Įsakymas netenka galios 2020-04-11:
Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministerija, Įsakymas
Nr. 3D-284, 2020-04-10, paskelbta TAR 2020-04-10, i. k. 2020-07707
Dėl kai kurių žemės ūkio ministro įsakymų pripažinimo netekusiais galios
Suvestinė redakcija nuo 2004-04-07 iki 2020-04-10
Įsakymas paskelbtas: Žin. 2002, Nr. 5-202, i. k. 1012330ISAK00000468
LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS
Į S A K Y M A S
DĖL SPIRAMICINO KIEKIO PAŠARUOSE NUSTATYMO TECHNINIO REGLAMENTO PATVIRTINIMO
2001 m. gruodžio 28 d. Nr. 468
Vilnius
Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos pašarų įstatymu (Žin., 2000, Nr. 34-952) ir atsižvelgdamas į Europos Sąjungos direktyvos 84/425/EEB, nustatančios analizės metodus, taikomus oficialiai kokybės kontrolei:
Patvirtinta
Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro
2001 m. gruodžio 28 d. įsakymu Nr. 468
spiramicino kiekio pašaruose nustatymo techninis reglamentas
Parengtas pagal 1984 m. liepos 25 d. dešimtąją Europos Komisijos direktyvą 84/425/EEB „Dėl Bendrijos cheminės analizės metodų, kuriuos valstybės institucijos taiko pašarams kontroliuoti“.
I. Bendrosios nuostatos
1. Šis techninis reglamentas nustato į rinką tiekiamų pašarinių žaliavų, kombinuotųjų pašarų cheminės analizės metodus pašarų kokybės valstybinei kontrolei vykdyti. (Tačiau kai kuriems pašarams dėl jiems būdingų sudėties savybių reikia taikyti atskirus, tik jiems tinkamus cheminės analizės metodus. Šie atvejai nurodyti metodų aprašymuose su nuoroda „Pastabos“.)
2. Jei pašarų analitei nustatyti taikomi du ar daugiau metodų, taikomą metodą, jei nenurodyta kitaip, pasirenka cheminę analizę atliekanti laboratorija, tačiau šis metodas turi būti nurodomas analizės sertifikate.
3. Šio techninio reglamento reikalavimų privalo laikytis visi prekinius pašarus gaminantys, laikantys, gabenantys, naudojantys, tarpininkaujantys juos parduodant ir jais prekiaujantys ūkio subjektai ir pašarų kokybės valstybinė kontrolės institucija.
II. Sąvokos ir sutrumpinimai
5. Šiame techniniame reglamente vartojamos sąvokos:
Nustatymo riba – kiekybinės analizės metodu ieškomo komponento mažiausias kiekis arba koncentracija, dar duodantys išmatuojamą analizinį signalą.
Spiramicinas – spiramicino I, spiramicino II ir spiramicino III mišinys.
Kitos šiame reglamente vartojamos sąvokos turi tą pačią reikšmę kaip Lietuvos Respublikos pašarų įstatyme (Žin., 2000, Nr. 34-952) ir žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 205 (Žin., 2000, Nr. 69-2064) patvirtintame Pašarų klasifikatoriuje.
6. Metodų aprašymuose vartojami cheminių junginių trivialieji pavadinimai ir juos atitinkantys IUPAC terminai:
agar-agaras – agaras, C12H18O9n;
gliukozė – C6H12O6;
kalio-divandenilio fosfatas – kalio-divandenilio tetraoksofosfatas, KH2PO4;
kalio-vandenilio fosfatas – dikalio-vandenilio tetraoksofosfatas, K2HPO4;
metanolis – CH3OH;
natrio chloridas – NaCl;
natrio-vandenilio karbonatas – natrio-vandenilio trioksokarbonatas, NaHCO3.
spiramicinas I – C45H78N2O15;
spiramicinas II – C47H80N2O16;
spiramicinas III – C48H82N2O16.
III. Mėginių paruošimas cheminei analizei
8. Pašarų cheminių analizių metodų bendrosios nuostatos:
8.1. Mėginių paruošimas cheminėms analizėms:
8.1.1. aprašyti veiksmai toliau taikomi galutiniams mėginiams (toliau – mėginiai), atsiųstiems į kontrolės laboratorijas po mėginių paėmimo pagal žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 208 (Žin., 2000, Nr. 60-1786) patvirtintą Pašarų mėginių paėmimo ir paruošimo techninį reglamentą;
8.2. Būtinos atsargumo priemonės mėginių paruošimo metu:
8.2.1. visi būtini veiksmai turi būti atliekami išvengiant mėginio užteršimo ir jo sudėties pokyčio. Malimas, maišymas ir sijojimas turi būti atliekami kaip galima greičiau, kuo trumpiau mėginį veikiant oru ir šviesa. Neturi būti naudojami malūnai ir smulkintuvai, pastebimai įšildantys mėginį. Pašarus, kurie yra ypatingai jautrūs šilumai, rekomenduojama smulkinti rankomis. Reikėtų įsitikinti, kad patys prietaisai nėra mikroelementų taršos šaltinis;
8.2.2. jei mėginys negali būti paruoštas be ženklaus mėginio drėgnio pokyčio, prieš paruošimą ir po jo nustatomas drėgnis pagal žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 206 (Žin., 2000, Nr. 60-1784) patvirtintą Drėgnio, lakiųjų azoto bazių, suminio fosforo, žalio aliejaus ir riebalų kiekio nustatymo pašaruose techninį reglamentą.
8.3. Galutinio mėginio paruošimo eiga:
8.3.1. galutinis mėginys kruopščiai sumaišomas maišytuvu arba rankomis. Mėginys padalijamas į dvi lygias dalis (jei tinka, turi būti naudojamas ketvirčiavimo metodas). Viena dalis saugoma tinkamoje švarioje, sausoje talpykloje, su oro nepraleidžiančiu kamščiu, antroji dalis (arba jai būdinga mažiausiai 100 g dalis) paruošiama kaip nurodyta toliau:
8.3.1.1. pašarai gali būti malami iš karto, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip.
Visas sumaltas mėginys persijojamas per sietą su kvadratinėmis akutėmis, kurios kraštinės ilgis 1 mm (pagal rekomendaciją ISO R565). Vengiama per smulkaus sumalimo. Persijotas mėginys išmaišomas ir surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei, mėginys vėl išmaišomas;
8.3.1.2. pašarai gali būti sumalami juos išdžiovinus, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip; mėginys džiovinamas, siekiant sumažinti drėgnį iki 8 % – 12 % pagal parengtinio džiovinimo procedūrą, nurodytą drėgnio nustatymo metodo 4.3 punkte. Toliau dirbama, kaip nurodyta šio techninio reglamento 8.3.1.1 punkte;
8.3.1.3. skysto ir pusiau skysto pašaro mėginys surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys kruopščiai išmaišomas;
8.4. Mėginiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Mėginiai, kuriuose numatyta analizuoti vitaminus ar kitas iš dalies šviesai jautrias medžiagas, turi būti laikomi rudo stiklo induose.
8.5. Reikalavimai reagentams ir prietaisams, naudojamiems cheminės analizės metoduose:
8.5.1. visi analiziniai reagentai turi būti analiziškai gryni (a. p.), jei cheminės analizės metoduose nenurodyta kitaip. Nustatant mikroelementus, reagentų grynumas turi būti tikrinamas „tuščiuoju“ bandymu. Atsižvelgiant į gautą rezultatą, gali būti reikalingas tolesnis reagentų gryninimas;
8.5.2. jei analizės metodų veiksmuose, susietuose su tirpalų ruošimu, skiedimu, skalavimu ar plovimu, nenurodoma naudojamo tirpiklio ar skiediklio prigimtis, suprantama, kad turi būti naudojamas vanduo. Vanduo turi būti tik demineralizuotas ar distiliuotas. Kai kuriais analizių metoduose nurodytais atvejais jis turi būti gryninamas specialiomis priemonėmis;
8.6. Cheminės analizės metodų taikymas ir rezultatų išraiška:
8.6.1. kiekviena medžiaga pašaruose paprastai nustatoma atskiru metodu. Jei yra pateikta keletas metodų, kontrolės laboratorijoje naudotas metodas turi būti nurodomas analizės ataskaitoje;
8.6.2. analizės ataskaitoje pateikiamas rezultatas išreiškiamas mažiausiai dviejų matavimų, atliktų su atskiromis mėginio dalimis, vidurkiu, esant patenkinamam šių matavimų pakartojamumui. Šis rezultatas išreiškiamas reikšmingų skaitmenų skaičiumi analizės metoduose nurodytu būdu ir, jei reikia, koreguojamas pagal drėgnio kiekį, esantį galutiniame mėginyje prieš jo paruošimą.
IV. Mėginių cheminė analizė
Spiramicino kiekio pašaruose
nustatymo techninio reglamento
priedas
Spiramicino NUSTATYMAS MATUOJANT DIFUZIJĄ AGARE
1. Tikslas ir taikymo sritis
Šiuo metodu nustatomas spiramicino kiekis pašaruose ir premiksuose. Nustatymo riba yra 5 mg/kg.1
2. Metodo esmė
Mėginys ekstrahuojamas metanolio ir fosfatinio-karbonatinio buferinio tirpalo mišiniu esant pH 8. Ekstraktas nupilamas arba centrifuguojamas ir skiedžiamas. Antibiotinis aktyvumas nustatomas matuojant spiramicino difuziją agaro terpėje, kurioje pasėta Micrococcus luteus. Difuzija matoma pagal inhibavimo zonų susidarymą terpėje su pasėtu mikroorganizmu. Šių zonų skersmuo yra proporcingas antibiotiko koncentracijos logaritmui.
3. Mikroorganizmas: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)
3.1. Pradinės bakterijų kultūros laikymas
Mėgintuvėlyje su gulsčiąja mitybine terpe (4.1) pasėjama Micrococcus luteus. Inkubuojama 24 val. 30 oC temperatūroje. Kultūra laikoma šaldytuve 4 oC temperatūroje. Persėjama kas dvi savaites.
3.2. Bakterijų suspensijos ruošimas2.
Bakterijos iš mėgintuvėlio su neseniai paruoštu gulsčiuoju agaru (3.1) surenkamos naudojant 2 ml –3 ml natrio chlorido tirpalo (4.3). Šia suspensija sėjama Roux kolboje su 250 ml mitybinės terpės (4.1) ir inkubuojama 18 – 20 valandų 30oC temperatūroje. Bakterijos surenkamos su 25 ml natrio chlorido tirpalo (4.3) ir sumaišoma. Ši suspensija praskiedžiama 1:10 natrio chlorido tirpalu (4.3). Suspensijos šviesos pralaidumo koeficientas, matuojant 650 nm srityje 1 cm storio kiuvetėje ir lyginant su natrio chlorido tirpalu (4.3), turi būti apie 75 %. Ši suspensija, laikoma 4oC temperatūroje, gali būti naudojama savaitę.
4. Mitybinės terpės ir reagentai:
4.1. Mitybinė terpė:3
| mėsos peptonas |
6,0 g |
| tripsino peptonas |
4,0 g |
| mielių ekstraktas |
3,0 g |
| mėsos ekstraktas |
1,5 g |
| gliukozė |
1,0 g |
| agaras |
10 g–20 g |
| vanduo |
1000 ml |
| pH (po sterilizavimo) |
6,5-6,6. |
4.2. Nustatymo terpė:
| tripsino peptonas |
5,0 g |
| mielių ekstraktas |
4,0 g |
| mėsos ekstraktas |
3,0 g |
| agaras |
10 g–20 g |
| vanduo |
1000 ml |
| pH (po sterilizavimo) |
8,0. |
4.3. Natrio chlorido tirpalas, 0,8 % (m/v): vandenyje ištirpinama 8 g natrio chlorido, skiedžiama vandeniu iki 1000 ml; sterilizuojama.
4.4. Fosfatinis-karbonatinis buferinis tirpalas, pH 8,0:
| kalio vandenilio fosfatas, K2HPO4 |
16,7 g |
| kalio divandenilio fosfatas, KH2PO4 |
0,5 g |
| natrio vandenilio karbonatas, NaHCO3 |
20,0 g |
vanduo, iki 1000 ml.
5. Standartiniai tirpalai
Tiksliai pasvertas standartinės medžiagos (4.6) kiekis ištirpinamas mišinyje (4.5). Skiedžiama tuo pačiu mišiniu, kol gaunamas pradinis standartinis 1000 T. V./ml spiramicino tirpalas.
Šis tirpalas šaldytuve 4 oC temperatūroje uždarame inde gali būti laikomas 5 dienas.
Iš šio tirpalo nuosekliai praskiedžiant mišiniu (4.5) ruošiami šie tirpalai:
| S8 |
1,0 T. V./ml, |
| S4 |
0,5 T. V./ml, |
| S2 |
0,25 T. V./ml, |
| S1 |
0,125 T. V./ml. |
6. Ekstrakto ir bandymo tirpalų paruošimas:
6.1. Ekstrahavimas
Pasveriama 20,0 g pašarų arba 1,0 g – 20,0 g premiksų. Įpilama 100 ml mišinio (4.5) ir 30 min. purtoma. Centrifuguojama arba nupilama. Centrifugatas skiedžiamas mišiniu (4.5) siekiant gauti numatomą 1,0 T. V./ml koncentracijos spiramicino tirpalą (U8).
Jei numatomas spiramicino kiekis pašaruose mažesnis nei 2,5 mg/kg, ekstrahuoti reikia taip: pasveriama 20,0 g mėginio, įpilama 100 ml mišinio (4.5) ir 30 min. purtoma. Centrifuguojama kelias minutes. Paimama 50 ml centrifugato, kurio tūris sukamuoju vakuuminiu garintuvu, esant 40oC temperatūrai, sumažinamas iki 4 ml. Likutis skiedžiamas mišiniu (4.5) siekiant gauti numatomą 1,0 T. V./ml koncentracijos spiramicino tirpalą (=U8).
7. Matavimas:
7.1. Sėjimas į mitybinę terpę
Į nustatymo mitybinę terpę (4.2) apytikriai 50 oC temperatūroje pasėjama bakterijų suspensija (3.2). Pradiniuose terpės (4.2) bandymuose ant lėkštelių nustatomas bakterinės suspensijos kiekis, reikalingas siekiant gauti didžiausias ir aiškiausias inhibavimo zonas su įvairiomis spiramicino koncentracijomis.
7.2. Lėkštelių paruošimas
Difuzija agare atliekama lėkštelėse, naudojant keturių koncentracijų standartinius tirpalus (S8, S4, S2 ir S1) ir keturių koncentracijų bandymo tirpalus; U8, U4, U2 ir U1. Kiekvienoje lėkštelėje turi būti keturių koncentracijų ekstrakto ir standartininiai tirpalai. Kad agaro terpėje būtų galima padaryti bent aštuonias 10 mm – 13 mm skersmens skyles, kurių centrai nutolę mažiausiai per 30 mm, parenkamos pakankamai didelės lėkštelės. Bandymai gali būti atlikti lėkštelėse, padarytose iš stiklo plokštelės, iš viršaus padengtos 200 mm skersmens ir 20 mm aukščio aliuminio ar plastiko žiedu.
Į lėkšteles įpilama toks kiekis pagal 7.1 apsėtos terpės (4.2), kad susidarytų maždaug 2 mm storio sluoksnis (60 ml – 200 mm skersmens lėkštelei). Paliekama sutirštėti horizantalioje padėtyje, išgręžiamos skylės ir į jas įlašinami tiksliai išmatuoti bandymo ir standartinių tirpalų kiekiai (nuo 0,10 ml iki 0,15 ml priklausomai nuo skylės skersmens). Kiekviena koncentracija panaudojama mažiausiai 4 kartus, taigi kiekviename nustatyme atliekamas 32 inhibavimo zonų įvertinimas.
8. Rezultatų įvertinimas
0,1 mm tikslumu išmatuojamas inhibavimo zonų skersmuo. Kiekvienos koncentracijos matavimų vidurkis užrašomas pusiau logaritminiame milimetriniame popieriuje, parodant koncentracijų logaritmo priklausomybę nuo ihibavimo zonų skersmens. Brėžiamos standartinį tirpalą ir ekstraktą atitinkančios tiesės, kaip parodyta tolesniame pavyzdyje. Taikant formulę, nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis mažiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SL):
(a) SL =(7S1+4S2+S4-2S8) / 10
Nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis didžiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SH), taikant formulę:
(b) SH =(7S8+4S4+S2-2S1) / 10
Panašiai apskaičiuojami taškai, geriausiai atitinkantys mažiausią UL ir didžiausią UH koncentraciją ekstrakte, pakeičiant nurodytose formulėse S1, S2, S4 ir S8 į U1, U2, U4 ir U8 (Formulių reikšmės S ir U yra inhibavimo zonų diametrai).
Tame pačiame grafike pažymimos apskaičiuotos SL ir SH vertės ir jas sujungus gaunama geriausiai standartinį tirpalą atitinkanti tiesė. Panašiai pažymėjus ir sujungus UL ir UH vertes, gaunama geriausiai ekstraktą atitinkanti tiesė.
Nesant trukdžių, šios dvi tiesės turėtų būti lygiagrečios. Praktiškai tieses galima laikyti lygiagrečiomis, jei SH – SL ir UH – UL vertės nuo jų vidurkio nesiskiria daugiau kaip 10 %. Jei tiesės nėra lygiagrečios, U1 ir S1 ar U8 ir S8 gali būti atmesti, o SL, SH, UL ir UH apskaičiuojami pagal alternatyvias formules, gaunant alternatyvias geriausiai atitinkančias tieses:
(a) SL = (5S1+2S2-S4) / 6 arba (5S2+2S4-S8) / 6,
(b) SH = (5S4+2S2-S1) / 6 arba (5S8+2S4-S2) / 6.
Panašiai apskaičiuojamos UL ir UH. Turi būti patenkinami tie patys lygiagretumo kriterijai. Faktas, kad rezultatas buvo skaičiuotas pagal tris vertes, turi būti pažymėtas galutinėje ataskaitoje.
Kai tiesės laikomos lygiagrečiomis, santykinio aktyvumo logaritmas (log A) skaičiuojamas pagal vieną iš formulių priklausomai nuo to, trys ar keturios vertės buvo taikomos įvertinant lygiagretumą.
Keturioms vertėms:
(c) log A =.
Trims vertėms:
(d) log A =
arba
(d) log A =.
Mėginio ekstrakto aktyvumas lygus atitinkamo standarto aktyvumui, padaugintam iš A
(U8 = S8 × A).
Jei apskaičiuojama, kad santykinis aktyvumas patenka už diapazono nuo 0,5 iki 2,0 ribų, bandymas kartojamas tinkamai sureguliavus ekstrakto, o jei tai neįmanoma, standartinio tirpalo koncentracijas. Kai santykinis aktyvumas negali būti gaunamas tarp reikalaujamų ribų, bet koks gautas rezultatas laikomas apytiksliu ir turi būti nurodytas galutinėje ataskaitoje.
Jei tiesės laikomos ne lygiagrečiomis, matavimas kartojamas. Jei lygiagretumas vis dar nepasiektas, matavimas laikomas nepatenkinamu.
Rezultatas išreiškiamas miligramais spiramicino kilograme pašaro.
Punkto pakeitimai:
Nr. 3D-135, 2004-03-30, Žin., 2004, Nr. 50-1663 (2004-04-06), i. k. 1042330ISAK003D-135
9. Pakartojamumas
Rezultatų skirtumas tarp dviejų lygiagrečių to paties mėginio matavimų, atliktų to paties analitiko, neturi viršyti:
2 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai spiramicino kiekis siekia iki 10 mg/kg,
20 % didžiausios vertės, kai kiekiai yra nuo 10 mg/kg iki 25 mg/kg,
5 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai kiekiai yra nuo 25 mg/kg iki 50 mg/kg,
10 % didžiausios vertės, kai kiekiai yra daugiau kaip 50 mg/kg.
Pakeitimai:
1.
Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministerija, Įsakymas
Nr. 3D-135, 2004-03-30, Žin., 2004, Nr. 50-1663 (2004-04-06), i. k. 1042330ISAK003D-135
Dėl žemės ūkio ministro 2001 m. gruodžio 28 d. įsakymo Nr. 468 „Dėl Spiramicino kiekio pašaruose nustatymo techninio reglamento patvirtinimo" pakeitimo