LIETUVOS RESPUBLIKOS SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRO

Įsakymas netenka galios 2008-06-01:

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministerija, Įsakymas

Nr. V-94, 2008-02-14, Žin., 2008, Nr. 22-818 (2008-02-23), i. k. 1082250ISAK0000V-94

Dėl kai kurių Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro įsakymų pripažinimo netekusiais galios

Suvestinė redakcija nuo 2006-06-01 iki 2008-05-31

Įsakymas paskelbtas: Žin. 2006, Nr. 15-539, i. k. 1062250ISAK0000V-11

LIETUVOS RESPUBLIKOS SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRO

Į S A K Y M A S

DĖL CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ IR PREPARATŲ, GALINČIŲ SUKELTI PAVOJŲ SVEIKATAI, TOKSIŠKUMO TYRIMO METODŲ APRAŠŲ PATVIRTINIMO

2006 m. sausio 4 d. Nr. V-11

Vilnius

Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų įstatymo (Žin., 2000, Nr. 36-987) 6 straipsnio 2 dalimi, Cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmogaus sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos, patvirtintos Lietuvos Respublikos aplinkos ministro 2000 m. gruodžio 29 d. įsakymu Nr. 762/556 „Dėl Cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmonių sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos“ (Žin., 2001, Nr. 3-60), 11.1 punktu ir įgyvendindamas 2004 m. balandžio 29 d. Komisijos direktyvos 2004/73/EB 29 kartą derinančios su technikos pažanga Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo nuostatas:

1. Tvirtinu pridedamus:

1.1. Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašą;

1.2. Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B. 1 tris) metodo aprašą;

1.3. Ūmaus toksiškumo. Odos dirginimo ar ardymo (B. 4) metodo aprašą;

1.4. Ūmaus toksiškumo. Akies dirginimo ar ardymo (B. 5) metodo aprašą;

1.5. Toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi tyrimo (B. 31) metodo aprašą;

1.6. Toksiško poveikio dviejų kartų reprodukcijai tyrimo (B. 35) metodo aprašą;

1.7. Odos jautrinimo. Vietinio limfmazgio tyrimo (B. 42) metodo aprašą;

1.8. Neurotoksiško poveikio graužikams tyrimo (B. 43) metodo aprašą.

1.9. Skysčių oksiduojamosios savybės (A.21) metodo aprašą.

Papildyta punktu:

Nr. V-421, 2006-05-25, Žin., 2006, Nr. 61-2223 (2006-05-31), i. k. 1062250ISAK000V-421

2. Pripažįstu netekusiais galios:

2.1. Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymo Nr. V-284 „Dėl cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų patvirtinimo“ (Žin., 2004, Nr. 70-2472) 1.2.1, 1.2.4 ir 1.2.5 punktus;

2.2. Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymo Nr. V-508 „Dėl cheminių medžiagų ir preparatų ūmaus, kartotinių dozių, poūmio, lėtinio ir specifinio toksiškumo bei alternatyvių tyrimo metodų patvirtinimo“ (Žin., 2004, Nr. 122-4472) 1.1, 1.8 ir 1.12 punktus.

3. Pavedu įsakymo vykdymą kontroliuoti ministerijos sekretoriui pagal administruojamą sritį.

SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRAS ŽILVINAS PADAIGA

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos

ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11

ŪMAUS TOKSIŠKUMO PER VIRŠKINIMO TRAKTĄ, FIKSUOTŲJŲ DOZIŲ (B.1 BIS) METODO APRAŠAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Šis bandymų metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 420 metodą (2001 m.).

2. Taikant tradicinius metodus ūmaus toksiškumo poveikis įvertinamas pagal gyvūno žūtį. Britų toksikologų draugija (British Toxicology Society) 1984 m. pasiūlė naują ūmaus toksiškumo bandymo būdą, pagrįstą kelių fiksuotų dozių suleidimu (22). Taikant šį būdą išvengiama gyvūnų žūties, kuri būtų poveikio įrodymas; jis pagrįstas aiškių toksiškumo požymių pasireiškimu, kai iš dozių serijos suleidžiama viena fiksuota dozė. Pasibaigus Jungtinės Karalystės (23) ir tarptautinio (24) tinkamumo patvirtinimo tyrimui in vivo, 1992 m. ši procedūra buvo patvirtinta kaip bandymo metodas. Vėliau, taikant matematinius modelius, daugelyje tyrimų buvo įvertintos statistinės fiksuotų dozių metodikos savybės (25)(26)(27). Kartu atliekami in vivo ir modeliavimo tyrimai įrodė metodikos atkuriamumą; ją taikant naudojama mažiau gyvūnų, jiems sukeliamos mažesnės kančios nei taikant tradicinius metodus ir ji leidžia suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus.

3. Patarimus dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą bandymo vadove (28). Be to, šiame vadove yra papildomos informacijos apie B.1 bis bandymo metodo taikymą ir aiškinimą.

4. Metodo esmę sudaro tai, kad atliekant pagrindinį tyrimą skiriamos vidutinio toksiškumo dozės ir išvengiama dozių, kurios sukeltų žūtį. Be to, nereikia skirti dozių, kurios, kaip žinoma, sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ardančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai numarinami ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi atliekant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro vadovo objektas (29).

5. Taikant metodą gaunama informacijos apie medžiagos pavojingas savybes, todėl ją galima įvertinti ir klasifikuoti pagal visuotinai sudarnintą sistemą (Globally Harmonised System, GHS), skirtą ūmų toksiškumą sukeliančioms cheminėms medžiagoms klasifikuoti (30).

6. Prieš tyrimo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudarytų medžiagos identiškumas ir cheminė struktūra, jos fizikinės cheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksinės savybės ir numatomas(-i) medžiagos naudojimo būdas(-ai). Ši informacija yra būtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus dėl bandymo reikalingumo žmonių sveikatai apsaugoti, ir padėti pasirinkti tinkamą pradinę dozę.

7. Apibrėžimai:

Ūmus toksiškumas per virškinimo traktą – taikomas tam neigiamam poveikiui, kuris atsiranda gavus per virškinimo traktą vienetinę medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h.

Uždelsta žūtis – kai gyvūnas nežūsta arba nepanašus į gaištantį per 48 h, bet žūsta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį.

Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg).

Aiškus toksiškumas – bendrasis terminas, aprašantis bandomosios medžiagos sukeltus aiškius toksiškumo požymius (pavyzdžiai pateikti (24), rodančius, kad kita didžiausia fiksuota dozė sukels didelio skausmo, ilgalaikių didelių kančių, gaišimo būsenos požymius (kriterijai pateikti poveikio žmonėms vadove (29) arba daugumos gyvūnų žūtį.

GHS – visuotinai sudarninta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) (žmonių sveikata ir aplinka), JT (Jungtinių Tautų) pavojingų prekių pervežimo ekspertų komiteto (fizikinės cheminės savybės) ir Tarptautinės darbo organizacijos (International Labour Organization (ILO)) (pavojų pranešimas) bendroji veikla, koordinuojama Tarporganizacinės cheminių medžiagų tinkamos vadybos programos (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)).

Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsenos arba žūties reikia laukti anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Šios graužikų būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. Daugiau detalių pateikta vadove dėl poveikio žmonėms (29).

LD₅₀ (vidutinė mirtina dozė) – statistiškai apskaičiuojama vienetinė medžiagos dozė per virškinimo traktą, kuri gali sukelti 50% tiriamųjų gyvūnų žūtį. LD₅₀ vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno kūno masės vienetui (mg/kg).

Ribinė dozė – dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2000 arba 5000 mg/kg).

Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba kai neišgyvena net gydomas gyvūnas. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms (29).

Numatoma žūtis – klinikinių požymių, rodančių žūtį tam tikru momentu ateityje prieš eksperimento pabaigą, pvz., nesugebėjimas pasiekti vandenį arba pašarą, buvimas. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms (29).

8. Bandymo metodo esmė:

8.1. Vienos lyties gyvūnų grupėms nuosekliai suleidžiamos fiksuotos 5, 50, 300 ir 2000 mg/kg dozės (išimtiniais atvejais galima spręsti apie papildomos fiksuotos 5000 mg/kg dozės suleidimą, žr. 17 skirsnį). Pradinė dozė pasirenkama atsižvelgiant į įvadinį tyrimą, kaip dozė, kuri galėtų sukelti kai kuriuos toksiškumo požymius, bet kuri nebūtų sunkaus toksiško poveikio arba žūties priežastimi.

8.2. Klinikiniai požymiai ir sąlygos, susijusios su skausmu, kančia ir neišvengiama žūtimi, išsamiai aprašytos atskirame EBPO vadove (29). Kitoms gyvūnų grupėms gali būti suleidžiamos didesnės arba mažesnės fiksuotos dozės, atsižvelgiant į toksiškumo požymius bei gyvūnų žūties atvejus. Ši procedūra tęsiama tol, kol identifikuojama dozė, sukelianti aiškų toksiškumą arba ne daugiau kaip vieno gyvūno žūtį, arba kai nėra jokio poveikio esant didžiausiai dozei ar kai gyvūnai žūsta esant mažiausiai dozei.

II. BANDYMO METODO APRAŠYMAS

9. Gyvūnų rūšies pasirinkimas:

9.1. Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės (28), kadangi tipinių LD₅₀ bandymų informacinės apžvalgos parodė, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie pastebimi, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės (31). Tačiau, jei giminingos struktūros cheminių junginių toksinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad patinai gali būti jautresni, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai atliekami su patinais, pateikiamas kompetentingas pagrindimas.

9.2. Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš suleidžiant dozę turi būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20% tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę.

10. Laikymo ir šėrimo sąlygos:

10.1. Bandomų gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50-60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai.

10.2. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Gyvūnai gali būti sugrupuoti narveliuose pagal dozes, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti atidžiai stebėti kiekvieną gyvūną.

11. Gyvūnų ruošimas:

11.1. Gyvūnai atrenkami „aklos atrankos“ metodu, ženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir prieš dozių suleidimo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras, kad galėtų priprasti prie laboratorinių sąlygų.

12. Dozių ruošimas:

12.1. Visos bandomosios medžiagos dozės skiriamos kaip pastovaus tūrio dozės, keičiant ruošiamos dozės koncentraciją. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui, galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias suleidžiamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima suleisti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai neturi būti didesnis kaip 1 ml/100g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima naudoti 2 ml/100g kūno masės.

12.2 Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama tirpalui (emulsijai, suspensijai) aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet naudojami tirpalai kituose nešikliuose. Jei nešiklis ne vanduo, turi būti žinomos jo toksinės savybės. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat suleidimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu.

III. DARBO EIGA

13. Dozių suleidimas:

13.1. Vienetinė bandomosios medžiagos dozė suleidžiama skrandžio zondu arba tinkamu intubaciniu vamzdeliu. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma suleisti vienetinės dozės, ji gali būti suleidžiama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.

13.2. Prieš suleidžiant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės naktį negauna pašaro, išskyrus vandenį; pelės negauna pašaro 3-4 h, neribojant vandens gavimo). Pasibaigus minėtam laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir suleidžiama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3-4 h, pelės nešeriamos 1-2 h. Jei dozė suleidžiama dalimis per tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę.

14. Įvadinis tyrimas:

14.1. Įvadinio tyrimo tikslas – leisti pasirinkti atitinkamą pradinę pagrindinio tyrimo dozę. Bandomoji medžiaga nuosekliai suleidžiama kiekvienam gyvūnui pagal 1 priedo diagramą. Įvadinis tyrimas baigiamas, kai galima priimti sprendimą dėl pagrindinio tyrimo pradinės dozės (arba jei gyvūnai žūsta esant mažiausiai fiksuotai dozei).

14.2. Įvadinio tyrimo pradinė dozė pasirenkama iš 5, 50, 300 ir 2000 mg/kg dozių, kaip dozė, kuri galėtų sukelti aiškų toksiškumą, pagrįstą, jei įmanoma, in vivo ir in vitro duomenimis apie tą pačią cheminę medžiagą ir struktūriniu požiūriu giminingas chemines medžiagas. Neturint tokios informacijos, pradinė dozė būtų 300 mg/kg.

14.3. Tarp dozių suleidimo kiekvienam gyvūnui turi būti mažiausiai 24 h laiko tarpas. Visi gyvūnai turėtų būti stebimi mažiausiai 14 parų.

14.4. Išimtiniais atvejais ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5000 mg/kg dozę (žr. 3 priedą). Dėl priežasčių, susijusių su gyvūnų gerove, neskatinama atlikti bandymo taikant GHS 5 kategorijos intervalus (2000–5000 mg/kg) ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga.

14.5. Tais atvejais, kai atliekant įvadinį tyrimą žūsta gyvūnas, gavęs mažiausią fiksuotą dozę (5 mg/kg), taikant įprastą procedūrą tyrimą reikia nutraukti ir medžiagą priskirti GHS 1 kategorijai (kaip nurodyta 1 priede). Tačiau jei reikalingas tolesnis klasifikavimo patvirtinimas, gali būti atliekama ši neprivaloma papildoma procedūra. 5mg/kg dozė suleidžiama antram gyvūnui. Jei šis antras gyvūnas žūsta, GHS 1 kategorija patvirtinama ir tyrimas iš karto nutraukiamas. Jei antras gyvūnas išgyvena, 5mg/kg dozę gauna ne daugiau kaip trys papildomi gyvūnai. Kadangi yra didelė žūties rizika, gyvūnų gerovei apsaugoti jie turi gauti šią dozę paeiliui. Laiko tarpo tarp dozės suleidimo kiekvienam gyvūnui turi pakakti nustatyti, ar pirmiau dozę gavęs gyvūnas turi galimybę išgyventi. Jei žūsta antras gyvūnas, dozių suleidimas iš karto nutraukiamas ir nė vienas papildomas gyvūnas dozės nebegauna. Kadangi žuvus antram gyvūnui (neatsižvelgiant į bandymo nutraukimo momentu panaudotų gyvūnų skaičių) rezultatas yra A (2 arba daugiau žūčių), taikoma 2 priedo klasifikavimo taisyklė esant 5mg/kg fiksuotai dozei (1 kategorija, jei žuvo 2 arba daugiau gyvūnų, 2 kategorija, jei žuvo ne daugiau kaip 1 gyvūnas). Be to, 4 priede pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, laukiant naujos GHS įgyvendinimo.

15. Pagrindinis tyrimas:

15.1. Gyvūnų skaičius ir dozės:

15.1.1. Veiksmai, kurių turi būti imamasi po bandymo su pradine doze, nurodyti 2 priede pateiktose schemose. Yra trys būdai: nutraukti bandymą ir priskirti medžiagą atitinkamai pavojaus klasei, bandyti esant didesnei fiksuotai dozei arba bandyti esant mažesnei fiksuotai dozei. Tačiau siekiant apsaugoti gyvūnus, atliekant pagrindinį tyrimą nebus kartojama dozė, sukėlusi žūtį atliekant įvadinį tyrimą (žr. 2 priedą). Patyrimas rodo, kad labiausiai tikėtinas pradinės dozės suleidimo rezultatas pasireikš tuo, kad medžiaga galės būti klasifikuota ir tolesnis bandymas nebus būtinas.

15.1.2. Kiekvienai tiriamai dozei paprastai bus naudojama iš viso po penkis vienos lyties gyvūnus. Penkis gyvūnus sudarys vienas gyvūnas iš įvadinio tyrimo, gavusio pasirinktą dozę, ir keturi papildomi gyvūnai (išskyrus neįprastus atvejus, kai pagrindinio tyrimo dozė nebuvo įtraukta į įvadinį tyrimą).

15.1.3. Laiko tarpą tarp dozių skyrimo lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės suleidimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai. Rekomenduojamas 3 arba 4 parų laikotarpis tarp kiekvienos dozės, jei prireikia, uždelstam toksiškumui stebėti. Laiko tarpas prireikus gali būti reguliuojamas, pvz., reakcijos be traukulių atveju.

15.1.4. Kai sprendžiama, ar skirti didžiausią fiksuotą 5000 mg/kg dozę, reikėtų laikytis 3 priede aprašytos metodikos (dar žr. 17 skirsnį).

15.2. Ribinis bandymas:

15.2.1. Ribinis bandymas visų pirma atliekamas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t. y., toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Informacijos apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima gauti pasinaudojus žiniomis apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius arba produktus, atsižvelgiant į toksikologinį reikšmingumą turinčių komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos išvis nėra arba kai pagal tą informaciją bandomoji medžiaga gali būti toksiška, turi būti atliekamas pagrindinis bandymas.

15.2.2. Taikant įprastą procedūrą, šiame vadove ribiniu bandymu būtų įvadinis tyrimas suleidžiant 2000 mg/kg dozę (arba išimtiniais atvejais 5000 mg/kg), po kurio keturiems papildomiems gyvūnams būtų skirta tokia pat dozė.

IV. STEBĖJIMAI

16. Kiekvienas gavęs dozę gyvūnas mažiausiai vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, ypač per pirmąsias 4 h, ir toliau kasdien stebimi visas 14 parų, išskyrus kai gyvūnams reikia nutraukti tyrimą ir humaniškai numarinti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksiškumo reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei jie vėluoja atsirasti (32). Visi kiekvieno gyvūno stebėjimai yra sistemingai aprašomi.

17. Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus vadove dėl poveikio žmonėms (29). Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai numarinti. Kai gyvūnai numarinami dėl humaniškų priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kiek įmanoma tiksliau.

18. Kūno masė. Kiekvieno gyvūno kūno masė nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos suleidimą ir vėliau – mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas kūno masės pokytis. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai sveriami ir humaniškai numarinami.

19. Patologija:

19.1. Visiems bandymo gyvūnams (įskaitant nugaišusius atliekant bandymą arba pašalintus iš tyrimo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) atliekamas bendrasis skrodimas. Aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai.

19.2. Gyvūnams, kurie po dozės gavimo išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų atlikti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos.

V. DUOMENYS

20. Turi būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to, visi duomenys suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas naudotų gyvūnų skaičius, toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius, atliekant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, kiekvieno gyvūno žūties laikas, toksiško poveikio aprašymas, to poveikio kitimas laike ir grįžtamumas, skrodimo duomenys.

VI. ATASKAITOS RENGIMAS

21. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei tinka:

21.1. Bandomoji medžiaga:

21.1.1. fizikinė būsena, grynumas ir, jei tinka, fizikinės cheminės savybės (įskaitant izomerizavimą);

21.1.2. identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį.

21.2. Nešiklis (jei tinka): jo pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.

21.3. Bandymo gyvūnai:

21.3.1. naudota rūšis ir veislė;

21.3.2. mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma;

21.3.3. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei tinka, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą);

21.3.4. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.

21.4. Bandymo sąlygos:

21.4.1. išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparatą, įskaitant suleidžiamos medžiagos fizikinį pavidalą;

21.4.2. išsami informacija apie bandomosios medžiagos suleidimą, įskaitant dozavimo tūrį ir suleidimo laiką;

21.4.3. išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą (tiekėją), vandens tiekėją);

21.4.4. pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas.

21.5. Rezultatai:

21.5.1. duomenų apie kiekvieno gyvūno atsaką pagal dozes lentelės (t. y. toksiškumo požymiai, įskaitant žūčių skaičių, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę);

21.5.2. kūno masės ir jos kitimo lentelės;

21.5.3. kiekvieno gyvūno kūno masė dozės suleidimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba numarinimo dieną;

21.5.4. žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį numarinimą;

21.5.5. toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir vystymasis, jų galimas grįžtamumas;

21.5.6. kiekvieno gyvūno skrodimo ir histopatologiniai duomenys, jei yra.

21.6. Rezultatų aptarimas ir aiškinimas.

21.7. Išvados.

VII. NUORODOS

22. British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.

23. Van den Heuvel, M. J., Dayan, A. D. and Shillaker, R. O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.

24. Van den Heuvel, M. J., Clark, D. G., Fielder, R. J., Koundakjian, P. P., Oliver, G. J. A., Pelling, D., Tomlinson, N. J. and Walker, AP. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD₅₀ test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.

25. Whitehead, A. and Curnow, R. N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313- 324.

26. Stallard, N. and Whitehead, A (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315- 323. Human Exptl. Toxicol.

27. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.

28. OECD (2001). Guidance Document on Acute Orai Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

29. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.

30. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0, FF.html].

31. Lipnick, R. L., Cotruvo, J. A, Hill, R. N., Bruce, R. D., Stitzel, K. A, Walker, AP, Chu, L, Goddard, M., Segal, L., Springer, J. A and Myers, R. C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD₅₀, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.

32. Chan P. K and A. W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A. W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

______________

Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą.

Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašo

1 priedas

ĮVADINIO TYRIMO SCHEMA

______________

Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą.

Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašo

2 priedas

PAGRINDINIO TYRIMO SCHEMA

______________

Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą.

Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašo

3 priedas

I. BANDOMŲJŲ MEDŽIAGŲ, KURIŲ TIKĖTINOS LD₅₀ VERTĖS YRA DIDESNĖS NEGU 2000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI NEATLIEKANT BANDYMO

1. Pavojaus 5 kategorijos kriterijai yra apibrėžti, kad būtų galima identifikuoti bandomąsias medžiagas, kurių ūmaus toksiškumo pavojus yra palyginti mažas, tačiau kurios esant tam tikroms aplinkybėms gali būti pavojingos pažeidžiamoms populiacijoms. Tikėtina, kad šių medžiagų LD₅₀ per virškinimo traktą arba odą yra 2000–5000 mg/kg arba ekvivalentinė dozė, kai medžiagos patenka kitais būdais. Bandomosios medžiagos galėtų būti priskirtos pavojaus kategorijai, apibrėžtai 2000 mg/kg < LD₅₀ < 5000 mg/kg (5 kategorija pagal GHS), šiais atvejais:

1.1 jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kurią nors iš 2 priedo bandymo schemų, pagrįstų žūties atvejais;

1.2. jei jau yra patikimų duomenų, rodančių, kad LD₅₀ yra 5 kategorijos verčių intervale, arba kiti tyrimai su gyvūnais arba toksiškas poveikis žmonėms rodo ūmaus tipo poveikį žmonių sveikatai;

1.3. gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo būdu, jei priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagrįstas ir:

1.3.1. yra patikimos informacijos, rodančios didelį toksišką poveikį žmonėms,

1.3.2. arba bandymo metu per virškinimo traktą suleidžiant dozes, siekiančias 4 kategorijos vertes, nustatomi žūties atvejai arba

1.3.3. jei, tęsiant bandymus iki 4 kategorijos verčių, ekspertų sprendimu patvirtinami reikšmingi klinikiniai toksiškumo požymiai, išskyrus viduriavimą, pasišiaušusius plaukus arba nesveiko gyvūno išvaizdą, arba

1.3.4. jei ekspertų sprendimu patvirtinama patikima informacija, rodanti galimą reikšmingą ūmų poveikį atliekant kitus tyrimus su gyvūnais.

II. BANDYMAS ESANT DIDESNĖMS NEGU 2000 MG/KG DOZĖMS

2. Išimtiniais atvejais, ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5000 mg/kg dozę. Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyvūnų gerovę, bandymas skiriant 5000 mg/kg neskatinamas ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga (30).

3. Įvadinis tyrimas:

3.1. Sprendimo priėmimo taisyklės, taikomos 1 priede pateiktai nuosekliai procedūrai, išplečiamos, kad būtų galima įtraukti 5000 mg/kg dozę. Taigi kai skiriama įvadinio tyrimo pradinė 5000 mg/kg dozė, gavus A rezultatą (žūtis) reikės atlikti bandymą su antru gyvūnu, skiriant 2000 mg/kg; gavus B ir C rezultatus (aiškus toksiškumas arba jokio toksiškumo) pradinė pagrindinio tyrimo dozė gali būti 5000 mg/kg.

3.2. Panašiai, jei skiriama kita nei 5000 mg/kg pradinė dozė, bandymas bus tęsiamas iki 5000 mg/kg, jei esant 2000 mg/kg dozei gaunami B arba C rezultatai; gavus A rezultatą, esant 5000 mg/kg, pagrindinio tyrimo pradinė dozė yra 2000 mg/kg, o gavus B ir C rezultatus, pagrindinio tyrimo pradinė dozė yra 5000 mg/kg.

4. Pagrindinis tyrimas:

4.1. Sprendimo priėmimo taisyklės, taikomos 2 priede pateiktai nuosekliai procedūrai, išplečiamos, kad būtų galima įtraukti 5000 mg/kg dozę. Taigi kai skiriama pagrindinio tyrimo pradinė 5000 mg/kg dozė, gavus A rezultatą (≥ 2 žūtys) reikės atlikti 2 grupės bandymą, skiriant 2000 mg/kg; gavus B rezultatą (aiškus toksiškumas ir (arba) ≤ 1 žūtis) arba C (jokio toksiškumo), medžiaga nebus klasifikuojama pagal GHS.

4.2. Panašiai, jei naudojama kita nei 5000 mg/kg pradinė dozė, bandymas bus tęsiamas iki 5000 mg/kg, jei esant 2000 mg/kg dozei gaunamas C rezultatas; gavus A rezultatą, esant 5000 mg/kg, medžiaga priskiriama GHS 5 kategorijai, o gavus B arba C rezultatus, medžiaga pagal GHS laikoma neklasifikuota.

______________

Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą.

Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašo

4 priedas

KLASIFIKAVIMO PAGAL EUROPOS SĄJUNGOS SCHEMĄ REKOMENDACIJOS, TAIKOMOS PEREINAMAJAM LAIKOTARPIUI IKI VISIŠKO VISUOTINAI SUDARNINTOS SISTEMOS (GHS) ĮGYVENDINIMO (PAIMTA IŠ (29) NUORODOS)

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos

ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11

ŪMAUS TOKSIŠKUMO PERVIRŠKINIMO TRAKTĄ. ŪMAUS TOKSIŠKUMO KLASIŲ (B.1 TRIS) METODO APRAŠAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Šis bandymų metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 423 metodą (2001 m.).

2. Šiame bandyme taikomas ūmaus toksiškumo klasių metodas (24) – tai nuosekli procedūra, pagal kurią vienai pakopai naudojami 3 vienos lyties gyvūnai. Atsižvelgiant į gyvūnų žūties atvejus ir (arba) jų gaišimo būseną, vidutiniškai gali prireikti 2–4 pakopų, kad būtų galima spręsti apie bandomosios medžiagos toksiškumą. Ši metodika yra atkuriama, ją taikant naudojama daug mažiau gyvūnų ir ji leidžia suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus. Ūmaus toksiškumo klasių metodas pagrįstas biometriniais įvertinimais (25)(26)(27)(28), naudojant fiksuotas dozes, kurios pakankamai skiriasi, kad medžiagą būtų galima klasifikuoti ir įvertinti jos pavojų. 1996 m. priimto metodo tinkamumas buvo plačiai patvirtintas nacionaliniu (29) ir tarptautiniu mastu (30) atliekant in vivo bandymus ir lyginant su literatūroje pateiktais LD₅₀ duomenimis.

3. Patarimus dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą bandymo vadove (31). Be to, šiame vadove yra papildomos informacijos apie B. l tris bandymo metodo taikymą ir aiškinimą.

4. Nereikia leisti dozių, kurios, kaip žinoma, sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ardančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai numarinami ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi atliekant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro vadovo objektas (32).

5. Metode naudojamos iš anksto nustatytos dozės, o rezultatai leidžia medžiagą įvertinti ir klasifikuoti pagal visuotinai sudarnintą sistemą (Globally Harmonised System, GHS), skirtą ūmų toksiškumą sukeliančioms cheminėms medžiagoms klasifikuoti (33).

6. Iš esmės šis metodas nėra skirtas tikslioms LD₅₀ vertėms apskaičiuoti, bet juo galima nustatyti apibrėžtus žūtį sukeliančių dozių intervalus, kadangi tokio bandymo tikslas ir yra nustatyti, ar dalis gyvūnų žūsta. Šiuo metodu galima nustatyti LD₅₀ vertę tik tais atvejais, kai mažiausiai dviejų dozių sukeliamų gyvūnų žūčių yra daugiau kaip 0% ir mažiau kaip 100%. Kai skiriamos iš anksto pasirinktos dozės neatsižvelgiant į bandomąją medžiagą, o klasifikavimas tiesiogiai siejamas su stebimų skirtingos būsenos gyvūnų skaičiumi, laboratorijoms didėja galimybė pasiekti suderinamų ir atkartojamų rezultatų.

7. Prieš tyrimo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudarytų medžiagos identiškumas ir cheminė struktūra, jos fizikinės cheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksinės savybės ir numatomas(-i) medžiagos naudojimo būdas(-ai). Ši informacija yra būtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus dėl bandymo reikalingumo žmonių sveikatai apsaugoti, ir padėti pasirinkti tinkamą pradinę dozę.

8. Apibrėžimai:

Ūmus toksiškumas per virškinimo traktą – taikomas tam neigiamam poveikiui, kuris atsiranda gavus per virškinimo traktą vienetinę medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h.

Uždelsta žūtis – kai gyvūnas nežūsta arba nepanašus į gaištantį per 48 h, bet žūsta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį.

Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg).

GHS – visuotinai sudarninta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). EBPO (žmonių sveikata ir aplinka), JT pavojingų prekių pervežimo ekspertų komiteto (fizikinės cheminės savybės) ir Tarptautinės darbo organizacijos (International Labour Organization (ILO)) (pavojų pranešimas) bendroji veikla, koordinuojama Tarporganizacinės cheminių medžiagų tinkamos vadybos programos (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)).

Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsenos arba žūties reikia laukti anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Šios graužikų būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms (32).

LD₅₀ (vidutinė mirtina dozė) – tai statistiškai apskaičiuojama vienetinė medžiagos dozė per virškinimo traktą, kuri gali sukelti 50% tiriamųjų gyvūnų žūtį. LD₅₀ vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno kūno masės vienetui (mg/kg).

Ribinė dozė – dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2000 arba 5000 mg/kg).

Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba kai neišgyvena net gydomas gyvūnas. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms (32).

9. Bandymo metodo esmė:

9.1. Šio bandymo esmę sudaro nuosekli metodika, pagal kurią vienai pakopai naudojant mažiausią įmanomą gyvūnų skaičių gaunama pakankamai informacijos apie bandomosios medžiagos ūmų toksiškumą, kad būtų galima ją klasifikuoti. Grupė bandymo gyvūnų per virškinimo traktą gauna vieną iš nustatytų bandomosios medžiagos dozių. Medžiaga bandoma taikant nuoseklią metodiką, kiekvienai pakopai naudojami trys vienos lyties gyvūnai (paprastai patelės). Su junginiu siejamas dozę gavusių gyvūnų gaišimas arba negaišimas per vieną iš pakopų lemia kitą pakopą, t.y.:

9.1.1. toliau bandyti nereikia;

9.1.2. suleisti tokią pat dozę dar trims gyvūnams;

9.1.3. trims papildomiems gyvūnams suleisti kitą didesnę arba mažesnę dozę.

9.2. Bandymo metodika išsamiai aprašyta 1 priede. Metodas leidžia spręsti, ar bandomąją medžiagą priskirti vienai iš toksiškumo klasių, apibrėžtų fiksuotomis LD₅₀ intervalo ribinėmis vertėmis.

II. METODO APRAŠYMAS

10. Gyvūnų rūšies pasirinkimas:

10.1. Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės (32). Pasirinkimą lėmė tipinių LD₅₀ bandymų informacinės apžvalgos, kurios parodė, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie pastebimi, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės (34). Tačiau jei giminingos struktūros cheminių junginių toksinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad patinai gali būti jautresni, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai atliekami su patinais, turėtų būti pateikti atitinkami tai patvirtinantys duomenys.

10.2. Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš skiriant dozę turėtų būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20% tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę.

11. Laikymo ir šėrimo sąlygos:

11.1. Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai.

11.2. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio. Gyvūnai gali būti sugrupuoti narveliuose pagal dozes, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti atidžiai stebėti kiekvieną gyvūną.

12. Gyvūnų ruošimas: gyvūnai atrenkami „aklos atrankos“ metodu, ženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir prieš dozių suleidimo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų.

13. Dozių ruošimas:

13.1. Visos bandomosios medžiagos dozės suleidžiamos kaip pastovaus tūrio dozės, keičiant ruošiamos dozės koncentraciją. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias skiriamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima suleisti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai neturėtų būti didesnis negu 1 ml/100 g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima naudoti 2 ml/100 g kūno masės.

13.2. Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama tirpalui (emulsijai, suspensijai) aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet naudojami tirpalai kituose nešikliuose. Jei nešiklis yra ne vanduo, turi būti žinomos jo toksinės savybės. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat suleidimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu.

III. DARBO EIGA

14. Dozių suleidimas:

14.1. Vienetinė bandomosios medžiagos dozė suleidžiama skrandžio zondu arba tinkamu intubaciniu vamzdeliu. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma suleisti vienetinės dozės, ji gali būti suleidžiama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.

14.2. Prieš suleidžiant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės naktį negauna pašaro, išskyrus vandenį; pelės negauna pašaro 3–4 h, neribojant vandens suvartojimo). Pasibaigus minėtam laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir suleidžiama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3–4 h, pelės nešeriamos 1–2 h. Jei dozė suleidžiama dalimis per tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę.

15. Gyvūnų skaičius ir dozės:

15.1. Kiekvienai pakopai imami trys gyvūnai. Dozė, kuri turi būti naudojama kaip pradinė dozė, pasirenkama iš keturių fiksuotų dozių: 5, 50, 300 ir 2000 mg/kg kūno masės. Kaip pradinė turėtų būti pasirinkta dozė, kuriai esant tikrai nugaištų kai kurie iš dozę gavusių gyvūnų. Schemose, pateiktose 1 priede, aprašyta procedūra, kurios reikėtų laikytis kiekvienai pradinei dozei. Be to, 4 priede pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, laukiant naujos GHS įgyvendinimo.

15.2. Kai turimoje informacijoje nurodoma, kad gyvūnai neturėtų gaišti esant didžiausiai pradinei dozei (2000 mg/kg kūno masės), reikėtų atlikti ribinį bandymą. Neturint informacijos apie bandomąją medžiagą, bet rūpinantis gyvūnų gerove, pradine doze reikėtų pasirinkti 300 mg/kg kūno masės.

15.3. Laiko tarpus tarp poveikių lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės suleidimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai.

15.4. Išimtiniais atvejais ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5000 mg/kg dozę (žr. 2 priedą). Dėl su gyvūnų gerove susijusių priežasčių, neskatinama atlikti bandymą taikant GHS 5 kategorijos intervalus (2000–5000 mg/kg) ir apie tokio bandymo reikalingumą turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos arba aplinkos apsauga.

16. Ribinis bandymas:

16.1. Ribinis bandymas visų pirma atliekamas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t. y. toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima sužinoti remiantis informacija apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius ar produktus, atsižvelgiant į toksikologinį reikšmingumą turinčių komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos visai nėra arba kai pagal tą informaciją bandomoji medžiaga gali būti toksiška, turi būti atliekamas pagrindinis bandymas.

16.2. Kai skiriama viena 2000 mg/kg kūno masės dozė, ribiniam bandymui galima imti šešis gyvūnus (po tris vienai pakopai). Išimtiniais atvejais, kai skiriama viena 5000 mg/kg dozė, ribiniam bandymui galima naudoti tris gyvūnus (žr. 2 priedą). Jei pastebimas su medžiaga siejamas gaišimas, gali tekti atlikti bandymą esant gretimai mažesnei dozei.

IV. STEBĖJIMAI

17. Kiekvienas gyvūnas, gavęs dozę mažiausiai vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, ypač per pirmąsias 4 h, ir toliau kasdien stebimas visas 14 parų, išskyrus kai gyvūnams reikia nutraukti tyrimą ir humaniškai numarinti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksiškumo reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei jie vėluoja atsirasti (35). Visi kiekvieno gyvūno stebėjimai yra sistemingai aprašomi.

18. Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to, kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus vadove dėl poveikio žmonėms (32).

19. Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai numarinti. Kai gyvūnai numarinami dėl humaniškų priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kiek įmanoma tiksliau.

20. Kūno masė:

20.1. Kiekvieno gyvūno kūno masė turi būti nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos suleidimą ir vėliau mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas kūno masės pokytis.

20.2. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai pasveriami ir humaniškai numarinami.

21. Patologija:

21.1. Visiems bandomiesiems gyvūnams (įskaitant nugaišusius atliekant bandymą arba pašalintus iš tyrimo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) atliekamas bendrasis skrodimas. Turėtų būti aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai.

21.2. Gyvūnams, kurie išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų atlikti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos.

V. DUOMENYS

22. Turėtų būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to, visi duomenys suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas naudotų gyvūnų skaičius, gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, skaičius, atliekant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, kiekvieno gyvūno žūties laikas, toksiškumo poveikio aprašymas, tokio poveikio kitimas laike ir grįžtamumas, skrodimo duomenys.

VI. ATASKAITOS RENGIMAS

23. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei tinka:

23.1. Bandomoji medžiaga:

23.1.1. fizikinė būsena, grynumas ir, jei tinka, fizikinės cheminės savybės (įskaitant izomerizavimą);

23.1.2. identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį.

23.2. Nešiklis (jei tinka): jo pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.

23.3. Bandomieji gyvūnai:

23.3.1. naudota rūšis ar veislė;

23.3.2. mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma;

23.3.3. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei tinka, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą);

23.3.4. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir t.t.

23.4. Bandymo sąlygos:

23.4.1. išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparatą, įskaitant suleidžiamos medžiagos fizikinį pavidalą;

23.4.2. išsami informacija apie bandomosios medžiagos suleidimą, įskaitant dozavimo turį ir suleidimo laiką;

23.4.3. išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą ar tiekėją, vandens tiekėją);

23.4.4. pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas.

23.5. Rezultatai:

23.5.1. duomenų apie kiekvieno gyvūno atsaką pagal dozes lentelės (t. y. toksiškumo požymiai, įskaitant žūčių skaičių, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę);

23.5.2. kūno masės ir jos kitimo lentelės;

23.5.3. kiekvieno gyvūno kūno masė dozės suleidimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba numarinimo dieną;

23.5.4. žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį numarinimą;

23.5.5. toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir vystymasis, jų galimas grįžtamumas;

23.5.6. kiekvieno gyvūno skrodimo ir histopatologiniai duomenys, jei yra.

23.6. Rezultatų aptarimas ir aiškinimas.

23.7. Išvados.

VII. NUORODOS

24. Roll R., Hofer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett, Suppl. 31, 86.

25. Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.

26. Diener W, Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Orai). Arch. Toxicol. 68, 559-610.

27. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Orai). Arch. Toxicol. 69, 729-734.

28. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134.

29. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method – An Alternative to the LD₅₀ Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.

30. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Orai). Arch. Toxicol. 69, 659-670.

31. OECD (2001) Guidance Document on Acute Orai Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

32. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

33. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0, FF. html].

34. Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD₅₀, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.

35. Chan P. K. and A. W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. Al Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

______________

Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą.

Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo

aprašo

1 priedas

PROCEDŪRA, TAIKOMA NAUDOJANT KIEKVIENĄ PRADINĘ DOZĘ

1. Į šį priedą įtrauktose atitinkamose bandymo schemose aprašoma kiekvienos pradinės dozės procedūra, kurios reikia laikytis:

1.1. 1a priedas: pradinė dozė 5 mg/kg kūno masės;

1.2. 1b priedas: pradinė dozė 50 mg/kg kūno masės;

1.3. 1c priedas: pradinė dozė 300 mg/kg kūno masės;

1.4. 1d priedas: pradinė dozė 2000 mg/kg kūno masės.

2. Atsižvelgiant į humaniškai numarintų arba žuvusių gyvūnų skaičių, bandymo eiga žymima rodyklėmis.

______________

Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą.

Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo

aprašo

1a priedas

PROCEDŪRA, ESANT 5 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI

______________

Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą.

Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo

1b priedas

PROCEDŪRA, ESANT 50 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI

______________

Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą.

Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo

1c priedas

PROCEDŪRA, ESANT 300 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI

______________

Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą.

Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo

1d priedas

PROCEDŪRA, ESANT 2000 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI

______________

Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą.

Ūmaus toksiškumo klasių (B. l tris) metodo

aprašo

2 priedas

BANDOMŲJŲ MEDŽIAGŲ, KURIŲ TIKĖTINOS LD₅₀ VERTĖS YRA DIDESNĖS NEGU 2000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI NEATLIEKANT BANDYMO

1.1. jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kurią nors iš 1a-1d prieduose pateiktų bandymo schemų, pagrįstų žūčių dažnumu;

1.3. gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo būdu, jei priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagrįstas ir:

1.3.1. yra patikimos informacijos, rodančios didelį toksišką poveikį žmonėms,

1.3.2. arba bandymo metu per virškinimo traktą suleidžiant dozes, siekiančias 4 kategorijos vertes, nustatomi žūties atvejai arba

1.3.4. jei ekspertų sprendimu patvirtinama patikima informacija, rodanti galimą reikšmingą ūmų poveikį atliekant kitus tyrimus su gyvūnais.

BANDYMAS ESANT DIDESNĖMS KAIP 2000 MG/KG DOZĖMS

2. Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyvūnų gerovę, bandymas su gyvūnais skiriant 5 kategorijos intervalo dozes (5000 mg/kg) neskatinamas ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga (18). Neturi būti atliekamas joks bandymas esant didesnėms dozėms.

3. Kai reikia bandyti naudojant 5000 mg/kg dozę, reikalinga tik viena pakopa (t.y. trys gyvūnai). Jei žūsta pirmas dozę gavęs gyvūnas, dozavimas tęsiamas skiriant 2000 mg/kg dozę pagal 1 priede pateiktas schemas. Jei pirmas gyvūnas lieka gyvas, dozę gauna kiti du gyvūnai. Jei žūsta tik vienas iš trijų gyvūnų, daroma prielaida, kad LD₅₀ vertė yra didesnė negu 5000 mg/kg. Jei žūsta abu gyvūnai, dozavimas tęsiamas skiriant 2000 mg/kg dozę.

______________

Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą.

Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo

aprašo

3 priedas

KLASIFIKAVIMO PAGAL ES SCHEMĄ REKOMENDACIJOS, TAIKOMOS PEREINAMAJAM LAIKOTARPIUI IKI VISIŠKO VISUOTINAI SUDARNINTOS SISTEMOS (GHS) ĮGYVENDINIMO (PAIMTA IŠ (31) NUORODOS)

– ES: Europos Sąjunga;	– OSHA (Occupational Safety and Health Administration): Saugos ir sveikatos darbe agentūra;	– vienai pakopai naudojami 3 gyvūnai (paprastai patelės)
– JT: Jungtinės Tautos;	– CPSC (Consumer Product Safety Commision): Vartotojams skirtų gaminių saugumo komisija	– 0, 1, 2, 3: kiekvienoje pakopoje gaištančių arba žuvusių gyvūnų skaičius
– WHMIS (Workplace Hazardous Materials Information System): Darbo vietos pavojingų medžiagų informacinė sistema	– AAA: Aplinkos apsaugos agentūra; crk (council resourse kit): išteklių taryba;	– ∞: neklasifikuota
		– GHS (Globally Harmonised System): visuotinai sudarninta sistema (mg/kg k. m.)

– ES: Europos Sąjunga;	– OSHA (Occupational Safety and Health Administration): Saugos ir sveikatos darbe agentūra;	– vienai pakopai naudojami 3 gyvūnai (paprastai patelės)
– JT: Jungtinės Tautos;		– 0, 1, 2, 3: kiekvienoje pakopoje gaištančių arba žuvusių gyvūnų skaičius
– WHMIS (Workplace Hazardous Materials Information System): Darbo vietos pavojingų medžiagų informacinė sistema	– CPSC (Consumer Product Safety Commision): Vartotojams skirtų gaminių saugumo komisija	– ∞: neklasifikuota
	– AAA: Aplinkos apsaugos agentūra; crk (council resourse kit): išteklių taryba;	– GHS (Globally Harmonised System):visuotinai sudarninta sistema (mg/kg k. m.)
		–* pirmoje pakopoje

– ES: Europos Sąjunga;	– OSHA (Occupational Safety and Health Administration): Saugos ir sveikatos darbe agentūra;	– vienai pakopai naudojami 3 gyvūnai (paprastai patelės)
– JT: Jungtinės Tautos;		– 0, 1, 2, 3: kiekvienoje pakopoje gaištančių arba žuvusių gyvūnų skaičius
– WHMIS (Workplace Information System): Darbo vietos pavojingų medžiagų informacinė sistema	– CPSC (Consumer Product Safety Commision): Vartotojams skirtų gaminių saugumo komisija	– ∞: neklasifikuota
	– AAA: Aplinkos apsaugos agentūra; crk (council resourse kit): išteklių taryba;	– GHS (Globally Harmonised System): visuotinai sudarninta sistema (mg/kg k. m.)
		–* pirmoje pakopoje

– ES: Europos Sąjunga;	– OSHA (Occupational Safety and Health Administration): Saugos ir sveikatos darbe agentūra;	– vienai pakopai naudojami 3 gyvūnai (paprastai patelės)
– JT: Jungtinės Tautos;
– WHMIS (Workplace Hazardous Materials Information System): Darbo vietos pavojingų medžiagų informacinė sistema		– 0, 1, 2, 3: kiekvienoje pakopoje gaištančių arba žuvusių gyvūnų skaičius
	– CPSC (Consumer Product Safety Commision): Vartotojams skirtų gaminių saugumo komisija
		– ∞: neklasifikuota
	– AAA: Aplinkos apsaugos agentūra; crk (council resourse kit): išteklių taryba;	– GHS (Globally Harmonised System): visuotinai sudarninta sistema (mg/kg k. m.)
		–* pirmoje pakopoje

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos

ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11

ŪMAUS TOKSIŠKUMO. ODOS DIRGINIMO AR ARDYMO (B. 4) METODO APRAŠAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Šis metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 404 metodą (2002 m.).

2. Rengiant šį atnaujintą metodą ypatingas dėmesys buvo kreipiamas į galimą gyvūnų gerovės pagerinimą ir į visos turimos informacijos apie bandomąją medžiagą įvertinimą, siekiant išvengti nebūtinų bandymų su laboratoriniais gyvūnais. Šiame metode rekomenduojama prieš atliekant aprašytą medžiagos ardymo ar dirginimo in vivo bandymą atlikti turimų atitinkamų duomenų įrodomosios vertės analizę. Jei duomenų nepakanka, jų galima gauti atliekant nuoseklųjį bandymą (13). Į bandymo strategiją, pateikiamą kaip šio metodo priedas, įtraukti įteisinti ir priimti in vitro bandymai. Be to, jei tinka, atliekant pradinį in vivo bandymą vietoj vienalaikio rekomenduojamas nuoseklusis trijų bandomųjų tamponų uždėjimo gyvūnui bandymas.

3. Siekiant užtikrinti ir duomenų mokslinį patikimumą, ir gyvūnų gerovę, in vivo bandymai neatliekami tol, kol atliekant duomenų įrodomosios vertės analizę nebus įvertinti visi turimi duomenys, apibūdinantys galimą medžiagos ardomąjį ar dirginamąjį poveikį odai. Tokius duomenis sudarys turimų tyrimų su žmonėmis ir (arba) laboratoriniais gyvūnais rezultatai, ardymo ar dirginimo duomenys, gauti apie vieną arba kelias medžiagas, turinčias giminingą struktūrą, arba apie jų mišinius, duomenys, patvirtinantys medžiagos stiprias rūgštines arba šarmines savybes (14)(15), be to, įteisintų ir priimtų in vitro arba ex vivo bandymų rezultatai (16)(17)(18). Ši analizė turėtų sumažinti poreikį in vivo bandyti tas medžiagas, apie kurių odos ardomąjį ar dirginamąjį poveikį jau turima pakankamai kitų tyrimų metu gautų duomenų.

4. Pirmenybė teikiama į šio metodo priedą įtrauktai nuosekliųjų bandymų strategijai, kurią sudaro įteisinti ir priimti in vitro arba ex vivo odos ardymo ar dirginimo bandymai. Strategiją parengė ir vienbalsiai rekomendavo EBPO seminaro dalyviai (19), ji buvo priimta ir rekomenduota kaip visuotinai sudarnintos cheminių medžiagų klasifikavimo sistemos (Globally Harmonised System, GHS) bandymų strategija (20). Rekomenduojama laikytis šios bandymų strategijos prieš pradedant in vivo bandymus. Naujoms medžiagoms rekomenduojamas nuoseklusis bandymo būdas moksliškai pagrįstiems duomenims apie medžiagos ardymo ar dirginimo savybes gauti. Turimoms medžiagoms, apie kurių odos ardymo ar dirginimo savybes duomenų nepakanka, ši strategija turėtų būti taikoma, jei trūksta duomenų. Kitokios bandymo strategijos arba metodikos taikymas arba sprendimas netaikyti nuoseklaus bandymų metodo turi būti pagrįstas.

5. Jei ardymo arba dirginimo savybių negalima nustatyti, atliekant duomenų įrodomosios vertės analizę, atitinkančią nuoseklaus bandymo strategiją, reikėtų spręsti klausimą apie in vivo bandymą (žr. priedą).

6. Apibrėžimai:

Odos dirginimas – išnykstantis odos pažeidimas, bandomąja medžiaga veikiant ne ilgiau kaip 4 h.

Odos ardymas – neišnykstantis odos pažeidimas; būtent, matomoji nekrozė per epidermį ir odos nekrozė po bandomosios medžiagos uždėjimo ne ilgiau kaip keturioms valandoms. Ardymo požymiai yra opos, kraujavimas, kruvini šašai ir, baigiantis 14 parų stebėjimo laikotarpiui, odos blukimas dėl jos šutimo, visiškai nuplikusios vietos ir randai. Neaiškiems pažeidimams nustatyti galima būtų atlikti histopatologinį tyrimą.

7. Bandymo metodo esmė:

7.1. Ant bandomo gyvūno odos dedama viena bandomosios medžiagos dozė; nepaveiktos gyvūno odos vietos naudojamos kontrolei. Nustatytais laiko tarpais nustatomas ir balais įvertinamas dirginimo ar ardymo laipsnis, kuris papildomai aprašomas, siekiant išsamiai įvertinti poveikį. Tyrimo trukmės turi pakakti stebimo poveikio grįžtamumui arba negrįžtamumui įvertinti.

7.2. Gyvūnai, kuriems kurioje nors bandymo stadijoje pasireiškia nuolatiniai sunkių kančių ir (arba) skausmo požymiai, turi būti humaniškai numarinami, o medžiaga atitinkamai įvertinama. Kriterijai, pagal kuriuos priimamas sprendimas dėl humaniško gaištančių ir labai kenčiančių gyvūnų numarinimo, aprašyti (21) nuorodoje.

II. BANDYMO METODO APRAŠYMAS

8. Pasiruošimas in vivo bandymui:

8.1. Gyvūnų rūšies pasirinkimas. Tinkamiausias laboratorinis gyvūnas – triušis albinosas. Naudojami sveiki, jauni ir suaugę triušiai. Kitų rūšių naudojimas turi būti pagrįstas.

8.2. Gyvūnų ruošimas:

8.2.1. Maždaug 24 h prieš bandymą nuo gyvūno kūno juosmens nugaros srityje reikia pašalinti vilną, ją nukerpant arba nuskutant. Reikia stengtis nepažeisti odos ir naudoti tik tuos gyvūnus, kurių oda yra sveika ir nepažeista.

8.2.2. Kai kurių veislių triušiai turi tankių plaukų vietas, kurios labiau matomos tam tikrais metų laikais. Tokios tankių plaukų vietos neturi būti naudojamos bandymui.

8.3. Laikymo ir šėrimo sąlygos:

8.3.1. Gyvūnai turi būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandomieji triušiai, temperatūra turi būti 20°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50-60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai.

8.3.2. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio.

9. Bandymo eiga:

9.1. Bandomosios medžiagos uždėjimas:

9.1.1. Bandomoji medžiaga uždedama ant mažo odos ploto (maždaug 6 cm²) ir uždengiama marlės tamponu, kuris tvirtinamas nedirginančia juosta. Jei tiesiogiai uždėti neįmanoma (pvz., skysčiai arba kai kurios pastos), bandomąją medžiagą reikėtų dėti ant marlės tampono, kuris butų dedamas ant odos. Visą poveikio laikotarpį tamponas turi laisvai liesti odą, naudojant pusiau pralaidų tvarstį. Jei bandomoji medžiaga dedama ant tampono, jis dedamas ant odos taip, kad medžiaga gerai liestųsi su oda ir tolygiai pasiskirstytų ant jos. Gyvūnai neturi pasiekti tampono ir praryti arba įkvėpti bandomosios medžiagos.

9.1.2. Skystos bandomosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos. Bandant kietąsias medžiagas (kurios gali būti purškiamos, jei būtų manoma, kad tai daryti yra būtina), bandomąją medžiagą reikėtų sudrėkinti kiek įmanoma mažesniu vandens kiekiu (arba prireikus kitu tinkamu nešikliu), kurio pakaktų geram sąlyčiui su oda užtikrinti. Kai nešiklis yra ne vanduo, galima nešiklio įtaka bandomosios medžiagos dirginamajam poveikiui turi būti kiek įmanoma mažesnė.

9.1.3. Pasibaigus poveikio laikotarpiui, kurio trukmė paprastai yra 4 h, bandomosios medžiagos likutis turi būti nuplautas, jei įmanoma, vandeniu arba kitu tinkamu tirpikliu, nepakeičiant odos reakcijos arba epidermio vientisumo.

9.2. Dozės. Ant bandymo vietos dedama 0,5 ml skysčio arba 0,5 g kietosios medžiagos arba pastos dozė.

9.3. Pradinis bandymas (in vivo odos dirginimo ar ardymo bandymas su vienu gyvūnu):

9.3.1. Labai rekomenduojama in vivo bandymą iš pradžių atlikti su vienu gyvūnu, ypač kai yra įtarimas dėl ardančiųjų medžiagos savybių. Tai atitinka nuosekliųjų bandymų strategiją (žr. 1 priedą).

9.3.2. Kai po duomenų įrodomosios vertės analizės padaroma išvada, kad medžiaga yra ardanti, bandymų su gyvūnais atlikti nereikia. Didesnei daliai medžiagų, kurias galima laikyti ardančiomis, in vivo bandymai paprastai nebūtini. Tačiau tais atvejais, kai turimi duomenys atrodo nepakankamai įrodantys, galima atlikti ribotą bandymą su gyvūnais, taikant šį būdą: ant gyvūno paeiliui dedami ne daugiau kaip trys tamponai. Pirmasis tamponas nuimamas po trijų minučių. Jei jokios sunkios odos reakcijos nėra, dedamas antras tamponas, kuris nuimamas po valandos. Jei šioje stadijoje stebėjimai rodo, kad poveikį galima humaniškai pratęsti keturioms valandoms, dedamas trečias tamponas, kuris nuimamas po keturių valandų, ir odos reakcija įvertinama balais.

9.3.3. Jei ardomasis poveikis pastebimas po bet kurio iš trijų nuoseklių poveikių, bandymas nedelsiant baigiamas. Jei ardomojo poveikio nėra, nuėmus paskutinį tamponą, gyvūnas stebimas 14 parų, jei ardymo požymių neatsiranda anksčiau.

9.3.4. Tai atvejais, kai nesitikima, kad bandomoji medžiaga sukels ardomąjį poveikį, o tik dirginantį, vienam gyvūnui keturioms valandoms dedamas vienas tamponas.

9.4. Patvirtinamasis bandymas (in vivo odos dirginimo bandymas su papildomais gyvūnais):

9.4.1. Jei atliekant pradinį bandymą ardomojo poveikio nėra, dirginantis poveikis arba neigiama reakcija turi būti patvirtinti naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus su vienu tamponu ir esant keturių valandų poveikio trukmei. Jei dirginantis poveikis pastebimas atliekant pradinį bandymą, patvirtinamąjį bandymą galima daryti nuosekliu būdu arba veikiant du papildomus gyvūnus vienu metu.

9.4.2. Išimtiniais atvejais, kai pradinis bandymas neatliekamas, dviem arba trims gyvūnams gali būti dedamas vienas tamponas, kuris nuimamas po keturių valandų. Kai naudojami du gyvūnai ir abiejų reakcija vienoda, toliau bandyti nereikia. Priešingu atveju dar atliekamas bandymas su trečiu gyvūnu. Neaiškias reakcijas gali tekti įvertinti naudojant papildomą gyvūną.

9.5. Stebėjimo laikotarpis:

9.5.1. Stebėjimo laikotarpio trukmės turi pakakti pastebėto poveikio grįžtamumui visiškai įvertinti. Tačiau bandymas turi būti nutrauktas bet kuriuo momentu, kai tik gyvūnui pasireiškia ilgalaikiai didelio skausmo arba kančios požymiai.

9.5.2. Poveikio grįžtamumui nustatyti gyvūnai po tamponų nuėmimo stebimi iki 14 parų. Jei grįžtamumas pastebimas anksčiau kaip po 14 parų, bandymas nutraukiamas tuo momentu.

9.6. Klinikiniai stebėjimai ir odos reakcijos įvertinimas balais:

9.6.1. Stebima, ar visi gyvūnai neturi paraudimo (eritemos) ir patinimo (edemos) požymių, o reakcija įvertinama po 60 minučių nuėmus tamponą, vėliau – po 24, 48 ir 72 valandų. Atliekant pradinį bandymą su vienu gyvūnu, bandymo vieta taip pat tiriama iškart po tampono nuėmimo. Odos reakcija įvertinama balais ir aprašoma pagal lentelėje pateiktą gradavimo skalę. Jei odai padarytas pažeidimas po 72 h negali būti identifikuotas kaip dirginimas arba ardymas, poveikio grįžtamumui nustatyti stebėjimą gali tekti tęsti iki 14 parų. Be dirginamojo poveikio stebėjimo, turi būti išsamiai apibūdintas ir užrašytas bet koks vietinis toksiškas poveikis, pvz., odos džiūvimas, ir bet koks sisteminis neigiamas poveikis (pvz., poveikis, pasireiškiantis kaip klinikiniai toksiškumo požymiai, ir poveikis kūno masei). Neaiškiems pažeidimams išaiškinti galima būtų atlikti histopatologinį tyrimą.

9.6.2. Odos reakcijos įvertinimas balais yra neišvengiamai subjektyvus. Siekiant labiau suderinti odos reakcijos įvertinimą balais, padėti bandymo laboratorijoms ir visiems, kurie vykdo ir aiškina stebėjimus, juos vykdantis personalas turi būti atitinkamai apmokytas taikyti įvertinimo balais sistemą (žr. toliau pateiktą lentelę). Tam galėtų būti naudingas iliustruotas odos dirginimo ir kitų pažeidimų įvertinimo vadovas (22).

III. DUOMENYS

10. Rezultatų pateikimas. Galutinėje ataskaitoje tyrimo rezultatai turi būti apibendrinti lentelėje, į kurią būtų įtraukti visi 7.1 skirsnio punktai.

11. Rezultatų įvertinimas:

11.1. Odos sudirginimas balais turi būti įvertintas pagal pažeidimų tipą ir sunkumą bei atsižvelgiant į grįžtamumą arba į jo nebuvimą. Kiekvienas įvertinimas balais nėra medžiagos dirginamųjų savybių absoliutusis įvertis, kadangi dar vertinamas kitas bandomosios medžiagos poveikis. Į kiekvieną įvertinimą balais reikėtų žiūrėti kaip į pamatines vertes, kurios turi būti vertinamos kartu su visais kitais stebėjimo rezultatais.

11.2. Vertinant sudirginimą turėtų būti atsižvelgta į odos pažeidimų grįžtamumą. Kai reakcija, pvz., plikimas (ribotame plote), hiperkeratozė, hiperplazija ir pleiskanojimas, pasireiškia baigiantis stebėjimo laikotarpio 14 parai, bandomoji medžiaga priskiriama dirginančioms.

IV. ATASKAITOS RENGIMAS

12. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:

12.1. In vivo bandymo pagrindimas: jau turimų bandymo duomenų įrodomosios vertės analizė, įskaitant nuosekliųjų bandymų strategijos taikymo rezultatus:

12.1.1. ankstesnių bandymų atitinkamų duomenų aprašymas;

12.1.2. duomenys, gauti kiekvienoje bandymų strategijos stadijoje;

12.1.3. atliktų in vitro bandymų aprašymas, įskaitant išsamią informaciją apie metodikas, rezultatus, gautus tiriant bandomąją ar etaloninę medžiagą;

12.1.4. duomenų įrodomosios vertės analizė in vivo tyrimui atlikti.

12.2. Bandomoji medžiaga:

12.2.1. identifikavimo duomenys (pvz., CAS numeris, gamintojas, grynumas, žinomos priemaišos, siuntos numeris);

12.2.2. fizikinė būsena ir fizikinės cheminės savybės (pvz., pH, lakumas, tirpumas, stabilumas);

12.2.3. sudėtis ir komponentų procentinė dalis, jei tai mišinys.

12.3. Nešiklis: jo identifikavimas, koncentracija (jei tinka), naudojamas tūris; nešiklio pasirinkimo pagrindimas.

12.4. Bandymo gyvūnai:

12.4.1. naudota rūšis ir veislė, kitų, ne baltųjų triušių, naudojimo pagrindimas;

12.4.2. kiekvienos lyties gyvūnų skaičius;

12.4.3. kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje ir pabaigoje;

12.4.4. amžius tyrimo pradžioje;

12.4.5. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.

12.5. Bandymo sąlygos:

12.5.1. tampono dėjimo vietos ruošimo technika;

12.5.2. išsami informacija apie naudojamas tampono medžiagas ir tampono dėjimo techniką;

12.5.3. išsami informacija apie bandomosios medžiagos ruošimą, dėjimą ir nuėmimą.

12.6. Rezultatai:

12.6.1. kiekvieno gyvūno dirginimo ar ardymo reakcijos balų, gautų visuose matavimo laiko taškuose, lentelių sudarymas;

12.6.2. visų pastebėtų pažeidimų aprašymas;

12.6.3. pastebėto dirginimo arba ardymo tipo ir laipsnio pasakojamasis aprašymas ir visi histopatologinio tyrimo rezultatai;

12.6.4. kito kartu su dirginimu arba ardymu pasireiškiančio neigiamo vietinio (pvz., odos džiūvimo) ir sisteminio poveikio aprašymas.

12.7. Rezultatų aptarimas.

V. NUORODOS

13. Barratt, M. D., Castell, J. V, Chamberlain, M., Combes, R. D., Dearden, J. C., Fentem, J. H., Gerner, L, Giuliani, A, Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.

14. Young, J. R., How, M. J., Walker, AP, Worth W. M. H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.

15. Worth, AP, Fentem, J. H., Balis, M., Botham, PA, Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720.

16. ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation“, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.

17. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balis, M., Botham, PA, Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483-524.

18. Testing Method B.40 Skin Corrosion.

19. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Finai Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).

20. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd. org/ehs/Class/HCL6.htm).

21. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http: //www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

22. EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.

[Paprašius, galima gauti EBPO sekretoriate].

______________

1 lentelė. Odos reakcijos vertinimo balais skalė

Paraudimas ir šašo formavimasis

Paraudimo nėra ........................................................................................ 0

Vos matomas paraudimas ........................................................................ 1

Aiškiai matomas paraudimas ................................................................... 2

Paraudimas nuo vidutinio iki didelio intensyvumo ................................. 3

Ypač ryškus paraudimas (jautienos raudonumo) arba šašo formavimasis, neleidžiantis stebėti paraudimo 4

Didžiausias įmanomas: 4

Patinimas

Patinimo nėra ............................................................................................ 0

Vos apčiuopiamas patinimas .................................................................... 1

Nedidelis patinimas (plotelio kraštai aiškiai apibrėžti, nes yra pakilę) ..... 2

Vidutinis patinimas (kraštai pakilę maždaug 1 mm) ................................ 3

Stiprus patinimas (pakilęs daugiau kaip 1 mm ir išplitęs už veikiamo ploto ribų) ... 4

Didžiausias įmanomas: 4

Neaiškiems pažeidimams paaiškinti galima būtų atlikti histopatologinį tyrimą.

______________

Ūmaus toksiškumo. Odos dirginimo ar ardymo

(B.4) metodo aprašo priedas

NUOSEKLIŲJŲ BANDYMŲ STRATEGIJA ODOS DIRGINIMUI IR ARDYMUI NUSTATYTI

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Siekiant gauti nuodugnių mokslinių rezultatų ir rūpinantis gyvūnų gerove, svarbu be reikalo nenaudoti gyvūnų ir kiek įmanoma mažinti visus bandymus, kurie gyvūnams gali sukelti sunkias reakcijas. Visa informacija apie medžiagos galimą ardomąjį ar dirginamąjį poveikį odai turėtų būti įvertinta prieš sprendžiant, ar atlikti in vivo bandymus. Jei jau yra pakankamai duomenų galimam bandomosios medžiagos ardomajam arba dirginamajam poveikiui odai klasifikuoti, nereikia bandymų su laboratoriniais gyvūnais. Taigi taikant duomenų įrodomosios vertės analizę ir nuosekliųjų bandymų strategiją, sumažėja būtinybė atlikti in vivo bandymus, ypač jei tikėtina, kad medžiaga gali sukelti sunkias reakcijas.

2. Turimai informacijai apie medžiagų dirginamąjį ir ardomąjį poveikį įvertinti rekomenduojama taikyti duomenų įrodomosios vertės analizę, kuri leistų spręsti, ar tokio poveikio galimybei apibūdinti reikia atlikti papildomus tyrimus, išskyrus in vivo odos tyrimus. Jei reikia papildomų tyrimų, atitinkamiems eksperimentiniams duomenims gauti, rekomenduojama taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Norint gauti duomenų apie nebandytas medžiagas, reikalingų jų ardomajam ar dirginamajam poveikiui odai įvertinti, reikėtų taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Šiame priede aprašyta bandymų strategija buvo parengta EBPO seminare (5) ir vėliau patvirtinta bei išplėsta kaip integruota darnioji pavojų dėl cheminių medžiagų poveikio žmonių sveikatai ir aplinkai klasifikavimo sistema (Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances), 1998 m. lapkričio mėn. priimta 28-ajame jungtiniame cheminių medžiagų komiteto ir cheminių medžiagų darbo grupės posėdyje (6).

3. Nors ši nuosekliųjų bandymų strategija nėra sudėtinė B.4 metodo dalis, ji apibūdina rekomenduojamą būdą odos dirginimo ar ardymo charakteristikoms nustatyti. Šis būdas atitinka geriausią praktiką ir yra odos dirginimo ar ardymo in vivo bandymų etikos etalonas. Bandymo metode pateikiamos in vivo bandymų rekomendacijos ir apibendrinami veiksniai, į kuriuos reikėtų atkreipti dėmesį prieš pradedant tokį bandymą. Strategijoje siūlomas būdas, kaip įvertinti turimus duomenis apie bandomųjų medžiagų odos dirginimo ar ardymo savybes, kad būtų galima gauti reikiamų duomenų apie medžiagas, kurioms reikalingi papildomi tyrimai arba kurios nebuvo tirtos. Be to, rekomenduojama atlikti įteisintus ir priimtus odos ardymo ar dirginimo in vitro arba ex vivo bandymus esant konkrečioms aplinkybėms.

II. ĮVERTINIMO IR BANDYMO STRATEGIJOS APRAŠYMAS

4. Siekiant nustatyti in vivo odos bandymų reikalingumą, prieš atliekant bandymus, kurie būtų nuosekliųjų bandymų strategijos dalis (schema), įvertinama visa turima informacija. Nors reikšmingos informacijos galima būtų gauti vertinant vienintelį parametrą (pvz., pH ribines vertes), turėtų būti nagrinėjama visa turima informacija. Sprendimui priimti turi būti daroma visų atitinkamų duomenų apie konkrečios medžiagos arba jos analogų poveikį įrodomosios vertės analizė, kuri pagrįstų priimamą sprendimą. Didžiausias dėmesys turėtų būti kreipiamas į duomenis apie medžiagą, gautus tiriant žmones ir gyvūnus, o vėliau tirti in vitro arba ex vivo bandymų duomenis. Ardančiųjų medžiagų in vivo tyrimų reikėtų kiek įmanoma vengti. Bandymų strategijos veiksniai:

4.1. Turimų duomenų, gautų tiriant žmones ir gyvūnus, įvertinimas (1 pakopa). Iš pradžių nagrinėjami tiriant žmones gauti duomenys, pvz., klinikiniai arba profesinių susirgimų tyrimai ir bylų ataskaitos, ir (arba) bandymų su gyvūnais duomenys, pvz., vienkartinio arba kartotinio poveikio odai toksiškumo tyrimai, kadangi jie suteikia informacijos, tiesiogiai susijusios su poveikiu odai. Medžiagų, kurios yra žinomos kaip dirginančios arba ardančios, ir medžiagų, kurios akivaizdžiai nėra ardančios arba dirginančios, nereikia bandyti atliekant in vivo tyrimus.

4.2. Struktūros ir aktyvumo ryšių (SAR) analizė (2 pakopa). Analizuojami giminingą struktūrą turinčių medžiagų bandymo rezultatai, jei tokie būtų. Kai tiriant žmones ir gyvūnus gautų duomenų apie giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius pakanka, norint įrodyti medžiagų gebą ardyti ar jautrinti odą, galima daryti prielaidą, kad įvertinimui pateiktos bandomosios medžiagos poveikis bus toks pats. Tokiais atvejais bandomosios medžiagos nebūtina bandyti. Taikant nuosekliųjų bandymų strategiją, neigiami duomenys, gauti tiriant giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius, nėra pakankamas įrodymas, kad medžiaga nėra ardanti ar jautrinanti. Medžiagų geba ardyti ir dirginti odą nustatoma taikant įteisintus ir priimtus SAR metodus.

4.3. Fizikinės cheminės savybės ir cheminis reaktyvumas (3 pakopa). Medžiagos, turinčios ribines pH vertes, pvz., ≤ 2,0 ir ≥ 11,5, gali turėti didelį vietinį poveikį. Jei ribinė pH vertė yra pagrindinė savybė, pagal kurią medžiaga identifikuojama kaip odą ardanti medžiaga, galima atsižvelgti į rūgšties ar šarmo atsargą (arba buferinę talpą) (7)(8). Jei buferinė talpa leidžia daryti prielaidą, kad medžiaga gali nebūti odą ardanti medžiaga, tai turi būti patvirtinta atliekant papildomus bandymus ir geriau būtų taikyti įteisintą ir priimtą in vitro arba ex vivo bandymą (žr. 5 ir 6 pakopas).

4.4. Toksiškumas per odą (4 pakopa). Jei buvo įrodyta, kad cheminė medžiaga yra labai toksiška per odą, in vivo odos dirginimo ar ardymo tyrimas gali būti neįmanomas, nes bandomosios medžiagos kiekis, kuris įprastai dedamas ant odos, gali būti didesnis už labai didelio toksiškumo dozę, taigi gyvūnas gali žūti arba sunkiai kentėti. Be to, jei jau yra atlikti toksiškumo per odą tyrimai su baltaisiais triušiais, naudojant 2000 mg/kg kūno masės arba didesnę ribinę dozę, ir nebuvo pastebėta odos dirginimo ar ardymo, papildomas odos dirginimo ar ardymo bandymas gali būti nereikalingas. Vertinant ūmų toksiškumą pirmiau atliktuose tyrimuose, reikėtų atsižvelgti į kelias aplinkybes. Pvz., paskelbta informacija apie odos pažeidimus gali būti neišsami. Gali būti bandomi ir stebimi gyvūnai kitų, ne triušių, rūšių, o rūšių jautrumas poveikiui gali labai skirtis. Be to, bandomosios medžiagos taikymo būdas gali netikti odos dirginimui ar ardymui įvertinti (pvz., medžiagų skiedimas bandant toksiškumą per odą) (9). Tačiau tais atvejais, kai toksiškumo per odą tyrimai su triušiais buvo gerai suplanuoti ir atlikti, neigiami rezultatai gali būti laikomi pakankamu įrodymu, kad medžiaga ardanti arba dirginanti.

4.5. In vitro arba ex vivo bandymų rezultatai (5 ir 6 pakopos). Medžiagų, kurios, kaip įrodyta, veikia kaip ardančios arba labai dirginančios atliekant patvirtinto tinkamumo ir priimtą in vitro arba ex vivo bandymą (10)(ll), skirtą šiam konkrečiam poveikiui įvertinti, nereikia bandyti su gyvūnais. Galima daryti prielaidą, kad tokios medžiagos turės panašų sunkų poveikį in vivo.

4.6. Bandymas su triušiais in vivo (7 ir 8 pakopos). Jei atlikus duomenų įrodomosios vertės analizę priimamas sprendimas atlikti bandymą in vivo, jį reikėtų pradėti pradiniu bandymu su vienu gyvūnu. Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad medžiaga yra odą ardanti, toliau bandyti nereikia. Jei atliekant pradinį bandymą ardomasis poveikis nepastebimas, dirginimo arba ardymo poveikis patvirtinamas naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus, veikiamus keturias valandas. Jei atliekant pradinį bandymą pastebimas dirginamasis poveikis, patvirtinamasis bandymas gali būti atliekamas nuosekliu būdu arba tuo pat metu veikiant du papildomus gyvūnus.

III. NUORODOS

5. OECD (1996). Test Guidelines Programme: Finai Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).

6. OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6. htm).

7. Worth, A. P., Fentem J. H., Balis M., Botham PA., Curren R. D., Earl L. K., Esdail D. J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709-720.

8. Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth, W. M. H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) p. 19-26.

9. Patil, S. M., Patrick, E., Maibach, H. I. (1996) Animal, Human, and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, 411-436.

10. Testing Method B.40.

11. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balis, M., Botham, PA, Curren, R. D., Earl, L. K., Edsail, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483-524.

______________

Schema. Odos dirginimo ar ardymo bandymo ir įvertinimo strategija

	Veikla	Rezultatas	Išvada
1	Yra duomenų apie žmones ir (arba) gyvūnus, kurie rodo poveikį odai ir gleivinei	Ardo	Galutinis sprendimas; laikoma ardančia. Bandyti nereikia.
		Dirgina	Galutinis sprendimas; laikoma dirginančia. Bandyti nereikia.
		Neardo/nedirgina	Galutinis sprendimas; laikoma neardančia arba nedirginančia. Bandyti nereikia.
	↓ Informacijos nėra arba turima informacija neįtikinanti ↓
2	Įvertinami SAR dėl odos ardymo ar dirginimo	Numatomas sunkus odos pažeidimas	Laikoma ardančia. Bandyti nereikia.
2	Įvertinami SAR dėl odos ardymo ar dirginimo	Numatomas odos dirginimas	Laikoma dirginančia. Bandyti nereikia.
	↓ Negalima prognozuoti arba prognozės neįtikinančios arba neigiamos ↓
3	Matuojama pH vertė (jei tinka, atsižvelgiama į buferinę talpą)	pH ≤ 2 arba ≥ 11.5 (esant didelei buferinei talpai, jei tinka)	Daroma prielaida apie ardymą. Bandyti nereikia.
	↓ 2< pH < 11.5, arba pH ≤ 2,0 arba ≥ 11,5, esant mažai ar didelei buferinei talpai, jei tinka ↓
4	Įvertinami sisteminio toksiškumo per odą duomenys(¹)	Labai toksiška	Daugiau bandyti nereikia.
4	Įvertinami sisteminio toksiškumo per odą duomenys(¹)	Neardo arba nedirgina, kai atliekamas bandymas su triušiais, naudojant ribinę 2000 mg/kg kūno masės arba didesnę dozę	Daroma prielaida, kad nėra ardanti arba dirginanti. Daugiau bandyti nereikia.
	↓ Tokios informacijos nėra arba ji nėra {tikinanti ↓
5	Atliekamas patvirtinto tinkamumo ir priimtas in vitro arba ex vivo odos ardymo bandymas	Ardo	Daroma prielaida apie ardymą in vivo. Daugiau bandyti nereikia.
	↓ Medžiaga neardo ↓
6	Atliekamas įteisintas ir priimtas in vitro arba ex vivo odos dirginimo bandymas	Dirgina	Daroma prielaida apie dirginimą in vivo. Daugiau bandyti nereikia.
	↓
⁽¹⁾	Galima nagrinėti prieš 2 ir 3 pakopą.
	Dar nėra įteisintų in vitro arba ex vivo metodų odos dirginimui bandyti arba medžiaga nėra dirginanti ↓
7	Atliekamas pradinis in vivo bandymas su vienu triušiu	Sunkus odos pažeidimas	Laikoma ardančia. Daugiau bandyti nereikia.
	↓ Nėra sunkaus pažeidimo ↓
8	Atliekamas patvirtinamasis bandymas, naudojant vieną arba du papildomus gyvūnus	Ardo arba dirgina	Laikoma ardančia arba dirginančia. Daugiau bandyti nereikia.
8		Neardo arba nedirgina	Laikoma neardančia arba nedirginančia. Daugiau bandyti nereikia.

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos

ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11

ŪMAUS TOKSIŠKUMO. AKIES DIRGINIMO AR ARDYMO (B.5) METODO APRAŠAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Šis metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 405 metodą (2002 m.).

2. Rengiant šį atnaujintą metodą ypatingas dėmesys buvo kreipiamas į galimą gyvūnų gerovės pagerinimą ir į visos turimos informacijos apie bandomąją medžiagą įvertinimą, siekiant išvengti nebūtinų bandymų su laboratoriniais gyvūnais. Šiame metode rekomenduojama prieš atliekant aprašytą medžiagos ūmaus akių ardymo ar dirginimo bandymą in vivo atlikti turimų atitinkamų duomenų įrodomosios vertės analizę (13). Jei duomenų nepakanka, jų galima gauti atliekant nuoseklųjį bandymą (14)(15). Į bandymo strategiją įtraukti šio metodo priede aprašyti įteisinti ir priimti in vitro bandymai. Be to, prieš numatant atlikti in vivo akių bandymą akių ardymui prognozuoti, rekomenduojama taikyti in vivo odos dirginimo ar ardymo bandymą.

3. Siekiant vienu metu užtikrinti duomenų mokslinį patikimumą ir gyvūnų gerovę, in vivo bandymai neturėtų būti numatomi tol, kol darant duomenų įrodomosios vertės analizę nebus įvertinti visi turimi duomenys, apibūdinantys galimą medžiagos ardomąjį ar dirginamąjį poveikį akims. Tokius duomenis sudarys turimų tyrimų su žmonėmis ir (arba) laboratoriniais gyvūnais rezultatai, ardymo ar dirginimo duomenys, gauti apie vieną arba kelias medžiagas, turinčias giminingą struktūrą, arba jų mišinius, duomenys, patvirtinantys medžiagos stiprias rūgštines arba šarmines savybes (16)(17), be to, įteisintų ir priimtų in vitro arba ex vivo odos ardymo ir dirginimo bandymų rezultatai (18)(19). Tyrimai gali būti atliekami prieš duomenų įrodomosios vertės analizę arba kaip jos rezultatas.

4. Tokia kai kurių medžiagų analizė gali parodyti, kad reikia atlikti medžiagos akių ardymo ar dirginimo gebos in vivo tyrimus. Visais šiais atvejais prieš numatant atlikti in vivo akių bandymą, iš pradžių reikėtų atlikti medžiagos poveikio odai in vivo tyrimą ir ją įvertinti pagal B.4 bandymo metodą (20). Duomenų įrodomosios vertės analizės ir nuosekliųjų bandymų strategijos taikymas turėtų sumažinti poreikį in vivo bandyti tokių medžiagų, apie kurias jau yra gauta pakankamai duomenų atliekant kitus tyrimus, akių ardymo ar dirginimo poveikį. Jei, taikant nuosekliųjų bandymų strategiją, akių ardymo arba dirginimo geba negali būti nustatyta net po odos ardymo ir dirginimo in vivo tyrimo, galima atlikti in vivo akių ardymo ar dirginimo bandymą.

5. Pirmenybė teikiama į šio metodo priedą įtrauktai nuosekliųjų bandymų strategijai, kurią sudaro įteisinti ir priimti in vitro arba ex vivo odos ardymo ar dirginimo bandymai. Strategiją parengė ir vienbalsiai rekomendavo EBPO seminaro dalyviai (21), ji buvo priimta ir rekomenduota kaip visuotinai sudarnintos cheminių medžiagų klasifikavimo sistemos (Globally Harmonised System, GHS) bandymų strategija (22). Rekomenduojama laikytis šios bandymų strategijos prieš pradedant in vivo bandymus. Naujoms medžiagoms rekomenduojamas nuoseklusis bandymo būdas moksliškai pagrįstiems duomenims apie medžiagos ardymo ar dirginimo savybes gauti. Turimoms medžiagoms, apie kurių odos ardymo ar dirginimo savybes duomenų nepakanka, ši strategija turėtų būti taikoma, jei trūksta duomenų.. Kitokios bandymo strategijos arba metodikos taikymas arba sprendimas netaikyti nuoseklaus bandymų metodo turi būti pagrįstas.

6. Apibrėžimai:

Akių dirginimas – akių pokyčių sukėlimas, paveikus bandomąja medžiaga priekinį akies paviršių, kai pokyčiai visiškai išnyksta per 21 parą po veikimo.

Akių ardymas – akies audinių pažeidimas arba sunkus regėjimo pablogėjimas, paveikus bandomąja medžiaga priekinį akies paviršių, kai pažeidimai ne visiškai išnyksta per 21 parą po veikimo.

7. Bandymo metodo esmė:

7.1. Ant bandomo gyvūno vienos akies dedama viena bandomosios medžiagos dozė; nepaveikta gyvūno akis naudojama kontrolei. Apibrėžtais laiko tarpais nustatomi ir balais įvertinami junginės, ragenos ir rainelės pažeidimai. Be to, poveikio išsamiam įvertinimui aprašomas bet koks kitas poveikis ir neigiamas sisteminis poveikis. Tyrimo trukmė turi būti pakankama poveikio grįžtamumui arba negrįžtamumui įvertinti.

II. BANDYMO METODO APRAŠYMAS

8. Pasiruošimas in vivo bandymui:

8.1. Gyvūnų rūšies pasirinkimas. Tinkamiausias laboratorinis gyvūnas – triušis albinosas. Naudojami sveiki, jauni ir suaugę triušiai. Kitų rūšių naudojimas turi būti pagrįstas.

8.2. Gyvūnų ruošimas. Abi kiekvieno bandymui numatyto gyvūno akys patikrinamos per 24 h iki bandymo pradžios. Gyvūnai, kuriems nustatomas akių dirginimas, akių defektai arba prieš tai buvęs ragenos pažeidimas, neturi būti naudojami.

8.3. Laikymo ir šėrimo sąlygos:

8.3.1. Gyvūnai turi būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandymo triušiai, temperatūra turi būti 20°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai.

8.3.2. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio.

9. Bandymo eiga:

9.1. Bandomosios medžiagos dėjimo būdas. Bandomoji medžiaga dedama į kiekvieno gyvūno vienos akies junginės maišelį, švelniai atitraukiant apatinį voką nuo akies obuolio. Vokai švelniai suspaudžiami maždaug vienai sekundei, kad būtų išvengta medžiagos nuostolių. Kita neapdorota akis naudojama kontrolei.

9.2. Akių plovimas:

9.2.1. Bandomo gyvūno akių, įdėjus bandomosios medžiagos, reikėtų neplauti mažiausiai 24 h, išskyrus kietąsias medžiagas (žr. 9.3.2 skirsnį) ir jei iš karto pasireiškia ardymo arba dirginimo poveikis. Po 24 h akis galima plauti, jei manoma, kad tai reikia daryti.

9.2.2. Nerekomenduojama naudoti pagalbinės gyvūnų grupės plovimo įtakai tirti, išskyrus kai tai yra moksliškai pagrįsta. Prireikus pagalbinės grupės, reikėtų naudoti du gyvūnus. Kruopščiai aprašomos plovimo sąlygos, pvz., plovimo laikas, plovimo tirpalo sudėtis ir temperatūra, trukmė, tūris ir tiekimo greitis.

9.3. Dozės:

9.3.1. Skysčių bandymas. Bandant skysčius, naudojama 0,1 ml dozė. Nereikėtų naudoti purškiklio medžiagai tiesiai į akį purkšti. Prieš įpurškiant 0,1 ml į akį, skystis iš pradžių pumpuojamas ir surenkamas į indą.

9.3.2. Kietųjų medžiagų bandymas:

9.3.2.1. Bandant kietąsias medžiagas, pastą ir daleles, naudojamos medžiagos tūris turi būti 0,1 ml arba masė – ne didesnė kaip 100 mg. Bandomoji medžiaga turi būti sumalta į smulkias dulkes. Kietosios medžiagos tūris matuojamas ją švelniai sutankinus, pvz., tapšnojant matavimo indą.

9.3.2.2. Jei stebint pirmą kartą, praėjus 1 h po akies apdorojimo, kieta bandomoji medžiaga nepašalinama iš bandomo gyvūno akies veikiant fiziologiniams mechanizmams, akį galima praplauti fiziologiniu tirpalu arba distiliuotu vandeniu.

9.3.3. Aerozolių bandymas:

9.3.3.1. Prieš įlašinant į akį rekomenduojama visas purškiamąsias medžiagas ir aerozolius iš pradžių surinkti į indą. Viena išimtis daroma slėginiuose aerozolių purkštuvuose esančioms medžiagoms, kurių negalima sukaupti dėl garavimo. Tokiais atvejais akis atmerkiama ir bandomoji medžiaga maždaug vieną sekundę tiesiog švirkščiama į akį stačiu kampu iš 10 cm atstumo. Šis atstumas gali būti kitoks, atsižvelgiant į purkštuvo ir jo turinio slėgį. Reikia imtis atsargumo priemonių nepažeisti akies veikiant purškimo slėgiui. Atitinkamais atvejais gali tekti įvertinti mechaninio akies pažeidimo srauto jėga galimybę.

9.3.3.2. Aerozolio dozei įvertinti galima modeliuoti šį įpurškimo bandymą: per triušio akies dydžio angą medžiaga purškiama ant pasverto popieriaus lapo, dedamo tiesiai prieš akį. Popieriaus masės padidėjimas naudojamas apytikriam į akį įpurkšto kiekio įvertinimui. Lakiųjų medžiagų dozė gali būti įvertinta pasveriant indą su medžiaga prieš įpurškimą ir po jo.

9.4. Pradinis bandymas (in vivo akies dirginimo ar ardymo bandymas su vienu gyvūnu):

9.4.1. Kaip aiškiai nurodyta nuosekliųjų bandymų strategijos aprašyme (žr. 1 priedą), labai rekomenduojama in vivo bandymą iš pradžių atlikti su vienu gyvūnu.

9.4.2. Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad taikant aprašytąją metodiką medžiaga yra akį ardanti arba labai ją dirginanti, kiti akies dirginimo bandymai neturi būti atliekami.

9.5. Vietinis nuskausminimas:

9.5.1. Galima naudoti vietinio nuskausminimo priemones atsižvelgiant į kiekvieną individualų atvejį. Jei duomenų įrodomosios vertės analizė rodo, kad medžiaga gali sukelti skausmą arba pradinis bandymas rodo skausmingą gyvūno reakciją, prieš įlašinant bandomąją medžiagą galima naudoti vietinio nuskausminimo priemonę.

9.5.2. Reikia kruopščiai parinkti vietinio nuskausminimo priemonės tipą, koncentraciją ir dozę, siekiant užtikrinti, kad dėl jos naudojimo nebūtų reakcijos į bandomosios medžiagos poveikį skirtumų. Kontrolinė akis nuskausminama panašiu būdu.

9.6. Patvirtinamasis bandymas (in vivo akies dirginimo bandymas su papildomais gyvūnais):

9.6.1. Jei atliekant pradinį bandymą ardantis poveikis nepastebimas, dirginantis poveikis arba neigiama reakcija turi būti patvirtinta naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus.

9.6.2. Jei atliekant pradinį bandymą pastebimas labai didelis dirginantis poveikis, rodantis galimą stiprų (neišnykstantį) poveikį atliekant patvirtinamąjį bandymą, šį bandymą rekomenduojama atlikti nuosekliu būdu ir vietoj dviejų papildomų gyvūnų vienu metu naudoti vieną gyvūną. Jei antrajam gyvūnui pasireiškia ardomasis arba sunkus dirginamasis poveikis, bandymas nutraukiamas.

9.6.3. Silpnam arba vidutinio dydžio dirginamajam poveikiui patvirtinti gali būti reikalingi papildomi gyvūnai.

9.7. Stebėjimo laikotarpis:

9.7.1. Stebėjimo laikotarpio trukmės turi pakakti stebimo poveikio dydžiui ir grįžtamumui visiškai įvertinti. Tačiau bandymas turi būti baigtas bet kuriuo momentu, kai tik gyvūnui pasireiškia ilgalaikiai didelio skausmo arba kančios požymiai (22). Poveikio grįžtamumui nustatyti gyvūnai paprastai stebimi 21 parą po bandomosios medžiagos suleidimo. Jei grįžtamumas pastebimas anksčiau nei baigiantis 21 parai, bandymas nutraukiamas tuo momentu.

9.7.2. Klinikiniai stebėjimai ir akių reakcijos įvertinimas balais:

9.7.2.1. Akys tiriamos praėjus 1, 24, 48, ir 72 h po bandomosios medžiagos įdėjimo. Gyvūnai bandomi ne ilgiau, nei būtina galutinei informacijai gauti. Gyvūnai, kuriems pasireiškia ilgalaikis didelis skausmas arba kančia, turi būti iš karto humaniškai numarinti, o medžiaga atitinkamai įvertinta. Turi būti humaniškai numarinami gyvūnai, kuriems po įlašinimo atsiranda šie pažeidimai: ragenos pradūrimas arba didelės ragenos opos, įskaitant stafilomą; kraujo atsiradimas priekinėje akies kameroje; 4 balų ragenos drumstumas, kuris nepraeina po 48 h; šviesos reflekso nebuvimas (2 balų rainelės reakcija) ilgiau kaip 72 h; junginės membranos opos; junginės arba niktitacinės membranos nekrozė arba nekrozinio audinio lupimasis. Numarinti reikia todėl, kad tokie pažeidimai paprastai yra negrįžtami.

9.7.2.2. Bandymas su gyvūnais, kuriems akių pažeidimų nepastebima, gali būti baigti ne anksčiau kaip ketvirtą parą po įlašinimo. Gyvūnai su nedideliais ir vidutiniais pažeidimais turi būti stebimi tol, kol pažeidimai pranyksta, arba 21 parą, t.y. iki tyrimo pabaigos. Apžiūrėti reikia po 7, 14 ir 21 paros, kad būtų galima nustatyti pažeidimų tipą ir jų grįžtamumą arba negrįžtamumą.

9.7.2.3. Akių pažeidimo balai (junginės, ragenos ir rainelės) užrašomi kiekvienos apžiūros metu (1 lentelė). Be to, nurodomi visi kiti akies pažeidimai (pvz., panuso, dėmių atsiradimas) arba sisteminis neigiamas poveikis.

9.7.2.4. Tikrinant reakciją galima naudoti binokulinę lupą, rankinę plyšinę lempą, biologinį mikroskopą arba kitokį tinkamą įtaisą. Užrašius 24 h stebėjimus, akys gali būti tiriamos naudojant fluoresceiną.

9.7.2.5. Akių reakcijos įvertinimas balais neišvengiamai yra subjektyvus. Siekiant labiau suderinti akių reakcijos įvertinimą balais ir padėti bandymo laboratorijoms ir visiems, kurie vykdo ir aiškina stebėjimus, juos vykdantis personalas turi būti atitinkamai mokomas taikyti įvertinimo balais sistemą.

III. DUOMENYS

10. Rezultatų įvertinimas:

10.1. Akių dirginimas balais įvertinamas pagal pažeidimų tipą ir sunkumą bei atsižvelgiant į grįžtamumą arba į jo nebuvimą.

10.2. Kiekvienas įvertinimas balais nėra medžiagos dirginamųjų savybių absoliutusis įvertis, kadangi dar įvertinamas kitas bandomosios medžiagos poveikis. Į kiekvieną įvertinimą balais reikėtų žiūrėti kaip į pamatines vertes, reikšmingas tik tais atvejais, kai jas patvirtina išsamus visų kitų stebėjimų aprašymas ir įvertinimas.

IV. ATASKAITOS RENGIMAS

11. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:

11.1. In vivo bandymo pagrindimas: jau turimų bandymo duomenų įrodomosios vertės analizė, įskaitant nuosekliųjų bandymų strategijos taikymo rezultatus:

11.1.1. ankstesnių bandymų atitinkamų duomenų aprašymas;

11.1.2. duomenys, gauti kiekvienoje bandymų strategijos stadijoje;

11.1.3. atliktų in vitro bandymų aprašymas, įskaitant išsamią informaciją apie procedūras, rezultatus, gautus tiriant bandomąją ar etaloninę medžiagą;

11.1.4. atlikto in vivo odos dirginimo ar ardymo tyrimo aprašymas, įskaitant gautus rezultatus;

11.1.5. duomenų įrodomosios vertės analizė in vivo tyrimui atlikti.

11.2. Bandomoji medžiaga:

11.2.1. jos identifikavimo duomenys (pvz., CAS numeris, gamintojas, grynumas, žinomos priemaišos, siuntos numeris);

11.2.2. fizikinė būsena ir fizikinės cheminės savybės (pvz., pH, lakumas, tirpurnas, stabilumas, reagavimas su vandeniu);

11.2.3. sudėtis ir komponentų procentinė dalis, jei tai mišinys;

11.2.4. jei naudojama vietinio nuskausminimo priemonė: identifikavimas, grynumas, tipas, dozė ir galima sąveika su bandomąja medžiaga.

11.3. Nešiklis: jo identifikavimas, koncentracija (jei tinka), naudojamas tūris; nešiklio pasirinkimo pagrindimas.

11.4. Bandymo gyvūnai:

11.4.1. naudota rūšis ar veislė, kitų nei baltųjų triušių naudojimo pagrindimas;

11.4.2. kiekvieno gyvūno amžius tyrimo pradžioje;

11.4.3. kiekvienos lyties gyvūnų skaičius bandymo ir kontrolinėje (jei reikia) grupėje;

11.4.4. kiekvieno gyvūno kūno masė bandymo pradžioje ir pabaigoje;

11.4.5. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir kt.

11.5. Rezultatai:

11.5.1. metodo, taikyto dirginimui kiekvienu stebėjimo momentu įvertinti balais (pvz., rankinė plyšinė lempa, biologinis mikroskopas, fluoresceinas), aprašymas;

11.5.2. kiekvieno gyvūno dirginimo ar ardymo reakcijos duomenų, gautų kiekvienu stebėjimo momentu iki gyvūno pašalinimo iš bandymo, lentelių sudarymas;

11.5.3. stebimo dirginimo arba ardymo tipo ir laipsnio pasakojamasis aprašymas;

11.5.4. visų kitų akies pažeidimų aprašymas (pvz., vaskuliarizacija, panuso susidarymas, sąaugų, dėmių atsiradimas);

11.5.5. bet kokio ne akims daromo neigiamo vietinio ir sisteminio poveikio aprašymas, visi histopatologinio tyrimo rezultatai, jei yra.

11.6. Rezultatų aptarimas.

12. Rezultatų aiškinimas:

12.1. Akių dirginimo rezultatų, gautų laboratoriniams gyvūnams, ekstrapoliavimas žmonėms tinka tik tam tikru laipsniu. Daugeliu atvejų baltieji triušiai yra jautresni akis dirginančioms arba ardančioms medžiagoms nei žmonės.

12.2. Aiškinant rezultatus reikia neįtraukti antrinės infekcijos sukelto dirginimo.

V. NUORODOS

14. de Silva, O., Cottin, M., Darni, N., Roguet, R., Catroux, P, Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K. G., Gerner, L, Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K. C., Hill, R. N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.

15. Worth AP. and Fentem J. H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.

16. Young, J. R., How, M. J., Walker, AP, Worth W. M. H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 – 26.

17. Neun, D. J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231.

18. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balis, M., Botham, PA, Curren, R. D., Earl, L. K., Edsaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483-524.

19. Testing Method B.40 Skin Corrosion.

20. Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion.

21. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Finai Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http: // www. oecd. org/ehs/test/background. htm).

22. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http: //www. oecd. org/ehs/Class/HCL6. htm).

23. Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

______________

1 lentelė. Akių pažeidimo vertinimo balais skalė

Ragena

Drumstis: tankumo laipsnis (duomenys imami iš tankiausios srities) (^*)

Opėjimo arba drumsties nėra .................................................................................... 0

Išsibarsčiusios arba išsklaidytos drumsties sritys (išskyrus nedidelį normalaus blizgesio sumažėjimą), rainelės elementai aiškiai matomi .............................................................................. 1

Lengvai įžiūrima pusiau skaidri sritis, rainelės elementai šiek tiek dulsvi ................. 2

Perlamutrinės sritys, rainelės elementai nematomi, vyzdžio ribos vos įžiūrimos ...... 3

Ragena matinė, dėl drumsties rainelės nesimato ....................................................... 4

Didžiausias įmanomas: 4

Rainelė

Normali ..................................................................................................................... 0

Labai pagilėjusios raukšlės, kraujo priplūdimas, pabrinkimas, vidutinė junginės apie rageną hiperemija; arba injekcija; rainelė vis dar reaguoja į šviesą (vangi reakcija laikoma poveikiu)............................ 1

Kraujavimas, stiprus rainelės audinių suardymas arba nėra reakcijos į šviesą............ 2

Didžiausias įmanomas: 2

Junginė

Raudonumas (taikoma voko ir obuolio junginei, išskyrus rageną ir rainelę)

Normali...................................................................................................................... 0

Kai kurie kraujo indai aiškiai hiperemiški (įšvirkšta)................................................. 1

Išsklaidyta tamsiai raudona spalva, atskiri indai sunkiai įžiūrimi.............................. 2

Išsklaidyta jautienos raudonumo spalva.................................................................... 3

Didžiausias įmanomas: 3

Chemozė

Paburkimas (taikoma vokams ir (arba) niktitacinėms membranoms)

Paburkimo nėra.......................................................................................................... 0

Nedidelis paburkimas, didesnis nei normalus............................................................ 1

Akivaizdus paburkimas, vokai iš dalies išvirsta......................................................... 2

Paburkimas, pusiau užmerkti vokai............................................................................ 3

Paburkimas, vokai užmerkti daugiau nei per pusę..................................................... 4

Didžiausias įmanomas: 4

______________

Ūmaus toksiškumo. Akies dirginimo ar

ardymo (B.5) metodo aprašo priedas

NUOSEKLIŲJŲ BANDYMŲ STRATEGIJA AKIŲ DIRGINIMUI IR ARDYMUI NUSTATYTI

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Siekiant gauti nuodugnių mokslinių rezultatų ir rūpinantis gyvūnų gerove, svarbu be reikalo nenaudoti gyvūnų ir kiek įmanoma mažinti visus bandymus, kurie gyvūnams gali iššaukti sunkias reakcijas. Visa informacija apie medžiagą dėl jos galimo ardomojo ar dirginamojo poveikio odai turėtų būti įvertinta prieš sprendžiant dėl in vivo bandymų. Jei jau yra pakankamai duomenų galimam bandomosios medžiagos ardomajam arba dirginamajam poveikiui odai klasifikuoti, nereikia bandymų su laboratoriniais gyvūnais Taigi taikant duomenų įrodomosios vertės analizę ir nuosekliųjų bandymų strategiją sumažėja būtinybė atlikti in vivo bandymus, ypač jei tikėtina, kad medžiaga gali iššaukti sunkias reakcijas.

2. Turimai informacijai apie medžiagų dirginamąjį ir ardomąjį poveikį akims įvertinti rekomenduojama taikyti duomenų įrodomosios vertės analizę, kuri leistų spręsti, ar tokio poveikio galimybei apibūdinti reikia atlikti papildomus tyrimus, išskyrus in vivo akių tyrimus. Jei reikia papildomų tyrimų, atitinkamiems eksperimentiniams duomenims gauti rekomenduojama taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Norint gauti duomenų apie nebandytas medžiagas, reikalingų jų ardomajam ar dirginamajam poveikiui odai įvertinti, reikėtų taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Šiame priede aprašyta bandymų strategija buvo parengta EBPO seminare (5). Vėliau ji buvo patvirtinta bei išplėsta kaip integruota darnioji pavojų dėl cheminių medžiagų poveikio žmonių sveikatai ir aplinkai klasifikavimo sistema, 1998 m. lapkričio mėn. priimta 28-ajame jungtiniame cheminių medžiagų komiteto ir cheminių medžiagų darbo grupės posėdyje (6).

3. Nors ši nuosekliųjų bandymų strategija nėra sudėtinė B.5 bandymo metodo dalis, ji apibūdina rekomenduojamą būdą akių dirginimo ar ardymo charakteristikoms nustatyti. Šis būdas atitinka geriausią praktiką ir yra akių dirginimo ar ardymo in vivo bandymų etikos etalonas. Bandymo metode pateikiamos in vivo bandymų rekomendacijos ir apibendrinami veiksniai, į kuriuos reikėtų atkreipti dėmesį prieš pradedant tokį bandymą. Nuosekliųjų bandymų strategijoje siūlomas duomenų įrodomosios vertės analizės būdas, kuris leistų įvertinti turimus duomenis apie bandomųjų medžiagų akių dirginimo ar ardymo savybes, kad būtų galima nuosekliai gauti reikiamų duomenų apie medžiagas, kurioms reikalingi papildomi tyrimai arba kurios nebuvo tirtos. Strategijoje nurodoma iš pradžių atlikti įteisintus ir priimtus in vitro arba ex vivo bandymus ir tik po to naudoti odos ardymo ar dirginimo bandymo metodą B.4 konkrečiomis aplinkybėmis (7)(8).

II. ĮVERTINIMO IR BANDYMO STRATEGIJOS APRAŠYMAS

4. Siekiant nustatyti in vivo akių bandymų reikalingumą, prieš atliekant bandymus, kurie būtų nuosekliųjų bandymų strategijos dalis (schema), įvertinama visa turima informacija. Nors reikšmingos informacijos galima būtų gauti vertinant vienintelį parametrą (pvz., pH ribines vertes), turėtų būti nagrinėjama visa turima informacija. Sprendimui priimti turėtų būti daroma visų atitinkamų duomenų apie konkrečios medžiagos arba jos struktūrinių analogų poveikį įrodomosios vertės analizė, kuri pagrįstų priimamą sprendimą. Didžiausias dėmesys turėtų būti kreipiamas į duomenis apie medžiagą, gautus tiriant žmones ir gyvūnus, o vėliau tirti in vitro arba ex vivo bandymų duomenis. Ardomųjų medžiagų in vivo tyrimų reikėtų kiek įmanoma vengti. Bandymų strategijos veiksniai:

4.1. Turimų duomenų, gautų tiriant žmones ir gyvūnus, įvertinimas (1 pakopa). Iš pradžių nagrinėjami tiriant žmones gauti duomenys, pvz., klinikiniai arba profesinių susirgimų tyrimai ir bylų ataskaitos, ir (arba) akių tyrimų su gyvūnais duomenys, kadangi jie suteikia informacijos, tiesiogiai susijusios su poveikiu akims. Toliau įvertinami turimi odos ardymo ar dirginimo duomenys, gauti atliekant tyrimus su žmonėmis ir (arba) gyvūnais. Medžiagos, kurios yra žinomos kaip ardančios arba labai dirginančios akis, neturėtų būti lašinamos į gyvūnų akis, be to, nereikėtų lašinti medžiagų, kurios ardo arba dirgina odą; tokios medžiagos laikomos ardančiomis ir (arba) dirginančiomis akis. Medžiagos, apie kurias yra pakankamai duomenų, kad jos nėra ardančios arba dirginančios, atsižvelgiant į ankstesnius akių tyrimus, irgi neturėtų būti bandomos atliekant in vivo akių tyrimus.

4.2. Struktūros ir aktyvumo ryšių (SAR) analizė (2 pakopa). Analizuojami giminingą struktūrą turinčių medžiagų bandymo rezultatai, jei tokie būtų. Kai tiriant žmones ir gyvūnus gautų duomenų apie giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius pakanka, norint įrodyti medžiagų gebą ardyti ar jautrinti akis, galima daryti prielaidą, kad įvertinimui pateiktos bandomosios medžiagos poveikis bus toks pats. Tokiais atvejais bandomosios medžiagos nebūtina bandyti. Taikant nuosekliųjų bandymų strategiją, neigiami duomenys, gauti tiriant giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius, nėra pakankamas įrodymas, kad medžiaga nėra ardanti ar jautrinanti. Medžiagų geba ardyti ir dirginti odą bei akis turi būti nustatoma taikant įteisintus ir priimtus SAR metodus.

4.3. Fizikinės cheminės savybės ir cheminis reaktyvumas (3 pakopa). Medžiagos, turinčios ribines pH vertes, pvz., ≤ 2,0 ir ≥ 11,5, gali turėti didelį vietinį poveikį. Jei ribinė pH vertė yra pagrindinė savybė, pagal kuria medžiaga identifikuojama kaip akis ardanti medžiaga, galima atsižvelgti į rūgšties ar šarmo atsargą (arba buferinę talpą) (9)(10). Jei buferinė talpa leidžia daryti prielaidą, kad medžiaga gali nebūti akis ardanti medžiaga, tai turi būti patvirtinta atliekant papildomus bandymus ir geriau būtų taikyti įteisintą ir priimtą in vitro arba ex vivo bandymą (žr. 5 ir 6 pakopas).

4.4. Kitos turimos informacijos nagrinėjimas (4 pakopa). Šioje stadijoje įvertinama visa turima informacija apie sisteminį toksiškumą per odą. Nagrinėjamas ūmus bandomosios medžiagos toksiškumas per odą. Jei buvo įrodyta, kad bandomoji medžiaga yra labai toksiška per odą, nebūtina bandyti jos poveikio akims. Nors nebūtinai turi būti ryšys tarp ūmaus toksiškumo per odą ir akių dirginimo ar ardymo, galima daryti prielaidą, kad medžiagai esant labai toksiškai per odą, ji taip pat bus labai toksiška jos įlašinus į akis. Be to, tokie duomenys gali būti nagrinėjami tarp 2 ir 3 pakopų.

4.5. In vitro arba ex vivo bandymų rezultatai (5 ir 6 pakopos). Medžiagų, kurios pasirodė ardančios arba labai dirginančios atliekant patvirtinto tinkamumo ir priimtą in vitro arba ex vivo bandymą (11)(12), skirtą šiam konkrečiam poveikiui akims arba odai įvertinti, nereikia bandyti su gyvūnais. Galima padaryti prielaidą, kad tokios medžiagos turės panašų sunkų poveikį in vivo. Jei įteisintų ir priimtų in vitro ar ex vivo bandymų nėra, 5 ir 6 pakopos praleidžiamos ir iš karto pereinama prie 7 pakopos.

4.6. Medžiagos dirginamojo arba ardomojo poveikio odai įvertinimas in vivo (7 pakopa). Jei pirmiau išvardytų tyrimų duomenų nepakanka, norint atlikti įtikinamą duomenų įrodomosios vertės analizę apie medžiagos gebą dirginti ar ardyti akis, iš pradžių įvertinama in vivo medžiagos geba dirginti ar ardyti odą, taikant bandymo metodą B.4 (8) ir jo priedą (13). Jei įrodoma, kad medžiaga ardo arba labai dirgina odą, ji laikoma akis ardančia ir dirginančia medžiaga, jei kita informacija nepatvirtina priešingos išvados. Taigi in vivo akių bandymo atlikti nereikėtų. Jei medžiaga nėra ardanti arba labai dirginanti odą, turėtų būti atliekamas in vivo akių bandymas.

4.7. Bandymas su triušiais in vivo (8 ir 9 pakopos). In vivo akių bandymą reikėtų pradėti atliekant pradinį bandymą su vienu gyvūnu. Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad medžiaga yra labai dirginanti arba ardanti akis, toliau bandyti nereikia. Jei atliekant pradinį bandymą ardymo arba sunkus dirginantis poveikis nepastebimas, atliekamas patvirtinamasis bandymas, naudojant du papildomus gyvūnus.

III. NUORODOS

5. OECD (1996) OECD Test Guidelines Programine: Finai Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Tęst Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).

6. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

7. Worth, A. P. and Fentem J. H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.

8. Testing method B.4. Acute Toxicity: dermal irritation/corrosion.

9. Young, J. R., How, M. J., Walker, AP, Worth W. M. H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.

10. Neun, D. J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231.

12. Testing Method B.40 Skin Corrosion.

13. Annex to Testing method B.4: A Sequential Testing Strategy for Skin Irritation and Corrosion.

______________

Schema. Akių dirginimo ar ardymo bandymo ir įvertinimo strategija

	Veikla		Rezultatas	Išvada
1	Yra duomenų apie žmones ir (arba) gyvūnus, kurie rodo poveikį akims		Ardo akis	Galutinis sprendimas; laikoma akis ardančia. Bandyti nereikia.
			Dirgina akis	Galutinis sprendimas; laikoma akis dirginančia. Bandyti nereikia.
			Akių neardo ir nedirgina	Galutinis sprendimas; laikoma, kad akių neardo ir nedirgina. Bandyti nereikia.
	Yra duomenų apie žmones ir (arba) gyvūnus, kurie rodo ardantį poveikį odai		Ardo odą	Daroma prielaida apie akių ardymą. Bandyti nereikia.
	Yra duomenų apie žmones ir (arba) gyvūnus, kurie rodo labai dirginantį poveikį odai		Labai dirgina odą	Daroma prielaida apie akių dirginimą. Bandyti nereikia
	↓
	Informacijos nėra arba turima informacija neįtikinanti
	↓
2	Įvertinami SAR dėl akių ardymo ar dirginimo		Numatomas sunkus akių pažeidimas	Daroma prielaida apie akių ardymą. Bandyti nereikia
			Numatomas akių dirginimas	Daroma prielaida apie akių dirginimą. Bandyti nereikia.
	Įvertinami SAR dėl odos ardymo		Numatomas odos ardymas	Daroma prielaida apie akių ardymą. Bandyti nereikia.
	↓ Negalima prognozuoti arba prognozės neįtikinančios arba neigiamos ↓
3	Matuojama pH vertė (jei tinka, atsižvelgiama į buferinę talpą)		pH≤2 arba ≥ 11,5 (esant didelei buferinei talpai, jei tinka)	Daroma prielaida apie akių ardymą. Bandyti nereikia.
	↓ 2 < pH < 11,5, arba pH ≤ 2,0 arba ≥ 11,5, esant mažai ar didelei buferinei talpai, jei tinka ↓
4	Įvertinami sisteminio toksiškumo per odą duomenys		Labai toksiška, esant koncentracijai, kuri būtų bandoma akims	Medžiaga būtų per daug nuodinga, kad galima būtų bandyti. Bandyti nereikia.
	↓ Tokios informacijos nėra arba medžiaga nėra labai toksiška ↓
5	Atliekamas įteisintas ir priimtas in vitro arba ex vivo akių ardymo bandymas	ardo		Daroma prielaida apie akių ardymą. Daugiau bandyti nereikia.
	↓ Medžiaga neardo arba įteisintų ir priimtų in vitro arba ex vivo akių ardymo bandymo metodų ↓
6	Atliekamas įteisintas ir priimtas in vitro arba ex vivo akių dirginimo bandymas	Dirgina		Daroma prielaida apie akių dirginimą. Daugiau bandyti nereikia.
	↓ Medžiaga nedirgina arba nėra įtvirtintų ir priimtų in vitro arba ex vivo akių dirginimo bandymo metodų ↓
7	Bandymu įvertinamas in vivo odos dirginimas ar ardymas (žr. bandymo metodą B.4 ir jo priedą)	Ardo arba labai dirgina		Daroma prielaida apie akių ardymą. Daugiau bandyti nereikia.
	↓ Medžiaga odos neardo arba labai nedirgina ↓
8	Atliekamas pradinis in vivo triušio akių bandymas, naudojant vieną gyvūną	Sunkus akių pažeidimas		Laikoma akis ardančia. Daugiau bandyti nereikia.
	↓ Nėra sunkaus pažeidimo arba jokio reakcijos ↓
9	Atliekamas patvirtinamasis bandymas, naudojant vieną arba du papildomus gyvūnus	Ardo arba dirgina		Laikoma akis ardančia arba dirginančia. Daugiau bandyti nereikia.
		Neardo arba nedirgina		Laikoma akių neardančia ir nedirginančia. Daugiau bandyti nereikia

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos

ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11

TOKSIŠKO POVEIKIO PRENATALINIAM VYSTYMUISI TYRIMO (B. 31) METODO APRAŠAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Šis metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 414 metodą (2001 m.).

2. Šis toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi bandymo metodas skirtas suteikti bendros informacijos apie poveikį veisiančios patelės gimdoje augančio vaisiaus prenataliniam vystymuisi; tai gali būti poveikio motinai, iškaitant žūtį, įvertinimas, struktūrinės anomalijos arba vaisiaus augimo pakitimai. Funkciniai trūkumai, nors ir yra svarbi vystymosi dalis, nėra šio bandymo metodo sudėtinė dalis. Jie gali būti bandomi atliekant atskirą tyrimą arba kaip šio tyrimo papildymas, taikant neurotoksiško poveikio vystymuisi bandymo metodą. Prireikus gauti informacijos apie funkcinių trūkumų ir kito postnatalinio poveikio bandymą, reikėtų susipažinti su toksiško poveikio dviejų kartų reprodukcijai tyrimu ir neurotoksiško poveikio vystymuisi tyrimu.

3. Gali tekti šį bandymo metodą specialiai pritaikyti atskiriems atvejams atsižvelgiant į konkrečias žinias, pvz., bandomosios medžiagos fizikinės chemines arba toksines savybes. Toks pritaikymas priimtinas, kai įrodantys moksliniai duomenys rodo, kad dėl to bandymas bus informatyvesnis. Tokiais atvejais šie moksliniai įrodymai turi būti kruopščiai aprašyti tyrimo ataskaitoje.

4. Apibrėžimai:

Vystymosi toksikologija – organizmo vystymuisi neigiamo poveikio, galinčio atsirasti dėl medžiagos veikimo prieš apvaisinimą, prenataliniu arba postnataliniu metu iki lytinio subrendimo, tyrimas. Pagrindinius toksiško poveikio vystymuisi požymius sudaro: 1) organizmo žūtis, 2) struktūros anomalijos, 3) augimo pakitimas ir 4) funkciniai trūkumai. Vystymosi toksikologija anksčiau buvo vadinama teratologija.

Neigiamas poveikis – bet koks su poveikiu susijęs pakitimas palyginti su etalonu, mažinantis organizmo gebą išgyventi, daugintis arba prisitaikyti prie aplinkos. Vystymosi toksikologiją plačiausia prasme sudaro bet koks poveikis, kuris trukdo apvaisinto kiaušinėlio normaliam vystymuisi, prieš gimimą ir po jo.

Augimo pakitimas – palikuonio organo arba kūno masės ar dydžio pakitimas.

Pakitimai (anomalijos) – struktūriniai vystymosi pakitimai, kuriuos sudaro išsigimimai ir nukrypimai (51).

Išsigimimas/didelė anomalija – struktūrinis pakitimas, laikomas kenksmingu gyvūnui (be to, gali būti mirtinas) ir paprastai retas.

Nukrypimas/maža anomalija – struktūrinis pakitimas, kurio kenksmingas poveikis gyvūnui yra mažas arba jo visai nėra; gali būti laikinas ir gana dažnai pasitaikyti kontrolinėje populiacijoje.

Apvaisintas kiaušinėlis – apvaisinto kiaušinėlio dalių visuma bet kurioje vystymosi stadijoje nuo apvaisinimo iki gimimo, įskaitant ekstraembrionines membranas, gemalą arba vaisių.

Implantacija (nidacija) – blastocistos susijungimas su gimdos epitelio gleivine, įskaitant jos prasiskverbimą per gimdos epitelį ir jos įaugimą į gleivinę.

Gemalas – visų organizmų ankstyvoji arba vystymosi stadija, tiksliau apvaisinto kiaušinėlio vystymosi produktas nuo didžiosios ašies pasirodymo iki pagrindinių struktūrų atsiradimo.

Toksiškas poveikis gemalui – kenksmingas poveikis normaliai struktūrai, vystymuisi, augimui ir (arba) gemalo gyvybingumui.

Vaisius – apvaisintas palikuonis postembrioniniu laikotarpiu.

Toksiškas poveikis vaisiui – kenksmingas poveikis normaliai struktūrai, vystymuisi, augimui ir (arba) vaisiaus gyvybingumui.

Persileidimas – apvaisintų produktų, gemalo arba negyvybingo vaisiaus priešlaikinis pašalinimas iš gimdos.

Rezorbcija – reiškinys, kai gimdoje implantuotas apvaisintas kiaušinėlis žūsta ir yra rezorbuojamas arba buvo rezorbuotas.

Ankstyvoji rezorbcija – implantacijos pėdsakai be atpažįstamo gemalo ar vaisiaus.

Vėlyvoji rezorbcija – žuvęs gemalas arba vaisius su išoriniais išsigimimą rodančiais pakitimais.

NOAEL (No observed adverse effect level) – nesukeliančio pastebimo neigiamo poveikio lygio santrumpa, ir tai yra didžiausia dozė arba poveikio lygis, kuris nesukelia su poveikiu susijusių neigiamų pakitimų.

5. Etaloninė medžiaga. Nėra.

6. Bandymų metodo esmė:

6.1. Paprastai bandomoji medžiaga leidžiama veisiančiai patelei ne vėliau kaip nuo implantacijos iki likus vienai parai iki numatyto numarinimo, kuris turi įvykti kiek įmanoma arčiau normalaus atsivedimo dienos, nerizikuojant prarasti duomenis, jei įvyktų priešlaikinis atsivedimas.

6.2. Bandymų metodas nėra skirtas tik organogenezės laikotarpiui tirti (pvz., 5-15 parų graužikams, 6-18 parų triušiams), juo taip pat tiriamas poveikis visą veisimo laikotarpį nuo ikiimplantacinio laikotarpio, jei tinka, iki likus vienai parai iki cezario pjūvio darymo. Prieš pat cezario pjūvio darymą patelės numarinamos, tiriamas gimdos turinys ir įvertinamos vaisiaus išoriškai matomos anomalijos bei minkštojo audinio ir griaučių pakitimai.

II. BANDYMO METODO APRAŠYMAS

7. Gyvūnų rūšies pasirinkimas:

7.1. Rekomenduojama bandymams pasirinkti tinkamiausią rūšį ir naudoti tas laboratorines rūšis bei veisles, kurios yra paprastai naudojamos atliekant toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi bandymus.

7.2. Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkė, o ne graužikų – triušis. Kitos rūšies naudojimą būtina pagrįsti.

8. Laikymo ir šėrimo sąlygos:

8.1. Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22°C (± 3 °C) graužikams ir 18°C (± 3 °C) triušiams. Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio.

8.2. Poruojama šiam tikslui pritaikytuose narveliuose. Pageidautina suporuotus gyvūnus laikyti atskirai, tačiau leidžiamas laikymas nedidelėmis grupėmis.

9. Gyvūnų ruošimas:

9.1. Naudojami sveiki ir ankstesniuose bandymuose nedalyvavę gyvūnai, kurie mažiausiai 5 paras pratinami prie laboratorinių sąlygų. Apibūdinama bandomo gyvūno rūšis, veislė, jų tiekėjas, lytis, masė ir (arba) amžius. Kiek įmanoma, visų bandymo grupių gyvūnai turi būti vienodos kūno masės ir amžiaus. Kiekvienai dozei naudojamos jaunos, suaugusios neturėjusios palikuonių patelės.

9.2. Patelės poruojamos su tos pačios rūšies ir veislės patinais, be to, reikėtų vengti poravimo su tų pačių tėvų palikuonimis. Graužikams 0 veisimo diena yra vaginalinio kamščio ir (arba) spermos atsiradimo diena; triušiams 0 diena paprastai yra suporavimo arba dirbtinio apvaisinimo diena, jei taikomas šis metodas.

9.3. Apvaisintos patelės suskirstomos „aklos atrankos“ metodu į kontrolinę ir bandomąją grupę. Narveliai išdėstomi taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks galimas poveikis dėl narvelio vietos. Kiekvienam gyvūnui turėtų būti priskirtas savitas identifikavimo numeris. Apvaisintos patelės nešališkai paskirstomos į kontrolinę ir bandymo grupes; jei patelės apvaisinamos grupėmis, kiekvienos grupės gyvūnai turi būti tolygiai paskirstomi į grupes. Patelės, apvaisintos to paties patino, panašiu būdu tolygiai paskirstomos tarp grupių.

III. DARBO EIGA

10. Gyvūnų skaičius ir lytis:

10.1. Kiekvienoje bandomojoje ir kontrolinėje grupėje turi būti pakankamas patelių skaičius, kad skrodžiant būtų maždaug 20 patelių su implantacijos vietomis.

10.2. Grupės, kuriose būtų mažiau kaip 16 patelių su implantacijos vietomis, gali netikti. Patelių žūties atvejai nebūtinai turi būti bandymo rezultatų negaliojimo priežastis, jei žuvusiųjų nėra daugiau kaip 10%.

11. Dozių ruošimas:

11.1. Jei dozių ruošimui lengvinti naudojamas nešiklis arba kitas priedas, reikėtų atsižvelgti į tokias jo charakteristikas: poveikį absorbcijai, pasiskirstymui, medžiagų apykaitai ir bandomosios medžiagos sulaikymui arba išskyrimui; poveikį bandomosios medžiagos cheminėms savybėms, dėl kurių gali pasikeisti jos toksiškumo charakteristikos; poveikį maisto ar vandens suvartojimui arba gyvūnų įmitimui.

11.2. Nešiklis neturi turėti toksiško poveikio vystymuisi ir reprodukcijai.

12. Dozavimas:

12.1. Paprastai bandomosios medžiagos reikėtų suleisti kasdien nuo implantacijos dienos (pvz., 5 paros po suporavimo) ir baigti dieną prieš numatytą cezario pjūvį. Jei išankstiniai tyrimai, kai jie buvo atlikti, nerodo, kad galimi ikiimplantaciniai nuostoliai, bandymą galima pratęsti ir įtraukti visą veisimo laikotarpį nuo suporavimo iki vienos paros prieš numatytą numarinimą. Gerai žinoma, kad netinkama priežiūra arba įtampa nėštumo metu gali būti prenatalinio vados netekimo priežastimi. Siekiant apsisaugoti nuo prenatalinio vados netekimo dėl veiksnių, nesusijusių su bandoma medžiaga, reikėtų be reikalo neiti prie patelių arba vengti išorinių veiksnių sukeliamos įtampos, pvz., triukšmo.

12.2. Turi būti naudojamos mažiausiai trijų dozių grupės ir lygiagrečiai viena kontrolinė grupė. Sveiki gyvūnai paskirstomi „aklos atrankos“ metodu į kontrolinę ir bandomų gyvūnų grupes. Dozės koncentracijos turėtų skirtis taip, kad būtų galima graduoti toksiškumo poveikį. Jei nėra apribojimų dėl fizikinių cheminių arba biologinių bandomosios medžiagos savybių, didžiausia dozė pasirenkama siekiant sukelti tam tikrą toksišką poveikį vystymuisi ir (arba) patelei (klinikiniai požymiai arba kūno masės mažėjimas), bet ne žūtį arba sunkias kančias. Mažiausiai viena tarpinė dozė turėtų sukelti mažiausią stebimą toksišką poveikį. Mažiausia dozė neturėtų sukelti jokio toksiško poveikio patelei arba vaisiaus vystymuisi. Turi būti pasirinkta mažėjanti dozės koncentracijos seka siekiant parodyti kiekvieną su dozės lygiu susietą reakciją ir nesukeliančio pastebimo neigiamo poveikio lygį (NOAEL). Mažėjančioms dozės koncentracijos vertėms nustatyti dažnai pakanka dvigubo arba keturgubo koncentracijos skirtumo; tačiau norint naudoti labai didelius intervalus tarp dozių (pvz., daugiklis didesnis kaip 10), dažnai gerai būtų pridėti ketvirtą bandymo grupę. Nors siekiama nustatyti NOAEL patelei, tyrimai, kuriais tokia koncentracija nenustatoma, gali būti taip pat priimtini (24).

12.3. Dozių koncentracijos pasirenkamos atsižvelgiant į visus turimus toksiškumo duomenis ir papildomą informaciją apie bandomosios medžiagos arba giminingų medžiagų apykaitą ir toksikokinetiką. Be to, ši informacija padės parodyti dozavimo režimo tinkamumą.

12.4. Lygiagrečiai naudojama kontrolinė grupė. Ši grupė turėtų būti medžiagos negaunanti kontrolinė grupė arba nešiklį gaunanti kontrolinė grupė, jei bandomajai medžiagai suleisti naudojamas nešiklis. Visoms grupėms turėtų būti suleidžiamas vienodas bandomosios medžiagos arba nešiklio tūris. Kontrolinės (-ių) grupės (-ių) gyvūnai prižiūrimi tokiu pat būdu, kaip ir bandymo grupės gyvūnai. Nešiklio kontrolinės grupės turėtų gauti nešiklio kiekį, atitinkantį didžiausią naudojamą kiekį (kokį gauna mažiausia doze veikiama grupė).

13. Ribinis bandymas:

13.1. Jei atliekant bandymą pagal šiame tyrime aprašytas metodikas per virškinimo traktą suleidus vienetinę mažiausiai 1000 mg/kg kūno masės per parą dozę, toksiškas poveikis veisiančiai patelei arba jos palikuonims nepastebimas ir jei tokio poveikio nelaukiama, atsižvelgiant į turimus duomenis (pvz., giminingos struktūros ir (arba) apykaitos junginių duomenis), nebūtina atlikti viso tyrimo naudojant tris dozių koncentracijas.

13.2. Atsižvelgiant į laukiamą poveikį žmonėms, ribiniam bandymui gali tekti naudoti didesnes dozių per virškinimo traktą koncentracijas. Kalbant apie kitus patekimo būdus, pvz., įkvėpimą arba poveikį per odą, bandomosios medžiagos fizikinės cheminės savybės dažnai gali apibrėžti ir riboti didžiausią pasiekiamą poveikio lygį (pvz., dėjimas ant odos neturi sukelti sunkaus vietinio toksiško poveikio).

14. Dozių suleidimas:

14.1. Bandomoji medžiaga arba nešiklis paprastai suleidžiama per virškinimo traktą zondu. Jei naudojamas kitas patekimo būdas, bandymų laboratorija turėtų pagrįsti sprendimą ir paaiškinti pasirinkimą, be to, padaryti atitinkamus būtinus pakeitimus (25)(26)(27). Bandomoji medžiaga turėtų būti suleidžiama kiekvieną dieną maždaug tuo pačiu metu.

14.2. Dozė kiekvienam gyvūnui paprastai turėtų būti nustatoma atsižvelgiant į patį paskutinį jo svėrimą. Tačiau reikia imtis atsargumo priemonių reguliuojant dozes paskutinius tris veisimo mėnesius. Dozė pasirenkama atsižvelgiant į turimus duomenis, kad būtų išvengta per didelio toksiško poveikio patelei. Tačiau jei pastebimas per didelis toksiškas poveikis patelėms, tie gyvūnai turi būti humaniškai numarinami. Jei per didelio toksiškumo požymiai pasireiškia kelioms veisiančioms patelėms, reikėtų spręsti dėl šios dozės grupės numarinimo.

14.3. Vienetinė bandomosios medžiagos dozė gyvūnams suleidžiama skrandžio zondu arba tinkamu intubaciniu vamzdeliu. Didžiausias gyvūnui suleidžiamas vienkartinis skysčio tūris priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Tūris neturi būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima suleisti po 2 ml/100 g kūno masės. Jei kaip nešiklis naudojamas kukurūzų aliejus, tūris neturėtų būti didesnis kaip 0,4 ml/100 g kūno masės. Bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas, keičiant koncentraciją taip, kad visų dozių tūris būtų pastovus.

15. Patelių stebėjimas:

15.1. Klinikinis tyrimas atliekamas ir užrašai vedami mažiausiai kartą per dieną, geriau kasdien tuo pačiu laiku, atsižvelgiant į didžiausio laukiamo poveikio pasireiškimo laiką po medžiagos suleidimo.

15.2. Aprašoma gyvūnų būklė, įskaitant žūties atvejus, liguistumą, atitinkamus elgesio pokyčius ir visus aiškaus toksiškumo požymius.

16. Kūno masė ir maisto suvartojimas:

16.1. Gyvūnai sveriami 0 veisimo dieną arba ne vėliau kaip 3 veisimo dieną, jei suporuoti gyvūnai tiekiami iš išorinio veislyno, pirmąją dozavimo dieną, mažiausiai kas 3 dieną dozavimo laikotarpiu ir numatyto numarinimo dieną.

16.2. Maisto suvartojimas turėtų būti registruojamas kas tris paras ir turi sutapti su kūno masės nustatymu.

17. Skrodimas:

17.1. Patelės numarinamos dieną prieš numatomą atsivedimą. Patelės, kurioms prieš numatomą numarinimą pasireiškia persileidimo arba priešlaikinio atsivedimo požymiai, turėtų būti numarinamos ir atliekamas bendrasis makroskopinis tyrimas.

17.2. Numarintai arba atliekant tyrimą žuvusiai patelei turėtų būti atliekamas makroskopinis tyrimas visoms struktūros anomalijoms arba patologiniams pakitimams nustatyti. Darant cezario pjūvį ir vėlesnį vaisiaus tyrimą, pateles geriau būtų vertinti nežinant bandymo grupės, kad būtų kiek įmanoma sumažinta sisteminė paklaida.

18. Gimdos turinio tyrimas:

18.1. Iš karto po numarinimo arba kiek įmanoma greičiau po patelės žūties gimda išimama gyvūno veisimo būsenai įvertinti. Gimdos, kuriose nėra veisimo požymių, turėtų būti papildomai tiriamos (pvz., graužikų atveju apdorojant amonio sulfidu arba Salewski metodu arba taikant kitą metodą triušiams) neveisimo būsenai patvirtinti (28).

18.2. Gimdos su vaisiumi, įskaitant kaklelį, pasveriamos. Gyvūnų, žuvusių atliekant tyrimą, gimdos su vaisiumi nesveriamos.

18.3. Turėtų būti nustatytas veisiančių patelių geltonkūnių (corpora lutea) skaičius.

18.4. Gimdos turinys tiriamas gemalo arba žuvusių ir gyvybingų vaisių skaičiui nustatyti. Turėtų būti apibudintas rezorbcijos laipsnis, siekiant nustatyti santykinį apvaisinto kiaušinėlio žūties laiką (žr. 4 skirsnį).

19. Vaisiaus tyrimas:

19.1. Nustatoma kiekvieno vaisiaus masė ir lytis. Tiriami kiekvieno vaisiaus išoriniai pakitimai (29).

19.2. Reikėtų ištirti vaisiaus griaučių ir minkštųjų audinių pakitimus (pvz., nukrypimus ir išsigimimus arba anomalijas) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36) (37) (38) (39) (40) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47). Pageidautina, bet nereikalaujama klasifikuoti vaisiaus pakitimus. Jei klasifikuojama, turi būti aiškiai nurodyti kriterijai kiekvienai kategorijai apibrėži. Ypatingą dėmesį reikėtų atkreipti į lytinio dauginimosi trakto pakitimų požymius.

19.3. Kiekvienos graužikų vados pusė paruošiama griaučių pakitimams tirti. Likusi dalis paruošiama minkštų audinių pakitimų tyrimui ir jie tiriami taikant priimtus arba tinkamus serijinių pjūvių metodus arba kruopštaus bendrojo skrodimo metodus.

19.4. Jei naudojami ne graužikai, pvz., triušiai, tiriami visi vaisiai minkštų audinių ir griaučių pakitimams nustatyti. Vaisių kūnai įvertinami kruopščiai skrodžiant minkštų audinių pakitimams nustatyti, be to, gali būti įtrauktos metodikos papildomai įvertinti širdies vidinę struktūrą (48). Nupjaunama pusė tokiu būdu ištirtų vaisių galvų, kurios apdorojamos minkštųjų audinių pakitimams įvertinti (įskaitant akis, smegenis, nosies landas ir liežuvį), taikant standartinius serijinių pjūvių metodus (49) arba tokio paties jautrumo metodą. Šių vaisių kūnai ir likę sveiki vaisiai apdorojami ir tiriami jų griaučių pakitimai, taikant tuos pačius metodus, kurie aprašyti graužikams.

IV. DUOMENYS

20. Rezultatų apdorojimas:

20.1. Kiekvienos patelės bei jų palikuonių duomenys pateikiami suvedant į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei ir kiekvienai kartai nurodomas gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, atliekant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, visų gyvūnų žūties arba numarinimo laikas, veisiančių patelių skaičius, toksiško poveikio požymių turinčių gyvūnų skaičius, pastebėtų toksiškumo požymių aprašymas, įskaitant pradžios laiką, trukmę ir bet kokio toksiško poveikio sunkumą, taikyti gemalo ar vaisiaus stebėjimų būdai ir atitinkami vados duomenys.

20.2. Skaitmeniniai rezultatai turi būti įvertinti taikant atitinkamą statistinį metodą, naudojant vadą kaip duomenų analizės statistinį vienetą. Turi būti taikomas visuotinai priimtas statistinis metodas; statistiniai metodai pasirenkami kaip tyrimo schemos dalis ir turi būti pagrįsti. Turėtų būti pateikti duomenys apie gyvūnus, kurie neišgyveno iki numatyto numarinimo laiko. Prireikus šie duomenys gali būti naudojami grupių vidutinėms vertėms apskaičiuoti. Tokiems gyvūnams gautų duomenų tinkamumas ir jų įtraukimas arba neįtraukimas į kurios nors grupės vidurkį (-ius) turi būti pagrįstas kiekvienu atskiru atveju.

21. Rezultatų įvertinimas:

21.1. Toksiškumo prenataliniam vystymuisi tyrimas įvertinamas atsižvelgiant į stebimą poveikį. Įvertinimą turi sudaryti ši informacija:

21.1.1. patelės ir gemalo ar vaisiaus bandymo rezultatai, įskaitant ryšį tarp gyvūno veikimo bandomąja medžiaga ir bet kokio stebimo poveikio dažnumo ir sunkumo, arba tokio ryšio nebuvimą;

21.1.2. kriterijai, taikyti vaisiaus išorės, minkštųjų audinių ir griaučių pakitimams klasifikuoti, jei buvo klasifikuojama;

21.1.3. prireikus, ankstesni duomenys apie kontrolinius gyvūnus tyrimo rezultatų interpretavimui pagerinti;

21.1.4. skaičiai, naudoti visoms procentinėms dalims arba rodikliams apskaičiuoti;

21.1.5. atitinkama tyrimo rezultatų statistinė analizė, jei reikia, kurioje pakaktų informacijos apie analizės metodą, kad nepriklausomas ekspertas ar statistikos specialistas galėtų iš naujo įvertinti bei atkurti analizės eigą.

21.2. Visuose tyrimuose, kuriuos atliekant negauta jokio toksiško poveikio, turėtų būti numatyti papildomi tyrimai bandomosios medžiagos absorbcijai ir biologiniam kaupimuisi nustatyti.

22. Rezultatų interpretavimas:

22.1. Toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi tyrimas suteiks informacijos apie poveikį patelėms veisimo metu ir jų palikuonių vystymuisi gimdoje dėl kartotinio poveikio medžiaga. Tyrimo rezultatus reikėtų interpretuoti atsižvelgiant į rezultatus, gautus atliekant pusiau lėtinio toksiškumo, toksiško poveikio reprodukcijai ir toksikokinetinius tyrimus.

22.2. Kadangi iš esmės tiriamas bendrasis toksiškumas, kaip toksiškas poveikis patelėms, ir toksiškas poveikis vystymuisi, jo rezultatai leis tam tikru laipsniu atskirti poveikį vystymuisi, nesant bendrojo toksiškumo, ir poveikį, kuris sukeliamas esant koncentracijai, kuri sukelia toksišką poveikį patelei (50).

V. ATASKAITOS RENGIMAS

23. Bandymo ataskaitą turi sudaryti ši konkreti informacija:

23.1. Bandomoji medžiaga:

23.1.1. fizikinė būsena ir, jei reikia, fizikinės cheminės savybės;

23.1.2. identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį, jei žinomas ar priskirtas;

23.1.3. grynumas.

23.2. Nešiklis (jei naudojamas), nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.

23.3. Bandymo gyvūnai:

23.3.1. naudota rūšis ir veislė;

23.3.2. gyvūnų skaičius ir amžius;

23.3.3. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir t.t.;

23.3.4. kiekvieno gyvūno kūno masė bandymo pradžioje.

23.4. Bandymo sąlygos:

23.4.1. dozės koncentracijos pasirinkimo pagrindimas;

23.4.2. detalės apie bandomosios medžiagos preparato ruošimą arba jos dėjimą į pašarą, gauta koncentracija, preparato stabilumas ir vienalytiškumas;

23.4.3. bandomosios medžiagos suleidimo detalės;

23.4.4. bandomosios medžiagos koncentracijos pašare ar geriamajame vandenyje (ppm) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/ kg kūno masės per parą), jei tinka;

23.4.5. aplinkos sąlygos;

23.4.6. pašaro ir vandens kokybės detalės.

23.5. Rezultatai:

23.5.1. Toksiško poveikio patelei duomenys atsižvelgiant į dozę. Neapsiriboti šiais rezultatais:

23.5.1.1. gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, išgyvenusių gyvūnų skaičius, veisiančių patelių skaičius, persileidimų ir priešlaikinių atsivedimų skaičius;

23.5.1.2. žūties atliekant tyrimą diena arba iki numarinimo išgyvenusių gyvūnų skaičius;

23.5.1.3. duomenys apie gyvūnus, neišgyvenusius iki numatyto numarinimo, pranešami, bet neįtraukiami į statistinį grupių palyginimą;

23.5.1.4. visų anomalių klinikinių požymių pastebėjimo diena ir jų vėlesnė eiga;

23.5.1.5. kūno masė, kūno masės kitimas ir gimdos su vaisiumi masė, įskaitant, neprivalomai, kūno masės kitimą su pataisa gimdos su vaisiumi masei;

23.5.1.6. pašaro suvartojimas ir, jei matuojamas, vandens suvartojimas;

23.5.1.7. skrodimo rezultatai, įskaitant gimdos masę;

23.5.1.8. patelei ir vystymuisi gautos NOAEL vertės.

23.5.2. Toksiško poveikio vystymuisi duomenys pagal dozę vadoms su implantais, įskaitant:

23.5.2.1. geltonkūnių skaičių;

23.5.2.2. implantacijų skaičių, gyvų ir žuvusių vaisių bei rezorbcijų skaičių ir procentinę dalį;

23.5.2.3. priešimplantacinių ir poimplantacinių nuostolių skaičių ir procentinę dalį.

23.5.3. Toksiško poveikio vystymuisi duomenys pagal dozę vadoms su gyvais vaisiais, įskaitant:

23.5.3.1. gyvų palikuonių skaičių ir procentinę dalį;

23.5.3.2. lyčių santykį;

23.5.3.3. vaisiaus kūno masę, pageidautina pagal lytį ir abiejų lyčių kartu;

23.5.3.4. išorinius, minkštųjų audinių ir griaučių išsigimimus ir kitus svarbius pakitimus;

23.5.3.5. klasifikavimo kriterijus, jei tinka;

23.5.3.6. vaisių ir vadų, turinčių kokių nors išorinių, minkštųjų audinių arba griaučių pakitimų, visą skaičių ir procentinę dalį, be to, kiekvienos anomalijos ir kitų atitinkamų pakitimų tipus ir dažnumą.

23.6. Rezultatų aptarimas.

23.7. Išvados.

VI. NUORODOS

24. Kavlock R. J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; 399-410.

25. Kimmel, C. A. and Francis, E. Z. (1990) Proceedings of the Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamentai and Applied Toxicology 14; 386-398.

26. Wong, B. A, et al. (1997) Developing Specialized Inhalation Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CIIT Activities 17; 1-8.

27. US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study.

28. Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte. Naunyn-Schmeidebergs Archivfur Pharmakologie und Experimentelle Pathologie 247: 367.

29. Edwards, J. A (1968) The external Development of the Rabbit and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D. H. M. Woolam (ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.

30. Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. Congenital Anomalies 16; 171-173.

31. Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial Skeletai Variations Detected by the Double Staining Techniquefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenital Anomalies 32; 381-391.

32. Kimmel, C. A. et al. (1993) Skeletai Development Following Heat Exposure in the Rat. Teratology 47: 229-242.

33. Marr, M. C. et al. (1988) Comparison of Single and Double Staining for Evaluation of Skeletai Development: The Effects of Etilene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476.

34. Barrow, M. V. and Tailor, W. J. (1969) A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morphology 127: 291-306.

35. Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of Foetal Maturity. Teratology 11; 313- 320.

36. Gibson, J. P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity Studies. Toxicology and Applied Pharmacology 9;: 398-408.

37. Kimmel, C. A. and Wilson, J. G. (1973) Skeletai Deviation in Rats: Malformations or Variations? Teratology 8; 309-316.

38. Marr, M. C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD (Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to Etilene Glycol. Teratology 46; 169-181.

39. Monie, I. W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, pp. 163-173.

40. Spark, C. and Dawson, AB. (1928) The Order and Time of appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible Influence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy 41; 411-445.

41. Staples, R. E. and Seimeli, V. L. (1964) Refinements in Rapid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone. Stain Technology 39; 61-63.

42. Strong, R. M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton. American Journal of Anatomy 36; 313-355.

43. Stuckhardt, J. L. and Poppe, S. M. (1984) Fresh Visceral Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 4; 181-188.

44. Walker, D. G. and Wirtschafter, Z. T (1957) The Genesis of the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL.

45. Wilson, J. G. (1965) Embryological Considerations in Teratology. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J. G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, p. 251-277.

46. Wilson, J. G. and Fraser, F. C. (eds). (1977) Handbook of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY.

47. Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techniąues in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28; 233-239.

48. Staples, R. E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mammalian Foetuses. Teratology 9; 37-38.

49. Van Julsingha, E. B. and C. G. Bennett (1977) A Dissecting Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, H. J. and Kwasigroch, TE. (eds.). University of Chicago, Chicago, IL, p. 126-144.

50. US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for Developmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register 56; 63798-63826.

51. Wise, D. L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Teratology 55; 249-292.

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos

ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11

TOKSIŠKO POVEIKIO DVIEJŲ KARTŲ REPRODUKCIJAI TYRIMO (B. 35) METODO APRAŠAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Šis metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 416 metodą (2001 m.).

2. Šis dviejų kartų reprodukcijos bandymo metodas skirtas suteikti bendros informacijos apie bandomosios medžiagos poveikį patinų ir patelių reprodukcijos sistemų vientisumui ir veiksmingumui, įskaitant lytinių liaukų funkciją, rujos ciklą, poravimosi elgesį, apvaisinimą, veisimą, atsivedimą, laktaciją, atjunkymą ir palikuonių augimą bei vystymąsi. Be to, tyrimas gali suteikti informacijos apie bandomosios medžiagos poveikį naujagimių liguistumui, gaištamumui, pirminių duomenų apie toksišką poveikį prenataliniam ir postnataliniam vystymuisi ir parengti vėliau atliekamų bandymų gaires. Taikant šį metodą tiriamas ne tik F1 kartos augimas ir vystymasis, jis taip pat skirtas patinų ir patelių reprodukcijos sistemų vientisumui bei veiksmingumui ir F2 kartos augimui bei vystymuisi įvertinti. Norint gauti papildomos informacijos apie toksišką poveikį vystymuisi ir funkcinius trūkumus, šį protokolą galima papildyti tyrimais, aprašytais atitinkamuose toksiško poveikio vystymuisi ir (arba) neurotoksiško poveikio vystymuisi metoduose, arba šie parametrai galėtų būti tiriami atliekant atskirus tyrimus, kuriuose būtų taikomi atitinkami bandymų metodai.

3. Bandymų metodo esmė:

3.1. Kelioms patinų ir patelių grupėms suleidžiamos skirtingos bandomosios medžiagos dozės. P kartos patinai turėtų gauti dozę augdami ir mažiausiai vieną visą spermatogenezės ciklą (maždaug 56 paras pelėms ir 70 parų žiurkėms), kad būtų galima gauti informacijos apie neigiamą poveikį spermatogenezei. Poveikis spermai yra nustatomas pagal kelis spermos parametrus (pvz., spermos morfologiją ir spermatozoidų judrumą), audinių preparatuose ir atliekant detalų histopatologinį tyrimą. Jei duomenys apie spermatogenezę yra gauti ankstesniame pakankamos trukmės kartotinos dozės tyrime, pvz., 90 parų tyrime, P kartos patinus nebūtina įtraukti į įvertinimą. Tačiau rekomenduojama išsaugoti P kartos spermos ėminius arba skaitmeninius užrašus, kad juos vėliau galima būtų įvertinti. P kartos patelės turi gauti dozę augdamos ir kelis visus rujos ciklus, kad būtų galima nustatyti bet kokį neigiamą bandomosios medžiagos poveikį normaliam rujos ciklui. Bandomoji medžiaga suleidžiama tėvų kartos (P) gyvūnams poruojantis, veisimo metu ir iki jų F1 palikuonių atjunkymo. Po atjunkymo medžiaga toliau suleidžiama F1 palikuonims iki jų subrendimo, poravimosi ir, atsiradus F2 kartai, iki šios kartos palikuonių atjunkymo.

3.2. Visiems gyvūnams atliekami klinikiniai stebėjimai ir patologiniai tyrimai toksiškumo požymiams nustatyti, kreipiant ypač didelį dėmesį į poveikį patinų ir patelių reprodukcijos sistemų vientisumui ir veiksmingumui bei palikuonių augimui ir vystymuisi.

II. BANDYMO METODO APRAŠYMAS

4. Gyvūnų rūšies pasirinkimas:

4.1. Tinkamiausia bandymo gyvūnų rūšis yra žiurkės. Jei naudojama kita rūšis, pasirinkimas turi būti pagrįstas ir atliekami atitinkami reikalingi pakeitimai.

4.2. Neturi būti naudojamos mažo vaisingumo veislės arba veislės, kurioms dažnai pasireiškia vystymosi trūkumai. Tyrimo pradžioje naudojamų gyvūnų masės skirtumas turi būti kiek įmanoma mažesnis ir kiekvienai lyčiai neturi būti didesnis kaip 20% vidutinės masės.

5. Laikymo ir šėrimo sąlygos:

5.1. Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22°C (± 3 °C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė tinkamai įmaišyti bandomąją medžiagą, jai patenkant šiuo būdu.

5.2. Gyvūnai gali būti laikomi narveliuose atskirai arba mažomis tos pačios lyties grupėmis. Poruojama turi būti šiam tikslui pritaikytuose narveliuose. Pasitvirtinus susiporavimui, suporuotos patelės turi būti laikomos po vieną atsivedimo arba veisimo narveliuose. Suporuotos žiurkės gali būti laikomos mažomis grupėmis ir atskiriamos likus vienai arba dviem paroms iki atsivedimo. Artėjant atsivedimui, suporuotos patelės turi būti aprūpinamos atitinkamais ir nustatytais pakratais.

6. Gyvūnų ruošimas:

6.1. Naudojami jauni ir sveiki, ankstesniuose bandymuose nedalyvavę gyvūnai, kurie mažiausiai 5 paras yra pratinami prie laboratorijos sąlygų. Apibūdinama bandymo gyvūno rūšis, veislė, jų tiekėjas, lytis, kūno masė ir (arba) amžius. Turi būti žinoma visų gyvūnų tarpusavio giminystė, kad būtų išvengta vienų tėvų gyvūnų poravimosi. Gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į kontrolinę ir bandymo grupę (rekomenduojama grupuoti taikant sluoksniavimą pagal kūno masę). Narveliai išdėstomi taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks galimas poveikis dėl narvelio vietos. Kiekvienas gyvūnas turi turėti savo identifikavimo numerį. P kartos gyvūnams numeris suteikiamas prieš suleidžiant bandomąją medžiagą. F1 kartos poravimui pasirinktiems gyvūnams numeris suteikiamas po jų atjunkymo. Duomenys apie visų pasirinktų F1 gyvūnų kilmės vadą turi būti registruojami. Be to, rekomenduojama kiek įmanoma anksčiau identifikuoti kiekvieną žiurkiuką, kai numatoma atskirai juos sverti arba atlikti kokius nors funkcinius bandymus.

6.2. Pradėjus leist dozes tėvų kartos (P) gyvūnams jie turi būti maždaug 5–9 savaičių. Visų bandomųjų grupių gyvūnai turi būti kiek įmanoma vienodos masės ir amžiaus.

III. DARBO EIGA

7. Gyvūnų skaičius ir lytis:

7.1. Kiekvienoje bandymo ir kontrolinėje grupėje turi būti pakankamas patelių skaičius, kad atsivedimo momentu arba jam artėjant būtų ne mažiau kaip 20 veisiančių patelių. Tai gali būti neįmanoma bandant medžiagas, sukeliančias nepageidaujamą su bandoma medžiaga siejamą poveikį (pvz., nevaisingumą, per didelį toksiškumą esant didelei dozei).

7.2. Tikslas – gauti pakankamą atsivedančių patelių skaičių, kad būtų galima reikšmingai įvertinti, kokia yra bandomosios medžiagos geba paveikti vaisingumą, veisimą, motinos elgesį, žindymą, F1 palikuonio augimą ir vystymąsi nuo apvaisinimo iki subrendimo ir jo palikuonių (F2) vystymąsi iki atjunkymo. Todėl nepavykus gauti norimą veisiančių patelių skaičių (t.y. 20), tyrimas nebūtinai bus netinkamas ir turi būti vertinamas atsižvelgiant į kiekvieną individualų atvejį.

8. Dozių ruošimas:

8.1. Rekomenduojama bandomąją medžiagą duoti šeriant, girdant arba suleidžiant zondu, išskyrus kai manoma, kad tinkamesnis būtų kitas patekimo būdas (pvz., per odą arba įkvepiant).

8.2. Prireikus bandomoji medžiaga ištirpinama arba suspenduojama tinkamame nešiklyje. Rekomenduojama visais įmanomais atvejais iš pradžių tirti galimybę naudoti vandeninį tirpalą ar suspensiją, vėliau tirpalą ar emulsiją aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet galimybę tirpinti kitame nešiklyje. Turi būti žinomos nešiklio, išskyrus vandenį, toksiškumo savybės. Turėtų būti nustatytas bandomosios medžiagos stabilumas nešiklyje.

9. Dozavimas:

9.1. Turi būti naudojamos mažiausiai trijų dozių grupės ir lygiagrečiai viena kontrolinė grupė. Jei nėra apribojimų dėl fizikinių cheminių arba biologinių bandomosios medžiagos savybių, didžiausia dozė pasirenkama siekiant sukelti tam tikrą toksišką poveikį, bet ne žūtį arba sunkias kančias. Nelaukto žūstamumo atveju, tyrimai, kuriuose tėvų kartos (P) gyvūnų žūstamumas yra maždaug kaip 10% mažesnis, paprastai yra dar priimtini. Turi būti pasirinkta mažėjanti dozės koncentracijos seka, siekiant parodyti kiekvieną su doze susietą reakciją ir nesukeliančio pastebimo neigiamo poveikio lygį (NOAEL – no observed adverse effect level). Mažėjančioms dozės koncentracijos vertėms nustatyti dažnai pakanka dvigubo arba keturgubo koncentracijos skirtumo ir dažnai geriau būtų papildomai naudoti ketvirtą bandymo grupę, užuot naudojus labai didelius intervalus tarp dozių (pvz., daugiklis didesnis kaip 10). Atliekant su pašaru duodamos medžiagos tyrimus, dozės neturėtų skirtis daugiau kaip 3 kartus. Dozė turėtų būti pasirenkama atsižvelgiant į visus turimus toksiškumo duomenis, ypač kartotinų dozių tyrimo rezultatus. Be to, reikėtų nagrinėti visą papildomą informaciją apie bandomojo junginio arba giminingų medžiagų apykaitą ir kinetiką. Kartu ši informacija padėtų parodyti dozavimo režimo tinkamumą.

9.2. Kontrolinė grupė turėtų būti medžiagos negaunanti grupė arba nešiklį gaunanti kontrolinė grupė, jei bandomajai medžiagai suleisti naudojamas nešiklis. Išskyrus tai, kad kontrolinės grupės gyvūnai nepaveikiami bandomąja medžiaga, jie prižiūrimi tokiu pat būdu, kaip ir bandymo grupės gyvūnai. Jei naudojamas nešiklis, kontrolinės grupės turėtų gauti nešiklio kiekį, atitinkanti didžiausią naudojamą tūrį. Jei bandomoji medžiaga duodama šeriant ir dėl to sumažėja pašaro suvartojimas arba įsisavinimas, gali tekti naudoti lygiagrečiai šeriamą kontrolinę grupę. Vietoj lygiagrečiai šeriamos kontrolinės grupės galima naudoti duomenis, gautus kontroliuojamuose tyrimuose, skirtuose įvertinti sumažėjusio pašaro suvartojimo įtaką reprodukcijos parametrams.

9.3. Reikėtų atsižvelgti į šias nešiklio ir kitų priedų savybes: poveikį absorbcijai, pasiskirstymui, medžiagų apykaitai ir bandomosios medžiagos sulaikymui; poveikį bandomosios medžiagos cheminėms savybėms, dėl kurių gali pasikeisti jos toksiškumo savybės; poveikį maisto ar vandens suvartojimui arba gyvūnų įmitimui.

10. Ribinis bandymas:

10.1. Jei atliekant bandymą pagal šiame tyrime aprašytas metodikas per virškinimo traktą suleista vienetinė mažiausiai 1000 mg/kg kūno masės per parą dozė arba atitinkamos procentinės dalies dozė duodama šeriant arba girdant nesukelia pastebimo neigiamo toksiško poveikio tėvų grupių gyvūnams arba jų palikuonims ir jei tokio poveikio nelaukiama, atsižvelgiant į turimus duomenis apie giminingos struktūros ir (arba) apykaitos junginius, nebūtina atlikti visą tyrimą, naudojant kelias dozių koncentracijas.

10.2. Kai poveikis žmonėms rodo, kad reikia per virškinimo traktą suleisti didesnes dozes, ribinis bandymas neatliekamas. Kalbant apie kitus patekimo būdus, pvz., įkvėpimą arba poveikį per odą, bandomosios medžiagos fizikinės cheminės savybės dažnai gali apibrėžti ir riboti didžiausią pasiekiamą poveikio lygį.

11. Dozių suleidimas:

11.1. Gyvūnai gauna bandomosios medžiagos dozę septynias dienas per savaitę. Geriau suleisti zondu arba duoti šeriant ar girdant. Jei medžiaga patenka kitu būdu, jis turi būti pagrįstas, be to, gali tekti atlikti atitinkamus pakeitimus. Atitinkamu bandymo laikotarpiu medžiagos dozės patekimo būdas turi būti tas pats. Kai bandomoji medžiaga suleidžiama zondu, reikia naudoti skrandžio vamzdelį. Vienu metu suleidžiamo skysčio tūris neturi būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės (0,4 ml/100 g kūno masės yra didžiausias kiekis naudojant kukurūzų aliejų), išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima suleisti po 2 ml/100 g kūno masės. Išskyrus dirginančias arba ardančias medžiagas, kurios esant didesnei koncentracijai turi sunkesnį poveikį, bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas, keičiant koncentraciją taip, kad visų dozių tūris būtų pastovus. Atliekant tyrimus su zondu, žiurkiukai dažniausiai gauna bandomosios medžiagos netiesiogiai su pienu tol, kol atjunkyti patys pradeda gauti dozes. Jei tyrimai atliekami medžiagą dedant į pašarą arba geriamąjį vandenį, žiurkiukai papildomai gauna bandomosios medžiagos tiesiogiai, kai paskutinę laktacijos laikotarpio savaitę jie pradeda ėsti patys.

11.2. Jei medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, svarbu užtikrinti, kad naudojami bandomosios medžiagos kiekiai netrukdytų įprastam maitinimuisi arba vandens pusiausvyrai. Kai bandomoji medžiaga duodama šeriant, galima naudoti pastovią koncentraciją (ppm) arba pastovią dozę pagal gyvūno kūno masę; naudotas variantas turi būti nurodytas. Jei medžiaga suleidžiama zondu, dozė turėtų būti suleidžiama kiekvieną dieną panašiu laiku ir reguliuojama mažiausiai kartą per savaitę pastoviam dozės ir gyvūno kūno masės santykiui užtikrinti. Reikėtų atsižvelgti į informaciją dėl placentinio pasiskirstymo, reguliuojant zondu suleidžiamą dozę, nustatomą pagal gyvūno masę.

12. Bandymo programos:

12.1. Kasdieninės dozės tėvų kartos (P) patinams ir patelėms pradedamos leisti, kai jie sulaukia 5–9 savaičių. Kasdieninės F1 patinų ir patelių dozės pradedamos leisti po atjunkymo; reikėtų turėti omenyje, kad tais atvejais, kai bandomoji medžiaga patenka su pašaru arba geriamuoju vandeniu, tiesioginis F1 kartos žiurkiukų poveikis bandomąja medžiaga gali vykti laktacijos laikotarpiu. Abiem lytims (P ir F1) dozės turi būti toliau leidžiamos mažiausiai 10 savaičių prieš poravimo laikotarpį. Dozės toliau leidžiamos abiem lytims 2 savaites poravimosi laikotarpiu. Kai patinai nebereikalingi įvertinant poveikį reprodukcijai, jie turi būti humaniškai numarinami ir ištiriami. Tėvų kartos (P) patelėms dozės leidžiamos toliau visą veisimo laiką ir iki F1 palikuonių atjunkymo. Reikėtų atsižvelgti į dozavimo programos pakeitimus, pagrįstus turima informacija apie bandomąją medžiagą, įskaitant turimus toksiškumo, medžiagų apykaitos indukcijos arba biologinio kaupimosi duomenis. Kiekvieno gyvūno dozė paprastai turėtų būti pagrįsta pačiu paskutiniu kiekvieno gyvūno kūno masės nustatymu. Tačiau reikia imtis atsargumo priemonių reguliuojant dozes paskutinius tris veisimo mėnesius.

12.2. P ir F1 kartų patinų ir patelių veikimas tęsiamas iki jų numarinimo. Visi P ir F1 suaugę patinai ir patelės turi būti humaniškai numarinami, kai jų nebereikia norint įvertinti poveikį reprodukcijai. Visi poravimui nepasirinkti F1 palikuonys ir visi F2 palikuonys po atjunkymo turi būti humaniškai numarinami.

13. Poravimo eiga:

13.1. Tėvų kartos (P) poravimas:

13.1.1. Kiekvienam suporavimui patelė atskirai uždaroma į narvelį su vienu tą pačią dozę gaunančiu patinu (1:1 poravimas) tol, kol jie susiporuoja, arba 2 savaitėms. Kiekvieną dieną patelės tiriamos dėl spermos arba makšties kamščių atsiradimo. 0 veisimo diena apibrėžiama kaip diena, kai randama spermos arba makšties kamštis.

13.1.2. Jei poravimas nesėkmingas, galima būtų spręsti dėl pakartotino patelių poravimo su patikrintais tos pačios grupės patinais. Pateikiant duomenis poruojamos poros turi būti aiškiai identifikuotos. Reikėtų vengti vienų tėvų palikuonių poravimo.

13.2. F1 kartos poravimas:

13.2.1. Norint poruoti F1 kartos palikuonis F2 kartai gauti, atjunkimo metu iš kiekvienos vados pasirenkamas mažiausiai vienas patinas ir viena patelė poravimui su kitais tą pačią dozę gavusiais kitos vados žiurkiukais. Kiekvienos vados žiurkiukai pasirenkami „aklos atrankos“ metodu, jei vienoje vadoje nėra reikšmingų kūno masės arba išvaizdos skirtumų. Tais atvejais, kai skirtumų yra, pasirenkami geriausi kiekvienos vados atstovai. Praktiškai tai geriausiai būtų daryti pagal kūno masę, bet gali labiau tikti atranka pagal išvaizdą. F1 palikuonys poruojami tik pasiekę lytinę brandą.

13.2.2. Turėtų būti įvertintos poros be palikuonių, siekiant nustatyti aiškią nevaisingumo priežastį. Šiam tikslui galbūt reikėtų taikyti metodikas, numatančias papildomo poravimo galimybes su kitais patikrintais patinais arba patelėmis, dauginimosi organų mikroskopinį tyrimą ir rujos ciklų arba spermatogenezės tyrimą.

13.3. Antrasis poravimas:

13.3.1. Tam tikrais atvejais, pvz., kai dėl poveikio pakinta vados dydis arba pastebimas neaiškus poveikis per pirmąjį poravimą, rekomenduojama P arba F1 kartų suaugusius gyvūnus dar kartą poruoti naujai vadai gauti.

13.3.2. Rekomenduojama dar kartą poruoti palikuonių neturėjusias pateles arba patinus su patikrintais priešingos lyties gyvūnais, skirtais veisimui. Jei laikoma, kad yra būtina bet kurios kartos antroji vada, gyvūnai turėtų būti poruojami praėjus savaitei nuo paskutinės vados atjunkymo.

13.4. Vados dydis:

13.4.1. Gyvūnams leidžiama normaliai atsivesti vadą ir auginti palikuonis iki atjunkymo.

13.4.2. Standartizuoti vados dydį neprivaloma. Standartizavus vados dydį, detaliai aprašomas taikytas metodas.

IV. STEBĖJIMAI

14. Klinikiniai stebėjimai:

14.1. Bendrasis klinikinis stebėjimas atliekamas kasdieną, o nustatant suleidimo zondu laiką, reikėtų atsižvelgti į didžiausio laukiamo poveikio po medžiagos suleidimo laiką. Turi būti aprašomi visi elgesio pokyčiai, sunkaus arba ilgesnio atsivedimo požymiai ir visi toksiškumo požymiai.

14.2. Mažiausiai kas savaitę turėtų būti atliekamas papildomas detalesnis kiekvieno gyvūno tyrimas, kurį patogu atlikti gyvūną sveriant. Du kartus per dieną ir prireikus kartą per dieną savaitgaliais visi gyvūnai turi būti stebimi liguistumo požymiams ir mirtingumui nustatyti.

15. Tėvų kartos gyvūnų kūno masė ir pašaro ar vandens suvartojimas:

15.1. Tėvų kartų (P ir F1) gyvūnai sveriami pirmąją dozės suleidimo dieną ir vėliau mažiausiai kartą per savaitę. Tėvų kartos (P ir F1) patelės sveriamos ne mažiau kaip 0, 7, 14, ir 20 arba 21 veisimo dieną, laktacijos metu sveriamos tomis pačiomis dienomis, kaip ir vada, ir gyvūnų numarinimo dieną. Šie rezultatai turi būti pateikiami ataskaitoje atskirai apie kiekvieną suaugusį gyvūną.

15.2. Poravimo ir veisimo laikotarpiu pašaro suvartojimas turi būti matuojamas mažiausiai kas savaitę. Vandens suvartojimas matuojamas mažiausiai kas savaitę, jei bandomoji medžiaga patenka su vandeniu.

16. Rujos ciklas:

16.1. P ir F1 kartų patelių rujos ciklo trukmė ir normalumas įvertinamas prieš suporavimą ir, nebūtinai, poravimo metu darant makšties tepinėlius tol, kol bus gautas suporavimo įrodymas.

16.2. Makšties ar gimdos kaklelio ląstelės turi būti imamos atsargiai, kad nebūtų pažeista gleivinė ir tokiu būdu nebūtų sukeltas netikras veisimas (27).

17. Spermos parametrai:

17.1. Užrašoma visų numarintų P ir F1 patinų sėklidžių ir antsėklidžių masė ir vienas kiekvieno organo pavyzdys paliekamas histopatologiniam tyrimui (žr. 20, 21, 22 skirsnius). Iš kiekvienos P ir F1 patinų grupės bent 10 gyvūnų pogrupio sėklidės ir antsėklidžiai naudojami homogenizavimui atsparioms spermatidėms ir antsėklidžių uodegoje sukauptiems spermatozoidams suskaičiuoti. Turi būti surinkta to paties pogrupio patinų sperma iš antsėklidžių uodegos arba iš sėklinio latako spermos judrumui ir morfologijai įvertinti. Jei pastebimas su bandoma medžiaga susijęs poveikis arba jei yra kituose tyrimuose gautų duomenų apie galimą poveikį spermatogenezei, turėtų būti tiriama visų kiekvienos dozės grupės patinų sperma; priešingu atveju galima apsiriboti kontrolinės grupės ir didžiausios dozės grupės P ir F1 patinų spermatozoidų skaičiavimu.

17.2. Skaičiuojamas bendras homogenizavimui atsparių sėklidžių spermatidžių ir antsėklidžių uodegos spermatozoidų skaičius (28)(29). Spermos atsargas uodegoje galima apskaičiuoti pagal suspensijos, naudojamos kokybiniam įvertinimui, spermatozoidų koncentraciją ir tūrį, ir spermatozoidų, išgautų vėliau sumalant ir (arba) homogenizuojant likusį uodegos audinį, skaičių. Visų dozių patinų grupių pasirinktų pogrupių gyvūnų spermatozoidai skaičiuojami iškart po gyvūnų numarinimo, išskyrus kai filmuojama analoginiu arba skaitmeniniu būdu arba kai bandiniai yra užšaldomi ir analizuojami vėliau. Šiais atvejais kontrolinės ir didelės dozės grupės gali būti analizuojamos pirmos. Jei su bandomąja medžiaga susijusio poveikio (pvz., poveikio spermatozoidų skaičiui, judrumui arba morfologijai) nėra, kitų grupių analizuoti nebūtina. Jei didelę dozę gavusioje grupėje pastebimas su bandomąja medžiaga susijęs poveikis, reikia įvertinti ir mažesnių dozių grupes.

17.3. Antsėklidžio (arba sėklinio latako) spermatozoidų judrumas įvertinimas arba filmuojamas iš karto po numarinimo. Sperma turi būti išgauta, kiek įmanoma mažinant galimybę jai pakenkti ir skiedžiama judrumui analizuoti, taikant tinkamus metodus (30). Subjektyviai arba objektyviai įvertinama vis labiau judresnių spermatozoidų procentinė dalis. Kai daroma kompiuterinė judėjimo analizė (31)(32)(33)(34)(35)(36), didėjantis judrumas nustatomas pagal vartotojo nustatytas ribines vertes vidutiniam greičiui išilgai trajektorijos ir tiesiškumui arba tiesiškumo indeksui. Jei ėminiai filmuojami (37) arba skrodimas įrašinėjamas kitu būdu, vėliau galima analizuoti tik kontrolinę ir didelę dozę gavusių P ir F1 patinų grupes, išskyrus kai pastebimas su bandomąja medžiaga susijęs poveikis; šiuo atveju dar reikia įvertinti mažesnių dozių grupes. Neturint analoginio arba skaitmeninio vaizdo įrašo, visi visų bandomųjų grupių ėminiai analizuojami atliekant skrodimą.

17.4. Daromas antsėklidžio (arba sėklinio latako) spermos ėminio morfologinis įvertinimas. Spermatozoidai (bent 200 vienam ėminiui) ištiriami kaip fiksuoti preparatai bei skystoje terpėje (38) ir klasifikuojami kaip normalūs arba nenormalūs. Morfologinės spermatozoidų anomalijos būtų spermatozoidų sulipimas, izoliuotos galvutės ir deformuotos galvutės ir (arba) uodegėlės. Įvertinami visų dozių grupių pasirinktų pogrupių patinai iš karto po gyvūnų numarinimo arba vėliau pagal analoginius arba skaitmeninius vaizdo įrašus.

17.5. Fiksuotus tepimus galima analizuoti ir vėliau. Šiais atvejais kontrolinių ir didžiausios dozės grupės gali būti analizuojamos pirmos. Jei su bandomąja medžiaga susijusio poveikio (pvz., poveikio spermatozoidų morfologijai) nėra, kitų grupių analizuoti nebūtina. Jei didelę dozę gavusioje grupėje pastebimas su bandomąja medžiaga susijęs poveikis, reikia įvertinti ir mažesnių dozių grupes.

17.6. Jei kuris nors iš pirmiau išvardytų spermos įvertinimo parametrų jau buvo tiriamas atliekant bent 90 parų sisteminio toksiškumo tyrimą, šio įvertinimo nebūtina kartoti atliekant dviejų kartų tyrimą. Tačiau rekomenduojama pasilikti P kartos spermos ėminius arba skaitmeninius vaizdo įrašus, kad prireikus būtų galima įvertinti vėliau.

18. Palikuonys:

18.1. Kiekviena vada tiriama kiek įmanoma greičiau po atsivedimo (0 laktacijos para) norint nustatyti žiurkiukų skaičių ir lytį, negyvagimius, gyvus palikuonis ir tai, ar yra išsigimimų. Nulinę parą rasti negyvi žiurkiukai, jei jie nemaceruoti, tiriami galimiems defektams ir žūties priežasčiai nustatyti, vėliau užkonservuojami. Gyvi žiurkiukai suskaičiuojami, kiekvienas pasveriamas atsivedimo metu (0 laktacijos para) arba pirmą parą, o vėliau – reguliariai, pvz., 4, 7, 14, ir 21 laktacijos parą. Aprašomos pastebėtos patelių arba palikuonių fizinės ir elgesio anomalijos.

18.2. Palikuonių fizinis vystymasis daugiausia registruojamas pagal kūno masės padidėjimą. Kiti fiziniai parametrai (pvz., ausų ir akių atsivėrimas, dantų prasikalimas, kailio augimas) gali suteikti papildomos informacijos, tačiau šiuos duomenis būtų geriau vertinti registruojant lytinio brendimo duomenis (pvz., amžius ir kūno masė makšties atsidarymo arba apyvarpės atsiskyrimo metu) (39). Rekomenduojama atlikti F1 palikuonių funkcinius tyrimus (pvz., motorinio aktyvumo, sensorinės funkcijos, refleksų ontogenezės) prieš ir po atjunkimo, visų pirma, susietus su lytiniu brendimu, jei tokia analizė neįtraukta į atskirus tyrimus. Nustatomas poravimui pasirinktų F1 atjunkytų gyvūnų makšties atsidarymo ir apyvarpės atsiskyrimo laikas. Išmatuojamas F2 žiurkiukų anogenitalinis atstumas nulinę parą po gimimo, jei buvo nustatytas F1 lyčių santykio arba lytinio subrendimo laiko pakitimas.

18.3. Funkcinių stebėjimų galima neatlikti tose grupėse, kuriose yra aiškių neigiamo poveikio požymių (pvz., reikšmingas masės didėjimo sumažėjimas ir t. t.). Jei atliekami funkciniai tyrimai, jie neatliekami poravimui atrinktiems žiurkiukams.

19. Bendroji autopsija:

19.1. Numarinti arba atliekant tyrimą žuvę visi tėvų kartos (P ir F1) gyvūnai, visi žiurkiukai su išorinėmis anomalijomis arba klinikiniais požymiais, be to, „aklos atrankos“ metodu pasirinktas iš kiekvienos F1 ir F2 kartos žiurkiukas ar lyties atstovas ar vada tiriama makroskopiškai struktūros anomalijoms arba patologiniams pakitimams nustatyti. Ypatingas dėmesys kreipiamas į reprodukcijos sistemos organus. Humaniškai numarinti leisgyviai žiurkiukai ir negyvi žiurkiukai, jei nemaceruoti, tiriami galimiems defektams ir žūties priežasčiai nustatyti, vėliau užkonservuojami.

19.2. Tiriama visų pirmą kartą gimdžiusių patelių gimda implantavimo vietų buvimui ir skaičiui nustatyti, stengiantis nepakenkti histopatologiniam įvertinimui.

20. Organų masė:

20.1. Numarinus nustatoma visų P ir F1 kartų tėvų kūno ir šių organų masė (poriniai organai sveriami atskirai): gimdos, kiaušidžių; sėklidės, antsėklidžio (viso ir uodegos); prostatos; sėklinių pūslelių su koaguliatorių liaukomis ir jų skysčiais ir prostatos (kaip vieno vieneto); smegenų, kepenų, inkstų, blužnies, hipofizio, skydliaukės, antinksčių liaukų ir žinomų veikiamų organų.

20.2. Po numarinimo nustatoma skrodimui pasirinktų F1 ir F2 žiurkiukų kūno masė. Sveriami šie vieno „aklos atrankos“ metodu pasirinkto žiurkiuko ar lyties ar vados (žr. 19 skirsnį) organai: smegenys, blužnis ir užkrūčio liauka.

20.3. Bendrojo skrodimo ir organų masės rezultatai įvertinami atsižvelgiant į stebėjimus kitų kartotinės dozės tyrimų metu, jei įmanoma.

21. Histopatologiniai tėvų tyrimai:

21.1. Histopatologiniam tyrimui fiksuojami ir atitinkamoje terpėje konservuojami šie tėvų (P ir F1) kartos gyvūnų organai ir audiniai arba jų tipiniai ėminiai:

21.1.1. makštis, gimda ir kaklelis, kiaušidės (konservuojamos atitinkame fiksatoriuje);

21.1.2. viena sėklidė (konservuojama Bouino arba panašiame fiksatoriuje), vienas antsėklidis, sėklinės pūslelės, prostata ir koagulianto liaukos;

21.1.3. visų poravimui pasirinktų P ir F1 gyvūnų organas (-ai), ankstesniuose tyrimuose identifikuotas (-i) kaip organas (-i) – taikinys (-iai).

21.2. Atliekami išsamūs histopatologiniai visų poravimui pasirinktų P ir F1 gyvūnų, priklausančių kontrolinėms ir didelės dozės grupėms, užkonservuotų organų ir audinių tyrimai. P gyvūnų kiaušidžių tyrimas neprivalomas. Dar tiriami mažos bei vidutinės dozės grupių organai, kuriems pasireiškia su bandomąja medžiaga siejami pakitimai, kad būtų lengviau nustatyti NOAEL. Be to, atliekamas histopatologinis mažos ir vidutinės dozės grupių gyvūnų, kuriems įtariamas sumažėjęs vaisingumas, pvz., kurie negalėjo susiporuoti, pastoti, būti reproduktoriumi arba atsivesti sveikus palikuonis, arba kurių rujos ciklas arba spermatozoidų skaičius, judrumas arba morfologija buvo paveikti, reprodukcijos organų įvertinimas. Turi būti ištirti visi dideli pažeidimai, pvz., atrofija arba augliai.

21.3. Atliekamas išsamus sėklidžių histopatologinius tyrimas (pvz., naudojant Bouino fiksatorių, į parafiną įlietus ėminius ir 4–5 mium storio skersinius pjūvius), siekiant nustatyti su bandomąja medžiaga susietą poveikį, pvz., spermatidžių sulaikymą, gemalų ląstelių sluoksnių arba tipų trūkumą, daugiabranduoles dideles ląsteles arba spermatogeninių ląstelių atitrūkimą į prošvaisą (40). Nepaliesto antsėklidžio tyrimas, tiriant galvutę, kūną ir uodegą, gali būti atliekamas įvertinant išilginį pjūvį. Antsėklidis įvertinamas leukocitų infiltracijai, ląstelių vyraujančių tipų pokyčiui, netipiškoms ląstelėms ir spermatozoidų fagocitozei nustatyti. Patinų reprodukcijos organų tyrimui gali būti naudojamas dažymas jodo perrūgšties ir Šifo reagentu arba hematoksilinu.

21.4. Po laktacijos kiaušidėje turi būti pirminiai ir augantys folikulai ir dideli laktacijos geltonkūniai. Atliekant histopatologinį tyrimą turėtų būti nustatytas kokybinis pirminių folikulių populiacijos sumažėjimas. F1 patelėms atliekamas kiekybinis pirminių folikulų įvertinimas; gyvūnų skaičius, kiaušidės skerspjūvio pasirinkimas ir pjūvių ėminių dydis turi statistiškai atitikti taikomą įvertinimo metodiką. Tyrimą sudaro pirminių folikulų, kurie gali būti sujungti su mažais augančiais folikulais, skaičiaus nustatymas, siekiant palyginti paveiktas ir kontrolines kiaušides (41) (42) (43) (44) (45).

22. Histopatologiniai atjunkytų jauniklių tyrimai:

22.1. Histopatologiniam tyrimui fiksuojami ir tinkamoje terpėje laikomi audiniai, turintys makroskopinių anomalijų, ir visų žiurkiukų veikiami organai, turintys išorinių anomalijų arba klinikinių požymių, be to, „aklos atrankos“ metodu pasirinktas vienas F1 ir F2 kartų žiurkiukas ar lytis ar vada, nepasirinkta poravimui.

22.2. Histopatologinis konservuotas audinys išsamiai apibūdinamas, ypatingą dėmesį kreipiant reprodukcijos sistemai.

V. DUOMENYS

23. Rezultatų apdorojimas:

23.1. Duomenys pateikiami atskirai ir suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei ir kiekvienai kartai nurodomas gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, atliekant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, visų gyvūnų žūties arba numarinimo laikas, vaisingų gyvūnų skaičius, veisiančių patelių skaičius, toksiško poveikio požymių turinčių gyvūnų skaičius, pastebėtų toksiškumo požymių aprašymas, įskaitant pradžios laiką, trukmę ir bet kokio toksiško poveikio sunkumą, taikyti tėvų ir palikuonių stebėjimo būdai, histopatologinių pakitimų tipai ir atitinkami vados duomenys.

23.2. Skaitmeniniai rezultatai turi būti įvertinti taikant atitinkamą visuotinai priimtą statistinį metodą; statistiniai metodai pasirenkami kaip tyrimo schemos dalis ir turi būti pagrįsti. Duomenims analizuoti gali padėti dozės ar reakcijos statistiniai modeliai. Ataskaitoje turi būti pakankamas kiekis informacijos apie analizės metodą ir taikytą kompiuterio programą, kad nepriklausomas ekspertas ar statistikos specialistas galėtų iš naujo įvertinti bei atkurti analizės eigą.

24. Rezultatų įvertinimas:

24.1. Šio toksiško poveikio dviejų kartų reprodukcijai tyrimo duomenys įvertinami atsižvelgiant į pastebimą poveikį, įskaitant skrodimą ir mikroskopinio tyrimo rezultatus. Įvertinamas ryšis tarp bandomosios medžiagos ir anomalijų buvimo, nebuvimo, dažnumo ir sunkumo, įskaitant makroskopinius pakitimus, nustatytus veikiamus organus, paveiktą vaisingumą, klinikines anomalijas, paveiktą reprodukavimo gebą ir vados charakteristikas, kūno masės pokyčius, poveikį gaištamumui ir bet kokį kitą toksišką poveikį arba tokio ryšio nebuvimas. Įvertinant rezultatus reikia atsižvelgti į bandomosios medžiagos fizikines chemines savybes ir toksikokinetinius duomenis, jei tokie būtų.

24.2. Tinkamai atliekant toksiško poveikio reprodukcijai bandymą turi būti gautas patenkinamas poveikio nesukeliančios dozės įvertis ir neigiamo poveikio reprodukcijai, atsivedimui, laktacijai, postnataliniam vystymuisi, įskaitant augimą ir lytinį brendimą, supratimas.

25. Rezultatų aiškinimas:

25.1. Toksiško poveikio dviejų kartų reprodukcijai tyrimas suteiks informacijos apie kartotinio medžiagos naudojimo poveikį visais reprodukcijos ciklo tarpsniais. Pirmiausia tyrimas suteikia informacijos apie reprodukcijos parametrus ir palikuonių vystymąsi, augimą, brendimą ir išlikimą. Tyrimo rezultatai turėtų būti aiškinami atsižvelgiant į pusiau lėtinio toksiško poveikio, toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi ir į toksikokinetinių bei kitų atliktų tyrimų rezultatus.

25.2. Šio tyrimo rezultatai gali būti naudojami įvertinant cheminės medžiagos papildomų tyrimų būtinumą. Tyrimo rezultatų ekstrapoliavimas žmonėms gali tikti tik tam tikru laipsniu. Jie labiausiai tinka, kai reikia gauti informacijos apie poveikio nesukeliančias dozes ir leistiną poveikį žmonėms (46) (47) (48) (49).

VI. ATASKAITOS RENGIMAS

26. Bandymo ataskaitą turi sudaryti ši informacija:

26.1. Bandomoji medžiaga:

26.1.1. fizikinė būsena ir, jei reikia, fizikinės cheminės savybės;

26.1.2. identifikavimo duomenys;

26.1.3. grynumas.

26.2. Nešiklis (jei naudojamas), jo pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.

26.3. Bandymo gyvūnai:

26.3.1. naudota rūšis ir veislė;

26.3.2. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis;

26.3.3. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras, kraiko medžiagos ir t.t.;

26.3.4. kiekvieno gyvūno kūno masė bandymo pradžioje.

26.4. Bandymo sąlygos:

26.4.1. dozės koncentracijos pasirinkimo pagrindimas;

26.4.2. detali informacija apie bandomosios medžiagos preparato ruošimą arba jos dėjimą į pašarą, gautos koncentracijos vertės;

26.4.3. preparato stabilumas ir vienalytiškumas;

26.4.4. detali informacija apie bandomosios medžiagos suleidimą;

26.4.5. bandomosios medžiagos koncentracijos pašare ar geriamajame vandenyje (ppm) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg kūno masės per parą), jei tinka;

26.4.6. detali informacija apie pašaro ir vandens kokybę.

26.5. Rezultatai:

26.5.1. pašaro suvartojimas ir, jei matuojamas, vandens suvartojimas, pašaro efektyvumas (kūno masės padidėjimas vienam suvartoto pašaro gramui), P ir F1 gyvūnų atveju nurodomas suvartotos bandomosios medžiagos kiekis, išskyrus bendrojo buvimo laikotarpį ir mažiausiai paskutinį laktacijos laikotarpio trečdalį;

26.5.2. absorbcijos duomenys (jei yra);

26.5.3. P ir F1 gyvūnų, pasirinktų poravimui, kūno masės duomenys;

26.5.4. vados ir žiurkiukų kūno masės duomenys;

26.5.5. tėvų kartų kūno masė numarinant ir absoliučios bei santykinės organų masės duomenys;

26.5.6. klinikinių požymių tipas, sunkumas ir trukmė (grįžtami ar negrįžtami);

26.5.7. žūties atliekant tyrimą laikas arba gyvūnai, išgyvenę iki numarinimo;

26.5.8. toksiškumo duomenys pagal lytį ir dozę, įskaitant poravimo, vaisingumo, veisimo, gimstamumo, gyvybingumo ir laktacijos rodiklius; ataskaitoje nurodomi skaičiai, naudojami rodikliams apskaičiuoti;

26.5.9. toksiškas arba kito tipo poveikis reprodukcijai, palikuonims, postnataliniam augimui ir t.t.;

26.5.10. skrodimo rezultatai;

26.5.11. detalus visų histopatologinių rezultatų aprašymas;

26.5.12. P ir F1 patelių, turinčių normalų ciklą, skaičius ir ciklo trukmė;

26.5.13. suminis spermatozoidų antsėklidžio uodegoje skaičius, vis labiau judresnių spermatozoidų procentinė dalis, morfologiškai normalių spermatozoidų procentinė dalis ir spermatozoidų, su kiekviena identifikuota anomalija, procentinė dalis;

26.5.14. poravimosi laikas, įskaitant parų iki poravimosi skaičių;

26.5.15. veisimo trukmė;

26.5.16. implantacijų, geltonkūnių skaičius, vados dydis;

26.5.17. gimusių gyvų žiurkiukų skaičius ir poimplantaciniai nuostoliai;

26.5.18. žiurkiukų su aiškiai matomais išsigimimais skaičius; pateikiamas silpniausių žiurkiukų skaičius, jei buvo nustatomas;

26.5.19. žiurkiukų fiziniai duomenys ir kiti postnatalinio vystymosi duomenys; įvertinti fiziniai parametrai turi būti pagrįsti;

26.5.20. žiurkiukų ir suaugusių gyvūnų funkcinių stebėjimų duomenys, kai tinka;

26.5.21. statistinis duomenų apdorojimas, jei reikia.

26.6. Rezultatų aptarimas.

26.7. Išvados, įskaitant patelėms ir palikuonims gautas NOAEL vertes.

VII. NUORODOS

27. Sadleir, R. M. F. S. (1979). Cycles and Seasons, In: Reproduction in Mammals: L Germ Cells and Fertilization, C. R. Auston and R. V. Short (eds.), Cambridge, New York.

28. Gray, L. E. et al, (1989). A Dose-Response Analysis of Metoksichlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamentai and Applied Toxicology 12: 92-108.

29. Robb, G. W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility 54: 103-107.

30. Klinefelter, G. R. et al., (1991). The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology 5: 39 44

31. Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3): 237- 244.

32. Chapin, R. E. et al, (1992). Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology 6: 267-273

33. Klinefelter, G. R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration. Journal ofAndrology 13: 409-421.

34. Slott, V. L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology 5: 449-458.

35. Slott, V. L. and Perreault, S. D., (1993). Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida, pp. 319-333.

36. Toth, G. P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401-415.

37. Working, PK. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal ofAndrology 8: 330-337.

38. Linder, R. E. et al, (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6: 491-505.

39. Korenbrot, C. C. et al., (1977). Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17: 298303.

40. Russell L. D. et al., (1990). Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.

41. Heindel, J. J. and R. E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.

42. Heindel, J. J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A. N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, p. 421-426.

43. Manson, J. M. and Y. J. Kang, (1989). Test Methods for Assessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: Principles and Methods of Toxicology, A. W. Hayes (ed.), Raven, New York.

44. Smith, B. J. et al,. (1991). Comparison of Random and Seriai Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive Toxicology 5: 379-383.

45. Heindel, J. J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and C. A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.

46. Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M. O. Amdur, J. Doull, and C. D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.

47. Zenick, H. and E. D. Clegg, (1989). Assessment of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A. W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.

48. Palmer, A. K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, C. A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.

49. Palmer, A. K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J. G. Wilson and FC. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos

ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11

ODOS JAUTRINIMO. VIETINIO LIMFMAZGIO TYRIMO (B. 42) METODO APRAŠAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Šis bandymų metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 429 metodą (2002 m.).

2. Vietinio limfmazgio tyrimas – VLT (Local Lymph Node Assay – LLNA) yra pakankamai įteisintas ir priimtas, kad būtų galima pagrįsti jo, kaip naujo metodo, patvirtinimą (13) (14) (15). Tai yra antrasis metodas, leidžiantis nustatyti galimą cheminių medžiagų sukeliamą gyvūnų odos jautrinimą. Pagal kitą metodą (B.6) naudojami bandymai su jūrų kiaulytėmis, ypač maksimizacijos ir Buehlerio bandymas su jūros kiaulytėmis (16).

3. VLT yra pakaitinis metodas odą jautrinančioms cheminėms medžiagoms identifikuoti ir patvirtinti, kad tam tikrų medžiagų geba jautrinti odą nėra didelė. Nereikia manyti, kad visais atvejais vietoj bandymo su jūrų kiaulytėmis reikėtų taikyti VLT bandymą; tai labiau reiškia, kad šis bandymas yra lygiavertis ir gali būti taikomas kaip pakaitinis metodas, pagal kurį teigiamų ir neigiamų rezultatų paprastai nebereikia papildomai patvirtinti.

4. VLT turi tam tikrų pranašumų atsižvelgiant į mokslo pažangą ir gyvūnų gerovę. Tiriamas odos jautrinimo indukcinis periodas ir gaunami kiekybiniai duomenys, tinkami reakcijai į dozę įvertinti. Yra paskelbta išsami informacija apie VLT tinkamumo patvirtinimą ir susijusių darbų apžvalga (17) (18) (19) (20). Be to, reikia pažymėti, kad silpnai arba vidutiniškai jautrinančios medžiagos, kurios yra rekomenduotos kaip tinkamos teigiamos kontrolės medžiagos bandymams su jūrų kiaulytėmis, tinka naudoti VLT metodui (18) (20) (21).

5. VLT yra in vivo metodas, todėl jautrinančiam poveikiui dėl sąlyčio įvertinti naudojami gyvūnai. Tačiau taikant šį metodą yra galimybė sumažinti šiam tikslui reikalingų gyvūnų skaičių. Be to, VLT iš esmės pagerina būdą, kuriuo gyvūnai naudojami jautrinimui dėl sąlyčio bandyti. VLT yra pagrįstas imunologinių reiškinių, kuriuos cheminės medžiagos sukelia jautrinimo indukcijos periodu, nagrinėjimu. Kitaip nei atliekant bandymus su jūrų kiaulytėmis, taikant VLT nereikia sukelti ypač didelio odos jautrumo reakcijų. Be to, taikant VLT nereikia naudoti aktyvuojančiųjų priedų, kurie reikalingi atliekant maksimizacijos bandymą su jūrų kiaulytėmis. Taigi VLT sumažina gyvūnų kančias. Nežiūrint į VLT pranašumus palyginti su tradiciniais bandymais su jūrų kiaulytėmis, reikia pripažinti, kad yra tam tikrų apribojimų, dėl kurių gali tekti taikyti tradicinius bandymus su jūrų kiaulytėmis (pvz., klaidingi neigiami rezultatai tiriant kai kuriuos metalus taikant VLT, klaidingi teigiami rezultatai tiriant tam tikrus odos dirgiklius) (22). Dar žr. B dalies įvadą.

6. Bandymo metodo esmė:

6.1. Pagrindinis principas, kuriuo pagrįstas VLT metodas, yra jautrinančiųjų medžiagų sukelta pirminė limfocitų proliferacija cheminės medžiagos uždėjimo vietą drenuojančiame limfmazgyje. Ši proliferacija yra proporcinga naudojamai dozei (ir alergeno gebai jautrinti), taigi tai yra paprastas būdas objektyviai ir kiekybiškai išmatuoti jautrinimą. Taikant VLT, ši proliferacija įvertinama kaip dozės ir reakcijos santykis, lyginant proliferaciją bandymo grupėse ir nešiklį gavusiose kontrolinėse grupėse. Nustatomas proliferacijos bandomosiose grupėse ir kontrolinėse nešiklio grupėse santykis, vadinamas stimuliavimo indeksu, kuris turi būti lygus mažiausiai trims, kad bandomoji medžiaga galėtų būti toliau vertinama kaip galinti odą jautrinti medžiaga.

6.2. Čia aprašyti metodai yra pagrįsti radioaktyviųjų indikatorių naudojimu ląstelių proliferacijai išmatuoti. Tačiau gali būti naudojami kiti parametrai proliferacijai įvertinti, jei jie pagrįsti atitinkamais moksliniais duomenimis, įskaitant išsamias nuorodas ir metodo aprašymą.

II. BANDYMO METODO APRAŠYMAS

7. Pasiruošimas:

7.1. Laikymo ir šėrimo sąlygos:

7.1.1. Gyvūnai turėtų būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandomieji gyvūnai, temperatūra turi būti 20°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai.

7.1.2. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio.

7.2. Gyvūnų ruošimas:

7.2.1. Gyvūnai pasirenkami „aklos atrankos“ metodu, ženklinami, kad būtų įmanoma kiekvieną identifikuoti (tačiau netaikomas joks ausų ženklinimas), ir laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras prieš pradedant veikti medžiagomis, kad galėtų priprasti prie laboratorijos sąlygų.

7.2.2. Prieš poveikį visi gyvūnai tiriami, siekiant įsitikinti, ar jie neturi pastebimų odos pažeidimų.

8. Bandymo sąlygos:

8.1. Bandymo gyvūnai:

8.1.1. Šiam bandymui pasirinkta gyvūnų rūšis – pelės. Naudojamos jaunos suaugusios CBA/Ca arba CBA/J veislės pelių patelės neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Pradedant tyrimą, gyvūnų amžius turi būti 8-12 savaičių, o gyvūnų kūno masės skirtumas turi būti kiek įmanoma mažesnis ir neviršyti 20% vidutinės masės.

8.1.2. Galima naudoti kitas veisles ir patinus, jei yra gauta pakankamai duomenų, kurie rodytų, kad nėra esminių veislei ir (arba) lyčiai būdingų reakcijos į VLT skirtumų.

8.2. Patikimumo tikrinimas:

8.2.1. Teigiamos kontrolės naudojamos siekiant parodyti gerą bandymo atlikimą ir laboratorijos kompetenciją sėkmingai atlikti bandymą. Teigiamos kontrolės veikimo dozė gyvūnams turi sukelti teigiamą VLT reakciją ir turėtų padidinti stimuliavimo indeksą (SI) > 3 palyginus su neigiama kontrole. Teigiamos kontrolės dozė pasirenkama taip, kad indukcija būtų aiški, bet ne per didelė. Tinkamiausios medžiagos yra heksilcinamono aldehidas (CAS Nr. 101-86-0, EINECS Nr. 202-983-3) ir merkaptobenztiazolas (CAS Nr. 149-30-4, EINECS Nr. 205-736-8). Gali pasitaikyti aplinkybės, kai pateikus pakankamai įrodymų galima naudoti kitas kontrolines medžiagas, atitinkančias pirmiau nurodytus kriterijus.

8.2.2. Nors paprastai teigiamos kontrolės grupė gali būti reikalinga atliekant kiekvieną tyrimą, gali būti situacijų, kai bandymų laboratorijos turės ankstesnius teigiamos kontrolės duomenis, kurie leistų parodyti patenkinamos reakcijos pastovumą šešis mėnesius arba ilgesnį laikotarpį. Tokiais atvejais gali pakakti rečiau atliekamo teigiamos kontrolės bandymo, esant ne didesniems kaip 6 mėnesių intervalams. Nors teigiamos kontrolės medžiaga turi būti bandoma nešiklyje, kuris būtų žinomas, kaip sukeliantis vienodą reakciją (pvz., acetonas, alyvuogių aliejus), gali būti reikalaujama bandyti naudojant netipinį nešiklį (klinikiniu arba cheminiu požiūriu atitinkantį mišinį). Tokiu atveju reikia patikrinti galimą teigiamos kontrolės medžiagos ir tokio netipinio nešiklio sąveiką.

8.3. Gyvūnų skaičiaus, dozės ir nešiklio pasirinkimas:

8.3.1. Vienos dozės grupėje naudojami mažiausiai keturi gyvūnai, esant ne mažiau kaip trims bandomosios medžiagos koncentracijos vertėms, taip pat neigiamos kontrolės grupė, paveikiama tik bandomosios medžiagos nešikliu, ir, prireikus, teigiamos kontrolės grupė. Tais atvejais, kai reikia surinkti kiekvieno gyvūnų duomenis, vienos dozės grupėje turi būti ne mažiau kaip penki gyvūnai. Kontrolinių grupių gyvūnai prižiūrimi kaip ir medžiaga veikiamų grupių gyvūnai, išskyrus tai, kad jie negauna bandomosios medžiagos.

8.3.2. Dozė ir nešiklis turi būti pasirenkami atsižvelgiant į rekomendacijas, pateiktas nuorodoje (1). Dozės pasirenkamos iš koncentracijos verčių eilutės 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% ir t.t. Pasirenkant tris nuoseklias koncentracijos vertes, turėtų būti atsižvelgta į turimus ūmaus toksiškumo ir odos dirginimo duomenis, kad didžiausia koncentracija turėtų kiek įmanoma didesnį poveikį, bet būtų išvengta sisteminio toksiškumo ir per didelio vietinio odos dirginimo (14) (23).

8.3.3. Nešiklis pasirenkamas taip, kad bandymo koncentracijos vertės ir tirpumas būtų kiek įmanoma didesni ir kad tirpalas ar suspensija tiktų bandomajai medžiagai uždėti. Pirmumo tvarka rekomenduojamas nešiklis yra acetonas arba alyvuogių aliejus (4:1 V/V), dimetilformamidas, metiletilketonas, propilenglikolis ir dimetilsulfoksidas (14) (22), tačiau galima naudoti kitus nešiklius, jei tai būtų tinkamai moksliškai pagrįsta. Tam tikrais atvejais papildomai kontrolei gali tekti naudoti klinikiniu požiūriu atitinkantį tirpiklį arba komercinį preparatą, turintį bandomosios medžiagos. Reikia ypač stengtis užtikrinti, kad į nešiklį būtų dedama hidrofilinių medžiagų, kurios drėkintų odą ir iš karto nenutekėtų. Taigi reikėtų vengti naudoti grynai vandeninius nešiklius.

9. Bandymo eiga:

9.1. Eksperimentinis bandymo planas vykdomas taip:

9.1.1. 1 diena: nustatoma ir užrašoma kiekvieno gyvūno kūno masė. Ant kiekvienos ausies išorinės pusės užlašinama 25 miul atitinkamai atskiesto bandomosios medžiagos tirpalo, vien tik nešiklio arba teigiamos kontrolės medžiagos (prireikus);

9.1.2. 2 ir 3 dienos: kartojama 1 dieną atlikta procedūra;

9.1.3. 4 ir 5 dienos: bandomoji medžiaga nenaudojama;

9.1.4. 6 diena:

9.1.4.1. Užrašoma kiekvieno gyvūno masė. Į visų pelių uodegos veną suleidžiama 250 miul valgomosios druskos ir fosfatinio buferio tirpalo (FBT), turinčio 20 miuCi (7,4e + 8Bq)³H-metiltimidino. Galima suleisti 250 miuL (FBT), turinčio 2 miuCi (7,4e + 7Bq) ¹²⁵I-joddeoksiuridino ir 10^-5 mol/l fluordeoksiuridino.

9.1.4.2. Po penkių valandų gyvūnai numarinami. Drenuojamieji ausų limfmazgiai išpjaunami iš kiekvienos ausies ir kiekvienos bandymo grupės išpjovos sudedamos į FBT (jungtinis bandomosios grupės metodas); taikant kitą metodą, galima išpjauti kiekvieno gyvūnų limfmazgius ir kiekvieno gyvūno atskirai sudėti į FBT (kiekvieno gyvūno metodas). Limfmazgių identifikavimo ir skrodimo aprašymą bei schemas galima rasti I priedo 10 nuorodoje.

9.2. Ląstelių suspensijos ruošimas:

9.2.1. Ruošiama jungtinių bandomųjų grupių arba kiekvieno gyvūno poros limfmazgių ląstelių suspensija, švelniai mechaniniškai susmulkinant per 200 mium nerūdijančio plieno tinklelį.

9.2.2. Limfmazgių ląstelės du kartus plaunamos (FBT) pertekliumi ir 18 h nusodinamos 5% trichloracto rūgštimi esant 4 °C (14). Nuosėdos vėl suspenduojamos 1 ml 5% trichloracto rūgštimi ir suspensija supilama į scintiliacinius mėgintuvėlius, turinčius 10 ml scintiliacinio skysčio, kai reikia skaičiuoti ³H, arba tiesiai į mėgintuvėlius gama impulsams skaičiuoti, kai reikia nustatyti ¹²⁵I.

9.3. Ląstelių proliferacijos nustatymas (radioaktyviųjų junginių patekimas):

9.3.1. ³H-metiltimidino patekimas matuojamas skaičiuojant beta scintiliacijas kaip dezintegracijų (skilimų) skaičių per minutę (DPM – disintegrations per minute). ¹²⁵I-joddeoksiuridino patekimas matuojamas skaičiuojant ¹²⁵I ir išreiškiamas kaip DPM.

9.3.2. Atsižvelgiant į taikomą metodą, patekimas bus išreiškiamas DPM/bandomajai grupei (jungtinis metodas) arba DPM/ gyvūnui (kiekvieno gyvūno metodas).

9.4. Stebėjimai:

9.4.1. Klinikiniai stebėjimai: gyvūnai kruopščiai apžiūrimi kartą per dieną bet kokiems klinikiniams požymiams (vietiniam dirginimui lašinimo vietoje arba sisteminiam toksiškumui) nustatyti. Visi kiekvieno gyvūno stebėjimai yra sistemingai registruojami.

9.4.2. Kūno masė: kiekvieno gyvūno kūno masė nustatoma bandymo pradžioje ir po numatyto gyvūno numarinimo (kaip nurodyta 9.1 skirsnyje).

10. Rezultatų apskaičiavimas:

10.1. Rezultatai išreiškiami kaip stimuliavimo indeksas (SI). Taikant jungtinį metodą, SI gaunamas bendrą visos bandomosios grupės gautą radioaktyviųjų junginių patekimo dydį dalijant iš visai nešiklio kontrolinei grupei gauto patekimo dydžio; šis dalmuo yra vidutinė SI vertė. Taikant kiekvieno gyvūno metodą, SI gaunamas dalijant kiekvienos bandomosios medžiagos grupės vidutinę DPM/gyvūnui vertę ir teigiamos kontrolės grupės vidutinę DPM/gyvūnui vertę iš tirpiklio/nešiklio kontrolinės grupės vidutinės DPM/gyvūnui vertės. Taigi nešiklio kontrolinės grupės vidutinė SI vertė lygi 1.

10.2. Jei SI apskaičiuoti taikomas kiekvieno gyvūno metodas, galima daryti statistinę duomenų analizę. Pasirinkdamas tinkamą statistinės analizės metodą, tyrėjas turi suvokti netolygios sklaidos ir kitų susijusių problemų galimybę, dėl to gali tekti duomenis transformuoti arba taikyti neparametrinę statistinę analizę. Tinkamas būdas duomenims interpretuoti – įvertinti visus individualius duomenis, gautus tiriant bandomosios grupės ir kontrolinės grupės, kurioje naudojamas nešiklis, gyvūnus, ir iš šių duomenų gauti geriausiai atitinkančią dozės ir reakcijos santykio kreivę, atsižvelgiant į pasikliautinuosius intervalus (20)(24)(25). Tačiau tyrėjas turi būti pasiruošęs galimiems grupės kiekvieno gyvūno reakcijos išsiskyrimams, ir dėl to gali tekti taikyti kitą reakcijos matą (pvz., medianinę, bet ne vidutinę vertę) arba pašalinti išsiskyrimą.

10.3. Sprendžiant dėl teigiamos reakcijos, stimuliavimo indeksas turi būti > 3, kartu būtina atsižvelgti į dozės ir reakcijos santykį ir, jei tinka, statistinį reikšmingumą (15)(18)(20)(24)(26).

10.4. Jei gauti rezultatai nėra visiškai aiškūs, reikėtų atsižvelgti į įvairias bandomosios medžiagos savybes, įskaitant tai, ar jos struktūra gimininga žinomų odą jautrinančių medžiagų struktūrai, ar ji sukelia per didelį odos dirginimą, ir pasireiškusiu dozės ir reakcijos santykio tipą. Šie ir kiti klausimai yra išsamiai aptarti kitur (19).

III. DUOMENYS

11. Duomenys turi būti suvesti į lenteles, kuriose nurodomos vidutinės bei kiekvienos DPM vertės ir stimuliavimo indeksai, taikomi kiekvienos dozės grupei (įskaitant nešiklio kontrolinę grupę).

IV. ATASKAITOS RENGIMAS

12. Bandymo ataskaitą turi sudaryti ši informacija:

12.1. Bandomoji medžiaga:

12.1.1. identifikavimo duomenys (pvz., CAS numeris, jei yra; grynumas; žinomos priemaišos; siuntos numeris);

12.1.2. fizikinė būsena ir fizikinės cheminės savybės (pvz., lakumas, stabilumas, tirpumas);

12.1.3. jei mišinys, jo sudėtis ir komponentų procentinė dalis.

12.2. Nešiklis: jo identifikavimo duomenys [grynumas; koncentracija (jei tinka); naudojamas tūris]; nešiklio pasirinkimo pagrindimas.

12.3. Bandymo gyvūnai:

12.3.1. naudota pelių veislė;

12.3.2. gyvūno mikrobiologinė būsena, jei žinoma;

12.3.3. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir t.t.;

12.3.4. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis;

12.4. Bandymo sąlygos:

12.4.1. išsami informacija apie bandomosios medžiagos ruošimą ir dėjimą;

12.4.2. dozės koncentracijos pasirinkimo pagrindimas, įskaitant intervalo nustatymo tyrimo rezultatus, jei tyrimas buvo atliekamas; naudotos nešiklio ir bandomosios medžiagos koncentracijos vertės, suminis dedamos medžiagos kiekis;

12.4.3. išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą ar tiekėją, vandens tiekėją).

12.5. Patikimumo tikrinimas:

12.5.1. paskutinės patikimumo patikros rezultatų santrauka, įskaitant informaciją apie medžiagą, koncentraciją ir naudojamą nešiklį;

12.5.2. lygiagrečiai ir (arba) anksčiau bandymo laboratorijoje gauti teigiamos ir neigiamos kontrolės duomenys.

12.6. Rezultatai:

12.6.1. kiekvieno gyvūno kūno masė dozės gavimo ir numatyto numarinimo dieną;

12.6.2. vidutinių DPM verčių (jungtinis metodas) ir individualių verčių (kiekvieno gyvūno metodas) lentelės, taikant abu metodus gautų verčių intervalas ir stimuliavimo indeksai kiekvienos dozės grupei (įskaitant nešiklio kontrolinę grupę);

12.6.3. statistinė analizė, jei tinka;

12.6.4. toksiškumo atsiradimo laikas ir požymiai, įskaitant kiekvieno gyvūno odos dirginimą medžiagos uždėjimo vietoje, jei yra.

12.7. Rezultatų aptarimas: trumpas rezultatų, dozės ir reakcijos santykio analizės ir statistinės analizės, jei tinka, aiškinimas, padarant išvadą, ar bandomoji medžiaga turėtų būti laikoma odą jautrinančia medžiaga.

V. NUORODOS

13. Kimber, I. and Basketter, D. A (1992). The murinę local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology 30, 165-169.

14. Kimber, I, Derman, R. J., Scholes E. W, and Basketter, D. A (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, 13-31.

15. Kimber, L, Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A, Basketter, D. A, Lea, L., House, R. V, Ladies, G. S., Loveless, S. E., Hastings, K. L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, 563-79.

16. Testing Method B.6.

17. Chamberlain, M. and Basketter, D. A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food and Chemical Toxicology, 34, 999-1002.

18. Basketter, D. A, Gerberick, G. F, Kimber, L and Loveless, S. E (1996). The local lymph node assay-Aviable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, 985-997.

19. Basketter, D. A, Gerberick, G. F. and Kimber, L (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, 327-33.

20. Van Och, F. M. M, Slob, W, De Jong, W. H., Vandebriel, R. J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49-59.

21. Dearman, R. J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P, Basketter, D. A. and Kimber, L (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexil cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281-4.

22. National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The Murinę Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99- 4494, Research Triangle Park, N. C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).

23. Testing method B.4.

24. Basketter, D. A, Selbie, E., Scholes, E. W. Lees, D. Kimber, L and Botham, PA (1993) Results with OECD recommended positive control sensitisers in the maximisation, Buehler and local lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63-67.

25. Basketter D. A, Lea L. J., Dickens A, Briggs D., Pate L, Dearman R. J., Kimber L (1999). A comparison of statistical approaches to the derivation of EC3 values from local lymph node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, 261-266.

26. Basketter DA, Blaikie L, Derman RJ, Kimber I, Ryan CA, Gerberick GF, Harvey P, Evans P, White IR and Rycroft RTG (2000). Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis 42, 344-48.

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos

ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11

NEUROTOKSIŠKO POVEIKIO GRAUŽIKAMS TYRIMO (B.43) METODO APRAŠAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Šis metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 424 metodą (1997 m.).

2. Šis bandymo metodas buvo sukurtas gauti informacijai, kuri yra būtina norint patvirtinti arba papildomai apibūdinti galimą cheminių medžiagų neurotoksišką poveikį suaugusiems gyvūnams. Šį metodą galima derinti su egzistuojančiais bandymo metodais, atliekant kartotinės dozės toksiškumo tyrimus, arba atlikti atskirą tyrimą. Rekomenduojama susipažinti su EBPO neurotoksiškumo tyrimo strategijos ir metodų vadovu (32), kuris padėtų planuoti tyrimus, pagrįstus šiuo bandymo metodu. Šis vadovas yra ypač reikalingas, kai rengiamasi daryti šiame metode rekomenduotų įprastų stebėjimų ir bandymo metodikų pakeitimus. Vadovas buvo parengtas norint palengvinti kitų bandymo metodikų, taikytinų konkrečiomis aplinkybėmis, pasirinkimą. Šis metodas neskirtas įvertinti neurotoksišką poveikį vystymuisi.

3. Vertinant cheminių medžiagų toksiškumo savybes, svarbu atsižvelgti į neurotoksiško poveikio galimybę. Jau kartotinės dozės bandymų metode sisteminiam toksiškumui nustatyti vykdomi galimo neurotoksiškumo stebėjimai. Šis bandymo metodas gali būti taikomas planuojant tyrimą, kuris leistų gauti papildomos informacijos arba patvirtinti neurotoksišką poveikį, pastebėtą kartotinės dozės sisteminio toksiškumo tyrimuose. Tačiau nagrinėjant galimą tam tikrų cheminių medžiagų klasių neurotoksiškumą, gali būti prieita prie išvados, kad šios medžiagos galėtų būti tinkamiau įvertintos taikant šį metodą, kai neturima išankstinių duomenų apie galimą neurotoksiškumą, kurie būtų gauti vykdant kartotinės dozės sisteminio toksiškumo tyrimus. Tai galėtų būti, pvz.:

3.1. neurologinių požymių arba neuropatologinių pažeidimų stebėjimas, atliekant kitus nei kartotinės dozės sisteminio toksiškumo tyrimus, arba

3.2. struktūros panašumų buvimas arba kita informacija, kuri leistų medžiagas susieti su kitomis neurotoksiškomis medžiagomis.

4. Be to, gali būti kitų pavyzdžių, kai galėtų tikti šis bandymų metodas; daugiau informacijos pateikiama nuorodoje (32).

5. Šis metodas buvo kuriamas taip, kad jį būtų galima pritaikyti konkretiems poreikiams, norint patvirtinti specifinį cheminės medžiagos histopatologinį neurotoksiškumą ir jos neurotoksiškumą, veikiantį elgseną, be to, apibūdinti ir kiekybiškai įvertinti neurotoksiškąjį poveikį.

6. Anksčiau neuro toksiškumas buvo prilyginamas neuropatijai, esant neuropatologiniams pažeidimams arba neurologiniams funkcijų sutrikimams, pvz., konvulsijos, paralyžius arba drebulys. Nors neuropatija yra svarbus neurotoksiškumo pasireiškimas, dabar paaiškėjo, kad yra daug kitų toksiško poveikio nervų sistemai požymių (pvz., motorinės koordinacijos netekimas, jutimo trūkumai, mokymosi ir atminties sutrikimai), kurių galima nepastebėti atliekant neuropatologinius arba kitų tipų tyrimus.

7. Šis neurotoksiškumo bandymo metodas skirtas nustatyti pagrindinį neurobihevioristinį ir neuropatologinį poveikį suaugusiems graužikams. Nors poveikis elgesiui gali rodyti neigiamą įtaką organizmui ir tuo atveju, kai morfologinių pakitimų nėra, ne visi elgesio pakitimai yra būdingi nervų sistemai. Taigi visus pastebėtus pakitimus reikėtų įvertinti kartu su susijusiais histopatologiniais, hematologiniais arba biocheminiais duomenimis ir kitų sisteminio toksiškumo tipų duomenimis. Šiam metodui numatytus bandymus neurotoksiškam poveikiui apibūdinti ir kiekybiškai įvertinti sudaro specifinės histopatologinio ir elgesio įvertinimo metodikos, kurias papildomai gali patvirtinti elektrofiziologiniai ir (arba) biocheminiai tyrimai (32)(33)(34)(35).

8. Neurotoksiškos medžiagos gali veikti įvairias nervų sistemos vietas ir įvairiais veikimo mechanizmais. Kadangi joks vienas bandymų rinkinys negali išsamiai įvertinti visų medžiagų neurotoksiškumo, gali tekti taikyti kitus in vivo arba in vitro bandymus, atitinkančius pastebėtą arba numatomą neurotoksiškumo tipą.

9. Be to, šis bandymo metodas gali būti taikomas atsižvelgiant į rekomendacijas, pateiktas EBPO neurotoksiškumo tyrimo strategijos ir metodų vadove (32), siekiant parengti tyrimus, skirtus papildomai apibūdinti dozės ir reakcijos santykį arba padidinti jo kiekybinio įvertinimo jautrumą, kad būtų galima geriau įvertinti nesukeliančio pastebimo neigiamo poveikio lygį arba pateikti neginčijamų įrodymų apie žinomus arba spėjamus cheminės medžiagos keliamus pavojus. Pvz., galima parengti tyrimus neurotoksiškumo mechanizmui(-ams) identifikuoti ir įvertinti arba papildyti duomenis, kurie jau buvo gauti taikant bazines elgesio ir neuropatologinių stebėjimų metodikas. Atliekant tokius tyrimus nereikia pakartotinai gauti duomenų, kurie gaunami taikant šiame metode rekomenduotas etalonines metodikas, jei tokie duomenys jau yra ir nėra laikomi būtinais tyrimo rezultatams aiškinti.

10. Šis neurotoksiškumo tyrimas, atliekamas atskirai arba kartu su kitais tyrimais, suteikia informacijos, kuri leidžia:

10.1. identifikuoti, ar nervų sistema yra visam laikui arba grįžtamai veikiama bandomąja chemine medžiaga;

10.2. papildomai apibūdinti nervų sistemos pakitimus, susijusius su cheminės medžiagos veikimu, ir suprasti veikiančio mechanizmo esmę;

10.3. nustatyti dozės ir reakcijos bei laiko ir reakcijos santykius, kad būtų galima įvertinti nesukeliančio pastebimo neigiamo poveikio lygį (kuris gali būti naudojamas nustatant cheminės medžiagos saugos kriterijus).

11. Taikant šį bandymo metodą, bandomoji medžiaga suleidžiama per virškinimo traktą. Kiti medžiagos patekimo būdai (pvz., per odą arba įkvepiant) gali būti tinkamesni ir gali tekti keisti rekomenduojamas metodikas. Patekimo būdo pasirinkimas priklauso nuo žmonių veikimo aplinkybių ir turimos informacijos apie toksikologiją ir kinetiką.

12. Apibrėžimai:

Neigiamas poveikis – bet koks su poveikiu susijęs pakitimas palyginti su etalonu, mažinantis organizmo gebą išgyventi, daugintis arba prisitaikyti prie aplinkos.

Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg) arba kaip pastovios koncentracijos pašare vertės (ppm).

Dozavimas – bendrasis terminas dozei, jos suleidimo dažnumui ir suleidimo laikotarpiui apibūdinti.

Neurotoksiškumas – nervų sistemos struktūros arba funkcijos neigiamas pakitimas dėl veikimo chemine, biologine arba fizikine medžiaga.

Neurotoksiška medžiaga – bet kuri cheminė, biologinė arba fizikinė medžiaga, galinti sukelti neurotoksiškumą.

NOAEL (No observed adverse effect level) – nesukeliančio pastebimo neigiamo poveikio lygio santrumpa, ir tai yra didžiausia dozė, kuri nesukelia su poveikiu susijusių neigiamų pakitimų.

13. Bandymo metodo esmė:

13.1. Bandomoji cheminė medžiaga suleidžiama kelioms laboratorinių graužikų grupėms į virškinimo traktą, naudojant kelias dozių koncentracijas. Paprastai tenka suleisti kartotines dozes ir dozavimo režimas gali būti 28 parų, pusiau lėtinis (90 parų) arba lėtinis (1 metai arba ilgiau). Be to, šiam bandymo metodui parengtos metodikos gali būti taikomos atliekant ūmaus neurotoksiškumo tyrimą. Gyvūnai bandomi siekiant aptikti arba apibūdinti elgesio ir (arba) neurologines anomalijas. Kiekvienu stebėjimo laikotarpiu įvertinami įvairūs elgesio, kuriam neurotoksiškos medžiagos galėtų daryti įtaką, aspektai. Pasibaigus bandymui, kiekvienos grupės kiekvienos lyties gyvūnų pogrupio gyvūnams daroma perfuzija in situ ir ruošiami bei tiriami galvos bei stuburo smegenų ir periferiniai nervų preparatai.

13.2. Kai atliekamas atskiras (stand-alone) tyrimas neurotoksiškumui aptikti arba neurotoksiškam poveikiui apibūdinti, kiekvienos grupės gyvūnai, kurie nebuvo panaudoti perfuzijai ir vėlesniam histopatologiniam tyrimui (žr. 1 lentelę), gali būti naudojami atliekant specialius elgesio tyrimo, neuropatologinius, neurocheminius arba elektrofiziologinius tyrimus, kuriais galima būtų papildyti duomenis, gautus atliekant šiame bandymo metode numatytus tipinius tyrimus (32). Šie papildomi tyrimai gali būti ypač naudingi, kai praktiniai stebėjimai arba numatomas poveikis rodo specifinį cheminės medžiagos neurotoksiškumo tipą arba veikiamą organą. Be to, likusieji gyvūnai gali būti naudojami vertinimams, kurie yra numatyti taikant graužikų kartotinės dozės toksiškumo tyrimų metodus.

13.3. Kai šis bandymo metodas vykdomas kartu su kitais bandymo metodais, reikia turėti pakankamą gyvūnų skaičių norint vykdyti abiem tyrimams reikalingus stebėjimus.

II. BANDYMO METODO APRAŠYMAS

14. Gyvūnų rūšies pasirinkimas:

14.1. Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti kitas graužikų rūšis, jei toks naudojimas būtų pagrįstas. Paprastai naudojamos laboratorinės jaunų, suaugusių ir sveikų gyvūnų veislės. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos.

14.2. Dozė paprastai pradedama leisti kiek įmanoma greičiau po atjunkymo, ir būtų gerai, kad gyvūnui būtų ne daugiau kaip šešios savaitės, tačiau bet kuriuo atveju anksčiau nei gyvūnas sulaukia devynių savaičių. Vis dėl to kai tyrimas atliekamas kartu su kitais tyrimais, šį amžiaus reikalavimą gali tekti keisti.

14.3. Naudojamų gyvūnų masė ir vidutinė kiekvienos lyties masė tyrimo pradžioje neturi skirtis daugiau kaip ± 20%. Kai prieš ilgalaikį tyrimą atliekamas trumpalaikis kartotinės dozės tyrimas, abiem tyrimams turi būti naudojami tos pačios veislės ir tiekėjo gyvūnai.

15. Laikymo ir šėrimo sąlygos:

15.1. Eksperimentinių gyvūnų patalpos temperatūra turėtų būti 22°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50-60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai.

15.2. Reikia kiek įmanoma mažinti didelį su pertrūkiais triukšmą. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė tinkamai įmaišyti bandomąją medžiagą, patenkant jai šiuo būdu. Gyvūnai narveliuose gali būti laikomi atskirai arba mažomis tos pačios lyties grupėmis.

16. Gyvūnų ruošimas:

16.1. Sveiki ir jauni gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į bandomąsias ir kontrolines grupes. Narveliai išdėstomi taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks galimas poveikis dėl narvelio vietos.

16.2. Gyvūnai paženklinami, kad juos būtų įmanoma identifikuoti, ir laikomi narveliuose mažiausiai penkias (36) paras prieš tyrimo pradžią, kad galėtų priprasti prie laboratorinių sąlygų.

17. Medžiagos patekimo būdas ir dozių ruošimas:

17.1. Taikant šį bandymo metodą, bandomoji medžiaga suleidžiama į virškinimo traktą. Medžiaga suleidžiama zondu arba duodama šeriant, girdant ar duodant kapsules. Galima naudoti kitus patekimo būdus (pvz., per odą arba įkvepiant), bet tada gali tekti keisti rekomenduojamas metodikas. Patekimo būdo pasirinkimas priklauso nuo poveikio žmonėms aplinkybių ir turimos informacijos apie toksikologiją ar kinetiką. Reikia pagrįsti patekimo būdo pasirinkimą ir nurodyti dėl to daromus šio bandymo metodo procedūrų pakeitimus.

17.2. Prireikus bandomoji medžiaga ištirpinama arba suspenduojama tinkamame nešiklyje. Rekomenduojama iš pradžių tirti galimybę naudoti vandeninį tirpalą ar suspensiją, vėliau tirpalą ar emulsiją aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet galimybę tirpinti kitame nešiklyje. Turi būti žinomos nešiklio toksiškumo savybės. Be to, reikėtų atsižvelgti į šias nešiklio charakteristikas: poveikį absorbcijai, pasiskirstymui, medžiagų apykaitai ir bandomosios medžiagos sulaikymui, dėl ko gali keistis bandomosios medžiagos cheminės savybės; poveikį maisto ar vandens suvartojimui arba gyvūnų įmitimui.

III. DARBO EIGA

18. Gyvūnų skaičius ir lytis:

18.1. Atliekant atskirą tyrimą kiekvienos dozės grupei ir kontrolinei grupei turi būti naudojama mažiausiai 20 gyvūnų (10 patelių ir 10 patinų) norint išsamiai įvertinti klinikinių ir funkcinių stebėjimų rezultatus. Baigus tyrimą mažiausiai penkiems patinams ir penkioms patelėms iš šių 10 patinų ir 10 patelių daroma perfuzija in situ ir jie naudojami išsamiam neurohistopatologiniam tyrimui. Tais atvejais, kai neurotoksiško poveikio požymiai pasireiškia tik ribotam tam tikros dozės grupės gyvūnų skaičiui, reikėtų numatyti šiuos gyvūnus įtraukti į pasirinktųjų perfuzijai gyvūnų skaičių.

18.2. Kai tyrimas atliekamas kartu su kartotinės dozės toksiškumo tyrimu, abiejų tyrimų tikslams pasiekti turi būti naudojamas atitinkamas gyvūnų skaičius. Įvairiems tyrimų deriniams reikalingas mažiausias gyvūnų skaičius grupėje pateiktas 1 lentelėje. Jei numatomi tarpiniai numarinimai arba planuojama sudaryti grupes poveikio grįžtamumui, jo išsilaikymui arba po paveikimo vėluojančiam toksiškam poveikiui stebėti, arba kai numatoma papildomai stebėti, gyvūnų skaičius turėtų būti padidintas siekiant užtikrinti, kad būtų gyvūnų, reikalingų stebėjimams ir histopatologiniam tyrimui.

19. Bandomosios ir kontrolinės grupės:

19.1. Paprastai turi būti naudojamos mažiausiai trijų dozių grupės ir kontrolinė grupė, tačiau, jei įvertinus kitus duomenis nelaukiama poveikio esant kartotinei 1000 mg/kg kūno masės/parą dozei, galima atlikti ribinį bandymą. Jei atitinkamų duomenų nėra, galima atlikti intervalo nustatymo tyrimą, siekiant palengvinti naudojamos dozės pasirinkimo kelią.

19.2. Kontrolinės grupės gyvūnai prižiūrimi kaip ir medžiagą gaunančių grupių gyvūnai, išskyrus tai, kad jie nepaveikiami bandomąja medžiaga. Jei suleidžiant bandomąją medžiagą naudojamas nešiklis, kontrolinė grupė turi gauti didžiausią naudojamą nešiklio tūrį.

20. Patikimumo tikrinimas:

20.1. Tyrimą atliekanti laboratorija turi pateikti duomenis, įrodančius jos kompetenciją atlikti tyrimą ir naudojamų metodikų jautrumą. Tokie duomenys turi patvirtinti įrodymus dėl sugebėjimo rasti ir prireikus kiekybiškai įvertinti stebėti skirtų skirtingų parametrų pakitimus, pvz., autonominių požymių, jutiminio aktyvumo, grybšnio jėgos ir motorinio aktyvumo.

20.2. Informacija apie chemines medžiagas, kurios sukelia įvairių tipų nerotoksišką poveikį ir kurios galėtų būti naudojamos kaip teigiamos kontrolės medžiagos, pateikta 11-18 nuorodose. Galima naudoti anksčiau gautus duomenis, jei nebus keičiami esminiai bandymo metodikų aspektai.

20.3. Rekomenduojama periodiškai atnaujinti anksčiau gautus duomenis. Kiekvieną kartą kai bandymus atliekanti laboratorija keičia kurį nors bandymo arba jo metodikų esminį elementą, reikėtų gauti naujų duomenų, kurie rodytų nekintamą metodikų jautrumą.

21. Dozės pasirinkimas:

21.1. Dozės koncentracijos vertes reikėtų pasirinkti atsižvelgiant į visus anksčiau gautus toksiškumo ir kinetinius duomenis apie bandomąją medžiagą arba giminingas medžiagas. Didžiausia dozė turėtų būti pasirinkta siekiant sukelti neurotoksišką poveikį arba aiškų sisteminį toksišką poveikį.

21.2. Vėliau turėtų būti pasirinkta mažėjanti dozės koncentracijos seka siekiant parodyti kiekvieną su doze susietą reakciją ir nesukeliančio pastebimo neigiamo poveikio lygį (NOAEL), atitinkantį mažiausią dozę.

21.3. Iš esmės turėtų būti nustatytos tokios dozės, kad būtų įmanoma atskirti pirminį toksišką poveikį nervų sistemai ir sisteminį toksišką poveikį. Paprastai pakanka nuo dviejų iki trijų dozių intervalų, ir dažnai gerai būtų naudoti ketvirtą bandymo grupę, norint naudoti labai didelius intervalus tarp dozių (pvz., daugiklis didesnis kaip 10). Jei yra patikimų poveikio žmonėms duomenų, į tai irgi reikia atsižvelgti.

22. Ribinis bandymas:

22.1. Jei atliekant bandymą pagal šiame tyrime aprašytas metodikas su viena mažiausiai 1000 mg/kg kūno masės/parą doze neurotoksiškas poveikis nepastebimas arba jei toksiško poveikio nelaukiama, atsižvelgiant į turimus duomenis apie giminingos struktūros junginius, nėra nebūtina atlikti visą tyrimą, naudojant tris dozių koncentracijas. Atsižvelgiant į laukiamą poveikį žmonėms gali tekti naudoti didesnes suleidžiamas per virškinimo traktą ribinio bandymo dozės.

22.2. Kalbant apie kitus patekimo būdus, pvz., įkvėpimą arba veikimą per odą, bandomosios medžiagos fizikinės cheminės savybės dažnai gali apibrėžti didžiausią pasiekiamą poveikio lygį. Atliekant ūmaus poveikio per virškinimo traktą tyrimą ribinio bandymo dozė turi būti mažiausiai 2000 mg/kg.

23. Dozių suleidimas:

23.1. Gyvūnai gauna bandomosios medžiagos dozę kasdien, septynias dienas per savaitę, ne trumpiau kaip 28 paras; penkių parų dozės režimas arba trumpesnė veikimo trukmė turi būti pagrįsti. Kai bandomoji medžiaga suleidžiama zondu, naudojamas skrandžio zondas arba tinkamas intubacinis vamzdelis. Didžiausias gyvūnui suleidžiamas vienkartinis skysčio tūris priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės. Tačiau vandeninių tirpalų atveju galima suleisti 2 ml/100 g kūno masės. Išskyrus dirginančias arba ardančias medžiagas, kurios esant didesnei koncentracijai turi sunkesnį poveikį, bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas, keičiant koncentraciją taip, kad visų dozių tūris būtų pastovus.

23.2. Jei medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, svarbu užtikrinti, kad naudojami bandomosios medžiagos kiekiai netrukdytų įprastam maitinimuisi arba vandens pusiausvyrai. Kai bandomoji medžiaga patenka su pašaru, galima naudoti pastovią koncentraciją (ppm) arba pastovią dozę pagal gyvūno kūno masę; naudotas variantas turi būti nurodytas. Jei medžiaga suleidžiama zondu, dozė turėtų būti suleidžiama kiekvieną dieną panašiu laiku ir reguliuojama pastoviam dozės ir gyvūno kūno masės santykiui užtikrinti. Jei prieš ilgalaikį tyrimą atliekamas kartotinės dozės tyrimas, atliekant abu tyrimus turi būti naudojamas panašus pašaras. Jei atliekant ūmaus toksiškumo tyrimus neįmanoma suleisti vienetinę dozę, ji gali būti suleidžiama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.

IV. STEBĖJIMAI

24. Stebėjimų ir bandymų dažnumas:

24.1. Atliekant kartotinės dozės tyrimus, stebėjimo laikotarpis turi atitikti dozavimo laikotarpį. Atliekant ūmaus toksiškumo tyrimus, stebima 14 parų po medžiagos suleidimo. Pagalbinių grupių gyvūnai, kurie negauna bandomosios medžiagos pasibaigus veikimo laikotarpiui, irgi turi būti stebimi tokį laikotarpį.

24.2. Stebima turi būti pakankamu dažniu siekiant kiek įmanoma padidinti tikimybę aptikti bet kokį elgesio ir (arba) neurologines anomalijas. Reikėtų stebėti kasdien vienodu laiku, atsižvelgiant į didžiausio laukiamo poveikio pasireiškimo laiką po medžiagos suleidimo. Klinikinių stebėjimų ir funkcinių bandymų dažnis apibendrintas 2 lentelėje. Jei ankstesniuose tyrimuose gauti kinetiniai duomenys rodo, kad stebėjimų, bandymų arba stebėjimų po bandymų laikas turi būti kitas, reikėtų patvirtinti kitą laiko grafiką didžiausiam informacijos kiekiui gauti. Padaryti grafiko pakeitimai turi būti pagrįsti.

24.3. Bendrosios sveikatos būklės ir gaištamumo ar liguistumo stebėjimas. Visi gyvūnai turi būti bent kartą per dieną apžiūrėti jų sveikatos būklei nustatyti ir bent du kartus per dieną liguistumui ir gaištamumui nustatyti.

24.4. Išsamūs klinikiniai stebėjimai:

24.4.1. Nuodugniai turi būti apžiūrimi visi šiam tikslui atrinkti gyvūnai (žr. 1 lentelę) – kartą prieš pirmą veikimą medžiaga (kad būtų galima palyginti to paties gyvūno duomenis) ir vėliau skirtingais intervalais, atsižvelgiant į tyrimo trukmę (žr. 2 lentelę). Pagalbinės sveikstančių gyvūnų grupės nuodugniai kliniškai apžiūrimos baigiantis pasveikimo laikotarpiui. Nuodugniai kliniškai apžiūrima ne narvelyje, bet standartiškai įrengtoje vietoje. Stebėjimų rezultatai turi būti kruopščiai užrašyti, naudojant įvertinimo balais sistemas, kurias sudaro kiekvienos apžiūros matavimų kriterijai arba įvertinimo balais skalės. Bandymų laboratorija turi aiškiai apibrėžti taikomus kriterijus arba balų skales. Reikia stengtis užtikrinti, kad bandymo sąlygų skirtumai būtų kiek įmanoma mažesni (išskyrus pagal metodiką susietas su poveikiu) ir apžiūrėtų patyrę specialistai, kurie nežinotų apie faktinį poveikį.

24.4.2. Rekomenduojama apžiūrėti struktūriniu būdu, kai kiekvienos apžiūros metu kiekvienam gyvūnui sistemingai taikomi aiškiai apibrėžti kriterijai (įskaitant normalaus „intervalo“ apibrėžimą). „Normalus intervalas“ turi būti tinkamai dokumentuojamas. Turi būti užrašyti visi pastebėti požymiai. Be to, visais įmanomais atvejais turi būti užrašytas pasireiškiančių požymių sunkumas. Klinikiniai stebėjimai turi apimti odos, kailio, akių, gleivinių, sekrecijų ir ekskrecijų dažnį ir autonominį aktyvumą (pvz., ašarojimą, drebulį, vyzdžių dydį, neįprastą kvėpavimą ir (arba) kvėpavimą per burną, visus neįprastus šlapinimosi arba tuštinimosi požymius, šlapimo išblukimą), tačiau neapsiriboti vien tuo.

24.4.3. Turi būti pažymėta bet kokia neįprasta reakcija dėl kūno padėties, aktyvumo lygio (pvz., naudojimosi tipiniu plotu sumažėjimas arba padidėjimas) ir judesių koordinacijos. Aprašomi eisenos (pvz., krypuojanti eisena, ataksija), laikysenos (pvz., kuprojimasis) ir reakcijos į priežiūrą, apgyvendinimą arba kitus aplinkos dirgiklius pakitimai, taip pat kloninių arba toninių judesių, traukulių arba drebulio buvimas, stereotipinis elgesys (per dažnas kūno prisižiūrėjimas, neįprasti galvos judesiai, nuolatinis sukimasis ratu) arba keistas elgesys (pvz., kandžiojimasis arba per didelis laižymasis, savęs žalojimas, vaikščiojimas atbulomis, vokalizacija) arba agresija.

24.5. Funkciniai bandymai:

24.5.1. Visiems šiam tikslui atrinktiems gyvūnams dar atliekami į nuodugnius klinikinius stebėjimus panašūs funkciniai bandymai vieną kartą prieš poveikį bandomąja medžiaga ir dažnai vėliau (žr. 1 lentelę). Be to, funkcinių bandymų dažnumas priklauso nuo tyrimo trukmės (žr. 2 lentelę). Be 2 lentelėje nustatytų stebėjimo laikotarpių, turėtų būti funkciniai pagalbinių grupių sveikimo stebėjimai kiek įmanoma prieš pat numatytą numarinimą.

24.5.2. Funkcinius bandymus turi sudaryti jutiminio aktyvumo bandymai įvairių dirgiklių atžvilgiu [pvz., garsinių, regėjimo ir proprioceptinių dirgiklių (36)(37)(38)], galūnių grybšnio jėgos įvertinimas (39) ir motorinio aktyvumo įvertinimas (40). Motorinis aktyvumas matuojamas naudojant mechanizuotą įtaisą, kuriuo galima nustatyti aktyvumo didėjimą ir mažėjimą. Jei naudojama kita apibrėžta sistemą, ji turi būti kiekybinio įvertinimo sistema ir turi būti įrodytas jos jautrumas ir patikimumas. Kiekvienas įtaisas tikrinamas siekiant užtikrinti jų patikimumą bėgant laikui ir įtaisų tarpusavio suderinamumą. Kitos metodikų detalės pateiktos atitinkamose nuorodose.

24.5.3. Jei nėra duomenų (pvz., informacijos apie struktūros ir aktyvumo santykį, epidemiologinių duomenų, kitų toksikologinių tyrimų), kurie rodytų galimą neurotoksiškąį poveikį, reikėtų numatyti įtraukti labiau specializuotus jutiminės ir motorinės funkcijos arba mokymo ir atminties bandymus šiam poveikiui išsamiau ištirti. Daugiau informacijos apie specializuotus bandymus pateikta (32).

24.5.4. Išimtiniais atvejais funkcinių bandymų su gyvūnais galima neatlikti, jei gyvūnams pasireiškia tokio laipsnio toksiškumo požymiai, koks labai trukdytų tyrimui. Sprendimas neįtraukti gyvūnų į funkcinį bandymą turi būti pagrįstas.

25. Kūno masė ir pašaro ar vandens suvartojimas:

25.1. Jei tyrimai vyksta mažiau kaip 90 parų, visi gyvūnai turi būti sveriami mažiausiai kartą per savaitę, be to, mažiausiai kas savaitę matuojamas pašaro suvartojimas (vandens suvartojimas, kai bandomoji medžiaga patenka su vandeniu).

25.2. Atliekant ilgalaikius tyrimus, visi gyvūnai sveriami mažiausiai kartą per savaitę pirmąsias 13 savaičių ir vėliau mažiausiai kas 4 savaites. Pašaro suvartojimas matuojamas (vandens suvartojimas, kai bandomoji medžiaga patenka su vandeniu) mažiausiai kartą per savaitę pirmąsias 13 savaičių ir vėliau maždaug kas tris mėnesius, išskyrus kai sveikatos būklė arba kūno masės kitimas reikalauja daryti kitaip.

26. Oftalmologiniai tyrimai:

26.1. Jei tyrimas trunka ilgiau kaip 28 paras, prieš bandomosios medžiagos suleidimą ir pasibaigus tyrimui būtina ištirti visų gyvūnų arba bent vieno didelės dozės grupės ir kontrolinės grupės gyvūno akis, naudojant oftalmoskopą arba lygiavertį tinkamą prietaisą.

26.2. Jei nustatomi akių pakitimai arba jei klinikiniai požymiai rodo oftalmologinio tyrimo būtinumą, turi būti ištirti visi gyvūnai. Atliekant ilgalaikius tyrimus, akys tiriamos po 13 savaičių. Oftalmologinių tyrimų atlikti nebūtina, jei šie duomenys yra gauti atliekant kitus panašios trukmės ir panašių dozių tyrimus.

27. Hematologiniai ir klinikiniai biocheminiai tyrimai:

27.1. Kai neurotoksiškumo tyrimas atliekamas kartu su kartotinės dozės sisteminio toksiškumo tyrimu, hematologiniai tyrimai ir klinikiniai biocheminės analizės atliekami taip, kaip nurodyta atitinkamame sisteminio toksiškumo tyrimo metode.

27.2. Ėminius reikia imti taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks neurologinis poveikis elgesiui.

28. Histopatologiniai tyrimai:

28.1. Turi būti planuojamas neuropatologinis tyrimas, siekiant papildyti ir išplėsti stebėjimų rezultatus, gautus tyrimo in vivo stadijoje. Mažiausiai 5 kiekvienos lyties ar grupės gyvūnai (žr. 1 lentelę ir kitą pastraipą) fiksuojami in situ, taikant visuotinai pripažintus perfuzijos ir fiksavimo metodus (žr. 34 nuorodos 5 skyrių ir 35 nuorodos 50 skyrių). Turi būti užrašyti visi pastebėti dideli pakitimai. Kai tyrimas atliekamas kaip atskiras tyrimas neuro toksiškoms medžiagoms atrinkti arba neuro toksiškam poveikiui apibūdinti, likusieji gyvūnai gali būti panaudoti specifiniams neurologinio elgesio (41) (42), neuropatologiniams (41) (42) (43) (44), neurocheminiams (41) (42) (45) (46) arba elektrofiziologiniams tyrimams (41) (42) (47) (48), kurie gali papildyti čia aprašytas metodikas ir tyrimus, arba padidinti histopatologiniuose tyrimuose naudojamų gyvūnų skaičių. Šie papildomi tyrimai yra ypač naudingi, kai praktiniai stebėjimai arba numatomas poveikis rodo specifinį neurotoksiškumo tipą arba veikiamą organą (33) (34). Be to, likusieji gyvūnai gali būti panaudoti įprastiems patologiniams įvertinimams, kaip aprašyta kartotinių dozių tyrimų metode.

28.2. Visi į parafiną įlieti audinio mėginiai dažomi įprastu būdu, pvz., hematoksilinu ir eozinu (H&E), ir atliekamas mikroskopinis tyrimas. Jei pasireiškia arba įtariami periferinės neuropatijos požymiai, tiriami į plastiką įlieti periferinių nervų audinio ėminiai. Be to, klinikiniai požymiai gali nurodyti papildomas tyrimo vietas arba poreikį naudoti specialias dažymo metodikas. Papildomos vietos, kurias reikėtų ištirti, aprašytos nuorodose (34) (35). Be to, konkretiems patologinių pakitimų tipams parodyti gali būti naudojami atitinkami specialūs dažai (49).

28.3. Tipiniai centrinės ir periferinės nervų sistemos pjūviai tiriami histologiškai (žr. 34 nuorodos 5 skyrių ir 35 nuorodos 50 skyrių). Tiriamas vietas paprastai sudaro: priekinės smegenys, didžiųjų smegenų pusrutulių vidurys, įskaitant hipokampo pjūvį, viduriniosios smegenys, smegenėlės, tiltas, pailgosios smegenys, akis su regos nervu ir tinklaine, stuburo smegenys kaklo ir juosmens sustorėjimų vietose, užpakalinės nugaros smegenų šaknelės mazgai, užpakalinės ir priekinės nugaros smegenų šaknelės pluoštai, proksimalinis sėdmens nervas, proksimalinis blauzdikaulio nervas (prie kelio) ir blauzdikaulio nervo šakos į blauzdos raumenį. Daromas stuburo smegenų ir periferinių nervų skersinis arba įstrižas ir išilginis pjūvis. Reikia atkreipti dėmesį į nervų sistemos vaskuliarizaciją. Be to, turi būti tiriamas raumenų ėminys, visų pirma, blauzdos raumuo. Ypatingą dėmesį reikia kreipti į centrinės ir periferinės nervų sistemų vietas su ląsteline ir pluoštine struktūra, kurios yra žinomos kaip ypač veikiamos neurotoksiškomis medžiagomis.

28.4. Informacija apie neuropatologinius pakitimus, paprastai atsirandančius dėl poveikio toksiškomis medžiagomis, pateikta nuorodose (34) (35). Rekomenduojamas audinio ėminių tyrimas etapais, kai iš pradžių lyginami didelės dozės ir kontrolinės grupės gyvūnų audinių pjūviai. Jei lyginant šias grupes neuropatologinių pakitimų nenustatoma, toliau analizuoti nereikia. Jei didelės dozės grupėje pastebimi neuropatologiniai pakitimai, reikia koduoti ir nuosekliai tirti visų galbūt paveiktų audinių ėminius, gautus tarpinės ir mažos dozės grupėms.

28.5. Jei kokie nors neuropatologinių pakitimų įrodymai gaunami atliekant kokybinį tyrimą, atliekamas antras visų pakitimus turinčių nervų sistemos sričių tyrimas. Visų dozių grupių galimai paveiktų sričių pjūviai koduojami ir „aklos atrankos“ metodu paskiriami tirti, nenurodant kodo. Turi būti užrašytas kiekvieno pažeidimo dažnumas ir sunkumas. Įvertinus visas visų dozių grupių sritis, kodą galima atskleisti ir daroma statistinė analizė dozės ir reakcijos santykiui įvertinti. Turi būti aprašyti kiekvieno pažeidimo įvairaus sunkumo laipsnio pavyzdžiai.

28.6. Neuropatologinių tyrimų rezultatai įvertinami atsižvelgiant į elgesio stebėjimus ir matavimus, be to, į duomenis, gautus atliekant ankstesnius ir lygiagrečius bandomosios medžiagos sisteminio toksiškumo tyrimus.

V. DUOMENYS

29. Rezultatų apdorojimas:

29.1. Pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys.

29.2. Papildomai visi duomenys apibendrinami ir suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo arba kontrolinei grupei nurodomas gyvūnų skaičius, atliekant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius, stebimų toksiškumo požymių aprašymas, įskaitant bet kokio toksiško poveikio pradžios laiką, trukmę, tipą ir sunkumą, pažeidimų turinčių gyvūnų skaičius, įskaitant pažeidimo(-ų) tipą ir sunkumą.

30. Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas:

30.1. Tyrimo rezultatai įvertinami kaip neuropatologinio poveikio ir poveikio elgesiui (be to, neurocheminio arba elektrofiziologinio poveikio, jei vykdomi papildomi tyrimai) dažnumas, sunkumas ir jų koreliacija ir bet koks kitas pastebimas neigiamas poveikis.

30.2. Jei įmanoma, skaitmeniniai rezultatai įvertinami taikant tinkamą ir visuotinai priimtą statistinį metodą. Statistiniai metodai pasirenkami rengiant tyrimo planą.

VI. ATASKAITOS RENGIMAS

31. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:

31.1 Bandomoji medžiaga: jos fizikinė būsena (įskaitant izomerizavimą, grynumą ir fizikines chemines savybes); identifikavimo duomenys.

31.2 Nešiklis (jei naudojamas): jo pasirinkimo pagrindimas.

31.3. Bandomi gyvūnai:

31.3.1. naudota rūšis ir veislė;

31.3.2. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis;

31.3.3. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, aklimatizavimas, maistas ir t.t.;

31.3.4. kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje.

31.4. Bandymo sąlygos:

31.4.1. išsami informacija apie bandomosios medžiagos ar preparato ruošimą, jo dėjimą į maistą, gautą koncentraciją, preparato stabilumą ir vienalytiškumą;

31.4.2. suleidžiamos dozės specifikacija, įskaitant išsamią informaciją apie nešiklį, suleidžiamos medžiagos tūrį ir fizikinį pavidalą;

31.4.3. bandomosios medžiagos patekimo būdo detalės;

31.4.4. pasirinktos dozės pagrindimas;

31.4.5. poveikio būdo ir trukmės pasirinkimo pagrindimas;

31.4.6. bandomosios medžiagos koncentracijos pašare ar geriamajame vandenyje (ppm) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg kūno masės/parą), jei tinka;

31.4.7. išsami informacija apie maisto ir vandens kokybę.

31.5. Stebėjimo ir bandymo metodikos:

31.5.1. išsami informacija apie kiekvienos grupės gyvūnų atranką į pogrupį perfuzijai daryti;

31.5.2. išsami informacija apie vertinimo balais sistemas, įskaitant kiekvieno matavimo vykdant nuodugnius klinikinius stebėjimus kriterijus ir balų skales;

31.5.3. išsami informacija apie funkcinius bandymus nustatant jutiminį aktyvumą įvairių dirgiklių atžvilgiu (pvz., garsinių, regėjimo ir proprioceptinių dirgiklių); galūnių grybšnio jėgos įvertinimo, motorinio aktyvumo įvertinimo (įskaitant išsamią informaciją apie aktyvumui nustatyti naudojamus automatizuotus įtaisus) ir kitos taikytos metodikos;

31.5.4. išsami informacija apie oftalmologinius tyrimus ir, jei tinka, hematologiniai tyrimai ir klinikinės biochemijos bandymai, nurodant atitinkamas etalonines vertes;

31.5.5. išsami informacija apie specifinius elgesio, neuropatologinių, neurocheminių arba elektrofiziologinių tyrimų metodikas.

31.6. Rezultatai:

31.6.1. kūno masė ar kūno masės pokyčiai, įskaitant kūno masę numarinant;

31.6.2. maisto ir vandens suvartojimas, jei tinka;

31.6.3. duomenys apie kiekvieno gyvūno atsaką pagal lytį ir dozes, įskaitant toksiškumo požymius ar žūčių skaičių;

31.6.4. nuodugnių klinikinių stebėjimų tipas, sunkumas ir trukmė (pradžios laikas ir vėlesnė eiga) (nurodyti grįžtamumą arba negrįžtamumą);

31.6.5. visų funkcinio bandymo rezultatų išsamus aprašymas;

31.6.6. skrodimo rezultatai;

31.6.7. išsamus visų turimų elgesio, neuropatologinių, neurocheminių arba elektrofiziologinių rezultatų aprašymas;

31.6.8. absorbcijos ir medžiagos apykaitos duomenys, jei yra;

31.6.9. statistinis rezultatų apdorojimas, jei daromas.

31.7. Rezultatų aptarimas:

31.7.1. informacija apie dozės ir reakcijos santykį;

31.7.2. ryšys su bet kokiu kitu toksišku poveikiu ir išvada apie bandomosios cheminės medžiagos neurotoksiškumą;

31.7.3. nesukeliantis pastebimo neigiamo poveikio lygis.

31.8. Išvados: prašoma pateikti bandomosios cheminės medžiagos bendrojo neurotoksiškumo įvertinimą.

VII. NUORODOS

32. OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.

33. Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.

34. World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.

35. Spencer, PS. and Schaumburg, H. H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, PS. and Schaumburg, H. H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.

36. Tupper, D. E. and Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999- 1003.

37. Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.

38. Moser, YC, McDaniel, K. M. and Phillips, PM. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol, 108, 267-283.

39. Meyer, O. A, Tilson, H. A, Byrd, W. C. and Riley, M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236.

40. Crofton, K. M., Haward, J. L., Moser, V. C, Gili, M. W, Reirer, L. W., Tilson, H. A and MacPhail, R. C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol, 13, 599- 609.

41. Tilson, H. A, and Mitchell, C. L. eds. (1992). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.

42. Chang, L. W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcei Dekker, New York.

43. Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695.

44. Moser, YC, Anthony, D. C, Sette, W. F. and MacPhail, R. C. (1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hidroksi etil Acrilate and Acrilamide in Rats. Fund. Appl. Toxicol., 18, 343-352.

45. O'Callaghan, J. P (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452.

46. O'Callaghan J. P. and Miller, D. B. (1988). Acute Exposure of the Neonatal Rat to Trietiltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378.

47. Fox. D. A, Lowndes, H. E. and Birkamper, G. G. (1982). Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C. L. ed. Raven Press, New York, p. 299- 335.

48. Johnson, B. L. (1980). Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, PS. and Schaumburg, H. H. eds., Williams and Wilkins Co., Baltimore/London, p. 726-742.

49. Bancroft, J. D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of Histological Techniąues. Chapter 17, Neuropathological Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.

______________

1 lentelė. Mažiausias gyvūnų skaičius vienoje grupėje atliekant neurotoksiškumo tyrimą atskirai arba kartu su kitais tyrimais

	NEUROTOKSIŠKUMO TYRIMAS, ATLIKTAS KAIP:
	atskiras tyrimas	tyrimas, atliekamas kartu su 28 parų tyrimu	tyrimas, atliekamas kartu su 90 parų tyrimu	tyrimas, atliekamas kartu su lėtinio toksiškumo tyrimu
Bendras gyvūnų skaičius grupėje	15 patinų ir 15 patelių	15 patinų ir 15 patelių	15 patinų ir 15 patelių	25 patinai ir 25 patelės
Gyvūnų, atrinktų funkciniam bandymui, įskaitant nuodugnius klinikinius stebėjimus, skaičius	10 patinų ir 10 patelių	10 patinų ir 10 patelių	10 patinų ir 10 patelių	10 patinų ir 10 patelių
Gyvūnų, atrinktų perfuzij ai in situ ir neurohistopatologiniam tyrimui, skaičius	5 patinai ir 5 patelės	5 patinai ir 5 patelės	5 patinai ir 5 patelės	5 patinai ir 5 patelės
Gyvūnų, atrinktų kartotinės dozės/pusiau lėtinio/lėtinio toksiškumo stebėjimui, hematologiniam, klinikiniam biocheminiam, histopatologiniam ir t.t. tyrimui, kaip nurodyta atitinkamuose vadovuose, skaičius		5 patinai ir 5 patelės	10 patinų^† ir 10 patelių^†	20 patinų^† ir 20 patelių^†
Papildomi stebėjimai, jei reikia	5 patinai ir 5 patelės
^† Įskaitant penkis gyvūnus, atrinktus funkciniam bandymui ir nuodugniems klinikiniams stebėjimams, kurie yra neurotoksiškumo tyrimo dalis.

2 lentelė. Klinikinių stebėjimų ir funkcinių bandymų dažnumas

Stebėjimų tipas		Tyrimo trukmė
Stebėjimų tipas		ūmus	28 parų	90 parų	lėtinis
Visi gyvūnai	Bendroji sveikatos būklė	kasdien	kasdien	kasdien	kasdien
Visi gyvūnai	Gaištamumas/liguistumas	du kartus per dieną	du kartus per dieną	du kartus per dieną	du kartus per dieną
Gyvūnai, atrinkti funkciniams stebėjimams	Nuodugnūs klinikiniai stebėjimai	– prieš pirmą poveikį	– prieš pirmą poveikį	– prieš pirmą poveikį	– prieš pirmą poveikį
		– po 8 h nuo dozės suleidimo, didžiausio numatomo poveikio momentu	– vėliau kartą per savaitę	– kartą per pirmą arba antrą savaitę po poveikio	– kartą pasibaigus pirmam mėnesiui po poveikio
		– 7 ir 14 parą po dozės suleidimo		– vėliau kas mėnesį	– vėliau kas tris mėnesius
	Funkciniai bandymai	– prieš pirmą poveikį	– prieš pirmą poveikį	– prieš pirmą poveikį	– prieš pirmą poveikį
		– po 8 h nuo dozės suleidimo, didžiausio numatomo poveikio momentu	– ketvirtą poveikio savaitę, kiek įmanoma arčiau poveikio laikotarpio pabaigos	– kartą per pirmą arba antrą savaitę po poveikio	– kartą pasibaigus pirmam mėnesiui po poveikio
		– 7 ir 14 parą po dozės suleidimo		– vėliau kas mėnesį	– vėliau kas tris mėnesius“

______________

PATVIRTINTA

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos

ministro 2006 m. gegužės 25 d.

Įsakymu Nr. V-421

SKYSČIŲ OKSIDUOJAMŲJŲ SAVYBIŲ BANDYMO METODO (A.21) APRAŠAS

I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Šis bandymų metodas skirtas matuoti skystosios medžiagos gebą padidinti degiosios medžiagos degimo greitį arba degimo intensyvumą arba sudaryti mišinį su degiąja medžiaga, kuris užsidega savaime, kai dvi medžiagos sumaišomos kartu. Jis yra pagrįstas JT bandymu, taikomu oksiduojamiesiems skysčiams ir jį atitinka. Tačiau, kadangi šis A.21 metodas visų pirma rengiamas siekiant atitikti Direktyvos 67/548 reikalavimus, reikia lyginti tik su viena pamatine medžiaga. Bandymas ir lyginimas su papildomomis pamatinėmis medžiagomis gali būti reikalingas, kai bandymų rezultatus numatoma naudoti kitais tikslais (JT transporto reglamentų kontekste).

2. Šis bandymas neatliekamas, kai tiriant struktūrinę formulę neabejotinai nustatoma, kad medžiaga negali egzotermiškai reaguoti su degiąja medžiaga. Prieš atliekant šį bandymą naudinga turėti išankstinės informacijos apie visas galimas medžiagos sprogiąsias savybes.

3. Šis bandymas netaikomas kietosioms medžiagoms, dujoms, sprogiosioms ar labai degioms medžiagoms arba organiniams peroksidams. Šis bandymas neatliekamas, jei bandomosios medžiagos rezultatai jau yra gauti darant JT oksiduojamųjų skysčių bandymą.

4. Apibrėžimai ir vienetai:

Vidutinė slėgio didėjimo trukmė – išmatuoto bandomojo mišinio slėgio didėjimo, palyginti su atmosferos slėgiu, nuo 690 kPa iki 2 070 kPa trukmės verčių vidurkis.

5. Pamatinė medžiaga:

5.1. Pamatine medžiaga naudojamas 65 sv. % vandeninis azoto rūgšties (grynos analizei) tirpalas. Prieš bandymus rūgštis turėtų būti titruojama jos koncentracijai patvirtinti.

5.2. Be to, jei bandytojas numato, kad šio bandymo rezultatai gali būti naudojami kitais tikslais (JT transporto reglamentų kontekste), pasirinktinai gali būti tikslinga naudoti papildomas pamatines medžiagas. Naudojama 50 sv. % perchlorato rūgštis ir 40 sv. % natrio chloratas.

6. Bandymų metodo esmė:

6.1. Bandomasis skystis maišomas 1:1 (svorio dalimis) su pluoštine celiulioze ir mišinys dedamas į slėginį indą. Jei maišant arba dedant įvyksta savaiminis užsidegimas, toliau bandymas neatliekamas.

6.2. Jei mišinys savaime neužsidega, atliekamas visas bandymas. Mišinys kaitinamas slėginiame inde ir nustatomas vidutinis laikas, per kurį slėgis, palyginti su atmosferos slėgiu, padidėja nuo 690 kPa iki 2070 kPa. Šis vidutinis slėgio didėjimo laikas lyginamas su vidutine pamatinės (-ių) medžiagos (-ų) ir celiuliozės 1:1 (svorio dalimis) mišinio slėgio didėjimo trukme.

7. Kokybės kriterijai:

7.1. Atliktų penkių vienos medžiagos bandymų aritmetinis vidurkis ir atskiri rezultatai turi skirtis ne daugiau kaip 30 %.

7.2. Rezultatai, kurie, palyginti su vidurkiu, skiriasi daugiau kaip 30 %, turi būti atmesti, maišymo ir pripildymo metodika patobulinta ir bandymas pakartotas.

II. BANDYMO METODO APRAŠYMAS

8. Degiosios medžiagos paruošimas:

8.1. Degiąja medžiaga naudojama sausa pluoštinė celiuliozė, kurios plaušelių ilgis 50-250 mm, o vidutinis skersmuo – 25 mm. Ne didesnio kaip 25 mm storio celiuliozės sluoksnis 4 h džiovinamas iki pastoviosios masės esant 105 °C temperatūrai ir aušinamas bei prieš bandymą laikomas eksikatoriuje su džiovikliu.

8.2. Drėgmės kiekis išdžiovintoje celiuliozėje turi būti mažesnis kaip 0,5 % sausos medžiagos masės (patvirtinama titruojant Karlo Fišerio metodu). Prireikus džiovinimo trukmė turi būti padidinta tokiam drėgmės kiekiui pasiekti. Be to, tokį drėgmės kiekį galima pasiekti kitu metodu, pvz., 24 h kaitinant vakuume esant 105 °C temperatūrai.

8.3. Viso bandymo metu turi būti naudojama ta pati celiuliozės siunta.

9. Įrenginiai:

9.1. Slėginį indą sudaro 89 mm ilgio ir 60 mm išorinio skersmens plieninis cilindras (žr. 1 paveikslą). Pagaminamos dvi plokštelės priešingiems cilindro galams (sumažinančios skerspjūvį iki 50 mm), kurios padėtų įtvirtinti cilindrą, įstatant uždegimo žvakę ir vedinimo angos aklidangtį. Indas su 20 mm skersmens anga iš abiejų galų viduje platinamas iki 19 mm gylio ir sriegiamas 1“ (arba jo metrinis atitikmuo) Britų standarto vamzdinis sriegis. Slėgio mažinimo atvamzdis įsriegiamas į kreivąjį slėginio indo paviršių 35 mm nuo vieno galo ir 90° kampu ištekintoms plokštelėms. Gręžiama 12 mm gylio anga, kurioje daromas sriegis įsukti atvamzdžiui, turinčiam 1/2“ (arba jo metrinio atitikmens) Britų standarto vamzdinį sriegį. Prireikus hermetiškumui užtikrinti įstatomas inertinės medžiagos sandariklis. Atvamzdžio ilgis, matuojant nuo slėginio indo korpuso, lygus 55 mm, jame išgręžiama 6 mm skersmens anga. Atvamzdžio galas platinamas ir įsriegiamas diafragminio tipo sriegis slėgio keitikliui įsukti. Galima naudoti bet kurią slėgio matavimo priemonę, atsparią karštoms dujoms ir skilimo produktams, kuri galėtų matuoti slėgio didėjimo greitį nuo 690 kPa iki 2070 kPa ne ilgiau kaip per 5 ms.

9.2. Į tolesnį nuo atvamzdžio slėginio indo galą įsukama uždegimo žvakė, turinti du elektrodus: vieną izoliuotą nuo korpuso, o kitą įžemintą žvakės korpuse. Į kitą slėginio indo galą įstatoma trūkioji membrana (trūkimo slėgis maždaug 2200 kPa), kurią laiko kamštis su 20 mm anga. Prireikus hermetiškumui užtikrinti uždegimo žvakė sandarinama inertinės medžiagos sandarikliu. Visą sąranka tvirtinama laikančiajame stove naudojimui tinkamame aukštyje (žr. 2 paveikslą). Stovą paprastai sudaro mažaanglio plieno pagrindo plokštė, kurios matmenys yra 235 mm x 184 mm x 6 mm ir 185 mm ilgio kvadratinė tuščiavidurė sekcija, kurios matmenys – 70 mm x 70 mm x 4 mm.

9.3. Vienas kvadratinės tuščiavidurės sekcijos galas nupjaunamas iš abiejų priešingų šonų dviem plokščiabriaunėms 86 mm ilgio kojoms gauti. Šių plokščiųjų šonų galai nupjaunami 60° kampu ir privirinami prie pagrindo plokštės. Viename viršutinio galo šone išpjaunama 22 mm pločio ir 46 mm gylio anga, į kurią įsistato slėginio indo atvamzdis, kai visa slėginio indo sąranka uždegimo žvake žemyn nuleidžiama į laikantįjį stovą. Prie žemesnės tuščiavidurės sekcijos sienos iš vidaus privirinamas 30 mm pločio ir 6 mm storio plieninis fiksatorius. Priešingoje sienoje įsriegiamos angos dviem 7 mm ilgio sparnuotosioms veržlėms, kurios neleistų slėginiam indui judėti. Slėgimam indui laikyti iš apačios prie šoninių sienų privirinamos dvi 12 mm pločio ir 6 mm storio plieninės juostos, įremtos į tuščiavidurės sekcijos pagrindą.

10. Uždegimo sistema:

10.1. Uždegimo sistemą sudaro 25 cm ilgio ir 0,6 mm skersmens Ni/Cr viela, kurios savitoji varža yra 3,85 W/m. Viela susukama į apviją naudojant 5 mm skersmens strypą ir tvirtinama prie uždegimo žvakės elektrodų. Apvijos konfigūracija turi atitikti vieną iš pavaizduotų 3 paveiksle. Atstumas nuo slėginio indo dugno iki apatinės uždegimo apvijos pusės turi būti 20 mm.

10.2. Jei elektrodų ilgis nereguliuojamas, uždegimo vielos galai nuo apvijos iki slėginio indo dugno turi būti izoliuoti keraminiu apvalkalu. Viela kaitinama naudojant pastovios įtampos srovės šaltinį, kuris galėtų tiekti mažiausiai 10 A stiprumo srovę.

III. DARBO EIGA

11. Oksiduojamųjų skysčių ir celiuliozės mišiniai turi būti laikomi potencialiai sprogiais mišiniais, todėl su jais reikia elgtis atsargiai.

12. Aparatas su slėgio keitikliu ir kaitinimo sistema, bet be trūkiosios membranos, tvirtinamas stove uždegimo žvake žemyn. Cheminėje stiklinėje stikline lazdele sumaišoma 2,5 g bandomojo skysčio ir 2,5 g išdžiovintos celiuliozės. Praktiškai tai galima padaryti ruošiant didesnį nei bandymui reikia bandomojo skysčio ir celiuliozės 1:1 (svorio dalimis) mišinio kiekį ir supilant 5 g ± 0,1 g į slėginį indą. Kiekvienam bandymui ruošiamas naujas mišinys. Saugai užtikrinti, maišant, tarp operatoriaus ir mišinio turi būti saugos skydas. Jei mišinys užsidega maišant arba pilant į indą, toliau bandymas neatliekamas. Mišinį reikia dėti į slėginį indą mažomis dalimis apie uždegimo apviją taip, kad jis gerai su ja liestųsi. Svarbu, kad dedant mišinį apvija nebūtų deformuota, kadangi dėl to gali būti gauti klaidingi rezultatai. Turi būti išvengta gretimų apvijos vijų sąlyčio. Trūkioji membrana dedama į vietą ir gerai užsukamas tvirtinimo kamštis. Indas su įkrova įtvirtinamas į laikantįjį stovą trūkiąja membrana į viršų bei pastatomas specialiai pritaikytoje šarvuotoje traukos spintoje arba deginimo kameroje. Prie uždegimo žvakės kontaktų jungiamas maitinimo šaltinis ir įjungiama 10 A srovė. Laikas nuo maišymo pradžios iki maitinimo įjungimo turi būti ne didesnis kaip 10 min.

13. Gautas slėgio kitimo signalas užrašomas specialiu prietaisu (ar įrangos sistema), kuris leistų gauti nepertraukiamą slėgio kitimo laike kreivę ir kartu ją analizuoti (pvz., pereinamųjų vyksmų savirašis, sujungtas su diagramų savirašiu). Mišinys kaitinamas tol, kol plyšta trūkioji membrana, arba bent 60 s. Jei trūkioji membrana neplyšta, mišinys paliekamas aušti prieš tai jį atsargiai atidarant, imantis atsargumo priemonių, jei slėginiame inde dar būtų per didelis slėgis. Bandomoji ir kiekviena pamatinė medžiaga bandoma penkis kartus. Užrašomas laikas, per kurį slėgis padidėja nuo 690 kPa iki 2070 kPa virš atmosferos slėgio. Apskaičiuojama vidutinė slėgio didėjimo trukmė.

14. Kartais medžiagos gali sukelti slėgio didėjimą (per didelį arba per mažą), kurio priežastis cheminės reakcijos, neapibūdinančios medžiagos oksiduojamųjų savybių. Tokiais atvejais, norint nustatyti reakcijos tipą, bandymą gali tekti kartoti, vietoj celiuliozės naudojant inertinę medžiagą, pvz., diatomitą.

IV. DUOMENYS

15. Bandomosios medžiagos ir pamatinės (-ių) medžiagos (-ų) slėgio didėjimo trukmės vertės.

16. Bandymų su inertine medžiaga slėgio didėjimo trukmės vertės, jei tokie bandymai atliekami.

17. Rezultatų apdorojimas:

17.1. Apskaičiuojamos bandomosios medžiagos ir etaloninės (-ių) medžiagos (-ų) vidutinės slėgio didėjimo trukmės vertės.

17.2. Apskaičiuojama bandymų su inertine medžiaga slėgio didėjimo trukmės vertė, jei tokie bandymai atliekami.

17.3. Kai kurie rezultatų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė. Rezultatų pavyzdžiai(^d)

Medžiaga(^c)	1:1 mišinio su celiulioze vidutinė slėgio didėjimo trukmė (ms)
Amonio dichromatas, sotusis vandeninis tirpalas	20 800
Kalcio nitratas, sotusis vandeninis tirpalas	6 700
Geležies (III) nitratas, sotusis vandeninis tirpalas	4 133
Ličio perchloratas, sotusis vandeninis tirpalas	1 686
Magnio perchloratas, sotusis vandeninis tirpalas	777
Nikelio nitratas, sotusis vandeninis tirpalas	6 250
Azoto rūgštis, 65 %	4 767(^a)
Perchlorato rūgštis, 50 %	121(^a)
Perchlorato rūgštis, 55 %	59
Kalio nitratas, 30 % vandeninis tirpalas	26 690
Sidabro nitratas, sotusis vandeninis tirpalas	-(^b)
Natrio chloratas, 40 % vandeninis tirpalas	2 555(^a)
Natrio nitratas, 45 % vandeninis tirpalas	4 133
Inertinė medžiaga
Vanduo: celiuliozė	-(^b)

(^a) Vidutinė vertė, gauta darant tarplaboratorinius lyginamuosius tyrimus.

(^b) Didžiausias 2 070 kPa slėgis nebuvo pasiektas.

(^c) Sotieji tirpalai turi būti ruošiami esant 20 °C.

(^d) Klasifikuoti pagal JT transportavimo schemą.

V. ATASKAITOS RENGIMAS

18. Bandymų ataskaitoje pateikiama ši informacija:

18.1. bandomosios medžiagos identiškumas, sudėtis, grynumas ir kitos savybės;

18.2. bandomosios medžiagos koncentracija;

18.3. naudojamos celiuliozės džiovinimo metodika;

18.4. drėgmės kiekis naudojamoje celiuliozėje;

18.5. matavimų rezultatai;

18.6. inertinės medžiagos bandymų rezultatai, jei yra;

18.7. apskaičiuotosios vidutinės slėgio didėjimo trukmės vertės;

18.8. visi nukrypimai nuo šio metodo ir jų pagrįstumas;

18.9. visa papildoma informacija arba pastabos rezultatams interpretuoti.

19. Rezultatų aiškinimas (rezultatus interpretuoti pagal JT transportavimo reglamentus, kai naudojamos kelios pamatinės medžiagos):

19.1. Bandymų rezultatai įvertinti:

19.1.1. pagal tai, ar bandomosios medžiagos ir celiuliozės mišinys užsidega savaime, ir

19.1.2. lyginant medžiagos ir pamatinės (-ių) medžiagos (-ų) vidutinę slėgio didėjimo nuo 690 kPa iki 2070 kPa trukmę.

19.2. Skystoji medžiaga turi būti laikoma oksidatoriumi, kai:

19.2.1. medžiagos ir celiuliozės 1:1 (svorio dalimis) mišinys užsidega savaime; arba

19.2.2. medžiagos ir celiuliozės 1:1 (svorio dalimis) mišinio vidutinė slėgio didėjimo trukmė yra mažesnė arba lygi 65 sv.% vandeninio azoto rūgšties tirpalo ir celiuliozės 1:1 (svorio dalimis) mišinio vidutinei slėgio didėjimo trukmei.

19.3. Siekiant išvengti klaidingų teigiamų rezultatų, interpretuojant juos reikėtų atsižvelgti į rezultatus, gautus bandant medžiagą su inertine medžiaga.

______________

1 paveikslas. Slėginis indas

(A) Slėgimo indo korpusas	(B) Trukiosios membranos tvirtinimo kamštis	(C) Uždegimo žvakė
(D) Minkštas švininis tarpiklis	(E) Trūkioji membrana	(F) Atvamzdis
(G) Slėgio keitiklio galvutė	(H) Tarpiklis	(J) Izoliuotas elektrodas
(K) Įžemintas elektrodas	(L) Izoliacija	(M) Plieninis kūgis
(N) Tarpiklio deformavimo griovelis

2 paveikslas. Laikantysis stovas

3 paveikslas. Uždegimo sistema

(A) Uždegimo apvija

(B) Izoliacija

(D) Uždegimo žvakė

Pastaba. Galima naudoti bet kurią iš šių schemų.

______________

Papildyta priedu:

Nr. V-421, 2006-05-25, Žin., 2006, Nr. 61-2223 (2006-05-31), i. k. 1062250ISAK000V-421

Pakeitimai:

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministerija, Įsakymas

Nr. V-421, 2006-05-25, Žin., 2006, Nr. 61-2223 (2006-05-31), i. k. 1062250ISAK000V-421

Dėl Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymo Nr. V-11 „Dėl cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų sveikatai, toksiškumo tyrimo metodų aprašų patvirtinimo" papildymo

^* Turi būti nurodyta ragenos drumsties sritis.