiagą ir metabolitus) arba bandiniai gali būti gryninami, kad pradinę medžiagą galima būtų analizuoti atskirai. Taip pat, pasiekus nuostoviąją būseną arba sugerties etapo pabaigą, priklausomai nuo to kas anksčiau, galima apibūdinti pagrindinius metabolitus.

Jei BKF, apskaičiuotas pagal bendrąjį radioaktyvius žymenis turinčių likučių kiekį, yra didesnis ar lygus 100 %, būtų patartina, o radus kai kurių cheminių medžiagų rūšių, pvz., pesticidų, labai rekomenduotina, identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus, kurie sudaro daugiau kaip 10 % bendrojo likučių kiekio žuvies audiniuose nuostoviosios būsenos sąlygomis.

Jei yra identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktai, kurie sudaro daugiau kaip 10 % bendrojo žymėtuosius atomus turinčių likučių kiekio, taip pat rekomenduojama identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus bandymo vandenyje.

Bandomosios medžiagos koncentracija dažniausiai turi būti nustatoma kiekvienoje pasvertoje žuvyje. Jei tai neįmanoma, kiekvieno ėmimo bandinius galima sudėti, tačiau bandinių sudėtis riboja statistinio apdorojimo metodikas, kurios galėtų būti taikomos duomenims apdoroti, galimybes. Jei yra svarbi specifinė statistinė procedūra ir jos reikšmingumas, tuomet bandyme turi būti naudojamas pakankamas žuvų skaičius, kuris atitiktų norimą jungimo procedūrą ir statistinį reikšmingumą (6) (7).

BKF turi būti išreikštas kaip visos šlapios masės funkcija, o labai lipofiliškoms medžiagoms – kaip riebalų kiekio funkcija. Riebalų kiekis žuvyje nustatomas kiekvieno bandinio ėmimo atveju, jei tai įmanoma. Riebalų kiekiui nustatyti turi būti taikomi atitinkami metodai (3 priedo 8 ir 2 nuorodos). Geriausias metodas, jei gali būti rekomenduota ekstrahavimo chloroformo ir metanolio mišiniu metodika (9). Įvairūs metodai neleidžia gauti vienodų verčių (10), todėl svarbu pateikti taikyto metodo detales. Kai tai įmanoma, riebalų analizė turi būti atliekama tame pačiame ekstrakte, kuris buvo gautas bandomajai medžiagai analizuoti, kadangi riebalus dažnai reikia pašalinti iš ekstrakto prieš tai, kai jį galima analizuoti chromatografiškai. Riebalų kiekis žuvyje (mg/kg šlapios masės) bandymo pabaigoje turi nesiskirti nuo bandymo pradžioje nustatyto kiekio daugiau kaip ± 25 %. Taip pat reikia pateikti procentais apskaičiuotą audinio sausų medžiagų kiekį, kad būtų galima apskaičiuoti sausų medžiagų riebalų koncentraciją.

2 REZULTATAI

2.1 REZULTATŲ APDOROJIMAS

Bandomosios medžiagos sugerties kreivė gaunama aritmetinėje skalėje žymint per sugerties bandymą gautos koncentracijos kaitą žuvyje arba jos paviršiuje (arba tam tikruose audiniuose) per tam tikrą laiką. Jei kreivė pasiekė horizontaliąją dalį, t.y. pasidaro beveik asimptotiška laiko ašiai, nuostoviosios būsenos BKFmb apskaičiuojamas taip:

Kai nuostovioji būsena nepasiekiama, BKF_mb bali būti įmanoma apskaičiuoti pagal 80 % (l,6/k₂) arba 95% (3,0/k₂) „nuostoviosios būsenos“ pusiausvyros, tai bus pakankamas tikslumas, reikalingas įvertinant pavojingumą.

Taip pat nustatomas biokoncentravimo faktorius (BKF_k) kaip dviejų pirmojo laipsnio kinetinių konstantų k₁/k₂ santykis. Apsivalymo greičio konstanta (k₂) dažniausiai nustatoma pagal apsivalymo kreivę (t.y., bandymo medžiagos žuvyje koncentracijos mažėjimo per tam tikrą laiką grafiką). Tuomet, turint k₂ vertę ir C_f, kuri gaunama pagal sugerties kreivę, apskaičiuojama sugerties greičio konstanta (k₁) (žr. 5 priedą). Tinkamiausias metodas BKF_k ir greičio konstantoms k₁ir k₂ apskaičiuoti yra netiesinių parametrų kompiuterinio vertinimo metodų taikymas (11). Kitaip k₁ ir k₂ apskaičiuoti gali būti naudojami grafiniai metodai. Jei apsivalymo kreivė akivaizdžiai yra ne pirmojo laipsnio, turi būti taikomi sudėtingesni modeliai (žr. 3 priedo nuorodas) ir prašoma biologo-statistiko patarimo.

2.2 REZULTATŲ INTERPRETAVIMAS

Rezultatai turi būti interpretuojami atsargiai, jei išmatuotos bandymo tirpalų koncentracijos yra arti analizinio metodo aptikimo ribos.

Aiškiai apibrėžtos sugerties ir išsivalymo kreivės yra biologinio koncentravimo duomenų geros kokybės ženklas. Dviem koncentracijoms nustatytų sugerties ir apsivalymo konstantų kitimas turi būti mažesnis kaip 20 %. Dviem bandymų koncentracijoms stebėti dideli sugerties ir apsivalymo greičių skirtumai turi būti registruojami ir pateikti galimi aiškinimai. Dažniausiai, atliekant gerai planuotus tyrimus, BKF verčių pasikliovimo riba artėja prie ± 20 %.

3 ATASKAITOS PATEIKIMAS

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija:

3.1 BANDOMOJI MEDŽIAGA

- fizinė prigimtis ir, jei reikia, fizinės ir cheminės savybės,

- cheminio identifikavimo duomenys (įskaitant organinės anglies kiekį jei reikia),

- jei turi radioaktyvius žymenis, tiksli žymėtojo atomo (-ų) padėtis ir su priemaišomis susijusio radioaktyvumo procentinė dalis.

3.2 BANDYMŲ RŪŠYS

- mokslinis pavadinimas, rūšis, šaltinis, bet koks išankstinis apdorojimas, aklimatizavimas, amžius, dydžio intervalas ir t.t.

3.3 BANDYMŲ SĄLYGOS

- taikyta bandymų metodika (pvz., pratekėjimo arba pusiau stacionariomis sąlygomis),

- naudoto apšvietimo tipas ir ypatybės bei apšvietimo periodas (-ai),

- bandymų schema (pvz., bandymo indų (talpų) skaičius ir dydis, vandens tūrinės apykaitos greitis, lygiagrečių bandymų skaičius, žuvų skaičius tuo pat metu atliktame bandyme, atliekant bandymus taikytų koncentracijų skaičius, sugerties ir išsivalymo etapų trukmė, žuvų ir vandens bandinių ėmimo dažnis),

- pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų keitimo dažnis (jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija ir indėlis į organinės anglies kiekį bandymo vandenyje),

- vardinės bandymų koncentracijos, bandymų induose nustatytų koncentracijų vidutinės vertės ir jų standartiniai nuokrypiai bei metodas, kuriuo jie buvo nustatyti,

- skiedimo vandens šaltinis, bet kokio jo apdorojimo aprašymas, bandomųjų žuvų sugebėjimo gyventi vandenyje rodymo rezultatai ir vandens ypatybės: pH, kietumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės, bandymo terpės druskingumas (jei reikia) ir visi kiti daryti matavimai,

- vandens kokybė bandymų talpose, pH, kietumas, BOA, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija,

- išsami informacija apie šėrimą (pvz., pašaro tipas, šaltinis, sudėtis, jei įmanoma bent riebalų ir baltymų kiekis, duodamas kiekis ir šėrimo dažnis), -informacija apie žuvų ir vandens bandinių apdorojimą, įskaitant ruošimo, laikymo, ekstrahavimo detales ir bandomosios medžiagos bei riebalų (jei nustatomi) analizės metodikas (ir tikslumą).

3.4 REZULTATAI

- bet kokių atliktų išankstinių tyrimų rezultatai,

- kontrolinių žuvų ir žuvų kiekviename bandymų inde mirtingumas bei bet koks jų neįprastas elgesys,

- riebalų kiekis žuvyje (jei nustatoma),

- kreivės (įskaitant visus gautų matavimų duomenis), rodančios bandomosios medžiagos žuvų sugertį ir jų apsivalymą, laikas iki nuostoviosios būsenos,

- C_f ir C_w (ir jų standartinis nuokrypis bei intervalas, jei tinka) visiems bandinio ėmimo atvejams (C_f išreikšta μg/g viso kūno arba tam tikrų jo audinių, pvz., riebalų, šlapios masės (ppm), o C_w- μg/ml (ppm)). C_w vertės kontrolinėse serijose (taip pat turi būti nurodytas fonas),

- nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius (BKF_mb) ir (arba) kinetinis biokoncentravimo faktorius (BKF_k) ir, jei taikytina, 95 % pasikliovimo ribos sugerties ir apsivalymo (išnykimo) greičio konstantoms (viskas apskaičiuota viso gyvūno kūno ir bendro riebalų kiekio, jei nustatytas, arba apibrėžtų jo audinių atžvilgiu), pasikliovimo ribos ir standartinis nuokrypis (kai yra) bei apskaičiavimų (duomenų analizės) metodai kiekvienai naudotos bandomosios medžiagos koncentracijai,

- jei naudojamos radioaktyvius žymenis turinčios medžiagos, ir jei to reikalaujama, gali būti pateikti bet kokių aptiktų metabolitų kaupimosi rezultatai,

- visa, kas bandyme buvo neįprasto, bet koks numatytų veiksmų nukrypimas ir bet kuri kita tinkama informacija.

Reikia mažinti rezultatų, kurie būtų „nenustatyti aptikimo riboje“, kiekį, paruošiant parengiamąjį bandymą ir planuojant bandymus, kadangi tokie rezultatai negali būti panaudoti apskaičiuojant greičio konstantas.

4 NUORODOS

(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, 117 -156 p.

(2) Birsein S, Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR ir QSAR in Environmental Research, 1, 29 – 390 p.

(3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformatkm of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing ir Assessment of Chemicals. No 3.

(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailabilily of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.

(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document (or the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.

(6) US PDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1,5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.

(7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human arba animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Evironmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.

(8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aąuatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Ch. 2.3. Part H. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.

(9) Gardner et al. (199.5). Limn. & Oceanogr. 30, 1099 – 1105 p.

(10) Randall R. C, Lee H., Ozretich R.J., Lake J. L. and Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, 1431 – 1436 p.

(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method, Ring Test Programme. 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholni.

(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.

1 priedas

Skiedimui tinkamo vandens cheminės savybės

	Medžiaga	Didžiausia leistina koncentracija
1	Kietosios dalelės	5 mg/l
2	Bendroji organinė anglis	2 mg/l
3	Nejonizuotas amoniakas	1 μg/l
4	Liekamasis chloras	1 μg/l
5	Bendras fosforoorganinių pesticidų kiekis	50 ng/1
6	Bendras chlororganinių pesticidų ir polichlorintų difenilų kiekis	50 ng/l
7	Bendras organinis chloras	25 ng/l
8	Aliuminis	1 μg/l
9	Arsenas	1 μg/l
10	Chromas	1 μg/l
11	Kobaltas	1 μg/l
12	Varis	1 μg/l
13	Geležis	1 μg/l
14	Švinas	1 μg/l
15	Nikelis	1 μg/l
16	Cinkas	1 μg/l
17	Kadmis	100 ng/l
18	Gyvsidabris	100 ng/l
19	Sidabras	100 ng/l

2 priedas

Bandyti rekomenduotos žuvų rūšys

	Rekomenduojamos rūšys	Rekomenduojamas bandymų temperatūros intervalas, °C	Rekomenduojamas bandymų gyvūno bendrasis kūno ilgis, cm
1	Zebrinė danija (Danio rerio (')) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan)	20-25	3,0 ± 0,5
2	Rainė (Pimephales promelas) (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesąue) (Phoxinus phoxinus)	20-25	5,0 ±2,0
3	Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus) Paprastasis karpis	20-25	5,0 ± 3,0
4	Japoninė medaka (Oryzias latipes) (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck ir Schlegel)	20-25	4,0 ±1,0
5	Vaivorykštinis gupis (Poecilia reticulata) (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Gupi	20-25	3,0 ±1,0
6	Melsvažiaunis saulešeris (Lepomis macrochirus) (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesąue)	20-25	5,0 ±2,0
7	Margasis upėtakis (Onchorhynchus mykiss) (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum)	13-17	8.0 ± 4,0
8	Trispyglė dyglė (Gasterosteus aculeatus) (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus)	18-20	3,0 ±1,0
(')Me	yer A, Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B, Vol. 252, p. 231.

Skirtingose šalyse buvo naudojamos įvairios upių žiočių ir jūros žuvų rūšys, pvz.,

Spotas (Leiostomus xanthuru); Margoji lėlžuvė (Cyprinodon variegatus);

Priekrančių menidija (Menidia beryllind); Gyvavedis šaineris (Cymatogaster aggregata);

Plekšnė (Parophrys vertulus); Siauragalvė plernė (Leptocottus armatus);

Trispyglė dyglė (Gasterosteus aculeatus); Jūros ešerys (Dicentracus labrax);

Aukšlė (Albumus albumus).

Parinkimas

Lentelėje nurodytas gėlųjų vandenų žuvis lengva auginti ir (arba) jų galima gauti ištisus metus, tuo tarpu galimybė gauti jūros ir upių žiočių žuvų iš dalies ribota atitinkamoms šalimis. Žuvis galima auginti ir veisti žuvų fermose arba laboratorijose, ligų ir parazitų kontrolės sąlygomis, kad bandomieji gyvūnai būtų sveiki, ir būtų žinoma jų kilmė. Šių žuvų yra daugelyje pasaulio kraštų.

3 priedas

Sugerties ir apsivalymo etapų trukmės prognozavimas

1 Sugerties etapo trukmės prognozavimas

Prieš atliekant bandymą, k₂ įvertis, taigi nuostoviajai būsenai pasiekti reikalingo laiko tam tikra procentinė dalis, gali būti gauta iš empirinių k₂ ir n-oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficiento (P_ow) arba k₂ priklausomybių ir tirpumo vandenyje (s).

Įvertis k₂ (para^-1) gali būti gautas, pvz., pagal tokią empirinę priklausomybę (1):

logk₂ = -0,414 log₁₀(P“_w) + 1,47 (r² = 0,95) (1 lygtis)

Kitos priklausomybės pateiktos 2 nuorodoje.

Jei pasiskirstymo koeficientas (P_ow) nežinomas, įvertis gali būti atliktas (3), jei žinomas medžiagos tirpumas vandenyje (s), taikant lygtį:

log₁₀(Pow) = 0,862 lo_gl0(s) + 0,710 (r² = 0,994) (2 lygtis)

kurioje s = tirpumas (mol/l): (n – 36).

Šios priklausomybės tinka tik toms cheminėms medžiagoms, kurių log (P_ow) vertės yra nuo 2 iki 6,5 (4).

Nuostoviajai būsenai pasiekti reikalingo laiko tam tikra procentinė dalis, taikant k₂ įvertį, gali būti nustatyta iš bendrosios kinetinės lygties, aprašančios sugertį ir apsivalymą (pirmojo laipsnio kinetika):

arba jei C_w yra pastovus dydis:

Artėjant prie nuostoviosios būsenos (t →∞), 3 lygtis gali būti supaprastinta (5) (6) iki:

Tokiu atveju, k₁/k₂ x C_w yra arti koncentracijos žuvyje „nuostoviosios būsenos“ sąlygomis (C_f,s). 3 lygtis gali būti pertvarkyta į:

arba (4 lygtis)

Taikant 4 lygtį, galima prognozuoti laiką, reikalingą pasiekti tam tikrą nuostoviosios būsenos procentinę dalį, kai pagal 1 arba 2 lygtį iš anksto yra įvertinta k₂.

Statistiškai priimtiniems duomenims (BKF_k) gauti, statistiškai optimalios sugerties etapo trukmės atskaitos tašku laikomas laikas, per kurį kreivė, vaizduojanti priklausomybę tarp bandymų medžiagos žuvyje koncentracijos logaritmo ir tiesinėje skalėje atidėto laiko, pasiektų jos vidurio tašką arba l,6/k₂, arba 80 % nuostoviosios būsenos, tačiau ne didesnis kaip 3,0/k₂, arba 95 % nuostoviosios būsenos (7).

Laikas 80% nuostoviosios būsenos pasiekti (4 lygtis)yra lygus:

arba (5 lygtis)

k₂ Panašiu būdu laikas, reikalingas pasiekti 95 % nuostoviosios būsenos, yra lygus:

(6 lygtis)

Pvz., sugerties etapo trukmė (sug) bandymų medžiagai, kurios log₁₀(P_ow) = 4, būtų (taikant lygtis 1, 5 ir 6):

log₁₀k₂ = -0,414 x (4) + 1,47 k₂ = 0,652 paros^-1

sug (80%) = 1,6/0,652, t.y. 2,45 paros (59 valandos)

arba sug (95%) = 3,0/0,652, t.y. 4,60 paros (110 valandų)

Panašiai, jei bandymų medžiagos s= 10^-5 mol/l (log(s) =-5,0), sug trukmė būtų (taikant lygtis 1,2, 5 ir 6):

log₁₀ (P_ow) = 0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02

log₁₀k₂ =-0,414 (5,02)+ 1,47

k₂ = 0,246 paros^-1

sug (80%) = 1.6/0,246, t.y. 6,5 paros (156 valandos)

arba sug (95 %) = 3.0/0,246, t.y. 12,2 paros (293 valandos)

Kaip alternatyva, lygtis:

T_eq = 6,54 x 10^-3 P_ow + 55,31 (valandos) gali būti taikoma apskaičiuoti laiką, reikalingą pasiekti tikrąją nuostoviąją būseną (4).

2 APSIVALYMO ETAPO TRUKMĖS PROGNOZAVIMAS

Laikas, per kurį organizme sulaikytos medžiagos kiekis sumažėja iki tam tikros pradinės koncentracijos procentinės dalies, taip pat gali būti prognozuojamas, taikant bendrąja lygtį kuri aprašo sugertį ir apsivalymą (pirmojo laipsnio kinetika) (1) (8).

Apsivalymo etapo atveju daroma prielaida, kad C_w lygi nuliui. Lygtis gali būti redukuota į lygtį:

arba,

kurioje C_f,o yra koncentracija apsivalymo etapo pradžioje. Tuomet 50 % apsivalymas bus pasiektas per laiką (t₅₀):

Panašiai 95 % apsivalymas bus pasiektas per laiką:

Jei pirmajam periodui taikoma sugerties trukmė sudaro 80 % (l,6/k₂), o per apsivalymo etapą sumažėjimas sudaro 95 % (3,0/k₂), tuomet apsivalymo etapas trunka maždaug du kartus ilgiau už sugerties etapą.

Svarbu pažymėti, kad įverčiai remiasi prielaida, jog sugerties ir apsivalymo modeliai atitinka pirmojo laipsnio kinetiką. Jei pirmojo laipsnio kinetikos akivaizdžiai nepaisoma, turi būti naudojami sudėtingesni modeliai (pvz., (1) nuoroda).

Nuorodos (3 priedo)

(1) Spacie A. and Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, 309-320 p.

(2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.

(3) ChiouC.T. and Schmedding D.W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16(1), 4- 10 p.

(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentralion kinetics withfish. Wat. Res. 22(6), 701-707 p.

(5) Branson D. R, Blau G. E, Alexander H.C. and Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), 785 – 792 p.

(6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aąuatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte P., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4,243 – 255 p. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons LtdN.Y.

(7) Reilly P.M, Bajraniovic R., Blau G. E., Branson D. R. and Sauerhotf M.W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55. 614 – 622 p.

(8) Konemann H. and .Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemnsinherp 9 3 – 19 p.

4 priedas

Bandinių ėmimo teorinis grafiko pavyzdys, tiriant medžiagų, kurių log (P_ow) = 4, biologini koncentravimą

	Bandinių ėmimo tvarkaraštis
Žuvų bandinių ėmimas	Mažiausias reikalingas dažnis (paros)	Papildomas bandinių ėmimas	Vandens bandinių skaičius	Žuvų skaičius bandinyje
Sugerties etapas	-1 0		2(*) 2	45-80 žuvų
1-asis	0,3	0,4	2 (2)	4 (4)
2-asis	0,6	0,9	2 (2)	4 (4)
3-iasis	1,2	1,7	2 (2)	4 (4)
4-asis	2,4	3,3	2 (2)	4 (4)
5-asis Apsivalymo etapas	4,7		2	6 Žuvų pernešimas į vandenį be bandymo medžiagos
6-asis	5,0	5,3		4 (4)
7-asis	5,9	7,0		4 (4)
8-asis	9,3	11,2		4 (4)
9-asis	14,0	17,5		6 (4)

(*) Vandens bandinys imamas po to, kai buvo pateikti mažiausiai trys „indo tūriai“.

Vertės skliausteliuose rodo bandinių (vandens, žuvų) skaičių, kurį reikia paimti, jei bandiniai papildomai imami.

NB: Prieš bandymą darytas k₂ įvertis, kai log (P_ow) = 4,0, yra 0,652 paros^-1. Bendra bandymo trukmė nustatyta 3 x sug = 3 x 4,6 paros, t.y. 14 parų. Kaip vertinti „sug“, žr. 3 priedą.

5 priedas

Modelio pasirinkimas

Buvo padaryta prielaida, kad biologinio koncentravimo duomenys „pakankamai“ gerai aprašomi paprasto dviejų indų ir dviejų parametrų modelio (tai matyti ištiesintoje kreivėje, kuri priartina žuvies apsivalymo etapo koncentracijos taškus, kai jie vaizduojami pusiau logaritminiame popieriuje. (Jei šie taškai negali būti aprašyti ištiesinta kreive, tuomet reikia naudoti sudėtingesnius modelius, žr., pvz., Spacie and Hanwhnk, 3 priedo 1 nuoroda).

Grafinis metodas apsivalymo (išnykimo) greičio konstantai k₂ nustatyti

Pusiau logaritminiame popieriuje nubraižomas kiekviename žuvies bandinyje rastos bandymo medžiagos koncentracijos kitimo ir laiko grafikas. Šios tiesės krypties koeficientas yra k₂.

Atkreipkite dėmesį, kad nukrypimai nuo tiesės gali reikšti, kad apsivalymo modelis yra sudėtingesnis už pirmojo laipsnio kinetiką. Norint spręsti apie tai, ar apsivalymo tipas nukrypsta nuo pirmojo laipsnio kinetikos, galima taikyti grafinį metodą.

Grafinis metodas, nustatant sugerties greičio konstantą k.

Duotai k₂ vertei k₁ apskaičiuojamas taip:

(1 lygtis)

C_f vertė yra gautosios sugerties glaudžiusios kreivės duomenų vidurio taškas. Kreivė vaizduoja koncentracijos logaritmo kitimą per tam tikrą laiką (aritmetinėje skalėje).

Kompiuteriniai metodai sugerties ir apsivalymo (išnykimo) greičio konstantoms apskaičiuoti

Geriausias būdas yra taikyti kompiuterinius netiesinių parametrų vertinimo metodus biologinio koncentravimo faktorių ir kj bei k₂ greičio konstantoms apskaičiuoti. Jei duota koncentracijos kitimo laike duomenų aibė ir modelis, šios programos apskaičiuoja k] ir k₂ vertes:

(2lygtis)

(3 lygtis)

čia: t_c = sugerties etapo pabaigos laikas.

Šis metodas duoda k₁ ir k₂ standartinio nuokrypio įverčius.

Didesnė dalis k₂ atvejų pagal išsivalymo kreivę gali būti įvertinta pakankamai tiksliai. Tarp dviejų parametrų, k₁ ir k₂, jei juos vertintume kartu, yra stipri koreliacija. Galima būtų patarti iš pradžių tik pagal išsivalymo duomenis apskaičiuoti k₂, o vėliau pagal sugerties duomenis ir taikant netiesinę regresiją apskaičiuoti k₁.

ŽUVŲ MAILIAUS AUGIMO BANDYMAS (C.14.)

1. METODAS

Šis toksiškumo augimui bandymo metodas yra OECD TG 215 (2000) kopija.

1.1 ĮVADAS

Sis bandymas skirtas įvertinti cheminių medžiagų ilgo veikimo įtaką žuvų mailiaus augimui. Jis pagrįstas Europos Sąjungoje sukurtu ir tarplaboratoriniais bandymais patikrintu (1) (3) dinaminiu metodu, taikytu įvertinti cheminių medžiagų poveikius vaivorykštinio upėtakio (Oncorynchus mykiss) mailiaus augimui. Galima naudoti kitas dokumentais tinkamai patvirtintas rūšis. Pvz., įgyta patyrimo, atliekant zebrinės danijos (Danio rerio) (2) (4) (5) ir japoninės medakos (Oryzias latipes) (6) (7) (8) augimo bandymus.

1.2 APIBRĖŽIMAI

Mažiausioji pastebimo poveikio koncentracija, LOEC: mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis yra statistiškai reikšmingas lyginant su kontroliniais bandiniais (p<0,05). Tačiau visų didesnių kaip LOEC bandomųjų koncentracijų kenksmingas poveikis turi būti lygus ar didesnis už LOEC poveikį.

Nepastebimo poveikio koncentracija, NOEC: bent kiek už LOEC mažesnė bandomoji koncentracija.

EC,: šiam bandymo metodui tai yra bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant žuvų augimo greičio pokytis lyginant su kontroliniais bandiniais yra x %.

Įkrova: gyvų žuvų masė, tenkanti vandens tūrio vienetui.

Žuvų tankis: žuvų skaičius, tenkantis vandens tūrio vienetui.

Atskiros žuvies savitasis augimo greitis: išreiškia atskiros žuvies augimo greitį pagal jos pradinę masę.

Vidutinis savitasis augimo greitis bandymo indui: išreiškia bandymo indo populiacijos vidutinį augimo greitį vienai koncentracijai.

Tariamai („Pseudo“) savitasis augimo greitis: išreiškia atskirų žuvų augimo greitį lyginant su bandymo indo populiacijos vidutine pradine mase.

1.3 BANDYMO METODO ESMĖ

Eksponentinio augimo etapo žuvų mailius pasveriamas, įleidžiamas į bandymo indus, kur jis geriau dinaminio bandymo sąlygomis ar, jei neįmanoma, atitinkamomis pusiau statinio bandymo (periodinio atnaujinimo) sąlygomis yra veikiamas bandomosios medžiagos subletalios koncentracijos diapazono vandeniniais tirpalais. Bandymo trukmė 28 paros. Žuvys šeriamos kasdien. Pašaro davinys nustatomas pagal pradinę žuvų masę ir po 14 parų gali būti perskaičiuojamas iš naujo. Bandymo pabaigoje žuvys vėl sveriamos. Taikant regresijos modelį, analizuojamas poveikis augimo greičiui, norint nustatyti koncentraciją, sukeliančią x % augimo greičio pokytį, t. y. EC_x (pvz., EC₁₀, EC₂₀ ar EC₃₀). Be to, norint nustatyti mažiausią pastebimo poveikio koncentraciją (LOEC), taigi ir nepastebimo poveikio koncentraciją (NOEC), duomenis galima lyginti su kontrolinių bandinių vertėmis.

1.4 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ

Reikėtų turėti atlikto ūmaus toksiškumo bandymo (žr. „Ūminis toksinis poveikis žuvims“, Žin., 2002, Nr. 81-3493), daryto su šiam bandymui pasirinkta rūšimi, rezultatus. Tai reikštų, kad bandomosios medžiagos tirpumas vandenyje ir garų slėgis yra žinomi ir kad ataskaitoje yra pateiktas patikimas metodas nustatyti ištirpintos bandomosios medžiagos kiekį žinomu tikslumu bei aptikimo riba.

Naudingą informaciją apie bandomąją medžiagą apima struktūrinė formulė, medžiagos grynumas, stabilumas vandenyje ir veikiant šviesai, pK_a, P_owir lengvo biologinio skaidomumo bandymo rezultatai (žr. „Lengvo“ biologinio skaidomumo nustatymas“, Žin., 2002, Nr. 81-3493).

1.5 BANDYMO PAGRĮSTUMAS (PATIKIMUMAS)

Bandymas yra pagrįstas, jei išlaikytos šios sąlygos:

- baigiant bandymą kontrolinio (-ių) bandymo (-ų) žuvų gaištamumas turi būti ne didesnis kaip 10%,

- kontrolinio (-ių) bandymo (-ų) vidutinė žuvų masė turi būti pakankamai padidėjusi, kad būtų galima aptikti mažiausią augimo greičio kitimą, kuris dar laikomas reikšmingu. Tarplaboratorinių bandymų palyginimas (3) parodė, kad kontroliniuose bandymuose vaivorykštinio upėtakio vidutinė masė per 28 paras turi padidėti bent per pusę jo pradinės vidutinės masės (t. y. 50 %); pvz., pradinė masė: 1g/žuviai (= 100 %), galutinė masė po 28 parų: daugiau arba lygu 1,5 g/žuviai (> 150 %),

- ištirpusio deguonies koncentracija per visą bandymą turi sudaryti bent 60 % oro soties vertės (OSV),

- kiekvieną bandymo momentą bandymo indų vandens temperatūra neturi tarpusavyje skirtis daugiau kaip ±1°C ir būti palaikoma 2°C intervale bandymo rūšims nurodytame diapazone (1 priedas).

1.6 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.6.1 Aparatūra

Be įprastos laboratorinės įrangos, reikalinga ši speciali įranga:

a) deguonies ir pH matuokliai;

b) įranga, nustatanti vandens kietumą ir šarmingumą;

c) darbo reikalavimus atitinkantys aparatai, kontroliuojantys temperatūrą, pirmenybę teikiant nuolatinės kontrolės aparatūrai;

d) indai, pagaminti iš chemiškai inertiškos medžiagos ir atitinkantys rekomenduotą įkrovą bei žuvų tankį (žr. 1.8.5 skirsnį ir 1 priedą);

e) reikiamo tikslumo svarstyklės (t. y. ± 0,5 % tikslumo).

1.6.2 Vanduo

Galima naudoti bet kokį vandenį, kuriame žuvys gali ilgai gyventi ir augti. Vandens kokybė turi nekisti visą bandymo laiką. pH vertė turi būti 6,5 -8,5, tačiau atliekant konkretų bandymą jo reikšmė neturi kisti daugiau kaip ± 0,5 pH vieneto. Rekomenduojamas didesnis kaip 140 mg/l (skaičiuojant CaCOs) kietumas. Norint užtikrinti, kad skiedimo vanduo per daug neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pvz., nesudarytų kompleksinių junginių su bandomąja medžiaga), bandiniai tam tikrais laiko tarpais turi būti analizuojami. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca, Mg, Na, K, Cl, SO₄), pesticidų (pvz., fosforo organinių ir chloro organinių pesticidų bendro kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti atliekama, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė santykinai nekinta. Jei buvo įrodyta, kad vandens kokybė nekinta bent metus, analizė gali būti atliekama ne taip dažnai, o intervalai padidinti (pvz., kas šešis mėnesius). Kai kurios skiedimui tinkamo vandens savybės yra pateiktos 2 priede.

1.6.3 Bandomieji tirpalai

Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą.

Pradinį tirpalą geriau ruošti bandomąją medžiagą maišant ar plakant skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ar ultragarsu). Koncentruotam pradiniam tirpalui ruošti galima naudoti prisotinimo kolonėles (tirpumo kolonėles).

Kartais norint gauti tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą, gali tekti naudoti organinius tirpiklius ar dispergatorius. Tinkami tirpikliai yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilsulfoksidas, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Tinkami dispergatoriai yra Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% metilceliuliozė ir HCO-40. Reikėtų atsargiai naudoti lengvai biologiškai suardomas medžiagas (pvz., acetoną) ir (ar) labai lakius junginius, nes, atliekant dinaminius bandymus, jie gali kelti problemų dėl bakterijų kaupimosi. Naudojama soliubilizuojanti medžiaga neturi daryti reikšmingo poveikio žuvų augimui ir neigiamo poveikio mailiui, kaip tai nustatoma atliekant kontrolinį bandymą vien tik su tirpikliu.

Bandomosios koncentracijos tirpalams į bandymo indus tiekti dinaminių bandymų metu reikalinga sistema, kuri nepertraukiamai dozuotų ir skiestų bandomosios medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozavimo siurblys, proporcingasis skiestuvas, prisotinimo sistema). Pradinių tirpalų ir skiedimo vandens srautai turi būti kartais, geriau kasdien, tikrinami ir per visą bandymą neturėtų kisti daugiau kaip 10 %. Tarplaboratorinio palyginimo bandymas (3) parodė, kad, atliekant bandymą su vaivorykštiniu upėtakiu, yra priimtinas 6 litrų/g žuvies ir parai vandens keitimo dažnis (žr. 1.8.2.2 skirsnį).

Pusiau statiniams (atnaujinimo) bandymams terpės atnaujinimo dažnis priklauso nuo bandomosios medžiagos stabilumo, tačiau vandenį atnaujinti rekomenduojama kasdien. Jei pradiniai stabilumo bandymai (žr. 1.4 poskyrį) rodo, kad bandomosios medžiagos koncentracija laikotarpiu tarp atnaujinimų yra nestabili (t. y. yra už 80 – 120 % vardinės koncentracijos ribų ar mažesnė kaip 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), reikėtų numatyti dinaminį bandymą.

1.6.4 Rūšių parinkimas

Šiam bandymui rekomenduojama rūšis yra vaivorykštinis upėtakis (Oncorhynchus mykiss), nes naudojant šią rūšį buvo sukauptas didžiausias tarplaboratorinio palyginimo bandymų patyrimas (1) (3). Galima naudoti ir kitas dokumentais tinkamai patvirtintas rūšis, bet tinkamoms bandymo sąlygoms gauti gali tekti pritaikyti bandymo metodiką. Pvz., įgyta patyrimo su zebrine danija (Danio rerio) (4) (5) ir japonine medaka (Oryzias latipes) (6) (7) (8). Taigi ataskaitoje reikia pateikti rūšies pasirinkimo priežastį ir bandymų metodą.

1.6.5 Žuvų laikymas

Bandymui pasirenkamos vieno kamieno populiacijos ir geriau to paties neršto bandymo žuvys, kurios prieš bandymą bent dvi savaites buvo laikomos tokios kokybės vandenyje ir tokiomis apšvietimo sąlygomis, kurios panašios į bandymo sąlygas. Jų dienos pašaro davinys laikymo ir bandymo laikotarpiu turi sudaryti ne mažiau kaip 2 % kūno masės, bet geriau 4 % kūno masės.

Po 48 valandų stabilizavimo laikotarpio užrašomi mirtingumo duomenys ir taikomi šie kriterijai:

- jei populiacijos mirtingumas per septynias paras yra didesnis kaip 10 %, visa partija atmetama;

- jei populiacijos mirtingumas 5-10%: žuvys papildomai aklimatizuojamos dar septynias paras; jei per kitas septynias paras mirtingumas yra didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama;

- jei populiacijos mirtingumas per septyniais paras yra mažesnis kaip 5 %, partija priimama. Dvi savaites prieš bandymą ir visą bandymo laiką žuvys neturėtų būti gydomos vaistais.

1.7 BANDYMO PLANAS

Bandymo planą sudaro – bandomosios koncentracijos verčių ir tarpo tarp jų parinkimas, indų kiekvienai koncentracijai ir žuvų skaičiaus viename inde parinkimas. Geriausia būtų, kad bandymo planas būtų pasirinktas atsižvelgiant į:

a) tyrimo tikslą;

b) taikomą statistinės analizės metodą;

c) bandymų priemonių buvimą ir kainą.

Jei įmanoma, aptariant tikslą reikėtų nurodyti statistinę galimybę duoto dydžio (pvz., augimo greičio) skirtumui aptikti, arba kitaip, koks turi būti EC“ (pvz., kai x = 10,20 ar 30 ir geriau ne mažesnis kaip 10) įvertinimo tikslumas. Be šito negalima tiksliai apibrėžti tyrimo apimties.

Svarbu pripažinti, kad vienam statistinės analizės metodui taikytas optimalus (geriausiai panaudoja išteklius) planas nebūtinai yra optimalus kitam metodui. Taigi rekomenduotas planas LOEC ir NOEC įvertinti nebus toks pat kaip regresinei analizei rekomenduotas planas.

Dėl Stephan ir Rogers (9) svarstytų priežasčių regresinė analizė dažniausiai tinka geriau nei dispersinė analizė. Tačiau nerandant tinkamo regresijos modelio (r² < 0,9), reikia taikyti NOEC ir LOEC įvertinimą.

1.7.1. Regresinės analizės planas

Svarbūs regresijos metodu analizuojamo bandymo plano nagrinėtini klausimai yra šie:

a) bandymui naudotos koncentracijos būtinai turi aprėpti poveikio koncentraciją (pvz., EC_{10, 20, 30} ir dominančio medžiagos poveikio koncentracijos verčių diapazoną. Poveikio koncentracijos įverčiai bus tiksliausi, kai poveikio koncentracijos bus ties bandomųjų koncentracijos verčių diapazono viduriu. Tinkamai parinkti bandomąsiams koncentracijas gali padėti iš anksto atliktas diapazono nustatymo bandymas;

b) norint turėti patenkinamą statistinį modelį bandymui turi būti naudojamas vienas kontrolinis rezervuaras ir penki papildomi rezervuarai, skirti skirtingoms koncentracijų vertėms. Jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, be bandomosios serijos, turi būti dar vienas kontrolinis bandinys su didžiausios bandomosios koncentracijos soliubilizavimo medžiaga (žr. 1.8.3 ir 1.8.4 skirsnius);

c) galima naudoti tinkamą geometrinės progresijos ar logaritminę eilutę (10) (žr. 3 priedą). Geriau naudoti logaritminę bandomųjų koncentracijų eilutę;

d) jei yra daugiau kaip šeši indai, papildomi indai turi būti panaudoti lygiagretiems bandymams arba paskirstyti visam koncentracijų verčių diapazonui, tarpams tarp jų sumažinti. Abi šios priemonės vienodai tinka.

1.7.2. NOEC ir LOEC įvertinimo planas taikant dispersinę analizę

Kiekvienai koncentracijos vertei gerai būtų turėti dar po vieną indą, ir statistinė analizė turėtų būti daroma atsižvelgiant į kiekvieno indo duomenis (11). Jei nėra indų lygiagrečiam bandymui, neįmanoma atsižvelgti į kintamumą tarp indų be to kintamumo, kuris atsiranda dėl atskirų žuvų. Tačiau patyrimas parodė (12), kad tiriamu atveju kintamumas tarp bandymo indų buvo labai mažas, lyginant su kintamumu viename inde (t. y. tarp žuvų). Taigi santykinai priimtina alternatyva yra statistinę analizę atlikti atsižvelgiant į kiekvienos žuvies tyrimus.

Dažniausiai naudojamos bent penkios koncentracijų vertės, sudarančios eilutę pagal geometrinę progresiją, kurios koeficientas turėtų būti ne didesnis kaip 3,2.

Kai bandymai daromi turint bandymų indus lygiagretiems bandymams, lygiagrečių kontrolinių indų skaičius, taigi ir žuvų skaičius, turi būti dvigubai didesnis negu kiekvienai bandomajai koncentracijai pasirinktas skaičius, kuris turi būti vienodas (13) (14) (15). Priešingu atveju, jei indų lygiagretiems bandymams nėra, kontrolinės grupės žuvų skaičius turi būti lygus kiekvienai bandomajai koncentracijai naudojamam žuvų skaičiui.

Jei dispersinė analizė (ANOVA) turi būti atliekama atsižvelgiant į bandymų indų duomenis, o ne į kiekvienos žuvies tyrimus (tam reikėtų kiekvieną žuvį paženklinti ar naudoti tariamai („pseudo“) savituosius augimo greičius (žr.2.1.2 skirsnį)), reikia turėti pakankamą indų skaičių lygiagretiems bandymams, kad būtų galima nustatyti standartinį,vienos koncentracijos bandymų indų“ nuokrypį. Vadinasi, dispersinės analizės paklaidai reikėtų turėti bent 5 laisvės laipsnius (11). Jei daromi tik lygiagretūs kontroliniai bandymai, esama pavojaus, kad paklaidos kintamumas bus pasislinkęs, nes paklaida gali didėti didėjant tiriamo augimo greičio vidutinei vertei. Reikia tikėtis, jog augimo greitis mažėja, koncentracijai didėjant, todėl atsiranda tendencija per daug sureikšminti kintamumą.

1.8 DARBO EIGA

1.8.1 Bandymų žuvų atranka ir svėrimas

Svarbu, kad žuvų masės skirtumas bandymo pradžioje būtų kuo mažesnis. Bandymams rekomenduotų skirtingų rūšių žuvų masės tinkami diapazonai yra pateikti 1 priedėlyje. Būtų geriausia, kad bandymo pradžioje visos partijos žuvų masės kitimo diapazonas būtų lygus žuvų masės aritmetiniam vidurkiui ± 10 % ir jokiu atveju nebūtų didesnis kaip 25 %. Vidutinei masei nustatyti rekomenduojama prieš bandymą pasverti žuvų ėminio dalį.

Žuvys turi būti nustojamos maitinti 24 h iki bandymo pradžios. Toliau jos turi būti atsitiktinai atrenkamos. Vartojant bendrąjį anestetiką, pvz., [neutralizuotą vandeninį 100 mg/l (3 – aminobenzenkarboninės rūgšties etilesterio metansulfonato (MS 222) tirpalą, sumaišant dvi dalis natrio hidrokarbonato ir vieną dalį MS 222], žuvys turi būti atskirai pasveriamos (sausai nušluostytos) gyvų žuvų masei nustatyti 1 priede nurodytu tikslumu. Tos žuvys, kurių masė atitinka numatytą diapazoną, paliekamos ir vėliau paskirstomos į bandymų indus. Turi būti registruojama bendra kiekvieno bandymų indo gyvų žuvų masė. Anestetiko vartojimas, taip pat apdorojimas (įskaitant šluostymą ir svėrimą) žuvų mailiui gali sukelti įtampą ir jį galima sužeisti, ypač jei tai mažų žuvų rūšys. Taigi apdoroti mailių reikia ypač atsargiai ir vengti bandymų gyvūnų įtampos ir sužeidimų.

Žuvys vėl sveriamos 28 bandymo parą (žr. 1.8.6 skirsnį). Tačiau, jei manoma, kad būtina perskaičiuoti pašaro davinį žuvys gali būti sveriamos 14 bandymo parą (žr. 1.8.2.3 skirsnį). Galima taikyti kitus metodus, pvz., fotografavimą, norint nustatyti žuvų dydžio pokytį pagal kurį būtų galima reguliuoti pašaro davinį.

1.8.2. Poveikio sąlygos

1.8.2.1. Trukmė

Bandymo trukmė ≥ 28 paros.

1.8.2.2. Įkrova ir žuvų tankis

Svarbu, kad įkrova ir žuvų tankis būtų tinkamas tiriamai žuvų rūšiai (žr. 1 priedą). Jei žuvų tankis per didelis, dėl perpildymo sukeltos įtampos mažėja augimo greitis ir žuvys gali susirgti. Jei žuvų tankis per mažas, gali atsirasti teritorinis elgesys, kuris irgi gali veikti augimą. Bet kuriuo atveju įkrova turi būti pakankamai maža, kad be aeravimo būtų palaikoma bent 60 % OSV ištirpusio deguonies koncentracija. Tarplaboratorinis bandymas (3) parodė, kad vaivorykštiniam upėtakiui priimtina įkrova, jei 40 l vandens tūrio būtų 16 upėtakių po 3 – 5 g masės. Rekomenduojamas vandens keitimo dažnis bandymo metu yra 6 litrai/g žuvies per parą.

1.8.2.3. Šėrimas

Žuvys turi būti šeriamos atitinkamu pašaru (1 priedas) ir pakankamai dažnai, kad būtų garantuotas priimtinas augimo greitis. Reikėtų stengtis išvengti mikroorganizmų dauginimosi ir vandens drumstumo. Vaivorykštiniam upėtakiui 4 % kūno masės davinys per parą turėtų atitikti šias sąlygas (3) (16) (17) (18). Paros davinys turi būti padalytas į dvi lygias dalis ir sušeriamas žuvims per du kartus darant bent penkių valandų pertrauką. Davinys nustatomas pagal kiekvieno bandymų indo bendrą pradinę žuvų masę. Jei žuvys 14 parą sveriamos papildomai, davinys perskaičiuojamas. Prieš sveriant, žuvys turi būti nemaitintos 24 h.

Nesuėstas pašaras ir išmatos iš bandymų indų turi būti pašalinami kasdien, rūpestingai išsiurbiant kiekvieno indo dugną.

1.8.2.4. Šviesa ir temperatūra

Apšvietimo laikotarpis ir vandens temperatūra turi atitikti žuvų rūšį (1 priedas).

1.8.3. Bandomosios medžiagos koncentracijos

Dažniausiai reikia naudoti penkias bandomosios medžiagos koncentracijas, neatsižvelgiant į bandymo planą (žr. 1.7.2 skirsnį). Ankstesnės žinios apie bandomosios medžiagos toksiškumą (pvz., ūmaus toksiškumo bandymo ir (ar) koncentracijų diapazono nustatymo tyrimo duomenys) turėtų padėti renkantis tinkamas bandomąsias koncentracijas. Sprendimą naudoti mažiau kaip penkias koncentracijas reikia pagrįsti. Didžiausia bandoma koncentracija turi būti ne didesnė už medžiagos tirpumo vandenyje ribinę koncentraciją.

Kad pradinį tirpalą būtų lengviau paruošti, gali būti naudojama soliubilizuojanti medžiaga, o jos galutinė koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1 ml/l. Geriau būtų, jei ji visuose bandymų induose būtų vienoda (žr. 1.6.3 skirsnį). Reikėtų kiek įmanoma stengtis vengti naudoti šias medžiagas.

1.8.4. Kontroliniai bandymai

Skiedimo vandens kontrolinių bandinių skaičius priklauso nuo bandymo plano (žr. 1.7 – 1.7.2). Jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, į bandymo planą turi būti įtrauktas toks soliubilizavimo medžiagos kontrolinių bandinių skaičius, kiek yra skiedimo vandens kontrolinių bandinių.

1.8.5. Kiekybės analizių ir matavimų dažnis

Atliekant bandymą bandomosios medžiagos koncentracijų vertės nustatomos reguliariais tarpais (žr. toliau).

Atliekant dinaminius bandymus, skiediklio ir toksiškos medžiagos pradinio tirpalo srautai turi būti tikrinami tam tikrais laiko tarpais, geriau kasdien, ir visą bandymą neturi kisti daugiau kaip 10 %. Jei tikimasi, kad bandomosios medžiagos koncentracijos vertės bus lygios vardinei koncentracijai ± 20 % (t. y. 80 -120 %; žr. 1.6.2 ir 1.6.3 skirsnius), rekomenduojama atlikti bent didžiausios ir mažiausios bandomosios koncentracijos analizę bandymo pradžioje, o vėliau kas savaitę. Jei atliekant bandymus nesitikima, kad bandomosios medžiagos koncentracija gali likti vardinės koncentracijos ± 20 % vertės (pagal bandomosios medžiagos stabilumo duomenis), būtina atlikti visų bandomųjų koncentracijų analizę, bet pagal tą patį grafiką.

Jei tikimasi, kad, atliekant pusiau statinius (atnaujinimo) bandymus, bandomosios medžiagos koncentracija liks vardinės koncentracijos ± 20 % vertės, rekomenduojama atlikti bent didžiausios ir mažiausios bandomosios koncentracijos analizę iš karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jo atnaujinimą tyrimo pradžioje ir kas savaitę vėliau. Jei tai bandymai, kuriuos atliekant nemanoma, kad koncentracija liks vardinės koncentracijos ± 20 % vertės, turi būti išmatuotos visos koncentracijos vertės laikantis to paties kaip ir stabilioms medžiagoms analizės režimo.

Rekomenduojama rezultatus pateikti remiantis išmatuotomis koncentracijos vertėmis. Jei yra įrodymų, leidžiančių parodyti, kad bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką buvo patenkinamai palaikoma vardinės koncentracijos ± 20 % vertės ar išmatuotos pradinės koncentracijos vertės, rezultatai gali būti pateikiami remiantis vardine ar išmatuota vertėmis.

Bandinius gali tekti filtruoti (pvz., pro 0,45 μm akytumo filtrą) ar centrifuguoti. Rekomenduojamas metodas – centrifugavimas. Tačiau, jei filtras bandomosios medžiagos neabsorbuoja, tinkamas būtų ir filtravimas.

Atliekant bandymą visuose bandymų induose turi būti matuojama ištirpusio deguonies koncentracija, pH ir temperatūra. Turi būti matuojamas kontrolinių bandymų ir indo su didžiausios koncentracijos bandymu bendras kietumas, šarmingumas ir druskingumas (jei reikia). Ištirpusio deguonies koncentracija ir druskingumas (jei reikia) turi būti matuojami mažiausiai tris kartus (bandymo pradžioje, viduryje ir pabaigoje). Darant pusiau statinius bandymus, ištirpusio deguonies koncentraciją rekomenduojama matuoti dažniau, geriau prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, ar bent kartą per savaitę. Atliekant statinius bandymus su atnaujinimu, pH vertė turi būti matuojama prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, o atliekant dinaminius bandymus – bent kartą per savaitę. Vandens kietumas ir šarmingumas atliekant kiekvieną bandymą matuojami vieną kartą. Temperatūrą bent viename bandymų inde reikėtų kontroliuoti nuolat.

1.8.6. Stebėjimai

Masė. Baigiant bandymą visos gyvos žuvys turi būti pasvertos, norint nustatyti gyvų žuvų grupių (sausai nušluostytų filtro popieriumi) masę, imant duomenis pagal bandymų indus ar atskirai kiekvienos žuvies. Geriau yra sverti bendrai bandymų indus, nes, sveriant kiekvieną žuvį, jas reikėtų atskirai ženklinti. Nustatant atskirų žuvų masę kiekvienos žuvies savitajam augimo greičiui nustatyti, pasirinktoji ženklinimo metodika gyvūnams neturi kelti įtampos (gali tikti žuvų ženklinimo užsaldant alternatyvos, pvz., plonas spalvotas valas).

Žuvys visą bandymo laiką turi būti kasdien apžiūrimos ir turi būti pažymimos bet kokios išorės anomalijos (pvz., kraujavimas, spalvos pakeitimas) bei neįprastas elgesys. Visi gaištamumo atvejai turi būti registruojami, o negyvos žuvys kuo greičiau pašalinamos. Jei įkrova ir žuvų tankis yra pakankami, negyvos žuvys kitomis nekeičiamos, kad būtų išvengta poveikio augimui dėl vienam bandymų indui tenkančio žuvų skaičiaus kitimo. Tačiau šėrimo davinį reikia koreguoti.

2 DUOMENYS IR ATASKAITA

2.1 REZULTATŲ APDOROJIMAS

Rekomenduojama, kad, planuojant ir analizuojant bandymo planą, dalyvautų statistikas, nes šis bandymo metodas leidžia keisti eksperimento planą, pvz., bandymo indų skaičių, bandomųjų koncentracijų skaičių, žuvų skaičių ir t. t. Atsižvelgiant į bandymo plano variantų įvairovę, jokių specialių nurodymų dėl statistinės tyrimo eigos čia nepateikiama.

Augimo greitis neturėtų būti apskaičiuojamas bandymų indams, jei gaištamumas juose didesnis kaip 10 %. Tačiau gaištamumas turi būti nurodytas visoms bandomosioms koncentracijoms.

Koks metodas bebūtų taikomas duomenims analizuoti, pagrindinė sąvoka yra savitasis augimo greitis r tarp laiko ti ir t2. Jis gali būti nustatytas keliais būdais pagal tai, ar žuvys yra ženklinamos atskirai ar ne, arba pagal tai, ar reikia nustatyti bandymo indui vidutinį greitį.

čia:

r₁ = atskiros žuvies savitasis augimo greitis,

r₂ = vidutinis savitasis augimo greitis rezervuare,

r₃ = tariamai „pseudo“ savitasis augimo greitis,

w₁, w₂ = konkrečios žuvies masė, atitinkamai, laiku t₁ ir t₂,

log_e w₁ = atskiros žuvies masės tyrimo pradžioje logaritmas,

log_e w₂ = atskiros žuvies masės tyrimo pabaigoje logaritmas,

log_ew, = tyrimo pradžioje nustatytos rezervuaro žuvų masės w₁ logaritmų verčių vidurkis,

log_e w₂ = tyrimo pabaigoje nustatytos rezervuaro žuvų masės w₂ logaritmų verčių vidurkis,

t₁, t₂ = tyrimo laikotarpio pradžios ir pabaigos laikas (paros),

r₁, r₂, r₃ gali būti apskaičiuoti 0-28 parų laikotarpiui ir, jei tinka (t. y. kai buvo matuojama 14 parą), 0-14 ir 14-28 parų laikotarpiams.

2.1.1 Rezultatų analizė, taikant regresiją (koncentracijos ir atsako santykio modeliavimas)

Šis analizės metodas nustato atitinkamą savitojo augimo greičio ir koncentracijos matematiškai išreiškiamą santykį taigi leidžia įvertinti EC“, t. y. kiekvieną reikiamą EC vertę. Taikant šį metodą, r vertės (n) atskirai žuviai apskaičiuoti nebūtina, ir analizė gali būti pagrįsta vidutine bandymo indo (r₂) r verte. Šiam metodui taikoma pirmenybė. Jis taip pat tinkamesnis naudojant mažiausių žuvų rūšis.

Norint ištirti koncentracijos ir atsako santykį, vidutiniai savitieji augimo greičiai bandymo indui (r₂) turi būti išreiškiami grafiškai, kaip koncentracijos funkcija.

Santykiui tarp r₂ ir koncentracijos išreikšti turi būti pasirinktas atitinkamas modelis ir jo pasirinkimas turi būti atitinkamai pagrįstas.

Jei kiekviename bandymo inde likusių gyvų žuvų skaičius yra nevienodas, modelio pritaikymo procese, paprastame ar netiesiniame, reikėtų naudoti svorinius koeficientus, taip atsižvelgiant į nevienodą grupių dydį.

Modelio pritaikymo metodas turi leisti įvertinti, pvz., EC20 ir nustatyti jos sklaidą (standartinę paklaidą ar pasikliovimo intervalą). Pritaikyto modelio grafikas turėtų būti parodytas lyginant su duomenimis, kad būtų galima įvertinti pritaikyto modelio atitikimą (9) (19) (20) (21).

2.1.2 Rezultatų analizė LOEC įvertinti

Jei atliekant bandymą kiekvienai iš visų koncentracijų verčių yra po keletą indų lygiagretiems pakartojimams, LOEC įvertinimas gali būti grindžiamas vidutinio savitojo augimo greičio bandymo indui dispersine analize (ANOVA) (žr. 2.1 poskyrį). Vėliau taikomas tinkamas metodas (pvz., Dunnett ar Williams kriterijus (13) (14) (15) (22), kuriuo kiekvienos koncentracijos vidutinė r vertė lyginama su kontrolinių bandinių vidutine r verte. Tai daroma, norint nustatyti mažiausią koncentraciją, kuriai šis skirtumas yra reikšmingas, esant 0,05 kriterijaus reikšmingumo lygmeniui. Jei parametriniams metodams reikiamos hipotezės (nenormalus pasiskirstymas (pvz., Shapiro-Wilk kriterijus) ar heterogeninė sklaida (Bartlett kriterijus)) nepasitvirtina, reikėtų numatyti duomenų pertvarkymą sklaidoms homogenizuoti prieš atliekant dispersine analizę ar atlikti svorinę dispersine analizę.

Jei, atliekant bandymą, lygiagretiems pakartojimams atlikti reikalingų indų yra ne visoms koncentracijos vertėms, bandymo indais pagrįsta dispersine analizė bus netiksli ar neįmanoma. Šiuo atveju yra priimtinas kompromisas dispersinei analizei panaudoti kiekvienos žuvies „pseudo“ savitąjį augimo greitį r₃.

Toliau vidutinė r₃ vertė kiekvienai koncentracijai gali būti lyginama su vidutine r₃ verte kontroliniams bandymams. Tuomet LOEC gali būti nustatytas taip, kaip buvo daryta pirmiau. Būtina pripažinti, kad šis metodas neatsižvelgia į kintamumą tarp bandymo indų, išskyrus kintamumą tarp atskirų žuvų, ir šiuo požiūriu nesuteikia jokios apsaugos. Tačiau patyrimas parodė (9), kad kintamumas tarp bandymo indų buvo labai mažas lyginant su kintamumu konkrečiame inde (t.y. tarp žuvų). Jei į analizę neįtraukiami kiekvienos žuvies duomenys, būtina numatyti išskirčių identifikavimo metodą ir pagrįsti jo taikymą.

2.2 REZULTATŲ AIŠKINIMAS

Rezultatai turi būti aiškinami atsargiai, jei išmatuotos bandomųjų tirpalų toksiškų medžiagų koncentracijos vertės yra arti analizės metodo aptikimo ribos arba, jei atliekant pusiau statinius bandymus, bandomosios medžiagos tirpalo prieš atnaujinimą koncentracija yra mažesnė kaip šviežiai paruošto tirpalo koncentracija.

2.3 BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:

2.3.1 Bandomoji medžiaga:

- fizinė būsena ir atitinkamos fizinės ir cheminės savybės,

- cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynumą, ir, jei reikia, analizės metodas bandomajai medžiagai kiekybiškai nustatyti.

2.3.2 Bandomieji gyvūnai

- mokslinis pavadinimas, gali būti,

- veislė, dydis, tiekėjas, bet kokie prieš tai buvę poveikiai, priežiūra ir 1.1.

2.3.3 Bandymo sąlygos:

- taikytas bandymo metodas (pvz., pusiau statinis ar su atnaujinimu, dinaminis, įkrova, žuvų tankis ir 1.1,

- bandymo planas (pvz., bandymų indų skaičius, bandomosios koncentracijos ir lygiagrečių bandymų skaičius, žuvų skaičius viename inde),

- pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų atnaujinimo dažnis (jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija),

- vardinės bandymo koncentracijos, bandymų induose nustatytų analizės būdu koncentracijų vidutinės vertės ir jų standartiniai nuokrypiai bei nustatymo metodas ir įrodymai, kad buvo atliekami tikrųjų bandomosios medžiagos tirpalų koncentracijų matavimai,

- skiedimo vandens savybės: pH, kietumas, šarmingumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės, bandymo terpės druskingumas (jei matuota) ir visi kiti atlikti matavimai,

- vandens kokybė bandymų induose: pH, kietumas, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija,

- išsami informacija apie šėrimą (pvz., davinio rūšis (-ys), šaltinis, duodamas kiekis ir šėrimo dažnumas).

2.3.4 Rezultatai:

- kontrolinių bandymų atitikimo pagrįstumo kriterijams duomenys ir duomenys apie gaištamumą visose bandomosiose koncentracijose,

- taikytos statistinės analizės metodikos, statistika, pagrįsta lygiagrečiais bandymų indais ar žuvimis, duomenų apdorojimas ir naudotų metodikų pagrindimas,

- lentelėse pateikti 0,14 (jei matuota) ir 28 parų atskirų žuvų ir vidutinės žuvų masės duomenys bandymo indui ar tariamai „pseudo“ savitojo augimo greičio (jei reikia) vertės 0-28 parų laikotarpiu ar galbūt 0 – 14 ir 14 – 28 parų laikotarpiu,

- statistinės analizės (t. y. regresinės analizės ar dispersinės analizės) rezultatai, geriau , kad tai būtų lentelės ir grafikai, LOEC (p = 0,05) bei NOEC ar EC_X vertės, nurodant, kai įmanoma, atitinkamas standartines paklaidas,

- visi pasitaikantys žuvų neįprasto elgesio atvejai ir visos matomos bandomosios medžiagos poveikio pasekmės.

3 NUORODOS

1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UKRing Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2.

2) Meyer, A., Bierman, C. H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231 – 236 p.

3) Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.

4) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, 1855 – 1870 p.

5) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N. and Hofte B. B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, 157 – 164 p.

6) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.

7) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28,287 – 297 p.

8) Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.

9) Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia,328-338p.

10) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 p.

11) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.

12) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10—12 December 1991.

13) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control J. Amer. Statist. Assoc, 50, 1096 – 1121 p.

14) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20,482 — 491 p.

15) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103 – 117 p.

16) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, 123 – 133 p.

17) Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, 33 – 41 p.

18) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 p.

19) Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485 – 1494

P-

20) De Graeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.

21) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assessment Center. Sept. 1988.12 p.

22) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28,510 —531 p.

1 priedas

BANDYMAMS REKOMENDUOJAMOS ŽUVŲ RŪŠYS IR TINKAMOS BANDYMO SĄLYGOS

Rūšys	Rekomenduojamas bandymo temperatūros diapazonas (°C)	Apšvietimo trukmė (valandos)	Rekomenduojamas žuvų pradinės masės diapazonas (g)	Būtinas matavimo tikslumas	Įkrova (g/l)	Gyvūnų tankis (litrui)	Maistas	Bandymo trukmė (paros)
Rekomenduojamos rūšys:
Oncorhynchus mykiss Vaivorykštinis upėtakis	12,5-16,0	12-16	1-5	100 mg tikslumu	1,2-2,0	4	Sausas firminis lašišinių mailių maistas	≥28
Kitos dokumentais tinkamai patvirtintos rūšys:
Danio rerio Zebrinė danija	21-25	12-16	0,050-0,100	1 mg tikslumu	0,2-1,0	5-10	Gyvas maistas {Brachionus Artemid)	≥28
Oryzias latipes Japoninė medaka	21-25	12-16	0,050-0,100	1 mg tikslumu	0,2-1,0	5-20	Gyvas maistas (Brachionus Artemid)	≥28

2 Priedas

KAI KURIOS SKIEDIMO VANDENS CHEMINĖS SAVYBĖS

Medžiaga	Koncentracija
Kietosios dalelės	< 20 mg/l
Bendra organinė anglis	< 2 mg/l
Nejonizuotas amoniakas	<1 μg/l
Liekamasis chloras	< 10 μg/l
Bendras fosforo organinių pesticidų kiekis	< 50 ng/l
Bendras chloro organinių pesticidų ir polichlorintų difenilų kiekis	< 50 ng/l
Bendras organinis chloras	< 25 ng/l

3 Priedas

TOKSIŠKUMO BANDYMUI TINKAMŲ KONCENTRACIJŲ LOGARITMINĖ EILUTĖ (9)

Stulpelis (koncentracijų tarp 100 ir 10 ar tarp 10 ir 1 skaičius)¹
1	2	3	4	5	6	7
100	100	100	100	100	100	100
32	46	56	63	68	72	75
10	22	32	40	46	52	56
3,2	10	18	25	32	37	42
1,0	4,6	10	16	22	27	32
	2,2	5,6	10	15	19	24
	1,0	3,2	6,3	10	14	18
		1,8	4,0	6,8	10	13
		1,0	2,5	4,6	7,2	10
			1,6	3,2	5,2	7,5
			1,0	2,2	3,7	5,6
				1,5	2,7	4,2
				1,0	1,9	3,2
					1,4	2,4
					1,0	1,8
						1,3
						1,0

¹ Stulpelyje galima pasirinkti penkių (ar daugiau) viena po kitos einančių koncentracijų eilutę. Stulpelio (x) koncentracijų vidurio taškai randami stulpelyje (2x +1). Sąraše nurodytos vertės gali būti išreikštos procentine tūrio dalimi ar masės koncentracija (mg/l ar μg/1). Vertės gali būti padaugintos ar padalytos iš 10, pakelto bet kuriuo tinkamu laipsniu. 1 stulpelį galima būtų naudoti, jei toksiškumo lygio neapibrėžtis yra didelė.

ŽUVYS, TRUMPALAIKIS TOKSIŠKUMO EMBRIONUI IR MAILIUI SU TRYNIO MAIŠELIU BANDYMAS (C.15.)

1 METODAS

Šis trumpalaikio toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 212 (1998) kopija.

1.1 ĮVADAS

Šis trumpalaikio toksiškumo žuvų embrionams ir mailiui su trynio maišeliu bandymas yra trumpalaikis. Ką tik apvaisinti žuvų ikrai yra veikiami nuo jų apvaisinimo iki mailiaus su trynio maišeliu stadijos pabaigos. Toksiškumo bandymas embrionui ir mailiui su trynio maišeliu atliekamas be šėrimo, bandymas turi būti baigtas, kol mailius dar maitinamas iš trynio maišelio.

Bandymo tikslas – nustatyti cheminių medžiagų letalaus ir mažesnio subletalaus poveikio specifinėms vystymosi stadijoms ir bandytai rūšiai pasekmes. Šis bandymas turėtų suteikti vertingos informacijos, nes jis a) galėtų būti letalumo ir subletalumo bandymų jungtimi, b) galėtų būti taikomas kaip atrankos bandymas, numatant visą pradinės gyvenimo stadijos bandymą ar chroniško toksiškumo bandymus ir c) galėtų būti taikomas bandyti rūšis, kurių auginimo metodai dar nėra taip gerai parengti, kad aprėptų perėjimo etapą iš endogeninio į egzogeninį maitinimą.

Žinotina, kad tik visas žuvies gyvenimo ciklo stadijas apimantys bandymai gali duoti tikslų chroniško toksiškumo žuvims įvertį ir kad bent kiek sutrumpinus veikimą, neįtraukiant kurios nors gyvenimo stadijos, gali sumažėti jautrumas, taigi gali būti nepakankamai įvertintas chroniškas toksiškumas. Todėl manoma, kad embriono ir mailiaus su trynio maišeliu bandymas turėtų būti ne toks jautrus kaip visas pradinio gyvenimo stadijų bandymas, ypač labai lipofiliškų cheminių medžiagų (log P_ow > 4) ir specifinio toksiško veikimo cheminių medžiagų atvejais. Tačiau mažesnių jautrumo skirtumų tarp šių dviejų bandymų reikėtų tikėtis bandant nespecifinio, narkotinio veikimo tipo chemines medžiagas (1).

Dar prieš šio bandymo paskelbimą daugiausia patyrimo, atliekant embriono ir mailiaus su trynio maišeliu bandymą, buvo sukaupta su gėlavandenėmis žuvimis – zebrinėmis danijomis (Danio rerio) Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – įprastas pavadinimas danija). Todėl smulkesnių nurodymų, kaip atlikti bandymą, naudojant šią žuvų rūšį, pateikta 1 priede. Tačiau tai netrukdo naudoti kitas rūšis, su kuriomis taip pat yra sukaupta patyrimo (IA ir IB lentelės).

1.2 APIBRĖŽIMAI

Mažiausia pastebimo poveikio koncentracija LOEC. Mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis yra statistiškai reikšmingas lyginant su kontroliniais bandiniais (kai p<0,05). Tačiau visų didesnių kaip LOEC bandomųjų koncentracijų kenksmingas poveikis turi būti lygus ar didesnis kaip LOEC poveikis.

Nepastebimo poveikio koncentracija NOEC. Bent kiek už LOEC mažesnė bandomosios medžiagos koncentracija.

1.3 BANDYMO ESMĖ

Embrionų ir mailiaus su trynio maišeliu augimo stadijų žuvys veikiamos vandeniniais įvairių koncentracijų bandomosios medžiagos tirpalais. Bandymo protokolas leidžia pasirinkti pusiau statinį ar dinaminį bandymą. Pasirinkimas priklauso nuo bandomosios medžiagos prigimties. Bandymas pradedamas sudėjus apvaisintus ikrus į bandymo indus ir baigiamas prieš pat tą momentą, kai kuriame nors inde lervos trynio maišelis yra visiškai absorbuotas ar kai iš bado pradeda gaišti kontrolinių bandymų lervos. Įvertinamos letalios ir subletalios poveikio pasekmės. Jos lyginamos su kontrolinėmis vertėmis mažiausiai pastebimo poveikio koncentracijai, taigi ir nestebimo poveikio koncentracijai nustatyti. Kitaip poveikiai gali būti analizuojami, taikant regresijos modelį ir siekiant nustatyti koncentraciją, kuri sukeltų x % pokytį (t. y., LC/EC_X, čia x yra tam tikras % išreikštas poveikis).

1.4 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ

Reikėtų turėti ūmaus toksiškumo bandymo (žr. „Ūminis toksinis poveikis žuvims“, Žin., 2002, Nr. 81-3493), geriau atlikto su šiam bandymui pasirinkta rūšimi, rezultatus. Rezultatai gali būti naudingi, tiriant ankstyvuosius gyvenimo etapus, pasirenkant atitinkamą bandomųjų koncentracijų diapazoną. Turi būti žinomas medžiagos tirpumas vandenyje (įskaitant tirpumą bandymo vandenyje) ir bandomosios medžiagos garų slėgis. Turi būti patikimas metodas nustatyti ištirpintos bandomosios medžiagos kiekį žinomu tikslumu ir aptikimo riba, kurie nurodomi ataskaitoje.

Informacija apie bandomąją medžiagą, vertinga bandymo sąlygoms nustatyti, yra struktūrinė formulė, medžiagos grynumas, stabilumas veikiant šviesai, stabilumas bandymo sąlygomis, pK_a, P_ow ir lengvo biologinio skaidomumo bandymo rezultatai (žr. „„Lengvo“ biologinio skaidomumo nustatymas“, Žin., 2002, Nr. 81-3493).

1.5 BANDYMO PAGRĮSTUMAS (PATIKIMUMAS)

Bandymo pagrįstumui (patikimumui), turi būti įvykdytos šios sąlygos:

- bendras apvaisintų ikrų išgyvenamumas kontroliniuose bandiniuose ir, jei reikia, induose vien tik su tirpikliu turi būti didesnis arba lygus ribinėms vertėms, apibrėžtoms 2 ir 3 prieduose,

- ištirpusio deguonies koncentracija visą bandymą turi sudaryti 60 % – 100 % oro soties vertės (OSV),

- kiekvieną bandymo momentą temperatūros verčių (ir bandymo induose, ir skirtingomis bandymo dienomis) skirtumas neturi būti didesnis kaip ±1,5 °C, o temperatūra turėtų būti palaikoma bandymo rūšims nurodyto diapazono (2 ir 3 priedai) ribose.

1.6 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.6.1. Bandymų indai

Galima naudoti bet kokius stiklinius ar chemiškai inertiškos medžiagos indus. Indų matmenys turi būti pakankamai dideli, kad atitiktų įkrovos sąlygas (žr. 1.7.1.2). Bandymų indus bandymų atlikimo plote rekomenduojama išdėstyti atsitiktinai. Jei laboratorijoje yra sistemingi poveikiai, kuriuos būtų galima kontroliuoti suskirstant į blokus, indus geriau išdėstyti nevisiškai atsitiktinai, bet pagal atsitiktinę blokų schemą, kiekvieną bloką kontroliuojant. Jei taikoma blokų schema, į tai būtina atsižvelgti vėliau analizuojant duomenis. Bandymų indai turi būti apsaugoti nuo nepageidautinų trikdžių.

1.6.2 Žuvų rūšių parinkimas

Rekomenduotos žuvų rūšys nurodytos 1A lentelėje. Tai netrukdo naudoti kitas rūšis (pavyzdžiai pateikti 1B lentelėje), bet, norint sudaryti tinkamas bandymų sąlygas, gali tekti pritaikyti bandymų metodiką. Šiuo atveju ataskaitoje turi būti pagrįsti rūšies pasirinkimas ir tyrimo metodas.

1.6.3 Veislinių žuvų laikymas

Duomenų apie veislinių žuvų laikymą patenkinamomis sąlygomis galima rasti OECD TG 210^{^[1]} ir nuorodose (2) (3) (4) (5) (6).

1.6.4 Embrionų ir lervų priežiūra (apdorojimas)

Embrionai ir lervos gali būti veisiami mažesniuose į pagrindinį indą įstatomuose induose, jų šonines ar galines sieneles pakeičiant tinklu, kad tirpalas galėtų tekėti per indą. Galima padaryti taip, kad per mažus indus tekėtų neturbulentinis srautas, tik reikia pakabinti juos ant svirties, kuri indus keltų ir nuleistų, bet visą laiką organizmai turi būti panardinti; taip pat galima naudoti sifoninę tekėjimo sistemą. Apvaisinti lašišinių žuvų ikrai gali būti laikomi dėžėse ar tinkluose su pakankamai didelėmis akutėmis, kad išsiritusios lervos galėtų pro jas iškristi. Lervoms pernešti, atliekant pusiau statinius bandymus su visišku kasdieniu atnaujinimu, tinka Pastero pipetės (žr. 1.6.6).

Jei ikrų talpyklos, grotelės ar tinkleliai buvo naudojami ikrams pagrindiniame inde laikyti, šitos apribojimo priemonės turėtų būti pašalintos išsiritus lervoms¹, tačiau reikia palikti tinklelius, kurie neleistų ištrūkti žuvims. Jei lervas reikia pernešti, jų neturi veikti oras, o žuvims iš ikrų talpyklų pernešti neturi būti naudojami tinklai (tokia atsargumo priemonė gal ir nebūtina kai kurioms ne tokioms gležnoms rūšims, pvz., karpiui). Šio pernešimo laikas įvairioms rūšims skirtingas ir pernešti nėra visuomet būtina. Taikant pusiau statinį metodą galima naudoti chemines stiklines ar negilias talpyklas ir, jei būtina, turinčias tinklo ekraną, truputį pakeltą virš stiklinės dugno. Jei šių talpyklų tūris yra pakankamas, kad atitiktų įkrovos reikalavimus (žr. 1.7.1.2), embrionų ar lervų pernešti nebūtina.

1.6.5 Vanduo

Bandymams galima naudoti bet kokį vandenį, kuris atitinka priimtino skiedimo vandens chemines ypatybes, nurodytas 4 priede, ir kuriame bandymo rūšis rodo kontrolinį išgyvenamumą, bent tokį, koks aprašytas 2 ir 3 prieduose. Vandens kokybė turėtų būti vienoda visą bandymo laiką. pH reikšmė neturėtų kisti daugiau kaip ± 0,5 pH vieneto. Norint garantuoti, kad skiedimo vanduo neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pvz., nesudarytų kompleksinių junginių su bandomąja medžiaga) ar nedarytų neigiamo poveikio neršiančių žuvų elgesiui, vandens bandiniai kartkartėmis turi būti analizuojami. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ir Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca²⁺, Mg²⁺, Na⁺, K⁺, Cf ir SO), pesticidų (pvz., bendro

fosforo organinių ir chloro organinių pesticidų kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti daroma, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė pakankamai ilgai nekinta. Jei būtų parodyta, kad vandens kokybė nekinta bent metus, analizė gali būti daroma ne taip dažnai, o intervalai padidinti (pvz., kas šešis mėnesius).

1.6.6 Bandomieji tirpalai

Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą.

Pradinį tirpalą geriau ruošti bandomąją medžiagą tiesiog maišant ar plakant skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ar ultragarsu). Pakankamai koncentruotą pradinį tirpalą ruošiant galima naudoti prisotinimo kolonėles (tirpumo kolonėles). Kiek įmanoma, reikia vengti naudoti tirpiklius ar dispergatorius (soliubilizuojančias medžiagas); tačiau kartais, norint gauti tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą, tokias medžiagas gali tekti panaudoti. Tinkami tirpikliai yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilsulfoksidas, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Tinkami dispergatoriai yra Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metilceliuliozė ir HCO-40. Reikėtų atsargiai naudoti lengvai biologiškai irstančias medžiagas (pvz., acetoną) ir (ar) labai lakius junginius, nes, darant dinaminius bandymus, jie gali kelti problemų dėl bakterijų kaupimosi. Naudojama soliubilizavimo medžiaga neturi daryti reikšmingo poveikio išgyvenamumui ir neigiamo poveikio ankstyvosioms stadijoms, kaip kad nustatoma atliekant kontrolinį bandymą vien tik su tirpikliu. Tačiau reikia kiek įmanoma stengtis tokių medžiagų nenaudoti.

Pusiau statiniam metodui galima taikyti dvi atnaujinimo metodikas: 1) nauji bandomosios medžiagos tirpalai paruošiami švariuose induose ir gyvi likę ikrai bei lervos su mažu seno tirpalo kiekiu pernešami į naujus indus, vengiant sąlyčio su oru, ar 2) bandymų organizmai paliekami senuose induose, tačiau pakeičiama dalis (bent trys ketvirčiai) jų vandens. Terpės atnaujinimo dažnis dažniausiai priklauso nuo bandomosios medžiagos stabilumo, tačiau vandenį atnaujinti rekomenduojama kasdien. Jei pradiniai stabilumo bandymai (žr. 1.4) rodo, kad bandomosios medžiagos koncentracija tarp atnaujinimų yra nestabili (t. y. yra už 80 – 120 % vardinės koncentracijos ribų ar yra mažesnė kaip 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), reikėtų numatyti dinaminio bandymo taikymą. Bet kuriuo atveju reikėtų pasirūpinti, kad atnaujinant vandenį lervos nepatirtų įtampos.

Bandomosios koncentracijos tirpalams į bandymo kameras tiekti atliekant dinaminius bandymus reikalinga sistema, kuri nepertraukiamai dozuotų ir skiestų bandomosios medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozavimo siurblys, proporcingasis skiestuvas, prisotinimo sistema). Pradinių tirpalų ir skiedimo vandens srautai turi būti kartais, geriau kasdien, tikrinami ir visą bandymą turi nekisti daugiau kaip 10 %. Tinkamas pasirodė esąs srautas, atitinkantis bent penkis bandymo indo tūrius per 24 h (2).

1.7 BANDYMO EIGA

Vertingos informacijos, kaip atlikti žuvų embrionų ir mailiaus su trynio maišeliu toksiškumo bandymus, yra literatūroje, kurios keli pavyzdžiai įtraukti į šio teksto nuorodų dalį (7) (8) (9).

1.7.1 Veikimo sąlygos

1.7.1.1. Trukmė

Bandymą geriau pradėti per 30 min. nuo ikrų apvaisinimo. Embrionai į bandomąjį tirpalą dedami prieš prasidedant blastodisko segmentacijos stadijai ar tik jai prasidėjus, bet būtinai prieš gastrolės stadijos pradžią. Jei ikrus tiekia prekybininkas, pradėti bandymą iš karto po apvaisinimo gali būti neįmanoma. Kadangi bandymo pradžios vėlavimas gali labai paveikti bandymo jautrumą, bandymas turėtų būti pradėtas per aštuonias valandas po apvaisinimo. Dėl tos priežasties, kad lervos veikimo laikotarpiu nemaitinamos, bandymas turėtų būti baigtas prieš pat tą momentą, kai kurioje nors bandymo kameroje kurios nors lervos trynio maišelis bus visiškai absorbuotas ar kai iš bado pradės žūti kontrolinių bandymų gyvūnai. Trukmė priklauso nuo naudotos rūšies. Kai kurios rekomenduojamos trukmės yra nurodytos 2 ir 3 priedėliuose.

1.7.1.2. Įkrova

Bandymo pradžioje turimų apvaisintų ikrų skaičiaus turi pakakti vykdant statistikos reikalavimus. Ikrai turi būti paskirstyti atsitiktinai ir kiekvienai koncentracijai turi būti naudojama bent po 30 apvaisintų ikrų, vienodai (ar kuo panašiau, nes naudojant kai kurias rūšis gali būti sunku gauti vienodas įkrovas) paskirstytų bent į tris tos pačios koncentracijos bandymų indus. Įkrova (biomasė bandomojo tirpalo tūrio vienetui) turi būti pakankamai maža, kad be aeracijos ištirpusio deguonies koncentraciją būtų galima palaikyti ne mažiau kaip 60 % oro soties vertės. Dinaminiams bandymams yra rekomenduota (2) ne didesnė kaip 0,5 g/l per 24 h ir bet kuriuo momentu ne didesnė kaip 5 g/l tirpalo įkrova.

1.7.1.3. Šviesa ir temperatūra

Apšvietimo laikotarpis ir vandens temperatūra turi atitikti žuvų rūšį (2 ir 3 priedai). Nuolatinei temperatūros kontrolei pravartu būtų turėti papildomą bandymų indą.

1.7.2 Bandomosios medžiagos koncentracijos

Dažniausiai reikia naudoti penkias bandomosios medžiagos koncentracijas, kurios skiriasi vienodu santykiu, geriausiai ne didesniu kaip 3,2. Renkantis koncentracijų verčių diapazoną, turi būti išnagrinėta ūmaus toksiškumo tyrimų kreivė, siejanti LC₅₀ ir veikimo trukmę. Tam tikromis aplinkybėmis gali pasiteisinti mažiau kaip penkių koncentracijų verčių naudojimas, pvz., atliekant ribinės koncentracijos vertės nustatymo bandymus, ar siauresnio koncentracijos verčių diapazono. Naudojant mažiau kaip penkias koncentracijų vertes, reikia tai pagrįsti. Medžiagos koncentracijos verčių, didesnių kaip 96 h LC₅o ar 100 mg/l, priklauso nuo to, kuri mažesnė, bandyti nebūtina. Neturėtų būti atliekami bandymai su koncentracijos vertėmis, didesnėmis kaip medžiagos tirpumo ribinė koncentracija.

Jei pradinio tirpalo ruošimui naudojama soliubilizuojanti medžiaga, jos galutinė koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1 ml/l ir geriau, kad ji visuose bandymo induose būtų vienoda (žr. 1.6.6).

1.7.3 Kontroliniai bandymai

Be bandomosios serijos turi būti atliktas vienas skiedimo vandens kontrolinis bandymas (su lygiagrečiais bandymais, kai reikia) ir, jei tinka, vienas kontrolinis bandymas su soliubilizavimo medžiaga (su lygiagrečiais bandymais, kai reikia).

1.7.4 Kiekybinių analizių ir matavimų dažnis

Atliekant bandymą reguliariais tarpais, nustatomos bandomosios medžiagos koncentracijų vertės.

Jei manoma, kad atliekant pusiau statinius bandymus bandomosios medžiagos koncentracija lieka vardinės koncentracijos ± 20 % vertės (t. y. 80 -120 % diapazono; žr. 1.4 ir 1.6.6), rekomenduojama mažiausiai tris kartus lygiais bandymo laiko tarpais nustatyti bent didžiausią ir mažiausią bandomąją koncentraciją iš karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jo atnaujinimą (t. y. reikia analizuoti tą patį tirpalą, imant bandinius iš šviežio tirpalo ir prieš pat jo atnaujinimą).

Jei bandymai tokie, kuriuos atliekant nesitikima, kad koncentracija lieka lygi vardinei vertei ± 20 % (pagal medžiagos stabilumo duomenis), turi būti nustatomos visos naujai paruoštų tirpalų ir atnaujintinų tirpalų koncentracijos vertės, laikantis to paties analizės režimo (t. y. bent tris kartus lygiais bandymo laiko tarpais). Bandomosios medžiagos koncentraciją prieš atnaujinimą reikia nustatyti tik viename tos pačios koncentracijos inde. Tarp nustatymų turi būti ne ilgesnis kaip septynių parų tarpas. Rekomenduojama pateikiant rezultatus remtis išmatuotomis koncentracijos vertėmis. Tačiau jei yra įrodymų, leidžiančių parodyti, kad bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką buvo patenkinamai palaikoma kaip vardinė koncentracijos ± 20 % vertė ar išmatuotoji pradinė koncentracijos vertė, rezultatai gali būti pateikiami remiantis vardine ar išmatuotąja vertėmis.

Atliekant dinaminius bandymus, tinka bandinių ėmimo režimas, panašus į aprašytąjį ir taikomas atliekant pusiau statinius bandymus (bet „senų“ tirpalų koncentracijų matavimas šiuo atveju netaikomas). Tačiau jei šis bandymas trunka ilgiau kaip septynias paras, būtų pageidautina pirmą savaitę padidinti bandinių ėmimo dažnį (pvz., trys matavimų serijos), norint įsitikinti, kad bandomosios koncentracijų vertės nesikeičia.

Bandinius gali tekti filtruoti (pvz., per 0,45 μm akytumo filtrą) ar centrifuguoti. Nei centrifugavimu, nei filtravimu dažniausiai negalima atskirti biologiškai neprieinamos bandomosios medžiagos dalies nuo biologiškai prieinamos dalies, todėl bandinių apdorojimas šiais būdais gali būti netaikomas.

Atliekant bandymą, visuose bandymų induose turi būti matuojama ištirpusio deguonies koncentracija, pH ir temperatūra. Turi būti matuojamas kontrolinių bandinių ir vieno indo su didžiausios koncentracijos bandiniu bendras kietumas ir druskingumas (jei reikia). Ištirpusio deguonies koncentracija ir druskingumas (jei reikia) turi būti matuojami mažiausiai tris kartus (bandymo pradžioje, viduryje ir pabaigoje). Atliekant pusiau statinius bandymus ištirpusio deguonies koncentraciją rekomenduojama matuoti dažniau, geriau prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, ar bent kartą per savaitę. Atliekant pusiau statinius bandymus pH vertė turi būti matuojama prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, atliekant dinaminius bandymus -bent kartą per savaitę. Vandens kietumas kiekvieną bandymą matuojamas vieną kartą. Temperatūrą būtina matuoti kasdien, o bent viename inde būtų gerai ją stebėti visą laiką, nepertraukiamai.

1.7.5 Stebėjimai

1.7.5.1. Embrioninio vystymosi stadija

Embrioninė stadija (t. y. gastrolės stadija) veikimo bandomąja medžiaga pradžioje turi būti kiek įmanoma tiksliau patikrinta (verifikuota). Tai galima padaryti naudojant tinkamai išlaikytų ir nuvalytų ikrų pavyzdinį bandinį. Embrioninių stadijų aprašymo ir iliustravimo pavyzdžių galima rasti literatūroje (2) (5) (10) (11).

1.7.5.2. Išsiritimas ir išlikimas

Išsiritimo ir išlikimo stebėjimai turi būti daromi bent kasdien, o gauti skaičiai registruojami. Pageidautina bandymo pradžioje stebėti dažniau (pvz., pirmąsias tris valandas kas 30 minučių), nes kartais išlikimo laikas gali būti svarbesnis už vien tik žūčių skaičių (pvz., dėl ūmaus toksiškumo poveikio). Negyvi embrionai ir lervos turi būti pašalinti iš karto, kai tik bus pastebėti, nes jie greitai suyra. Šalinti reikėtų labai atsargiai, kad nebūtų užgauti ar fiziškai sužaloti šalia esantys ikrai arba lervos, kadangi jie yra labai gležni ir jautrūs. Žūties kriterijai kinta, atsižvelgiant į gyvenimo etapą:

- ikrams, ypač ankstyvosiomis stadijomis, pastebimas skaidrumo sumažėjimas ir spalvos pokytis dėl baltymo koaguliacijos ir (ar) nusėdimo, dėl to atsiranda baltas matinis atspalvis,

- embrionams pastebimas kūno judėjimo ir (ar) širdies plakimo nebuvimas, matinio atspalvio atsiradimas rūšims, kurių embrionai yra permatomi, esant normalioms sąlygoms,

- lervoms pastebimas nejudamumas ir (ar) kvėpavimo judėjimo, ir (ar) širdies plakimo nebuvimas, ir (ar) balta matinė centrinės nervų sistemos spalva, ir (ar) reakcijos į mechaninius dirgiklius nebuvimas.

1.7.5.3. Išvaizdos anomalijos

Kūno ir (ar) pigmentacijos anomalijų turinčių lervų skaičius ir trynio maišelio absorbcijos stadija turi būti registruojami atitinkamais laiko tarpais, atsižvelgiant į bandymo trukmę ir į aprašytos anomalijos prigimtį. Pastebėtina, kad nenormalūs embrionai ir lervos pasitaiko natūraliai ir kai kurių rūšių gali sudaryti net kelis kontrolinio (-ių) bandinio (-ių) procentus. Iš bandymo indų turi būti pašalinami išvaizdos anomalijų turintys ką tik žuvę gyvūnai.

1.7.5.4. Elgesio anomalijos

Anomalijos, pvz., hipervėdinimas, nekoordinuotas plaukimas ir netipiškas nejudrumas, turi būti registruojamos atitinkamais laiko tarpais, atsižvelgiant į bandymo trukmę. Šie pastebėti pokyčiai, nors juos sunku įvertinti kiekybiškai, gali padėti interpretuojant gaištamumo duomenis, t. y. suteikti informacijos apie medžiagos toksiško veikimo būdą.

1.7.5.5. Ilgis

Baigiant bandymą, rekomenduojama išmatuoti atskirų gyvūnų ilgį galima matuoti standartinį ilgį iki uodegos peleko išsišakojimo arba bendrą ilgį. Jei supuvo uodegos pelekas ar jis yra išėstas, turi būti imamas standartinis ilgis. Dažniausiai, jei bandymas vykdomas tiksliai, ilgio variacijos koeficientas lygiagretiems kontroliniams bandiniams turi būti < 20 %.

1.7.5.6. Masė

Baigiant bandymą, galima išmatuoti atskirų gyvūnų masę; geriau nustatyti sausų gyvūnų masę (po 24 h esant 60 °C temperatūrai), o ne gyvų (sausai nušluostytų filtro popieriumi). Dažniausiai, jei bandymas atliekamas tiksliai, masės variacijos koeficientas lygiagretiems kontroliniams bandiniams turi būti < 20 %.

Atliekant stebėjimus, dažniausiai gaunama dalis nurodytų duomenų ar visi duomenys, kuriems taikytina statistinė analizė:

- bendras gaištamumas,

- sveikų lervų skaičius baigiant bandymą,

- išsiritimo pradžia ir jo pabaiga (t. y. 90 % išsiritusių ikrų kiekviename vienodos koncentracijos inde),

- kiekvieną parą išsiritančių lervų skaičius,

- iki bandymo pabaigos išgyvenusių gyvūnų ilgis (ir masė),

- deformuotų ar anomalios išvaizdos lervų skaičius,

- anomalaus elgesio lervų skaičius.

2. DUOMENYS IR ATASKAITA

2.1. REZULTATŲ APDOROJIMAS

Rekomenduojama, kad tiek rengiant bandymo planą, tiek ir analizuojant bandymą dalyvautų statistikas, nes šis bandymų metodas leidžia labai keisti eksperimento planą, pvz., bandymo indų skaičių, bandomųjų koncentracijų skaičių, pradinį apvaisintų ikrų skaičių, matuojamų parametrų skaičių. Atsižvelgiant į bandymo plano variantų įvairovę, jokių specialių statistinės metodikos nurodymų čia nepateikiama.

Jei reikia įvertinti LOEC ir NOEC vertes, būtina analizuoti kiekvieno vienodos koncentracijos pakartojimų duomenų sklaidą, taikant dispersinę analizę (ANOVA) ar atsitiktinių veiksnių analizę. Norint atlikti atskiros koncentracijos ir kontrolinių bandinių gautų rezultatų bendrą palyginimą, gali būti naudingas Dunnetto metodas (12) (13). Yra ir kitų naudingų metodų pavyzdžių (14) (15). Taikant dispersinę analizę (ANOVA) ar kitas procedūras, nustatomo poveikio dydis (t. y. metodo galimybės) turi būti apskaičiuotas ir pateiktas ataskaitoje. Žinotina, kad ne visus 1.7.5.6 skirsnyje išvardytus stebėjimus galima statistiškai apdoroti, taikant dispersinę analizę. Pvz., bendras gaištamumas ir gyvų lervų skaičius baigiant bandymą galėtų būti analizuojami, taikant probito modelio metodus.

Jei reikia įvertinti LC ar EC“ vertes, tyrimo rezultatams taikant statistinį metodą, pvz., mažiausių kvadratų ar netiesinių mažiausių kvadratų metodą, turi būti pritaikyta tinkama (-os) kreivė (-ės), pvz., logistinė kreivė. Kreivė (-ės) turi būti sudalyta (-os) taip, kad nustatomos LC ar EC“ vertės ir jų standartinė paklaida galėtų būti įvertintos tiesiogiai. Tai tikrai lengviau apskaičiuoti pasikliovimo rėžius LC ar EC_X. Jei nėra svarbių priežasčių pirmenybę teikti kitiems pasikliovimo lygmenims, turi būti nurodomas dvipusis 95 % pasikliovimo intervalas. Pageidautina, kad pritaikymo metodika turėtų priemonių įvertinti atitikimo stokos reikšmę. Galima taikyti grafinius kreivių pritaikymo metodus. Regresinė analizė tinka visiems 1.7.5.6 skirsnyje išvardytiems stebėjimams.

2.2 REZULTATŲ INTERPRETAVIMAS

Rezultatai turi būti interpretuojami atsargiai, jei matuojamos bandomųjų tirpalų toksiškų medžiagų koncentracijos vertės yra arti analizės metodo aptikimo ribos. Taip pat labai atsargiai reikėtų interpretuoti gautus koncentracijos verčių rezultatus, didesnius už medžiagos tirpumo vandenyje vertes.

2.3 BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:

2.3.1. Bandomoji medžiaga:

- fizinė būsena ir atitinkamos fizinės bei cheminės savybės,

- cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynumą ir, jei reikia, analizės metodas, norint nustatyti bandomosios medžiagos kiekį.

2.3.2 Bandymų gyvūnai:

- mokslinis pavadinimas, veislė, motininių žuvų skaičius (t. y. kiek moteriškosios lyties žuvų buvo naudojama bandymui reikalingų ikrų skaičiui gauti), apvaisintų ikrų surinkimo šaltinis bei metodas ir vėlesnė priežiūra.

2.3.3 Bandymo sąlygos:

- taikytas bandymo metodas (pvz., pusiau statinis ar dinaminis, laikas nuo apvaisinimo iki bandymo pradžios, įkrova ir 1.1);

- apšvietimo laikotarpio (-ių) trukmė,

- bandymo planas (pvz., bandymų indų skaičius ir lygiagrečių bandymų skaičius, embrionų skaičius vienam lygiagrečiam bandiniui),

- pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų atnaujinimo dažnis (jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija),

- vardinės bandomosios koncentracijos, išmatuotos tirpalų koncentracijos vertės bandymų induose, jų vidutinės vertės, standartiniai nuokrypiai ir nustatymo metodas; jei bandomosios medžiagos tirpumas yra mažesnis už bandomosios koncentracijos, įrodymai, kad buvo matuojama bandomosios medžiagos koncentracija tirpale,

- vandens kokybė bandymų induose: pH, kietumas, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija.

2.3.4 Rezultatai:

- visų parengiamųjų bandomosios medžiagos stabilumo tyrimų rezultatai;

- įrodymai, kad kontroliniai bandiniai atitinka priimtą bendro bandymų rūšies išgyvenamumo standartą (2 ir 3 priedai);

- embriono ir lervos stadijos žuvų gaištamumo ir išgyvenamumo bei bendro gaištamumo ir išgyvenamumo duomenys;

- ikrų inkubacijos parų skaičius ir išsiritusių lervų skaičius;

- ilgio (ir masės) duomenys;

- morfologinių anomalijų, jei yra, dažnis ir aprašymas;

- poveikių elgesiui, jei yra, dažnis ir aprašymas;

- duomenų statistinė analizė ir apdorojimas;

- jei bandymų duomenims buvo taikoma dispersinė analizė, kiekvieno įvertinto atsako mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC), kai p = 0,05, ir nestebimo poveikio koncentracija (NOEC), įskaitant taikytų statistinių procedūrų aprašymą ir nuorodą, kokio dydžio poveikis gali būti aptiktas,

- jei bandymo duomenims buvo taikomas regresinės analizės metodas, LC ir EC_x jų pasikliovimo intervalai ir šioms vertėms apskaičiuoti naudoto pritaikyto modelio grafikas,

- visų nukrypimų nuo bandymo metodo paaiškinimai.

3. NUORODOS

1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 p. June 1990.

2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241 – 88. 26

P-

3) Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.

4) Brungs W. A. and Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.

5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, 121 – 173 p.

6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of Daily Spavming and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, 328 – 330 p.

7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chenristry, 6,61 — 71 p.

8) Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chenristry 4, 807 – 821 p.

9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986). Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. m. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, 129 – 145 p.

10) Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1 – 4. Carolina Biological Supply Company.

11) Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 p.

12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50,1096 – 1121 p.

13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20,482 – 491 p.

14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity TestData. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.

15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, 321 – 334 p.

16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological TestMethod Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, 81 p.

17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Niekei, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 21, 126 – 134 p.

18) Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 231 – 236 p.

19) Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F. and Roubaud P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Environmental Safety 32, 19 – 28 p.

20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.

21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.

22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth tęst: an intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, 1189-1203 p.

23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spavming, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.

24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ, Dordrecht, 280 p.

25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, 1 – 58 p.

1A LENTELĖ. Bandymui rekomenduojamos žuvų rūšys

Gėlavandenės
Oncorhynchus mykiss — Vaivorykštinis upėtakis (9) (16)
Danio rerio — Zebrinė danija (7)(17)(18)
Cyprinus carpio — Paprastasis karpis (8) (19)
Oryzias latipes — Japoninė medaka (20) (21)
Pimephales promelas – (8) (22)

1B LENTELĖ. Kitų, dokumentais patvirtintų, naudotų rūšių pavyzdžiai

Gėlavandenės

Sūriavandenės (jūrų)

Carassius amatus –

Sidabrinis karosas (8)

Menidia peninsula –

Tidewater silverside (23) (24) (25)

Lepomis macrochirus —

Melsvažiaunis saulešeris (8)

Clupea harengus —

Strimelė (24) (25)

Godus morhua –

Menkė (24) (25)

Cyprinodon variegatus

Margoji lėlžuvė (23) (24) (25)

1 priedas

TOKSIŠKUMO DANIJOS (BRACHYDANIO RERIO) EMBRIONAMS IR MAILIUI SU TRYNIO MAIŠELIU BANDYMO REKOMENDACIJOS

ĮVADAS

Danijos yra Indijos Koromandelio (Coromandel) pakrančių žuvis, gyvenanti srauniose upėse. Tai yra paplitusi karpinių šeimos akvariumų žuvis. Informacijos apie jos priežiūros ir auginimo būdus galima rasti tropinių žuvų auginimo standartų kataloguose. Žuvies biologija ir naudojimas žuvininkystės tyrimams buvo apžvelgti Laale'so veikale (1).

Žuvis retai yra ilgesnė kaip 45 mm. Kūnas cilindriškas su 7 — 9 tamsiai mėlynomis horizontaliomis juostomis sidabriniame fone. Šios juostos eina iki kaudalinio ir analinio pelekų. Nugara yra alyvuogių žalumo. Patinėliai yra liaunesni už pateles. Patelės yra labiau sidabriškos, o jų pilvai yra daugiau išspūtę, ypač prieš nerštą.

Suaugusios žuvys gali išverti didelius temperatūros, pH ir vandens kietumo svyravimus. Tačiau norint gauti sveikų žuvų, kurios nerštų geros kokybės ikrus, reikia sudaryti optimalias sąlygas.

Neršiant patinas persekioja patelę ir bado ją galva, ir kai tik ikrai yra išneršiami, jie iš karto apvaisinami. Ikrai, permatomi ir nelipnūs, krenta į dugną, kur juos gali suryti suaugusios žuvys. Nerštui įtakos turi ir apšvietimas. Jei rytą pakanka šviesos, žuvis dažniausiai neršia anksti, kai tik išaušta.

Patelė gali neršti po kelis šimtus ikrų kas savaitę.

MOTININIŲ ŽUVŲ BŪSENA, REPRODUKCIJA IR ANKSTYVOSIOS GYVENIMO STADIJOS

Parenkamas atitinkamas skaičius sveikų žuvų ir prieš numatytą neršto laiką bent dvi savaites laikomas tinkamame vandenyje (pvz., 4 priedas). Žuvų grupei turi būti leista bent kartą neršti prieš tai, kaip bus ruošiama bandymui skirtų ikrų partija. Žuvų tankis šiuo laikotarpiu turi būti ne didesnis kaip 1 gramas žuvų litrui vandens. Tankis gali būti didesnis, jei vanduo keičiamas reguliariai ar naudojamos valymo sistemos. Temperatūra talpyklose turi būti (25 ± 2)°C. Žuvys turėtų būti šeriamos įvairiu maistu, kurį gali sudaryti, pvz., atitinkamas parduodamas sausas maistas, gyvos ką tik išsiritusios artemijos, chironomidai, dafnijos, baltosios kirmėlės (Enchytraeids).

Toliau pateikti dviejų metodikų aprašai. Jas taikant galima gauti pakankamą skaičių sveikų apvaisintų ikrų:

i) Į 50 l skiedimo vandens pilną akvariumą, apsaugotą nuo tiesioginės šviesos, įleidžiamos aštuonios patelės ir 16 patinų, kurie

48 valandas kuo mažiau arba visiškai netrikdomi. Prieš bandymo pradžią vidurdienį akvariumo dugne padedamas padėklas. Padėklą sudaro

5-7 cm aukščio rėmas (iš organinio stiklo ar kitos tinkamos medžiagos), jo viršuje tvirtintas stambių 2-5 mm akučių tinklas, apačioje – smulkių 10 – 30 μm akučių tinklas. Prie stambaus tinklo rėmo pritvirtinami keli „medžiai“ nerštui, padaryti iš nesusuktos nailono virvutės. 12 valandų pabuvus tamsoje, įjungiama silpna šviesa, kad žuvys pradėtų neršti. Po neršto praėjus dviem ar keturioms valandoms, padėklas išimamas ir surenkami ikrai. Padėklas apsaugo ikrus nuo suaugusių žuvų (neleidžia suryti ikrų), be to, lengviau juos surinkti. Žuvų grupei turi būti leista bent kartą neršti prieš tai, kaip bus ruošiama bandymui skirtų ikrų partija.

ii) Nuo penkių iki dešimties patinų ir patelių bent dvi savaites prieš numatytą nerštą laikoma atskirai. Po 5 – 10 parų patelių pilvai bus išsipūtę ir matyti jų genitaliniai speneliai. Patinai spenelių neturi. Žuvys naršinamos tam skirtose talpyklose, turinčiose netikrą tinklinį dugną (kaip pirmiau). Talpykla pripilama skiedimo vandens taip, kad vandens virš tinklo būtų 5-10 cm. Parą prieš numatytą nerštą į rezervuarą įleidžiama viena patelė ir du patinai. Vandens temperatūra palaipsniui didinama kol pasiekiama vienu laipsniu didesnė už aklimatizacijos temperatūrą. Šviesa išjungiama ir stengiamasi netrikdyti talpykloje esančių žuvų. Rytą, nerštui pradėti, įjungiama silpna šviesa. Po 2 – 4 valandų žuvys išimamos ir surenkami ikrai. Jei ikrų reikia daugiau nei gali išneršti viena patelė, galima įrengti pakankamą skaičių talpyklų. Jei prieš bandymą buvo registruota kiekvienos patelės reprodukcijos geba (partijos dydis ir kokybė), nerštui galima atrinkti geriausios reprodukcijos pateles.

Ikrai turi būti pernešti į bandymo indus naudojant stiklinius vamzdelius (vidinis skersmuo ne mažesnis kaip 4 mm), turinčius lanksčias siurbimo kriaušes. Su ikrais pernešamo vandens turi būti kuo mažiau. Ikrai yra sunkesni kaip vanduo ir iškrenta iš vamzdelio. Reikia žiūrėti, kad ikrams (ir lervoms) nepatektų oro. Siekiant užtikrinti, kad pradinėse vystymosi stadijose nebūtų nukrypimų nuo normos, ikrų partijų ėminiai turi būti ištirti mikroskopu. Ikrų dezinfekuoti negalima.

Ikrų daugiausia žūva per pirmąsias 24 h po apvaisinimo. Šiuo laikotarpiu dažnai jų žūva nuo 5% iki 40 %. Ikrai išsigimsta dėl nesėkmingo apvaisinimo ar dėl nenormalaus vystymosi. Atrodo, kad ikrų partijos kokybė priklauso nuo patelių, nes kai kurios patelės visą laiką neršia geros kokybės ikrus, o kitoms tai niekuomet nepavyksta. Skiriasi ikrų partijų vystymosi greitis ir išsiritimo trukmė. Sėkmingai apvaisintų ikrų ir lervų su trynio maišeliu išliekamumas yra geras, dažniausiai didesnis kaip 90 %. Esant 25 °C temperatūrai, lervos išsirita per 3-5 paras po apvaisinimo, o trynio maišelis absorbuojamas maždaug per 13 parupo apvaisinimo.

Embrioninį vystymąsi gerai aprašė Hisaoka and Battle (2). Ikrai ir išsiritusios lervos yra permatomi, todėl galima sekti žuvies vystymąsi ir pastebėti išsigimimus. Praėjus maždaug keturioms valandoms po neršto, neapvaisintus ikrus galima atskirti nuo apvaisintų (3). Šiam tyrimui ikrai ir lervos dedami į mažo tūrio bandymo indus ir tiriami mikroskopu.

Ankstyvosioms gyvenimo stadijoms taikomos bandymo sąlygos yra išvardytos 2 priede. Optimalios praskiedimo vandens pH ir kietumo vertės yra lygios 7,8 ir 250 mg CaCO₃/l.

APSKAIČIAVIMAI IR STATISTIKA

Siūlomas dviejų stadijų metodas. Iš pradžių statistiškai analizuojami gaištamumo, nenormalaus vystymosi ir išsiritimo trukmės duomenys. Vėliau pagal tas koncentracijas, kurioms esant neigiamo poveikio šiems parametrams nebuvo aptikta, statistiškai įvertinamas kūno ilgis. Siūloma taikyti šį metodą, nes nuo toksiškos medžiagos gali selektyviai žūti kai kurios mažesnės žuvys, vėluoti išsiritimo laikas ir atsirasti akivaizdžių išsigimimų, taigi dėl to gali būti gauti netikslūs ilgio matavimai. Be to, kiekvienam veikimui reikės išmatuoti maždaug tokį pat žuvų skaičių, o taip bus garantuotas bandymo statistikos pagrįstumas (patikimumas).

LC₅₀ IR EC₅₀ NUSTATYMAS

Išgyvenusių ikrų ir lervų procentinė dalis, darant pataisą dėl gaištamumo kontroliniuose bandymuose, apskaičiuojama pagal Abbotto formulę (4):

čia:

P = pataisyta išgyvenamumo vertė %;

P' = stebėta išgyvenamumo vertė %, esant bandomajai koncentracijai;

C = stebėta išgyvenamumo vertė kontroliniuose bandymuose.

Jei įmanoma, bandymo pabaigoje tinkamu metodu nustatoma LC₅₀.

Jei vertinant EC₅₀ į statistiką norima įtraukti morfologines anomalijas, rekomendacijų galima rasti Stephan darbe (5).

LOEC IRNOEC ĮVERTINIMAS

Ikrų ir mailiaus su trynio maišeliu bandymo tikslas – nenulines koncentracijos vertes palyginti su kontroliniais bandymais, t. y. nustatyti LOEC. Taigi turi būti taikomos bendro palyginimo {multiple comparison) metodikos (6) (7) (8) (9) (10).

NUORODOS

1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 121-173 p.

2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311p.

3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabarbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 2, 173-181 p.

4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, 1 – 333 p.

5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, 69 – 81 p.

6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, 1096-1121 p.

7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20,482 – 491 p.

8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, 103 – 117 p.

9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. Biometrics 28, 519 – 531 p.

10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.

2 priedas

REKOMENDUOJAMŲ RŪŠIŲ BANDYMŲ SĄLYGOS, TRUKMĖ IR IŠGYVENAMUMO KRITERIJAI

Rūšis	Temperatūra, °C	Druskin-gumas, 0/00	Apšvietimo trukmė, valandos	Stadijų trukmė (paros)		Tipiška bandymo trukmė	Išgyvenamumas kontroliniuose bandymuose (ne mažesnis kaip, %)
Rūšis	Temperatūra, °C	Druskin-gumas, 0/00	Apšvietimo trukmė, valandos	embrionas	mailius su trynio maišeliu	Tipiška bandymo trukmė	išsiritimo sėkmė	po išsiritimo
GĖLAVANDENĖS Brachydanio rerio Zebrinė danija	25±1		12-16	3-5	8-10	Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 5 parų po išsiritimo (8-10 parų)	80	90
Oncorhynchus mykiss Vaivorykštinis upėtakis	1O±1¹ 12±1²		0³	30-35	25-30	Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 20 parų po išsiritimo (50-55 paros)	66	70
Cyprinus carpio Paprastasis karpis	21-25		12-16	5	>4	Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 parų po išsiritimo (8-9 paros)	80	75
Oryzias latipes Japoninė medaka	24±1¹ 23±1²		12-16	8-11	4-8	Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 5 parų po išsiritimo (13-16 parų)	80	80
Pimephales promelas	25±2		16	4-5	5	Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 parų po išsiritimo (8-9 paros)	60	70

¹ Embrionų.

² Lervų.

³ Embrionas ir lerva vieną savaitę po išsiritimo laikomi tamsoje, išskyrus kai jie yra tikrinami. Toliau visą bandymo laiką palaikomas silpnesnis apšvietimas.

3 priedas

KITŲ DOKUMENTAIS TINKAMAI PATVIRTINTŲ RŪŠIŲ BANDYMŲ SĄLYGOS, TRUKMĖ IR IŠGYVENAMUMO KRITERIJAI

Rūšis	Temperatūra *°'c*	Druskin-gumas, 0/00	Apšvietimo trukmė, valandos	Stadijų trukmė (paros)		Tipiška embriono ir mailiaus su trynio maišeliu bandymo trukmė	Išgyvenamumas kontroliniuose bandymuose (ne mažesnis kaip, %)
Rūšis	Temperatūra *°'c*	Druskin-gumas, 0/00	Apšvietimo trukmė, valandos	embrionas	mailius su trynio maišeliu		išsiritimo sėkmė	išsiritimo sėkmė
GĖLAVANDENĖS Carassius auratus Sidabrinis karosas	24±1	-	-	3^	>4	Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 parų po išsiritimo (7 paros)		80
Leopomis macrochirus Melsvažiaunis saulešeris	21±1		16	3	>4	Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 parų po išsiritimo (7 paros)		75
JUROS Menidia peninsulae Tidevvater silverside	22-25	15-22	12	1,5	10	Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 5 parų po išsiritimo (6-7 paros)	80	60
Clupea harengus Strimelė	10±1	8-15	12	20-25	3-5	Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 3 parų po išsiritimo (23- 27 paros)	60	80
Gadus morhua Menkė	5±1	5-30	12	14-16	3-5	Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 3 parų po išsiritimo (18 parų)	60	80
Cyprinodon variegatus Margoji lėlžuvė	25±1	15-30	12			Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 ar 7 parų po išsiritimo (28 paros)	>75	80

4 priedas

KAI KŪMOS SKIEDIMO VANDENS CHEMINĖS SAVYBĖS

Medžiaga	Koncentracija
Kietosios dalelės	< 20 mg/l
Bendra organinė anglis	< 2 mg/l
Nejonizuotas amoniakas	< 1 μg/l
Liekamasis chloras	< 10 μg/1
Bendras fosforo organinių pesticidų kiekis	< 50 ng/l
Bendras chloro organinių pesticidų ir polichlorintų difenilų kiekis	< 50 ng/l
Bendras organinis chloras	< 25 ng/l

NAMINĖS BITĖS. ŪMAUS ORALINIO TOKSIŠKUMO BANDYMAS (C.16.)

1 METODAS

Šis ūmaus toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 213 (1998) kopija.

1.1 ĮVADAS

Šis toksiškumo bandymas yra laboratorinis metodas, skirtas įvertinti augalų apsaugai skirtų produktų ir kitų cheminių medžiagų ūmų oralinį toksiškumą suaugusioms naminėms bitėms darbininkėms.

Vertinant ir nustatant cheminių medžiagų toksiškumo savybes, gali prireikti nustatyti jų ūmų oralinį toksiškumą naminėms bitėms, pvz., kai naminės bitės gali būti veikiamos chemine medžiaga. Ūmaus oralinio toksiškumo bandymas atliekamas, siekiant nustatyti pesticidų ir kitų cheminių medžiagų būdingą toksiškumą bitėms. Šio bandymo rezultatai turėtų būti taikomi vertinant pesticidų pavojų bitėms. Tokios programos turi būti pradedamos vykdyti nuo laboratorinių toksiškumo bandymų, o baigiamos atliekant bandymus pusiau lauko ir lauko sąlygomis (1). Pesticidai gali būti bandomi kaip aktyviosios medžiagos (a. m.) ir kaip preparatai.

Turi būti vartojamas toksiškumo etalonas, tikrinant bičių jautrumą ir bandymo metodo tikslumą.

1.2 APIBRĖŽIMAI

Ūmus oralinis toksiškumas. Žalingo poveikio pasekmės, kurios pasireiškia per 96 valandas (h), davus oralinę vienkartinę bandomosios medžiagos dozę.

Dozė. Suvartotos medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama kaip bandomosios medžiagos masė (μg) vienam bandymo gyvūnui (μg/bitei). Tikroji dozė kiekvienai bitei negali būti apskaičiuota, nes bitės maitinamos kartu, tačiau galima įvertinti vidutinę dozę (bendras suvartotas bandomosios medžiagos kiekis padalintas iš bandomųjų bičių skaičiaus viename narvelyje).

Oralinė LD50 (medianinė letali dozė). Tai yra statistiškai apskaičiuota vienkartinė medžiagos dozė, kurią duodant oraliniu būdu, gali žūti 50 % gyvūnų. LD₅₀ vertė yra išreiškiama (μg) bandomosios medžiagos kiekiu vienai bitei. Jei tai pesticidai, bandomoji medžiaga gali būti aktyvioji medžiaga (a. m.) arba apibrėžtos sudėties produktas, kuriame yra viena ar daugiau kaip viena aktyvioji medžiaga.

Mirštamumas. Bitė registruojama kaip mirusi, kai ji visiškai nejuda.

1.3 BANDYMO METODO ESMĖ

Suaugusios naminės bitės darbininkės (Apis meili/era) yra paveikiamos sacharozės tirpale ištirpyta bandomąja medžiaga, skiriant tam tikrą kiekį dozių. Toliau bitės maitinamos tuo pačiu maistu, bet be bandomosios medžiagos. Mirštamumas registruojamas kasdien, bent 48 h, jis lyginamas su mirštamumo kontroliniuose bandymuose vertėmis. Jei mirštamumas didėja per 24h – 48 h, o mirštamumas kontroliniuose bandymuose lieka priimtinas, t. y. < 10 %, bandymą reikia tęsti iki 96 h. Rezultatai analizuojami, kad būtų galima apskaičiuoti LD₅₀ po 24 h ir 48 h, o į ei bandymas tęsiamas, tai ir po 72 h bei 96 h.

1.4 BANDYMO PAGRĮSTUMAS

Bandymas yra pagrįstas, jei galioja šios sąlygos:

- baigiant bandymą vidutinis mirštamumas visuose kontroliniuose bandiniuose turi būti ne didesnis kaip 10 %,

- toksiškumo etalono LD₅₀ atitinka apibrėžtą diapazoną.

1.5 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.5.1 Bičių rinkimas

Turi būti pasirinktos jaunos, suaugusios ir tos pačios kilmės bitės darbininkės, t. y. to paties amžiaus, vienodai maitinamos ir t. t. Bitės turi būti gaunamos iš tinkamai maitinamų, sveikų, kuo sveikesnės ir geresnės motinėlės šeimų, kurių istorija ir fiziologinė būklė yra žinoma. Jos gali būti renkamos tą rytą, kai numatoma tirti, arba vakare prieš bandymą, ir laikomos bandymo sąlygomis iki kitos dienos. Tinka bitės, surinktos nuo rėmelių, kuriuose nėra perų. Reikia vengti rinkti bites ankstyvą pavasarį ar vėlyvą rudenį, nes tuomet keičiasi bičių fiziologija. Jei bandymai turi būti atliekami anksti pavasarį ar vėlai rudenį, bitės gali būti užaugintos inkubatoriuje ir vieną savaitę maitinamos bičių duonele (iš korių surinkta žiedadulkių masė) ir sacharozės tirpalu. Bitės, apdorotos cheminėmis medžiagomis, pvz., antibiotikais, preparatais nuo varoatozės (ektoparazitinė bičių liga) ir 1.1, toksiškumo bandymams neturi būti imamos, jei po paskutinio apdorojimo dar nėra praėjusios keturios savaitės.

1.5.2 Laikymo ir maitinimo sąlygos

Naudojami lengvai plaunami ir gerai vėdinami narveliai. Galima naudoti bet kurios tinkamos medžiagos, pvz., nerūdijančio plieno, vielos tinklelio, plastiko, vienkartinius medinius narvelius ir t.t. Siūloma pasirinkti 10-ies bičių grupes viename narvelyje. Narvelių dydis turi atitikti bičių skaičių, t. y. joms turi būti pakankamai erdvės.

Bitės bandymų patalpoje turi būti laikomos tamsoje, esant 25 ± 2 °C temperatūrai. Santykinė drėgmė, dažniausiai apie 50 – 70 %, turi būti registruojama visą bandymą. Bičių tvarkymo procedūras, įskaitant apdorojimą ir stebėjimus, galima atlikti esant (dienos) šviesai. Maistas yra sacharozės vandeninis tirpalas, kurio galutinė koncentracija yra 500 g/l (50 % w/v). Paveikus bandomąja medžiaga, bitės toliau maitinamos pasirinktiną laiką. Maitinimo sistema turi leisti registruoti maisto suvartojimą kiekviename narvelyje. Galima naudoti stiklinį vamzdelį (maždaug 50 mm ilgio ir 10 mm vidinio skersmens, kurio atvirasis galas susiaurintas maždaug iki 2 mm skersmens).

1.5.3 Bičių ruošimas

Surinktos bitės atsitiktiniu būdu paskirstomos į bandymo narvelius, kurie atsitiktiniu būdu išdėstomi bandymų patalpoje.

Prieš bandymo pradžią bites galima laikyti nemaitintas ne daugiau kaip 2 h. Rekomenduojama, prieš veikiant bandomąja medžiaga, bičių nemaitinti, kad bandymo pradžioje visų bičių virškinimo trakto turinys būtų vienodas. Prieš pradedant bandymą mirštančios bitės turi būti pašalintos ir pakeistos sveikomis.

1.5.4 Dozių ruošimas

Jei bandomoji medžiaga yra su vandeniu susimaišantis junginys, jį galima tiesiogiai disperguoti 50 % sacharozės tirpale. Vandenyje blogai tirpius techninės paskirties produktus ir medžiagas galima naudoti kartu su bitėms mažai toksiškais tirpikliais, pvz., organiniu tirpikliu, emulsikliu ar dispergatoriumi (pvz., acetonu, dimetilformamidu, dimetilsulfoksidu). Tirpiklio koncentracija priklauso nuo bandomosios medžiagos tirpumo ir turi būti vienoda visoms bandomoms koncentracijoms. Dažniausiai paskiriama 1 % nešiklio koncentracija neturi būti viršijama.

Turi būti paruošti atitinkami kontroliniai tirpalai, t. y., jei bandomajai medžiagai soliubilizuoti naudojamas tirpiklis ar dispergatorius, turi būti naudojamos dvi atskiros kontrolinių bandymų grupės: sacharozės tirpalas vandenyje ir sacharozės tirpalas su tirpikliu ar nešikliu tokios pat koncentracijos, kokia naudojama bandomajame tirpale.

1.6 BANDYMO EIGA

1.6.1 Bandymų ir kontrolinės grupės

Dozių ir lygiagrečių bandymų skaičius turi atitikti statistinius LD₅₀ nustatymo reikalavimus, esant 95 % pasikliovimo ribai. Dažniausiai bandymui atlikti reikia penkių dozių, išdėstytų geometrine progresija, kurių daugiklis būtų ne didesnis kaip 2,2 ir galima būtų nustatyti LD₅₀. Skiedimo veiksnys ir dozavimui naudojamų koncentracijų skaičius turi būti nustatyti pagal toksiškumo kreivės (mirštamumas, kaip dozės funkcija) krypties koeficientą ir atsižvelgiant į pasirinktą statistinį metodą, skirtą analizuoti rezultatus. Dozavimui tinkamas koncentracijas galima pasirinkti pagal diapazono nustatymo bandymo rezultatus.

Kiekvienos koncentracijos doze turi būti paveiktos ne mažiau kaip trys bandymų grupės po 10 bičių. Turi būti ne mažiau kaip trys kontrolinės bandymų grupės po 10 bičių, neskaičiuojant bandomosios serijos. Kontrolinės grupės taip pat turi būti įtrauktos ir naudojamiems tirpikliams ar nešikliams (žr. 1.5.4).

1.6.2 Toksiškumo etalonas

Į bandymų seriją turi būti įtrauktas toksiškumo etalonas. Kiekvienai bandomajai dozei turėtų būti bent trys narveliai su 10 bičių kiekviename narvelyje. Toksiškumo etalonu geriau naudoti dimetoksatą (dimethoate), kuriam oralinės 24 h LD₅₀ vertės diapazonas yra 0,10 – 0,35 μg aktyviosios medžiagos vienai bitei (2). Tačiau būtų priimtini ir kiti toksiškumo etalonai, jei būtų pateikta pakankamai duomenų tikrinant laukiamą atsaką į dozės poveikį (pvz., tiofosas).

1.6.3 Poveikis

1.6.3.1. Dozių davimas

Kiekvienai bičių bandymo grupei turi būti duodama 100 – 200 ui 50 % sacharozės vandeninio tirpalo, kuriame būtų reikiamos koncentracijos bandomoji medžiaga. Blogai tirpiems, mažo toksiškumo produktams ar mažos koncentracijos preparatams reikalingas didesnis tūris, nes turi būti sunaudota didesnė sacharozės tirpalo dalis. Turi būti kontroliuojamas grupės suvartotas bandomojo maisto kiekis. Maistą suvartojus (dažniausiai per 3-4 h), maitinimo įtaisas (penėtuvė) turi būti pašalintas iš narvelio ir pakeistas maitinimo įtaisu vien tik su sacharozės tirpalu. Toliau sacharozės tirpalai duodami pasirinktinam vartojimui. Esant kai kurių junginių didesnei koncentracijai, bandomosios dozės gali būti atmetamos, nes maisto suvartota mažai arba bitės gali jo visiškai nevartoti. Ne vėliau kaip po 6 h nesuvartotas bandomasis maistas turi būti pakeistas vien tik sacharozės tirpalu. Turi būti įvertintas nesuvartoto bandomojo maisto kiekis (pvz., matuojant nesuvartoto maisto tūrį arba masę).

1.6.3.2. Trukmė

Pirmenybė teikiama 48 h bandymo trukmei, po kurios bandomasis tirpalas pakeičiamas vien tik sacharozės tirpalu. Jei mirštamumas po pirmųjų 24 h didėja daugiau kaip 10 %, bandymo trukmė turi būti ilgesnė, bet ne daugiau kaip 96 h, jei mirštamumas kontroliniuose bandymuose yra ne didesnis kaip 10 %.

1.6.4 Stebėjimai

Mirštamumas registruojamas praėjus 4 h nuo bandymo pradžios, o vėliau 24 h ir 48 h (t. y. po dozės davimo). Jei reikalingas ilgas stebėjimo laikotarpis, tolesni vertinimai turi būti daromi kas 24 h, bet ne ilgiau kaip 96 h, jei mirštamumas kontroliniuose bandymuose yra ne didesnis kaip 10 %.

Turi būti įvertintas grupės suvartoto maisto kiekis. Apdoroto (bandomojo) ir neapdoroto maisto suvartojimo greičio per 6 h lyginimas gali suteikti informacijos apie apdoroto maisto priimtinumą.

Turi būti registruojami visi bandymą atliekant pastebėti neįprasto elgesio reiškiniai.

1.6.5 Ribinis bandymas

Kartais (pvz., kai manoma, kad bandomosios medžiagos toksiškumas turėtų būti mažas) galima atlikti ribinį bandymą, naudojant 100 μg aktyviosios medžiagos vienai bitei, taip norint parodyti, kad LD₅₀ yra didesnė už šią vertę. Turi būti naudojama ta pati procedūra, įskaitant tris lygiagrečias bandymų grupes bandomajai dozei, atitinkamus kontrolinius bandymus ir toksiškumo etaloną. Jei pasitaiko mirštamumo atvejų, turi būti atliekamas visas tyrimas. Jei pastebimi subletalūs poveikiai (žr. 1.6.4), jie turi būti užregistruoti.

2 DUOMENYS IR ATASKAITA

2.1 DUOMENYS

Kiekvienos dozės grupės, kontrolinių bandinių ir toksiškumo etalono grupių duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, nurodant bičių skaičių, mirštamumą kiekvieną stebėjimo momentą ir bičių, kurios neįprastai elgiasi, skaičių. Mirštamumo duomenys analizuojami atitinkamais analizės metodais (pvz., probito funkcijos analizė, slenkamasis vidurkis, binominio skirstinio tikimybė) (3) (4). Nubraižomos kiekvieno rekomenduoto stebėjimo momento (t. y. 24 h, 48 h ir, jei reikia, 72 h, 96 h) dozės funkcijos kreivės ir apskaičiuojami kreivių krypties koeficientai bei medianinės letaliosios dozės (LD₅₀) su 95 % pasikliovimo riba. Galima padaryti pataisas dėl mirštamumo kontroliniuose bandymuose, naudojant Abbotto pataisą (4) (5). Jei apdorotas maistas suvartojamas ne visiškai, turi būti nustatyta grupės suvartota bandomosios medžiagos dozė. LD₅₀ turi būti išreikšta bandomosios medžiagos μg vienai bitei.

2.2 BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje turi būti ši informacija:

2.2.1 Bandomoji medžiaga:

- fizinė būklė ir atitinkamos fizinės ir cheminės savybės (pvz., stabilumas vandenyje, garų slėgis),

- cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant struktūrinę formulę, grynumą (t. y., pesticidams – identiškumas ir aktyviosios (-ųjų) medžiagos (-ų) koncentracija).

2.2.2 Bandymų gyvūnai:

- mokslinis pavadinimas, rasė, apytikris amžius (savaitės), rinkimo būdas, rinkimo data,

- informacija apie bičių rinkimui naudotas šeimas, įskaitant sveikatą, visas suaugusių bičių ligas, prieš tai taikytą apdorojimą ir 1.1.

2.2.3 Bandymo sąlygos:

- bandymo patalpos temperatūra ir santykinė drėgmė,

- laikymo sąlygos, įskaitant narvelių tipą, dydį ir medžiagą,

- pradinių ir bandomųjų tirpalų ruošimo būdai (turi būti nurodytas tirpiklis, jei naudojamas, ir jo koncentracija),

- pradinių tirpalų ruošimo būdas ir atnaujinimo dažnumas (turi būti nurodyta soliubilizavimo medžiaga, jei naudojama, ir jos koncentracija),

- bandymo atlikimas, pvz., naudotos bandomosios koncentracijos ir jų skaičius, kontrolinių bandymų skaičius; kiekvienai bandomajai koncentracijai ir kontroliniam bandymui naudotų narvelių skaičius ir bičių skaičius viename narvelyje,

- bandymo data.

2.2.4 Rezultatai:

- parengiamojo tyrimo diapazono nustatymo, jei atliktas, rezultatai,

- neapdoroti duomenys: mirštamumas po kiekvienos bandytos dozės ir kiekvienu stebėjimo momentu,

- dozės ir atsako kreivės, baigiant bandymą,

- bandomosios medžiagos ir toksiškumo etalono LD₅₀ vertės su 95 % pasikliovimo riba, nustatytos kiekvieną rekomenduotą stebėjimo laiką,

- LD₅₀ nustatymui taikyti statistiniai metodai,

- mirštamumas kontroliniuose bandymuose,

- kiti stebėti ar išmatuoti biologiniai poveikiai, pvz., neįprastas bičių elgesys (įskaitant bandomosios dozės atmetimą), maisto vartojimo greitis apdorotų ir neapdorotų bičių grupėse,

- visi nukrypimai nuo čia aprašytų bandymo metodikų ir visa kita reikalinga informacija.

3. NUORODOS

1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products — Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, 151 – 165 p. March 1993.

2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L) 1981 – 1992. Journal of Apicultural Research, 22, 119 – 125 p.

3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simpliSed method of evaluating dose – effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96,99 – 113 p.

4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol, 18, 265-267 p.

NAMINĖS BITĖS. ŪMAUS TOKSIŠKUMO BANDYMAS SĄLYČIO BŪDU (C.17.)

1. METODAS

Šis ūmaus toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 214 (1998) kopija.

1.1 ĮVADAS

Šis toksiškumo bandymas yra laboratorinis metodas, skirtas įvertinti augalų apsaugai skirtų produktų ir kitų cheminių medžiagų ūmų toksiškumą, dėl sąlyčio, suaugusioms naminėms bitėms darbininkėms.

Vertinant ir nustatant cheminių medžiagų toksiškumo savybes, gali prireikti nustatyti ūmų toksiškumą naminėms bitėms sąlyčio būdu, pvz., kai naminės bitės gali būti veikiamos chemine medžiaga. Ūmaus toksiškumo bandymas sąlyčio būdu atliekamas, siekiant nustatyti pesticidų ir kitų cheminių medžiagų būdingą toksiškumą bitėms. Šio bandymo rezultatai turėtų būti naudojami pesticidų pavojaus bitėms vertinimo programose, vykdomose kaip laboratoriniai toksiškumo bandymai ir net kaip bandymai pusiau lauko ir lauko sąlygomis (1). Pesticidai gali būti bandomi kaip aktyviosios medžiagos (a. m.) ar kaip preparatai.

Turi būti vartojamas toksiškumo etalonas bičių jautrumui ir bandymo metodo tikslumui tikrinti.

1.2 APIBRĖŽIMAI

Ūmus toksiškumas sąlyčio būdu. Žalingos pasekmės, kurios pasireiškia ne vėliau kaip per 96 h po vienkartinės bandomosios medžiagos dozės vietinio užtepimo.

Dozė. Užteptos medžiagos kiekis. Dozė yra išreiškiama kaip bandomosios medžiagos masė μg vienam bandymų gyvūnui (μg/bitei).

Sąlyčio LD₅₀ (medianinė letali dozė). Yra statistiškai apskaičiuota vienkartinė medžiagos dozė, kurią naudojant gali žūti 50 % gyvūnų. LD₅₀ vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos μg vienai bitei. Jei tai pesticidai, bandomoji medžiaga gali būti aktyvioji medžiaga (a. m.) ar apibrėžtos sudėties produktas, kuriame yra viena ar daugiau kaip viena aktyvioji medžiaga.

Mirštamumas. Bitė registruojama kaip mirusi, kai ji visiškai nejuda.

1.3 BANDYMO METODO ESMĖ

Suaugusios naminės bitės darbininkės (Apis mellifera) tam tikrais laiko tarpais yra veikiamos tinkamame nešiklyje ištirpinta bandomąja medžiaga, ją tiesiogiai užlašinant ant torakso (lašeliais). Bandymo trukmė yra 48 h. Jei mirštamumas per 24 h – 48 h didėja, o mirštamumas kontroliniuose bandymuose lieka priimtino lygio, t. y. ≤10 %, bandymą reikia tęsti 96 h. Mirštamumas registruojamas kasdien ir lyginamas su mirštamumo kontroliniuose bandymuose vertėmis. Rezultatai yra analizuojami, kad būtų galima apskaičiuoti LD₅₀ po 24 h ir 48 h, o jei bandymas yra tęsiamas, po 72 h ir 96 h.

1.4 BANDYMO PAGRĮSTUMAS (PATIKIMUMAS)

Bandymas yra pagrįstas (patikimas), jei galioja šios sąlygos:

- baigiant bandymą vidutinis mirštamumas visuose kontroliniuose bandiniuose turi būti ne didesnis kaip 10 %,

- toksiškumo etalono LD₅₀ atitinka apibrėžtą diapazoną.

1.5 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.5.1 Bičių rinkimas

Turi būti tiriamos jaunos suaugusios bitės darbininkės, t. y. to paties amžiaus, vienodai maitinamos, tos pačios rasės ir t. t. Bitės turi būti gaunamos iš tinkamai maitinamų, sveikų ir vienos motinėlės šeimų, kurių istorija ir fiziologinė būklė yra žinoma. Jos gali būti renkamos tą rytą, kai numatomos tirti, ar vakare prieš bandymą ir laikomos esant bandymo sąlygoms iki kitos dienos. Tinka bitės, surinktos nuo rėmelių, kuriuose nėra perų. Reikia vengti rinkti bites ankstyvą pavasarį ar vėlyvą rudenį, nes tuomet keičiasi bičių fiziologija. Jei bandymai turi būti atliekami anksti pavasarį ar vėlai rudenį, bitės gali būti užaugintos inkubatoriuje ir vieną savaitę maitinamos bičių duonele (iš korių surinkta žiedadulkių mase) ir sacharozės tirpalu. Bitės, apdorotos cheminėmis medžiagomis, pvz., antibiotikais, preparatais varoatozės ir t. t, toksiškumo bandymams neturi būti naudojamos, jei po apdorojimo paskutinį kartą dar nėra praėjusios keturios savaitės.

1.5.2 Laikymo ir maitinimo sąlygos

Naudojami lengvai plaunami ir gerai vėdinami narveliai. Galima naudoti bet kurios tinkamos medžiagos, pvz., nerūdijančio plieno, vielos tinklelio, plastiko, vienkartinius medinius narvelius ir t.t. Narvelių dydis turi atitikti bičių skaičių, t. y. joms turi būti pakankamai erdvės. Siūloma naudoti dešimties bičių grupes viename narvelyje.

Bitės bandymų patalpoje turi būti laikomos tamsoje, esant 25 ± 2 °C temperatūrai. Santykinė drėgmė, dažniausiai apie 50 – 70 %, turi būti registruojama per visą bandymą. Bičių tvarkymo procedūras, įskaitant apdorojimą ir stebėjimus, galima atlikti (dienos) šviesoje. Maistas, sacharozės vandeninis tirpalas, kurio galutinė koncentracija yra 500 g/l (50 % w/v), duodamas ed libidum (pasirinktu laiku) per visą bandymą, naudojant bičių maitinimo įtaisą. Tai gali būti stiklinis vamzdelis (maždaug 50 mm ilgio ir 10 mm vidinio skersmens, kurio atvirasis galas susiaurintas maždaug iki 2 mm skersmens).

1.5.3 Bičių ruošimas

Surinktos bitės gali būti anestezuotos anglies dioksidu ar azotu, kad būtų galima užtepti bandomąją medžiagą. Anestezuojančios medžiagos kiekis ir veikimo trukmė turi būti kiek įmanoma mažesni. Prieš pradedant bandymą, mirštančios bitės turi būti pašalintos ir pakeistos sveikomis.

1.5.4 Dozių ruošimas

Bandomoji medžiaga, o tai yra tirpalas su nešikliu, t.y. ji ištirpinama organiniame tirpiklyje ar vandenyje, turinčiame drėkiklio, užtepama ant bitės. Kaip organinį tirpiklį geriau būtų naudoti acetoną, tačiau galima naudoti ir kitus bitėms mažai toksiškus tirpiklius (pvz., dimetilformamidą, dimetilsulfoksidą). Jei tai vandenyje disperguoti cheminiai preparatai ir organiniuose tirpikliuose netirpios labai polinės organinės medžiagos, lengviau juos užtepti, paruošus nedidelės koncentracijos kurio nors prekybinio drėkiklio (pvz., Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tweeri) tirpalą.

Turi būti paruošti atitinkami kontroliniai tirpalai, t. y., jei bandomajai medžiagai soliubilizuoti naudojamas tirpiklis ar dispergatorius, turi būti naudojamos dvi atskiros kontrolinių bandymų grupės: vienos grupės bitės apdorojamos vandeniu, kitos grupės bitės tirpikliu ir nešikliu.

1.6 BANDYMO EIGA

1.6.1 Bandymų ir kontrolinės grupės

Dozių ir lygiagrečių bandymų skaičius turi atitikti statistinius LD₅₀ nustatymo reikalavimus, esant 95 % pasikliovimo ribai. Dažniausiai bandymui reikia penkių LD₅₀ diapazono dozių, išdėstytų geometrine progresija, tarp kurių daugiklis būtų ne didesnis kaip 2,2. Skiedimo veiksnys ir dozavimui naudojamų koncentracijų skaičius turi būti nustatyti pagal toksiškumo kreivės (mirštamumas kaip dozės funkcija) krypties koeficientą ir atsižvelgiant į rezultatams analizuoti parinktą statistinį metodą. Dozavimui tinkamas koncentracijas galima pasirinkti pagal diapazono nustatymo rezultatus.

Kiekvieną bandymo koncentraciją reikia tepti ne mažiau kaip trims bandymų grupėms po 10 bičių.

Be bandomosios serijos, turi būti bandomos trys kontrolinės grupės po 10 bičių. Jei naudojamas organinis tirpiklis ar drėkiklis, tirpikliui ar drėkikliui turi būti naudojamos papildomos trys kontrolinės grupės, kurių kiekvienoje būtų po 10 bičių.

1.6.2 Toksiškumo etalonas

Į bandymų seriją turi būti įtrauktas toksiškumo etalonas. Laukiamai LD50 dozei turi būti pasirenkamos bent trys dozės. Kiekvienai bandomajai dozei turi būti bent trys narveliai su 10 bičių kiekviename narvelyje. Kaip toksiškumo etalonui pirmenybė teikiama dimetoksatui (dimethoate), kuriam sąlyčio 24 h LD₅₀vertės diapazonas yra (0,10 – 0,30) μg aktyviosios medžiagos vienai bitei (2). Tačiau būtų priimtini ir kiti toksiškumo etalonai, jei būtų pateikta pakankamai duomenų laukiamam dozės poveikio atsakui patikrinti (pvz., tiofosas).

1.6.3 Veikimas

1.6.3.1. Dozių davimas

Anestezuotos (apmarintos) bitės apdorojamos kiekviena atskirai, darant vietinį užtepimą (užlašinimą). Bitės skirtingoms bandomosioms dozėms ir kontroliniams bandiniams paskirstomos atsitiktinai. Ant kiekvienos bitės torakso dorsalinės pusės mikropipete užtepamas 1 μl tinkamos koncentracijos bandomosios medžiagos tirpalo. Galima naudoti kitokius tūrius, jei tai yra pagrįsta. Užlašinus bitės paskirstomos į narvelius ir joms duodama sacharozės tirpalo.

1.6.3.2. Trukmė

Pirmenybė teikiama 48 h bandymo trukmei, jei mirštamumas 24 h — 48 h laikotarpiu didėja daugiau kaip 10 %. Bandymo trukmė turi būti ilginama ne daugiau kaip iki 96 h, jei mirštamumas kontroliniuose bandymuose yra ne didesnis kaip10 %.

1.6.4 Stebėjimai

Mirštamumas registruojamas po 4 h nuo dozės davimo, o vėliau 24 h ir 48 h. Jei reikalingas ilgesnis stebėjimo laikotarpis, tolesni vertinimai turi būti daromi kas 24 h ne ilgiau kaip iki 96 h, jei mirtingumas kontroliniuose bandiniuose yra ne didesnis kaip 10 %. Turėtų būti registruojami visi bandymo metu pastebėti neįprasto elgesio reiškiniai.

1.6.5 Ribinis bandymas

Kartais (pvz., kai manoma, kad bandomosios medžiagos toksiškumas turėtų būti mažas) galima atlikti ribinį bandymą, naudojant 100 μg aktyviosios medžiagos vienai bitei, taip norint parodyti, kad LD₅₀ yra didesnė už šią vertę. Turėtų būti naudojama ta pati procedūra, įskaitant tris lygiagrečias bandymų grupes bandomajai dozei, atitinkamus kontrolinius bandymus ir toksiškumo etalono naudojimą. Jei pasitaiko mirštamumo atvejų, turi būti atliekamas visas tyrimas. Jei pastebimi subletalūs poveikiai (žr. 1.6.4 skirsnį), jie turi būti užregistruoti.

2 DUOMENYS IR ATASKAITA

2.1 DUOMENYS

Kiekvienos dozės grupės duomenys turi būti apibendrinti ir pateikti lentelėse, kontrolinių bandymų ir toksiškumo etalono grupėms nurodant tirtų bičių skaičių, mirštamumą kiekvieną stebėjimo momentą ir neįprastai besielgiančių bičių skaičių. Mirštamumo duomenys analizuojami atitinkamais analizės metodais (pvz., probito funkcijos analizė, slenkamasis vidurkis, binominio skirstinio tikimybė) (3) (4). Nubraižomos kiekvieno rekomenduoto stebėjimo momento (t. y. 24 h, 48 h ir, jei reikia, 72 h, 96 h) atsako, kaip dozės funkcijos, kreivės ir apskaičiuojami kreivių krypties koeficientai bei medianinės letalios dozės (LD₅₀) su 95 % pasikliovimo ribomis. Galima padaryti kontrolinių bandymų pataisas dėl mirštamumo, naudojant Abbotto pataisą (4) (5). LD₅₀ turi būti išreikšta μg bandomosios medžiagos vienai bitei.

2.2 BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje turi būti ši informacija:

2.2.1 Bandomoji medžiaga:

- fizinė būsena ir atitinkamos fizinės ir cheminės savybės (pvz., stabilumas vandenyje, garų slėgis),

- cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant struktūrinę formulę, grynumą (t. y., pesticidams – identiškumas ir aktyviosios (-ųjų) medžiagos (-ų) koncentracija).

2.2.2 Bandymų gyvūnai:

- mokslinis pavadinimas, rasė, apytikris amžius (savaitėmis), rinkimo būdas, rinkimo data,

- informacija apie bandymų bičių rinkimui naudotas kolonijas, įskaitant sveikatą, visas suaugusių bičių ligas, prieš tai taikytą apdorojimą ir 1.1.

2.2.3 Bandymo sąlygos:

- bandymo patalpos temperatūra ir santykinė drėgmė, – laikymo sąlygos, įskaitant narvelių tipą, dydį ir medžiagą,

- bandomosios medžiagos davimo būdai, pvz., naudojamas tirpiklis, užtepamo bandomojo tirpalo tūris, naudotos anestezuojančios medžiagos,

- bandymo atlikimas, pvz., naudotos bandomosios dozės ir jų skaičius, kontrolinių bandinių skaičius; kiekvienai bandomajai koncentracijai ir kontroliniam bandiniui naudotų narvelių skaičius ir bičių skaičius viename narvelyje,

- bandymo data.

2.2.4 Rezultatai:

- parengiamojo tyrimo diapazono nustatymo, jei atliktas, rezultatai,

- neapdoroti duomenys: mirštamumas po kiekvienos bandytos dozės ir kiekvieną stebėjimo momentą,

- dozės ir atsako kreivės bandymo pabaigoje,

- bandomosios medžiagos ir toksiškumo etalono LD₅₀ vertės su 95 % pasikliovimo riba, nustatytos kiekvieną rekomenduotą stebėjimo etapą,

- LD₅₀ nustatymui taikyti statistiniai metodai,

- mirštamumas kontroliniuose bandymuose,

- kiti pastebėti ar išmatuoti biologiniai efektai ir bet koks neįprastas bičių elgesys,

- visi nukrypimai nuo čia aprašytų bandymo metodikų ir visa kita reikalinga informacija.

3 NUORODOS

1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N. 1,151 – 165 p. March 1993.

2) Gough, H. J., McIndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 – 1992. Journal of Apicultural Research 22, 119 – 125 p.

3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose – effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96,99 – 113 p.

4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18,265-267 p.

ADSORBCIJA IR DESORBCIJA TAIKANT ĮKROVOS PUSIAUSVYROS METODĄ (C.18.)

1 METODAS

Šis metodas yra OECD (Organization for Economic Cooperation and Development – Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos) TG (Test Guidlines – Bandymų rekomendacijų) 106 dėl dirvožemio adsorbcijos ir desorbcijos, taikant įkrovos pusiausvyros metodą, kopija (2000).

1.1 ĮVADAS

Metodas atsižvelgia į tarplaboratorinio palyginimo bandymą ir į seminaro apie dirvožemio atranką, tobulinant adsorbcijos metodą, medžiagą (1) (2) (3) (4), taip pat į nacionaliniu lygiu taikomas rekomendacijas (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).

Adsorbcijos ir desorbcijos tyrimai yra naudingi kaupiant svarbią informaciją apie cheminių medžiagų judrumą ir jų pasiskirstymą biosferos dirvožemio, vandens ir oro sudedamosiose dalyse (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Informacija gali būti naudojama numatant ar įvertinant, pvz., kaip cheminės medžiagos gali būti skaidomos (22) (23), kaip jas keičia ir įsisavina organizmai (24); kaip jos išplaunamos per dirvos sluoksnius (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28); koks jų lakumas nuo dirvožemio paviršiaus (21) (29) (30); koks nuotėkis nuo žemės paviršiaus į natūraliuosius vandenis (18) (31) (32). Adsorbcijos duomenys gali būti naudojami palyginant ir modeliuojant (19) (33) (34) (35).

Cheminės medžiagos pasiskirstymas dirvožemyje ir vandeninėse fazėse yra sudėtingas procesas, kuris priklauso nuo daugelio skirtingų veiksnių: medžiagos cheminės prigimties (12) (36) (37) (38) (39) (40), dirvožemio savybių (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) ir klimato veiksnių, pvz., lietaus, temperatūros, saulės šviesos ir vėjo. Taigi daugybės reiškinių ir mechanizmų, kurie dirvožemyje dalyvauja cheminių medžiagų adsorbcijos procese, negali visiškai išaiškinti toks supaprastintas laboratorinis modelis, kaip čia pateiktas metodas. Tačiau, nors šis bandymas negali apimti visų galimų aplinkoje atvejų, jis suteikia vertingos informacijos apie cheminės medžiagos adsorbcijos svarbą aplinkai.

1.2 TAIKYMO SRITIS

Metodu siekiama įvertinti, kaip medžiagos dirvožemiuose adsorbuojamos ir desorbuojamos. Tikslas yra gauti sorbcijos vertę, kuri galėtų būti naudojama prognozuojant pasiskirstymą, esant įvairioms aplinkos sąlygoms; cheminių medžiagų adsorbcijos pusiausvyros koeficientai nustatomi kaip dirvožemio savybių (pvz., organinės anglies kiekio, molio kiekio, dirvožemio tekstūros bei pH) funkcija. Turi būti naudojami įvairūs dirvožemio tipai, kad būtų galima kiek įmanoma plačiau aptarti konkrečios medžiagos sąveiką su natūraliai esančiais dirvožemiais.

Šiame metode adsorbcija yra cheminės medžiagos susijungimo su dirvožemio paviršiumi procesas; metodas neskiria skirtingų adsorbcijos procesų (fizinės ir cheminės adsorbcijos) ir kitų procesų, pvz., paviršiaus katalizuojamo skaidymo, tūrio adsorbcijos ar cheminės reakcijos. Neatsižvelgiama į adsorbciją, kuri vyksta ant dirvožemyje susidarančių koloidinių dalelių (skersmuo < 0,2 μm).

Adsorbcijai svarbiausi dirvožemio parametrai yra: organinės anglies kiekis (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) (45) (46) (47) (48), molio kiekis, dirvožemio tekstūra (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) ir, jei tai jonizuojami junginiai, pH vertė (3) (4) (42). Kiti dirvožemio parametrai, kurie galėtų veikti konkrečios medžiagos adsorbciją ir desorbciją, yra efektyvioji katijonų mainų talpa (EKMT), amorfinių geležies ir aliuminio oksidų kiekis, ypač vulkaninės kilmės ir tropikų dirvožemių atvejais (4), taip pat savitasis paviršius (49).

Bandymas skirtas įvertinti cheminės medžiagos adsorbciją į skirtingus dirvožemio tipus su kintamu organinės anglies kiekiu, molio kiekiu ir dirvožemio struktūra bei įvertinti pH. Jį sudaro trys etapai:

1 etapas: Parengiamasis tyrimas, siekiant nustatyti:

- dirvožemio ir tirpalo santykį,

- adsorbcijos pusiausvyros nusistovėjimo trukmę ir pusiausvyros sąlygomis adsorbuotos medžiagos kiekį,

- medžiagos adsorbciją ant bandymų indų paviršių ir bandomosios medžiagos stabilumą bandymo laikotarpiu.

2 etapas: Atrankos bandymas – tiriama penkių skirtingų tipų dirvožemio adsorbcija, matuojant adsorbcijos kinetiką, esant vienai koncentracijai ir nustatant pasiskirstymo koeficientus K_d ir K_oc.

3 etapas: Freundlicho adsorbcijos izotermių apskaičiavimas, norint nustatyti koncentracijos įtaką adsorbcijos dirvožemiu laipsniui. Desorbcijos tyrimas, taikant desorbcijos kinetiką ir Freundlicho desorbcijos izotermes (1 priedas).

1.3 APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI

Simbolis	Apibrėžimas	Vienetai
A_ti	adsorbcijos procentinė dalis laiko momentu t	%
A_eq	adsorbcijos procentinė dalis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis	%
m_s^ads (t_i)	bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu laiko momentu ti, masė	μg
m_s^ads (Δt_i)	bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu per laiką Ati, masė	μg
m_s^ads (eq)	bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis, masė	μg
m₀	adsorbcijos bandymo pradžioje mėgintuvėlyje esančios bandomosios medžiagos masė	μg
m_m^ads (t_i)	bandomosios medžiagos masė, išmatuota tirpalo alikvotinėje dalyje (V^A_a ) laiku t_i	μg
m_aq^ads (eq)	medžiagos tirpale masė adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis	μg
m_soil	dirvožemio fazės kiekis, išreikštas sauso dirvožemio mase	g
c_st	medžiagos pradinio tirpalo masės koncentracija	μg x cm^-3
c₀	sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomojo tirpalo pradinė masės koncentracija	μg x cm^-3
C_aq^ads (t_i)	medžiagos vandeninės fazės masės koncentracija laiko momentu t, kai buvo daroma analizė	μg x cm^-3
C_s^ads (eq)	dirvožemiu adsorbuotos medžiagos kiekis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis	μg x g^-1
C_aq^ads (eq)	medžiagos vandeninės fazės masės koncentracija adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis	μg x cm^-3
v₀	sąlytyje su dirvožemiu esančios vandeninės fazės pradinis tūris atliekant adsorbcijos bandymą	cm³
V^A_a	alikvotinės tirpalo dalies, kurioje išmatuota bandomoji medžiaga, tūris	cm³
K_d	adsorbcijos pasiskirstymo koeficientas	cm³ x g^-1
K_oc	adsorbcijos koeficientas normalizuotas pagal organinę anglį	cm³ x g^-1
K_om	pasiskirstymo koeficientas normalizuotas pagal organinę medžiagą	cm³ x g^-1
K_F^ads	Freundlicho adsorbcijos koeficientas	μg^1-1/n x (cm³)^1/n x g^-1
1/n	Freundlicho lygties laipsnio rodiklis
D_ti	desorbcijos procentinė dalis laiku t	%
D_Δti	desorbcijos procentinė dalis, atitinkanti laiko intervalą Ati	%
K_des	tariamasis desorbcijos koeficientas	cm³ x g^-1
K_F^des	Freundlicho desorbcijos koeficientas	μg^1-1/n x (cm³)^1/n x g^-1
m_aq^des (t_i)	bandomosios medžiagos, desorbuotos nuo dirvožemio laiku t, masė	μg
m_aq^des (Δt_i)	bandomosios medžiagos, desorbuotos nuo dirvožemio per laiko tarpą Ati, masė	μg
m_m^des (eq)	medžiagos, analiziškai nustatytos vandeninėje fazėje desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, masė	μg
m_aq^des (eq)	bandomosios medžiagos, desorbuotos desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, bendroji masė	μg
m_s^des (Δt_i)	medžiagos, kuri liko adsorbuota dirvožemiu praėjus laiko tarpui Ati, masė	μg
m^A_aq	medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl ne visiško tūrio pakeitimo, masė	μg
C_s^des (eq)	bandomosios medžiagos, kuri liko adsorbuota dirvožemiu desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, kiekis	μg x g^-1
C_aq^des (eq)	bandomosios medžiagos vandeninėje fazėje masės koncentracija desorbcijos pusiausvyros sąlygomis	μg x cm^-3
V_T	vandeninės fazės, esančios sąlytyje su dirvožemiu, atliekant desorbcijos kinetikos bandymą nuosekliuoju metodu, bendras tūris	cm³
V_R	tirpalo virš nuosėdų, pašalinto iš mėgintuvėlio pasiekus adsorbcij os pusiausvyrą ir pakeisto tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo, tūris	cm³
V^D_a	tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti atliekant desorbcijos kinetikos bandymą nuosekliuoju metodu, alikvotinės dalies tūris	cm³
Vⁱ_r	tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti atliekant desorbcijos kinetikos bandymą (lygiagretusis metodas), tūris	cm³
V^F_r	tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, tūris	cm³
MB	masių balansas	%
m_E	bandomosios medžiagos, dviem etapais ekstrahuotos iš dirvožemio ir nuo sienelių, bendroji masė	μg
V_rec	adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis regeneruoto tirpalo virš nuosėdų tūris	cm³
P_ow	pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas
pK_a	disociacijos konstanta
S_w	tirpumas vandenyje	g x 1^-1

1.4 BANDYMŲ METODO ESMĖ

Žinomi bandomosios medžiagos, neturinčios ar turinčios žymėtųjų atomų, tirpalo 0,01 M CaCl₂ tūriai yra sumaišomi su žinomos sauso dirvožemio masės bandiniais, prieš tai laikytais 0,01 M CaCl₂, kad nusistovėtų pusiausvyra. Mišinys tam tikrą laiką maišomas. Paskui dirvožemio suspensija atskiriama centrifugavimu ir, jei to pageidaujama, filtravimu, o vandeninė fazė analizuojama. Dirvožemio bandiniu adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis apskaičiuojamas kaip skirtumas tarp pradinio bandomosios medžiagos kiekio tirpale ir jos kiekio bandymo pabaigoje (netiesioginis metodas).

Pagal kitą metodą atliekama dirvožemio analizė ir tiesiogiai nustatomas adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis (tiesioginis metodas). Šis metodas, kurį sudaro dirvožemio ekstrahavimas tam tikrais etapais atitinkamu tirpikliu, rekomenduojamas tais atvejais, kai negalima tiksliai nustatyti bandomosios medžiagos tirpalo koncentracijos skirtumo. Tokių atvejų pavyzdžiai yra: bandomosios medžiagos adsorbcija ant bandymų indų paviršiaus; bandomosios medžiagos nestabilumas atliekant bandymą; silpna adsorbcija, todėl tirpalo koncentracijos pokytis yra labai mažas; stipri adsorbcija, todėl tirpalo koncentracija labai sumažėja ir negali būti tiksliai nustatyta. Naudojant medžiagą su radioaktyviąja žymena, dirvožemio galima ir neekstrahuoti, jei dirvožemio fazės analizei taikomas sudeginimo ir skysčių scintiliacijos skaičiavimo metodas. Skysčių scintiliacijos skaičiavimas yra ne specifinis metodas ir juo negalima atskirti pradinių produktų nuo jų kitimo produktų; taigi jis turi būti taikomas tik tokiu atveju, jei cheminė medžiaga yra stabili atliekant tyrimą.

1.5 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ

Cheminiai reagentai turi būti analiziškai gryni. Rekomenduojama naudoti bent 95 % grynumo žinomos sudėties radioaktyviųjų žymenų neturinčias bandomąsias medžiagas ar žinomos sudėties radioaktyviai grynas medžiagas su radioaktyviąja žymena. Jei radioaktyviųjų izotopų pusamžis yra trumpas, turi būti taikomos skilimo pataisos.

Prieš atliekant adsorbcijos ir desorbcijos bandymą, apie bandomąją medžiagą turi būti žinoma ši informacija:

a) tirpumas vandenyje (A.6 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais);

b) garų slėgis (A.4 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais) ir (ar) Henry'o dėsnio konstanta;

c) abiotinis skaidymas: hidrolizė, kaip pH funkcija (Žin., 2002, Nr. 81 – 3493, „Skaidymas – abiotinio hidrolizinio skaidymo kaip pH funkcijos nustatymas“);

d) pasiskirstymo koeficientas (A.8 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais);

e) lengvas biologinis skaidomumas (Žin., 2002, Nr. 81 – 3493, „Lengvo biologinio skaidomumo nustatymas“) ar aerobinis ir anaerobinis kitimas dirvožemyje;

f) jonizuojamų medžiagų pK_a,

g) tiesioginė fotolizė vandenyje (t.y. vandeninio tirpalo UV-VIS absorbcijos spektras, kvantinė išeiga) ir fotocheminis skaidymas ant dirvožemio.

1.6 BANDYMO TAIKOMUMAS

Bandymas tinka cheminėms medžiagoms, kurioms nustatyti yra turimas pakankamo tikslumo analizės metodas. Svarbus parametras yra bandomosios medžiagos stabilumas atliekant bandymą, kuris gali turėti įtakos rezultatų patikimumui, ypač taikant netiesioginį metodą. Taigi atliekant parengiamąjį tyrimą, būtina tikrinti stabilumą; jei atliekant bandymą stebimas medžiagos kitimas, atliekant pagrindinį tyrimą – rekomenduojama analizuoti dirvožemio ir vandeninę fazes.

Gali kilti sunkumų, atliekant bandymą su bandomosiomis medžiagomis, kurių tirpumas vandenyje yra mažas (S_w < 10^-4 g x1^-1), taip pat esant dideliam bandomųjų medžiagų kiekiui, nes medžiagos koncentracija vandeninėje fazėje negali būti analiziškai nustatyta pakankamai tiksliai. Šiais atvejais būtina imtis papildomų priemonių. Nurodymai, kaip spręsti šias problemas, pateikti atitinkamuose šio metodo aprašymo poskyriuose.

Bandant lakiąsias medžiagas, reikia imtis atsargumo priemonių per bandymą išvengti nuostolių.

1.7 METODO APRAŠYMAS

1.7.1 Aparatūra ir cheminiai reagentai

Reikalinga ši standartinė laboratorinė įranga:

a) mėgintuvėliai ar indai bandymams atlikti. Svarbu, kad šie mėgintuvėliai ar indai:

- būtų pritaikyti centrifugavimo aparatui, norint sumažinti manipuliavimo ir pernešimo paklaidas,

- būtų pagaminti iš inertinės medžiagos, kurios paviršiuje bandomosios medžiagos adsorbcija būtų kuo mažesnė.

b) maišymo įtaisas: vartomoji maišyklė ar lygiavertė įranga; maišant maišymo įtaisu dirvožemis turi būti palaikomas suspensijos būsenoje,

c) centrifuga: pirmenybė teikiama didelio apsukų dažnio centrifugoms, pvz., centrifugavimo jėga > 3000 g, termostatuojama, iš vandeninio tirpalo galinti pašalinti daleles, kurių skersmuo didesnis kaip 0,2 μm. Maišant ir centrifuguojant mėgintuvėliai turi būti uždaryti dangteliais, kad būtų išvengta nuostolių dėl medžiagų lakumo ir vandens nugaravimo; adsorbcijai ant dangtelių sumažinti turi būti naudojami dezaktyvuoti dangčiai, pvz., užsukami, politetrafluoretileno plėvele iškloti dangteliai,

d) neprivalomas: filtravimo įtaisas; filtrų poringumas – 0,2 μm, sterilūs, vienkartiniai. Ypatingą dėmesį reikia kreipti parenkant filtro medžiagą, kad būtų išvengta bet kokių bandomosios medžiagos nuostolių ant filtro; mažai tirpioms medžiagoms nerekomenduojama naudoti filtrų iš organinės medžiagos,

e) analizės aparatūra, tinkama bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai nustatyti,

f) laboratorinė krosnis, palaikyti 103 °C – 110 °C temperatūrą.

1.7.2 Dirvožemio tipo apibūdinimas ir parinkimas

Dirvožemio tipą turėtų apibūdinti trys parametrai, kurie daro didžiausią įtaką adsorbcijos gebai: organinė anglis, molio kiekis ir dirvožemio tekstūra bei pH. Kaip minėta (žr. poskyrį „Taikymo sritis“), konkrečios medžiagos adsorbcijai ir desorbcijai gali turėti įtakos kitos fizinės ir cheminės dirvožemio savybės, o tokiais atvejais į jas turi būti atsižvelgta.

Metodai, taikyti dirvožemiui apibūdinti, yra labai svarbūs ir gali turėti didelės įtakos rezultatams. Taigi atitinkamu ISO metodu (ISO-10390-1) rekomenduojama išmatuoti dirvožemio 0,01 M CaCl₂ tirpale (t. y. tirpale, naudojamame adsorbcijos ir desorbcijos bandymuose) pH vertę. Taip pat rekomenduojama, kad standartiniais metodais (pvz., ISO, „Handbook of Soil Analysis“) būtų nustatytos kitos reikalingos dirvožemio savybės; tai leidžia sorbcijos duomenis analizuoti pagal visam pasauliui standartizuotus dirvožemio parametrus. Kai kurie duomenys apie esamus standartinius dirvožemio analizės ir apibūdinimo metodus pateikti nuorodose (50 – 52). Dirvožemio bandymų metodams kalibruoti rekomenduojama naudoti etaloninius dirvožemius.

Nurodymai, kaip parinkti dirvožemius adsorbcijos ir desorbcijos bandymams, pateikti 1 lentelėje. Parinkti septyni dirvožemio tipai apima vidutinėse geografinėse zonose pasitaikančius dirvožemio tipus. Jei bandomosios medžiagos yra joninės, parinkti dirvožemio tipai turi apimti platų pH verčių diapazoną, kad būtų galima įvertinti jonizuotos ir nejonizuotos medžiagos adsorbciją. Nurodymai, kiek skirtingų dirvožemio tipų naudoti įvairiuose bandymo etapuose, pateikti 1.9 poskyryje „Bandymo eiga“.

Jei tinkamesnis kitų tipų dirvožemis, jis turi būti apibūdintas tais pačiais parametrais ir jo savybės turi įvairuoti panašiai kaip 1 lentelėje aprašytos savybės, net jei tiksliai kriterijų ir neatitinka.

1 lentelė. Nurodymai, kaip parinkti dirvožemio bandinius adsorbcijos ir desorbcijos bandymams

Dirvožemio tipas	pH diapazonas (0,01 M CaCl₂)	Organinės anglies kiekis, %	Molio kiekis, %	Dirvožemio tekstūra¹
1	4,5-5,5	1,0-2,0	65-80	Molis
2	>7,5	3,5 – 5,0	20-40	sunkus priemolis
3	5,5 – 7,0	1,5-3,0	15-25	rudasis priemolis
4	4,0-5,5	3,0-4,0	15-30	priemolis
5	<4,0-6,0²	<0,5-l,5²'³	<10-15²	priemolio smėlis
6	>7,0	< 0,5-1,0²'³	40-65	sunkus priemolis ar molis
7	<4,5	>10	<10	smėlis ar priemolio smėlis

¹Pagal FAO (Food and Agricultural Organisation – Maisto ir žemės ūkio organizacija) ir JAV sistemą (85).

²Būtų geriau, jei atitinkamų kintamųjų vertės būtų nurodytame diapazone. Tačiau, jei kyla sunkumų rasti tinkamą dirvožemį, priimtinos mažesnės negu nurodytos mažiausios vertės.

³Dirvožemis, kuriame organinės anglies yra mažiau kaip 0,3 %, gali sugriauti naudoti dirvožemį kuriame organinės anglies būtų ne mažiau kaip 0,3 %.

1.7.3 Dirvožemio bandinių rinkimas ir laikymas

1.7.3.1. Rinkimas

Nėra rekomenduojami kokie nors specifiniai bandinių ėmimo metodai ar priemonės; bandinių ėmimo metodas priklauso nuo tyrimo tikslo (53) (54) (55) (56) (57) (58).

Reikia atsižvelgti į šiuos dalykus:

a) būtina turėti išsamią informaciją apie lauko sklypą; reikia atsižvelgti į vietą, augmenijos dangą, apdorojimą pesticidais ir (ar) trąšomis, biologinius priedus ar atsitiktinį užteršimą. Reikia laikytis dirvožemio bandinių ėmimo ISO standarto (ISO 10381-6) rekomendacijų, atsižvelgiant į bandinio ėmimo vietos aprašymą;

b) bandinių ėmimo vieta turi būti apibrėžta UTM (Universal Transversal Mercator-Projection/European Horizontal Datum — Universalioji skersinė Merkatoriaus projekcija arba Europos horizontalusis atskaitos lygis) ar geografinių koordinačių; tai leistų ateityje vėl paimti konkretaus dirvožemio ar padėtų apibūdinti dirvožemį pagal įvairias klasifikavimo sistemas, taikomas skirtingose šalyse. Be to, reikia rinkti tik A horizonte, ne giliau kaip 20 cm. Jei konkrečiai 7 tipo dirvožemio dalį sudaro Oh horizontas, jis turi būti įtrauktas į bandinį.

Dirvožemio bandiniai turi būti gabenami konteineriuose, esant tokiai temperatūrai, kuri garantuotų pradines dirvožemio savybes ir jų labai nepakeistų.

1.7.3.2. Laikymas

Geriau naudoti ką tik iš lauko paimtą dirvožemį. Jei tai neįmanoma, išdžiovintas ore dirvožemis gali būti laikomas kambario temperatūros sąlygomis. Rekomendacijų apie laikymo trukmės ribas nepateikiama, tačiau daugiau kaip trejus metus laikytas dirvožemis prieš naudojant turi būti vėl analizuojamas, kad būtų nustatytas organinės anglies kiekis, pH ir katijonų mainų talpa (KMT).

1.7.3.3. Dirvožemio bandinių apdorojimas ir paruošimas bandymui

Dirvožemis džiovinamas ore kambario temperatūros sąlygomis, geriau 20 — 25 °C. Smulkinti reikia kuo mažesne jėga, kad pradinė dirvožemio sandara pasikeistų kuo mažiau. Dirvožemis sijojamas, kol lieka 2 mm dydžio ir smulkesnės dalelės; sijoj ant reikėtų laikytis ISO standarto dirvožemio bandinių ėmimo rekomendacijų (ISO 10381-6). Rekomenduojama dirvožemį kruopščiai homogenizuoti, nes tai pagerina rezultatų atkuriamumą. Kiekvieno dirvožemio bandinio drėgmės kiekis nustatomas tris alikvotines dalis kaitinant 105 °C temperatūroje tol, kol masė daugiau nesikeičia (maždaug 12 h). Visiems skaičiavimams nurodoma krosnyje išdžiovinto dirvožemio masė, t. y. dirvožemio, atėmus drėgmės kiekį, masė.

1.7.4 Bandomosios medžiagos paruošimas maišymui su dirvožemiu

Bandomoji medžiaga ištirpinama 0,01 M CaCl₂ tirpale, kuriam paruošti naudojamas distiliuotas ar dejonizuotas vanduo; CaCl₂ tirpalas yra naudojamas kaip vandeninis tirpiklis centrifugavimui palengvinti ir katijonų mainams, kiek įmanoma, sumažinti. Pradinio tirpalo koncentracija turėtų būti trimis dydžio eilėmis didesnė už analizės metodo aptikimo ribą. Ši riba garantuoja tikslius matavimus, taikant šį metodą; be to, pradinio tirpalo koncentracija turėtų būti mažesnė už bandomosios medžiagos tirpumo vandenyje vertę.

Pradinį tirpalą geriau ruošti prieš pat maišymą su dirvožemio bandiniais. Paruoštas tirpalas turi būti uždengtas ir laikomas tamsoje, esant 4 °C temperatūrai. Laikymo trukmė priklauso nuo bandomosios medžiagos stabilumo ir nuo tirpalo koncentracijos.

Mažai tirpioms medžiagoms (S_w < 10^-4 g x 1^-1), kai bandomąją medžiagą sunku ištirpinti, gali būti reikalingas atitinkamas soliubilizavimo agentas. Šis soliubilizavimo agentas: a) turi maišytis su vandeniu, pvz., metanolis ar acetonitrilas; b) jo koncentracija neturi būti didesnė kaip 1 % bendrojo pradinio tirpalo tūrio ir turi būti mažesnė nei sąlytyje su dirvožemiu esančios bandomosios medžiagos koncentracija (geriau, jei mažesnė kaip 0,1 %); c) neturi būti paviršiaus aktyvioji medžiaga arba dalyvauti solvolizės reakcijoje su bandomąja medžiaga. Duomenų ataskaitoje turi būti nurodytas ir pagrįstas tokio soliubilizavimo agento naudojimas.

Kitas mažai tirpioms medžiagoms taikomas būdas yra pridėti bandomosios medžiagos į bandymo sistemą, naudojant pagalbinį tirpiklį: bandomoji medžiaga ištirpinama organiniame tirpiklyje, alikvotinė šio tirpalo dalis pridedama į dirvožemio ir 0,01 M CaCl₂ tirpalo distiliuotame ar dejonizuotame vandenyje sistemą. Organinio tirpiklio kiekis vandeninėje fazėje turi būti kuo mažesnis, dažniausiai ne didesnis kaip 0,1 %. Medžiagos pridėjimas, naudojant tirpalą organiniame tirpiklyje, gali pabloginti tūrio atkuriamumą. Taigi gali atsirasti papildoma paklaida, nes bandomosios medžiagos ir pagalbinio tirpiklio koncentracija visuose bandymuose gali būti nevienoda.

1.8 ADSORBCIJOS IR DESORBCIJOS BANDYMO BŪTINOSIOS SĄLYGOS

1.8.1 Analizės metodas

Pagrindiniai parametrai, galintys turėti įtakos sorbcijos matavimams, yra tirpalui ir adsorbuotoms fezėms analizuoti taikomo analizės metodo tikslumas, bandomosios medžiagos stabilumas ir grynumas, sorbcijos pusiausvyros pasiekimas, tirpalo koncentracijos pokyčio dydis, dirvožemio ir tirpalo santykis, dirvožemio struktūros pokyčiai, nusistovint pusiausvyrai (35) (59 – 62). Keletas pavyzdžių, susijusių su tikslumo problemomis, pateikta 2 priede.

Taikomo analizės metodo patikimumas turi būti patikrintas pagal koncentracijų diapazoną, kuris greičiausiai bus taikomas atliekant bandymą. Bandytojas gali laisvai tobulinti atitinkamą metodą, turintį reikiamą tikslumą, atkuriamumą, aptikimo ribas ir atgavimo lygį. Toliau pateikti nurodymai, kaip tokį bandymą atlikti.

Atitinkamas 0,01 M CaCl₂ tirpalo tūris, pvz., 100 cm³, 4 h maišomas su tam tikra labai adsorbuojančio, t. y. turinčio didelį organinės anglies ir molio kiekį, dirvožemio mase, pvz., 20 g; ši masė ir tūris gali skirtis priklausomai nuo analizės poreikių, tačiau dirvožemio ir tirpalo santykis – 1:5 yra patogus pradžios taškas. Mišinys centrifuguojamas ir vandeninė jo fazė gali būti filtruojama. Į vandeninę fazę įpilamas tam tikras tūris bandomosios medžiagos pradinio tirpalo, kad būtų pasiekta vardinė koncentracija koncentracijų diapazone, kuris bus numatomas atliekant bandymą. Šis tūris turi sudaryti ne daugiau kaip 10 % galutinio vandeninės fazės tūrio, kad kuo mažiau pasikeistų pradiniam pusiausvyros nusistovėjimui paimto tirpalo savybės. Tirpalas analizuojamas.

Norint patikrinti analizės metodo artefaktus ir dėl dirvožemio atsiradusius matricos efektus, turi būti įtrauktas vienas tuščias bandymas, kurį sudaro sistema iš dirvožemio + CaCl₂ tirpalo (be bandomosios medžiagos).

Analizės metodus, kurie gali būti taikomi sorbcijai matuoti, sudaro dujų ir skysčių chromatografija (Gas-Liquid Chromatography, GLC), didelio efektyvumo skysčių chromatografija (high-performance liąuid chromatography, HPLC), spektrometrija (pvz., GC/masių spektrometrija, HPLC/masių spektrometrija) ir skysčių scintiliacijos skaičiavimas (medžiagų su radioaktyviąja žymena). Nepriklausomai nuo analizės metodo, patenkinamu laikomas aptikimo lygis, kuris sudaro 90 % — 110 % vardinės vertės. Norint medžiagą aptikti ir įvertinti po įvykdyto atskyrimo, analizės metodo aptikimo riba turi būti bent dviem dydžio eilėmis mažesnė už vardinę koncentraciją.

Adsorbcijos tyrimams taikomo analizės metodo savybės ir aptikimo riba yra labai svarbios, apibrėžiant bandymo sąlygas ir bendrą bandymo veiksmingumą. Šis metodas pateikia bendrąją bandymo eigą ir numato rekomendacijas alternatyviems sprendimams ten, kur galimybes gali riboti analizės metodas ir laboratorijos įranga.

1.8.2 Optimalaus dirvožemio ir tirpalo santykio parinkimas

Tinkamo dirvožemio ir tirpalo santykio parinkimas sorbcijos tyrimams priklauso nuo pasiskirstymo koeficiento K_d ir nuo pageidaujamo santykinio adsorbcijos laipsnio. Matavimo, pagrįsto adsorbcijos lygties forma ir analizės metodo riba, statistinį tikslumą, nustatant medžiagos tirpalo koncentraciją, lemia šios koncentracijos pokytis. Taigi naudinga pasirinkti kelias pastovias santykio vertes, kurioms adsorbuotos medžiagos procentinė dalis yra didesnė negu 20 %, geriau didesnė negu 50 % (62), ir pasirūpinti, kad bandomosios medžiagos tirpalo koncentracija būtų palaikoma tokia, kad ją būtų galima tiksliai nustatyti. Tai ypač svarbu, kai yra didelė adsorbcijos procentinė dalis.

Patogus būdas parinkti tinkamą dirvožemio ir vandens santykį, pagrįstą K_d vertės įverčiu, atliekant išankstinius tyrimus arba taikant sukurtus vertinimo metodus (3 priedas). Tinkamą santykį galima pasirinkti pagal dirvožemio ir tirpalo santykio bei nustatytos adsorbcijos procentinės dalies K_d grafiką (1 pav.). Šiam grafikui nubrėžti daroma prielaida, kad adsorbcijos lygtis yra tiesiška (3)¹³. Tinkamas sąryšis gaunamas K_d4 lygtį pertvarkant į 1 lygtį:

ar į jos logaritminę išraišką, darant prielaidą, kad,

Pasiskirstymo koeficientas K_d (cm³ x g^-1)

1 pav. Dirvos ir tirpalo santykio, ir K_d sąryšis, esant įvairioms adsorbuotos medžiagos procentinėms dalims

1 pav. Reikiamas dirvožemio ir tirpalo santykis pateiktas kaip K_d funkcija esant įvairiems adsorbcijos lygiams. Pvz., jei dirvožemio ir tirpalo santykis yra 1:5, ir K_d 20, adsorbcijos laipsnis maždaug 80 %. 50% adsorbcijai gauti, esant tam pačiam K_d, turi būti taikomas santykis 1:25. Šis tinkamo dirvožemio ir tirpalo santykio pasirinkimo būdas leidžia bandytojui lanksčiai prisitaikyti prie bandymo sąlygų.

Sunkiau yra panaudoti tas sritis, kuriose medžiaga adsorbuojama labai stipriai arba labai silpnai. Jei adsorbcija vyksta silpnai, rekomenduojamas 1:1 dirvožemio ir tirpalo santykis, nors kai kuriems dirvožemiams su dideliu organinės medžiagos kiekiu šį santykį būtina padidinti norint gauti suspensiją. Reikia pasirūpinti analizės metodu mažiems tirpalo koncentracijos pokyčiams matuoti, kitaip adsorbcijos matavimas bus netikslus. Kita vertus, esant labai dideliems pasiskirstymo koeficientams K_d, dirvožemio ir tirpalo santykį galima mažinti iki 1:100, kad cheminės medžiagos tirpale liktų daug. Reikia užtikrinti gerą sumaišymą ir būtina duoti pakankamai laiko sistemai pasiekti pusiausvyrą. Alternatyvus šių ribinių atvejų naudojimo būdas, kai nėra tinkamo analizės metodo, yra K_d vertės prognozė, taikant vertinimo metodikas, pagrįstas, pvz., P_ow vertėmis (3priedas). Tai gali būti naudinga ypač silpnai adsorbuojamoms ar polinėms medžiagoms, kurių P_ow < 20, ir lipofilinėms ar stipriai sorbuojamoms cheminėms medžiagoms, kurių P_ow > 10⁴.

1.9 BANDYMŲ EIGA

1.9.1 Bandymų sąlygos

Visi bandymai atliekami aplinkos temperatūros ir, jei įmanoma, pastovios temperatūros nuo 20 °C iki 25 °C sąlygomis.

Centrifugavimo sąlygos turi būti tokios, kad būtų galima pašalinti iš tirpalo didesnes kaip 0,2 μm daleles. Ši vertė atitinka mažiausią dydį iki kurio dalelė dar laikoma kietąja dalele, ir tai yra riba tarp kietųjų ir koloidinių dalelių. Kaip nustatyti centrifugavimo sąlygas, nurodyta 4 priede.

Jei negalima garantuoti, kad centrifugavimo priemonės pašalins didesnes kaip 0,2 μm daleles, būtų galima taikyti centrifugavimo ir filtravimo pro 0,2 μm filtrus derinį. Norint išvengti ant filtrų bet kokių bandomosios medžiagos nuostolių, indai turi būti pagaminti iš tinkamos inertinės medžiagos. Bet kuriuo atveju turi būti įrodyta, kad filtruojant nepatiriama jokių bandomosios medžiagos nuostolių.

1.9.2.1 etapas. Parengiamasis tyrimas

Pradinio tyrimo vykdymo tikslas jau buvo nurodytas poskyryje „Taikymo sritis“. Toliau pateikiamos rekomendacijos, kaip atlikti tokį bandymą.

1.9.2.1. Optimalaus dirvožemio ir tirpalo santykio verčių parinkimas

Naudojami du dirvožemio tipai ir trys dirvožemio ir tirpalo santykio vertės (šeši bandymai). Vieno tipo dirvožemyje yra didelis organinės anglies ir mažas molio kiekis, kito tipo dirvožemyje — mažas organinės anglies ir didelis molio kiekis. Siūloma naudoti tokius dirvožemio ir tirpalo santykius:

- 50 g dirvožemio ir 50 cm³ bandomosios medžiagos vandeninio tirpalo (santykis 1/1),

- 10 g dirvožemio ir 50 cm³ bandomosios medžiagos vandeninio tirpalo (santykis 1/5),

- 2 g dirvožemio ir 50 cm³ bandomosios medžiagos vandeninio tirpalo (santykis 1/25).

Mažiausias dirvožemio kiekis, su kuriuo gali būti atliekamas bandymas, priklauso nuo laboratorijos įrangos ir taikomų analizės metodų. Tačiau, norint gauti patikimus bandymo rezultatus, rekomenduojama naudoti nemažiau kaip 1 g, o geriau 2 g dirvožemio.

Bandomosios medžiagos stabilumui CaCl₂ tirpale ir jos galimai adsorbcijai ant bandymų indų paviršių patikrinti – vienas kontrolinis bandinys, kurį sudaro 0,01 M CaCl₂ tirpale ištirpinta bandomoji medžiaga (be dirvožemio), pereina tiksliai tuos pačius etapus kaip ir bandomosios sistemos.

Tuščiasis bandymas kiekvienam dirvožemiui su tuo pačiu dirvožemio kiekiu ir bendru 50 cm³ 0,01 M CaCl₂ tirpalo tūriu (be bandomosios medžiagos) atliekamas pagal tą pačią bandymo metodiką. Atliekant analizę, šis bandymas yra fono kontrolės priemonė, norint aptikti trukdančių medžiagų ar užterštų dirvožemių.

Visi bandymai, įskaitant kontrolinius ir tuščiuosius, turi būti atliekami mažiausiai po du kartus. Bendras tyrimui paruoštų bandinių skaičius gali būti apskaičiuotas atsižvelgiant į taikomą metodą.

Parengiamojo tyrimo ir pagrindinio tyrimo metodai dažniausiai yra tie patys, būtinos išimtys yra nurodomos.

Norint pasiekti pusiausvyrą ore, išdžiovinti dirvožemio bandiniai sumaišomi su ne mažesnio kaip 45 cm³ tūrio 0,01 M CaCl₂ tirpalu ir mišinys maišomas per naktį (12 h) prieš bandymo atlikimo dieną. Vėliau įpilamas tam tikras tūris bandomosios medžiagos pradinio tirpalo taip, kad būtų gautas galutinis 50 cm³ tūris. Šis įpilamo pradinio tirpalo tūris: a) neturi sudaryti daugiau kaip 10 % galutinio 50 cm³ vandeninės fazės tūrio, kad kuo mažiau pasikeistų pradinei pusiausvyrai nusistovėti naudoto tirpalo savybės; b) būtų toks, kad sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomosios medžiagos pradinio tirpalo koncentracija (C₀>) būtų bent dviem dydžio eilėmis didesnė negu analizės metodo aptikimo ribos vertė; šis ribinis dydis leidžia daryti tikslius matavimus, esant didelio laipsnio adsorbcijai (> 90%) ir vėliau apskaičiuoti adsorbcijos izotermes. Be to, rekomenduojama, kad pradinė medžiagos koncentracija (C₀>), jei tai įmanoma, būtų ne didesnė kaip pusė tirpumo vertės.

Toliau pateikiamas pavyzdys, kaip apskaičiuoti pradinio tirpalo koncentraciją (C_st). Tarkime, kad aptikimo riba yra 0,01 μg x cm^-3 ir adsorbcijos laipsnis 90 %; taigi sąlytyje su dirvožemiu esančios bandomosios medžiagos pradinė koncentracija turi būti 1 μg x cm^-3 (dviem dydžio eilėmis didesnė kaip aptikimo ribos vertė). Darant prielaidą, kad įpilamo pradinio tirpalo tūris yra didžiausias, koks buvo rekomenduotas, t. y. 5 cm³ į 45 cm³ 0,01 M CaCl₂ pusiausvyros nusistovėjimo tirpalo (pradinis tirpalas sudaro 10 % 50 cm³ bendrojo vandeninės fazės tūrio), pradinio tirpalo koncentracija turi būti 10 μg x cm^-3; ji yra trimis dydžio eilėmis didesnė už analizės metodo aptikimo ribinę vertę.

Vandeninės fazės pH vertė turi būti matuojama prieš sąlytį su dirvožemiu ir po jo, kadangi ji visą adsorbcijos procesą yra svarbi, ypač jei tai jonizuojamosios medžiagos.

Mišinys maišomas tol, kol pasiekiama adsorbcijos pusiausvyra. Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė dirvožemiams yra labai nevienoda, atsižvelgiant į cheminę medžiagą ir dirvožemį; dažniausiai pakanka 24 h (77). Atliekant parengiamąjį tyrimą, bandinius per visą 48 h maišymo laikotarpį galima imti nuosekliai (pvz., 4, 8, 24,48 h). Tačiau rinktis analizės laiką reikėtų lanksčiai ir atsižvelgiant į laboratorijos darbo grafiką.

Yra du galimi būdai bandomosios medžiagos vandeniniam tirpalui analizuoti: a) lygiagretusis metodas ir b) nuoseklusis metodas. Pabrėžtina, kad, nors eksperimentinio darbo lygiagrečiuoju metodu yra daugiau, matematinis rezultatų apdorojimas yra paprastesnis (5 priedas). Tačiau metodą pasirinkti leidžiama pačiam bandytojui, kuris turės atsižvelgti į laboratorijos įrangą ir lėšas.

a) Lygiagretusis metodas: paruošiami bandiniai su vienodu dirvožemio ir tirpalo santykiu, bandinių reikia tiek, kiek laiko tarpų pasirinkta adsorbcijos kinetikai tirti. Po centrifugavimo ir, jei pageidaujama, filtravimo vandeninė fazė, jei įmanoma, išgaunama visa ir analizuojama, pvz., pirmojo mėgintuvėlio po 4 h, antrojo mėgintuvėlio – po 8 h, trečiojo mėgintuvėlio – po 24, ir 1.1.

b) Nuoseklusis^{^[2]}metodas: kiekvienam dirvožemio ir tirpalo santykiui paruošiama tik po du bandinius. Nustatytais laiko tarpais mišinys centrifuguojamas fazėms atskirti. Maža alikvotinė tirpalo dalis tuojau pat analizuojama bandomajai medžiagai nustatyti; bandymas tęsiamas su pradiniu mišiniu. Jei po centrifugavimo taikomas filtravimas, laboratorijoje turi būti priemonių mažiems alikvotinių dalių tūriams filtruoti. Rekomenduojama bendrą alikvotinių dalių tūrį imti ne didesnį kaip 1 % bendrojo tirpalo tūrio, kad atliekant bandymą labai nepakistų dirvožemio, ir tirpalo santykis ir nesumažėtų adsorbuojamos medžiagos masė.

Pagal vardinę pradinę koncentraciją ir koncentraciją, išmatuotą bandinio ėmimo momentui (t), pataisytą pagal tuščiojo bandymo vertę, kiekvienam laiko momentui (t_i) apskaičiuojama adsorbcijos A_ti procentinė dalis. Braižomi A_ti kitimo laike grafikai (5 priedas, 1 pav.), kad būtų galima nustatyti, ar jau pasiekta pusiausvyros horizontalioji kreivės dalis (¹). Taip pat apskaičiuojama K_d vertė pusiausvyros sąlygomis. Pagal šią K_d vertę (1 pav.) pasirenkamas tinkamas dirvožemio ir tirpalo santykis, kad adsorbcijos procentinė dalis būtų didesnė kaip 20 %, o geriau, jei > 50 % (61). Visos taikomos lygtys ir grafikų sudarymo principai pateikti poskyryje „Duomenys ir ataskaita“ ir 5 priede.

1.9.2.2. Adsorbcijos pusiausvyros nusistovėjimo, trukmės ir pusiausvyros sąlygomis adsorbuotos medžiagos kiekio nustatymas

Kaip jau sakyta, A_ti ar C^ads_aq kitimo per tam tikrą laiką grafikai leidžia įvertinti, ar pasiekta adsorbcijos pusiausvyra ir koks yra pusiausvyros sąlygomis adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis. Tokių grafikų pavyzdžiai pateikti 5 priede. Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė – tai laikas, per kurį sistema pasiekia kreivės horizontaliąją dalį.

Jei konkrečiai medžiagai kreivės lygiagrečioji dalis nepasiekiama, bet adsorbcija visą laiką didėja, gali būti sunkinančių veiksnių, pvz., biologinis skaidymas ar lėta difuzija. Biologinį skaidymą galima įrodyti, pakartojant bandymą su steriliu dirvožemio bandiniu. Jei ir dabar lygiagrečioji kreivės dalis nepasiekiama, bandytojas turi ieškoti kitų reiškinių, trukdančių vykdyti specifinį tyrimą; tai galima padaryti atitinkamai pakeitus bandymo sąlygas (temperatūrą, maišymo trukmę, dirvožemio ir tirpalo santykį). Bandytojas pats turi spręsti, ar tęsti bandymą, nepaisant to, kad gali ir nepavykti pasiekti pusiausvyrą.

1.9.2.3. Adsorbcija ant bandymų indų paviršiaus ir bandomosios medžiagos stabilumas

Tam tikros informacijos apie bandomosios medžiagos adsorbciją ant bandymų indų paviršiaus, taip pat apie jos stabilumą, galima gauti analizuojant kontrolinius bandinius. Jei pastebimas medžiagos išeikvojimas yra didesnis už analizės metodo standartinę paklaidą, gali vykti abiotinis skaidymas ir (ar) adsorbcija ant bandymų indų paviršiaus. Šiuos du reiškinius galima atskirti, jei indų sienelės gerai nuplaunamos žinomu kiekiu atitinkamo tirpiklio ir plovimui naudotas tirpalas analizuojamas, norint nustatyti bandomąją medžiagą. Jei adsorbcija ant indų paviršiaus nevyksta, medžiagos išeikvojimas rodo abiotinį bandomosios medžiagos nestabilumą. Jei adsorbcija įrodoma, būtina keisti medžiagas, iš kurių pagaminti bandymų indai. Tačiau duomenys, gauti atliekant šį bandymą, negali būti tiesiogiai ekstrapoliuoti dirvožemio ir tirpalo bandymui. Šiai adsorbcijai įtakos gali turėti dirvožemis.

Papildomos informacijos apie bandomosios medžiagos stabilumą galima gauti, nustatant pradinės medžiagos masės balansą per tam tikrą laiką. Tokiu atveju vandeninė fazė, dirvožemio ekstraktai ir bandymų indų sienelės analizuojamos, norint nustatyti bandomąją medžiagą. Pridėtos bandomosios medžiagos masės ir bandomosios medžiagos vandeninėje fazėje, ekstraktuose ir ant bandymų indų sienelių masių sumos skirtumas yra lygus masei medžiagos, kuri buvo suardyta ir (ar) išgaravo, ir (ar) nebuvo ekstrahuota. Norint nustatyti masių balansą, atliekant bandymą turi būti pasiekta adsorbcijos pusiausvyra.

Masių balansas sudaromas dviem dirvožemiams ir kiekvieno dirvožemio vienam dirvožemio ir tirpalo santykiui, kuriam pusiausvyros sąlygomis gaunamas didesnis negu 20 %, o geriau didesnis negu 50 % išeikvojimas. Baigus santykio nustatymo bandymą, kai po 48 h padaroma paskutinė vandeninės fazės bandinio analizė, fazės yra atskiriamos centrifugavimu ir, jei pageidaujama, filtravimu. Iš dirvožemio išgaunama kuo didesnio laipsnio vandeninė fazė, vėliau, norint ekstrahuoti bandomąją medžiagą, į jį įpilama tinkamo ekstrahavimo tirpiklio (ekstrahavimo veiksnys bent 95%). Rekomenduojama nuosekliai ekstrahuoti bent du kartus. Nustatomas medžiagos kiekis dirvožemio ir bandymų indų ekstraktuose ir apskaičiuojamas masių balansas (10 lygtis, „Duomenys ir ataskaita“). Jei jis yra mažesnis negu 90 %, laikoma, kad bandomoji medžiaga, atliekant bandymą, yra nestabili. Tyrimus galima tęsti toliau, atsižvelgiant į bandomosios medžiagos nestabilumą; rekomenduojama, atliekant pagrindinį tyrimą, analizuoti abi fazes.

1.9.3 2 etapas. Adsorbcijos kinetika, esant vienai bandomosios medžiagos koncentracijai

Naudojami iš 1 lentelės pasirinkti penki dirvožemio tipai. Jei tinka, tarp šių penkių tipų naudinga turėti kai kuriuos dirvožemio tipus, naudotus atliekant parengiamąjį tyrimą. Tuomet parengiamajam tyrimui naudotiems dirvožemio tipams 2 etapo bandymų daryti nereikia.

Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė, dirvožemio ir tirpalo santykis, dirvožemio bandinio masė, susijęs su dirvožemiu vandeninės fazės tūris ir bandomosios medžiagos tirpalo koncentracija pasirenkami pagal parengiamojo tyrimo rezultatus. Analizę būtų geriau atlikti maždaug po 2, 4, 6, 8 (galbūt dar po 10 h) ir po nusistovėjimo trukmė. Analizės laiką reikėtų rinktis lanksčiai.

Kiekvienas bandymas (vienas dirvožemis ir vienas tirpalas) atliekamas bent du kartus, kad būtų galima įvertinti rezultatų sklaidą. Atliekant kiekvieną bandymą, lygiagrečiai atliekamas tuščiasis bandymas. Jį sudaro dirvožemis ir 0,01 M CaCl₂ tirpalas be bandomosios medžiagos, kurių tūris yra atitinkamai toks pat kaip ir bandymo su bandomąja medžiaga masė. Norint išvengti netikėtumų, pagal tą pačią bandymo metodiką atliekamas kontrolinis bandymas tik su bandomąja medžiaga, ištirpinta 0,01 M CaCl₂ tirpale (be dirvožemio).

A A

Apskaičiuojama kiekvieno laiko momento A_ti ir (ar) laiko tarpo A_Δti (pagal poreikį) adsorbcijos procentinė dalis ir pateikiamas adsorbcijos kitimo tam tikrą laiką grafikas. Apskaičiuojamas pasiskirstymo koeficientas K_d pusiausvyros sąlygomis, taip pat pagal organinę anglį normalizuotas adsorbcijos koeficientas K_oc(nepolinių organinių medžiagų).

Adsorbcijos kinetikos bandymo rezultatai

Tiesinė K_d vertė dažniausiai tiksliai aprašo dirvožemio sorbcinį elgesį (35) (78) ir yra cheminių medžiagų būdingo judrumo dirvožemyje išraiška. Pvz., cheminės medžiagos, kurių K_d < 1 cm³ x g^-1, kokybiškai laikomos judriomis. Panašiai MacCall et ai. (16) buvo sukurta judrumo klasifikavimo schema, pagrįsta K_oc vertėmis. Be to, yra išplovimo klasifikavimo schemos, pagrįstos K_d ir DT-50^{^[3]} santykiu (32) (79).

Pagal paklaidų analizės tyrimus (61) mažesnės kaip 0,3 cm³ x g^-1 K_d vertės negali būti tiksliai įvertintos pagal vandeninės fazės koncentracijos mažėjimą, netgi taikant palankiausią (tikslumo požiūriu) dirvožemio ir tirpalo santykį, t. y. 1:1. Šiuo atveju rekomenduojama analizuoti abi fazes, dirvožemį ir tirpalą.

Atsižvelgiant į šias pastabas, rekomenduojama tęsti adsorbcinį cheminės medžiagos dirvoje elgesio ir jos potencialaus judrumo tyrimą, nustatant Freundlicho adsorbcijos izotermes tų sistemų, kurių K_d vertes galima tiksliai nustatyti pagal šio metodo aprašymą. Tiksliai nustatyti galima, jei K_d ir dirvožemio ir tirpalo santykio sandaugos vertė yra > 0,3, matuojant vandeninės fazės koncentracijos mažėjimą (netiesioginis metodas) ar > 0,1, kai analizuojamos abi fazės (tiesioginis metodas) (61).

1.9.4 3 etapas. Adsorbcijos izotermes ir desorbcijos kinetika bei desorbcijos izotermes

1.9.4.1. Adsorbcijos izotermes

Naudojamos penkios bandomosios medžiagos koncentracijos ir rekomenduojama, kad jų vertės apimtų dvi dydžio eiles; pasirenkant šias koncentracijas, reikia atsižvelgti į tirpumą vandenyje ir gaunamą vandeninės fazės pusiausvyros koncentraciją. Tas pats dirvožemio ir tirpalo santykis turi būti taikomas visą tyrimą. Adsorbcijos bandymas atliekamas taip, kaip aprašyta pirmiau, skirtumas tik toks, kad vandeninė fazė analizuojama vieną kartą pusiausvyros nusistovėjimo momentu, nustatytu pagal 2 etapo rezultatus. Nustatoma tirpalų pusiausvyros koncentracija ir pagal medžiagos kiekio tirpale sumažėjimą arba tiesioginiu metodu apskaičiuojamas adsorbuotos medžiagos kiekis. Adsorbuotos medžiagos masė, tenkanti dirvožemio masės vienetui, grafiškai pateikiama kaip bandomosios medžiagos pusiausvyros koncentracijos funkcija (žr. „Duomenys ir ataskaita“).

Bandymo rezultatai, norint gauti adsorbcijos izotermę

Apibūdinant adsorbcijos procesus iš ligi šiol pasiūlytų matematinių adsorbcijos modelių dažniausiai taikoma Freundlicho izotermė. Smulkesnė informacija, interpretuojant adsorbcijos modelius ir jų svarbą, pateikta nuorodose (41), (45), (80), (81), (82).

PASTABA. Reikėtų paminėti, kad skirtingų medžiagų K_F (Freundlicho adsorbcijos koeficiento) vertes galima palyginti, jei šios K_F vertės yra išreikštos tais pačiais vienetais (83).

1.9.4.2. Desorbcijos kinetika

Šio bandymo tikslas yra ištirti, ar cheminę medžiagą dirvožemis adsorbuoja grįžtamai ar negrįžtamai. Ši informacija yra svarbi, kadangi cheminės medžiagos elgesiui dirvožemyje lauko sąlygomis desorbcijos procesas taip pat turi svarbią įtaką. Be to, desorbcijos duomenys yra naudingi kaip įvesties duomenys kompiuteriu modeliuojant išplovimą ir ištirpusių medžiagų nuotėkį. Jei norima vykdyti desorbcijos tyrimą, rekomenduojama, kad su kiekviena sistema, kurios K_d buvo galima tiksliai nustatyti, atliekant ankstesnį adsorbcijos kinetikos bandymą, būtų atliekamas toliau aprašytas tyrimas.

Panašiai kaip atliekant adsorbcijos kinetikos tyrimą, yra du desorbcijos kinetikos bandymo metodai: a) lygiagretusis metodas ir b) nuoseklusis metodas. Pasirinkti metodą patikima bandytojui, kuris turi atsižvelgti į laboratorijos įrangą ir lėšas.

a) Lygiagretusis metodas: kiekvienam desorbciją tirti pasirinktam dirvožemio tipui paruošiama bandinių, kurių dirvožemio ir tirpalo santykis būtų vienodas ir kurių būtų tiek, kiek yra desorbcijos kinetiką tiriant pasirinktų laiko tarpų. Geriau naudoti laiko tarpus, pasirinktus tiriant adsorbcijos kinetiką; tačiau bendras laikas gali būti atitinkamai padidintas, kad sistema galėtų pasiekti desorbcijos pusiausvyrą. Atliekant kiekvieną bandymą (vienas dirvožemis, vienas tirpalas), šalia atliekamas vienas tuščiasis bandymas. Jį sudaro dirvožemis ir 0,01 M CaCl₂ tirpalas be bandomosios medžiagos, kurių masė ir tūris atitinkamai yra tokie pat kaip ir bandinio su bandomąja medžiaga. Pagal tą pačią bandymo metodiką tiriamas kontrolinis bandinys tik su bandomąja medžiaga, ištirpinta 0,01 M CaCl₂ tirpale (be dirvožemio). Visi dirvožemio ir tirpalo mišiniai maišomi, kol pasiekiama adsorbcijos pusiausvyra (kaip nustatyta pirmiau pagal 2 etapą). Toliau fazės atskiriamos centrifugavimu ir pašalinama kuo daugiau vandeninių fazių. Pašalinti tirpalai pakeičiami tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl₂ tirpalo be bandomosios medžiagos ir nauji mišiniai vėl maišomi. Pirmojo mėgintuvėlio vandeninė fezė kuo geriau išgaunama ir analizuojama, pvz., po 2 h, antrojo mėgintuvėlio – po 4 h, trečiojo mėgintuvėlio – po 6 h ir 1.1, kol pasiekiama desorbcijos pusiausvyra.

b) Nuoseklusis metodas: baigus adsorbcijos kinetikos bandymą, mišinys centrifuguojamas ir vandeninė fazė kiek įmanoma daugiau pašalinama. Pašalintas tirpalas pakeičiamas tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl₂ tirpalo be bandomosios medžiagos. Naujas mišinys maišomas tol, kol pasiekiama desorbcijos pusiausvyra. Per tą laiką tam tikrais laiko tarpais mišinys yra centrifuguodamas, kad fazės būtų atskirtos. Maža alikvotinė tirpalo dalis tuojau pat analizuojama, nustatant bandomąją medžiagą; vėliau bandymas tęsiamas su pradiniu mišiniu. Kiekvienos atskiros alikvotinės dalies tūris turi sudaryti mažiau negu 1 % bendro tūrio. Dirvožemio ir tirpalo santykį išlaikant tokį pat, įpilamas toks pat kiekis šviežio 0,01 M CaCl₂ tirpalo. Maišoma, kol ateina kitas laiko tarpas.

Apskaičiuojama kiekvieno laiko momento (D_ti) ir (ar) laiko tarpo (D_Δ_ti) (pagal tyrimo poreikius) desorbcijos procentinė dalis ir braižomas kitimo tam tikrą laiką grafikas. Taip pat apskaičiuojamas desorbcijos koeficientas K_des pusiausvyros sąlygomis. Visos taikomos lygtys pateiktos poskyryje „Duomenys ir ataskaita“ ir 5 priedėlyje.

Desorbcijos kinetikos bandymo rezultatai

Bendri desorbcijos procentinės dalies D_ti ir adsorbcijos A_ti kitimo tam tikrą laiką grafikai leidžia įvertinti adsorbcijos proceso grįžtamumą. Adsorbcija laikoma grįžtamąja, jei laikas, skirtas pasiekti desorbcijos pusiausvyrą, yra trumpesnis už dvigubą laiką, reikalingą pasiekti adsorbcijos pusiausvyrai, o bendroji desorbciją sudaro daugiau negu 75 % adsorbuoto kiekio.

1.9.4.3. Desorbcijos izotermės

Apskaičiuojamos dirvožemių, kuriems buvo apskaičiuojamos adsorbcijos izotermės, Freundlicho desorbcijos izotermės. Desorbcijos bandymas daromas, kaip aprašyta skirsnyje „Desorbcijos kinetika“, išskyrus tai, kad vandeninė fazė analizuojama tik vieną kartą, kai nusistovi desorbcijos pusiausvyra. Apskaičiuojamas desorbuotos bandomosios medžiagos kiekis. Desorbcijos pusiausvyros sąlygomis likęs dirvožemio adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis grafiškai pateikiamas kaip bandomosios medžiagos tirpalo pusiausvyros koncentracijos funkcija (žr. „Duomenys ir ataskaita“ ir 5 priedą).

2 DUOMENYS IR ATASKAITA

Analizės duomenys pateikiami lentelėse (žr. 6 priedą). Pateikiami atskiri matmenys ir apskaičiuotos vidutinės vertės. Adsorbcijos izotermės pateikiamos grafiškai. Apskaičiuojama taip, kaip nurodyta toliau.

Atliekant šį bandymą laikoma, kad 1 cm³ vandeninio tirpalo masė yra 1 g. Dirvožemio ir tirpalo santykis gali būti išreikštas m/m ar m/V, skaitmeninė šių dydžių vertė yra vienoda.

2.1 ADSORBCIJA

Adsorbcija (A_ti) yra išreiškiama bandymo sąlygomis dirvožemio adsorbuotos medžiagos procentine dalimi nuo jos kiekio bandymo pradžioje. Jei

Ą bandomoji medžiaga yra stabili ir indo sienelės jos labai neadsorbuoja, A_ti kiekvienu laiko momentu A_ti apskaičiuojama pagal lygtį:

čia:

A_ti = adsorbcijos procentinė dalis laiko momentu į (%),

m_s^ads(t_i) = laiku t_i dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg),

m_o= bandymo pradžioje mėgintuvėlyje esančios bandomosios medžiagos masė (μg).

Informacija, kaip apskaičiuoti adsorbciją A_ti lygiagrečiuoju ir nuosekliuoju metodu, išsamiai aprašyta 5 priede.

Pasiskirstymo koeficientas K_d yra medžiagos kiekio dirvožemio fazėje ir vandeninio tirpalo masės koncentracijos santykis bandymo sąlygomis, pasiekus adsorbcijos pusiausvyrą.

čia:

C_s^ads (eq) = dirvožemiu adsorbuotos medžiagos kiekis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg x g^-1),

C_aq^ads (eq) = medžiagos vandeninės fazės masės koncentracija adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg x cm^-3). Ši koncentracija nustatoma analizės būdu, atsižvelgiant į vertes, gautas atlikus tuščiuosius bandymus,

m_s^ads (eq) = dirvožemiu adsorbuotos medžiagos masė adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg),

m_aq^ads (eq) = medžiagos masė tirpale adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg),

m_soil = dirvožemio fazės kiekis, išreikštas sauso dirvožemio mase (g),

V_o = su dirvožemiu susijusios vandeninės fazės pradinis tūris (cm³).

A_eq, ir K_d santykis aprašomas lygtimi:

čia:

A_eq = adsorbcijos procentinė dalis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis %.

Pagal organinę anglį normalizuotas adsorbcijos koeficientas K_oc susieja pasiskirstymo koeficientą K_d ir dirvožemio bandinio organinės anglies kiekį:

čia:

%_oc = organinės anglies dirvožemio bandinyje procentinė dalis (g x g^-1).

K_oc koeficientas rodo vienintelę vertę, kuri dažniausiai apibūdina neporinių organinių cheminių medžiagų pasiskirstymą tarp dirvožemio organinės anglies ar nuosėdų ir vandens. Šių cheminių medžiagų adsorbcija susiejama su organinės medžiagos kiekiu adsorbuojančioje kietojoje medžiagoje (7); taigi K_oc vertės priklauso nuo humusinių dalių, kurių sorbcijos galia labai skiriasi dėl kilmės, genezės ir kt. specifinių savybių.

2.1.1. Adsorbcijos izotermės

Freundlicho adsorbcijos izotermių lygtis susieja adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekį ir bandomosios medžiagos tirpalo koncentraciją pusiausvyros sąlygomis (8 lygtis).

Duomenys apdorojami, kaip nurodyta „Adsorbcijos“ poskyrio bendrojoje dalyje, ir kiekvienam mėgintuvėliui po adsorbcijos bandymo apskaičiuojamas dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis (C_s^ads (eq), kitur žymimas x/m). Daroma prielaida, kad pusiausvyra yra pasiekta ir kad C_s^ads (eq) rodo pusiausvyros vertę:

Freundlicho adsorbcijos lygtis pateikta (8):

ar kaip tiesė:

čia:

K_F^ads = Freundlicho adsorbcijos koeficientas; jo dimensija yra cm³ x g^-1, tik jei l/n= 1; visais kitais atvejais į K_F^ads dimensiją įvedamas krypties koeficientas 1/n [μg^1-1/n x (cm³)^1/n x g^-1],

n = regresijos konstanta; 1/n dažniausiai kinta 0,7 – 1,0 ribose. Tai rodo, kad sorbcijos duomenys dažnai yra šiek tiek netiesiški.

Gali būti nubrėžti 8 ir 9 lygčių grafikai ir, taikant 9 lygtį, regresijos analizės metodu apskaičiuojami K_F^ads ir 1/n. Taip pat apskaičiuojamas logaritminės lygties koreliacijos koeficientas r². Tokių grafikų pavyzdys pateiktas 2 pav.

2 pav. Freundlicho adsorbcijos įprastas ir ištiesintas grafikas.

2.1.2 Masių balansas

Masių balansas (MB) apibrėžiamas kaip medžiagos, galinčios būti analiziškai išgautos po adsorbcijos bandymo, procentinė dalis nuo medžiagos vardinio kiekio bandymo pradžioje.

Duomenų apdorojimas skirsis, jei tirpiklis visiškai maišosi su vandeniu. Jei tirpiklis maišosi su vandeniu, ekstrahuojant tirpikliu nustatyti atgaunamos medžiagos kiekį galima taikyti duomenų apdorojimo būdą, aprašytą „Desorbcijos“ poskyryje. Jei tirpiklis su vandeniu maišosi blogiau, reikia nustatyti atgautos medžiagos kiekį.

Adsorbcijos atveju masių balansas MB apskaičiuojamas, kaip nurodyta toliau. Daroma prielaida, kad narys (m_B) atitinka bandomosios cheminės medžiagos, organiniu tirpikliu ekstrahuojamos iš dirvožemio ir nuo bandymų indo sienelių, masių sumą:

čia:

MB= masių balansas (%)

m_E bandomosios medžiagos, dviem etapais ekstrahuotos iš dirvožemio ir nuo sienelių, bendroji masė (μg),

C_o= sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomojo tirpalo pradinė masės koncentracija (μg x cm^-3)

V_rec= adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis išgauto virš nuosėdų tirpalo tūris (cm³).

2.2 DESORBCIJA

Desorbcija (D) apibrėžiama kaip desorbuotos bandomosios medžiagos procentinė dalis nuo medžiagos kiekio, prieš tai adsorbuotos bandymo sąlygomis:

čia:

D_ti = desorbcijos procentinė dalis laiko momentu į (%)

m_aq^des (t_i) = laiko momentu t_i nuo dirvožemio desorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg)

m_s^ads (eq) = adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg).

Informacija, kaip apskaičiuoti desorbcijos procentinę dalį D_ti lygiagrečiuoju ir nuosekliuoju metodu, išsamiai aprašyta 5 priede. Tariamasis desorbcijos koeficientas (K_des) bandymo sąlygomis yra dirvožemio fazėje likusios medžiagos kiekio ir desorbuotos medžiagos vandeninio tirpalo masės koncentracijos santykis pasiekus desorbcijos pusiausvyrą:

čia:

K_des = desorbcijos koeficientas (cm³ x g“¹)

m_aq^ads (eq) = nuo dirvožemio desorbuotos bandomosios medžiagos bendroji masė desorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg)

V_t= atliekant desorbcijos kinetikos bandymą sąlytyje su dirvožemiu esančios vandeninės fazės bendrasis tūris (cm³).

Kaip apskaičiuoti m_aq^des (eq), nurodyta 5 priedo poskyryje „Desorbcija“.

PASTABA. Jei prieš tai atliekant adsorbcijos bandymą buvo taikomas lygiagretusis metodas, laikoma, kad tūris V_T 12 lygtyje yra lygus V_o.

2.2.1 Desorbcijos izotermės

Freundlicho desorbcijos izotermių lygtis susieja desorbcijos pusiausvyros sąlygomis likusios dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekį ir bandomosios medžiagos tirpalo koncentraciją (16 lygtis).

Desorbcijos pusiausvyros sąlygomis likusios dirvožemio adsorbuotos medžiagos kiekis kiekvienam mėgintuvėliui apskaičiuojamas taip:

m_aq^des (eq) yra apibrėžiama taip:

čia:

C_s^des (eq) = bandomosios medžiagos, kuri liko adsorbuota dirvožemiu desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, kiekis (μg x g ),

m_m^des (eq) = medžiagos, analiziškai nustatytos vandeninėje terpėje desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, masė (μg),

m^A_aq = bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl ne visiško tūrio pakeitimo, masė (μg),

m_aq^des (eq) = medžiagos, esančios tirpale adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis, masė (μg)

V^F_r = tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio, norint nustatyti bandomosios medžiagos kiekį desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, tūris (cm³),

V_R= virš nuosėdų esančio tirpalo, pašalinto iš mėgintuvėlio, kai pasiekta adsorbcijos pusiausvyra ir pakeista tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl₂ tirpalo, tūris (cm³).

Freundlicho desorbcijos lygtis pateikta (16):

ar kaip tiesė:

čia:

K_F^des = Freundlicho desorbcijos koeficientas

n = regresijos konstanta,

C_aq^des (eq) = medžiagos vandeninėje fazėje masės koncentracija desorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg x cm^-3).

Gali būti nubrėžti 16 ir 17 lygčių grafikai ir taikant 17 lygtį regresijos analizės metodu apskaičiuojami K^des_F ir 1/n.

PASTABA. Jei Freundlicho adsorbcijos ar desorbcijos laipsnio rodiklis 1/n yra lygus 1, Freundlicho lygčių adsorbcijos ar desorbcijos konstantos (K_F^ads ir K_F^des) bus lygios atitinkamai adsorbcijos ar desorbcijos pusiausvyros konstantoms (K_d ir K_des), ir C_s priklausomybės nuo C_aq grafikas dažniausiai būna tiesė. Jei laipsnių rodikliai nėra lygūs 1, C_s priklausomybės nuo C_aq grafikai nebūna tiesės ir adsorbcijos bei desorbcijos konstantos dažniausiai keičiasi išilgai izotermių.

2.2.2 Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti ši informacija:

- išsamus naudotų dirvožemio bandinių identifikavimas, įskaitant:

- geografinį vietos nurodymą (platuma, ilguma),

- bandinio ėmimo datą,

- kilmę (pvz., žemės ūkio paskirties dirvožemis, miškas ir 1.1),

- bandinio ėmimo gylį,

- smėlio, dumblo, molio kiekį, -pH vertes (0,01 M CaCl₂),

- organinės anglies kiekį,

- organinės medžiagos kiekį,

- azoto kiekį,

- C/N santykį,

- katijonų mainų talpą (mmol/kg),

- visą informaciją apie dirvožemio bandinių rinkimą ir laikymą,

-jei reikia, visą informaciją, reikalingą interpretuoti bandomosios medžiagos adsorbciją ir desorbciją,

- metodus, taikomus nustatant kiekvieną parametrą,

- atitinkama informacija apie bandomąją medžiagą,

- bandymų temperatūra,

- centrifugavimo sąlygos,

- analizės procedūra, taikyta analizuojant bandomąją medžiagą,

- priežastys, kurios pagrįstų soliubilizavimo agento naudojimą ruošiant pradinį bandomosios medžiagos tirpalą,

- skaičiavimuose darytų pataisų aiškinimai, jei reikia,

- duomenys pagal formą (6 priedas) ir grafikai,

- visa informacija ir pastabos, padedančios interpretuoti bandymų rezultatus.

3. NUORODOS

1) Kukowski H. and Brummer G., (1987). Investigations on the Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02 045, Part H.

2) Franzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02 045, Part I.

3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, Collection, Treatment, Characterisatioa Special Publication No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.

4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995 (June 1995).

5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, Series 163 – 1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.

6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 835-Fate, Transport and Transformation TestGuidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.

7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Determining a Sorption Constant (Koc) for an Organic Chemical in Soil and Sediments.

8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.

9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Application for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.

10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment.

11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany.

12) Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and the prediction of the mobilities of pesticides in soils“, in Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).

13) Calvet R., (1980), „Adsorption-Desorption Phenomena“ in Interactions between herbicides and the soil. (R. J. Hance ed.), Academic Press, London, 83 – 122 p.

14) Hasset J. J., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of nonpolar organics by soils and sediments“ in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, 31 – 44 p.

15) van Genuchten M. Th., Davidson J. M., and Wierenga P. J., (1974), „An evaluation of kinetic and eąuilibrium eąuations for the prediction of pesticide movement through porous media“. Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), 29 – 35 p.

16) McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., and Dishburger H. J., (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis“, in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.

17) Lambert S. M., Porter P. E., and Schieferrstein R. H., (1965), „Movement and sorption of chemicals applied to the soil“. Weeds, 13,185 – 190 p.

18) Rhodes R. C, Belasco I. J., and Pease H. L., (1970) „Determination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils“. J.Agric.Food Chem., 18, 524-528 p.

19) Russell M. H., (1995), „Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil“ in Environmental Behaviour of Agrochemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley & Sons Ltd.

20) Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. W. and Holland P. T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides“, IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 901 – 932 p.

21) Guth J. A., Burkhard N., and D. O. Eberle, (1976), „Experimental models for studying the persistence of pesticides in soils“. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 137 – 157 p., BCPC, Surrey, UK.

22) Furminge C. G. L., and Osgerby J. M., (1967), „Persistence of herbicides in soil“. J. Sci. Fd Agric, 18, 269 – 273 p.

23) Burkhard N., and Guth J. A., (1981), „Chemical hydrolysis of 2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption“. Pestic. Sci. 12, 45 – 52 p.

24) Guth J. A., Gerber H. R., and Schlaepfer T., (1977), „Effect of adsorption, movement and persistence on the biological availability of soil-applied pesticides“. Proc. Br. Crop Prot. Conf, 3,961 – 971 p.

25) Osgerby J. M., (1973), „Process affecting herbicide action in soil“. Pestic. Sci., 4,247 – 258 p.

26) Guth J. A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von Pflanzenschutzmitteln in Boden“. Schr. Reihe Ver. Wass. -Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, 143 – 154 p.

27) Hamaker J. W., (1975), „The interpretation of soil leaching experiments“, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), 135 – 172 p., Plenum Press, NY.

28) Helling C. S., (1971), „Pesticide mobility in soils“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc, 35, 732 – 210 p.

29) Hamaker J. W., (1972), „Diffusion and volatilization“ in Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J. W. Hamaker eds), Vol. I, 49-143 p.

30) Burkhard N. and Guth J. A., (1981), „Rate of volatilisation of pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results with those determined in a laboratory model system“. Pestic. Sci. 12, 37 – 44 p.

31) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F., and Enfield C.G., (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, 297 – 325 p., Acs Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.

32) Gustafson D. L, (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple method for assessing pesticide leachability“. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), 339 – 357 p.

33) Leistra M., and Dekkers W. A., (1976). „Computed effects of adsorption kinetics on pesticide movement in soils“. J. of Soil Sci., 28, 340 – 350 p.

34) Bromilov R. H., and Leistra M., (1980), „Measured and simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fellow soils“. Pest. Sci., 11,389 – 395 p.

35) Green R. E., and Karickoff S. W., (1990), „Sorption estimates for modeling“, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., Book Series no. 2, 80-101 p.

36) Lambert S. M., (1967), „Functional relationship between sorption in soil and chemical structure“. J. Agri. Food Chem., 15,572 – 576 p.

37) Hance R. J., (1969), „An empirical relationship between chemical structure and the sorption of some herbicides by soils“. J. Agri. Food Chem., 17, 667-668 p.

38) Briggs G. G. (1969), „Molecular structure of herbicides and their sorption by soils“. Nature, 223, 1288.

39) Briggs G. G. (1981). „Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor“. J. Agric. Food Chem., 29, 1050 – 1059 p.

40) Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of soil sorption of organic polutance by molecular topology“. J. Agric. Food Chem., 32, 243-246 p.

41) Bailey G. W., and White J. L., (1970), „Factors influencing the adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil“. Residue Rev., 32,29 – 92 p.

42) Bailey G. W., J. L. White and Y. Rothberg., (1968), „Adsorption of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 32:222 – 234 p.

43) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natūrai sediments and soils“. Chemosphere 10, 833-846 p.

44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners“. Environ. Toxicol. Safety 21,1 – 17 p.

45) Hamaker J. W., and Thompson J. M., (1972), „Adsorption in organic chemicals“ in Organic Chemicals in the Soil Environment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and n, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972,49 – 143 p.

46) Deli J., and Warren G. F., 1971, „Adsorption, desorption and leaching of diphenamid in soils“. Weed Sci. 19: 67 – 69 p.

47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, (1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils“. Weed Science, Vol. 23,454 – 457 p.

48) Haues M. H. B., Stacey M., and Thompson J. M., (1968), „Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations“ in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.

49) Pionke H. B., and Deangelis R. J., (1980), „Methods for distributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase“, CREAMS, in A Field Scale Model for Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.

50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition (1994).

51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 1 1th edition.

52) Black, Evans D. D., White J. L.,EnsmingerL. E., and Clark F. E., eds. „Methods of Soil Analysis“, Vol 1 and 2, American Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.

53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality-Sampling-Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.

54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance on sampling techniques.

55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality- Sampling -Part 3: Guidance on safety of sampling.

56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality -Sampling – Part 4: Guidance on the investigation of natūrai and cultivated soils.

57) ISO/DIS 103 81 -5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.

58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

59) Green R. E., and Yamane V. K., (1970), „Precision in pesticide adsorption measurements“. Soil Sci. Am. Proc, 34, 353 – 354 p.

60) Grover R., and Hance R. J. (1970), „Effect of ratio of soil to water on adsorption of linuron and atrazine“. Soil Sci., 109 – 138 p.

61) Boesten, J. J. T. I, „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients inpesticide/soil system“. Pest. Sci. 1990,30,31 – 41 p.

62) Boesten, J. J. T. I. „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106“. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26 – 29 April 1994.

63) Bastide J., Cantier J. M., et Coste C, (1980), „Comportement de substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimiąue“. Weed Res. 21,227-231 p.

64) Brown D. S., and Flagg E. W., (1981), „Empirical prediction of organic pollutants sorption in natūrai sediments“. J. Environ.Qual., 10(3), 382 – 386 p.

65) Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W., (1983), „Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water“. Environ. Sci. Technol, 17(4), 227 – 231 p.

66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic substances by soils and sediments“. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), 297 — 312 p.

67) Vowles P. D., and Mantoura R. F. C, (1987), „Sediment-water partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons“. Chemosphere, 16(1), 109- 116 p.

68) Lyman W. J., Reehl W. F.and Rosenblatt D. H. (1990). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.

69) Keniga E. E., and Goring, C. A. I. (1980). „Relationship between water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota“ in Aquatic Toxicology (eds J.G. Eaton, et ai), 78 – 115 p., ASTM STP 707, Philadelphia.

70) Chiou C. T., Peters L. J., and Freed V. H., (1979), „A physical concept of soil-water eąuilibria for non-ionic organic compounds“. Science, Vol. 206, 831-832 p.

71) Hassett J. J., Banwart W. L, Wood S. G., and Means J. C, (1981), „Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption“. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, 38 – 42 p.

72) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natūrai sediments and soils“. Chemosphere, Vol. 10(8), 833-846 p.

73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilitė-reactivitė“. Revue de l'Agric, 34 (4), 319-322 p.

74) Mūller M., Kordel W. (1996), „Comparison of screening methods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil“. Chemosphere, 32(12), 2493 – 2504 p.

75) Kordel W., Kotthoff G., Mūller M. (1995), „HPLC – screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil – results of a ring test“. Chemosphere 30 (7), 1373 – 1384 p.

76) Kordel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC – screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil – comparison of different stationary phases“. Chemosphere 27 (12), 2341 – 2352 p.

77) Hance, R. J., (1967), „The Speed of Attainment of Sorption Eąuilibria in Some Systems Involving Herbicides“. Weed Research, Vol. 7,29 – 36 p.

78) Koskinen W. C, and Harper S. S., (1990), „The retention processes: mechanisms“ in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.

79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield C. G. (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, 297 – 325 p, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.

80) Giles C. H., (1970), „Interpretation and use of sorption isotherms“ in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37,14 – 32 p.

81) Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, (1960), „Studies in adsorption: XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils“. J. Chem. Soc, 3973 – 93 p.

82) Calvet R., Tercė M., and Arvien J. C, (1980), „Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caracteristiąues generales de l'adsorption“. Ann. Agron. 31: 239 — 251 p.

83) Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich eąuation“, Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environment, 13 – 15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.

84) Guth, J. A., (1985), „Adsorption/desorption“, in Joint International Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.

85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).

1 priedas

BANDYMO PLANAS

2 priedas

ANALIZĖS METODO TIKSLUMO IR KONCENTRACIJOS POKYČIO ĮTAKA ADSORBCIJOS REZULTATŲ TIKSLUMUI

Iš toliau pateikiamos lentelės (84) matyti, kad jei tirpale esančios bandomosios medžiagos pradinės masės (m₀ =110 μg) ir pusiausvyros masės m_aq^ads (eq) = 100 μg) skirtumas labai mažas (nes yra 5 % paklaida), tai matuojant pusiausvyros koncentraciją susidaro 50 % paklaida, kai apskaičiuojamas dirvožemiu adsorbuotos medžiagos masė m_s^ads (eq), ir 52,4 % paklaida, apskaičiuojant K_d.

Dirvožemio kiekis m_soil = 10 g Tirpalo tūris V₀=100cm³

m_aq^ads (eq)	C_aq^ads (eq)	R	m_s^ads (eq)*	C_s^ads (eq)*	R*	K_d*	R*
	(μg x cm^-3)		(μg)	(μg x g^-1)
(μg)

m_o=110 μg ar				A = 9 %
m_o=110 μg ar	100	1,000	Tikroji vertė	10	1,00	Tikroji vertė	1
C_o= 1,100 μg /cm³
C_o= 1,100 μg /cm³	101	1,010	1%	9	0,90	10%	0,891	10,9 %
	105	1,050	5%	5	0,50	50%	0,476	52,4 %
	109	1,090	9%	1	0,10	90%	0,092	90,8 %
m_o=110 μg ar				A = 55 %
m_o=110 μg ar	50,0	0,500	Tikroji vertė	60,0	6,00	tikroji vertė	12,0
C_o= 1,100 μg /cm³	50,5	0,505	1%	59,5	5,95	0,8 %	11,78	1,8 %
	52,5	0,525	5%	57,5	5,75	4,0 %	10,95	8,8 %
	55,0	0,550	10%	55,0	5,50	8,3 %	10,00	16,7 %
m_o=110 μg ar				A = 99 %
m_o=110 μg ar	1,100	0,011	tikroji vertė	108,9	10,89	tikroji vertė	990
C_o= 1,100 μg /cm³	1,111	0,01111	1%	108,889	10,8889	0,01 %	980	1,0 %
	1,155	0,01155	5%	108,845	10,8845	0,05 %	942	4,8 %
	1,21	0,0121	10%	108,790	10,8790	0,10%	899	9,2 %

Čia:

m_s^ads (eq) = bandomosios medžiagos dirvožemio fazėje masė pusiausvyros sąlygomis, μg,

m_aq^ads (eq) = bandomosios medžiagos vandeninėje fazėje masė pusiausvyros sąlygomis, μg,

C_s^ads (eq) = bandomosios medžiagos dirvožemio fazėje kiekis pusiausvyros sąlygomis, μg x g^-1,

C_aq^ads (eq) = bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija pusiausvyros sąlygomis, μg x cm^-3,

R = analizinė paklaida nustatant m_aq^ads (eq),

R*= apskaičiuota paklaida dėl analizinės paklaidos R.

3 priedas

K_d VERTINIMO METODAI

1. Vertinimo metodai leidžia daryti K_d vertės prognozę, pagrįstą koreliacija, su, pvz., P_owvertėmis (12) (39) (63 – 68), tirpumo vandenyje duomenimis (12) (19) (21) (39) (68 – 73) ar poliškumo duomenimis, gautais taikant atvirkštinių fazių HPLC metodą (74 – 76). Kaip parodyta 1 ir 2 lentelėse, pagal tas lygtis apskaičiuojamos K_oc ar K_om vertės ir vėliau netiesiogiai pagal šias lygtis apskaičiuojama K_d:

2. Šių koreliacijų koncepcija pagrįsta dviem prielaidomis: 1) dirvožemio organinė medžiaga, kuri daro didžiausią įtaką medžiagos adsorbcijai; ir 2) vykstančios sąveikos dažniausiai yra nepolinės. Todėl šios koreliacijos: 1) netinka arba tik iš dalies tinka polinėms medžiagoms, ir 2) netinka tais atvejais, kai organinės medžiagos dirvožemyje kiekis yra labai mažas (12). Be to, nors tarp P“„ ir adsorbcijos buvo nustatytos patenkinamos koreliacijos (19), to negalima pasakyti apie tirpumo vandenyje ir adsorbcijos laipsnio priklausomybę (19) (21); taigi tyrimai yra labai prieštaringi.

3. Kai kurie adsorbcijos koeficiento ir oktanolio-vandens pasiskirstymo koeficiento bei tirpumo vandenyje koreliacijų pavyzdžiai pateikti atitinkamai 1 ir 2 lentelėje.

1 lentelė. Adsorbcijos pasiskirstymo koeficiento ir oktanolio-vandens pasiskirstymo koeficiento koreliacijos pavyzdžiai; kiti pavyzdžiai pateikti (12) (68)

Medžiagos	Koreliacijos lygtys	Autoriai
Karbamido pakaitalai	log K_om = 0,69 + 0,52 log P_ow	Briggs(1981)(39)
Chlorinti aromatiniai junginiai	log K_oc = – 0,779 + 0,904 log P_ow	Chiouetal. (1983) (65)
Įvairūs pesticidai	log K_om = 4,4 + 0,72 log P_ow	Gerstl and Mingelgrin (1984) (66)
Aromatiniai angliavandeniliai	log K_oc =-2,53+ 1,15 log P_ow	Vowles and Mantoura (1987) (67)

2 lentelė. Adsorbcijos pasiskirstymo koeficiento ir tirpumo vandenyje koreliacijos pavyzdžiai; kiti pavyzdžiai pateikti (68), (69)

Junginiai	Koreliacijos lygtys	Autoriai
Įvairūs pesticidai	log K_om = 3,8 -0,561 log S_w	Gerstl and Mingelgrin (1984) (66)
Alifatinės, aromatinės chlorintos medžiagos	log K_om = (4,040 ±0,038)-(0,557 ±0,012) log S_w	Chiouetal. (1979) (70)
a – naftolis	log K_oc = 4,273-0,686 log S_w	Hassetetal.(1981)(71)
Ciklinės, alifatinės aromatinės medžiagos	log K_oc = – 1,405 – 0,921 log S_w -0,00953 (mp-25)	Karickhoff (1981) (72)
Įvairūs junginiai	log K_om = 2,75-0,45 log S_w	Moreale van Blade (1982) (73)

4 priedas

SKAIČIAVIMAI CENTRIFUGAVIMO SĄLYGOMS APIBRĖŽTI

1. Centrifugavimo trukmė nustatoma pagal šią formulę, darant prielaidą, kad dalelės yra rutulio formos:

Siekiant supaprastinti, visi paramerai yra išreikšti ne SI vienetais (g, cm).

Čia:

ω= sukimosi greitis (=2П x rpm/60), rad x s^-1;

rpm= apsukų dažnis, min^-1;

η = tirpalo klampumas, g x s^-1 x cm^-1;

r_p = dalelių spindulys, cm;

ρ_s = dirvožemio tankis, g x cm^-3;

ρ_aq = tirpalo tankis, g x cm^-3;

R_t = nuotolis nuo centrifugos rotoriaus centro iki tirpalo centrifugavimo mėgintuvėlyje viršaus, cm;

R_b = nuotolis nuo centrifugos rotoriaus centro iki tirpalo centrifugavimo mėgintuvėlyje apačios, cm;

R_b – R_t = dirvožemio ir tirpalo mišinio stulpelio centrifugavimo mėgintuvėlyje ilgis, cm.

Kad būtų garantuotas visiškas atskyrimas, praktikoje taikoma trukmė dažniausiai yra dvigubai ilgesnė už apskaičiuotąją.

2. Pirmoji lygtis gali būti dar supaprastinta, darant prielaidą, kad tirpalo klampumas (η) ir tankis (ρ_aq) yra lygūs vandens klampumui ir tankiui 25 °C temperatūroje; taigi η = 8,95 x 10^-3 g x s^-1 x cm^-1 ir ρa, = 1,0 g x cm^-3.

Tuomet centrifugavimo trukmė išreiškiama 2 lygtimi:

3. Iš 2 lygties aišku, kad norint pasiekti tam tikro dydžio dalelių atsiskyrimą (mūsų atveju 0,1 μm spindulio) centrifugavimo sąlygoms, t. y. laikui (t) ir apsukų dažniui (min^-1), apibrėžti yra svarbūs du parametrai: 1) dirvožemio tankis ir 2) mišinio stulpelio centrifugavimo mėgintuvėlyje ilgis (Rb – Rt), t. y. nuotolis, kurį dirvožemio dalelė įveikia nuo tirpalo viršaus iki mėgintuvėlio dugno; akivaizdu, kad tam tikro tūrio mišinio stulpelio mėgintuvėlyje ilgis priklauso nuo mėgintuvėlio spindulio, pakelto kvadratu.

4. 1 pav. pavaizduota centrifugavimo trukmės (t) priklausomybė nuo centrifugos apsukų dažnio (r.p.m, min^-1), esant skirtingiems dirvožemių tankiams (ρ_s) (1a pav.) ir skirtingiems mišinio stulpelio centrifugavimo mėgintuvėlyje ilgiams (1b pav.). Iš 1a pav. matyti, kad dirvožemio tankio įtaka yra akivaizdi; pvz., tradicinis centrifugavimas 3000 min^-1 dažniu trunka maždaug 240 min, kai dirvožemio tankis 1,2 g x cm^-3, tuo tarpu ši trukmė yra tik 50 min, jei tankis 2,0 g x cm^-3. Panašiai, pagal 1b pav., centrifuguojant tradiciniu 3000 min^-1 dažniu, centrifugavimo trukmė yra maždaug 50 min, jei mišinio stulpelio ilgis lygus 10 cm, ir tik 7 min, jei ilgis lygus 1 cm. Tačiau svarbu rasti optimalų centrifugavimo sąlygų, kai turi būti kuo mažesnis stulpelio ilgis, ir galimybės bandymą atliekančiajam lengvai atskirti fazes po centrifugavimo santykį.

5. Be to, apibrėžiant bandymų sąlygas dirvožemio ir tirpalo fazėms atskirti, svarbu atsižvelgti į galimą trečios „pseudofazės“ koloidinių dalelių buvimą. Šios dalelės, kurios yra mažesnės negu 0,2 μm, gali daryti reikšmingą įtaką visam medžiagos adsorbcijos dirvožemio suspensija mechanizmui. Centrifuguojant taip, kaip aprašyta pirmiau, koloidinės dalelės lieka vandeninėje fazėje ir analizuojamos kartu su ja. Taigi prarandama informacija apie jų poveikį.

Jei bandymus atliekanti laboratorija turi ultracentrifugavimo ar ultrafiltravimo priemonių, medžiagos adsorbcija ir desorbcija dirvožemiu galėtų būti ištirta išsamiau, įskaitant informaciją apie medžiagos adsorbciją koloidinėmis dalelėmis. Šiuo atveju norint atskirti tris fazes: dirvožemį, koloidines daleles ir tirpalą, turi būti taikomas ultracentrifugavimas 60000 min^-1 apsukų dažniu ar ultrafiltravimas pro filtrą, kurio akytumas 100 000 Daltonų. Atitinkamai turi būti pakeistas bandymų protokolas, kad visos trys fazės būtų išanalizuotos.

Centrifugos apsukų dažnis (min^-1)

1a pav. Centrifugavimo trukmės (t) priklausomybė nuo centrifugos apsukų dažnio (min^-1), esant skirtingam dirvožemio tankiui (ρ_s). R_t = 10 cm, R_b – R_t = 10 cm, η = 8,95 x 10^-3 g x s^-1 x cm^-1 ir ρ_ad = 1,0 g x cm^-3 25 °C temperatūroje

Centrifugos apsukų dažnis (min^-1)

1b pav. Centrifugavimo trukmės (t) priklausomybė nuo centrifugos apsukų dažnio (min^-1), esant skirtingam mišinio stulpelio centrifugavimo mėgintuvėlyje ilgiui (R_b – R_t) = L; R_t = 10 cm, η = 8,95 x 10^-3 g x s^-1 x cm^-1, ρ_aq = 1,0 g x cm^-3 25 °C temperatūrai ir ρ_s = 2,0 g x cm^-3

5 priedas

ADSORBCIJOS A (%) IR DESORBCIJOS D (%) APSKAIČIAVIMAS

Metodikai taikyta laiko schema:

Darant visus skaičiavimus taikoma prielaida, kad bandomoji medžiaga yra stabili, ir jos labai neadsorbuoja indo sienelės.

ADSORBCIJA A (A%)

a) Lygiagretusis metodas

Kiekvienam mėgintuvėliui (i) kiekvienu laiko momentu (t_i) adsorbcijos procentinė dalis apskaičiuojama pagal lygtį:

^{^[4]}

Šios lygties nariai gali būti apskaičiuoti taip:

čia:

A_ti = adsorbcijos procentinė dalis (%) laiko momentu t,

m_s^ads (t_i) = dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė laiko momentu t_i, kai buvo atliekama analizė (μg),

m_o = bandymo pradžioje mėgintuvėlyje buvusios bandomosios medžiagos masė (μg),

C_o= sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomojo tirpalo pradinė masės koncentracija (μg x cm^-3),

C_aq^ads (t_i)= medžiagos vandeninės fazės masės koncentracija laiko momentu t, kai atliekama analizė (μg x cm^-3); ši koncentracija nustatoma analizės būdu, atsižvelgiant į tuščiuosiuose bandymuose gautas vertes,

V_o= sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomojo tirpalo pradinis tūris (cm³).

Adsorbcijos procentinės dalies A_ti ar C_aq^ads (t_i) vertės pažymimos grafike pagal laiką ir nustatomas sorbcijos pusiausvyros pasiekimo laikas. Tokių grafikų pavyzdžiai pateikti atitinkamai 1 pav. ir 2 pav.

1 pav. Adsorbcijos pusiausvyros grafikas

2 pav. Bandomosios medžiagos masės koncentracijos vandeninėje fazėje (C_m) kaita tam tikrą laiką

b) Nuoseklusis metodas

Toliau pateiktose lygtyse atsižvelgiama į tai, kad pagal adsorbcijos matavimo metodiką bandomosios medžiagos kiekis tam tikrais laiko tarpais nustatomas mažose vandeninės fazės alikvotinėse dalyse.

- Kiekvienam laiko tarpui dirvožemiu adsorbuotos medžiagos kiekis apskaičiuojamas taip:

- pirmajam laiko tarpui Δt₁ = t₁- t_o

- antrajam laiko tarpui Δt₂ = t₂ – t₁

- trečiajam laiko tarpui Δt₂ t₃ = t₃ – t₂

- n-tajam laiko tarpui Δt_n = t_n – t_n-1

- Kiekvienam laiko tarpui procentinė adsorbcijos dalis, A_Δti apskaičiuojama pagal šią lygtį:

^{^[5]}

tuo tarpu procentinė adsorbcijos dalis (A_ti) laiko momentu t apskaičiuojama pagal lygtį:

^{^[6]}

Adsorbcijos vertės A_ti (arba atsižvelgiant į tai, kuri reikalinga tyrimui) pažymimos grafike pagal laiką ir nustatomas sorbcijos pusiausvyros

pasiekimo laikas.

Pusiausvyros pasiekimo laiku t_i:

- dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė lygi:

^{^[7]}

- bandomosios medžiagos tirpale masė yra lygi:

^{^[8]}

- ir adsorbcijos procentinė dalis pusiausvyros sąlygomis yra lygi:

^{^[9]}

Pirmiau naudoti parametrai apibrėžiami kaip:

m_s^ads (t₁), m_s^ads (t₂),..., m_s^ads (t_n)= bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu atitinkamai per laiko tarpus Δt₁, Δt₂,..., Δt_n masė (μg),

m_m^ads (t₁), m_m^ads (t₂),..., m_m^ads (t_n)= alikvotinėje tirpalo dalyje V^A_a, atitinkamai laiko momentu t₁, t₂,..., t_n nustatyta bandomosios medžiagos masė (μg),

m_s^ads (eq)= adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis dirvožemiu adsorbuotos medžiagos masė (μg),

m_aq^ads (eq)= adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis tirpale esančios medžiagos masė (μg),

V^A_a = alikvotinės dalies, kurioje nustatoma bandomoji medžiaga, turis (cm ),

A_Δti = adsorbcijos, atitinkančios laiko tarpą Δt_i, procentinė dalis (%),

A_eq = adsorbcijos procentinė dalis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (%).

DESORBCIJA D (%)

Laikas to, kuris laikomas desorbcijos kinetikos bandymo pradžia, yra tas momentas, kai kuo didesnis išgauto bandomosios medžiagos tirpalo tūris (po to, kai pasiekiama adsorbcijos pusiausvyra) yra pakeičiamas tokiu pat 0,01 M CaCl₂tirpalo tūriu.

a) Lygiagretusis metodas

Laiko momentu t_i matuojama masė bandomosios medžiagos, esančios iš mėgintuvėlio i paimtame vandeninės terpės tūryje (Vⁱ_r), ir desorbuotos medžiagos masė apskaičiuojama pagal lygtį:

Desorbcijos pusiausvyros sąlygomis t_i = t_eq, todėl per laiko tarpą (Δt_i) desorbuotos medžiagos masė nustatoma pagal lygtį:

Desorbcijos procentinė dalis apskaičiuojama:

- laiko momentu t_i pagal lygtį:

- ir per laiko tarpą (Δt_i) pagal lygtį:

čia:

D_ti = desorbcijos procentinė dalis laiko momentu t_i (%),

D_Δti = desorbcijos procentinė dalis, atitinkanti laiko tarpą Δt_i (%),

m_aq^des (t_i)= laiko momentu t_i desorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg),

m_aq^des (Δt_i) ⁼ per laiko tarpą Δt_i desorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg),

m_m^des (t_i) = bandomosios medžiagos, analizės būdu nustatytos laiko momentu t_i analizei paimtame tirpalo tūryje Vⁱ_r, masė (μg),

m^A_aq = bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl nevisiško tūrio pakeitimo, masė (μg):

m_aq^ads (eq)= tirpale esančios bandomosios medžiagos masė adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg),

V_R= tirpalo virš nuosėdų, pašalinto iš mėgintuvėlio pasiekus adsorbcijos pusiausvyrą ir pakeisto tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl₂ tirpalo, tūris (cm³),

V_rⁱ = tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti atliekant desorbcijos kinetikos bandymą, tūris (cm³).

Desorbcijos vertės D_tiarba D_Δti (žiūrint, kuri reikalinga tyrimui) pažymimos pagal laiką grafike ir nustatomas desorbcijos pusiausvyros pasiekimo laikas.

b) Nuoseklusis metodas

Šiose lygtyse atsižvelgta į tai, kad anksčiau taikytoje adsorbcijos metodikoje bandomoji medžiaga buvo nustatinėjama nedidelėse vandeninės fazės alikvotinėse dalyse (V^A_a) (lygiagretusis metodas pagal 1.9 poskyrį „Bandymo eiga“). Daroma prielaida, kad: a) po adsorbcijos kinetikos bandymo iš mėgintuvėlio pašalintas tirpalas virš nuosėdų buvo pakeistas tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl₂ tirpalo (V_R) ir b) sąlytyje su dirvožemiu esančios vandeninės fazės bendras tūris (V_T) atliekant desorbcijos kinetikos bandymą yra pastovus ir apibrėžiamas lygtimi:

Laiko momentu į:

- bandomosios medžiagos masė matuojama mažame alikvotinės dalies tūryje V_a^D ir desorbuotos medžiagos masė apskaičiuojama pagal lygtį:

- desorbcijos pusiausvyros sąlygomis t_i = t_eq, todėl m_aq^des (t_i)= m_aq^des (eq),

- desorbcijos procentinė dalis D_ti apskaičiuojama pagal šią lygtį:

Per laiko tarpą (Δt_i):

Per kiekvieną laiko tarpą desorbuotos medžiagos kiekis apskaičiuojamas taip:

- pirmajam laiko tarpui Δt₁= t₁-t_o

- antrajam laiko tarpui Δt₂= t₂-t₁

- n-tajam laiko tarpui Δt_n= t_n-t_n-1

Galiausiai desorbcijos procentinė dalis kiekvienam laiko tarpui D_Δti apskaičiuojama pagal šią lygtį:

tuo tarpu desorbcijos procentinė dalis D_ti laiko momentu t_i nustatoma pagal lygtį:

Šiose lygtyse naudoti parametrai apibrėžiami kaip:

m_s^des (t₁), m_s^des (t₂),..., m_s^des (t_n)=	medžiagos, kuri dar liko adsorbuota dirvožemiu pasibaigus atitinkamai laiko tarpams Δt₁, Δt₂,..., Δt_n, masė (μg),
m_aq^des (t₁), m_aq^des (t₂),..., m_aq^des (t_n)=	bandomosios medžiagos, desorbuotos atititinkamai per laiko tarpus Δt₁, Δt₂,..., Δt_n, masė (μg),

m_m^des (t₁), m_m^des (t₂),.., m_m^des (t_n)=		medžiagos masė, nustatyta alikvotinės dalies tūryje V^D_a atitinkamai laiko momentais t₁, t₂,..., t_n, (μg),
V_T	=	vandeninės fazės, esančios sąlytyje su dirvožemiu atliekant desorbcijos kinetikos bandymą pagal nuoseklųjį metodą, bendras tūris (cm³),
m^A_aq	=	bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl ne visiško tūrio pakeitimo, masė (μg),
m^A_aq	=
V_R	=	tirpalo virš nuosėdų, pašalinto iš mėgintuvėlio pasiekus adsorbcijos pusiausvyrą ir pakeisto tokiu pat tūriu 0,01 M CaCb tirpalo, tūris (cm³),
V^D_a	=	tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti, atliekant desorbcijos kinetikos bandymą, alikvotinės dalies tūris (cm³):

6 priedas

DIRVOŽEMIŲ ADSORBCIJA IR DESORBCIJA: DUOMENŲ PATEIKIMO LENTELĖS

Bandyta medžiaga:

Bandytas dirvožemis:

Sauso dirvožemio masės dalis (105 °C, 12 h): %

Temperatūra: °C

Analizės metodo tinkamumas

Pasverta dirvožemio	g
Sauso dirvožemio masė	g
CaCl₂ tirpalo tūris	cm³
Galutinio tirpalo vardinė koncentracija	μg x cm^-3
Galutinio tirpalo analizinė koncentracija	μg x cm^-3

Taikyto analizės metodo esmė:

Analizės metodo kalibravimas:

Bandyta medžiaga:

Bandytas dirvožemis:

Sauso dirvožemio masės dalis (105 °C, 12 h): %

Temperatūra: °C

Taikytas analizės metodas:

Netiesioginis  Tiesioginis 

Lygiagretusis 

Nuoseklusis 

Adsorbcijos bandymas: bandiniai

	Simbolis	Vienetai	Pusiausvyros nusistovėjimo laikas	Pusiausvyros nusistovėjimo laikas	Pusiausvyros nusistovėjimo laikas	Pusiausvyros nusistovėjimo laikas
Mėgintuvėlio Nr.
Pasverta dirvožemio	-	g
Sauso dirvožemio masė	m_soil	g
Vandens tūris pasvertame dirvožemyje (apskaičiuotas)	V_WS	cm³
0,01 M CaCl₂ tirpalo tūris pusiausvyrai su dirvožemiu pasiekti Pradinio tirpalo tūris		cm³
Su dirvožemiu sąlytyje esančios vandeninės fazės bendras tūris	V_o	cm³
Bandomosios medžiagos tirpalo pradinė koncentracija	C_o	μg x cm^-3
Bandomosios medžiagos masė bandymo pradžioje	m_o	μg

Po sumaišymo ir centrifugavimo

Netiesioginis metodas

Lygiagretusis metodas

Bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija, įskaitant tuščiojo bandymo pataisą

C_aq^ads (t_i)

μg x cm^-3

Nuoseklusis metodas

V^A_a Alikvotinės tirpalo dalies tūryje išmatuota medžiagos masė

m_aq^ads (t_i)

μg

Tiesioginis metodas

Dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė

m_s^ads (t_i)

μg

Adsorbcijos apskaičiavimas

Adsorbcija	A_ti	%
Adsorbcija	A_Δti	%
Vidutinės vertės
Adsorbcijos koeficientas	K_d	cm³ x g^-1
Vidutinės vertės
Adsorbcijos koeficientas	K_oc	cm³ x g^-1
Vidutinės vertės

Bandyta medžiaga:

Bandytas dirvožemis:

Sauso dirvožemio masės dalis (105 °C, 12 h): %

Temperatūra: °C

Adsorbcijos bandymas: tuštieji ir kontroliniai bandymai

	Simbolis	Vienetai	Tuščiasis	bandymas	Tuščiasis	bandymas	Kontrolinis	bandymas
Mėgintuvėlio Nr.
Pasverta dirvožemio		g					0	0
Vandens tūris pasvertame dirvožemyje (apskaičiuotas)		cm³
Įpilto 0,01 M CaCl₂ tirpalo tūris		cm³
Įpiltas bandomosios medžiagos pradinio tirpalo tūris		cm³	0	0	0
Bendras vandeninės fazės tūris (apskaičiuotas)		cm³
Pradinė bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija		μg x cm^-3

Po sumaišymo ir centrifugavimo

Vandeninės fazės koncentracija

μg x cm^-3

PASTABA. Prireikus stulpelių gali būti ir daugiau

Bandyta medžiaga:

Bandytas dirvožemis:

Sauso dirvožemio masės dalis (105 °C, 12 h): %

Temperatūra: °C

Masių balansas

	Simbolis	Vienetai
Mėgintuvėlio Nr.
Pasverta dirvožemio	-	g
Sauso dirvožemio masė	m_soil	g
Vandens tūris pasvertame dirvožemyje (apskaičiuotas)	V_WS	ml
0,01 M CaCk tirpalo tūris pusiausvyrai su dirvožemiu pasiekti		ml
Pradinio tirpalo tūris		cm³
Su dirvožemiu sąlytyje esančios vandeninės fazės bendras tūris	V_o	cm³
Bandomosios medžiagos tirpalo pradinė koncentracija	C_o	μg x cm^-3
Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė	-	h

Po sumaišymo ir centrifugavimo

bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija, skaitant tuščiojo bandymo pataisą	C_aq^ads (eq)	μg x cm^-3
'usiausvyros nusistovėjimo trukmė	t_aq	h

1-asis praskiedimas tirpikliu

Nupiltos vandeninės fazės tūris	V_rec	cm³
Įpilto tirpiklio tūris	ΔV	cm³

1-asis ekstraliavimas tirpikliu

Tirpiklio fazėje analizuojamos medžiagos signalas	S_b1	įv.
Tirpiklyje ištirpusios bandomosios medžiagos koncentracija	C_b1	μg x cm^-3
Medžiagos, ekstrahuotos iš dirvožemio ir nuo indo sienelių, masė	m_B1	μg

2-asis praskiedimas tirpikliu

Nupilto tirpiklio tūris	ΔV_s	cm³
Įpilto tirpiklio tūris	ΔV‘	cm³

2-asis ekstraliavimas tirpikliu

Tirpiklio fazėje analizuojamos medžiagos signalas	S_b2	įv.
Tirpiklyje ištirpusios bandomosios medžiagos koncentracija	C_b2	μg x cm^-3
Medžiagos, ekstrahuotos iš dirvožemio ir nuo indo sienelių, masė	m_B2	μg
Dviejų etapų ekstrahuotos bandomosios medžiagos bendroji masė	m_E	μg
Masių balansas	MB	%

Bandyta medžiaga:

Bandytas dirvožemis:

Sauso dirvožemio masės dalis (105 °C, 12 h): %

Temperatūra: °C

Adsorbcijos izotermės

	Simbolis	Vienetai
Mėgintuvėlio Nr.
Pasverta dirvožemio	-	g
Sauso dirvožemio masė	E	g
Vandens tūris pasvertame dirvožemyje (apskaičiuotas)	V_WS	ml
0,01 M CaCk tirpalo tūris pusiausvyrai su dirvožemiu pasiekti		ml
Įpilto pradinio tirpalo tūris		cm³
Su dirvožemiu sąlytyje esančios vandeninės fazės bendras tūris (apskaičiuotas)	V_o	cm³
Tirpalo koncentracija Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė	C_o	μg x cm^-3

Po sumaišymo ir centrifugavimo

Bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija, įskaitant tuščiojo bandymo pataisą	C_aq^des (eq)	μg x cm^-3
Temperatūra		°C
Adsorbuotos medžiagos masė, tenkanti dirvožemio masės vienetui	C_aq^des (eq)	μg x g^-1

Regresijos analizė:

K_F^ads vertė:

l/n vertė:

regresijos koeficientas r²:

Bandyta medžiaga: Bandytas dirvožemis:

Sauso dirvožemio masės dalis (105 °C, 12 h): %

Temperatūra: °C

Taikytas analizės metodas:

Netiesioginis  Tiesioginis 

Lygiagretusis 

Nuoseklusis 

Desorbcijos bandymas

		Simbolis	Vienetai	Laiko tarpas	Laiko tarpas	Laiko tarpas	Laiko tarpas
Mėgintuvėlio, gauto iš adsorbcijos etapo, Nr.
Adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis dirvožemio adsorbuotos medžiagos masė		m_s^ads (eq)	„g
Pašalintos vandeninės fazės tūris, pakeistas 0,01 M CaCl₂		V_r	cm³
Su dirvožemiu sąlytyje esančios vandeninės fazės bendras tūris (apskaičiuotas)	LM NM	V_o V_T	cm³ cm³
Bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl nevisiško tūrio pakeitimo, masė		m^A_aq	μg

Desorbcijos kinetika

Laiko momentu į nuo dirvožemio desorbuotos medžiagos išmatuota masė		m_m^des (t_i)	μg
Tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomajai medžiagai nustatyti, tūris	LM	Vⁱ_r	cm³
	NM	Vⁱ_r	cm³
Laiko momentu t_i nuo dirvožemio desorbuotos medžiagos masė (apskaičiuota)		m_aq^des (t_i)	μg
Per laiko tarpą Δt_i nuo dirvožemio desorbuotos medžiagos masė (apskaičiuota)		m_aq^des (Δt_i)	μg

Desorbcijos procentinė dalis

Desorbcija laiko momentu t_i	D_ti	%
Desorbcija per laiko tarpą Δt_i	D_Δti	%
Tariamas desorbcijos koeficientas

LM: lygiagretusis metodas

NM: nuoseklusis metodas

DIRVOŽEMIO IR NUOTEKŲ DUMBLO ADSORBCIJOS KOEFICIENTO (K“_c) VERTINIMAS, TAIKANT DIDELIO EFEKTYVUMO SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJĄ (HPLC) (C.19.)

1 METODAS

Šis metodas yra OECD TG121 (2000) kopija.

1.1 ĮVADAS

Dirvožemio ar nuotekų dumblo medžiagų gebėjimą sorbuoti tam tikras medžiagas gali apibūdinti parametrai, nustatyti taikant C. 18 bandymų metodą. Svarbus parametras yra adsorbcijos koeficientas, kuris apibrėžiamas kaip medžiagos dirvožemyje ir dumble koncentracijos ir medžiagos vandeninės fazės koncentracijos santykis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis. Adsorbcijos koeficientas, normuotas pagal dirvožemio organinės anglies kiekį, K_oc yra naudingas cheminės medžiagos ir dirvožemio bei nuotekų dumblo organinės medžiagos surišimo gebos rodiklis ir leidžia lyginti įvairias chemines medžiagas. Šis parametras gali būti įvertintas taikant koreliacijas su tirpumu vandenyje ir n-oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficientu (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).

Pagal aprašytą šio bandymo metodą, adsorbcijos dirvožemiu ir nuotekų dumblu koeficientui K_oc nustatyti, naudojamas HPLC (8). Įverčiai yra patikimesni nei gauti pagal QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships – Kiekybinės struktūros ir aktyvumo sąsajos) apskaičiavimus (9). Kaip vertinimo metodas, jis negali visiškai pakeisti įkrovos pusiausvyros bandymų, atliekamų pagal C. 18 bandymų metodą. Tačiau įvertintas K_oc gali būti naudingas tinkamiems bandymų parametrams pasirinkti adsorbcijai ir desorbcijai tirti pagal C. 18 bandymų metodą, apskaičiuojant K_d (pasiskirstymo koeficientą) ar K_f (Freundlicho adsorbcijos koeficientą) pagal 3 lygtį (žr. 1.2).

1.2 APIBRĖŽIMAI

K_d pasiskirstymo koeficientas apibrėžiamas kaip dviejų fazių sistemoje, sudarytoje iš sorbento (dirvožemio ar nuotekų dumblo) ir vandeninės fazės, ištirpintos bandomosios medžiagos pusiausvyros koncentracijos C santykis; jis yra bematis dydis, jei abiejų fazių koncentracija išreikšta masės ir masės koncentracija. Jei vandeninės fazės koncentracija išreikšta masės ir tūrio koncentracija, vienetas yra ml x g^-1. Kį gali skirtis priklausomai nuo sorbento savybių ir gali priklausyti nuo koncentracijos.

čia:

C_soil = bandomosios medžiagos dirvožemyje koncentracija pusiausvyros sąlygomis (μg x g^-1),

C_sludge = bandomosios medžiagos dumble koncentracija pusiausvyros sąlygomis (μg x g^-1),

C_aq = bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija pusiausvyros sąlygomis (μg x g^-1, μg x ml^-1).

K_f: Freundlicho adsorbcijos koeficientas yra apibrėžiamas kaip bandomosios medžiagos dirvožemyje ar nuotekų dumble koncentracija (x/m), kai vandeninės fazės pusiausvyros koncentracija C_aq lygi vienetui; vienetai yra μg x g^-1 sorbento. Vertė gali skirtis priklausomai nuo sorbento savybių.

čia:

x/m = kiekis x (μg) bandomosios medžiagos, pusiausvyros sąlygomis adsorbuotos sorbentu, kurio kiekis m (g),

1/n = Freundlicho adsorbcijos izotermės lygties nuožulnumo koeficientas,

C_aq, = bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija pusiausvyros sąlygomis (μg x ml^-1).

Kai C_aq= l;logK_f=log x/m

K_oc: pasiskirstymo koeficientas (K_d) arba Freundlicho adsorbcijos koeficientas (K_f), normalizuoti pagal sorbento organinės anglies kiekį (f_oc); ypač nejoninėms cheminėms medžiagoms jis yra apytikris medžiagos ir sorbento adsorbcijos laipsnio rodiklis ir leidžia lyginti skirtingas chemines medžiagas. Pagal tai, kokios yra K_d ir K_f dimensijos, K_oc gali būti bematis arba jo vienetai yra ml x g^-1 ar μg x g^-1 organinės medžiagos.

K_oc ir K_d santykis nėra visuomet tiesiškas, taigi įvairių dirvožemių K_oc vertės gali būti skirtingos, tačiau jų kintamumas yra daug mažesnis, lyginant su K_d ar K_f verčių kintamumu.

Adsorbcijos koeficientas (K_oc) nustatomas iš sulaikymo veiksnio (k¹), naudojant pasirinktų etaloninių medžiagų log k¹ pagal log K_oc kalibracinį grafiką.

čia:

t_R: bandomosios ir etaloninės medžiagos sulaikymo trukmė HPLC metodu (minutės)

t_o: eliuento sulaikymo trukmė (dead time) HPLC metodu (minutės) (žr. 1.8.2).

P_ow: oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficientas apibrėžiamas kaip medžiagos n-oktanolio tirpalo ir vandens tirpalo koncentracijos santykis; jis yra bematis dydis.

1.3 ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Prieš taikant metodą, reikia žinoti struktūrinę formulę, grynumą ir disociacijos konstantą (jei reikia). Vertinga yra tirpumo vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, oktanolio ir vandens koeficiento pasiskirstymo, hidrolizės duomenų informacija.

Išmatuotiems bandomosios medžiagos HPLC sulaikymo duomenims ir jos adsorbcijos koeficientui K_oc susieti turi būti gauta log K_oc, pagal log k', kalibracinė kreivė. Turi būti panaudoti ne mažiau kaip šeši etaloniniai taškai, bent vienas jų – žemiau nuo laukiamos bandomosios medžiagos vertės ir vienas – aukščiau šios vertės. Metodo tikslumas labai padidėja, jei naudojamos etaloninės medžiagos struktūra yra panaši į bandomosios medžiagos. Jei tokių duomenų nėra, vartotojas gali pats pasirinkti atitinkamas kalibravimo medžiagas, todėl reikia turėti įvairios cheminės struktūros medžiagų rinkinį. Rekomenduojamos naudoti medžiagos ir nuotekų dumblo K_oc vertės yra pateiktos 1 priedo 1 lentelėje, o dirvožemio – 3 lentelėje. Kitų kalibravimo medžiagų pasirinkimą reikia pagrįsti.

1.4 BANDYMO METODO ESMĖ

Tyrimas HPLC metodu atliekamas analizinėse kolonėlėse, užpildytose komerciniu būdu gaunamos cianpropilo kietosios fazės, su lipofilinėmis ir pūlinėmis grupėmis. Naudojama vidutinio poliškumo nejudančioji (stacionari) fazė, nešiklis – silicio dioksidas:

- O – Si	- CH₂ – CH_{2 –}CH₂	- CN
silicio dioksidas	neopolinė tarpinė grupė	polinė grupė

Bandymo metodo esmė yra panaši į A.8 bandymo metodo (pasiskirstymo koeficientas, HPLC metodas; Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais) esmę. Bandomajai medžiagai einant per kolonėlę kartu su judamąja faze, vyksta medžiagos ir nejudamosios fazės sąveika. Dėl pasiskirstymo tarp judančiosios ir nejudančiosios fazių, sulėtinamas bandomosios medžiagos slinkimas. Nejudančioji (stacionari) fazė sudaryta iš polinių ir nepolinių grupių, vyksta jos sąveika su molekulės polinėmis ir nepolinėmis grupėmis, panašiai kaip ir bendrosios organinės medžiagos, kurios nešiklis yra dirvožemis ar nuotekų valymo dumblas. Taip galima nustatyti sąsają tarp kolonėlės sulaikymo trukmės ir adsorbcijos ant organinės medžiagos koeficiento.

Didelės įtakos sorbcijai turi pH, ypač polinių medžiagų. Žemės ūkio paskirties dirvožemio ar nuotekų valymo įrenginių talpyklų turinio pH dažniausiai yra 5,5-7,5. Jei medžiagos gali jonizuotis, tai naudojant tinkamus buferinius tirpalus turi būti atliekami du bandymai, medžiagai esant joninio ir nejoninio pavidalo, tačiau tik tais atvejais, jei bandomosios medžiagos disociacijos laipsnis yra bent 10 %, kai pH yra nuo 5,5 iki 7,5.

Kadangi vertinimui naudojama HPLC kolonėlės sulaikymo trukmės ir adsorbcijos koeficiento priklausomybė, nereikia jokio kiekybinio analizės metodo, būtina nustatyti tik sulaikymo trukmę. Jei yra tinkamas etaloninių medžiagų rinkinys ir galima naudoti standartines bandymo sąlygas, metodas leidžia greitai ir veiksmingai įvertinti adsorbcijos koeficientą K_oc.

1.5 METODO TAIKYMAS

HPLC metodas taikomas cheminėms medžiagoms (nežymėtoms ar žymėtoms), kurioms galima pritaikyti tinkamą aptikimo sistemą (pvz., spektrofotometrą, radioaktyvumo detektorių) ir kurios yra gana stabilios vykdant bandymą. Jis gali būti ypač naudingas cheminėms medžiagoms, sunkiai tiriamoms kitomis bandymų sistemomis (t. y. lakioms medžiagoms; medžiagoms, kurių tirpumas yra mažesnis nei analiziškai nustatoma koncentracija; medžiagoms, kurių giminingumas inkubavimo sistemų paviršiams yra didelis). Metodas gali būti taikomas mišiniams, kurių išplovimo juostos neatsiskirta. Tokiu atveju turi būti nurodyta mišinio junginių viršutinė ir apatinė log K_oc verčių riba.

Kartais priemaišos gali trukdyti interpretuojant HPLC rezultatus, tačiau jos nėra tokios svarbios, jei bandomoji medžiaga gali būti analiziškai aiškiai identifikuota ir atskirta nuo priemaišų.

Metodas patikrintas, naudojant priedo 1 lentelėje išvardytas medžiagas, taip pat juo buvo tiriamos įvairios šių klasių medžiagos:

- aromatiniai aminai (pvz., trifluralinas, 4-chloranilinas, 3,5-dinitroanilinas, 4-metilanilinas, N-metilanilinas, 1-naftilaminas),

- aromatinių karboninių rūgščių esteriai (pvz., benzenkarboksirūgšties metilesteris, 3,5-dinitrobenzenkarboksirūgšties etilesteris),

- aromatiniai angliavandeniliai (pvz., toluenas, ksilenas, etilbenzenas, nitrobenzenas),

- ariloksifenoksipropano rūgšties esteriai (pvz., diklofopmetilas, fenoksapropetilas, fenoksaprop-P-etilas),

- fungicidai benzimidazolo ir imidazolo pagrindu (pvz., karbendazimas, fuberidazolas, triazoksidas),

- karboksirūgščių amidai (pvz., 2-chlorbenzamidas, N,N-dimetilbenzamidas, 3,5-dinitrobenzamidas, N-metilbenzamidas, 2-nitrobenzamidas, 3 -nitrobenzamidas),

- chlorinti angliavandeniliai (pvz., endosulfanas, DDT, heksachlorbenzenas, kvintozenas, 1,2,3-trichlorbenzenas),

- fosforo organiniai insekticidai (pvz., azinfosmetilas, disulfotonas, fenamifosas, izofenfosas, pirazofosas, sulprofosas, triazofosas),

- fenoliai (pvz., fenolis, 2-nitrofenolis, 4-nitrofenolis, pentachlorfenolis, 2,4,6-trichlorfenolis, 1-naftolis),

- fenilkarbamido dariniai (pvz., izoproturonas, monolinuronas, pencikuronas),

- pigmentiniai dažai (pvz., rūgštusis geltonas 219, bazinis mėlynas 41, tiesioginis raudonas 81),

- poliaromatiniai angliavandeniliai (pvz., acenaftenas, naftalenas),

- herbicidai 1,3,5-triazino pagrindu (pvz., prometrinas, propazinas, simazinas, terbutrinas),

- triazolo dariniai (pvz., tebukonazolas, triadimefonas, tradimenolis, triapentenolis).

Metodas netinka medžiagoms, reaguojančioms su eliuentu ar su nejudančiąja faze. Jis taip pat netinka medžiagoms, kurios su neorganiniais komponentais reaguoja specifiniu būdu (pvz., su molio mineralais sudaro klasterinius kompleksinius junginius). Metodas gali netikti paviršiaus aktyviosioms medžiagoms, neorganiniams junginiams ir vidutinio stiprumo ar stiprioms organinėms rūgštims ir bazėms. Galima nustatyti log K_oc vertes 1,5-5,0 diapazone. Jonizuojamos medžiagos turi būti matuojamos naudojant buferinę judančiąją fazę, tačiau reikia žiūrėti, kad nesusidarytų buferinio tirpalo komponentų ar bandomosios medžiagos nuosėdų.

1.6 KOKYBĖS KRITERIJAI

1.6.1. Tikslumas

Dažniausiai bandomosios medžiagos adsorbcijos koeficientas gali būti įvertintas ± 0,5 log vieneto tikslumu, lyginant su verte, nustatyta įkrovos pusiausvyros metodu (žr. 1 priedo lentelėj. Galima pasiekti didesnį tikslumą, jei naudota etaloninė medžiaga ir bandomoji medžiaga yra panašios cheminės struktūros.

1.6.2. Pakartojamumas

Nustatymas turi būti atliekamas bent du kartus. Atskirų matavimų log K_oc turi skirtis mažiau kaip 0,25 log vieneto.

1.6.3. Atkuriamumas

Iki šiol sukauptas patyrimas taikant šį metodą, patvirtina jo pagrįstumą. Kai HPLC metodas buvo ištirtas panaudojus 48 medžiagas (daugiausia pesticidus), kurioms yra patikimi adsorbcijos dirvožemiu K_oc duomenys, gautas koreliacijos koeficientas R = 0,95 (10) (11).

Metodui tobulinti ir jo pagrįstumui patvirtinti buvo atliktas tarplaboratorinio palyginimo bandymas, dalyvaujant 11 laboratorijų (12). Rezultatai pateikti priedo 2 lentelėje.

1.7 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.7.1. Pirminis adsorbcijos koeficiento {vertinimas

Kaip adsorbcijos laipsnį nusakantys rodikliai, ypač nejonizuotų medžiagų, gali būti naudojami oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficientas P_ow (=K_ow) ir tam tikras tirpumas vandenyje, taigi jie gali būti naudojami nuspėti pirminį etapą. Kelioms cheminių medžiagų grupėms buvo paskelbta nemažai naudingų koreliacijų (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).

1.7.2. Aparatūra

Būtina turėti skysčių chromatografą su nepulsuojančiu siurbliu ir atitinkamu detektavimo įtaisu (detektoriumi). Rekomenduojama naudoti injekcijos (mėginio įvedimo) vožtuvą ir injekcijos kilpą. Naudojamos komercinės cianpropilo dervos, chemiškai surištos su silicio dioksido nešikliu (pvz., Hypersil ir Zorbax CN). Tarp injekcijos sistemos ir analizės kolonėlės galima įtaisyti tos pačios medžiagos apsauginę kolonėlę. Skirtingų tiekėjų kolonėlių skiriamoji galia gali labai skirtis. Vadovautis reikėtų šiomis sulaikymo veiksnių k' vertėmis: log k' > 0,0, jei log K_oc = 3,0, ir log k' > 0,4, jei log K_oc = 2,0, jei judančiąją faze naudojamas metanolio ir vandens 55/45 % mišinys.

1.7.3. Judančiosios fazės

Buvo bandytos kelios judančiosios fazės, rekomenduoti galima šias dvi:

- metanolio ir vandens (55/45 % v/v) mišinį,

- metanolio ir 0,01 M citratinio buferio pH 6,0 (55/45 % v/v) mišinį.

Eliuavimo tirpikliui paruošti naudojamas HPLC grynumo metanolis ir distiliuotas vanduo ar citratinis buferinis tirpalas. Prieš naudojant, mišinys nudujinamas. Turi būti taikomas izokratinis eliuavimas. Jei metanolio ir vandens mišiniai netinka, galima išmėginti kitus organinio tirpiklio ir vandens mišinius, pvz., etanolio ir vandens ar acetonitrilo ir vandens mišinius. Tiriant jonizuojamas medžiagas, rekomenduojama pH vertei stabilizuoti naudoti buferinį tirpalą. Reikia stengtis nesudaryti sąlygų susidaryti druskų nuosėdoms ir nesugadinti kolonėlės, taip gali atsitikti su kai kuriais organinės fazės ir buferinio tirpalo mišiniais.

Negalima naudoti priedų, pvz., jonų porų reagentų, nes jie gali veikti nejudamosios fazės sorbcines savybes. Tokie nejudamosios fazės pokyčiai gali būti negrįžtami. Dėl šios priežasties privaloma, kad bandymai, naudojant priedus, būtų atliekami atskirose kolonėlėse.

1.7.4. Tirpiniai

Bandomoji ir etaloninės medžiagos turi būti ištirpintos judamojoje fazėje.

1.8 BANDYMO EIGA

1.8.1. Bandymo sąlygos

Matuojant turi būti registruojama temperatūra. Norint užtikrinti nekintamas sąlygas, kolonėlę rekomenduojama laikyti termostatuojamoje kameroje, kai atliekami kalibravimo, vertinimo ir bandomosios medžiagos matavimai.

1.8.2. Eliuento sulaikymo trukmės to nustatymas

Eliuento sulaikymo trukmei nustatyti galima taikyti du skirtingus metodus (žr. taip pat 1.2).

1.8.2.1. Eliuento sulaikymo trukmės nustatymas naudojant homologines serijas

Įrodyta, kad šiuo metodu gaunamos patikimos ir etaloninės to vertės. Detalės pateiktos A.8 bandymo metodo – „Pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolis ir vanduo), HPLC metodas“ – aprašyme (Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais).

1.8.2.2. Eliuento sulaikymo trukmė nustatoma naudojant inertiškas medžiagas, kurių nesulaiko kolonėlė

Metodas pagrįstas formamido, karbamido ar natrio nitrato tirpalų įvedimu. Matavimai turi būti atliekami mažiausiai du kartus.

1.8.3. Sulaikymo trukmės t_R nustatymas

Etaloninės medžiagos turi būti parinktos taip, kaip aprašyta 1.3 poskyryje. Norint nustatyti jų sulaikymo trukmę, medžiagos gali būti įvestos kaip mišrusis etalonas, jei buvo patvirtinta, kad kiekvieno etaloninio standarto sulaikymo trukmei kiti esantys etaloniniai standartai įtakos neturi. Kalibruoti būtina nuolat, mažiausiai du kartus per dieną, kad būtų galima atsižvelgti į netikėtus kolonėlės veikimo pokyčius. Gera praktika reikalauja, kad kalibravimo tirpalų įvedimas būtų atliekamas prieš ir po bandomosios medžiagos įvedimo, siekiant patvirtinti, kad sulaikymo trukmės poslinkio neįvyko. Bandomosios medžiagos kaip galima mažesniais kiekiais (kad būtų išvengta kolonėlės perkrovos) įvedamos atskirai ir nustatoma jų sulaikymo trukmė.

Norint didinti matavimo patikimumą, turi būti atliekami mažiausiai du matavimai. Atskirų matavimų log K_oc turi skirtis mažiau kaip 0,25 log vieneto.

1.8.4. Įvertinimas

Pagal eliuento sulaikymo trukmę to ir pasirinktų etaloninių medžiagų t_R, taikant 4 lygtį, apskaičiuojami sulaikymo veiksniai k' (žr. 1.2). Etaloninių medžiagų log k' duomenys brėžiami grafike pagal jų log K_oc vertes, gautas įkrovos pusiausvyros bandymuose ir pateiktas priedo 1 ir 3 lentelėse. Pagal šį grafiką gauta bandomosios medžiagos log k' vertė yra naudojama jos log K_oc vertei nustatyti. Jei gauti rezultatai rodo, kad bandomosios medžiagos log K_oc yra už kalibravimo intervalo ribų, bandymą reikia pakartoti, naudojant kitas, tinkamesnes etalonines medžiagas.

2. DUOMENYS IR ATASKAITA

Ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:

- bandomosios ir etaloninės medžiagos identifikavimas bei jų grynumas ir, jei reikia, pK_a vertės,

- įrangos ir darbo sąlygų aprašymas, pvz., analizinės (ir apsauginės) kolonėlės tipas bei matmenys, detektavimo priemonės, judamoji fazė (komponentų santykis ir pH), bandymų temperatūros diapazonas atliekant matavimus,

- eliuento sulaikymo trukmė ir jo nustatymo metodas,

- į kolonėlę įvestų bandomosios ir etaloninių medžiagų kiekiai,

- kalibravimui naudotų etaloninių medžiagų slinkimo sulėtinimo trukmė,

- regresijos kreivės detalės (log k' pagal log K_oc) ir šios kreivės grafikas,

- vidutiniai sulaikymo duomenys ir įvertinta bandomosios medžiagos log K_oc vertė,

- chromatogramos.

3. NUORODOS

1) W. J. Lyman, W. F. Reehl D. H. Rosenblatt (ed). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, McGraw-Hill New York.

2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Koc) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67.

3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefScients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29,1050 – 1059 p.

4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol, 17, 227 – 231 p.

5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19,297 – 312 p.

6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, 831 – 832 p.

7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, 833 – 846 p.

8) W. Kordel D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121 – 128 p.

9) M. Mueller, W. Kordel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), 2493 -2504 p.

10) W. Kordel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), 2341 – 2352 p.

11) B. von Oepen, W. Kordel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22,285 – 304 p.

12) W. Kordel G. Kotthoff, J. Muller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373-1384 p.

Priedas

1 LENTELĖ

Dirvožemių ir nuotekų dumblų K_oc verčių ir HPLC atrankos metodu apskaičiuotų verčių palyginimas^1,2

Medžiaga	CAS Nr.	Nuotekų dumblų log K_oc	log K_oc HPLC	Δ	Dirvožemių log K_oc	log K_oc HPLC	Δ
Atrazinas	1912-24-9	1,66	2,14	0,48	1,81	2,20	0,39
Linuronas	330-55-2	2,43	2,96	0,53	2,59	2,89	0,30
Fentionas	55-38-9	3,75	3,58	0,17	3,31	3,40	0,09
Monuronas	150-68-5	1,46	2,21	0,75	1,99	2,26	0,27
Fenantrenas	85-01-8	4,35	3,72	0,63	4,09	3,52	0,57
Fenilbenzoatas	93-99-2	3,26	3,03	0,23	2,87	2,94	0,07
Benzamidas	55-21-0	1,60	1,00	0,60	1,26	1,25	0,01
4-nitrobenzamidas	619-80-7	1,52	1,49	0,03	1,93	1,66	0,27
Acetanilidas	103-84-4	1,52	1,53	0,01	1,26	1,69	0,08
Anilinas	62-53-3	1,74	1,47	0,27	2,07	1,64	0,43
2,5-dichloranilinas	95-82-9	2,45	2,59	0,14	2,55	2,58	0,03

¹W. Kordel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121 – 128 p.

²W. Kordel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), 107 -119 p.

2 LENTELĖ

Tarplaboratorinio palyginamojo bandymo (11 dalyvaujančių laboratorijų), atlikto HPLC metodui patobulinti ir pagrįstumui patvirtinti, rezultatai¹

Medžiaga	CAS Nr.	log K_oc(OECD 106)	K_oc	log K_oc
Medžiaga	CAS Nr.	log K_oc(OECD 106)	[HPLC metodas]
Atrazinas	1912-24-9	1,81	78 ±16		1,89
Monuronas	150-68-5	1,99	100 ±8		2,00
Triapentenolis	77608 – 88 – 3	2,37	292 ± 58		2,47
Linuronas	330-55-2	2,59	465 ± 62		2,67
Fentionas	55-38-9	3,31	2062 ± 648		3,31

¹ W. Kordel, G. Kotthoff, J. Muller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring tęst. Chemosphere, 30(7), 1373-1384 p.

3 LENTELĖ

Rekomenduojamos etaloninės medžiagos HPLC atrankos metodui, parinktos pagal jų adsorbcijos dirvožemiu duomenis

Etaloninė medžiaga	CAS Nr.	log K_oc vidutinės vertės, gautos iš įkrovos pusiausvyros tyrimo duomenų	K_oc duomenų skaičius	log S.D.	Šaltinis
Acetanilidas	103-84-4	1,25	4	0,48	a
Fenolis	108-95-2	1,32	4	0,70	a
2-Nitrobenzamidas	610-15-1	1,45	3	0,90	b
N,N-dimetilbenzamidas	611-74-5	1,52	2	0,45	a
4-Metilbenzamidas	619-55-6	1,78	3	1,76	a
Metilbenzoatas	93-58-3	1,80	4	1,08	a
Atrazinas	1912-24-9	1,81	3	1,08	c
Izoproturonas	34123-59-6	1,86	5	1,53	c
3-Nitrobenzamidas	645-09-0	1,95	3	1,31	b
Anilinas	62-53-3	2,07	4	1,73	a
3,5-dinitrobenzamidas	121-81-3	2,31	3	1,27	b
Karbendazimas	10605-21-7	2,35	3	1,37	c
Triadimenolis	55219-65-3	2,40	3	1,85	c
Triazoksidas	72459-58-6	2,44	3	1,66	c
Triazofosas	24017-47-8	2,55	3	1,78	c
Linuronas	330-55-2	2,59	3	1,97	c
Naftalenas	91-20-3	2,75	4	2,20	a
Endosulfandiolis	2157-19-9	3,02	5	2,29	c
Metiokarbas	2032-65-7	3,10	4	2,39	c
Rūgštusis geltonas 219	63405 – 85 – 6	3,16	4	2,83	a
1,2,3-trichlorobenzenas	87-61-6	3,16	4	1,40	a
Y-HCH	58-89-9	3,23	5	2,94	a
Fentionas	55-38-9	3,31	3	2,49	c
Tiesioginis raudonasis 81	2610-11-9	3,43	4	2,68	a
Pirazofosas	13457-18-6	3,65	3	2,70	c
a-Endosulfanas	959-98-8	4,09	5	3,74	c
Dichlofopmetilas	51338-27-3	4,20	3	3,77	c
Fenantrenas	85-01-8	4,09	4	3,83	a
Bazinis mėlynasis 41 (mišinys)	26850-47-5 12270-13-2	4,89	4	4,46	a
DDT	50-29-3	5,63	1		b

^aW. Kordel, J. Muller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D Report No 106 01 044 (1994).

^bB.V. Oepen, W. Kordel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22,285 – 304 p.

^cPramonės pateikti duomenys.

DAPHNIA MAGNA REPRODUKCIJOS BANDYMAS (C. 20.)

1. METODAS

Šis toksiškumo reprodukcijai bandymo metodas yra OECD TG 211 (1998) kopija.

1.1 ĮVADAS

Pagrindinis šio bandymo tikslas – įvertinti cheminių medžiagų poveikį Daphnia magna reprodukcijai.

1.2 APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI

Motininiai gyvūnai – nuo bandymo pradžios naudojamos moteriškosios lyties dafnijos (motininiai gyvūnai), kurių yra tiriamas reprodukcijos našumas.

Palikuonys – atliekant bandymą išsiritusios (produkuotos) dafnijos.

Mažiausia pastebimo poveikio koncentracija (LOEC) – mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis per nustatytą veikimo laikotarpį yra statistiškai reikšmingas reprodukcijai ir motininių gyvūnų gaištamumui (p<0,05), lyginant su kontroliniais bandymais. Tačiau visų didesnių LOEC bandomųjų koncentracijų poveikio kenksmingos pasekmės turi būti lygios ar didesnės negu bandomosios medžiagos LOEC poveikio pasekmės. Jei šios dvi sąlygos negali būti įvykdytos, turi būti pateiktas išsamus paaiškinimas, kodėl buvo pasirinkta LOEC (taigi ir NOEC).

Nepastebimo poveikio koncentracija (NOEC) – bandomoji koncentracija bent kiek mažesnė už LOEC, kurios poveikis per nustatytą veikimo laikotarpį nėra statistiškai reikšmingas (p < 0,05), lyginant su kontroliniais bandymais.

EC, – vandenyje ištirpintos bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant Daphnia magna reprodukcija per nustatytą veikimo laikotarpį sumažėja x %.

Būdingasis prieaugio greitis – yra populiacijos augimo matas, apimantis reprodukcijos našumą ir amžiui būdingą gaištamumą (20) (21) (22). Stacionarios būsenos populiacijų jis yra lygus nuliui. Augančių populiacijų yra teigiamas, o nykstančių populiacijų – neigiamas. Aišku, kad pastarosios yra neilgaamžės ir galiausiai išnyksta.

Aptikimo riba – mažiausia koncentracija, kai medžiagą galima aptikti, bet neįmanoma nustatyti kiekybiškai.

Nustatymo riba- mažiausia kiekybiškai nustatoma koncentracija.

Gaištamu mas – gyvūnas laikomas žuvusiu, kai jis nejuda, t.y. kai negali plaukti arba kai, 15 s lengvai papurčius bandymų indą, nepastebima judant galūnių ar pilvelio. (Jei taikomas kitas apibrėžimas, jis turi būti pateiktas kartu su jo nuoroda.)

1.3 BANDYMO METODO ESMĖ

Jaunos moteriškosios lyties dafnijos (motininiai gyvūnai), kurių amžius bandymo pradžioje mažesnis kaip 24 h, yra veikiamos bandomosios medžiagos tam tikrų koncentracijų tirpalais. Bandymo trukmė 21 para. Baigus bandymą įvertinamas vienam gyvam motininiam gyvūnui tenkančių gyvų palikuonių bendras skaičius. Jaunikliai, kurie žūva per bandymą, į skaičiavimus neįtraukiami. Motininių gyvūnų reprodukcijos našumą galima išreikšti kitais būdais (pvz., gyvų palikuonių, produkuotų vieno gyvūno per parą nuo pirmos palikuonių pastebėjimo dienos, skaičiumi), tačiau ataskaitoje šie skaičiai turi būti pateikiami papildomai prie bendro gyvų jauniklių skaičiaus, bandymo pabaigoje tenkančio vienam motininiam gyvūnui. Mažiausiai pastebimo poveikio koncentraciją (LOEC) ir nepastebimo poveikio koncentraciją (NOEC) norint nustatyti, bandomąja medžiaga veikiamų gyvūnų reprodukcijos našumas lyginamas su kontrolinio (-ių) bandinio (-ių) našumu. Be to, kiek įmanoma, duomenys analizuojami, naudojant regresijos modelį, kad būtų galima įvertinti koncentraciją, kuriai esant reprodukcijos našumas sumažėtų x % (t. y. EC₅₀, EC₂₀ ar EC₁₀).

Ataskaitoje taip pat turi būti nurodytas motininių gyvūnų išlikimo laipsnis ir pirmosios vados atsiradimo laikas. Gali būti ištirti kiti bandomąja medžiaga veikiami parametrai, pvz., augimas (pvz., ilgis) ir galbūt būdingasis prieaugio greitis.

1.4 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ

Reikėtų turėti su Daphnia magna atlikto trumpalaikio toksiškumo bandymo (žr. „Ūminis toksinis poveikis dafnijoms“, Žin., 2002, Nr. 81-3493) rezultatus. Rezultatas gali būti naudingas, parenkant atitinkamą reprodukcijos bandymų bandomųjų koncentracijų diapazoną. Turėtų būti žinomas bandomosios medžiagos tirpumas vandenyje ir garų slėgis, be to, nustatant bandomosios medžiagos tirpalų koncentracijos kiekį, turi būti prieinamas patikimas analizės metodas, kurio tikslumas ir nustatymo riba yra žinomi.

Informacija apie bandomąją medžiagą galinti būti vertinga nustatant bandymo sąlygas, ji apima struktūrinę formulę, medžiagos grynumą, stabilumą šviesoje, stabilumą bandymo sąlygomis, pK_a, P_ow ir lengvo biolologinio skaidomumo bandymo rezultatus (žr. „Lengvo“ biologinio skaidomumo nustatymas“, Žin., 2002, Nr. 81-3493 ).

1.5 BANDYMO PAGRĮSTUMAS (PATIKIMUMAS)

Metodas yra pagrįstas, jei atliekant kontrolinį (-ius) bandymą (-us), įvykdomi šie veiksmingumo kriterijai:

- bandymo pabaigoje motininių gyvūnų gaištamumas (moteriškosios lyties dafnijų) yra ne didesnis kaip 20 %;

- iš vieno iki bandymo pabaigos išgyvenusio motininio gyvūno gautų gyvų palikuonių vidutinis skaičius yra > 60.

1.6 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.6.1. Aparatūra

Bandymų indai ir kita aparatūra, su kuria liečiasi bandomieji tirpalai, turi būti pagaminti vien tik iš stiklo ar kitos chemiškai inertinės medžiagos. Bandymams dažniausiai naudojamos laboratorinės stiklinės. Be to, yra reikalingi šie prietaisai arba jų dalys:

- deguonies matuoklis (su mikroelektrodu ar kitas tinkamas prietaisas, skirtas matuoti ištirpusį deguonį mažo tūrio bandiniuose),

- atitinkama aparatūra, skirta palaikyti pastovią temperatūrą,

- pH metras,

- įranga, skirta nustatyti vandens kietumą,

- įranga, skirta nustatyti bendrosios organinės anglies koncentraciją (BOA) ar įranga, skirta nustatyti cheminį deguonies suvartojimą (ChDS) vandenyje,

- tinkama aparatūra apšvietimo režimui kontroliuoti ir šviesos intensyvumui matuoti.

1.6.2 Bandymų organizmai

Dažniausiai rekomenduojama naudoti rūšis yra Daphnia magna Straus. Galima naudoti kitas dafnijų rūšis, jei jos atitinka nustatytus patikimumo kriterijus (dafnijų rūšiai turi būti taikomas su kontrolinių bandinių reprodukcijos našumu susijęs patikimumo kriterijus). Jei naudojamos kitos dafnijų rūšys, jos turi būti aiškiai apibrėžtos ir jų naudojimas turi būti įteisintas.

Kloną geriau būtų identifikuoti pagal genotipą. Tyrimas (1) parodė, kad A klono (jo kilmė – IRCHA (Institut de Recherche en Chimie Appliquee), Prancūzija) (3) reprodukcijos našumas visą laiką atitinka pagrįstumo kriterijų, pagal kurį vieno išlikusio gyvo motininio gyvūno ir auginamo šiame metode aprašytomis sąlygomis vidutinis palikuonių skaičius yra > 60. Tačiau priimtini ir kiti klonai, jei parodoma, kad dafnijų kultūra atitinka bandymo pagrįstumo kriterijus.

Bandymo pradžioje gyvūnai turi būti jaunesni kaip 24 h ir palikuonių karta neturi būti pirmoji. Jie turi būti gauti iš sveiko kamieno (t. y. be streso požymių, pvz., didelio mirtingumo, vyriškosios lyties atstovų ir ephippia buvimo, vėlavimo produkuoti pirmąją vadą, pasikeitusios gyvūnų spalvos ir t. t.). Kamieno gyvūnai turi būti laikomi tokiomis sąlygomis (šviesa, temperatūra, terpė, maitinimas ir gyvūnų skaičius tūrio vienetui), kurios būtų panašios į bandymo sąlygas. Jei bandymui naudota auginimo terpė skiriasi nuo įprastos dafnijų auginimo terpės, norint išvengti motininių gyvūnų streso, gera praktika reikalauja leisti dafnijoms, dažniausiai maždaug per tris savaites (t. y. vienos kartos laikotarpį), aklimatizuotis.

1.6.3 Bandymų terpė

Rekomenduojama šiems bandymams naudoti visiškai apibrėžtą terpę. Taip galima išvengti sunkiai apibūdinamų priedų (pvz., jūros dumblių, dirvožemio ekstrakto ir 1.1.) naudojimo, taigi pagerėja tarplaboratorinio standartizavimo galimybės. Buvo nustatyta, kad geriausiai tinka Elendt M4 (4) ir M7 terpės (žr. 1 priedą). Tačiau yra priimtinos ir kitos terpės (pvz., (5) (6)), jei jose išauginta dafnijų kultūra atitinka bandymui nustatytus pagrįstumo kriterijus.

Jei naudojamos tokios terpės, kuriose yra neapibrėžtų priedų, šie priedai turi būti aiškiai apibūdinti ir bandymų ataskaitoje turi būti informacija apie jų sudėtį, ypač apie organinės anglies kiekį, nes tai gali būti tiekiamo maisto dalis. Rekomenduojama nustatyti organinio priedo pradinio tirpalo bendrąją organinę anglį (BOA) ir (ar) cheminį deguonies suvartojimą (ChDS) ir įvertinti jų indėlį į paruoštos terpės BOA ir ChDS. Rekomenduojama, kad terpės (t.y. prieš pridedant dumblių) BOA lygis būtų mažesnis negu 2 mg/l (7).

Bandant metalų turinčias medžiagas, svarbu suprasti, kad bandomosios terpės savybės (pvz., kietumas, chelatų susidarymo geba) gali turėti įtakos bandomosios medžiagos toksiškumui. Dėl šios priežasties pageidautina turėti visiškai apibrėžtą terpę. Tačiau vienintelės, visiškai apibrėžtos terpės, kurios, kiek šiandien žinoma, tiktų ilgą laiką auginti Daphnia magna, yra Elendt M4 ir M7. Abiejose terpėse esama chelatų susidarymo agento EDTA.

Darbas (2) parodė, kad, reprodukcijos bandymą atliekant M4 ir M7 terpėje, kadmio „tariamasis toksiškumas“ dažniausiai yra mažesnis, lyginant su EDTA neturinčia terpe. Taigi M4 ir M7 terpių nerekomenduojama naudoti, bandant metalų turinčias medžiagas, taip pat reikėtų vengti naudoti terpes, turinčias žinomų chelatų susidarymo agentų. Metalų turinčioms medžiagoms patartina naudoti kitą terpę, pvz., ASTM (American Society for Testing and Materials) dirbtinį gėlą vandenį (7) be EDTA, į kurį pridėta jūros dumblių ekstrakto (8). Šis ASTM dirbtinio gėlo vandens ir jūros dumblių ekstrakto derinys taip pat tinka ilgą laiką auginti ir bandyti Daphnia magna (2), nors dėl jūros dumblių ekstrakto organinio komponento vis tiek pasireiškia nedidelis chelatuojantis veikimas.

Bandymo pradžioje ir visą bandymą ištirpusio deguonies koncentracija turi būti didesnė negu 3 mg/l. pH vertė turi būti 6 – 9 ir atliekant bet kurį bandymą, ji dažniausiai neturi kisti daugiau kaip 1,5 vieneto. Rekomenduojamas 140 mg/l (pagal CaCO₃) vandens kietumas. Bandymai, atlikti esant šiam ar aukštesniam lygiui, parodė, kad reprodukcijos našumas atitinka pagrįstumo kriterijus (9) (10).

1.6.4. Bandomieji tirpalai

Parinktos koncentracijos bandomieji tirpalai dažniausiai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradinius tirpalus geriau ruošti tirpinant medžiagą bandymų terpėje.

Kartais, norint gauti tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą, gali tekti naudoti organinius tirpiklius ar disperguojančius priedus, tačiau reikia stengtis šių medžiagų nenaudoti, jei tik įmanoma. Tinkami tirpikliai yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Tinkamos disperguojančios medžiagos yra Cremophor RH40, 0,01 % metilceliuliozė ir HCO-40. Bet kuriuo atveju bandomosios medžiagos bandomojo tirpalo koncentracija neturi būti didesnė negu tirpumo bandymų terpėje riba.

Tirpikliai naudojami, ruošiant pradinį tirpalą, kuris gali būti tiksliai dozuojamas į vandenį. Jei pirmiau išvardyti tirpikliai galutinėje bandymų terpėje būna rekomenduojamos koncentracijos (t. Y.<0,1 ml/l), jie nebus toksiški ir dažniausiai nepadidins bandomosios medžiagos tirpumo vandenyje.

Disperguojančios medžiagos gali padėti tiksliai dozuoti ir disperguoti. Kai pirmiau išvardytos disperguojančios medžiagos galutinėje bandymų terpėje bus rekomenduojamos koncentracijos (< 0,1 ml/l), jos nebus toksiškos ir nepadidins medžiagos tirpumo vandenyje.

1.7 BANDYMO PLANAS

Bandymų indai paskirstomi pagal apdorojimo būdus, o toliau visi bandymų indai turi būti tvarkomi atsitiktiniu būdu. Taip nedarant, gali atsirasti nukrypimų, kurie galėtų būti aiškinami kaip koncentracijos poveikio pasekmė. Ypač, jei bandymo vienetai tvarkomi tokia seka, kokia jie buvo apdoroti, arba, atsižvelgiant į koncentraciją, kai kurie su laiku susiję veiksniai, pvz., operatoriaus nuovargis ar kita klaida, esant didesnėms koncentracijos vertėms, gali turėti rimtesnių pasekmių. Be to, jei bandymo rezultatus gali veikti bandymo pradinės ar aplinkos, pvz., padėties laboratorijoje, sąlygos, reikėtų svarstyti blokinį bandymo planą.

1.8 BANDYMO EIGA

1.8.1. Veikimo sąlygos

1.8.1.1. Trukmė

Bandymo trukmė — 21 para.

1.8.1.2. Įkrova

Motininiai gyvūnai laikomi atskirai po vieną bandymų inde su 50 — 100 ml terpės.

Kartais, atsižvelgiant į reikalavimus nustatant bandomąją medžiagą, gali būti reikalingas didesnis tūris, nors atliekant cheminę analizę leidžiama kartu supilti tos pačios koncentracijos bandinius. Jei naudojamas didesnis negu 100 ml tūris, gali tekti padidinti dafnijų pašaro davinį, kad turimo pašaro pakaktų ir būtų garantuota pagrįstumo kriterijų atitiktis. Dinaminiams bandymams dėl techninių priežasčių galima numatyti alternatyvius bandymo planus (pvz., keturias grupes po 10 gyvūnų didesniame bandymo tūryje), tačiau visi bandymo plano pakeitimai turi būti nurodyti ataskaitoje.

1.8.1.3. Gyvūnų skaičius

Atliekant pusiau statinius bandymams, kiekvienai koncentracijai imama bent 10 atskirai laikomų gyvūnų ir bent 10 atskirai laikomų gyvūnų kontrolinės serijos bandymams.

Buvo parodyta, kad dinaminiams bandymams kiekvienai koncentracijai tinka naudoti 40 gyvūnų, padalytų į keturias grupes po 10 gyvūnų (1). Galima naudoti mažiau bandomųjų organizmų, bet kiekvienai koncentracijai rekomenduojama naudoti ne mažiau kaip po 20 gyvūnų, padalytų į du ar daugiau indų su vienodu gyvūnų skaičiumi (pvz., į keturis indus po 5 dafnijas kiekviename). Jei atliekant bandymus su grupėmis laikomais gyvūnais, motininiai gyvūnai žūva, reprodukcijos našumo bus neįmanoma išreikšti kaip bendro gyvų palikuonių skaičiaus, tenkančio vienam bandymo pabaigoje gyvam motininiam gyvūnui. Tuomet reprodukcijos našumas išreiškiamas kaip „bendras skaičius gyvų palikuonių, tenkantis vienam bandymo pradžioje buvusiam gyvūnui“.

1.8.1.4. Maitinimas

Atliekant pusiau statinius bandymus gyvūnus geriau šerti kasdien, tačiau ne mažiau kaip tris kartus per savaitę (tai atitinka terpės keitimą). Nukrypimai nuo šių sąlygų (pvz., dinaminių bandymų) nurodomi ataskaitoje.

Atliekant bandymą motininių gyvūnų pašarą turėtų sudaryti šių gyvų dumblių ląstelės: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata (11)) ir Scenedesmus subspicatus. Tiekiamas pašaras turėtų būti apskaičiuotas pagal organinės anglies (C) kiekį, duodamą kiekvienam motininiam gyvūnui. Tyrimas (12) parodė, kad pvz., Daphnia magna pakanka gauti 0,1 – 0,2 mg C vienai dafnijai per parą, kad būtų pasiektas bandymo patikimumo kriterijus, atitinkantis palikuonių skaičių. Pašarą galima tiekti vienodai visą bandymo laiką ar, jei taip reikalaujama, mažiau bandymo pradžioje ir vis daugiau per bandymą, atsižvelgiant į motininių gyvūnų augimą. Šiuo atveju visą laiką davinys turi atitikti rekomenduotą 0,1 – 0,2 mg C kiekį vienai dafnijai per parą.

Jei šėrimo lygiui nustatyti naudojami pakeičiantys supaprastinti parametrai, pvz., dumblių ląstelių skaičius ar tariamasis suspensijos optinis tankis (t. y. kad būtų patogiau, nes anglies kiekiui nustatyti reikia daug laiko), kiekviena laboratorija turi sudaryti savo nomogramą, kuri tokį supaprastintą parametrą susietų su anglies kiekiu dumbliuose (nomogramos sudarymas, žr. 2 priedą). Nomogramas būtina tikrinti bent kartą per metus ir dažniau, jei kinta dumblių auginimo sąlygos. Buvo nustatyta, kad tariamasis suspensijos optinis tankis yra geresnis anglies kiekio nustatymą pakeičiantis parametras negu ląstelių skaičius (13).

Dafnijos šeriamos koncentruota dumblių suspensija, kad į bandymų indus pilamos kultūros tūris būtų kuo mažesnis. Dumbliams koncentruoti galima naudoti centrifugavimą ir pakartotinį suspendavimą distiliuotame, dejonizuotame vandenyje ar dafnijų kultūros terpėje.

1.8.1.5. Šviesa

16 h trukmės apšvietimas, kurio intensyvumas ne didesnis kaip 15 — 20 μE x m^-2 x s^-1.

1.8.1.6. Temperatūra

Bandymų terpės temperatūra turi būti 18-22 °C. Tačiau, jei įmanoma, atliekant visus bandymus tokia temperatūra neturėtų kisti daugiau kaip 2 °C (pvz., 18-20, 19-21 ar 20-22 °C). Temperatūros kontrolei galima skirti papildomą bandymų indą.

1.8.1.7. Aeravimas

Atliekant bandymą bandomieji tirpalai neaeruojami.

1.8.2. Bandomoji koncentracija

Dažniausiai naudojamos bent penkios bandomosios koncentracijų vertės, sudarančios geometrinę progresiją, kurios daugiklis būtų ne didesnis kaip 3,2. Kiekvienai bandomosios koncentracijos vertei daromas atitinkamas skaičius lygiagrečiųjų bandymų (žr. 1.8.1.3 skirsnį). Jei naudojamos mažiau kaip penkios koncentracijų vertės, tai reikia pagrįsti. Bandomosioms medžiagoms neturi būti parenkamos koncentracijos, didesnės už jų tirpumo bandymų terpėje ribą.

Nustatant koncentracijų diapazoną būtina žinoti:

i) jei tikslas – nustatyti LOEC ir NOEC, mažiausia bandomoji koncentracija turi būti pakankamai maža, kad ją naudojant vaisingumas, lyginant jį su kontroliniu bandymu nebūtų pastebimai mažesnis. Jei taip nėra, bandymą reikia pakartoti su dar mažesne mažiausia koncentracija,

ii) jei tikslas – nustatyti LOEC ir NOEC, didžiausia bandomoji koncentracija turi būti pakankamai didelė, kad ją naudojant vaisingumas, lyginant jį su kontroliniu bandymu būtų pastebimai mažesnis. Jei taip nėra, bandymą reikia pakartoti su dar didesne didžiausia koncentracija,

iii) jei vertinama reprodukciją veikianti EC_X, jai apibrėžti atitinkamu pasikliovimo lygiu patartina naudoti pakankamą koncentracijos verčių skaičių. Jei vertinama reprodukciją veikianti EC₅₀, patartina, kad didžiausia bandomoji koncentracija būtų didesnė už šią EC₅₀. Priešingu atveju, nors EC₅₀ vis dar galima įvertinti, EC₅₀ pasikliovimo intervalas būtų labai platus, ir gali būti neįmanoma patenkinamai įvertinti parinkto modelio tinkamumo,

iv) reikėtų vengti į bandomosios koncentracijos verčių diapazoną įtraukti koncentracijos vertes, kurios būtų statistiškai reikšmingos suaugusių gyvūnų išlikimui, nes taip pasikeistų bandymo esmė, ir jis iš paprasto reprodukcijos bandymo taptų sudėtinio reprodukcijos ir gaištamumo bandymu, kuriam reikalinga daug sudėtingesnė statistinė analizė.

Tinkamas bandomąsias koncentracijas parinkti turėtų padėti anksčiau gautos žinios apie bandomąją medžiagą (pvz., trumpalaikio toksiškumo ir (ar) diapazono nustatymo tyrimų duomenys).

Jei bandomiesiems tirpalams ruošti naudojamas tirpiklis ar disperguojanti pagalbinė medžiaga (žr. 1.6.4 skirsnį), jų galutinė koncentracija visuose bandymų induose turi būti vienoda ir ne didesnė negu 0,1 ml/l.

1.8.3 Kontroliniai bandymai

Be bandomosios medžiagos bandymų serijos, atliekama viena bandymų terpės kontrolinių bandymų serija ir, jei reikia, viena tirpiklio ar disperguojančios medžiagos kontrolinių bandymų serija. Naudojamo tirpiklio ar disperguojančios medžiagos koncentracija turi būti tokia, kokia yra induose su bandomąja medžiaga. Turi būti atliekamas atitinkamas lygiagrečiųjų bandymų skaičius (žr. 1.8.1.3 skirsnį).

Jei bandymų serija atliekama tinkamai, kontrolinio (-ių) bandymo (-ų) variacijos ties vidutine motininio gyvūno produkuotų palikuonių verte koeficientas turi būti < 25 %, ir jis turi būti nurodomas bandymo planams su atskirai laikomais gyvūnais.

1.8.4 Bandymų terpės atnaujinimas

Bandymų terpės atnaujinimo dažnis priklauso nuo bandomosios medžiagos, tačiau ji turėtų būti atnaujinama ne mažiau kaip tris kartus per savaitę. Jei pagal išankstinius stabilumo bandymus (žr. 1.4) bandomosios medžiagos koncentracija per ilgiausią (t. y. trijų parų) atnaujinimo laikotarpį yra nestabili (t. y. yra už 80 – 120 % vardinės koncentracijos ribų ar yra mažesnė negu 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), reikėtų numatyti dažnesnį terpės atnaujinimą arba naudoti dinaminį bandymo metodą.

Kai reikia atnaujinti pusiau statinių bandymų terpę, paruošiama antra bandymų indų serija, ir įjuos perkeliami motininiai gyvūnai naudojant, pvz., tinkamo skersmens stiklinę pipetę. Su Daphnia pernešamos terpės tūris turi būti kuo mažesnis.

1.8.5 Matavimai

Stebėjimų rezultatai, gauti atliekant bandymą, registruojami duomenų lentelėse (žr. 3 ir 4 priedo pavyzdžius). Jei reikalingi kiti matavimai (žr. 1.3 ir 1.8.8), gali būti atitinkamai reikalingi papildomi stebėjimai.

1.8.6 Palikuonys

Kiekvieno motininio gyvūno palikuonis patartina atskirti ir skaičiuoti kasdien nuo pirmosios vados atsiradimo, kad jie nevartotų suaugusiems gyvūnams skirto maisto. Pagal šį metodą reikia skaičiuoti tik gyvus palikuonis, tačiau taip pat reikia registruoti neapvaisintų kiaušinių ar negyvų palikuonių skaičių.

1.8.7 Gaištamumas

Motininių gyvūnų gaištamumą patartina registruoti kasdien, bent jau tuomet, kai skaičiuojami palikuonys.

1.8.8. Kiti parametrai

Nors šis metodas iš esmės yra skirtas vertinti reprodukcijos rezultatus, galima kiekybiškai įvertinti ir kitus rezultatus, kad būtų įmanoma jų statistinė analizė. Pageidautina, kad būtų matuojamas augimas, nes jis suteikia informacijos apie galimus subletalius rezultatus, kurie gali būti naudingesni negu vien tik reprodukcijos matavimas; baigiant bandymą rekomenduojama išmatuoti motininių gyvūnų ilgį (t. y. kūno ilgį, išskyrus analinį dyglį). Kiti parametrai, kuriuos galima išmatuoti ar apskaičiuoti, yra pirmosios vados (ir vėlesnių vadų) atsiradimo laikas, vieno gyvūno vadų skaičius ir dydis, neapvaisintų kiaušinėlių skaičius, vyriškosios lyties atstovų ar ephippia buvimas ir populiacijos prieaugio būdingasis greitis.

1.8.9 Analizinių nustatymų ir kitų matavimų dažnis

Deguonies koncentracija, temperatūra, kietumas ir pH vertės turi būti matuojamos bent kartą per savaitę prieš ir po terpės atnaujinimo ir induose su didžiausia bandomosios medžiagos koncentracija ir atliekant kontrolinį (-ius) bandymą (-us).

Atliekant bandymą, bandomosios medžiagos koncentracijos vertės nustatomos reguliariais laiko tarpais.

Jei pusiau statiniuose bandymuose daroma prielaida, kad bandomosios medžiagos koncentracija lieka vardinės koncentracijos ± 20 % vertės (t. y. 80 -120 %, žr. 1.4 ir 1.8.4), rekomenduojama nustatyti bent didžiausią ir mažiausią bandomąją koncentraciją iš karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jį atnaujinant pirmąją bandymo savaitę (t. y. turi būti atliekama to paties tirpalo mėginių analizė iš karto po tirpalo paruošimo ir jį atnaujinant). Vėliau tokia analizė turi būti kartojama bent kas savaitę.

Jei yra tokių bandymų, kuriuos atliekant nesitikima, kad koncentracija liks vardinės koncentracijos ± 20 % vertės, būtina analizuoti visų koncentracijos verčių bandomuosius tirpalus iš karto po jų paruošimo ir prieš pat atnaujinant. Bandymuose, kur išmatuota pradinė bandomosios medžiagos koncentracija nepatenka į (± 20) % vardinės vertės diapazoną, bet galima gauti pakankamai įrodymų, kad pradinės koncentracijos vertės yra pakartojamos ir stabilios (t. y. 80 – 120 % pradinės koncentracijos verčių), antrą ar trečią bandymo savaitę cheminių analizių skaičių galima sumažinti ir apsiriboti didžiausios ir mažiausios bandomosios koncentracijos nustatymu. Visais atvejais prieš atnaujinimą turi būti daromas tik vieno lygiagretaus kiekvienos koncentracijos bandymo bandomosios koncentracijos nustatymas.

Jei atliekamas dinaminis bandymas, tinka pusiau statinių bandymų bandinių ėmimo režimas (bet „senų“ tirpalų analizės šiuo atveju nebėra). Tačiau, norint patikrinti bandomosios koncentracijos verčių stabilumą, patartina pirmąją savaitę bandinius imti dažniau (pvz., trims matavimų serijoms). Šio tipo bandymuose skiediklio srautas ir bandomoji medžiaga turi būti kontroliuojami kasdien.

Jei yra įrodymų, kad bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymą gali būti išlaikyta vardinės koncentracijos ar išmatuotos pradinės koncentracijos vertės ± 20%, rezultatai gali būti išreikšti, remiantis vardinėmis arba išmatuotomis pradinėmis vertėmis. Jei vardinės ar išmatuotos pradinės koncentracijos nuokrypis yra didesnis kaip ± 20 %, rezultatai turėtų būti išreiškiami kaip laiko svorinis vidurkis (žr. 5 priedą).

2. DUOMENYS IR ATASKAITA

2.1 REZULTATŲ APDOROJIMAS

Šio bandymo tikslas – nustatyti, kokį poveikį daro bandomoji medžiaga bendrajam palikuonių kiekiui, kuriuos produkuoja kiekvienas iki bandymo pabaigos išlikęs gyvas motininis gyvūnas. Bendras vieno motininio gyvūno palikuonių skaičius apskaičiuojamas pagal kiekvieno bandymų indo duomenis (t. y. lygiagrečiojo bandymo). Jei, atliekant bandymą, kuriame nors inde motininis gyvūnas nugaišta arba pasirodo, kad yra vyriškosios lyties, lygiagretusis bandymas iš analizės pašalinamas. Tuomet analizė bus atliekama remiantis mažesniu skaičiumi lygiagrečiųjų bandymų.

Norint įvertinti LOEC, taigi ir NOEC, susijusią su cheminės medžiagos poveikiu reprodukcijai, būtina apskaičiuoti visų kiekvienos koncentracijos lygiagrečiųjų bandymų vidutinį reprodukcijos našumą ir grupinį liekamąjį standartinį nuokrypį. Tai galima atlikti, taikant dispersinę analizę. Toliau kiekvienos koncentracijos vidutinė vertė turi būti palyginta su kontrolinio bandymo vidutine verte, taikant atitinkamą daugybinio lyginimo metodą. Gali būti naudingi Dunnetto ar Williamso kriterijai (14) (15) (16) (17). Būtina patikrinti, ar taikant dispersinę analizę galioja sklaidos homogeniškumo prielaida. Rekomenduojama tai daryti grafiškai, o ne taikant formalų reikšmingumo kriterijų (18); tinkama alternatyva būtų Bartletto kriterijus. Jei ši prielaida negalioja, reikėtų numatyti duomenų transformavimą, homogenizuojant sklaidas, ar atlikti svorinę dispersinę analizę. Tai daryti prieš atliekant dispersinę analizę. Taikant dispersinę analizę, aptinkamo poveikio dydis (t. y. mažiausias reikšmingas skirtumas) turi būti apskaičiuotas ir pateiktas ataskaitoje.

Koncentracijai, kuri sukeltų reprodukcijos našumo sumažėjimą 50 % (t. y. EC₅o), įvertinant pagal duomenis, turi būti pritaikyta tinkama kreivė, pvz., logistinė kreivė, taikant statistinį, pvz., mažiausių kvadratų, metodą. Kreivė galėtų būti sudalyta taip, kad EC₅o ir jos standartinė paklaida būtų įvertinta tiesiogiai. Taip būtų lengviau apskaičiuoti EC₅₀ pasikliovimo rėžius. Jei nėra svarbių priežasčių, kodėl turėtų būti naudojami kiti pasikliovimo lygiai, turi būti nurodytos dvipusės 95 % pasikliovimo ribos. Pritaikymo metodika turėtų numatyti būdą, kaip įvertinti atitikties nebuvimo reikšmingumą. Tai galima padaryti grafiškai arba liekamąją kvadratų sumą padalijus į „atitikties nebuvimo“ dalį ir „grynos paklaidos komponentų“ dalį. Tuomet galima atlikti atitikties nebuvimo reikšmingumo tikrinimą. Esant apdorojimo atvejų, dėl kurių vaisingumas būna didelis, gali būti didesnė jauniklių skaičiaus sklaida negu tuomet, kai yra apdorojimo atvejų, dėl kurių vaisingumas būna mažas. Reikėtų atsižvelgti į galimybę taikyti svorinius koeficientus, kad būtų galima atspindėti skirtingų apdorojimo grupių skirtingą sklaidą (žr. (18) nuorodą, kurioje yra pateikti teoriniai pagrindai).

Analizuojant galutinio tarplaboratorinio bandymo duomenis (2), logistinė kreivė buvo pritaikyta imant šį modelį, nors galima taikyti ir kitus tinkamus modelius:

Čia:

Y – bendras jauniklių skaičius, tenkantis vienam gyvam motininiam gyvūnui bandymo pabaigoje (apskaičiuotas kiekvienam indui),

X – medžiagos koncentracija,

C – laukiamas jauniklių skaičius, kai x = 0,

X₀ – populiacijos EC₅₀,

b – krypties koeficiento parametras.

Šis modelis turėtų tikti daugeliui situacijų, tačiau pasitaiko bandymų, kuriems jis netinka. Reikėtų patikrinti modelio pagrįstumą, kaip užsiminta pirmiau. Kai kuriais atvejais gali tikti Hormesis modelis, kurį taikant būna didesnis mažų koncentracijos verčių poveikis (19).

Gali būti įvertintos kitos poveikio koncentracijos vertės, pvz., EC₁₀ ar EC₂₀, bet nustatant modelio parametrus geresnis gali pasirodyti kitas būdas, o ne tas, kuris buvo naudotas įvertinant EC₅o.

2.2 BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje turi būti:

2.2.1. Bandomoji medžiaga

- fizinė būsena ir atitinkamos fizinės bei cheminės savybės;

- cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynumą.

2.2.2. Bandymo gyvūnai

- klonas (jei nustatytas jo genotipas), tiekėjas ar šaltinis (jei žinomas) ir taikytos auginimo sąlygos. Jei naudojama ne Daphnia magna rūšis, tai turi būti nurodyta ataskaitoje ir pagrįsta.

2.2.3. Bandymo sąlygos

- naudota bandymo metodika (pvz., pusiau statinis ar dinaminis bandymas, tūris, įkrova ir dafnijų skaičius litre);

- apšvietimo trukmė ir šviesos intensyvumas;

- bandymo planas (pvz., lygiagrečiųjų bandymų skaičius, vieno lygiagrečiojo bandymo motininių gyvūnų skaičius);

- naudotos auginimo terpės išsamus apibūdinimas;

- organinės medžiagos priedai, jei naudoti, įskaitant sudėtį, šaltinį, ruošimo metodą, pradinių tirpalų BOA ir ChDS, gautų bandymo terpės BOA ir ChDS verčių įvertinimas;

- išsami informacija apie šėrimą, įskaitant pašaro kiekį (mg C/Daphnia/parai) ir programa (pvz., pašaro (-ų) tipas, įskaitant, jei tai dumbliai, specialųjį pavadinimą (rūšį) ir, jei žinomas, kamieną, auginimo sąlygas);

- pradinių tirpalų paruošimo metodas ir atnaujinimo dažnumas (tirpiklis ar disperguojanti medžiaga, jei naudojami, ir jų koncentracija).

2.2.4. Rezultatai

- visų išankstinių bandomosios medžiagos stabilumo tyrimų rezultatai,

- bandomosios koncentracijos vardinės vertės ir analizių rezultatai, reikalingi bandymų induose nustatant medžiagos kiekį (žr. 4 priedo duomenų lentelių

pavyzdžius); taip pat ataskaitoje pateikiamas metodo tikslumas ir nustatymo riba,

- vandens kokybė bandymų induose (t. y. pH, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, BOA ir (ar) ChDS bei kietumas, jei reikia) (žr. 3 priedą,

duomenų lentelės pavyzdys),

- išsamus kiekvieno motininio gyvūno gyvų palikuonių registravimas (žr. 3 priedą, duomenų lentelės pavyzdys),

- nugaišusių motininių gyvūnų skaičius ir diena (žr. 3 priedą, duomenų lentelės pavyzdys),

- kontrolinių bandinių vaisingumo variacijos koeficientas (pagrįstas bendruoju gyvų palikuonių skaičiumi, tenkančiu vienam iki bandymo pabaigos

gyvam išlikusiam motininiam gyvūnui),

- vienam iki bandymo pabaigos gyvam išlikusiam motininiam gyvūnui tenkančio gyvų palikuonių bendro skaičiaus (kiekvienam tuo pat metu atliekamam

bandiniui) ir bandomosios medžiagos koncentracijos grafikas,

- mažiausia stebimo poveikio reprodukcijai koncentracija (LOEC), įskaitant taikytų statistinių metodikų aprašymą ir nurodymą, kokio dydžio poveikio

pasekmių gali būti aptikta, ir nepastebimo poveikio reprodukcijai koncentracija (NOEC); jei tinka, taip pat turi būti pateikta motininių gyvūnų gaištamumo LOEC ir NOEC,

- jei reikia, reprodukcijos EC_X ir pasikliovimo intervalai bei ją apskaičiuoti taikyto modelio grafikas, dozės ir atsako kreivės krypties koeficientas, jos

standartinė paklaida,

- kiti stebėti biologiniai rezultatai ar matavimai: pateikiami visi kiti pastebėti ar matuoti biologiniai rezultatai (pvz., motininių gyvūnų augimas), įskaitant

kiekvieno iš jų pagrindimą,

- bet kokio nukrypimo nuo bandymo metodo pagrindimas.

3. NUORODOS

1)OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University,UK,20-21 March 1993.

2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.

3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C, Soares A. M. V. M. and Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicology and Environmental Safety, 21,257 – 265 p.

4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154,25-33 p.

5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4 – 90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.

6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol.,47, 775-782 p.

7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 p.

8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Lokke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), 144 – 148 p.

9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity Testwith Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol, 26, 1 – 8 p.

10) Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water ąuality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol, 120(2), 185-196 p.

11) Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F – 1990. Biologice Prace, 36,209.

12) Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a Standard Daphnia juvenile production tęst. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 2053-2058 p.

13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128,459 – 466 p.

14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc, 50,1096 – 1121 p. (15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20,482 — 491 p.

16) Williams D. A. (1971). A Test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103 – 117 p.

17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, 510 – 531 p.

18) Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.

19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96 p.

20) Wilson E. O. and Bossert, W. H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.

21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, 532 p.

22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L. and Boyce M. S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67,1156-1166 p.

1 priedas

VISIŠKAI APIBRĖŽTŲ ELENDT M7 IR M4 TERPIŲ RUOŠIMAS

Aklimatizavimas Elendt M7 ir M4 terpėje

Kai kurios laboratorijos turėjo sunkumų, perkeliant dafnijas tiesiai į M4 (1) ir M7 terpes. Tačiau šiek tiek pasisekė aklimatizuojant pamažu, t.y. perkeliant dafnijas iš jų terpės į 30 % ELENDT, vėliau į 60 % ELENDT ir pagaliau į 100 % ELENDT. Aklimatizavimas gali trukti visą mėnesį.

RUOŠIMAS

Mikroelementai

Atskirų mikroelementų pradiniai tirpalai (I) iš pradžių ruošiami, naudojant tinkamo grynumo vandenį pvz., dejonizuotą, distiliuotą arba atvirkščiosios osmozės būdu gautą vandenį. Iš šių skirtingų tirpalų (I) ruošiamas antras pradinis tirpalas (H), kuriame yra visų mikroelementų (bendras tirpalas), t.y.:

I Pradinis tirpalas (atskira medžiaga)	Į vandenį įdėtas kiekis (mg/l)	Koncentracija (lyginant su M4 terpe) (kartų)	Ruošiant bendrą II pradinį tirpalą, į vandenį įpilto I pradinio tirpalo tūris, ml/l
I Pradinis tirpalas (atskira medžiaga)	Į vandenį įdėtas kiekis (mg/l)	Koncentracija (lyginant su M4 terpe) (kartų)	M4	M7
H₃BO₃	57 190	20 000	1,0	0,25
MnCl₂ x 4H₂O	7210	20 000	1,0	0,25
LiCl	6 120	20 000	1,0	0,25
RbCl	1420	20 000	1,0	0,25
SrCl₂ x 6H₂O	3 040	20 000	1,0	0,25
NaBr	320	20 000	1,0	0,25
Na₂MoO₄ x 2H₂O	1260	20 000	1,0	0,25
CuCl₂ x 2H₂O	335	20 000	1,0	0,25
ZnCl₂	260	20 000	1,0	1,0
CoCl₂ x 6H₂O	200	20 000	1,0	1,0
KI	65	20 000	1,0	1,0
Na₂Se0₃	43,8	20 000	1,0	1,0
NH₄VO₃	11,5	20 000	1,0	1,0
Na₂EDTA x 2H₂O	5 000	2 000	-	-
FeSO₄ 7H₂O	1991	2 000	_	_
Na₂EDTA ir FeSO₄ tirpalai ruošiami atskirai, vėliau supilami kartu ir iš karto apdorojami autoklave. Taip gaunamas:
2 1 Fe-EDTA tirpalas		1000	20,0	5,0

M4 ir M7 terpės

M4 ir M7 terpės, naudojant II pradinį tirpalą, makroelementus ir vitaminus, yra ruošiamos taip:

	Į vandenį įdėtas kiekis, mg/l	Koncentracija (lyginant su M4 terpe) (kartų)	Terpei paruošti įpilto pradinio tirpalo tūris, ml/l
			M4	M7
II pradinis visų mikroelementų tirpalas		20	50	50

Mitybinių makroelementų pradiniai tirpalai (atskira medžiaga)

CaCl₂ x 2 H₂O	293 800	1000	1,0	1,0
MgSO₄ x 7H₂O	246 600	2 000	0,5	0,5
KC1	58 000	10 000	0,1	0,1
NaHCO₃	64 800	1000	1,0	1,0
Na₂Si0₃x9H₂0	50 000	5 000	0,2	0,2
NaNO₃	2 740	10 000	0,1	0,1
KH₂PO₄	1430	10 000	0,1	0,1
K₂HPO₄	1 840	10 000	0,1	0,1
Vitaminų mišinio pradinis tirpalas	-	10 000	0,1	0,1

Vitaminų mišinio pradinis tirpalas ruošiamas, į 1 litrą vandens dedant tokį šių vitaminų kiekį:

Tiamino hidrochloridas	750	10 000	-	-
Ciankobalaminas (B₁₂)	10	10 000	-	-
Biotinas	7,5	10 000	-	-

Vitaminų mišinio pradinis tirpalas laikomas užšaldytas mažomis lygiomis dalimis. Į terpę vitaminų dedama prieš pat naudojimą.

Pastabos: Kad būtų išvengta druskų nuosėdų susidarymo galutinėje terpėje, lygios pradinio tirpalo dalys įpilamos į maždaug 500 — 800 ml dejonizuoto vandens ir praskiedžiamos taip, kad susidarytų 1 litras.

Pirmąją publikaciją apie M4 terpę galima rasti Elendt, B.P. (1990). Selenium dęficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154,25 — 33 p.

2 priedas

BENDROS ORGANINĖS ANGLIES (BOA) ANALIZĖ IR DUMBLIŲ MAISTO BOA KIEKIO NOMOGRAMŲ GAVIMAS

Pripažinta, kad dumblių pašaro anglies kiekis tiesioginiu metodu dažniausiai nematuojamas, bet taikoma jo koreliacija (t. y. nomogramos) su pakeičiamais paprastesniais parametrais, pvz., dumblių ląstelių skaičiumi ar tariamu suspensijos optiniu tankiu.

BOA reikėtų matuoti taikant oksidavimo, esant aukštai temperatūrai, metodą, bet ne UV ar persulfatinį metodą (žr. The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).

Nomogramai gauti dumbliai ir auginimo terpė atskiriami centrifuguojant, vėliau dumbliai vėl suspenduojami distiliuotame vandenyje. Kiekvieno bandinio supaprastintas dydis ir BOA koncentracija matuojami tris kartus. Analizuojami distiliuoto vandens tuštieji bandiniai ir jų BOA koncentracija atimama iš dumblių bandinio BOA koncentracijos.

Nomograma nustatytam anglies koncentracijų diapazonui turėtų būti tiesinė. Pavyzdžiai pateikti toliau.

NB. Jų negalima naudoti perskaičiuojant; svarbu, kad laboratorijos turėtų savo sudarytas nomogramas.

Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 211/12).

Sausos masės mg/l ir mg C/l regresija. Koncentruotų suspensijų, gautų iš pusiau nepertraukiamu būdu auginamų ląstelių partijų ir pakartotinai suspenduotų distiliuotame vandenyje, duomenys.

Sauso koncentruoto dumblių pašaro masė mg/l

Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 211/12).

Ląstelių skaičiaus ir mg C/l regresija.

Koncentruotų suspensijų, gautų iš pusiau nepertraukiamu būdu auginamų ląstelių partijų ir pakartotinai suspenduotų distiliuotame vandenyje, duomenys.

Koncentruoto dumblių pašaro ląstelių skaičius/ 1(x 10⁸)

Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 112/12).

Šviesos absorbcijos faktoriaus ir mg C/l regresija. (1 cm kiuvetė)

Koncentruotų suspensijų, gautų iš pusiau nepertraukiamu būdu auginamų ląstelių partijų ir pakartotinai suspenduotų distiliuotame vandenyje, duomenys.

1/10 praskiesto koncentruoto dumblių maisto šviesos absorbcijos faktorius esant 440 nm bangos ilgiui

3 Priedas

TERPĖS ATNAUJINIMO, FIZINIO IR CHEMINIO MONITORINGO, MAITINIMO, DAFNIJŲ REPRODUKCIJOS IR SUAUGUSIŲ GYVŪNŲ GAIŠTAMUMO DUOMENŲ REGISTRACIJOS LENTELĖS PAVYZDYS

Bandymo Nr.	Pradžios data:					Klonas:				Terpė:				Maisto tipas:				Bandomoji medžiaga					Vardinė konc.
	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21
Terpės atnaujinimas (dėti varnelę)
pH¹																							naujos
pH¹																							senos
O₂mg/l¹																							naujos
O₂mg/l¹																							senos
Temperatūra ^oC¹																							naujos
Temperatūra ^oC¹																							senos
Duota pašaro (dėti varnelę)
Nėra gyvulių palikuonių²																								Bendras
1 indas
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Bendrasis suaugusių gyvūnų gaištamumas³																							Bendras

¹Nurodomas bandymui naudotas indas

²Registruojami neapvaisinti kiaušiniai, atitinkamame langelyje įrašant „AB“

³ Registruojamas visų suaugusių gyvūnų gaištamumas, atitinkamame langelyje įrašant „M”

4 Priedas

CHEMINĖS ANALIZĖS REZULTATŲ REGISTRAVIMO LENTELĖS PAVYZDYS

a) Išmatuotos koncentracijos vertės

	1 savaitės bandinys		2 savaičių bandinys		3 savaičių bandinys
Vardinė konc.	Šviežias	Senas	Šviežias	Senas	Šviežias	Senas

b) Išmatuotos koncentracijos vertės, išreikštos vardinės koncentracijos procentine dalimi

	1 savaitės bandinys		2 savaičių bandinys		3 savaičių bandinys
Vardinė konc.	Šviežias	Senas	Šviežias	Senas	Šviežias	Senas

5 Priedas

LAIKO SVORINIO VIDURKIO APSKAIČIAVIMAS

Laiko svorinis vidurkis

Darant prielaidą, kad bandomosios medžiagos koncentracija tarp terpės atnaujinimų gali mažėti, būtina nustatyti koncentracijos vertę, kuri atspindėtų motinines dafnijas veikiančios medžiagos koncentracijos verčių ribas. Pasirinkimas turi būti pagrįstas biologiniais ir statistiniais sumetimais. Pvz., jei manoma, kad reprodukciją labiausiai veikia didžiausia koncentracija, reikia naudoti didžiausios koncentracijos vertę. Jei svarbesniu laikomas kaupiamasis ar ilgalaikis toksiškas medžiagos poveikis, tinkamesnis yra koncentracijos vidurkis. Šiuo atveju tinkamas naudoti vidurkis yra laiko svorinė vidutinė koncentracijos vertė, nes ją nustatant atsižvelgiama į momentinį koncentracijos kitimą per tam tikrą laiką.

1 paveikslas. Laiko svorinio vidurkio pavyzdys

1 paveiksle pateiktas septynių parų trukmės (supaprastinto) bandymo pavyzdys, terpę atnaujinant 0,2 ir 4 parą.

- Zigzagas, nubrėžtas plona linija, rodo koncentracijos vertę bet kurį matavimo momentą. Daroma prielaida, kad koncentracijos mažėjimas atitinka irimo pagal eksponentę procesą.

- Šeši pažymėti taškai rodo stebimas koncentracijų vertes, išmatuotas kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje.

- Stora linija rodo laiko svorinio vidurkio vietą.

Laiko svorinis vidurkis apskaičiuojamas taip, kad plotas po laiko svorinio vidurkio tiese yra lygus plotui po koncentracijos kitimo kreive. Pirmame paveiksle pateikto pavyzdžio apskaičiavimas parodytas 1 lentelėje.

1 lentelė. Laiko svorinio vidurkio apskaičiavimas (LS)

Atnaujinimo Nr.	Paros	Conc0	Conc1	ln(Conc0)	ln(Conc1)	Plotas
1	2	10,000	4,493	2,303	1,503	13,767
2	2	11,000	6,037	2,398	1,798	16,544
3	3	10,000	4,066	2,303	1,403	19,781
Bendras parų skaičius: 7					Bendras plotas	50,091
Bendras parų skaičius: 7					LS vidurkis	7,156

„Paros“ – atnaujinimo laikotarpio parų skaičius,

„Conc0“ – kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje išmatuota koncentracija,

„Conc1“ – kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pabaigoje išmatuota koncentracija,

„ln(Conc0)“ – Conc0 natūralusis logaritmas,

„ln(Conc1)“ – Conc1 natūralusis logaritmas,

„Plotas“ – plotas po eksponentės kreive kiekvieną atnaujinimo laikotarpį. Jis apskaičiuojamas:

Laiko svorinis vidurkis („LS vidurkis“) yra „bendro ploto“ ir „bendro parų skaičiaus“ dalmuo.

Savaime aišku, kad atliekant dafnijų reprodukcijos bandymą, lentelė turėtų būti išplėsta iki 21 paros.

Aišku, kad matuojant tik kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje, neįmanoma patvirtinti, kad irimo procesas iš tikrųjų vyksta eksponentiškai. Esant kitokiai kreivei, būtų gautas kitas „ploto“ apskaičiavimo rezultatas. Irimo pagal eksponentinę kreivę procesas nėra nekeliantis pasitikėjimo ir, nesant kitos informacijos, tai yra tinkamiausia taikyti kreivė.

Jei atnaujinimo laikotarpio pabaigoje, atlikus cheminę analizę, visiškai nerandama bandomosios medžiagos, dėl atsargumo reikia atlikti visų ankstesnių duomenų peržiūrą. Jei negalima įvertinti, kaip greitai medžiaga išnyko iš tirpalo, neįmanoma gauti tikrojo ploto po kreive, taigi neįmanoma gauti priimtino laiko svorinio vidurkio.

______________

Papildyta priedu:

Nr. D1-193, 2004-04-19, Žin., 2004, Nr. 64-2287 (2004-04-29), i. k. 104301MISAK00D1-193

Pakeitimai:

Lietuvos Respublikos aplinkos ministerija, Įsakymas

Nr. 354, 2003-07-09, Žin., 2003, Nr. 71-3295 (2003-07-18), i. k. 103301MISAK00000354

Dėl aplinkos ministro 2002 m. sausio 3 d. įsakymo Nr. 4 "Dėl aplinkos apsaugos normatyvinio dokumento LAND 45-2001 patvirtinimo" pakeitimo

Lietuvos Respublikos aplinkos ministerija, Įsakymas

Nr. D1-193, 2004-04-19, Žin., 2004, Nr. 64-2287 (2004-04-29), i. k. 104301MISAK00D1-193

Dėl aplinkos apsaugos normatyvinio dokumento LAND 45-2003 patvirtinimo

^* Norint išvengti gyvsidanbrio diseminavimo aplinkoje, panaudoti tirpalai su gyvsidabrio druskomis turi būti apdoroti

^{^[1]} OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, Fish, Early-life Stage Toxicity Test.

^{^[2]} Bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracijos (C^ads_aq) kitimo laike grafikai taip pat gali būti panaudoti nustatant, ar pasiekta pusiausvyros horizontalioji kreivės dalis (žr. 5 priedo 2 pav.).

^{^[3]} DT-50: laikas, per kurį suskaidoma 50 % bandomosios medžiagos.

^{^[4]} Lygtis tinka tiesioginiam ir netiesioginiam metodui. Visos kitos lygtys tinka tik netiesioginiam metodui.

^{^[5]} Lygtis tinka tiesioginiam ir netiesioginiam metodui. Visos kitos lygtys tinka tik netiesioginiam metodui.

^{^[6]} Lygtis tinka tiesioginiam ir netiesioginiam metodui. Visos kitos lygtys tinka tik netiesioginiam metodui.

^{^[7]} Lygtis tinka tiesioginiam ir netiesioginiam metodui. Visos kitos lygtys tinka tik netiesioginiam metodui.

^{^[8]} Lygtis tinka tiesioginiam ir netiesioginiam metodui. Visos kitos lygtys tinka tik netiesioginiam metodui.

^{^[9]} Lygtis tinka tiesioginiam ir netiesioginiam metodui. Visos kitos lygtys tinka tik netiesioginiam metodui.